›

Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto

pdf 74 trang thiennha21 12/04/2022 4360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_cac_yeu_to_anh_huong_den_kha_nang_sinh_tong_h.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis Natto Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT ThS. PHAN TRUNG HẢI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ MINH TRANG MSSV: 1211100022 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Nguyễn Như Nhứt và ThS. Phan Trung Hải. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kì gian lận nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. TP. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG
  3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của quý thầy cô đã không quản công lao khó nhọc trang bị những kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội được áp dụng những kiến thức đó vào thực tiễn thông qua đợt thực tập này. Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi nhưng đã trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho công việc sau này. Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu cùng toàn thể giáo viên giảng dạy của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM nói chung và thầy cô khoa Công nghệ sinh học nói riêng đã cho em có cơ hội được đi thực tập. - Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Như Nhứt, người đã tạo điều kiện, hướng dẫn và giúp em hoàn thành tốt bài đồ án của mình. - Em xin cảm ơn ThS. Phan Trung Hải đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thành đồ án này. Em xin tri ân sự giúp đỡ tận tình của: Các anh, chị phòng thí nghiệm Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cùng toàn thể các anh, chị các phòng ban của Công ty đã tạo mọi điều kiện hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến những người bạn của tôi, đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong học tập và ngoài cuộc sống. Sinh viên thực tập NGUYỄN THỊ MINH TRANG
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Kết quả đạt được 3 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto 5 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto 5 1.1.2. Lịch sử phát hiện 5 1.1.3. Phân bố 7 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto 7 1.2. Enzyme protease 10 1.2.1. Khái niệm về protease 10 1.2.2. Phân loại 11 1.2.3. Nguồn thu nhận 12 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis 14 1.4. Ứng dụng của protease 18 1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease 19 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.5.1.Trên thế giới 19 1.5.2. Tại Việt Nam 20 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm 22 2.1.1. Địa điểm 22 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 22 2.2. Vật liệu thí nghiệm 22 2.2.1. Nguồn vi sinh vật 22 2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm 22 2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 23 2.3. Môi trường nuôi cấy 23 2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1) 23 2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2) 23 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) 24 2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4) 24 2.4. Phương pháp tiến hành 25 2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25 2.4.2. Phương pháp tăng sinh 25 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào 25 2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease 26 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn 27 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn 27 2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 27 2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease 30 2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê 30 2.5. Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease cao 30 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau 30 2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto 31 2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng Bacillus subtilis Natto 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao 33 3.2. Khảo sát hoạt độ protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau 35 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 37 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease 37 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease 39 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease 41 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B.subtilis Natto BN2.1 43 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1. Kết luận 45 4.2. Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. candidus Aspergillus candidus A.oryzae Aspergillus oryzae B. Bacillus B. subtilis Bacillus subtilis BDN Bã đậu nành CB Cám bắp CG Cám gạo CM Cám mì CFU Colony Foming Unit DX Đậu xanh kDa kiloDalton nKat nanoKatal OD Optical Density pI Điểm đẳng điện của protein P. roquerti Penicillium roqueforti UI Đơn vị hoạt độ SPSS Phần mềm xử lý thống kê (Statistical Package for the Social Science) TLPT Trọng lượng phân tử iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis 8 Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 15 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 16 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 17 Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu 22 Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine 28 Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu 29 Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn 31 Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto 34 Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau 35 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease 40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease 41 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease 43 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sản phẩm Natto 6 Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto 7 Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. 10 Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease 11 Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto 33 Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto. 34 Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. 36 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. 38 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. 40 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. 42 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. 43 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus[40]. Bacillus subtilis Natto là một chủng vi khuẩn có ích, rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng có khả năng phát triển rất nhanh và sinh tổng hợp nhiều loại enzyme thủy phân như amylase, protease, phytase, hemicellulase, glucannase Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong món ăn truyền thống của Nhật Bản từ lâu. Khi ủ ấm với hạt đậu nành, chúng sẽ sản sinh ra enzyme nattokinase hoạt huyết mạnh, có khả năng phòng và chữa các bệnh chống viêm, ngừa bệnh tả[54] Nhiều nghiên cứu về B. subtilis Natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như nattokinase[33], elastase[32], bacillopeptidase F [45] Chủng vi khuẩn này có thể đáp ứng nhu cầu lớn về protease của ngành chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trong lĩnh vực chế biến thức ăn chăn nuôi, bổ sung men tiêu hóa, giúp vật nuôi nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn này tạo sản phẩm protease ở Việt Nam chưa nhiều. Do đó nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Natto”. Ý nghĩa đề tài nghiên cứu: - Về khoa học: Cung cấp thông tin về khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus subtilis Natto trên môi trường nuôi cấy bán rắn với thành phần là các phế phụ liệu của ngành nông nghiệp Việt Nam. - Về thực tiễn: Góp phần xây dựng quy trình sản xuất sản phẩm giàu protease, giúp đa dạng hóa sản phẩm. 1
  11. Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Do có những ưu điểm vượt trội, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto vẫn luôn được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam, một số công trình và ứng dụng tiêu biểu: - Đinh Thu Hương (2013) nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme protease từ vi khuẩn B. subtilis Natto. Kết quả cho thấy, môi trường kết hợp có 2% maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết enzyme protease 21,7% so với môi trường canh thang , nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu để thu được tủa enzyme có hoạt độ protease cao nhất: 172,5 nKat. Sau khi tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, lựa chọn được phân đoạn 10 là phân đoạn có hoạt độ protease cao nhất 27,2 nKat. Đã xác định được phân đoạn này có khả năng phân giải mạnh cơ chất fibrin và có trọng lượng phân tử khoảng 29 kDa nên có thể là enzyme nattokinase, hoạt độ enzyme khoảng 300 FU/5 ml [5]. - Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành[27]. - LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất nattokinase từ vi khuẩn B. subtilis Natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, [24] CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu nành: 3% . - Ứng dụng khả năng làm tan và chống hình thành máu đông của chủng B. subtilis Natto vào các lọai thực phẩm chức năng trên thị trường Việt Nam như: Nattospes của Công ty TNHH dược phẩm Á Âu; Đậu tương Lên Men Natto Kinaza của công ty TNHH Khoa Học Xanh Đức Thanh Mai; DOSAKA của Công ty cổ phần xuất nhập khẩu y tế DOMESCO 3. Mục tiêu nghiên cứu Chọn được chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease cao từ các chủng nghiên cứu. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Xác định một số điều kiện nuôi cấy bán rắn để chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp enzyme protease có hoạt tính cao nhất. Xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng B. subtilis Natto. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh protease cao. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis Natto khi được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các điều kiện khác nhau như thành phần cơ chất, tỉ lệ cơ chất, độ ẩm và thời gian nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng phản ứng protease của chủng Bacillus subtilis Natto. 5. Phương pháp nghiên cứu Thu thập thông tin từ sách báo và các trang mạng điện tử. Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0. Các phương pháp nghiên cứu thực hiện trong đề tài: - Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. - Phương pháp tăng sinh. - Phương pháp xác định mật độ tế bào (Phương pháp đếm khuẩn lạc). - Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease. - Phương pháp nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn. - Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson). - Phương pháp tủa enzyme protease. 6. Kết quả đạt được Đề tài với mục đích nghiên cứu thu nhận protease từ chủng cho hoạt độ enzyme protease cao nhất trong năm chủng nghiên cứu là BN1, BN2.1, BN2.2, BN2.3 và BN3. Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng sinh tổng hợp protease cao hơn so với các chủng còn lại. Môi trường nuôi cấy thích 3
  13. Đồ án tốt nghiệp hợp cho hoạt độ protease tốt nhất là bã đậu nành và cám bắp. Với các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 như: tỉ lệ cơ chất bã đậu nành: cám bắp là 5:5, thời gian nuôi cấy là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất là 60%. Chế phẩm enzyme protease tinh sạch sơ bộ từ chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 có khả năng xúc tác tốt nhất tại pH 7. 7. Kết cấu đề tài nghiên cứu Đề tài nghiên cứu bao gồm 3 chương: Chương 1: TỔNG QUAN - Sơ lược về chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto và enzyme protease. - Giới thiệu ứng dụng và tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme protease trong và ngoài nước. Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU - Trình bày địa điểm, thời gian thí nghiệm, vật liệu thí nghiệm, môi trường nghiên cứu, các phương pháp tiến hành và các phương pháp nghiên cứu. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - Trình bày kết quả đạt được và nêu ý kiến thảo luận về đề tài nghiên cứu. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Nêu kết luận và kiến nghị của nhóm thực hiện đề tài. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis Natto 1.1.1. Hệ thống phân loại Bacillus subtilis Natto Giới Bacteria Ngành Firmicutes Lớp Bacilli Bộ Bacillales Họ Bacillaceae Giống Bacillus Loài subtilis Phân loài Bacillus subtilis Natto. “Nguồn: Keith H. Steinlraus (2004)” 1.1.2. Lịch sử phát hiện B. subtilis Natto được sử dụng trong sản xuất thương mại thực phẩm Natto của Nhật Bản. Chúng được tìm thấy bởi tiến sĩ Sawamura vào năm 1906 và được đặt tên là Bacillus Natto Sawamura. Kể từ đó B. subtilis Natto được chấp thuận để dùng cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc tác dụng lên hệ thần kinh vào năm 1968, thuốc thú y vào năm 1990, phụ gia dinh dưỡng vào năm 1996. Và hiện đang thu hút sự chú ý vì gần đây đã bắt đầu được sử dụng làm thực phẩm dành cho sức khỏe[55]. Khi mới được phát hiện ra, B. subtilis Natto được coi như là một loài vi sinh vật mới. Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B. subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [28], [50], các khóa phân loại đã xếp B. subtilis Natto là một dòng thuộc loài B. subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác nhờ khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [40]. Trong dòng B. subtilis Natto còn có nhiều loại như B. subtilis Natto B – 12 [21], B. subtilis Natto OK2 [47], B. subtilis Natto NRRL 3666 [39] 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, những hạt đậu nành đã luộc chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14 - 18 giờ[25],[46]. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis Natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn B. mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc trưng và vị ngọt. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis Natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi khuẩn B. subtilis Natto[46]. Hình 1.1. Sản phẩm Natto. (Nguồn: healthplus.vn) Chức năng của B. subtilis Natto[55]: - Tăng cường vi khuẩn có lợi. - Ức chế vi khuẩn đường ruột có hại. - Sản xuất các enzyme phân hủy protein và tinh bột - Xây dựng hệ thống vitamin nhóm B 6
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Phân bố B. subtilis Natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis Natto có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương. Vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [40]. 1.1.4. Đặc điểm của Bacillus subtilis Natto 1.1.4.1. Đặc điểm hình thái B. subtilis Natto là trực khuẩn hiếu khí bắt màu tím khi nhuộm Gram, nội bào tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [22],[23]. Bào tử Tế bào vi khuẩn Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis Natto (độ phòng đại 100 lần). “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” 1.1.4.2. Đặc điểm sinh lý B. subtilis Natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis Natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 50oC), tối thích là 37oC. Ở 55oC, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly 7
  17. Đồ án tốt nghiệp giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40oC, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0oC. B. subtilis Natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 - 7,6. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [23]. 1.1.4.3. Đặc điểm sinh hoá B. subtilis Natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose, saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là protein và amino acid. B. subtilis Natto có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginin, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonin, tryptophan, phenylalanin và methionin [23]. Bảng 1.1. Kết quả phản ứng sinh hóa của chủng B. subtilis Phản ứng sinh hóa Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) 1.1.4.4. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis Natto Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều nhóm enzyme ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzyme γ– transpeptidase theo Noda năm 1989[30] và Ogawa năm 1991[52]; amylase theo Yamane K năm 1974 [31]; phytase theo Kerovuo J năm 1998 [29], Shimizu M năm 1992 [36]; cellulase theo Sun Yan năm 2011 [48]; và nhóm enzyme được nghiên cứu nhiều nhất là protease [21],[ [33],[34],[50],[53]. Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B. subtilis Natto như sau: o Nattokinase: là một enzyme thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27,7 kDa đến 29 kDa [21],[33]. Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học. o Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20 kDa, pI = 8,7 [42]. Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8 kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 50oC; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [32]. o Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34 kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His, Asp[45]. o Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; pH 10 và nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là 55oC, pI = 3,9. Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Asp33, His81, Ser259 [49],[53]. 9
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Enzyme protease 1.2.1. Khái niệm về protease[1] Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO - NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide. “Nguồn: Đinh Thu Hương (2013)[7]” Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein,“ polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ: Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase. Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit. Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc 10
  20. Đồ án tốt nghiệp điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.4. Cấu trúc không gian enzyme protease. “Nguồn: Tống Ngọc Triêm(2010)[16]” 1.2.2. Phân loại [9] Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: o Protease – xerin o Protease – thiol o Protease – kim loại o Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: o Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. 11
  21. Đồ án tốt nghiệp o Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. o Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Trong bốn protease kể trên, các protease - xerin và protease - thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của amino acid. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20,000 – 27,000 Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44,000), Asp, oryzae OUT 5038 (52,000). Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33,800 – 48,400). Protease thiol và nhiều protease - acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30,000 - 40,000 Dalton. 1.2.3. Nguồn thu nhận Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống . 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Enzyme protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật do enzyme thu nhận từ nguồn thực vật và động vật thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau: Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao. Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp. Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme. Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác. Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau[9]. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis[7],[16] Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, độ thông khí và thành phần môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp, mỗi loài có nhiệt độ thích hợp khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme đều không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ tối ưu của Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme protease là 37oC. Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp nuôi cấy chìm, pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến đến sự tích lũy protease trong môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện rất rõ ở các loài thuộc chi Bacillus. pH môi trường có thể thay đổi sau khi khử trùng hoặc trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH tối ưu cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme protease của Bacillus subtilis là 7,0 - 8,0. Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp: + Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinh tổng hợp protease. + Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các vi sinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976). Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính của protease có thể 14
  24. Đồ án tốt nghiệp giữ được trong khoảng từ 60 - 82 giờ tuy nhiên hoạt tính sẽ giảm dần theo thời gian. Hoạt động của protease chỉ mạnh trong khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn. Protease của Bacillus subtilis sinh tổng hợp hoạt động tốt nhất trong khoảng thời gian 46 - 68 giờ. Ảnh hưởng của nguồn carbon: nguồn carbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các glucid: monosaccharide, disaccharide và cả polysaccharide (tinh bột), đặc tính tác dụng của nguồn carbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn carbon tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Ở vi khuẩn Bacillus subtilis, quá trình tổng hợp protease xảy ra khá mạnh khi nguồn carbon là tinh bột với nồng độ khoảng 8%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống còn 2% sẽ làm giảm một phần hoạt tính trong quá trình phân giải protein của dịch môi nuôi cấy. Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 Nguồn carbon Hoạt tính protease (U/ml) Trisodium citrate 0,00 Glucose 678 Tinh bột hoà tan 596 Cám gạo 407 Trấu 515 Cám mì 541 Bột bắp 368 “Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008)[37] ” Ảnh hưởng của nguồn nitrogen: các chất có thể dùng làm nguồn nitrogen trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối vô cơ. Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng nitrogen của HNO3. + Nguồn nitrogen hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các 15
  25. Đồ án tốt nghiệp nguồn nitrogen thường dùng là: các loại bột khác nhau, nước chiết cám, nấm men tự phân, pepton và protein. Trong các nguyên liệu này đều có hàm lượng amino acid tương đối thấp. + Khi sử dụng phối hợp nguồn nitrogen hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình sinh tổng hợp protease (Âu Thị Bích Phượng, 2006). Theo Ngô Thị Thanh Nhàn (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis 61 tác giả đã dùng các nguồn nitrogen khác nhau như: NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl cao nấm men, cao thịt và phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton với các nguồn nitrogen vô cơ khác. Kết quả là sự phối hợp giữa nguồn nitrogen hữu cơ pepton và KNO3 đạt giá trị hoạt tính cao nhất là 0,038 UI/ml so với các nguồn khác. + Khi cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, hoạt lực enzyme protease tăng 22 - 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung. Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml) NaNO3 198 KNO3 245 NH4H2PO4 242 (NH4)2HPO4 175 (NH4)2SO4 60,8 NH4NO3 90,1 NH4HCO3 107 NH4Cl 19,6 “Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]” 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.4. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen hữu cơ lên hoạt độ protease của chủng Bacillus licheniformis N-2 Nguồn nitrogen Hoạt tính protease (U/ml) Mạch nha 333 Casein 464 Cao nấm men 551 Peptone 470 Cao thịt 445 Urea 0,00 “Nguồn: Muhammad Nadeem và cộng sự (2008) [37]” Ảnh hưởng của khoáng: phosphore và sulphur có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease. Nói chung, phosphore vô cơ có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình tổng hợp enzyme thủy phân nhờ tính chất đệm của nó. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: các yếu tố vi lượng như NaCl và vitamin cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các muối chloride, nitrate, amonium có ảnh hưởng xấu đến quá trình tổng hợp protease. Ảnh hưởng của amino acid: các amino acid có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Gly, Ala, Met và Leu có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A.oryzae 251 - 90 đến 6 - 9% và nguyên chủng A.oryzae 132 - 63 tới 7 - 24%. Nhiều amino acid có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme là Val, Glu và isoleucine trong đó Val ức chế tổng hợp enzyme ở Bacillus megaterium 60%. Còn đối với Bacillus subtilis các amino acid ức chế trong quá trình này là Gly, Met, Glu, Ala, Leu Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường bổ sung các chất cảm ứng, các chất này thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Casein thuộc nhóm 17
  27. Đồ án tốt nghiệp protein chủ yếu có trong sữa và thường dùng làm chất cảm ứng cho vi khuẩn sản xuất protease[5]. 1.4. Ứng dụng của protease[4] Trong Y học: Sử dụng nhiều protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương. Trong chế biến thủy sản: Trong chế biến nước mắm sử dụng enzym protease thực vật ( bromelain, papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong công nghiệp sữa : Sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Ví dụ : Renin, Pepsin, và một số protease vi sinh vât: A. candidus, P. roquerti, B. mensentericus Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy: Protease làm giảm thời gian đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc, protease của A. oryrae dùng thủy phân protease trong hạt ngủ cốc tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ da khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen thành phần làm da dị ứng. Protease được sử dụng tách từ vi khuẩn (B. mensertericus, B.subtilis), nấm mốc và xạ khuẩn Trong công nghiệp dệt: Đây là protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatine) để sợi được được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. Một số ứng dụng khác: 18
  28. Đồ án tốt nghiệp + Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. + Protease có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzym dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. + Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm + Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh 1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protease 1.5.1.Trên thế giới Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 - 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của Xạ khuẩn. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996). Junguo Liu và cộng sự (2005) nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng B. subtilis Natto NLSSE. Khảo sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat, casein, pepton từ đậu nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, saccharose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20g/l. Tối ưu hóa 6 nhân tố dinh dưỡng: nguồn C, N, MgSO4.7H2O, KH2PO4.3H2O, cao nấm men và CaCl2. Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1,300U/ml 19
  29. Đồ án tốt nghiệp với thành phần môi trường tối ưu (g/l) : pepton đậu nành: 8,28, CaCl2: 0,64 và cao nấm men: 0,74 [27]. Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các nhân tố được chọn để khảo sát: glucose, pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ. Hoạt tính đạt 3,194U/ml với thành [51] phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% . Weng và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cải thiện tính bền nhiệt và hạn chế sự oxy hóa Nattokinase tái tổ hợp ở E.coli bằng đột biến điểm: thay thế Methioni tại vị trí 222 (vì gần vị trí xúc tác Ser221 của enzyme) bằng Alanin đã giảm khả năng bị oxy hóa enzyme này[35]. 1.5.2. Tại Việt Nam Các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế. “Nghiên cứu ứng dụng protease Bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease từ B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 50oC. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme protease từ ruột cá Basa. Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/g CKNT (chất khô nội tạng) trong điều 20
  30. Đồ án tốt nghiệp kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút[3]. Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus sp. 7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase 470FU/g trên môi trường đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto[13]. 21
  31. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm 2.1.1. Địa điểm Thực hiện tại phòng thí nghiệm – chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương, kho C2 – lô D – Tổng kho Sóng Thần – KCN Sóng Thần 1, huyện Dĩ An. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Từ 16/5/2016 đến 7/8/2016. 2.2. Vật liệu thí nghiệm 2.2.1. Nguồn vi sinh vật Năm chủng vi khuẩn được cung cấp bởi chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương. Bảng 2.1. Danh sách các chủng nghiên cứu Ký hiệu Tên chủng BN 1 Bacillus subtilis Natto 1 BN 2.1 Bacillus subtilis Natto 2.1 BN 2.2 Bacillus subtilis Natto 2.2 BN 2.3 Bacillus subtilis Natto 2.3 BN 3 Bacillus subtilis Natto 3 2.2.2. Cơ chất dùng trong thí nghiệm Bã đậu nành, cám bắp, cám mì, cám gạo và đậu xanh được cung cấp bởi chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương. 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 2.2.3.1. Hoá chất Các hoá chất do phòng thí nghiệm – chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cung cấp. 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm - Dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, bình định mức, erlen - Thiết bị thí nghiệm: tủ sấy, tủ lạnh, máy lắc, máy đo OD, lò viba, bể ổn nhiệt, máy li tâm 2.3. Môi trường nuôi cấy 2.3.1. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton agar (MT1)[18] Công thức môi trường: Giá đậu 100g Glucose 50g Pepton 10g Agar 20g Nước cất đủ 1000 ml Cách thực hiện: Rửa sạch giá, cân 100g giá đậu, đun đến khi sôi thì vặn nhỏ lửa, tiếp tục nấu trong 20 phút. Lọc lấy nước chiết, sau đó bổ sung thêm nước cho đủ 1000 ml. Hoà tan glucose, pepton và agar vào dung dịch trên ,sau đó vừa đun vừa khuấy đều. Khi dung dịch vừa sôi thì phân vào các dụng cụ và hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút. 2.3.2. Môi trường nước chiết giá đậu đường pepton (MT2)[18] Công thức môi trường: Giá đậu 100g Glucose 50g Pepton 10g Nước cất đủ 1000 ml 23
  33. Đồ án tốt nghiệp Cách thực hiện: Làm tương tự như MT1 nhưng không bổ sung agar. Đong 200 ml môi trường vào các chai nước biển, đem hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút. 2.3.3. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease (MT3) [11] Công thức môi trường: Casein 4g Glucose 0,05g Peptone 0,2g NaCl 3g K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g MgSO4.4H2O 0,1g Agar 15 Nước cất đủ 1000 ml Cách thực hiện: Nấu cách thuỷ Casein trong 50ml đệm Sorensen cho đến khi tan. Hoà dung dịch trên vào môi trường đã bổ sung các chất khoáng và định mức cho đủ 1000 ml. Sau đó hoà tan agar vào dung dịch và đun cho tới khi agar tan. Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút. 2.3.4. Môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease (MT4)[6] Công thức môi trường: Bã đậu nành 200g Cám bắp 200g MgSO4 0,2 g KH2PO4 0,4 g Diamoniphosphate 0,8 g CaCO3 2,4 g 24
  34. Đồ án tốt nghiệp NaCl 1,44g ZnSO4 0,0014g Nước 60% (w/w) Cách thực hiện: Trộn bã đậu nành và cám bắp lại với nhau rồi cho 30g vào erlen. Bổ sung 37 ml nước đã hoà tan các khoáng chất vào các erlen. Hấp khử trùng ở 1 atm trong 30 phút. 2.4. Phương pháp tiến hành 2.4.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật[18] Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn cấy vào môi trường thạch nghiêng và ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đi bảo quản lạnh. Cấy chuyền hàng tháng. 2.4.2. Phương pháp tăng sinh[18] Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chứa môi trường nườc chiết giá đậu đường pepton. Nuôi cấy lắc với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ ở 37oC. Dịch giống có màu vàng nâu, thơm ngái đặc trưng. 2.4.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào (phương pháp đếm khuẩn lạc)[2] 2.4.3.1. Chuẩn bị: Đổ môi trường MT1 đã hấp khử trùng vào các đĩa petri vô trùng. Để 2 - 3 ngày cho bề mặt môi trường khô ráo. Dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,85%): hòa tan 0,85 g NaCl trong 1000 ml nước cất thành, phân vào mỗi ống nghiệm 9 ml. Khử trùng ở áp suất 1 atm trong 30 phút. 2.4.3.2. Cách tiến hành: Dùng nước muối sinh lý vô trùng pha loãng mẫu tuần tự thành các nồng độ thập phân (10-1, 10-2, 10-3, ). Sau đó, dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển dịch chứa giống đã pha loãng vào bề mặt đĩa petri chứa môi trường MT1. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng que trang trải cho dịch khuẩn đều trên bề mặt môi trường thạch khô. Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ. Sau khi ủ tiến hành quan sát và đếm khuẩn lạc. Đếm các đĩa có khuẩn lạc từ 30 đến 300. Số vi khuẩn A trên gam hoặc ml đươc tính theo công thức: A (CFU/ml) = (N1/(n1.V1.f1) + N2/(n2.V2.f2) + + Ni/(ni.Vi.fi))/i Với: A: là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc, CFU) vi khuẩn trong 1ml mẫu. Ni: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa tại nồng độ i. ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i. V: là thể tích dịch mẫu cấy vào trong môi trường đĩa (ml). fi: là độ pha loãng tương ứng. 2.4.4. Phương pháp định tính khả năng tổng hợp protease[12] 2.4.4.1. Nguyên tắc Khi protease tác dụng lên cơ chất casein trong môi trường thạch, Casein bị phân giải làm cho độ đục của môi trường giảm đi, môi trường trở nên trong suốt. 2.4.4.2. Cách tiến hành: Chuẩn bị các đĩa petri có chứa khoảng 20 ml môi trường thạch Casein đã được đục lỗ với đường kính 12 mm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được nuôi cấy lắc tăng sinh cho vào lỗ đã đục ở đĩa petri. Sau 48 giờ ủ ở 37oC, tráng dung dịch Lugol. Quan sát vòng phân giải tạo thành. Nếu thấy xuất hiện vòng phân giải trong suốt xung quanh lỗ thạch, tức là Casein đã bị phân giải. Như vậy, chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp protease. Đo đường kính vòng phân giải (ký hiệu D) và lỗ khoan (ký hiệu d). Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng vi khuẩn được tính bằng đường kính vòng phân giải (ΔD). Các giá trị (ΔD) càng lớn thì khả năng sinh enzyme của các chủng càng mạnh. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp ΔD = D - d Trong đó: D: đường kính vòng phân giải (mm). d: đường kính lỗ thạch (mm). 2.4.5. Phương pháp nuôi cấy bán rắn[4] Cấy 1 ml dung dịch tăng sinh Bacillus subtilis Natto có mật độ tế bào 106CFU/ml vào môi trường bán rắn, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Canh trường được sấy ở 40 - 45oC đến độ ẩm 5 – 8%. 2.4.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết từ nuôi cấy bán rắn[17] Cân 10 g canh trường đã sấy khô hoà trong 100 ml nước cất, đem lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong 15 phút. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút, ta có dịch enzyme pha loãng 10 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính protease. 2.4.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease (Phương pháp Anson)[17] 2.4.7.1. Nguyên tắc Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các Tyrosine và Tryptophan hoà tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng Tyrosine và Tryptophan hoà tan bởi thuốc thử Folin. 2.4.72. Hoá chất Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ 250 ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M: hoà tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6: trộn chung 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thuỷ 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100 ml. Dung dịch TCA 10% : hoà tan 10 g TCA trong nước cho đủ 100 ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hoà tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml. Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:2). Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HClđđ với nước cho vừa đủ 250 ml. Dung dịch Tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 500ml. Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2N: pha loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml . 2.4.7.3. Cách tiến hành: Bảng 2.2. Dựng đường chuẩn Tyrosine Ống nghiệm Dung dịch hoá chất 0 1 2 3 4 5 Lượng Tyrosine (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch Tyrosine chuẩn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1mM (ml) Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Ống 0 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thử thật (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (µM) và OD ( OD = ODTT – ODTK). 28
  38. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu Ống nghiệm Dung dịch hoá chất Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 2,5 2,5 Dung dịch TCA 10% (ml) 0 2,5 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0,5 0 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút. Dung dịch TCA 10% (ml) 2,5 0 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0 0,5 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm. 2.4.7.4. Cách tính: Định nghĩa đơn vị Anson: Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (35,5oC; pH 7,6 ) thuỷ phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hoà tan trong TCA , phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1 µM Tyrosine trong đường chuẩn. Với: V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (5,5 ml). v: thể tích dịch enzyme phản ứng (0,5 ml). 29
  39. Đồ án tốt nghiệp t: thời gian thuỷ phân (30 phút). K: độ pha loãng mẫu. x: lượng µM Tyrosine suy ra từ đường chuẩn. 1UI (Anson) = 1µmol Tyrosine/ml/phút; hoặc = 1µmol/mg/phút. HT: hoạt tính enzyme. 2.4.8. Phương pháp tủa enzyme protease[18] Chọn canh trường có hoạt độ cao đã sấy khô, xay nhuyễn. Hòa tan 1 g canh trường khô vào 100 ml nước, lắc 200 vòng/phút trong 30 phút để enzyme từ canh trường khô tan vào nước. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch thu được lọc phần nổi bỏ phần cặn. Tủa enzyme trong phần dịch nổi đã lọc với cồn 96% lạnh theo tỉ lệ thể tích enzyme với cồn là 1:3, giữ lạnh trong 30 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút. Thu phần cặn, bỏ phần dịch nổi. Phần cặn được sấy khô và bảo quản. 2.4.9. Phương pháp xử lý thống kê Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để tìm hiểu sự tác động về ý nghĩa thống kê của yếu tố thí nghiệm và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức. 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Sàng lọc chủng Bacillus subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease cao Mỗi loài B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp enzyme protease khác nhau, vì vậy nhóm thực hiện tiến hành nghiên cứu định tính các chủng B. subtilis Natto, dựa vào kích thước vòng phân giải để xác định được chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao. 2.5.2. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau Môi trường dinh dưỡng thích hợp là yếu tố quan trọng giúp vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cao, trong đó mỗi thành phần cơ chất mang nguồn dinh dưỡng khác nhau kích thích cho sự phát triển và tạo khả năng sinh enzyme. Vì vậy nhóm 30
  40. Đồ án tốt nghiệp thực hiện tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease của các chủng Bacillus subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau nhằm lựa chọn môi trường bán rắn thích hợp nhất cho B. subtilis Natto. Cấy chủng B. subtilis Natto đã xác định ở mục 2.5.1 vào môi MT4 có thành phần cơ chất thay đổi theo bảng 2.2. Bảng 2.4. Thành phần khối lượng của các cơ chất trong môi trường bán rắn. Thành phần Bột đậu Bã đậu xanh Cám bắp Cám gạo Cám mì nành Nghiệm (BDX) (CB) (g) (CG) (g) (CM) (g) (BDN) (g) thức (g) NT1 15 0 15 0 0 NT2 15 0 0 15 0 NT3 15 0 0 0 15 NT4 0 15 15 0 0 NT5 0 15 0 15 0 NT6 0 15 0 0 15 Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Anson. Dựa vào kết quả, ta tìm được thành phần môi trường tốt nhất và chủng sinh protease cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto 2.5.3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn Mỗi loài B. subtilis Natto có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp enzyme với mỗi loại cơ chất nuôi cấy khác nhau. Ngoài ra, khả năng sinh tổng hợp enzyme còn phụ thuộc vào thành phần và tỷ lệ đối với từng loại cơ chất riêng biệt. Mục đích của thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Nuôi cấy chủng B. subtilis Natto sinh tổng hợp protease cao với môi trường nuôi cấy có thành phầm cơ chất thích hợp đã tìm thấy ở mục 2.5.2. Trong đó tỉ lệ khối lượng 2 thành phần cơ chất có sự thay đổi 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, và 8:2. Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson. Lựa chọn được môi trường có tỷ lệ cơ chất thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp enzyme protease tối ưu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.5.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng về độ ẩm của môi trường bán rắn Nuôi cấy chủng B. subtilis Natto xác định từ mục 2.5.3.1. trên môi trường bán rắn với độ ẩm thay đổi: 40%, 50%, 60% và 70%. Thu nhận dịch chiết protease và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson. Môi trường nuôi cấy với độ ẩm cho hoạt độ protease mạnh là điều kiện thích hợp để khảo sát thí nghiệm tiếp theo. 2.5.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy bán rắn Ở mỗi thời điểm khác nhau, vi khuẩn đều cho lượng enzyme tổng hợp khác nhau. Vì vậy sau khi nuôi cấy chủng B.subtilis Natto theo điều kiện xác định ở thí nghiệm trên, các chủng sẽ được ủ ở nhiệt độ phòng sau các khoảng thời gian khác nhau: 12, 24, 36, 48, 60, 72 và 84 giờ, để khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy bán rắn lên khả năng tổng hợp enzyme protease. 2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác enzyme protease của chủng Bacillus subtilis Natto Sử dụng enzyme protease đã tinh sạch sơ bộ. Tiến hành đo hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Anson với giá trị pH thay đổi từ 6,0 – 8,0. Lựa chọn pH thích hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 32
  42. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sàng lọc chủng B. subtilis Natto có khả năng tổng hợp protease cao Cấy 5 chủng Bacillus subtilis Natto vào môi trường thạch đĩa casein. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 - 33oC). Sau 48 giờ, tráng lugol và quan sát đĩa thạch. Kết quả được trình bày theo hình 3.1, bảng 3.1 và biểu đồ 3.1. Hình 3.1. Khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng Bacillus subtilis Natto. A: Chủng BN1; B: Chủng BN2.1; C: Chủng BN2.2; D: Chủng BN2.3; E: Chủng BN3; F: Mẫu đối chứng. 33
  43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto Chủng D trung bình (mm) BN1 7,00 1,73c BN2.1 20,3 0,58a BN2.2 12,3 0,58b BN2.3 12,7 1,53b BN3 13,0 1,73b Mẫu đối chứng 0,00 0,00d Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 25,00 20,3 20,00 15,00 12,3 12,7 13,0 10,00 ∆Dtb (mm) ∆Dtb 7,00 5,00 0,00 0,00 BN1 BN2.1 BN2.2 BN2.3 BN3 Mẫu đối chứng Chủng Biểu đồ 3.1. Kích thước đường kính vòng phân giải casein của các chủng B. subtilis Natto. Dựa vào kích thước vòng phân giải, nhận thấy các đĩa có chủng B. subtilis Natto so với mẫu đối chứng không chứa khuẩn, tất cả đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Trong đó chủng BN1 cho khả năng phân giải casein thấp hơn các chủng còn lại với đường kính vòng phân giải là 7,00 mm. Các chủng BN2.2, 34
  44. Đồ án tốt nghiệp BN2.3 và BN3 có khả năng phân giải casein cao hơn BN1 nhưng không khác biệt về mặt thống kê. Chủng BN2.1 cho khả năng phân giải casein mạnh với đường kính vòng phân giải là 20,3mm, cao hơn khoảng 36 - 39% so với các chủng BN2.2, BN2.3, BN3. Kết quả trên cho thấy, mỗi chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease khác nhau. Trong đó, chủng BN 2.1 có khả năng sinh enzyme protease cao nhất, do đó được lựa chọn để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau Thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Mục đích của thí nghiệm này nhằm khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng BN2.1 trên các môi trường nuôi cấy có sự kết hợp giữa các nguồn cơ chất khác nhau. Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau Thành phần môi trường Hoạt độ trung bình (UI/g) BDN:CB 0,80 0,13a BDN:CG 0,66 0,03abc BDN:CM 0,68 0,08abc DX:CB 0,62 0,08bc DX:CG 0,52 0,12c DX:CM 0,77 0,03ab Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp 0,90 0,80 0,77 0,80 0,66 0,68 0,70 0,62 0,60 0,52 0,50 0,40 0,30 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,10 0,00 BDN:CB BDN:CG BDN:CM DX:CB DX:CG DX:CM Môi trường Biểu đồ 3.2. Hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 khi sử dụng các thành phần nuôi cấy khác nhau. Theo kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, với mỗi môi trường nuôi cấy khác nhau thì chủng vi khuẩn BN2.1 cho khả năng sinh tổng hợp protease khác nhau. Ở môi trường DX:CG, chủng BN2.1 cho hoạt độ enzyme thấp hơn các môi trường còn lại đạt 0,52 UI/g. Trong khi đó, môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất đạt 0,80 UI/g. Với ba môi trường nuôi cấy chứa thành phần là bã đậu nành thì môi trường BDN:CG cho hoạt độ protease thấp nhất chỉ đạt 0,66 UI/g, môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn 2 môi trường còn lại. Bên cạnh đó, những môi trường chứa thành phần là đậu xanh thì môi trường DX:CG cho hoạt tính enzyme protease thấp hơn môi trường DX:CB và DX:CM. Môi trường DX:CM cho hoạt tính cao hơn 2 môi trường còn lại với 0,77 UI/g. Qua đó cho thấy, hai môi trường BDN:CB và DX:CM là môi trường thích hợp để chủng BN2.1 sinh tổng hợp enzyme protease cao. Môi trường BDN:CB cho hoạt độ protease cao hơn môi trường DX:CM, tuy nhiên không khác biệt về mặt thống kê. Kết quả nghiên cứu tương tự với báo cáo của Abdelnaser S.S. Ibrahim và cộng sự (2009) khi chủng Bacillus halodurans tổng hợp protease trên môi trường đậu nành cao hơn trên môi trường cám mì. Một nghiên cứu khác của U.O.George-Okafor và cộng sự (2012) 36
  46. Đồ án tốt nghiệp cho thấy, chủng Bacillus sp. Sw-2 khi nuôi cấy trên đậu nành cũng cho hoạt độ protease cao hơn so với các môi trường còn lại. Sự chênh lệch hoạt độ giữa các môi trường này có thể là do sự kết hợp giữa độ thoáng khí và nguồn dưỡng chất của các thành phần cơ chất khác nhau. Đậu xanh là nguồn nguyên liệu tương đối đắt tiền, trong khi đó bã đậu nành là nguồn phế phụ liệu có giá thành rẻ hơn. Vì vậy, để tiết kiệm chi phí sản xuất và tận dụng nguồn phế phụ liệu nông nghiệp là bã đậu nành, thông qua kết quả thí nghiệm, nhóm thực hiện lựa chọn bã đậu nành và cám bắp là nguồn cơ chất tối ưu để thu nhận enzyme protease từ chủng BN2.1. 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn lên khả năng tổng hợp protease Chủng BN2.1 được nuôi cấy trên môi trường bán rắn đã chọn là BDN:CB, với các tỉ lệ khối lượng thành phần cơ chất thay đổi lần lượt: 2:8; 3:7; 4:6; 5:5; 6:4; 7:3 và 8:2. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.3. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease Tỉ lệ Hoạt độ trung bình (UI/g) 2:8 0,39 0,05c 3:7 0,50 0,13bc 4:6 0,58 0,04abc 5:5 0,75 0,10a 6:4 0,61 0,10ab 7:3 0,57 0,16abc 8:2 0,48 0,12bc bc Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 0,80 0,75 0,70 0,58 0,61 0,60 0,57 0,50 0,48 0,50 0,39 0,40 0,30 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,10 0,00 2:8 3:7 4:6 5:5 6:4 7:3 8:2 Tỉ lệ BDN:CB Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ BDN:CB trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Quan sát kết quả ở bảng 3.3, nhận thấy hoạt độ enzyme có sự thay đổi theo thành phần cơ chất của môi trường nuôi cấy. Cụ thể, khi ở tỉ lệ 2:8 hoạt độ protease đạt 0,39 UI/g, ở tỉ lệ 3:7 thì tăng lên mức 0,50 UI/g. Tuy nhiên, từ tỉ lệ 4:6 đến tỉ lệ 7:3 hoạt độ protease không chênh lệch vê mặt thống kê. Khi tăng lượng bã đậu nành đến tỉ lệ 8:2, hoạt độ protease chỉ đạt 0,48 UI/g. Nghiên cứu của Trần Ngọc Hùng (2013) cho thấy chủng B. subtilis Ba-15 tổng hợp protease tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa nguồn cơ chất bã đậu nành và bột bắp với tỉ lệ 2:8. Theo Nguyễn Đức Lượng (2012), tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối của vi sinh vật và sự tạo thành các enzyme thuỷ phân. Chỉ khi nào môi trường có đủ lượng carbon, nitơ cần thiết mới tích luỹ được lượng enzyme lớn. Bã đậu nành không chỉ là nguồn cung cấp nitơ chính mà còn tạo độ thoáng khí cần thiết cho môi trường bán rắn. Có thể thấy bã đậu nành là một nguồn cơ chất kích thích sự sinh tổng hợp enzyme protease. Nhưng khi nồng độ cơ chất quá cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất, gây ra sự ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme này. Như vậy, mỗi loài vi khuẩn đều có nhu cầu khác nhau về độ thoáng khí cũng như nguồn dinh dưỡng từ thành phần môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ 4:6 đến 7:3 tuy hoạt tính không khác biệt về thống kê nhưng xét về năng suất thu được canh trường thì tỷ lệ 5:5 cho năng suất cao hơn so với 3 tỷ lệ phối trộn còn lại. Vì vậy đối với chủng đối với chủng BN2.1, tỉ lệ 5:5 của BDN:CB cho hoạt độ protease cao nhất được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease Thực hiện nghiên cứu độ ẩm môi trường bán rắn với điều kiện nuôi cấy đã chọn ở trên, trong đó độ ẩm môi trường thay đổi 40, 50, 60 và 70%. Kết quả được trình bày theo bảng 3.4 và biểu đồ 3.4. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp enzyme protease Độ ẩm (%) Hoạt độ trung bình (UI/g) 40 0,02 0,01d 50 0,38 0,07c 60 0,79 0,14a 70 0,57 0,10b Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 0,90 0,79 0,80 0,70 0,57 0,60 0,50 0,38 0,40 0,30 0,20 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,10 0,02 0,00 40 50 60 70 Độ ẩm (%) Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp protease. Theo Ramesh (1990), độ ẩm ban đầu ảnh hưởng đến sự sản sinh các loại enzyme thủy phân khi nuôi ở môi trường bán rắn vì nó ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của sinh vật. Từ kết quả cho thấy, độ ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ protease, độ ẩm 40% cho hoạt độ thấp nhất là 0,02 UI/g, hoạt độ tăng dần đến độ ẩm 60% thì chủng BN2.1 cho hoạt độ protease mạnh hơn đạt 0,79 UI/g, cao gấp đôi so với ở độ ẩm 50%. Tuy nhiên sự gia tăng này không kéo dài, với 70% ẩm, hoạt độ protease giảm đáng kể, chỉ đạt 0,57 UI/g. Độ ẩm của môi trường nuôi cấy là một 40
  50. Đồ án tốt nghiệp trong những yếu tố chính trong nuôi cấy bán rắn và thường quyết định sự thành công của cả quá trình (Narahara và cộng sự, 1982; Lonsane và cộng sự, 1985; Renu và cộng sự, 2001). Báo cáo về độ ẩm trung bình (50 - 63%) bởi George và cộng sự (1995) cho thấy, khi độ ẩm vượt quá mức, không có sự tăng thêm hoạt độ enzyme, thậm chí làm giảm sự tăng trưởng và sản xuất enzyme. Qua đó cho thấy việc giữ ẩm cho môi trường ở mức tối thích là sự cần thiết đối với các chủng vi sinh vật và độ ẩm thích hợp để chủng BN2.1 tổng hợp protease cao nhất là 60%. 3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease Tiến hành cấy chủng B. subtilis Natto theo điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian khác nhau: 12, 24, 36, 48, 60, 72 vả 84 giờ. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp protease Thời gian nuôi cấy (giờ) Hoạt độ trung bình (UI/g) 12 0,84 0,02d 24 0,89 0,01cd 36 0,93 0,02bc 48 0,96 0,04b 60 1,01 0,04a 72 1,04 0,02a 84 1,04 0,03a Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp 1,20 1,04 1,04 0,96 1,01 1,00 0,93 0,84 0,89 0,80 0,60 0,40 Hoạt độ Hoạt(UI/g) 0,20 0,00 12 24 36 48 60 72 84 Thời gian nuôi cấy (giờ) Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường bán rắn lên hoạt độ protease. Theo thời gian nuôi cấy, hoạt độ protease của chủng BN2.1 tăng đều trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 12 đến 72 giờ. Ở thời điểm 12 giờ hoạt độ protease chỉ đạt 0,84 UI/g, đến 60 giờ thì tăng đến 1,01 UI/g. Sau 72 giờ thì hoạt độ protease không tăng nữa và duy trì ở mức ổn định với 1,04 UI/g. Kết quả tương tự với nghiên cứu của U.O.George-Okafor và E.E.Mike-Anosike (2012) khi chủng Bacillus sp. Sw-2 cho hoạt độ protease cao nhất ở 72 giờ (2,697 UI/ml). Khi kéo dài thời gian nuôi cấy thì các thành phần trong môi trường thay đổi do sự hình thành các hợp chất mới của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, dẫn đến hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, làm cho tế bào vi khuẩn suy thoái, enzyme bị bất hoạt. Chủng BN2.1 sinh tổng hợp enzyme mạnh và lượng protease tích luỹ trong canh trường cao nhất trong khoảng thời gian từ 60 đến 84 giờ. Vì vậy để tiết kiệm thời gian nuôi cấy, thời điểm 60 giờ sẽ được chọn làm thời điểm để thu nhận canh trường và tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 42
  52. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng xúc tác protease của chủng B. subtilis Natto BN2.1 Tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme từ canh trường cho hoạt độ cao theo các điều kện tối ưu ở trên và khảo sát sát ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác enzyme protease của chủng BN2.1 với pH phản ứng thay đổi từ 6 đến 8. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease pH Hoạt độ trung bình (UI/g) 6 59,7 2,42b 6,5 61,6 1,15b 7 67,9 2,27a 7,5 67,2 4,28a 8 66,7 1,43a Các giá trị theo sau bởi chữ cái khác nhau không cùng kí tự biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 0,05. 70 67,9 68 67,2 66,7 66 64 61,6 62 59,7 60 58 Hoạt độHoạt (UI/g) 56 54 6 6,5 7 7,5 8 pH Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác protease. Kết quả khảo sát cho thấy, mỗi pH khác nhau cho khả năng xúc tác enzyme protease khác nhau. Chủng BN2.1 sinh tổng hợp protease tăng dần từ pH 6 đến 7. Trong đó, hoạt độ protease thấp nhất ở pH 6 đạt 59,7 UI/g và cao nhất ở pH 7 với 43
  53. Đồ án tốt nghiệp hoạt độ đạt 67,9 UI/g, ổn định trong khoảng pH từ 7 đến 8. Kết quả tương tự với nghiên cứu của E. M. El-Safey and U. M. Abdul-Raouf (2004) trên B. subtilis, khi hoạt độ protease của chủng này mạnh nhất ở pH 7 của bộ đệm phosphate. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về ảnh hưởng của pH lên đặc tính của enzyme cho thấy sự khác biệt như Ishtiaq Ahmed và cộng sự (2011), lựa chọn pH 10 cho protease của chủng B. subtilis; Sun và cộng sự (1997) lựa chọn khoảng pH 11 cho hoạt độ tối ưu của protease từ chủng Bacillus sphaericus C3 - 41, protease này ổn định ở mức pH từ 5 đến12. Theo nghiên cứu của Sadia Almas và cộng sự (2009) thì chủng Bacillus SAL1 cho protease hoạt độ tối ưu ở pH 9 và ổn định trong khoảng pH 7 đến 10. Như vậy, enzyme từ mỗi chủng khác nhau chịu ảnh hưởng khác nhau của pH lên hoạt độ protease của chúng. Từ kết quả khảo sát trên nhận thấy, pH 7 là pH tối ưu đối với protease của chủng BN2.1. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu nhóm thực hiện rút ra được kết luận như sau: - Sàng lọc được chủng Bacillus subtilis Natto BN2.1 cho hoạt độ protease cao từ năm chủng Bacillus subtilis Natto nghiên cứu. - Các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp protease cao của chủng BN2.1 là hỗn hợp môi trường bán rắn BDN:CB, với tỉ lệ thích hợp là 5:5; thời gian nuôi cấy tốt nhất là 60 giờ và độ ẩm môi trường ban đầu thích hợp nhất để nuôi cấy là 60%. - Khảo sát được ảnh hưởng của pH phản ứng tối ưu lên khả năng xúc tác enzyme protease của chủng BN2.1 là pH 7. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu một số thông số khác trong quá trình nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của chủng BN2.1 như: nhiệt độ, điều kiện cấp khí, pH môi trường từ đó đưa ra được môi trường nuôi cấy tổng hợp tối ưu giúp chủng BN2.1 tăng tiết enzyme đích protease, đồng thời hạn chế được các enzyme amylase và cellulase để thuận lợi hơn trong quá trình tinh chế sau này. - Nghiên cứu về hoạt độ enzyme amylase, phytase, nattokinase cùa chủng BN2.1. - Phân lập các dòng vi khuẩn từ sản phẩm Natto và định danh để tiếp tục nghiên cứu cho ra những chủng Bacillus subtilis Natto có hoạt độ protease cao. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 2. Lâm Thị Kim Châu (2004). Thực tập lớn sinh hoá, Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 3. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006). Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti),Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11. 4. Hin Vireak (2012). Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 5. Trần Ngọc Hùng (2006). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và tính chất của α-amylase từ một số chủng Bacillus subtilis, Khoá luận tốt nghiệp ngành sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, TP Hồ Chí Minh. 6. Trần Ngọc Hùng (2010). Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis sử dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 7. Đinh Thu Hương (2013). Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzym protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Luận văn thạc sĩ dược học, trường Đại học Dược, Hà Nội. 8. Đinh Thị Kim Loan (2006). Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease từ một số chủng Bacillus sp. phân lập từ các chế phẩm sinh học dung trong chăn nuôi ở Việt Nam, Khoá luận cử nhân khoa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Đức Lượng (2004). Công Nghệ Enzyme, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 10. Nguyễn Đức Lượng (2012). Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia, TP Hồ Chí Minh. 11. Đặng Lê Minh (2006). Khảo sát khả năng thuỷ phân một số dạng cơ chất của một số chủng Bacillus phân lập từ các sản phẩm thuốc thú y và thuỷ sản, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, chuyên ngành sinh hoá. 12. Trương Thị Hồng Nhung, Hoàng Minh Nguyệt (2013). Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 13. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân và Lê Thị Hương (2012). Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase, Tạp chí sinh học, 34(3), tr. 99 – 104. 14. Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương (2006). Xác định một số tính chất hóa lý của protease chủng Serratia sp. DT3, Tạp chí sinh học - tập4(2), Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội. 15. Trần Linh Thước (2005). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật, Hà Nội. 16. Tống Ngọc Triêm(2010). Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis, khóa luận tốt nghiệp, ĐH Công Nghệ TPHCM. 17. Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu (1982). Enzyme vi sinh vật tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội. 18. Bùi Ngọc Xuân (2012). Khảo sát khả năng sinh tổng hợp và một số đặc tính enzyme α-amylase của chủng Bacillus stearothermophilus, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học, Bình Dương. 47
  57. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu nước ngoài 19. Ishtiaq Ahmed, Muhammad Anjum Zia and Hafiz Muhammad Nasir Iqbal (2011). Purification and Kinetic Parameters Characterization of an Alkaline Protease Produced from Bacillus subtilis through Submerged Fermentation Technique, World Applied Sciences Journal 12 (6): 751-757. 20. Sadia Almas, Abdul Hameed, Dennis Shelly and Priya Mohan (2009). Purification and characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1, African Journal of Biotechnology, Vol. 8 (15), pp. 3603 - 3609 21. Wang C, Du M (2009). Purification and characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis natto B – 12, Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, p. 9722 – 9729. 22. Qiu D, Fujita K et al (2004). Comparative analysis of physical maps of four Bacillus subtilis (natto) genomes, Appl Environ Microbiol (70), pp. 6247 – 6256. 23. Keith H. Steinkraus (2004). Industrialization of indigenous fermented foods, pp.227 - 230. 24. Rong L.H (2011).The optimization, extraction and purification of Nattokinase and genetic cloning, Master's thesis, Hebei Union University (China). 25. Yiu H. Hui, Lisbeth Meunier - Goddik, Jiste Josephsen, Wai-Kit Nip (2005). Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612 - 620. 26. Abdelnasser S.S. Ibrahim, Ali A. Al-Salamah (2009). Optimization of media and cultivation conditions for alkaline protease production by Alkaliphilic Bacillus halodurans, Research journal of microbiology 4 (7): 251 - 259. 27. Liu J, Xing J, Chang T, Ma Z and Liu H (2005). Optimization of nutritional conditions for Nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods, Process Biochemistry, vol.40(8), pp. 2757– 2762. 48
  58. Đồ án tốt nghiệp 28. Tamang J, Thapa S. (2002). Phylogenetic analysis of Bacillus strains isolated from fermented soybean foods of Asian: Kinema, Chungkokjang and Natto, Journal of Hill Research, 15(2), pp.56 - 62. 29. Kerovuo J et al (1998). Isolation, characterization, molecular gene cloning and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis, American society for microbiology Appl. Environ. Microbiol, vol. 64 no. 6 p 2079 – 2085. 30. Noda K, Igata K (1989). Synthesis of γ – glytamyl peptides catalyzed by transamidase from Bacillus natto, Agricultural Biology and Chemistry, 44, p. 2419 – 2423. 31. Yamane K, Hiroshi M (1974). Hybrid α – amylase produced by transformants of Bacillus subtilis – Purification and characterization of extracellular α – amylase produced by the parental strains and trasformants, Biochimica et Biophysica Acta, 365, p. 235 – 247. 32. Muramatsu K, Yamawake K (2000). Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase, Journal of Home Economics of Japan, 51(12), p. 1127 – 1135. 33. Fujita M et al (1993). Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (Nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan, Biochemical and Biophysical research communication, p. 1340 – 1347. 34. Fujita M, Hong K (1995). Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(10), p. 1387 – 1391. 35. Weng M, Zheng Z, Bao W, Cai Y, Yin Y, Zou G (2009). Enhancement of oxidative stability of the subtilisin Nattokinase by site-directed mutagenesis expressed in Escherichia coli, Biochim Biophys Acta, 1794(11):1566 - 72 49
  59. Đồ án tốt nghiệp 36. Shimizu M (1992). Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis (natto) N – 77, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56(8), p. 1266 – 1269. 37. Muhammad Nadeem, Javed Iqbal Qazi, Shahjahan Baig, Qurat-ul-Ain Syed (2008). Effect of Medium Composition on Commercially Important Alkaline Protease Production by Bacillus licheniformis N-2, Food Technol. Biotechnol, 46 (4): 388 – 394 38. U.O.George-Okafor and E.E.Mike-Anosike (2012). Screening and optimal protease production by Bacillus sp. Sw-2, using low cost substrate medium, Research journal of microbiology 7 (7): 327 - 336. 39. Mahajan P, Sagar V (2010). Production of Nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, scale up and kinetic modeling, Food Science and Biotechnology, 19(6), p. 1593 – 1603. 40. Gupta R, Beg Q.K (2002). Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, p. 15 – 32. 41. R. Sindhu, G. N. Suprabha and S. Shashidhar (2009). Optimization of process parameters for the production of alkaline protease from Penicillium godlewskii SBSS 25 and its application in detergent industry, African Journal of Microbiology Research Vol. 3(9) pp. 515 - 522. 42. Hiroyuki S, Misako Y (1999). Elastase activity in Natto and its relation to nattokinase, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p. 1187 – 1190. 43. Joo H.S., Kumar C.G., Park G.C., Paik S.R., Chang C.S. (2002). Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii, Process Biochemistry, 38, 155 – 159. 44. S Vijayalaksmi, J Ranjitha, V Devi Rajeswari (2013). Enzyme production ability by Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis – A comparative study, Asian journal of pharmaceutical and clinical research, Vol 6, Issue 4, 2013. 50
  60. Đồ án tốt nghiệp 45. Tokudome S, Omura K (2005). A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects, Journal of Pharmacological Sciences , 99, p. 247 – 251. 46. William Shurtleff, Akiko Aoyagi (2012). History of Natto and Its Relatives, Soyinfo Center. 47. Ashikaga S, Nanamiya H (2000). Natural genetic competence in Bacillus subtilis natto OK2, Journal of Bacteriology, 182(9), p. 2411 – 2415. 48. Yan S, JiaQi W (2011). Screening of protease and cellulase producing Bacillus subtilis natto strain and its growth characteristics, Dongbei Nongye Daxue Xuebao Journal, 42(3), p. 39 – 43. 49. Kato T et al (1992). Purification of a new extracellular 90 – kDa serine proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and elucidation of its distinct mode of action, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56 (7), p. 1166 – 1168. 50. Seki T., Oshima T. (1975). Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic acid – deoxyribonucleic acid hybridization and interspecific transformation, International Journal of Systematic Bacteriology, 25(3), pp.258 - 270. 51. Deepak V et al (2008). Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresource Technology (99), pp.8170 - 8174. 52. Ogawa Y, Hosoyama H, Hamano M, Motai M (1991). Purification and properties of γ – glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto), Agricultural Biology and Chemistry, 55, p. 2971 – 2977. 53. Yamagata Y, Abe R (1995). Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16, Current Microbiology, 31(6), p. 340 – 344. 51
  61. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu Internet 54. Báo điện tử Sahifa (2016). NATTOKINASE là gì? - Những điều cần biết., 15/8/2016: doi-voi-suc-khoe/.html 55. Japan NattoKinase Associasion (online). Bacillus subtilis Natto, 5/7/2016: 56. Lorie Kramer (2011). Resen(online). The Bacillus subtilis Story, 5/9/2015: 52
  62. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. Bảng độ ẩm nguyên liệu ban đầu Nguyên liệu Độ ẩm (%) Bã đậu nành 9,6 Đậu xanh 11 Cám bắp 10,65 Cám gạo 9,8 Cám mì 10 PHỤ LỤC B. Đường chuẩn Tyrosine theo phương pháp Anson. OD trung bình 0,0163 0,2320 0,5546 0,694 1,0767 1,2966 Lượng Tyrosine 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 (µM) OD 0 0,2157 0,5383 0,6777 1,0604 1,2803 Đồ thị phụ lục B. Đường chuẩn Tyrosine. 1
  63. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C. Khảo sát khả năng phân giải casein trên môi trường thạch đĩa của các chủng B. subtilis Natto ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 7.0000 1.73205 1.00000 2.6973 11.3027 6.00 9.00 2 3 20.3333 .57735 .33333 18.8991 21.7676 20.00 21.00 3 3 12.3333 .57735 .33333 10.8991 13.7676 12.00 13.00 4 3 12.6667 1.52753 .88192 8.8721 16.4612 11.00 14.00 5 3 13.0000 1.73205 1.00000 8.6973 17.3027 11.00 14.00 6 3 .0000 .00000 .00000 .0000 .0000 .00 .00 Total 18 10.8889 6.48880 1.52943 7.6621 14.1157 .00 21.00 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 697.778 5 139.556 93.037 .000 Within Groups 18.000 12 1.500 Total 715.778 17 2
  64. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Interval Mean Lower Upper (I) NT (J) NT Difference (I-J) Std. Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 6 7.00000* 1.00000 .000 4.0987 9.9013 a (2-sided) 2 6 20.33333* 1.00000 .000 17.4321 23.2346 3 6 12.33333* 1.00000 .000 9.4321 15.2346 4 6 12.66667* 1.00000 .000 9.7654 15.5679 5 6 13.00000* 1.00000 .000 10.0987 15.9013 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 4 Duncana 6 3 .0000 1 3 7.0000 3 3 12.3333 4 3 12.6667 5 3 13.0000 2 3 20.3333 Sig. 1.000 1.000 .538 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 3
  65. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC D. Khảo sát hoạt độ enzyme protease của chủng B. subtilis Natto trên môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 .7980 .13258 .07654 .4687 1.1273 .72 .95 2 3 .6600 .02606 .01504 .5953 .7247 .64 .69 3 3 .6797 .07950 .04590 .4822 .8772 .63 .77 4 3 .6160 .08271 .04775 .4105 .8215 .56 .71 5 3 .5220 .11988 .06921 .2242 .8198 .40 .64 6 3 .7713 .02948 .01702 .6981 .8446 .74 .79 Total 18 .6745 .12077 .02847 .6144 .7346 .40 .95 ANOVA HD Sum of df Mean F Sig. Squares Square Between .155 5 .031 3.977 .023 Groups Within Groups .093 12 .008 Total .248 17 4
  66. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Mean Interval Difference Std. Lower Upper (I) NT (J) NT (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 6 .02667 .07200 .995 -.1822 .2356 (2- 2 6 -.11133 .07200 .432 -.3202 .0976 sided)a 3 6 -.09167 .07200 .599 -.3006 .1172 4 6 -.15533 .07200 .176 -.3642 .0536 5 6 -.24933* .07200 .019 -.4582 -.0404 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 Duncana 5 3 .5220 4 3 .6160 .6160 2 3 .6600 .6600 .6600 3 3 .6797 .6797 .6797 6 3 .7713 .7713 1 3 .7980 Sig. .064 .068 .100 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 5
  67. Đồ án tốt nghiệp PHỤC LỤC E: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất trong môi trường bán rắn ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 .3910 .04924 .02843 .2687 .5133 .35 .45 2 3 .4967 .13342 .07703 .1652 .8281 .40 .65 3 3 .5783 .03636 .02099 .4880 .6687 .55 .62 4 3 .7447 .10218 .05899 .4908 .9985 .63 .81 5 3 .6143 .10016 .05783 .3655 .8631 .54 .73 6 3 .5657 .15908 .09184 .1705 .9608 .38 .66 7 3 .4753 .12345 .07127 .1687 .7820 .38 .62 Total 21 .5523 .14060 .03068 .4883 .6163 .35 .81 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .230 6 .038 3.253 .032 Within Groups .165 14 .012 Total .395 20 6
  68. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Mean Interval Difference Std. Lower Upper (I) NT (J) NT (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 7 -.08433 .08868 .845 -.3426 .1739 a (2-sided) 2 7 .02133 .08868 1.000 -.2369 .2796 3 7 .10300 .08868 .717 -.1553 .3613 4 7 .26933* .08868 .040 .0111 .5276 5 7 .13900 .08868 .456 -.1193 .3973 6 7 .09033 .08868 .807 -.1679 .3486 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 Duncana 1 3 .3910 7 3 .4753 .4753 2 3 .4967 .4967 6 3 .5657 .5657 .5657 3 3 .5783 .5783 .5783 5 3 .6143 .6143 4 3 .7447 Sig. .075 .176 .083 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 7
  69. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC F: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm lên khả năng tổng hợp enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 .0207 .00651 .00376 .0045 .0368 .01 .03 2 3 .3780 .07184 .04148 .1995 .5565 .30 .43 3 3 .7913 .13903 .08027 .4460 1.1367 .70 .95 4 3 .5677 .10312 .05954 .3115 .8238 .45 .65 Total 12 .4394 .30579 .08827 .2451 .6337 .01 .95 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between .958 3 .319 36.330 .000 Groups Within Groups .070 8 .009 Total 1.029 11 8
  70. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Mean Interval (J) Difference Std. Lower Upper (I) NT NT (I-J) Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 4 -.54700* .07656 .000 -.7675 -.3265 a (2-sided) 2 4 -.18967 .07656 .091 -.4101 .0308 3 4 .22367* .07656 .047 .0032 .4441 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 4 a Duncan 1 3 .0207 2 3 .3780 4 3 .5677 3 3 .7913 Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 9
  71. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC G: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tổng hợp enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Std. Lower Upper N Mean Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 .8397 .02346 .01354 .7814 .8979 .81 .86 2 3 .8857 .01021 .00590 .8603 .9110 .87 .89 3 3 .9323 .01804 .01041 .8875 .9771 .92 .95 4 3 .9577 .03512 .02028 .8704 1.0449 .92 .99 5 3 1.0070 .03637 .02100 .9166 1.0974 .97 1.04 6 3 1.0420 .02433 .01405 .9816 1.1024 1.01 1.06 7 3 1.0363 .03215 .01856 .9565 1.1162 1.01 1.07 Total 21 .9572 .07641 .01667 .9225 .9920 .81 1.07 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups .106 6 .018 24.060 .000 Within Groups .010 14 .001 Total .117 20 10
  72. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: HD 95% Confidence Mean Interval (I) (J) Difference Lower Upper NT NT (I-J) Std. Error Sig. Bound Bound Dunnett t 1 7 -.19667* .02217 .000 -.2612 -.1321 a (2-sided) 2 7 -.15067* .02217 .000 -.2152 -.0861 3 7 -.10400* .02217 .002 -.1686 -.0394 4 7 -.07867* .02217 .015 -.1432 -.0141 5 7 -.02933 .02217 .611 -.0939 .0352 6 7 .00567 .02217 1.000 -.0589 .0702 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 3 4 Duncana 1 3 .8397 2 3 .8857 .8857 3 3 .9323 .9323 4 3 .9577 5 3 1.0070 7 3 1.0363 6 3 1.0420 Sig. .057 .054 .272 .156 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 11
  73. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC H: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH phản ứng lên khả năng xúc tác enzyme protease ONEWAY HD BY NT /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN DUNNETT ALPHA(0.05). Oneway [DataSet0] Descriptives HD 95% Confidence Interval for Mean Std. Lower Upper N Mean Deviation Std. Error Bound Bound Minimum Maximum 1 3 59.7249 2.41668 1.39527 53.7215 65.7283 57.17 61.97 2 3 61.5992 1.14829 .66296 58.7467 64.4517 60.39 62.67 3 3 67.9251 2.26877 1.30988 62.2892 73.5610 65.31 69.35 4 3 67.1832 4.27583 2.46865 56.5614 77.8049 62.50 70.87 5 3 66.7146 1.43115 .82627 63.1594 70.2698 65.72 68.35 Total 15 64.6294 4.05478 1.04694 62.3839 66.8749 57.17 70.87 ANOVA HD Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 164.903 4 41.226 6.316 .008 Within Groups 65.274 10 6.527 Total 230.177 14 12
  74. Đồ án tốt nghiệp Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable:HD 95% Confidence Mean Interval Difference Lower Upper (I) NT (J) NT (I-J) Std. Error Sig. Bound Bound Dunnett t (2- 1 5 -6.98971* 2.08605 .024 -13.0194 -.9600 a sided) 2 5 -5.11537 2.08605 .102 -11.1451 .9143 3 5 1.21051 2.08605 .937 -4.8192 7.2402 4 5 .46858 2.08605 .998 -5.5611 6.4983 a. Dunnett t-tests treat one group as a control, and compare all other groups against it. *. The mean difference is significant at the 0.05 level. Homogeneous Subsets HD Subset for alpha = 0.05 NT N 1 2 Duncana 1 3 59.7249 2 3 61.5992 5 3 66.7146 4 3 67.1832 3 3 67.9251 Sig. .390 .592 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 13