Đồ án Khảo sát điều kiện trồng nấm hoàng kim (Pleurotus citrinopileatus) trên giá thể vỏ mía

Nội dung text: Đồ án Khảo sát điều kiện trồng nấm hoàng kim (Pleurotus citrinopileatus) trên giá thể vỏ mía

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN TRỒNG NẤM HOÀNG KIM ( Pleurotus citrinopileatus ) TRÊN GIÁ THỂ VỎ MÍA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: ThS. TRẦN THỊ TƯỞNG AN Sinh viên thực hiện: PHẠM NHƯ NGỌC MSSV: 1311101020 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, Năm 2017
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Trần Thị Tưởng An. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được tôi thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung khóa luận của mình. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 05 năm 2017 Người cam đoan Phạm Như Ngọc
3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài của đồ án này tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hỗ trợ về mọi mặt từ rất nhiều người nên lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình tới tất cả mọi người. Trước hết tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành đến ThS. Trần Thị Tưởng An người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện toàn bộ đề tài này. Xin cám ơn các thầy cô, các anh chị và các bạn ở phòng thí nghiệm Nhiên Liệu Sinh Học và Biomass trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí và máy móc, trang thiết bị và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này. Xin cám ơn Nước mía Nhật Huy đã cung cấp cho tôi nguyên liệu vỏ mía trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh cùng tất cả các thầy cô của khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy, cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu cũng như kỹ năng cần thiết trong suốt 4 năm qua để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận của mình. Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 13DSH04 đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường. Cuối cùng xin cho tôi gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến gia đình, hậu phương vững chắc của tôi đã luôn bên tôi, ủng hộ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi vững bước trên con đường học tập. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 05 năm 2017 Xin viên thực hiện Phạm Như Ngọc
4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu nguyên liệu vỏ mía 3 1.1.1. Vỏ mía 3 1.1.2. Thành phần của vỏ mía 3 1.2. Tổng quan về nấm hoàng kim 6 1.2.1. Giới thiệu về nấm hoàng kim 6 1.2.2. Vị trí và phân loại 7 1.2.3. Đặc điểm sinh học của nấm hoàng kim 7 1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng của nấm hoàng kim 10 1.2.5. Một số điểm lưu ý trong quá trình trồng nấm hoàng kim 10 1.2.6. Giá trị dinh dưỡng của nấm hoàng kim 12 1.2.7. Giá trị dược liệu của nấm hoàng kim 15 1.2.8. Thực trạng việc trồng nấm hoàng kim ở Việt Nam và trên thế giới 15 1.2.9. Tiềm năng phát triển của nấm Hoàng kim tại Việt Nam 17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Vật liệu và thiết bị 18 2.1.1. Vật liệu 18 i
5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường thạch (giống cấp 1) 21 2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (giống cấp 2) 23 2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. 25 2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước vôi ngâm đến mật độ của tơ nấm Hoàng kim trên giá thể vỏ mía. 31 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía. 32 2.5. Phương pháp thu nhận kết quả 34 2.6. Xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm của hoàng kim trên môi trường thạch (giống cấp 1). 35 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (giống cấp 2). 38 3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng trên giá thể vỏ mía 41 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước vôi ngâm đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. 45 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của vôi một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía 47 3.6. Một số thành phần hóa học trong mẫu vỏ mía phơi khô 51 3.7. Quả thể nấm hoàng kim 52 3.8. Quy trình trồng nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía 54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 ii
6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4.1. Kết luận 55 4.2. Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC iii
7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 Một số thành phần hóa học của hoàng kim 12 Bảng 1. 2. Thành phần amino acid có trong nấm hoàng kim 13 Bảng 1. 3. Thành phần vitamin có trong nấm hoàng kim 13 Bảng 1. 4. Thành phần khoáng chất có trong nấm hoàng kim 14 Bảng 2. 1 Các loại hóa chất sử dụng 19 Bảng 2. 2. Các nghiệm thức của thí nghiệm 5 32 Bảng 3. 1. Độ dài tơ nấm trên môi trường thạch (cấp 1) theo thời gian 37 Bảng 3. 2. Độ dài tơ nấm trên môi trường hạt (cấp 2) theo thời gian 39 Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của thời gian ngâm vôi đến chiều dài của tơ nấm hoàng kim43 Bảng 3. 4. Ảnh hưởng của nồng độ vôi ngâm đến chiều dài của tơ nấm hoàng kim 46 Bảng 3. 5. Sự ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến chiều dài sợi nấm hoàng kim 49 iv
8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1. Máy bào vỏ mía 3 Hình 1. 2. Nấm hoàng kim (P. citrinopileatus) 7 Hình 1. 3. Nấm hoàng kim 8 Hình 1. 4. Chu trình sinh trưởng của nấm hoàng kim 8 Hình 1. 5. Hình dạng quả thể nấm hoàng kim qua các giai đoạn phát triển 9 Hình 2. 1. Nguyên liệu vỏ mía. 26 Hình 2.2. Cắt vỏ mía 26 Hình 2. 3. Ngâm vỏ mía bằng nước vôi 26 Hình 2. 4. Chất đống ủ 26 Hình 2. 5. Đảo đống ủ 27 Hình 2. 6. Phối trộn dinh dưỡng 28 Hình 2. 7. Vào bịch phôi 28 Hình 2. 8. Làm nút cỗ và nhét bông 28 Hình 2. 9. Cấy meo vào bịch phôi 28 Hình 2. 10. Ủ tơ nấm 29 Hình 3. 1. Tơ nấm hoàng kim phân lập trên môi trường thạch 35 Hình 3. 2. Tơ nấm hoàng kim cấy chuyền trên môi trường thạch. 36 Hình 3. 3. Nấm cấy trên môi trường thạch nghiêng (dùng giữ giống) 37 Hình 3. 4.Sự tăng trưởng tơ nấm hoàng kim trên môi trường thạch (cấp 1) 37 Hình 3. 5. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường thạch (40X) 38 Hình 3. 6. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường hạt 39 Hình 3. 7. Sự tăng trưởng tơ nấm Hoàng kim trên môi trường hạt (cấp 2) 40 Hình 3. 8. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (40X) 40 Hình 3. 9. Sự phát triển của tơ nấm hoàng kim trên bịch phôi theo thời gian xử lý vỏ mía 42 v
9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3. 10. Sự ảnh hưởng của thời gian ngâm vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trong các nghiệm thức. 43 Hình 3. 11.Tơ nấm hoàng kim phát triển trên vỏ mía được xử lý các nồng độ vôi 45 Hình 3. 12. Sự ảnh hưởng của nồng độ vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trong các nghiệm thức 46 Hình 3. 13. Tơ nấm hoàng kim phát triển trên giá thể bổ sung các thành phần dinh dưỡng 48 Hình 3. 14. Sự ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ của nấm hoàng kim 49 Hình 3. 15. Vỏ mía phơi khô 51 Hình 3. 16. Các bịch phôi nấm hoàng kim ở nơi trồng nấm 52 Hình 3. 17. Cácdạng quả thể của nấm hoàng kim 53 vi
10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21 Sơ đồ 2. 2. Quy trình trồng nấm hoàng kim tren vỏ mía 54 vii
11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Ngành nuôi trồng nấm ngày càng được phát triển mạnh mẽ không chỉ riêng ở Việt Nam mà trên toàn Thế Giới. Nấm ăn là một loại thực phẩm sạch và giàu giá trị dinh dưỡng , không những vậy nhiều loại nấm ăn còn có dược tính quý giá. Việc nuôi trồng nấm góp phần giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động và làm giảm thiểu sự ô nhiễm môi trường. Vì nguồn nguyên liệu để trồng nấm là tận dụng những phụ phẩm, phế thải trong nông nghiệp và công nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bông vải Được thiên nhiên ưu đãi, nước ta có điều kiện thời tiết thuận lợi cho các loài nấm phát triển. Đặc biệt khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm thuận lợi cho việc trồng nấm quanh năm. Cùng với nguồn nguyên liệu và lực lượng lao động dồi dào càng giúp cho nghề trồng nấm ở nước ta ngày càng phát triển mạnh mẽ. Nghề trồng nấm hiện nay rất đa dạng và phong phú về chủng loại, trong số đó nấm hoàng kim ( Pleurotus citrinopileatus) là một loại nấm ăn ngon và bổ dưỡng, có dược tính cao và là một loại nấm đang có tiềm năng phát triển mạnh và đem lại giá trị kinh tế cao. 1. Lý do chọn đề tài Nghề trồng nấm phát triển ở nước ta, đặc biệt là các loại nấm bào ngư, linh chi do nhu cầu và sự lựa chọn của người tiêu dùng ngày càng cao. Vì vậy việc trồng và phát triển các loại nấm mới có giá trị như nấm hoàng kim (Pleurotus citrinopileatus) là vô cùng cần thiết. Hiện nay trên thị trường nước ta nấm hoàng kim chưa được trồng phổ biến và còn hiếm chính vì vậy việc nhân rộng mô hình nuôi trồng nấm hoàng kim hứa hẹn sẽ đem lại hiệu quả vô cùng lớn cho người nông dân. Bên cạnh đó, việc tìm ra những nguồn nguyên liệu mới làm giá thể để đáp ứng nhu cầu của việc trồng nấm là rất cần thiết. Vỏ mía có hàm lượng lignin, cellulose có thể đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của nấm. Tại Tp. Hồ Chí Minh, hàng ngày lượng nước mía được bán ra rất lớn do đó lượng vỏ mỉa thải ra cũng rất lớn. 1
12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tận dụng nguồn phế phẩm vỏ mía này để trồng nấm đem lại hiệu quả kinh tế và góp phần giảm lượng rác thải ra môi trường. Đó cũng chính là lý do để thực hiện đề tài: “ Khảo sát điều kiện trồng nấm Hoàng Kim ( Pleurotus citrinopileatus) trên giá thể vỏ mía”. 2. Mục đích nghiên cứu Chuyển hóa vỏ mía thành cơ chất dinh dưỡng để trồng nấm hoàng kim. Xác định các thông số thích hợp, cần thiết để trồng nấm hoàng kim trên vỏ mía. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Tìm hiểu tổng quan tài liệu liên quan đến đề tài. Phân lập và nhân giống nấm hoàng kim. Khảo sát một số đặc điểm của nấm hoàng kim trên các môi trường. Khảo sát điều kiện xử lý vỏ mía để làm nguyên liệu trồng nấm hoàng kim. Khảo sát một số điều kiện để trồng nấm hoàng kim trên nguyên liệu vỏ mía. Bước đầu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm hoàng kim trên vỏ mía. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Giống nấm hoàng kim được cung cấp bởi công ty Mộc Mạc Tình Yêu Nấm ( Địa chỉ 470B quốc lộ 13, Hiệp Bình Phước, Q.Thủ Đức, Tp.HCM). Sau đó sẽ tiến hành phân lập, quan sát và bảo quản giống để tiến hành thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Cơ chất để trồng nấm là vỏ mía. Phạm vi nghiên cứu Thời gian: tháng 2 / 2017 đến tháng 7 / 2017. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nhiên Liệu Sinh Học và Biomass, trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 2
13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu nguyên liệu vỏ mía 1.1.1. Vỏ mía Mía từ lâu đã được chú ý nhờ những đặc tính vật lý tốt gần giống với gỗ và được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vật liệu composite .Vỏ mía quan sát qua kính hiển vi điện tử quét cho thấy bên ngoài là một lớp sáp, tiếp theo là lớp xơ sợi, trong cùng là phần lõi. Vỏ mía chứa lượng lignin và lượng hemicellulose cao . Hàm lượng cellulose gần bằng gỗ. Vỏ mía được tách ra khỏi thân cây mía nhờ máy bào vỏ mía thành các sợi mảnh, bề rộng khoảng 5 mm và dài từ 7 – 10 cm uốn cong giống như gỗ bào. Ngoài ra còn có các sợi mảnh hơn, ngắn hơn và cả mảnh vụn như mạt cưa. Chính vì vậy vỏ mía rất thuận tiện trong quá trình chế biến và bổ sung dinh dưỡng, có thể sử dụng luôn để làm giá thể mà không cần phải xay nhỏ đến kích cỡ như mạt cưa. Hình 1. 1. Máy bào vỏ mía 1.1.2. Thành phần của vỏ mía Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 50% tổng lượng hydrocarbon trên Trái Đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu, còn có ở trong giới động vật nhưng số lượng rất ít. Cellulose là polysaccharide liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside, mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10.000 – 14.000 đơn vị glucose/phân tử. 3
14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Số lượng lớn liên kết hydro nội và ngoại phân tử làm cho cellulose có độ cứng và vững chắc. Liên kết glucoside không bền với acid. Cellulose dễ bị phân hủy với acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro-cellulose có độ bền cơ học kém hơn cellulose nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucose. Về bản chất hóa học cellulose là rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các nhóm –OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bới các gốc –metyl, -etyl, , tạo ra những chất có độ kết tinh cà độ hòa tan trong nước khác nhau. 1.1.1.1. Cellulose Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy – cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4) và muối của nó. Cellulose không tan trong nước , dung dịch kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose phân tử nhỏ. Đặc biệt cellulose dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat [Cu(NH3)4(OH)2]và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadimi, kẽm, (J.F.Kennedy, 1989). 1.1.1.2. Lignin Lignin là một polymer gốc rượu , có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nân đỡ cấu trúc tế bào gỗ. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và là phần lớn nguồn chất thơm đa dạng trên Trái Đất. Sự có mặt của lignin giúp cho tế bào thực vật cứng rắn hơn và đồng thời giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp với những polysaccharide như cellulose và hemicelluloses, nó cũng giúp bảo vệ những polysaccharide này khỏi sự phân hủy sinh học. Lignin được sinh tổng hợp bởi sự polymer hóa các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy thuộc theo số lượng nhóm methocyl trên vòng thơm. 4
15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lignin gỗ mềm chứa hầu hết những đơn vị guaiacyl (1 nhóm methocyl), lignin gỗ cứng cũng chứa số lượng cân bằng guaiacyl và suringyl (2 nhóm methocyl), các lignin khác chứa cả p-hydroxylphenyl ( không có nhóm methocyl), và cả 2 loại kia (Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F.Kennedy, 1989). 1.1.1.3. Hemicellulose Cũng là một phần polysaccharide thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Tuy nhiên cellulose, hemicellulose được không chỉ một đường mà nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ acid urnoic của chúng. Người ta gọi tên cụ thể 1 loại hemicelluloses là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví dụ: xylan là một hemicelluloses mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan – manoza, Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu lá hemicellulose được tạo nên từ loại đường 6 cacbon: galactam, manan Khác với cellulose, phân tử hemicelluloses nhỏ hơn nhiều. Thông thường không quá 150 gốc đường được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh. Vì độ polymer thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemicellulose để tan trong dung dịch kiềm, trong mước nóng và dễ bị phân hủy bởi acid lỏng. Xylan là một hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng rơm, 20 – 25% cây gỗ lá rộng, 7 – 17% cây gỗ lá kim (Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F.Kennedy, 1989). 1.1.1.4. Thành phần khác Mỗi thành phần cấu tạo nên lignin – cellulose do bản chất các liên kết hóa học, do mức độ polymer hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy. Tính khó phân hủy là gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và tới các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặc chẽ và phức tạp. Các mặt phân tử cellulose không bao giở tồn tại riêng lẻ mà nhờ liên kết hydro giữa các phân tử tạo thành các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợi có những 5
16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vùng tại đó các phân tử sắp xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẽ những vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Các vi sợi liên kết với nhau bằng cách đan xen ở những vùng vô định hình này. Các vi sợi cellulose, lignin đan xen theo những quy tắc nhất định đễ định thành nên cấu trúc. Với cấu trúc nhiều lớp gồm nhiều thành phần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignin – cellulose dó độ bền vật lý cao rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa đễ phân hủy bất cứ thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành phần khác (Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F.Kennedy, 1989). 1.2. Tổng quan về nấm hoàng kim 1.2.1. Giới thiệu về nấm hoàng kim Nấm bào ngư là tên gọi dùng chung cho các loài thuộc giống Pleurotus. Theo Singer (1975) có tất cả 39 Nấm bào ngư là tên dùng chung cho các loài thuộc giống Pleurotus. Theo Singer ( 1975) có tất cả 39 loài và chia thành hai nhóm lớn: - Nhóm ưa nhiệt trung bình( ôn hòa) kết quả thể ở nhiệt độ từ 10oC – 20oC. - Nhóm ưa nhiệt kết quả thể ở nhiệt độ từ 20oC – 30oC. Nấm hoàng kim ( Pleurotus citrinopileatus) là một trong những loài nấm bào ngư thuộc giống Pleurotus ưa nhiệt được phát hiện bởi nhà khoa học Singer vào năm 1942. Nấm hoàng kim có tên khoa học là Pleurotus citrinopileatus, tên tiếng Anh là Golden Oyster ( hàu vàng) ,tên tiếng Nhật là tamogitake. Ở Việt Nam có tên gọi là hoàng kim hay tên gọi khác là sò vàng. Nấm hoàng him có nguồn gốc ở miền đông nước Nga, là loại nấm ăn phổ biến ở Trung Quốc (Zhang et all, 1994), Ấn Độ (Ghosh & Chakravarty, 1986) và Nhật Bản. 6
17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2. Vị trí và phân loại Nguồn: 1001 freedownloads.com Hình 1. 2. Nấm hoàng kim (P. citrinopileatus) Nấm hoàng kim được phân loại: Giới : Fungi Ngành : Basidiomycota Lớp : Agaricomycetes Bộ : Agaricales Họ : Pleurotaceae Chi : Pleurotus Loài : P. citrinopileatus 1.2.3. Đặc điểm sinh học của nấm hoàng kim Nấm hoàng kim là một loài thuộc chi nấm bào ngư cho nên nấm hoàng kim cũng có những đặc điểm sinh học chung của nấm bào ngư. Cây nấm có hình dạng phễu lệch gồm 3 bộ phận: mũ, phiến, và cuống nấm( hình 1.2). Chúng thường mọc tập trung thành từng cụm hoặc một số cây nấm nhóm lại với nhau 7
18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1. Mũ nấm 2. Thân nấm 3. Cuống nấm 4. Sợi nấm Hình 1. 3. Nấm hoàng kim Chu trình sống của nấm hoàng kim bắt đầu từ đảm bào tử hữu tính nảy mầm cho hệ sợi tơ dinh dưỡng sơ cấp và thứ cấp và kết thúc bằng việc hình thành cơ quan sinh trưởng là tai nấm. Tai nấm lại sinh đảm bào tử và chu trình sống tiếp tục (hình 1.3) . Hình 1. 4. Chu trình sinh trưởng của nấm hoàng kim Quả thể của nấm hoàng kim (P. citrinopileatus ) phát triển thành các cụm màu vàng nhạt với mũ nấm màu nâu vàng với bề mặt khô. Mũ rộng từ 20 – 65 mm đường kính. Thịt mỏng và trắng, có vị nhẹ và không có mùi mạnh. 8
19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cuốn nấm có hình trụ, màu trắng, thường cong hoặc uốn cong, dài khoảng 20 – 50 mm và đường kính từ 2 – 8 mm. Phiến có màu trắng mang bào tử, khoảng cách chặt chẽ, và kéo dài xuống đến chân. Các bào tử của nấm hoàng kim có hình trụ hoặc hình elip. Quả thể nấm phát triển qua các giai đoạn (hình 1.4) a. Dạng san hô b. Dạng dùi trống c. Dạng phễu d. Dạng bán cầu lệch e. Dạng lá lục bình Hình 1. 5. Hình dạng quả thể nấm hoàng kim qua các giai đoạn phát triển - Dạng san hô: quả thể mới tạo thành, dạng sợi mãnh thành chum (hình 1.4.a). - Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dưới dạng khối tròn, còn cuống phát triển theo cả chiều ngang và chiều dài nên đường kính cuống và mũ không khác nhau bao nhiêu (hình 1.4.b). - Dạng phễu: mũ mở rộng, trong khi cuống còn ở giữa nhìn giống cái phễu( hình 1.4.c). - Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên và bắt đầu lệch so với vị trí trung tâm của mũ (hình 1.4.d). - Dạng lá lục bình: cuống ngừng tăng trưởng, trong khi mũ vẫn tiếp tục tăng trưởng, bìa mép thẳng đến dợn sóng (hình 1.4.e). Nấm bào ngư nói chung và nấm hoàng kim nói riêng đều là loài có khả năng sử dụng lignin mạnh , nhất là thời gian khởi đầu của việc tạo quả thể nấm. 9
20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng của nấm hoàng kim Đặc điểm sinh trưởng của nấm hoàng kim cũng giống như những loài nấm bào ngư thuộc chi Pleurotus khác. Ngoài yếu tố dinh dưỡng từ các chất có trong nguyên liệu trồng nấm hoàng kim thì sự tăng trưởng và phát triển của nấm có liên quan đến nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, ẩm độ, pH, ánh sáng, oxy - Nhiệt độ: Nấm hoàng kim là một loại nấm sò chịu nhiệt, sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ tương đối rộng 21 – 29 oC. Ở giai đoạn ủ tơ, một số loài cần nhiệt độ từ 24 – 29oC. Nhiệt độ thích hợp để nấm ra quả thể ở một số loài cần từ 21 – 29oC. - Độ ẩm: độ ẩm rất quan trọng đối với sự phát triển tơ và quả thể của nấm. Trong giai đoạn tăng trưởng tơ, độ ẩm nguyên liệu yêu cầu từ 50 - 60%, còn độ ẩm không khí không được nhỏ hơn 70%. Ở giai đoạn tưới đón nấm ra quả thể, độ ẩm không khí tốt nhất là 70 – 95%. Ở độ ẩm không khí 50%, nấm ngừng phát triển và chết, nếu nấm ở dạng phễu lệch và dạng lá thì sẽ bị khô mặt. Nhưng nếu độ ẩm cao trên 95%, tai nấm dễ bị nhũn và rũ xuống. - pH: Nấm Hoàng kim có khả năng chịu đựng sự giao động pH tương đối tốt. Tuy nhiên pH thích hợp đối với hầu hết các loài nấm hoàng kim trong khoảng 5 – 7. - Ánh sáng: Yếu tố này chỉ cần thiết trong giai đoạn ra quả thể nhằm kích thích nụ nấm phát triển. Nhà nuôi trồng nấm cần có ánh sáng khoảng 200 – 300 lux (ánh sáng khuếch tán – ánh sáng phòng). - Thông thoáng: Nấm cần có oxy để phát triển vì vậy nhà trồng cần có độ thông thoáng vừa phải, nhưng phải tránh gió lùa trực tiếp. 1.2.5. Một số điểm lưu ý trong quá trình trồng nấm hoàng kim 1.2.5.1 Nhạy cảm với môi trường 10
21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nấm hoàng kim rất nhạy cảm với môi trường. Khi nấm ở dạng san hô, nếu nhiệt độ lên trên 32oC trong 1 giờ, nụ nấm sẽ khô quéo lại như cỏ úa. Cũng như trong giai đoạn này, nếu độ ẩm tăng lên trên 90% nhiều giờ thì nấm non sẽ bị thối nhũng. Đặc biệt nước tưới nhiễm phèn hơi nặng (pH acid), thì tai nấm ngã vàng, tai nấm dị dạng, mũ nấm khô nứt. Trường hợp phèn nhẹ cũng làm trên bề mặt mũ nấm có những nốt sần mở ra thành hốc nhỏ. Nấm hoàng kim còn đặc biệt nhạy cảm với tác nhân gây ô nhiễm môi trường như hóa chất, thuốc trừ sâu, kim loại nặng cả trong nguyên liệu, cũng như không khí nơi nuôi trồng. Tai nấm thường sẽ bị biến dạng hoặc ngừng tạo quả thể. Do đó cần lưu ý khâu chế biến nguyên liệu hoặc kiểm tra các điều kiện nuôi trồng khi thấy tai nấm có biểu hiện không bình thường. 1.2.5.1. Dịch bệnh gây hại cho nấm Giống với các loại nấm sò khác, nấm hoàng kim cũng là loài có ít bệnh hại. Chủ yếu thường gặp là hai loại bệnh phổ biến là: mốc xanh Trichoderma sp. và ấu trùng ruồi nhỏ. Đối với mốc xanh, ngoài việc tranh giành thức ăn chúng còn thay đổi môi trường sống, tạo ra nhiều tạp chất ảnh hưởng đến sự phát triển và tăng trưởng của nấm hoàng kim. Để hạn chế sự phát triển loài mốc này, có hai biện pháp: khử trùng tốt nguyên liệu hoặc nâng pH. Đối với ấu trùng ruồi nhỏ, chúng thường chui vào khe của phiến nấm, cắn phá và làm hư hại nấm. Đối với bịch phôi, chúng làm tơ nấm đổi màu, thâm nâu, quằng quện. Tốc độ sinh trưởng của chúng lại rất nhanh, nên thiệt hại gây ra không phải nhỏ. Nhà trồng vì vậy nên có tấm lưới chắn để chúng không lọt vào. Tuy nhiên, vấn đề chính vẫn là đảm bảo vệ sinh nhà trại, không để ổ dịch phát sinh. 1.2.5.3. Dị ứng do bào tử nấm hoàng kim Bào tử nấm bào ngư (hay Hoàng kim) cũng rất nguy hiểm. Người hít phải nếu nhạy cảm sẽ biểu hiện trong 8 giờ, còn ngược lại là từ 4 – 6 tuần. Người bệnh có 11
22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP triệu chứng khó thở, mệt mỏi, nhiều vết đỏ ở tay, nhức đầu, ho và sốt (có thể tới 39oC). Bệnh có thể kéo dài trong vài ngày rồi dứt, nhưng sau đó lại tái phát và nhất là sau khi tiếp xúc với mầm bệnh. 1.2.6. Giá trị dinh dưỡng của nấm hoàng kim Nấm ăn nói chung và nấm hoàng kim nói riêng là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Nấm hoàng kim giàu dinh dưỡng, ít calo nhưng giàu protein và một số vitamin nhất định. Dinh dưỡng nấm hoàng kim rất cao không kém dinh dưỡng của các sản phẩm từ động vật. Kết quả phân tích của Fredrick Musieba và cộng sự năm 2013 cho thấy nấm hoàng kim có hàm lượng protein chiếm khoảng 22% (bảng 1.1), đặc biệt có chứa khoảng 18 loại axit amin (bảng 1.2), ngoài ra còn có carbohydrate, nhiều vitamin và các khoáng chất khác . Sử dụng nấm không những không tăng cân mà còn ngăn ngừa một số bệnh như: giảm cholesterol trong máu, tiểu đường, béo phì, đau bao tử, rối loạn gan, ung thư, v.v , đồng thời người ăn nấm thường xuyên sẽ giúp cơ thể tăng tính miễn dịch, điều hòa huyết áp, dễ tiêu hóa và chống lão hóa. Bảng 1. 1 Một số thành phần hóa học của hoàng kim Thành phần hóa học Hàm lượng (g/100g chất khô) Hàm lượng ẩm 9,12 ± 1,57 Tro 7,65 ± 0,89 Protein 22,10 ± 2,03 Lipit 1,32 ± 2,03 Cellulose 20,78 ± 2,72 Calo 3,76 ± 0,17 Acid béo không no 0,48 ± 0,11 (Nguồn Fredrick Musieba và cộng sự, 2013) Thành phần các chất dinh dưỡng chính của một số loài nấm nấm hoàng kim bao gồm: carbonhydrate, protein, amino acid, chất béo, khoáng chất, hoạt chất và các vitamin được nhiều nhà dinh dưỡng học quan tâm nghiên cứu, nhằm đánh giá vai trò của nấm như nguồn thực phẩm cho con người. 12
23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Carbonhydrate và protein là thành phần chính, chiếm từ 70 đến 90% trọng lượng khô quả thể, tro khoảng 10% chứa nhiều loại chất khoáng. Chất béo có hàm lượng thấp trong hầu hết các loài, dao động trong khoảng 2 – 3 %. Giá trị về mặt năng lượng được đánh giá trên cơ sở thành phần protein thô, chất béo và carbohydrate, trị số này thấp khoảng từ 261 - 367 Kcal/100g chất khô. Hàm lượng protein của nấm hoàng kim chỉ đứng sau thịt, cá, giàu các chất khoáng và các acid amin tan trong nước, các acid amin không thay thế như lysine, tryptophan, các acid amin chứa nhóm lưu huỳnh (bảng 1.2) . Bảng 1. 2. Thành phần amino acid có trong nấm hoàng kim STT Amino acid Hàm STT Amino acid Hàm lượng lượng (%) (%) 1 Valine 0,85 10 Threonine 0,83 2 Leucine 1,07 11 Phenyl alanine 0,65 3 Lysine 0,81 12 Tryptophan 0,28 4 Isoleusine 0,61 13 Alanine 0,86 5 Methionine 0,33 14 Aspartic axit 1,82 6 Arginine 1,01 15 Glycine 0,84 7 Histidine 0,51 16 Proline 0,33 8 Glutamic axit 3,07 17 Cysteine 0,20 9 Serine 1,03 18 Tryrosine 0,58 (Nguồn Fredrick Musieba và cộng sự, 2013) Ngoài ra nấm hoàng kim còn chứa một lượng lớn các vitamin quan trọng (bảng 1.3). Bảng 1. 3. Thành phần vitamin có trong nấm hoàng kim Vitamin Hàm lượng Vitamin A (µg/100 g) < 10,00 Vitamin B1 (mg/100 g) 0,16 Vitamin B2 (mg/100 g) 0,94 Vitamin B3 (mg/100 g) 22,20 Vitamin B5 (mg/100 g) 17,30 Vitamin B6 (mg/100 g) 0,57 itamin B7 (µg/100 g) 9,40 Vitamin B9 (µg/100 g) 97,00 Vitamin B12 (µg/100 g) < 0,30 Vitamin C (mg/100 g) < 1,00 13
24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Nguồn Fredrick Musieba và cộng sự, 2013) Theo Ghada M. Mendany( 2014), khi nuôi cấy nấm hoàng kim trên các môi trường khác nhau kết quả cho thấy hàm lượng protein thô của nấm ăn dao động trong khoảng 18,4 – 61,5 % . Hàm lượng protein thô của nấm hoàng kim có giá trị trung bình 22 – 26 %, trị số này có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng. Hàm lượng chất béo trong nấm hoàng kim nhìn chung là khá thấp. Hàm lượng carbonhydrat tương đối và hàm lượng chất xơ trong P.citrinopileatus rất thấp, do vậy về mặt cảm quan cho thấy nấm hoàng kim có mùi vị rất thơm ngon. Hàm lượng nước dao động trong khoảng 85 – 87 % nghĩa là lượng sinh khối khô chỉ vào khoảng 15% , song tỷ lệ chất dinh dưỡng rất đáng kể và cân đối, vượt hơn hẳn các loại rau quả. Do đó quan niệm trước đây coi nấm như là một loại rau là không chính xác. Hàm lượng protein thô của nấm hoàng kim nếu như so với các loại thịt cá lượng protein đạt xấp xỉ 40% trọng lượng khô, trị số sinh năng lượng khá thấp, chỉ cung cấp năng lượng ở mức tối thiểu, đây là một trong những ưu điểm của loài nấm ăn này, thích hợp cho người ăn kiêng. Trong nấm hoàng kim còn chứa một số loại khoáng chất thiết yếu cần cho sức khỏe của con người (bảng 1.4). Bảng 1. 4. Thành phần khoáng chất có trong nấm hoàng kim Thành phần khoáng Hàm lượng (mg /100g chất khô) chất Kali (K) 2,28 ± 0,14 Natri (Na) 0,33 ± 0,60 Canxi (Ca) 0,02 ± 0,00 Magie (Mg) 0,07 ± 0,00 Sắt (Fe) 0,01 ± 0,00 Kẽm (Zn) Không phát hiện Phốt pho (P) 0,10 ± 0,01 Đồng (Cu) Không phát hiện (Nguồn Fredrick Musieba và cộng sự, 2013) 14
25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.7. Giá trị dược liệu của nấm hoàng kim Không chỉ là loài nấm có giá trị dinh dưỡng cao, nấm hoàng kim có có những dược tính quý giá. - Nấm hoàng kim là một nguồn vi chất dinh dưỡng tuyệt hảo và chứa các thành phần chống oxy hoá. Theo Rushita và cộng sự (2013) P. citrinopileatus có hoạt tính chống nôn cao và do đó có tiềm năng là một thành phần trong sản phẩm chăm sóc sức khoẻ tự nhiên. - Nấm hoàng kim chứa nguồn chất chống oxy hóa. Chiết xuất từ nấm hoàng kim đã được nghiên cứu về tính chất chống cao huyết áp, làm giảm lượng đường trong máu ở chuột mắt bệnh đái tháo đường (Shu-Hui Hu et al,2006). - Nấm hoàng kim cũng đã được nghiên cứu như là một nguồn thuốc hạ lipid (Shu Hui Hu et al 2006). - Đồng thời cũng tìm thấy có chứa lovastatin giảm cholesterol trong loại nấm sò này. - Ngoài ra, các polysaccharides hòa tan trong nước được chiết xuất từ nấm này được phát hiện là có hoạt tính chống ung thư (Zhanget al., 1994) và khả năng kháng độc tính kháng sinh (Wang, Hu, Liang & Lee, 2005) - Trong tự nhiên nấm hoàng kim tươi có tiết ra chất kháng tuyến trùng và giun tròn. Do đó khi ăn nấm hoàng kim còn có tác dụng phòng ngừa giun, sán rất tốt. 1.2.8. Thực trạng việc trồng nấm hoàng kim ở Việt Nam và trên thế giới 1.2.8.1. Ở Việt Nam Ở Việt Nam, nấm hoàng kim chưa được trồng phổ biến trên quy mô lớn, được trồng chủ yếu ở các trại nấm nhỏ lẻ thử nghiệm. Và nấm hoàng kim bán trên thị trường ở nước ta cũng còn khá hiếm nên giá thành cũng còn cao. Giá trên thị trường hiện nay giao động từ khoảng 80 – 100 nghìn đồng /kg. Việc tổ chức sản xuất nấm hoàng kim của các đơn vị chuyên kinh doanh về nấm còn nhiều thiếu sót. Chất lượng giống nấm chưa đảm bảo từ khâu sản xuất 15
26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đến quá trình nuôi trồng, bảo quản, cách sử dụng. Các giống hoàng kim đã và đang được nuôi trồng ở Việt Nam từ nhiều nguồn giống khác nhau. Một số giống được nhập từ một số nước và vùng lãnh thổ: Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Một số khác được nhân giống trong nước, song cần việc chọn lọc, kiểm tra để đánh giá tiềm năng về năng suất, chất lượng của từng loại, từ đó để nhân giống đại trà phục vụ cho sản xuất hầu như chưa có đơn vị nào đảm trách. Khâu hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng, chế biến nấm đạt chất lượng xuất khẩu đến từng hộ gia đình không đầy đủ, do thiếu cán bộ và trình độ kỹ thuật viên non kém. Đội ngũ cán bộ nghiên cứu và làm công tác kỹ thuật về nấm được đào tạo cơ bản tại các trường đại học, có kinh nghiệm lâu năm và chuyên tâm với nghề nghiệp còn quá ít. Công tác nghiên cứu về công nghệ chọn, tạo giống, công nghệ nuôi trồng nấm bào ngư đạt năng suất cao, chi phí thấp, công nghệ bảo quản nấm đạt chất lượng ở các trung tâm nghiên cứu và cơ sở sản xuất chưa được chú trọng đúng mức. Các thiết bị, công nghệ trồng nấm nhập khẩu từ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, không phù hợp với điều kiện tự nhiên, kinh tế, xã hội ở Việt Nam. 1.2.8.2. Tình hình trên thế giới Từ lâu nấm hoàng kim đã trở thành một trong số những loại nấm ăn phổ biến ở một số nước như Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản. Với giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị kinh tế cao, nấm hoàng kim ở các quốc gia này đã và đang được trồng phổ biến ở quy mô lớn để phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Ở các nước phương Tây như Liên Ban Nga cũng coi nấm hoàng kim như loài thực phẩm dinh dưỡng hàng đầu và rất được ưa chuộng. Một số nghiên cứu về P. citrinopileatus trên thế giới Năm 2006, Shu Hui Hu et all đã nghiên cứu tác dụng chống trầm cảm và chống oxy hóa của chiết xuất từ P. citrinopileatus trên chuột bạch. Kết quả cho thấy rằng chiết xuất P. citrinopileatus có thể có hiệu quả chống cao huyết áp. Năm 2006, Yu-Ling Lee et all đã nghiên cứu về tính chất chống oxy hóa của ba chiết suất từ P. citrinopileatus. Kết quả khả năng thu nhận chiết xuất đối với các 16
27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP gốc hydroxyl là 53,4 – 80,1 % ở 20 mg / ml. Khả năng tách chiết bằng nước lạnh và nước nóng chiết xuất trên ion sắt cao hơn các chất chiết xuất ethanol. Hàm lượng phenol tổng thể theo thứ tự giảm dần: quả thể (8,62 – 12,38 mg / g) > sợi nấm ( 5,84 – 7,85 mg/g) > lọc (4.80 – 5.57 mg / g). Nhìn chung, ba chất chiết xuất từ quả thể có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các chất từ sợi nấm và filtrate. 1.2.9. Tiềm năng phát triển của nấm Hoàng kim tại Việt Nam Nấm hoàng kim được trồng tại Việt Nam trong vài năm gần đây, trên nguyên liệu chủ yếu là mạc cưa. Hiện nay trên thị trường còn khan hiếm nên việc sản xuất để phục vụ nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao. Nấm hoàng kim có giá trị dinh dưỡng cao, màu sắc đẹp, mùi vị thơm ngon nên sẽ được mọi người rất ưa chuộng. Kỹ thuật trồng, chăm sóc nấm hoàng kim không khó, chỉ cần người trồng tuân thủ đúng quy trình hướng dẫn. Hiệu quả kinh tế mà nó mang lại khá cao. Hiện nay đã có nhiều nông dân Việt Nam thoát nghèo nhờ việc trồng nấm bào ngư. Mô hình trồng nấm bào ngư đa chủng loại đã được nhân rộng ra nhiều nơi như: Đồng Nai, Bến Tre, Củ Chi, Bình Thuận,Vĩnh Long, An Giang, Bình Dương, Đà Lạt. Đồng Tháp Không những giúp người dân thoát nghèo, việc trồng nấm bào ngư đúng quy trình và theo quy mô lớn còn có thể giúp một số doanh nhân biết cách đầu tư làm giàu nhanh chóng. 17
28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa điểm Phòng thí nghiệm Nhiên Liệu Sinh Học và Biomass, trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 02/2017 đến tháng 7/2017. Đối tượng nghiên cứu: Dùng bã mía để trồng nấm hoàng kim. Nội dung nghiên cứu Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm hoàng kim trên môi trường thạch PGA (giống cấp 1). Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (giống cấp 2). Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm vôi nguyên liệu vỏ mía đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vôi xử lý nguyên liệu vỏ mía đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. 2.1. Vật liệu và thiết bị 2.1.1. Vật liệu 2.1.1.1. Nguyên liệu Nấm hoàng kim cung cấp từ công ty Mộc Mạc Tình Yêu Nấm ( Địa chỉ 470B quốc lộ 13, Hiệp Bình Phước, Q.Thủ Đức, Tp.HCM). Vỏ mía thu gom từ tiệm Nước mía Nhật Huy đường Tô Hiến Thành, quận 10, thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.1.2. Hóa chất a. Hóa chất phân tích và xử lý nguyên liệu 18
29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các hóa chất xử dụng trong quá trình thực hiện đề tài được trình bày trong bảng 2.1, bao gồm các hóa chất để phân tích và xử lý nguyên liệu. STT Tên hóa chất Xuất xứ Mục đích sử dụng 1 Axit sulfuric (H2SO4) Trung Quốc Thủy phân Làm blank UV-vis 2 Nước cất Từ máy cất Pha môi trường PGA nước 2 lần 3 Xanh methylene Ấn Độ Nhuộm tơ nấm 4 Glucose Trung Quốc Pha môi trường PGA 5 Agar Ấn Độ Pha môi trường PGA 6 Ethanol Việt Nam Đốt đèn cồn Khử trùng 7 KH2PO4 Trung Quốc Bổ sung dinh dưỡng 8 MgSO4 Trung Quốc Bổ sung dinh dưỡng 9 (NH4)2SO4 Trung Quốc Bổ sung dinh dưỡng 10 (NH4)2HPO4 Trung Quốc Bổ sung dinh dưỡng 11 Glycerin Ấn Độ Pha lactophenol 12 Acid lactic Trung Quốc Pha lactophenol Bảng 2. 1 Các loại hóa chất sử dụng b. Môi trường vi sinh Môi trường PGA (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): 200g khoai tây, 20 glucose, 20 agar, 1 lít nước cất. Môi trường hạt thóc (môi trường nhân giống cấp 2): 500g thóc, 50g cám gạo, 25g cám bắp. Môi trường nuôi trồng ra quả thể: vỏ mía, cám bắp, cám gạo, vôi bột, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4. 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.1.2.1. Thiết bị Tủ cấy Nồi hấp khử trùng (hãng ALP – Nhật Bản) 19
30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cân điện tử Bếp điện từ Hệ thống lọc chân không Tủ sấy Lò nung (hãng Naberthem – Đức) Kính hiển vi, lam, lamel Máy quang phổ kết hợp đo độ hòa tan tự động (Automatic UV-VIS, hãng JASCO – Nhật Bản.) Hệ thống sắc ký lỏng HPLC 2.1.2.2. Dụng cụ thí nghiệm Ống nghiệm Cốc sứ Pipet các loại Cốc crucible Bông không thấm Cuvet thạch anh Chai thủy tinh Bao PE chịu nhiệt Đĩa petri Nút cỗ Bình tam giác Bồn ngâm 100 lít Dao mổ, kẹp Kệ trồng nấm Lam, lamel Bình xịt tưới nấm 20
31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2 Phương pháp nghiên cứu Quá trình thí nghiệm được thể hiện ở sơ đồ 2.1. Khảo sát các thành Vỏ mía Nấm phần hóa h Đo tốc độ lan tơ, Phân lập quan sát Ngâm vôi tơ nấm Xử lý Đo tốc độ Nồng độ Nhân giống vôi lan tơ, cấp1,cấp 2 quan sát tơ nấm Bổ sung Bịch phôi dinh dưỡng Meo giống Đo tốc độ lan Hấp khử Cấy meo tơ, quan trùng sát tơ Quả thể Sơ đồ 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường thạch (giống cấp 1) 2.2.1.1. Bố trí thí nghiệm Pha môi trường phân lập nấm hoàng kim. Làm môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm và thạch đĩa trên đĩa petri. Phân lập nấm trên đĩa petri, sử dụng 4 đĩa. Thạch nghiêng dùng giữ giống, sử dụng 3 ống thạch nghiêng. 21
32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cấy chuyền 3 lần để làm thuần khiết giống. 2.2.1.2. Phương pháp thực hiện a. Phương pháp pha môi trường phân lập Môi trường dùng để phân lập nấm hoàng kim là môi trường PGA ( Potato Dextro Agar) thạch. Môi trường này vừa dùng để phân lập vừa để cấy chuyền và giữ giống nấm hoàng kim. Thành phần môi trường PGA gồm : 200g khoai tây 20 g đường glucose, 20g agar và 1 lít nước cất. Thao tác thực hiện: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt nhỏ. Cho khoai tây vào nồi, thêm 600 mL nước cất, đun sôi đến khi khoai tây mềm ra. Lọc qua giấy lọc, thu dịch lọc ta được dịch chiết khoai tây. Bổ sung 20g glucose và 20g agar vào dịch chiết khoai tây vừa thu, khuấy đều, thêm nước cất đến 1 lít nước . Đun sôi, khuấy đều hỗn hợp 3 – 5 phút, tắt bếp. Phân chia môi trường vào các ống nghiệm (khoảng 1/3 ống) và chai thủy tinh. Làm nút bông, gói đĩa petri, đem hấp khử trùng 1210C trong 10 phút. Lấy ống nghiệm ra, để nghiêng sao cho môi trường không chạm vào nút bông, khi nguội tạo thành môi trường thạch nghiêng. Bình thủy tinh để nguội đến nhiệt độ thích hợp (da tay có thể chịu đựng được). Đổ đĩa trong tủ cấy vô trùng với 15ml môi trường/đĩa petri. Không đổ môi trường với nhiệt độ quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên nắp sau đó rơi xuống làm ướt mặt thạch hoặc chảy ra ngoài khi úp ngược đĩa petri làm tăng khả năng nhiễm vi sinh vật. Cũng không đổ môi trường khi đã nguội vì môi trường có thể đông vón lại khi đang đổ đĩa. b. Thao tác phân lập nấm hoàng kim: Mọi thao tác phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Các bước thực hiện: - Sát trùng bề mặt quả thể nấm bằng cồn 70o . Rửa lại bằng nước vô trùng. 22
33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Dùng dao gọt một lớp mỏng (lưỡi dao chỉ gọt một đường không quay lại để tránh nhiễm trùng). Tiếp tục gọt cho đến khi được một miếng mô nấm đã sạch lớp bẩn bên ngoài. Dùng kẹp đưa vào chai môi trường và thạch đĩa. Đem chai và đĩa thạch đã cấy ủ ở nhiệt độ phòng và ánh sáng khuếch tán nhẹ. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy sau 2 ngày. Loại bỏ các mẫu bị nhiễm khuẩn vả nấm mốc. Tiếp tục ủ trong 5 ngày sau đó cấy chuyền sang ống thạch nghiêng và thạch đĩa mới. Sau 3 lần cấy chuyền, thu được giống nấm thuần khiết làm giống cấp 1. Giữ giống cấp 1 bằng cách bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4o C. 2.2.1.3. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Đo tốc độ lan tơ trên môi trường thạch đĩa, ghi nhận kết quả mỗi ngày kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường. Quan sát tơ nấm dưới kính hiển vi bằng cách làm tiêu bản không nhuộm màu và tiêu bản nhuộm màu. Nhận xét kết quả. 2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (giống cấp 2) 2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm Làm môi trường hạt trong chai thủy tinh. Số lượng chai thủy tinh sử dụng là 15 chai. Cấy chuyền giống từ môi trường thạch sang môi trường hạt. 2.2.2.2. Phương pháp thực hiện Môi trường hạt thóc có bổ sung dinh dưỡng là môi trường được chọn để nhân giống cấp 2 đối với nấm hoàng kim. Công thức môi trường hạt: - Thóc hạt: 85% - Cám gạo: 10% - Cám bắp: 5% 23
34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a. Quá trình chuẩn bị môi trường hạt Cân khối lượng thóc cần làm đổ vào thau nhựa, rửa nhiều lần bằng nước sạch để loại bỏ bụi, đất và các hạt thóc lép sau đó ngâm thóc trong nước sạch 12 – 16 giờ. Thóc sau khi ngâm, tiến hành đãi, rửa sạch để khử hết mùi chua. Cho thóc vào nấu đến khi vỏ trấu mở khoảng 1/3. Vớt thóc ra dụng cụ chứa , để ráo, độ ẩm còn khoảng 70 – 75% là được. Chú ý khi luộc thóc phải thường xuyên khuấy trộn để độ nở các hạt thóc đồng đều nhau. Bổ sung cám gạo, cám bắp vào thóc. Trộn đều để dinh dưỡng bám vào vỏ hạt thóc đồng đều. Kiểm tra độ ẩm đến 65- 70% là đạt yêu cầu. Phân phối thóc đã phối trộn vào các chai thủy tinh. Tiến hành làm nút bông, dùng giấy báo bọc kín vùng nút bông để chống hút ẩm trong quá trình hấp khử trùng. Khử trùng môi trường nhân giống nấm cấp 2, áp suất 1 atm, 1300C trong thời gian 20 phút. Để nguội 24 giờ sau đó cấy giống cấp 2. b. Thao tác cấy chuyền giống cấp 2: Mọi thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. - Đốt đèn cồn để đèn cồn, khử trùng lại dụng cụ cấy. - Mở nút bông và giữ nút bông của ống giống cấp 1 và chai môi trường cấp 2 bằng kẽ tay út và áp út, hơ miệng ống nghiệm và túi môi trường trên ngọn lửa đèn cồn, chỉ mở nút bông quanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng về hướng ngọn lửa. - Dùng que cấy chấn 1 phần giống trong ống giống cấp1 và chuyển phần giống đó sang lọ môi trường cấp 2. Lật úp miếng thạch để tơ dễ lan trên môi trường mới. - Đậy nút bông lại. Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. 2.2.2.3. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Đo tốc độ lan tơ kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường cho đến khi ăn trắng toàn bộ chai. 24
35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quan sát tơ nấm dưới kính hiển vi 40X bằng cách làm tiêu bản không nhuộm màu và tiêu bản nhuộm màu. Nhận xét kết quả. 2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. 2.2.3.1. Bố trí thí nghiệm Vỏ mía thu gom về được phơi khô sau đó được xử lý với nước vôi (Ca(OH)2)1% (100g vôi bột (CaCO3)/ 10L nước). Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức mỗi nghiệm thức 10 bịch, tổng số bịch phôi là 40 bịch. Ngâm vỏ mía trong nước vôi 1% ở những khoảng thời gian 15 phút, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ được bố trí như các nghiệm thức sau: NT1: Ngâm nước vôi 1% trong 15 phút. NT2: Ngâm nước vôi 1% trong 24 giờ. NT3: Ngâm nước vôi 1% trong 48 giờ. NT4: Ngâm nước vôi 1% trong 72 giờ. 2.2.3.2. Phương pháp thực hiện a. Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu vừa thu gom về (hình 2.1.a) và vỏ mía được phơi khô (hình 2.1.b), sau đó chặt nhỏ vỏ mía và lựa bỏ những phần than mía lân vào trong nguyên liệu. Trích một phần mẫu đem phân tích một số thành phần hóa học của vỏ mía sau đó đem xử lý với nước vôi 1% (hình 2.3) với thời gian ngâm trong 15 phút, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. a. Vỏ mía tươi b. Hình vỏ mía khô 25
36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 1. Nguyên liệu vỏ mía. Hình 2.2. Cắt vỏ mía Hình 2. 3. Ngâm vỏ mía bằng nước vôi Nước đưa vào xử lý phải là nước sạch. Lượng nước vôi ngâm phải đủ để ngập bề mặt nguyên liệu. Nguyên liệu sau khi xử lý với nước vôi được vớt ra, chất thành đống, phủ nilon và ủ trong 1 tuần. Trong quá trình ủ cần đảo đống ủ mỗi 3 ngày một lần. Hình 2. 4. Chất đống ủ 26
37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 5. Đảo đống ủ b. Phối trộn dinh dưỡng và vào bịch phôi Sau khi nguyên liệu được xử lý, nên phối trộn nguyên liệu với các thành phần dinh dưỡng khác. Trước khi trộn dinh dưỡng cần làm ẩm nguyên liệu. Ẩm độ của nguyên liệu vào khoảng 65 – 70 %, nghĩa là nếu nắm nguyên liệu trong tay bóp thì nghuyên liệu sẽ kết khối và không có nước tràn ra kẽ tay là được. Công thức phối trộn dinh dưỡng: Cám gạo: 5% (w/w) Cám bắp: 3% (w/w) SA: 0,1% (w/w) DAP: 0,1% (w/w) MgSO4: 0,1% (w/w) Trộn đều dinh dưỡng vào nguyên liệu sau khi ủ, kiểm tra lại độ ẩm trước khi chuyển vào bịch. Cho nguyên liệu vào túi PE chịu nhiệt loại chứa khối lượng 500g, nén chặt vừa phải. Làm nút cổ cho túi, dùng bông gòn không thấm làm nút gòn, dùng giấy bao bên ngoài nút. Trung bình mỗi túi chứa khoảng 360 - 400g nguyên liệu. Khử trùng các bịch nguyên liệu bằng nồi hấp khử trùng với nhiệt độ 130oC trong 60 phút. Túi hấp xong phải có mùi thơm, không bị chua do lên men, nút bông chặt không ướt. Để nguội 24 giờ rồi tiến hành cấy giống. 27
38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 6. Phối trộn dinh dưỡng Hình 2. 7. Vào bịch phôi Hình 2. 8. Làm nút cỗ và nhét bông Thao tác cấy giống cấp 2 vào bịch phôi phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Hình 2. 9. Cấy meo vào bịch phôi 28
39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Đốt đèn cồn để đèn cồn cháy tự do trong thời gian 2 – 3 phút, ngọn lửa đèn cồn không nên để quá lớn hoặc quá nhỏ, nên cao từ 3 – 4 cm. - Khử trùng lại các dụng cụ cấy bằng cách nhúng cồn và đốt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, thao tác tiến hành 2 – 3 lần và để nguội. - Mở nút bông và giữ nút bông của lọ giống cấp 2 và bịch phôi bằng kẽ tay út và áp út, hơ miệng bịch phôi gần ngọn lửa đèn cồn, chỉ mở nút bông quanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng về hướng ngọn lửa. - Dùng kẹp lấy các hạt meo cấp 2 trong lọ giống cấp 2 và chuyển phần hạt đó sang lọ bịch phôi. Mỗi bịch từ 15 – 20 hạt meo. - Đậy nút bông lại. Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. c. Nuôi ủ tơ nấm Các bịch phôi được đưa tới nơi ủ tơ nấm. Nơi ủ tơ nấm phải thông thoáng, sạch sẽ. Không có ánh sáng chiếu trực tiếp nhưng cũng không quá tối. Hình 2. 10. Ủ tơ nấm Trong thời gian nuôi ủ tơ, không cần tưới nước thường xuyên do độ ẩm khi xử lý nguyên liệu trước khi vào bịch (65 – 70 %) đã đủ cho tơ nấm phát triển. Nếu tưới nhiều nước sẽ gây hiện tượng bị úng. Chỉ cần tưới nước quanh vách và dưới nền sao cho đảm bảo nhiệt độ không khí từ 20 – 30oC và độ ẩm không khí 60 – 70% thích hợp cho sợi nấm phát triển. Khi thấy tơ ăn trắng bịch thì chuyển ra nơi trồng nấm. 29
40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP d. Chăm sóc và tưới đón nấm Nơi trồng nấm khác với nơi ủ nấm do tơ nấm sau khi ăn trắng bịch cần tăng độ thông thoáng và ánh sáng nhằm mục đích thay đổi môi trường để tơ nấm kết hợp với nhau nhanh hơn, chuẩn bị hình thành quả thể. Nên sau khi tơ nấm ăn trắng bịch thì tiến hành chuyển các bịch phôi đến nơi trồng nấm. Nơi trồng nấm phải sạch sẽ, đủ ánh sáng, không bị chiếu nắng trực tiếp. Nhiệt độ thích hợp từ 20 – 30oC, độ ẩm không khí 80 –90%. Bịch được rút nút bông, tưới nước từ 1 – 2 lần mỗi ngày, không tưới thẳng và trực tiếp vào bịch phôi mà chỉ phun sương tạo mưa nhẹ cho nước rơi từ trên xuống, tưới ướt vách, nóc vải và nền nhà để tạo độ ẩm không khí cần thiết ở nơi trồng. tùy theo thời tiết mà tưới nước nhiều hay ít, nếu trời mưa ẩm ướt thì không nên tưới vì lúc này độ ẩm không khí đã đủ. Nước tưới phải là nước sạch, nếu nước nhiễm phèn nhiễm mặn thì tai nấm sẽ bị biến dạng. Nước tưới quá nhiều dễ làm phôi bị úng và tạo điều kiện cho các loài nấm mốc phát triển. e. Thu hái nấm Thu hái nấm đúng tuổi, không hái nấm khi nấm còn quá non hay quá già. Nên thu khi nấm chuyển từ dạng phễu lệch sang dạng lá lục bình. Giai đoạn này nấm có giá trị dinh dưỡng cao, ít hư hỏng, có thể bảo quản tươi lâu hơn. Nên hái cả chùm nấm, không hái tách lẻ riêng từng tai nấm. Không nên để sót lại phần cuống nấm để tránh nhiễm các mầm bệnh. 2.2.3.3. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Các mẫu cấy có hệ sợi thuần khiết, tơ nấm màu trắng phát triển nhanh, mật độ hệ sợi dày, phân bố đồng đều, không bị lẫn tạp bất kì sợi nấm nào khác như nấm mốc, nấm dại hay nhiễm khuẩn, bịch phôi trở nên rắn chắc là đạt yêu cầu. Phải loại bỏ các bịch phôi bị nhiễm nấm mốc. Đo tốc độ lan tơ kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào giá thể cho đến khi ăn trắng toàn bộ bịch phôi. So sánh các nghiệm thức với nhau và nhận xét kết quả. 30
41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước vôi ngâm đến mật độ của tơ nấm Hoàng kim trên giá thể vỏ mía. Sau khi thực hiện xong thí nghiệm 3 và thu được kết quả nghiệm thức tốt nhất. Ta tiếp tục tiến hành thí nghiệm 4 để khảo xác sự ảnh hưởng của nồng độ nước vôi khi xử lý nguyên liệu vỏ mía đến tốc độ lan tơ của nấm Hoàng kim trên bịch phôi vỏ mía. 2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm Vỏ mía thu gom về được phơi khô sau đó được xử lý với nước vôi trong 15 phút. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức mỗi nghiệm thức 10 bịch, tổng số bịch phôi là 20 bịch. NT1: Ngâm nước vôi 1% trong 15 phút. NT2: Ngâm nước vôi 5% trong 15 phút. 2.2.4.2. Phương pháp thực hiện  Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu sau khi phơi khô được xử lý với nước vôi theo các nghiệm thức NT1, NT2 vì nguyên liệu ẩm thường có nhiều dinh dưỡng (đường mía) thích hợp với nấm mốc phát triển có thể gây nhiễm bịch phôi và nguyên liệu ẩm khó làm nước vôi khó xâm nhập vào nguyên liệu làm giảm hiệu quả xử lý vôi. Nước đưa vào xử lý phải là nước sạch. Lượng nước vôi ngâm phải đủ để ngập bề mặt nguyên liệu. Nguyên liệu sau khi xử lý với nước vôi được vớt ra, chất thành đống, phủ nilon và ủ trong 1 tuần. Trong quá trình ủ cần đảo đống ủ mỗi 3 ngày một lần. a. Phối trộn dinh dưỡng và vào bịch phôi Thực hiện như mục 2.2.3.2.b b. Cấy bịch phôi Thực hiện như mục 2.2.3.2.c c. Nuôi ủ tơ Thực hiện như mục 2.2.3.2.d 31
42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP d. Chăm sóc và tưới đón nấm Thực hiện như mục 2.2.3.2.e e. Thu hái nấm Thực hiện như mục 2.2.3.2.f 2.2.4.3. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Các bịch phôi có hệ sợi thuần khiết, tơ nấm màu trắng phát triển nhanh, mật độ hệ sợi dày, phân bố đồng đều, không bị lẫn tạp bất kì sợi nấm nào khác như nấm mốc, nấm dại hay nhiễm khuẩn, bịch phôi trở nên rắn chắc là đạt yêu cầu. Phải loại bỏ các bịch phôi bị nhiễm nấm mốc. Đo tốc độ lan tơ kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào giá thể cho đến khi ăn trắng toàn bộ bịch phôi. Nhận xét kết quả. 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía. 2.4.5.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 bịch, tổng số bịch phôi là 30 bịch. Các nghiệm thức của thí nghiệm 5 được bố trí như bảng 2.2. Bảng 2. 2. Các nghiệm thức của thí nghiệm 5 Thành phần dinh dưỡng (%) Nghiệm Cám Cám SA DAB MgSO4 KH2PO4 thức gạo bắp NT1 5 3 0,1 0,1 0,1 0,0 NT2 5 3 0,1 0,1 0,0 0,1 NT3 5 3 0,1 0,1 0,1 0,1 2.4.5.2. Phương pháp thực hiện a. Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu sau khi phơi khô được xử lý với nước vôi theo nghiệm thức NT1 của Thí nghiệm 3 (ngâm nước vôi 1% trong 15 phút). 32
43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyên liệu sau khi xử lý với nước vôi được vớt ra, chất thành đống, phủ nilon và ủ trong 1 tuần. Trong quá trình ủ cần đảo đống ủ mỗi 3 ngày một lần. b. Phối trộn dinh dưỡng và vào bịch phôi Sau khi nguyên liệu được xử lý, nên phối trộn nguyên liệu với các thành phần dinh dưỡng khác. Trước khi trộn dinh dưỡng cần làm ẩm nguyên liệu. Ẩm độ của nguyên liệu vào khoảng 65 – 70 %, nghĩa là nếu nắm nguyên liệu trong tay bóp thì nghuyên liệu sẽ kết khối và không có nước tràn ra kẽ tay là được Công thức phối trộn dinh dưỡng theo các NT1, NT2, NT3. Trộn đều dinh dưỡng vào nguyên liệu sau khi ủ, kiểm tra lại độ ẩm trước khi đưa vào bịch phôi. Cho nguyên liệu vào túi PE chịu nhiệt, nén chặt vừa phải. Nên đóng túi đồng loạt cho đến hết nguyên liệu, không để thừa nguyên liệu qua đêm. Mỗi túi chứa khoảng 360 – 400 g nguyên liệu. Khử trùng các bịch nguyên liệu bằng nồi hấp khử trùng với nhiệt độ 130oC trong 60 phút. Túi hấp xong phải có mùi thơm, không bị chua do lên men, nút bông chặt không ướt. Để nguội 24 giờ rồi tiến hành cấy giống. c. Cấy bịch phôi Thực hiện như mục 2.2.3.2.c d. Nuôi ủ tơ Thực hiện như mục 2.2.3.2.d e. Chăm sóc và tưới đón nấm Thực hiện như mục 2.2.3.2.e f. Thu hái nấm Thực hiện như mục 2.2.3.2.f 2.4.5.3. Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi Các mẫu cấy có hệ sợi thuần khiết, tơ nấm màu trắng phát triển nhanh, mật độ hệ sợi dày, phân bố đồng đều, không bị lẫn tạp bất kì sợi nấm nào khác như nấm mốc, nấm dại hay nhiễm khuẩn là đạt yêu cầu. Phải loại bỏ các bịch phôi bị nhiễm nấm mốc. 33
44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đo tốc độ lan tơ kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào giá thể cho đến khi ăn trắng toàn bộ bịch phôi. Nhận xét kết quả. 2.5. Phương pháp thu nhận kết quả Tốc độ lan tơ nấm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị cm. Lấy giá trị trung bình. Quan sát hình thái bên ngoài và mô tả. 2.6. Xử lý số liệu Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần, lấy giá trị trung bình. Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. 34
45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đặc điểm của hoàng kim trên môi trường thạch (giống cấp 1). Mẫu đạt chất lượng là mẫu có hệ sợi thuần khiết, tơ nấm màu trắng phát triển nhanh, mật độ hệ sợi dày, phân bố đồng đều, không bị lẫn tạp bất kì sợi nấm nào khác như nấm mốc, nấm dại hay nhiễm khuẩn. Phân lập nấm hoàng kim trên chai môi trường thạch với 1 điểm cấy trên chai đĩa. Sau 3 ngày bắt đầu có tơ nấm màu trắng mọc ra từ thịt nấm màu trắng và bám vào bề mặt thạch (hình 3.1a). Đến ngày thứ 7 tơ nấm đã lan toàn bộ bề mặt thạch trong chai, có nhiều tơ khí, tơ trắng đục (hình 3.1b). a. Sau 3 ngày. b. Sau 7 ngày. Hình 3. 1. Tơ nấm hoàng kim phân lập trên môi trường thạch Từ chai nấm đã phân lập, cấy chuyền nấm sang đĩa thạch mới (hình 3.2). Sau 2 ngày, bắt đầu có tơ nấm mọc ra khỏi bề mặt thạch, bám vào môi trường thạch mới (hình 3.2a). Tơ nấm mọc sát bề mặt thạch, ít tơ khí sinh, tơ rối bông (các hình 3.2b, 3.2c, 3.2d). Sau 10 ngày tơ nấm có hiện tượng đan lại với nhau giống hình dạng của san hô, tơ có màu vàng nhạt, lúc này tơ không còn rối bông nhiều như ban đầu nữa. 35
46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c. 7 ngày a. 2 ngày b. 3 ngày d. 9 ngày. e. 12 ngày f. 14 ngày g. 17 ngày Hình 3. 2. Tơ nấm hoàng kim cấy chuyền trên môi trường thạch. 36
47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3. 3. Nấm cấy trên môi trường thạch nghiêng (dùng giữ giống) Bảng 3. 1. Độ dài tơ nấm trên môi trường thạch (cấp 1) theo thời gian Thời gian 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (ngày) Độ dài tơ 5 6,3 8,5 10 11,2 11,5 12 13,5 14,8 nấm (mm) 100 90 92.8 80 78 70 64.5 60 50 52.5 40 41 30 29.8 20 19.8 10 11.3 5 0 Độ dài tơ nấm (mm) 0 2 4 6 8 10 12 Thời gian (ngày) Hình 3. 4.Sự tăng trưởng tơ nấm hoàng kim trên môi trường thạch (cấp 1) Nhận xét: Sau 1 ngày kể từ khi cấy giống, mẫu cấy chưa ra tơ do chúng vừa bị tổn thương và chưa thích ứng ngay được với môi trường mới. Ngày thứ 2 và 3 các sợi tơ bắt đầu vươn ra khỏi bề mặt thạch và bám vào bề mặt thạch mới, phát triển và ăn sâu xuống bề mặt môi trường. 37
48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7, sợi nấm đã thích ứng được với môi trường thạch mới, tơ nấm vươn dài ra phía trước, phân nhánh. Tơ nấm phát triển với tốc độ trung bình 10,3 mm/ ngày, đạt đường kính 52,5 mm vào ngày thứ 7. Ngày thứ 8 và 9 tơ nấm phát triển mạnh hơn với tốc độ 12,8 mm/ngày, đạt đường kính 78 mm vào ngày thứ 9. Đây là thời gian tơ nấm lan mạnh nhất. Tơ nấm tiếp tục phát triển và dừng sinh trưởng khi lan đầy trên nắp đĩa Petri (hình 3.2g). a. Tiêu bản nhuộm lactophenol b. Tiêu bản không nhuộm Hình 3. 5. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường thạch (40X) Tơ nấm mọc thẳng, sợi tơ phân nhánh nhánh nhỏ, các sợi nhánh có bề rộng nhỏ hơn sợi tơ chính. Vách tế bào nhìn rõ, ít thấy được vách ngăn giữa các tế bào nấm, không thấy được nhân ở cả 2 tiêu bản (hình 3.5). 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo đặc điểm của nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (giống cấp 2). Các mẫu cấy có hệ sợi thuần khiết, tơ nấm màu trắng phát triển nhanh, mật độ hệ sợi dày, phân bố đồng đều, không bị lẫn tạp bất kì sợi nấm nào khác như nấm mốc, nấm dại hay nhiễm khuẩn là các mẫu đạt yêu cầu làm giống cấp 2. Phải loại bỏ các mẫu cấy bị nhiễm nấm mốc. Trên môi trường hạt hệ sợi nấm lan sâu vào khối cơ chất. Tốc độ sinh trưởng của tơ nấm trên môi trường hạt rất chậm, sau khoảng 5 ngày mới thấy được độ lan sâu của hệ sợi nấm (hình 3.6 a). Sau đó, sợi nấm lan nhanh và ổn định cho đến khi đầy 38
49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP chai thủy tinh. Màu sắc và mật độ tơ nấm cũng tăng dần theo thời gian. Lúc đầu, tơ nấm thưa và nhạt màu. Về sau mật độ tơ nấm tăng dần lên, hệ sợi kết cấu chặt chẽ và các sợi bện chặt với nhau tạo màu trắng đậm rõ ràng hơn so với phần tơ ở phía trên(hình 3.6c). a 5 à b 9 à c 11 ngày d 15 ngày Hình 3. 6. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường hạt Tơ nấm vẫn tiếp tục sinh trưởng kể cả khi đã lan đầy toàn bộ chai, chủ yếu là tăng mật độ tơ nấm. Tơ nấm trong chai nấm dày hơn và màu sắc đậm dần lên (hình 3.6d). Bảng 3. 2. Độ dài tơ nấm trên môi trường hạt (cấp 2) theo thời gian Thời gian Chiều dài sợi Thời gian Chiều dài sợi (ngày) nấm (mm) (ngày) nấm (mm) 2 1,5 8 10,8 3 5 9 11,4 4 7,8 10 11,6 5 9,8 11 11,5 6 11 12 10,4 7 11,5 13 11,2 Ghi chú: Các số liệu trong bảng 3.2 là kết quả trung bình của 5 chai giống. 39
50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Độ dài tơ nấm 120 (mm) 113.5 100 102.3 91.9 80 80.4 68.8 60 57.4 46.6 40 35.1 24.1 20 14.3 6.5 0 1.5 Thời gian 0 2 4 6 8 10 12 14 (ngày) Hình 3. 7. Sự tăng trưởng tơ nấm Hoàng kim trên môi trường hạt (cấp 2) Quan sát đặc điểm hình thái của tơ nấm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40X. Sử dụng lactophenol làm tiêu bản không nguộm màu (hình 3.8a). Nhuộm màu tơ nấm bằng thuốc nhuộm Xanh methylene làm tiêu bản nhuộm màu (hình b.8b). a. Tiêu bản nhuộm lactophenol b. Tiêu bản nhuộm Xanh methylene b. Hình 3. 8. Tơ nấm hoàng kim trên môi trường hạt thóc (40X) Sợi nấm mọc thẳng dài, phân nhánh, các sợi nhánh có bề rộng nhỏ hơn sợi trục nhưng không quá rõ ràng như sợi nấm trên thạch. Vách tế bào nhìn rõ, ít thấy được vách ngăn giữa các tế bào nấm, không thấy được nhân ở cả 2 tiêu bản (hình 4.4). Sợi nấm trên môi trường hạt thóc mảnh hơn so với sợi nấm trên môi trường thạch. 40
51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Môi trường hạt lúa được chọn làm môi trường nhân giống cấp 2 cho nấm Hoàng kim do thành phần môi trưỡng dễ kiếm, dễ thao tác và môi trường này được sử dụng để nhân giống thành công rất nhiều loại nấm ăn cũng như rất nhiều loài nấm sò khác. Sau khi cấy giống từ môi trường thạch, sau ngày thứ nhất, sợi nấm chưa bung ra do vừa bị tổn thương và chưa thích ứng được ngay với môi trường mới. Đến ngày thứ 2, bắt đầu thấy tơ nấm vươn ra khỏi bề mặt thạch bị cắt. Vào ngày thứ 3, tơ nấm bắt đầu bám và xâm nhập vào môi trường mới. Từ ngày thứ 5 trở đi tơ nấm sinh trưởng và phát triển ổn định với tốc độ lan tơ 11,0 mm/ngày. Đến ngày thứ 15 thì tơ nấm lan toàn bộ chai thủy tinh. Ngày thứ 25 phần tơ nấm nửa dưới chai thủy tinh có mật độ dày hơn so với phần tơ phía trên và có màu vàng nhạt do tơ nấm bắt đầu già đi. Có thể bảo quản lạnh khi tơ nấm vừa mới lan đầy chai. Có thể thấy rõ tốc độ lan trên môi trường hạt chậm hơn môi trường thạch. Thể hiện khi so sánh bảng 3.1 và bảng 3.2 ở cùng ngày thứ 10, độ dài tơ nấm trên môi trường thạch là 92,8 mm, môi trường hạt là 80,4 mm. Có thể giải thích do môi trường thạch có nhiều chất dinh dưỡng từ dịch chiết khoai tây và các chất này ở dưới dạng đơn chất dễ hấp thụ như acid amin, đường đơn (glucose), Hơn nhiều so với môi trường hạt (giàu tinh bột). Có thể đem cấy bịch phôi sau 2 ngày tơ lan đầy chai, trước khi cấy giống nên trộn đều chai hạt để hạt meo được đồng đều nhau. 3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng trên giá thể vỏ mía. Tuy nấm hoàng kim là loài nấm gỗ có khả năng tiết ra các enzyme thủy giải mạnh phân giải lignin và cellulose nhưng xử lý vôi cho sẽ làm lỏng lẽo cấu trúc lignincellulose của vỏ mía giúp nấm thích nghi nhanh với cơ chất mới do đó rút ngắn thời gian ủ tơ. 41
52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi tơ nấm hoàng kim ăn sâu vào bịch cơ chất thì có sự thay đổi màu của vỏ mía từ màu xanh đen sang màu nâu sáng (hình 3.9) những vùng hệ sợi nấm lan qua. Tơ nấm thưa và nhạt màu ở phần đầu, trở nên đậm dần và dày hơn khi xuống đáy bịch. a. b. NT2 c. d. Hình 3. 9. Sự phát triển của tơ nấm hoàng kim trên bịch phôi theo thời gian xử lý vỏ mía 42
53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của thời gian ngâm vôi đến chiều dài của tơ nấm hoàng kim Ngày Chiều dài của tơ nấm (mm) NT1 NT2 NT3 NT4 2 4,5 3,5 4,1 4 3 10 10,3 8,7 9,2 4 10 11,6 9,5 9 5 10,7 12 11 9,8 6 11 11,5 10,5 8,5 7 10,5 10,5 11 9,5 8 10,3 11,7 10,2 10 9 11,4 11,5 11 10,8 10 10,5 12,5 10,5 9,7 11 11 12 10,7 10,5 12 11,5 12,2 11,2 10 13 10,8 12,3 11 11 Ghi chú: các số liệu trong bảng 3.3 là kết quả trung bình của 10 bịch phôi. Ký hiệu nghiệm thức xem ở mục 2.2.3.1 140 120 100 80 NT 1 60 NT 2 40 20 Chiều dài tơ nấm (mm) 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Thời gian(ngày) NT1: Ngâm vôi 1% trong 15 phút. NT2: Ngâm vôi 1% trong 24 giờ NT3: Ngâm vôi 1% trong 48 giờ NT4: Ngâm vôi 1% trong 72 giờ e Hình 3. 10. Sự ảnh hưởng của thời gian ngâm vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trong các nghiệm thức. 43
54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Từ bảng 3.3 và hình 3.10 cho thấy: Ngày thứ nhất sau khi cấy giống vẫn chưa có tơ nấm bung ra từ meo hạt do tơ nấm bị tổn thương trong quá trình cấy giống.Vào ngày thứ 2, bắt đầu có tơ nấm màu trắng bung ra từ mọi phía của meo hạt. Sau 4 ngày cấy giống thì tơ nấm đã thích nghi với nguồn cơ chất mới và có chiều hướng lan sâu mạnh mẽ vào khối cơ chất. Hình 3.10 cho thấy ở cả 4 nghiệm thức tơ nấm đều sinh trưởng và phát triển tốt, tuy có sự chênh lệch giữa các nghiệm thức nhưng không quá lớn. Trong đó: - Tốc độ sinh trưởng của tơ nấm ở nghiệm thức 2 là cao nhất (ngâm vôi 1% trong 24 giờ). Tơ nấm phát triển mạnh ngay khi mới thích nghi với môi trường cơ chất mới vào ngày thứ 4 và phát triển ổn định với tốc đô lan tơ 11,8 mm/ngày cho đến ngày thứ 13. Tơ nấm phát triển theo chiều từ trên xuống và từ ngoài vào trong. - Sinh trưởng chậm nhất là nghiệm thức 4 (ngâm vôi 1% trong 72 giờ). Tơ nấm cũng phát triển với tốc độ ổn định với tốc độ 9,9 mm/ngày kể từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 15. Theo lý thuyết thời gian xử lý vôi nguyên liệu càng dài thì cấu trúc lignocellulos càng lỏng lẽo giúp tơ nấm phân giải cơ chất thuận lợi hơn. Nguyên nhân của sự chênh lệch này có lẽ do tơ nấm không lan đều cả bên ngoài lẫn bên trong khối phôi, tức là tơ phân nhánh nhiều hơn là vươn dài về phía trước. Điều này thể hiện ở độ rắn chắc của bịch phôi. Các bịch phôi của nghiệm thức 4 rắn chắc hơn hẳn so với các bịch phôi của các nghiệm thức còn lại. - Nghiệm thức 1 (ngâm vôi 1% trong 15 phút) và nghiệm thức 3 (ngâm vôi 1% trong 48 giờ), tơ lan với tốc độ xấp xỉ nhau (2 đường biểu diễn kề sát nhau). Tuy nhiên ở nghiệm thức 3, tốc độ lan tơ từ ngày thứ 4 đến thứ 7 là 9,2 mm/ngày và từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 15 thì tăng lên 10,3 mm/ngày. Bịch phôi rắn chắc hơn so với các bịch phôi ở nghiệm thức 1. Còn nghiệm thức 1, tơ nấm lan với tốc độ ổn định 10,8 mm/ngày kể từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 15. Khối phôi có độ rắn chắc thấp nhất trong 4 nghiệm thức. 44
55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ các kết quả trên, cho thấy nghiệm thức 2 với thời gian ngâm nước vôi 24 giờ thì tơ nấm hoàng kim phát triển tốt nhất. 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nước vôi ngâm đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim. a. NT1 b. NT2 a. NT1: Vỏ mía ngâm nước vôi 1% trong 15 phút b. NT2: Vỏ mía ngâm nước vôi 5% trong 15 phút Hình 3. 11.Tơ nấm hoàng kim phát triển trên vỏ mía được xử lý các nồng độ vôi Có thể thấy rõ sự thay đổi màu của vỏ mía từ màu xanh đen sang màu nâu sáng (hình 3.11) sau khi hệ sợi nấm lan qua. Tơ nấm thưa và nhạt màu ở phần đầu, trở nên đậm dần và dày hơn khi xuống đáy bịch. 45
56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3. 4. Ảnh hưởng của nồng độ vôi ngâm đến chiều dài của tơ nấm hoàng kim Chiều dài sợi nấm Chiều dài sợi nấm Ngày (mm) Ngày (mm) NT1 NT2 NT1 NT2 2 3,5 3,7 9 11,3 13,2 3 8,2 10 10 12,3 14 4 10,5 11,2 11 11,7 14,3 5 9,5 10,5 12 12 13,8 6 10,2 11,7 13 12,1 13,5 7 10,5 12,1 14 13 14,3 8 11 12,8 15 12 13,6 180 160 140 120 100 NT1 80 NT2 60 40 Chiều dài tơ nấm (mm) 20 0 0 5 10 15 20 Thời gian (ngày) NT1: Vỏ mía ngâm nước vôi 1% trong 15 phút NT2: Vỏ mía ngâm nước vôi 5% trong 15 phút Hình 3. 12. Sự ảnh hưởng của nồng độ vôi đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trong các nghiệm thức 46
57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét: Bảng 3.4 và hình 3.12 cho thấy: Ngày thứ nhất sau khi cấy giống vẫn chưa có tơ nấm bung ra từ meo hạt do tơ nấm bị tổn thương trong quá trình cấy giống. Vào ngày thứ 2, bắt đầu có tơ nấm màu trắng bung ra từ mọi phía của meo hạt (hình 3.11). Sau 4 ngày cấy giống thì tơ nấm đã thích nghi với nguồn cơ chất mới và có chiều hướng lan sâu mạnh mẽ vào khối cơ chất. Tơ nấm lan theo chiều từ trên xuống và từ ngoài vào trong. Cả 2 nghiệm thức tơ nấm đều sinh trưởng và phát triển tốt. Trong đó: - Nghiệm thức 2 (ngâm vôi 5% trong 15 phút) tơ nấm phát triển mạnh ngay khi mới thích nghi với môi trường cơ chất mới từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 với tốc độ lan tơ trung bình 11,4 mm/ngày. Tơ nấm phát triển nhanh nhất từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 với tốc độ lan tơ trung bình 13,6 mm/ngày.Tiếp theo tơ nấm lan với tốc độ 13,8 mm/ ngày cho đến ngày thứ 15. Các bịch phôi có mật độ tơ dày, trắng đậm, hệ sợi bện chặt hơn (hình 3.10a) so với các bịch phôi ở nghiệm thức 1 (hình 3.10b). Có thể giải thích do nồng độ vôi cao nên tơ nấm hấp thu lượng Ca2+ nhiều làm vách tế bào dày hơn. - Tốc độ sinh trưởng của tơ nấm ở nghiệm thức 1 (ngâm vôi 1% trong 15 phút) ổn định với tốc 12,4 mm/ngày kể từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 15. Lớp tơ màu trắng bên ngoài thưa và nhạt màu hơn so với nghiệm thức 2. Kết quả cho thấy nghiệm thức 2 ngâm vôi 5% tơ nấm hoàng kim phát triển tốt hơn cả. 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía Có thể thấy rõ sự thay đổi màu của vỏ mía từ màu xanh đen sang màu nâu sáng (hình 3.13) sau khi hệ sợi nấm lan qua. Tơ nấm thưa và nhạt màu ở phần đầu, trở nên đậm dần và dày hơn khi xuống đáy bịch. 47
58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a. NT1 b. NT2 c. NT3 a. NT1: 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% MgSO4 b. NT2: 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% KH2PO4 Hình 3. 13. Tơ nấm hoàng kim phát triển trên giá thể bổ sung các thành phần dinh dưỡng 48
59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3. 5. Sự ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến chiều dài sợi nấm hoàng kim Chiều dài tơ nấm Chiều dài tơ nấm (mm) Ngày Ngày (mm) NT1 NT2 NT3 NT1 NT2 NT3 2 3,7 3,5 3,2 9 11,5 11,5 11,7 3 8,5 10,2 12,1 10 11,5 11,8 12,5 4 11 10,8 12 11 11,2 12,2 13,2 5 10,5 11,3 11,5 12 10,5 11,5 12,2 6 9,5 10,2 11,3 13 11,6 11,8 11,7 7 10,8 10 12 14 12,1 12,1 12,6 8 11,3 11,4 12,2 15 11,5 11,7 12,8 Ghi chú: các số liệu trong bảng 4.5 là kết quả trung bình của 10 bịch phôi. Ký hiệu nghiệm thức xem ở mục 2.2.5.1 180 160 140 120 100 NT1 80 NT2 60 NT3 40 20 Chiều dài sợi nấm (mm) 0 0 5 10 15 20 Thời gian (ngày) NT1: 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% MgSO4 NT2: 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% KH2PO4 NT3: 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% MgSO4 + 0,1% KH2PO4 Hình 3. 14. Sự ảnh hưởng của một số nguyên tố khoáng vi lượng đến tốc độ lan tơ của nấm hoàng kim 49
60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận xét Bảng 3.5 và hình 3.14 cho thấy: Ngày thứ nhất sau khi cấy giống vẫn chưa có tơ nấm bung ra từ meo hạt do tơ nấm bị tổn thương trong quá trình cấy giống. Vào ngày thứ 2, bắt đầu có tơ nấm màu trắng bung ra từ mọi phía của meo hạt. Sau 4 ngày cấy giống thì tơ nấm đã thích nghi với nguồn cơ chất mới và có chiều hướng lan sâu mạnh mẽ vào khối cơ chất. Tơ nấm lan theo chiều từ trên xuống và từ ngoài vào trong. Cả 3 nghiệm thức tơ nấm đều sinh trưởng và phát triển tốt. Trong đó: - Tốc độ sinh trưởng của tơ nấm ở nghiệm thức 1 (bổ sung 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% MgSO4) ổn định với tốc 12,1 mm/ngày kể từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 15. - Sự sinh trưởng và phát triển của tơ nấm ở nghiệm thức 2 (bổ sung 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% KH2PO4) xấp xỉ với nghiệm thức 1, đường biểu diễn của chúng lúc đầu gần như trùng nhau trên biểu đồ 3.5 và từ ngày thứ 12 trở đi tốc độ lan tơ của nghiệm thức 2 nhanh hơn nghiệm thức 1. Tốc độ lan tơ từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 là 10,6 mm/ngày sau đó tăng lên 13,4 mm/ngày từ này thứ 8 cho đến ngày thứ 15. - Tốc độ sinh trưởng và phát triển của tơ nấm ở nghiệm thức 3 (bổ sung 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% KH2PO4 + 0,1% MgSO4) là cao nhất trong 3 nghiệm thức. Tuy chênh lệch với 2 nghiệm thức còn lại không lớn, tốc độ lan tơ từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 là 11,7 mm/ngày và 11,7 mm/ngày từ này thứ 8 cho đến ngày thứ 15. Nhưng có thể thấy bổ sung kết hợp các nguyên tố khoáng Mg và K giúp tơ nấm phát triển tốt hơn. Tơ nấm vươn dài, dày và có màu trắng đậm rõ ràng so với 2 nghiệm thức còn lại. Kết quả trên cho thấy nghiệm thức 3 bổ sung 5% cám gạo + 3% cám bắp + 0,1% SA + 0,1% DAP + 0,1% KH2PO4 + 0,1% MgSO4) cho kết quả tối ưu nhất. 50
61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6. Một số thành phần hóa học trong mẫu vỏ mía phơi khô Hình 3. 15. Vỏ mía phơi khô Sau khi đo độ ẩm bằng phương pháp sấy khô, đo hàm lượng lignin bằng phương pháp Klason và hàm lượng tro bằng phương pháp nung mẫu ở nhiệt độ cao ta được kết quả như biểu đồ 3.6. Bảng 3. 6. Một số thành phần hóa học của vỏ mía phơi khô Thành phần Hàm lượng Lignin 47,05 Ẩm 18,16 Tro 8,56 Hàm lượng lignin trong vỏ mía chiếm cao nhất với 47,05%. Vỏ mía phơi khô có độ ẩm khá cao là 18,16%. Trong quá trình xử lý nguyên liệu vỏ mía đề tài tiến hành thử nghiệm ngâm vỏ mía tươi trong nước vôi 1% nhưng sau thời gian 24 giờ số vỏ mía này nhanh chóng hư hỏng, thối rửa gây mùi rất khó chịu. nguyên nhân này l à do nguyên liệu quá ẩm và còn chứa nhiều chất dinh dưỡng (đường mía) và có nhiều vi sinh vật, đồng thời nguyên liệu ẩm làm nước vôi khó xâm nhập Còn đối với vỏ mía đã phơi khô thì không có hiện tượng này, vỏ mía sau khi ngâm có màu vàng nâu và mùi thơm của rơm rạ rất dễ chịu. 51
62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.7. Quả thể nấm hoàng kim Sau thời gian ủ tơ, khi tơ nấm đã lan đầy bịch, các bịch phôi được chuyển đến nhà trồng để chăm sóc và tưới đón quả thể. Hình 3. 16. Các bịch phôi nấm hoàng kim ở nơi trồng nấm Nhà nuôi trồng nấm phải thường xuyên tưới nước (phun sương) để duy trì độ ẩm và nhiệt độ. Sau 3 ngày, bịch phôi ra quả thể. Cần khoảng 3 ngày để quả thể phát triển từ dạng san hô sang dạng lá lục bình mép dợn sóng). Cần lưu ý không nên để nấm hoàng kim to ra mới hái để có sản lượng cao, nên hái khi nấm ở dạng lá lục bình mép thẳng. Sản lượng nấm phụ thuộc vào chất lượng sợi nấm mọc trên cơ chất. Nếu hái nấm khi còn nhỏ hay hái khi nấm xòe to đều có được sản lượng như nhau. Tuy nhiên chất lượng nấm lại phụ thuộc vào kích thước của mũ nấm. Mũ nấm càng lớn (tức là càng già) thì chất lượng của nấm càng giảm. Tơ nấm bện kết lại với nhau thành quả thể, bắt đầu từ dạng san hô (hình 3.17a) đến dạng dùi trống (hình 3.17b) có phần đầu phình ra, bề mặt có một lớp sẫm màu. Dùi trống to ra ở phần đầu, lõm vào chuyển sang dạng phễu (hình 3.17c). Cuống nấm to ra, mũ nấm lệch sang một bên thành dạng bán cầu lệch (hình 3.17c). Cuống ngừng tăng trưởng, mũ vẫn tiếp tục phát triển thành dạng lá lục bình (hình 3.17d). 52
63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nếu không thu hái nấm, nấm sẽ tiếp tục già đi (hình 3.17e), sau đó bào tử không còn phun ra ngoài không khí mà bám lại dưới phiến nấm. Quả thể từ dạng san hô đến dạng bán cầu lệch có màu vàng nhạt sau đó bắt đầu đậm màu hơn ở dạng lá lục bình (hình 3.17). a. Dạng san hô b. Dạng dùi trống c. Dạng phễu d. Dạng lá lục bình e. Quả thể nấm già Hình 3. 17. Cácdạng quả thể của nấm hoàng kim 53
64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.8. Quy trình trồng nấm hoàng kim trên giá thể vỏ mía Từ các kết quả thu được có thể xây dựng quy trình trồng nấm hoàng kim trên vỏ mía như sơ đồ 3.2. Hạt thóc Nấm Vỏ mía Nấu Phân lập Phơi khô Phố i trộn dinh dưỡng Nhân giống cấp 1 Ngâm vôi (10% cám gạo + 5% cám 5% vôi/24 bắp) giờ Nhân giống cấp 2 Ủ đống Vào chai 1 tuần Cấy meo Phối trộn dinh dưỡng Hấp khử trùng (5% cám gạo + 3% cám Ủ tơ (t0: 25oC bắp + 0,1% SA + 0,1% Độ ẩm không khí: 60-70%) DAP + 0,1% KH2PO4 + Quả thể Vào bịch Tưới đón nấm Hấp khử trùng (130oC/1 giờ) Thu hoạch Sơ đồ 3.2. Quy trình trồng nấm hoàng kim trên vỏ mía 54
65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu thu được của đề tài chúng tôi đã đưa ra một số kết luận sau: - Trên môi trường thạch tơ nấm hoàng kim lan nhanh hơn môi trường hạt. Sợi nấm màu trắng, thẳng dài, phân nhánh. - Trên môi trường hạt. Tơ nấm lan nhanh, sợi nấm màu trắng, thẳng dài, phân nhánh. Mật độ tơ thưa ở đoạn đầu, tơ dày và bện chặt hơn khi càng xuống đáy bình. - Xử lý nguyên liệu bằng nước vôi 1% trong 24 giờ cho kết quả tốt nhất về độ dài tơ. Tiết kiệm thời gian xử lý vôi và ủ tơ. - Xử lý nguyên liệu với nồng độ vôi 5% cho kết quả tốt nhất. Tơ lan nhanh, mật độ tơ dày, màu đậm hơn so với xử lý vôi nồng độ 1% - Kết hợp bổ sung KH2PO4 và MgSO4 cho kết quả tốt hơn so với bổ sung đơn KH2PO4 hoặc MgSO4. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu khảo sát các thành phần của nguyên liệu ban đầu và sau khi xử lý. Nghiên cứu khảo sát các yếu tố để giữ sắc tố vàng của nấm hoàng kim bền và đâm. Thực hiện thêm các nghiên cứu phân lập nấm hoàng kim trên các môi trường PGA cải tiến khác như bổ sung thêm dịch chiết giá, dịch chiết cà rốt để tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu. Khảo sát thêm các nồng độ vôi ngâm để tìm ra nồng độ vôi cho kết quả tốt nhưng tiết kiệm hơn. Khảo sát thêm ảnh hưởng của các tỷ lệ KH2PO4và MgSO4 khác nhau hoặc bổ sung thêm các khoáng khác như Mn, Bo, trên môi trường cơ chất để tìm ra tỷ lệ bổ sung dinh dưỡng cho năng suất cao hơn. 55
66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thử nghiệm trồng nấm hoàng kim trên các môi trường cơ chất khác như vỏ bắp, vỏ hạt bông, bã cà phê, lục bình, rơm rạ, Tận dụng phế phẩm làm giá thể trồng nấm. Thử nghiệm trồng các loài nấm khác trên giá thể vỏ mía. Tiếp tục nghiên cứu dùng vỏ mía sau khi trồng nấm sò làm phân bón, trồng nấm rơm 56
67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Lê Duy Thắng (2006), “Kỹ thuật trồng nấm, tập 1. Nuôi trồng một số nấm ăn thông dụng ở Việt Nam”. Nhà xuất bản nông ngiệp TP.HCM. [2] Nguyễn Lân Dũng (2007), “Vi sinh vật học”. Nhà xuất bản Giáo dục. [3] Nguyễn Lân Dũng (2009), “Công nghệ trồng nấm I, II”. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. [4] Nguyễn Thị Thanh Kiều (2004), “Ngiên cứu sự phân hủy Lignin của một số nấm đảm và khả năng ứng dụng”. Luận án Tiến sĩ sinh học. Trường Đại học khoa học Tự Nhiên TP.HCM. [5] Bùi Xuân Đống (1977). Một số vấn đề về nấm học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. [6] Trịnh Tam Kiệt (1998). Nấm lớn ở Việt Nam. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. [7] Nguyễn Hữu Đống , Đình Xuân Linh, Nguyễn Thi Sơn , Zani Federico (2005). Nấm ăn cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp. [8] Nguyễn Thị Sáu. Giáo trình môn Kỹ thuật trồng và chế biến nấm – Đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu nước ngoài [9] Shu-Hui Hu; Jinn-Chyi Wang; Juang-Lin Lien; Ean-Tun Liaw & Min-Yen Lee (March 2006). Antihyperglycemic effect of polysaccharide from fermented broth of Pleurotus citrinopileatus. Applied Microbiology and Biotechnology. [10] Shu Hui Hu; Zeng Chin Liang; Yi Chen Chia; Juang Lin Lien; Ker Shaw Chen; Min Yen Lee & Jinn Chyi Wang (2006). Antihyperlipidemic and Antioxidant Effects of Extracts from Pleurotus citrinopileatus. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57
68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [11]Yu-Ling Lee; Gi-Wei Huang; Zeng-Chin Liang & Jeng-Leun Mau (June 2007). Antioxidant properties of three extracts from Pleurotus citrinopileatus. LWT - Food Science and Technology. [12] Ghada M. Medany (2014).Cultivation possibility of golden oyster mushroom (pleurotus citrinopileatus) under the egyptian conditions,Food Tech. Res. Inst. [9] Musieba, F. ,S. Okoth, R. K. Mibey, S. Wanjiku, K.Moraa (2013). Proximate Composition, Amino Acids and Vitamins Profile of Pleurotus citrinopileatusSinger: An Indigenous Mushroom in Kenya.American Journal of Food Technology. [13] Pandey,V. K.M. P.Singh, A. K. Srisvastava,S. K.Vishwakarmaands. Takshak (2012). Biodegradation of sugarcane bagasse by Pleurotus citrinopileatus. Cell. Mol. Bio. [14] Ohira, Ikuo (1990). A revision of the taxonomic status of Pleurotus citrinopileatus. Reports of the Tottori Mycological Institute. [15] A. G. Rosnina,Yee Shin Tan,Noorlidah Abdullah,S. Vikineswary (2015). Morphological and molecular characterization of yellow oyster mushroom,Pleurotus citrinopileatus, hybrids obtained by interspecies mating. World J Microbiol Biotechnol [16] Miyazawa M, Dejima Y, Takahashi T, Matsuda N, Ishikawa R (2011). Characteristic odor components of essential oil from dried fruiting bodies of golden oyster mushroom (Pleurotuscitrinopileatus). J Essent Oil Res. [17] Zhang Q, Xu B, Liu L, Yuan Q, Dong H, Cheng X, Lin D (2012).Analysis of genetic diversity among Chinese Pleurotus citrinopileatus Singer cultivars using two molecular marker systems (ISSRs and SRAPs) and morphological traits. World Microbiol Biotechnol. 58
69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [18] Zeng-Chin Liang, Chiu-Yeh Wu, Zheng-Liang Shieh, Shou-Liang Cheng (2009). Utilization of grass plants for cultivation of Pleurotus citrinopileatus. International Biodeterioration & Biodegradation. Tài liệu từ internet [19] Wikipedia. Truy cập 11:04 AM 5/6/2017 [20] Iowamushroom. Truy cập 9:43 PM 5/6/2017 [21] Researchgate. 9:05 AM 25/6/2017 hree_extract_from_Pleurotus_citrinopileatus [22] Shroomery. Truy cập 8:34 PM 28/6/2017 [23] Mushrooms. Truy cập 11:30 AM 28/6/2017 [24] Amazon. Truy cập 11:33 AM 28/6/2017 Mycelium/dp/B01N4A1U7Q 59
70. PHỤ LỤC 1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy khô Nguyên tắc: Dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu. Cách tiến hành: Sấy mẫu ở 100 – 1050C đến khối lượng không đổi, khi đó lượng nước tự do có trong mẫu sẽ bốc hơi hết. Tính toán: Công thức tính độ ẩm (W): W = ((M1 - M2)/M)x100% Trong đó: M1 là khối lượng cốc sứ và mẫu trước khi sấy (g) M2 là khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g) M là khối lượng mẫu đem sấy (g) Kết quả: M1 M2 M Hàm lượng ẩm (%) 59,7434 59,1984 3,0013 18,1588 2. Xác định hàm lượng lignin bằng phương pháp Klason Nguyên tắc: Đây là một phương pháp đơn giản để xác định hàm lượng lignin trong nguyên liệu gỗ. Phương pháp này sử dụng acid để thủy phân các hydrolysis thành các dạng đơn giản để phân tích. Hóa chất và dụng cụ sử dụng: Hóa chất: Acid (sử dụng 100 mL H2SO4 98% d=1,825g/mL) hòa tan trong 65,9 mL nước qua cột lọc trao đổi ion, tạo thành dung dịch acid H2SO4 72%. 1
71. Dụng cụ : - Lọ thủy tinh - Động cơ khuấy và cá từ - Ống nghiệm - Bình tam giác - Cốc crucible - Pipet các loại Cách tiến hành : - Chuẩn bị mẫu để tiến hành thủy phân : Đem cốc crucible đi sấy ở 105°C trong 6 giờ và để trong bình hút ẩm trong 1h. Sau đó cân khối lượng cốc ban đầu (m0). Cân 300 ± 10 mg cho vào bình thủy tinh (3 bình). Cho 3,00 ± 0,01 mL acid H2SO4 72% vào bình thủy tinh và khuấy trộn hoàn toàn. Đặt bình thủy tinh vào thiết bị điều nhiệt ở 30°C trong 60 ± 5 phút, khuấy bằng cá từ. Lấy 1 bình ra và pha loãng nồng độ acid đến 4% bằng cách cho thêm 84 ± 0,04 mL nước qua thiết bị trao đổi ion, trộn đều để loại bỏ các lớp nồng độ acid trong bình. Hấp nguyên liệu ở 121°C trong 60 phút. Nguyên liệu được chia ra 2 phần: Phần 1: hòa tan bởi acid, được đo bới máy UV-vis Phần 2: không hòa tan bởi acid (tro, chất trích ly, protein ) có thể xác định được. Mẫu sau khi hấp được lọc qua cốc crucible qua hệ thống lọc hút chân không. Phần rắn trong cốc được đem đi sấy ở 105°C cho đến khi khối lượng không đổi. Đem cân khối lượng cốc và mẫu được khối lượng m1. - Phân tích mẫu chứa lignin không hòa tan acid: Tiếp tục đem mẫu sau sấy đi nung ở 575°C ít nhất trong (24± 6) giờ cho đến khi mẫu thành tro trắng. Đem cân khối lượng cốc và mẫu sau nung được khối lượng m2. - Phân tích mẫu chứa lignin hòa tan acid: Lấy 50 mL mẫu dùng để đo lignin hòa tan bởi acid. Pha loãng mẫu từ 5 – 10 lần với H2SO4 4%. Đo mẫu trên máy UV-Vis với bước sóng 240nm. Lựa chọn độ hấp thụ nằm trong khoảng từ 0,7 đến 1,0 tương ứng với hệ số pha loãng. 2
72. Tính toán : AIL% = (((m1 – m0)-(m2 – m0) – mprotein)/( mmẫu - mmẫu×ᴪẩm)) ×100 ASL% = (UVabs × volumefiltrate × hệ số pha loãng × 100) / (ɛ ×( mmẫu - mmẫu×ᴪẩm) × Pathlength) Với: mprotein = 0 (protein chiếm thành phần không đáng kể) ASL: lignin hòa tan. AIL: lignin không hòa tan trong acid. UVasb = trung bình mẫu đo tại 240nm Volumefiltrate = 86,73 (thể tích sau lọc) Hệ số pha loãng: 5 ɛ = 25 (240 nm) Pathlength = 1(cm) %Lignin = %ASL + %AIL Kết quả: m0 m1 m2 mmẫu UVasb %AIL %AS %ligni (mg) (mg) (mg) (mg) L n 26455, 26577, 26472, 245,5 0,601 42,806 4,247 47,053 6 4 3 2 2 5 4 9 3. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung tro Nguyên tắc: Dùng sức nóng (550 - 6000C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong thực phẩm. Dụng cụ và hóa chất: - Lò nung điều chỉnh được nhiệt - Đèn cồn hay bếp điện độ - HNO3 đậm đặc, H2O - Cân phân tích - Bình hút ẩm - Chén nung bằng sứ 3
73. Cách tiến hành: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550 - 6000C đến trong lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g. Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu thử. Cân tất cả ở phân tích với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550 - 6000C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thường khoảng 6 - 7 giờ. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến trong lượng không đổi. Tính toán: Hàm lượng tro theo % được tính theo công thức X = ((G2 - G)×100)/(G1 - G) Trong đó G: trọng lượng chén (g) G1: trong lượng chén và mẫu trước khi nung (g) G2: trong lượng chén và mẫu sau khi nung (g) Kết quả: G1 G2 G Hàm lượng tro (%) 59,7434 56,9991 56,7421 8,563 4