Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng, nước dừa và than hoạt tính lên sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà á Mentha Arvensis L

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng, nước dừa và than hoạt tính lên sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà á Mentha Arvensis L

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương SVTH: Nguyễn Chí Thanh MSSV: 1515100010 Lớp: 15HSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2016
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương HVTH: Nguyễn Chí Thanh MSHV: 1515100010 Lớp: 15HSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2016
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kì hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 18 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Chí Thanh
4. LỜI CẢM ƠN Trong cuộc sống không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua. Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này ngoài sự nổ lực của bản thân, em còn được sự hỗ trợ từ rất nhiều người, em xin chân thành gửi lời cảm ơn: Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép chúng em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho chúng em thực hiện tốt bài đề tài tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho chúng em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đề tài thực nghiệm này, chúng em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho chúng em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đề tài thực nghiệm. giúp chúng em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, chúng em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ chúng em
5. trong suốt thời gian làm đề tài thực nghiệm. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đề tài thực nghiệm. Cuối cùng chúng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện đề tài Nguyễn Chí Thanh
6. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 6. Kết quả đạt được của đề tài 4 7. Kết cấu đồ án 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5 1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro 5 1.1.2. Sơ lược một số phương pháp nuôi cấy in vitro 7 1.2. Sơ lược về nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 9 1.2.1. Môi trường khoáng cơ bản 9 1.2.1.1. Môi trường MS 11 1.2.1.2. Môi trường SH 15 1.2.1.3. Môi trường N6 15 1.2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng và hợp chất hửu cơ 16 1.2.2.1. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 16 1.2.2.2. Sơ lược về than hoạt tính và nước dừa trong nhân giống in vitro 20 1.3. Giới thiệu sơ lược về cây Bạc hà 24 1.3.1. Phân loại 24 i
7. 1.3.2. Nguồn gốc, phân bố, và đặc điểm hình thái sinh học 26 1.3.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 26 1.3.2.2. Đặc điểm hình thái sinh học 27 1.3.2.3. Điều kiện sinh thái 30 1.3.3. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam 31 1.3.3.2. Ngoài nước 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 34 2.2. Phương pháp thí nghiệm 34 2.2.1. Chọn mẫu thí nghiệm 34 2.2.2. Môi trường nuôi cấy 34 2.2.3. Bố trí thí nghiệm 35 2.2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L 35 2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk và Heldebrandt) lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L 36 2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L 37 2.2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nước dừa lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L 38 ii
8. 2.2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á Mentha Arvensis L 39 2.4. Chỉ tiêu theo dõi 40 2.5. Thống kê và xử lý số liệu 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiếnlên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 41 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 48 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường N6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 55 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần 62 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1. Kết luận 78 4.2. Kiến nghị 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 iii
9. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số môi trường nuôi cây cơ bản được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro 10 Bảng 2.1. Ảnh hưởng của MS cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 35 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của SH cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 36 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của N6 cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà 37 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà 38 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình tăng trưởng hình thành rễ phát triển chồi ở cây từ đoạn cắt thân Bạc hà 39 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 42 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. 49 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường n6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 56 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 65 iv
10. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 73 v
11. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 43 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 44 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 50 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 51 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 57 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 58 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 66 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa lên sư tăng trưởng của Bạc hà Á 67 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 74 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 75 vi
12. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. 24 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến MS lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 45 Hình 3.2. Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng từ đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. không qua gia đoạn cảm ứng sau 8 tuần nuôi cấy 46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 52 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 53 Hình 3.5. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 59 Hình 3.6. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy 60 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 63 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 64 Hình 3.9. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L . 71 Hình 3.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L . 72 vii
13. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid B5 : Gamborg và cộng sự (1968) BAP : 6-Benzylaaminopurin DNA : Deoxyribonucleic acid DKW : Driver – Kuniyuki Walnut ĐHSTTV : Điều hòa sinh trưởng thực vật EM : Effective Microorganisms IAA : Indol acetic acid IBA : Indol butyric acid IBA : Indolebutyric acid Ki : Kinetin KNC : Knudson C (1946) MS : Murashige và Skoog (1962) N6 : Nitsch (1969) NAA : Naphthyl acetic acid NSC : Ngày sau cấy PVP : Polyvinylpyrrolidone SA : Ammonium Sunfate TB : Trung bình TDZ : Thidiazuron VW : Vacin và Went (1949) WPM : Lloyd và McCown (1980) Z : Zeatin 2,4-D : Acid 2,4-Diclorophenoxiacetic viii
14. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương SVTH: Nguyễn Chí Thanh MSSV: 1515100010 Lớp: 15HSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2016
15. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH–TP–MT  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG, NƯỚC DỪA VÀ THAN HOẠT TÍNH LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY BẠC HÀ Á MENTHA ARVENSIS L. GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương HVTH: Nguyễn Chí Thanh MSHV: 1515100010 Lớp: 15HSH01 TP.HCM, tháng 8/ 2016
16. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ xa xưa, cây Bạc hà đã được con người biết đến là một vị thuốc rất hữu hiệu, và tinh dầu Bạc hà còn được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, Cây bạc hà Châu Á còn được gọi là Bạc hà Á Mentha Arvensis L. cho hàm lượng tinh dầu rất cao (80 90%). Nhiều năm qua, nhu cầu sử dụng những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được ưu tiên sản xuất số lượng lớn. Để đảm bảo nguồn cung cấp cho nguyên liệu sản xuất các chế phẩm từ Bạc hà ngày một tăng cao thì việc tập trung vào nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân nhanh giống cây Bạc hà Á là hết sức cần thiết. Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt, Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống của Bạc hà gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, kỹ thuật invitro được coi là phương pháp hữu hiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược thảo quan trọng như Bạc hà Mentha Arvensis L. Nhân giống invitro đã được chứng minh là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Vài năm gần đây việc nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống Bạc hà Á bằng phương pháp nuôi cấy mô đã có nhiều tiến bộ. Bằng phương pháp này cho phép từ một lượng nhỏ giống ban đầu nhân nhanh với tốc độ cao trong thời gian ngắn có thể cung cấp một lượng lớn giống đồng nhất, sạch bệnh.Tuy nhiên, để đảm bảo được tỷ lệ sống sót và năng suất như mong muốn sau khi đưa cây ra vườn ươm ta cần phải áp dụng các kỹ thuật chăm sóc đặc biệt. Mỗi loại cây có một nhu cầu dinh dưỡng riêng, nên cần có một môi trường nuôi cấy đặc trưng riêng (Preece JE., 1995), hiện đã có hơn 685 loại môi trường nuôi cấy mô thực vật đã được công bố (Georgen et al., 1987). Không những thế các khoáng chất lại có ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành hình thái của các loại thực vật (Ramage CM et al., 2002). Nên việc nghiên cứu tìm ra môi trường thích hợp và an toàn không có dư lượng nitrate là công việc vô cùng cần thiết trong nhân giống in vitro nhất là đối với các loại cây dược liệu. Bên cạnh tìm kiếm môi trường 1
17. dinh dưỡng an toàn và thích hợp, trong nuôi cấy in vitro chất điều hòa sinh trưởng thực vật an toàn cũng là điều đáng quan tâm trong nhân giống vô tính cây dược liệu. Nước dừa có chứa một số hợp chất hữu cơ và chất dinh dưỡng khoáng chất quan trọng trong sự phát triển của thực vật, đóng một vai trò quan trọng như bộ đệm sinh lý chứa hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng cao, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Krikorian, 1991), (Ge et al, 2005; Yong et al, 2009). Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến sự ra rễ, kéo dài chồi và phát sinh phôi (Webb., 1988). Ngoài ra, khi bổ sung than vào môi trường nuôi cấy có thể thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng của thực vật in vitro; các tác động của than bao gồm: tạo điều kiện tối trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợp chất hữu cơ khác đồng thời phóng thích các cơ chất có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật nuôi cấy in vitro (Pan M. J. et al., 1998). Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, tạo nguồn lớn nguyên liệu dược liệu sạch. Chúng tôi đề suất nghiên cứu đề tài: “Khảo sát sự ảnh hưởng môi trường nuôi cấy và các chất bổ sung lên cây Bạc hà Á Mentha arvensis L.” 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy như MS, SH, N6 lên Bạc hà, bên cạnh đó khảo sát ảnh hưởng của than và nước dừa đến sự phát triển của cây Bạc hà nhằm góp phần xây dựng và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây dược liệu nói chung và cây Bạc hà Á Mentha arvensis L. nói riêng. Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng tới mẫu cấy in vitro Bạc hà Á Mentha arvensis L. và hướng khắc phục để tăng cường sự phát triển của mẫu, đồng thời tạo nguồn cây giống chất lượng phục vụ sản xuất. 2
18. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) khi thay đổi nồng độ môi trường lên khả năng tăng trưởng và phát triển Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk et Hildebrandt, 1972) khi thay đổi nồng độ môi trường lên khả năng tăng trưởng và phát triển Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) khi thay đổi nồng độ môi trường lên khả năng tăng trưởng và phát triển Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Khảo sát sự ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ không xác định như nước dừa lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Khảo sát sự ảnh hưởng chất làm thay đổi trạng thái của môi trường lên Bạc hà Á Mentha Arvensis L. 4. Phương pháp nghiên cứu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiênn, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi nghiệm thức cấy 1 chai. Kết quả ghi nhận số liệu là giá trị trung bình. Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.1 và 9.4. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một số khảo sát về môi trường nuôi cấy thông qua kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á Mentha Arvensis L. bằng phương pháp in vitro 3
19. để đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống Bạc hà Á Mentha Arvensis L. ở quy mô lớn, cây sạch bệnh, an toàn nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 6. Kết quả đạt được của đề tài Xác định được ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Xác định được ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk et Hildebrandt, 1972) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Xác định được ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Xác định sự ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ không xác định như nước dừa lên sự phát triển của Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Xác định sự ảnh hưởng chất làm thay đổi trạng thái của môi trường than hoạt tính lên Bạc hà Á Mentha Arvensis L. 7. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
20. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cây in vitro 1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thực hiện nuôi cấy mô tế bào thực vật đầu tiên từ lá của một số cây một lá mầm như: Errythronium, Orrnithogalum, nhưng không thành công. Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhưng trên đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo, trên môi trường lỏng có muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ kéo dài trong thời gian ngắn. Năm1934, nhiều nghiên cứu về nuôi cấy mô thành công như: White và Gautheret đã nuôi cấy rễ cây cà chua trên môi trường muối khoáng và dịch chiết nấm men, nhóm tác giả Nobecourt và Gautheret duy trì sự sinh trưởng của mô sẹo cà rốt, đặc biệt, Kogl lần đầu tiên xác định vai trò của IAA, một hormone thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt, White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và thuốc lá. Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non ở cây cà Datura. Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh có virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cùng năm đó hai ông đã thực hiện vi ghép in vitro thành công. Năm 1955, các chất kích thích sự phân bào được Skoog đặt tên là kinetin và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin. Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành công nuôi cấy mô vào cây lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm. Năm 1957, Skoog và Millert đã phát hiện vai trò tỉ lệ nồng độ của các chất auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. 5
21. Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm thử sinh khối mô thực vật bằng nuôi cấy chìm. Năm 1960 – 1964, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh giống địa lan Cymbidium mở đầu thành công trong sự nghiệp vi nhân giống thực vật. Từ kết quả đó, lan được xem là nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Đến nay, hầu hết các giống lan đã được nhân giống nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô như: Oncidium, Denrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Ngọc điểm, Và ngay cả lan Hài nổi tiếng của Việt Nam. Năm 1964, Guha và Maheshwari tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà chua Datura. Năm 1971, Takebe và cộng sự đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở cây thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần từ hai loài thuốc lá Nicotiana glauca và Nicotiana langsdorfii. Năm 1974, Zaenen và cộng sự đã phát hiện plasmid Ti đóng vai trò yếu tố gây khối u ở cây trồng. Năm 1977, Noguchi đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích 20.000 l. Chilt và cộng sự đã chuyển thành công T-DNA vào thực vật. Năm 1978, Melchers đã tạo được cây lai soma giữa cà chua và thuốc lá bằng lai xa hai tế bào trần của hai cây. Năm 1979, Marton đã xây dựng quy trình chuyển gene vào tế bào trần bằng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Năm 1982, đã chuyển thành công DNA vào tế bào trần. Năm 1985, Fraley và cộng sự đã thiết kế vertor chuyển gene vào thực. Cùng năm ấy Horsch cũng đã chuyển gene vào mảng lá bằng Agribacterium tumefacienns và tái sinh cây chuyển gene. Năm 1994, thương mại hóa cây cà chua chuyển gene “Flavr-savr”. Tại Việt Nam, trước 1975, Nguyễn Văn Uyển cùng với Lê Thị Xuân, Lê Văn Cát, là những nhà khoa học đầu tiên có ý tưởng xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào 6
22. thực vật như bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo, bao phấn lúa và protoplast thuốc lá. Sau năm 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đầu tiên tại Viện Sinh Vật Học, Viện Khoa Học Việt Nam, do Tiến sĩ Lê Thị Muội khởi xướng đã đạt được thành tựu lớn khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cộng sự, 1978). Cùng thời điểm trên, Phân Viện Khoa Học Việt Nam được thành lập tại thành phố Hồ chí Minh đã hình thành các phòng thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật không những chỉ phát triển tại thành phố Hồ Chí Minh, mà còn ở các địa phương khác, trong đó đáng kể nhất là tại Đà Lạt. Phát huy lợi nhuận về khí hậu của Đà Lạt, Nguyễn Văn Uyển đã thành công trong việc triển khai nhân giống in vitro cây khoai tây bằng những phòng thí nghiệm gia đình và sản xuất cây khoai tây giống trong bầu bằng kỹ thuật luống mạ khoai tây. Thành công lớn nhất của nghiên cứu này là áp dụng phương pháp nhân giống mới vào sản xuất giống khoai tây tại Đà Lạt trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau trong cả nước. Từ thành công này, International Foundation for Science đã tài trợ cho PGS. TS Nguyễn Văn Uyển tổ chức hội thảo quốc tế “Propagation Tcechniques for Commercial Crops of the Tropics” cho các nhà nuôi cấy mô vùng Đông Nam Á Thái Bình Dương, tổ chức tại Tp Hồ Chí Minh (Tháng 2/1993). 1.1.2. Sơ lược một số phương pháp nuôi cấy in vitro a. Nuôi cấy nốt đơn thân Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn. Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây nguyên vẹn, nhiều chồi và lá được được hình thành. Tiếp tục cấy chuyền trên môi trường dinh dưỡng thích hợp đến khi đủ số lượng chồi cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. b. Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Nhưng khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân thường không cần đến cytokinin để phát triển. Phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ nách lá phát 7
23. triển dưới tác dụng của cytokinin nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để các chồi bên có thể phát triển. c. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi ngọn được rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypochlorite calcium. Sau đó dùng dao mổ tách đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh. Với phương pháp này, chúng ta tạo được cây sạch bệnh, sạch virus. d. Nuôi cấy mô sẹo Tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hóa chất, tia phóng xạ, ). Các tế bào của mô sẹo phải chịu sự phản phân hóa trước lần chia đầu tiên (Halperin,1969). Mô sẹo tăng trưởng nhanh trên môi trường có chất auxin và trong môi trường không có chất kích thích thì mô sẹo có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cụm mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn. e. Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào được tạo từ các mảnh mô sẹo nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc liên tục. Trong môi trường lỏng, mô sẹo phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ các chất dinh dưỡng. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường đặc để tái sinh thành cây. f. Nuôi cấy thể đơn bội Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng những phần sau cho việc nuôi cấy in vitro: - Túi phấn: thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa. Còn thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn. - Hạt phấn: được nuôi cấy trên môi trường để tạo mô sẹo. - Cụm hoa: thường nuôi cấy trong môi trường lỏng. 8
24. g. Nuôi cấy protoplast (tế bào trần) Tế bào thực vật được xử lý bằng hóa lý để tách lớp vỏ cellulose, nhưng vẫn còn giữ chức năng của tế bào. Trong môi trường thích hợp, protoplast có thể phân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Với cách nuôi cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau. 1.2. Sơ lược về môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 1.2.1. Môi trường khoáng cơ bản Môi trường dinh dưỡng cơ bản là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự thành công của trong việc nuôi cấy in vitro thực vật (Gamborg et al., 1976). Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), Ngay từ những giai đoạn đầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thưc vật, Gautheret (1939) và White (1943) đã đề xuất các môi trường nuôi cấy mô sẹo, mô rễ. Do đối tượng nghiên cứu, mục đích nghiên cứu rất khác biệt đòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thich hợp khác nhau, việc nghiên cứu đề xuất các môi trường nuôi cấy mới đã được liên tục phát triển. Theo tổng kết của Georgen và cộng sự (19/87) hiện đã có 685 loại môi trường nuôi cấy mô thực vật đã được công bố. 9
25. Bảng 1.1. Một số môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro. Thành phần môi trường White MS B5 SH N6 NN DKW WPM trường nuôi (1963) (1962) (1968) (1972) (1975) (1969) (1981) (1984) dưỡng NH4NO3 1650 720 1416 KNO3 80 1900 2500 2500 2830 950 CaCl2H2O 440 150 200 166 166 149 96 MgSO4.7H2O 750 370 250 400 185 185 740 370 KH2PO4 170 400 68 265 170 (NH4)2SO4 134 463 (NH4)H2PO4 300 NaH2PO4.H2O 19 150 K2SO4 1559 990 Ca(NO3)2.4H2O 300 1968 556 Na2SO4 200 KI 0,75 0,83 0,83 1,0 0,8 H3BO3 1,5 6,2 6,2 0,5 1,6 10 4,8 6,2 MnSO4.4H2O 5,0 22,3 22,3 3,3 19 MnSO4.H2O 10 33,6 22,3 ZnSO4.7H2O 3,0 8,6 8,6 1,0 1,5 10 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,1 0,25 0,25 0,39 8,6 MoO3 0,001 CuSO4.5H20O 0,01 0,025 0,025 0,2 0,025 0,025 0,025 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,1 0,025 0,025 0,025 NiSO4.6H2O 0,005 Zn(NO3)2.6H2O 17,0 Na2EDTA 37,3 37,3 20 37,3 37,3 45,4 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 15 27,8 27,8 33,8 37,8 Fe2(SO4)3 Myo-insositol 2,5 100 100 1000 100 100 100 Acid nicotinic 0,05 0,5 1,0 5,0 0,5 5,0 1,0 0,5 MS: Murashige và Skoog; B5: Gamborg và cộng sự, 1968; N6: Chu và cộng sự, 1975; SH Schenk et Hildebrandt, 1972; NN: Nísch và Nisch 1969; DKW: Driver – Kuniyuki Walnut, 1984; WPM: Woody Plant Medium (Lloyd G, Mc Cown B., 1980). 10
26. Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm: Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: đại diện là môi trường MS (1962), ER (Erksson 1965): nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là các muối nitrat, amon, kali, các nguyên tố vi lượng đầy đủ. Môi trường thuộc nhóm này thích hợp với hầu hết các loại và đối tượng nuôi cấy. Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: đại diện là các môi trường N6, B5, SH. Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS, nhưng đặc biệt có hàm lượng muối nitrat kali cao. Nhóm môi trường này thích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành callus và phân hóa chồi. Nhóm thứ 3 là môi trường nghèo dinh dưỡng: đại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch và Nitsch. Môi trường này có hàm lượng muối đa lượng chỉ bằng ½ môi trường MS, nhưng hàm lượng các muối vi lượng và hàm lượng vitamin thì phong phú hơn so với MS. Môi trường này thích hợp cho nuôi cấy bao phấn nhiều loại cây nhất là cây họ Cà Nhóm thứ tư là nhóm môi trường thích hợp để nuôi cấy các cây nhân gỗ: môi trường WPM, DKW, Thành phần chủ yếu của môi trường nuôi cấy là dinh dưỡng vô cơ (Nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng) dinh dưỡng hữu cơ nguồn cacbon, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chất làm đông tạo giá thể. Thông thường thành phần môi trường nuôi cấy biểu thị thành phần cơ bản của môi trường dinh dưỡng vô cơ và dinh dưỡng hữu cơ cơ bản, nguồn cacbon và pH (bảng 1.1). Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các chất dinh dưỡng hữu cơ khác vào môi trường hoàn toàn phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu riêng. 1.2.1.1. Môi trường MS Lịch sử nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng 11
27. cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gene, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu. Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. Nguồn carbon. Các vitamin và amino acid. Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường. Các chất điều hòa sinh trưởng. ➢ Các khoáng vô cơ Thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan trong cơ thể thực vật (Anderson, 1980). Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K. Đạm (N) giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu, cây sinh trưởng kém, cằn cỗi, Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau: CO(NH2)2 : Urea (46% N) (NH4)2SO4 : Ammonium sulfate (22% N) KNO3 : Potassium nitrate (14% N) NH4NO3 : Ammonium nitrate (34% N) NaNO3 : Sodium nitrate (16,4% N) Ca(NO3)2 : Calcium nitrate (15,5% N) 12
28. Lân (P): giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng, Các chất có thể cung cấp lân: Super Lân : (20% P2O5) (NH4)2HPO4 : Diammonium phosphate DAP (46% P2O5) (NH4)3 HPO4.3H2O : Triammonium phosphate (15,21% P) KH2 PO4 : Potassium phosphate (10,35% P) Potassium (K): tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa, Các chất cung cấp potassium như: KC1 : Potassium chloride (60% K2O). KH2PO4 : Monopotassium phosphate (40% K2O). K2SO4 : Potassium sulfate (48% K2O). KNO3 : Potassium nitrate (44% K2O). Nhóm bán đa lượng Gồm các nguyên tố: Ca, Mg, S. Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc, Các chất cung cấp Ca như: CaCl2 (Calcium Chloride), Ca(NO3)2 (Calcium nitrate). Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm nhiều trở nên quá mập, tán lá rợp xuống, dễ bị gãy. Thiếu Ca cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được. Magnesium (Mg): thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. Nếu dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị khô héo. Thiếu Mg bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá lại èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá. Sulfur (S): là thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng. Thường (S) có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4, Thiếu S cây sẽ cằn cỗi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu. Nhóm vi lượng Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo, Mn, Fe, Các nguyên tố 13
29. này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn Xuân hóa (Lê Văn Chi, 1992), ngoài ra nó còn là thành phần của enzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hoá trong cơ thể. Sắt (Fe): đóng vai trò tạo diệp lục tố, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu sắt làm lá cây có màu xanh lợt, cây không quang hợp tốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. Đồng (Cu): thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc. Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. Kẽm (Zn): Zn giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây, đồng thời giảm tưới lân. Mangan (Mn): thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây. Molypden (Mo): điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (sodium molybdate) để cung cấp Mo cho cây. Cobalt (Co): cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nồng độ sử dụng là 1 μM, đôi khi người ta có thể sử dụng nồng độ cobalt cao gấp 10 lần. Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp nucleic acid nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy. Một trong những mục đích của việc bổ sung cobalt vào môi trường nuôi cấy có lẽ là chống lại sự gây độc của các chelate kim loại và có thể ngăn cản các phản ứng oxy hóa gây ra bởi đồng và sắt. Cobalt kết hợp với lưu huỳnh dưới dạng CoSO4 và đạm nitrogen dưới dạng Co(NO3)2. Sodium thiosunfate (Na2S2O3): nuôi cấy mô thực vật sử dụng với các muối sulfate cung cấp nguồn thiosulfate đặc biệt khi và chỉ khi phức của bạc sulfate được thêm vào môi trường. Gần đây, Steinitz et al., (2010) nhận thấy rằng bổ sung sodium thiosulfate (Na2S2O3) vào môi trường kích thích rõ rệt sự phát triển 14
30. ở loài thực vật họ Đào kim nương Corymbia maculata, nghiên cứu chỉ ra rằng 2- thiosulfate (S2O3) trong bạc thiosulfate góp phần vào sự phát triển của việc nuôi cấy. 1.2.1.2. Môi trường SH Năm 1983 ông David Stuart and Steven Strickland đã nuôi cấy thành công phôi soma của cây Linh lăng (Medicago sativa L. ) môi trường SH có bổ sung proline trung bình với 50 – 300 mM L – proline Năm 2014, Nguyễn Hữu Hồ và cộng sự đã nuôi nhân sinh khối mô sẹo sinh phôi đối tượng sâm ngọc linh không dùng chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong bình tam giác và bioreactor dùng môi trường ½ SH có và không có 10% nước dừa. Nuôi nhân sinh khối cụm mô phôi có rễ bằng bioreactor cũng được thực hiện có kết quả dùng môi trường SH có bổ sung 1-2 mg/l IBA nuôi cấy thành công các loại hệ thống mô tạo tiền đề cho việc nhân giống sâm thông qua phôi soma Alma Neri-Soto. (2015) cũng đã nhân giống in vitro thành công cây Chihuahuana Picea qua việc nuôi cấy hạt cây này trên môi trường SH. 1.2.1.3. Môi trường N6 Chu lập phương tiện này và nó được sử dụng cho ngũ cốc nuôi cấy bao phấn, bên cạnh việc nuôi cấy mô khác. Chu (N6) vừa được xác định để cải thiện sự hình thành, phát triển và biệt hóa của phấn hoa mô sẹo trong gạo. Nồng độ amoni được chứng minh là rất quan + trọng cho sự phát triển của mô sẹo. Nồng độ tối ưu NH4 là 7,0 mM (tương đương 3,5 mM (NH4) 2SO4). nồng độ cao hơn của amoni mạnh ức chế sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo. Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sự phát triển của (N6) vừa callus. Môi trường N6 (Chu 1978) được xác định để cải thiện sự hình thành, phát triển và biệt hóa của phấn hoa mô sẹo trong gạo. Nồng độ amoni được chứng minh là rất quan trọng cho sự phát triển của mô sẹo. Nồng + độ tối ưu NH4 là 7.0 mM (tương đương 3,5 mM (NH4)2SO4). Nồng độ cao hơn của amoni mạnh ức chế sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo. 15
31. Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo. Chu (N6) vừa được xác định để cải thiện sự hình thành, phát triển và biệt hóa của phấn hoa mô sẹo trong gạo. Nồng độ amoni được chứng minh là rất quan trọng cho sự phát triển của mô sẹo. Nồng độ tối ưu NH4 + là 7.0 mM (tương đương 3,5 mM (NH4)2SO4. Nồng độ cao hơn của amoni mạnh ức chế sự phát triển và biệt hóa của các hạt phấn hoa gạo. Nồng độ của KNO3 và các thành phần khác vừa không ảnh hưởng đến sự phát triển của mô sẹo. Trần Đình Giỏi cùng cộng sự (2002) đã nuôi cây thành công mô sẹo cây lúa cao sản trên môi trường N6. Cũng trên môi trường N6, theo Jaruwan Summart và cộng sự (2008) để tăng tốc độ tăng trưởng trong nuôi cấy mô sẹo cây lúa thì bổ sung thêm bổ sung thêm 4% sucrose trong môi trường nhân giống. 1.2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng và hợp chất hữu cơ 1.2.2.1. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất điều tiết sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hoá học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Khác với các chất cần thiết cấu tạo nên cơ thể thực vật như: protein, carbohydrate, acid nucleic, Chất điều tiết sinh trưởng với một lượng rất nhỏ nhưng nó có vai trò quan trọng. Nó điều chỉnh tất cả các quá trình phát triển và hoạt động sinh lý của cây. Chất điều tiết sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Các chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ sinh lý có tác dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của cây gọi là các chất kích thích sinh trưởng. Còn các chất điều hoà sinh trưởng nhìn chung ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng gọi là chất ức chế sinh trưởng. Vai trò điều hoà của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó. 16
32. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberelin và ethylene cũng là những chất có vai trò quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật. Auxin Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là acid indol acetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA- glucan, IAA-aspartate, Các dẫn suất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol. Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở định chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật: lá, rễ và các mô dự trữ, Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D, ). Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: tốc độ sinh trưởng, trạng thái ngủ, sự ra hoa, sự kết trái, sinh trưởng quả, sự chín của quả, sự rụng quả và rụng lá, tạo củ, sự lão hóa, Các loại hormone thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hormone khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hormone khác. Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào. Cytokinin Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purine. Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ hạt ngô. Ngoài ra còn có hàng loạt 17
33. cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngừơi ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt DNA. Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside. Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi acid nucleic và protein. Gibberellin Là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane. Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. Acid abscisic Là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải caroteniod. Acid abscisic được sinh tổng hợp trong các lạp thể (Neill và Horgan, 1984; Milborrow, 1974). Vai trò quan trọng của ABA như là một chất cảm ứng với stress đã được biết trong nhiều năm qua. 18
34. Xử lý ABA ngoại sinh gây đóng khí khẩu trong điều kiện sáng và duy trì cho đến khi ABA bị chuyển hóa. Trong điều kiện stress do thiếu nước ABA có thể gia tăng lên 20 lần. Hàm lượng ABA gia tăng khi cây bị stress do mặn, lạnh và nóng. Những sự biến đổi này là nguyên nhân của sự thiếu nước. Việc xử lý ABA ngoại sinh có thể làm cho một số loài cây chống lại điều kiện lạnh và mặn. Trong điều kiện ngày ngắn, hàm lượng ABA gia tăng trong lá và mầm chồi đã dẫn đến sự miên trạng. Tuy nhiên cũng có trường hợp trong điều kiện ngày ngắn gây ra sự miên trạng trong vài loài lại không có sự gia tăng ABA nội sinh. Việc xử lý ABA ngoại sinh lên mầm chồi và lên hột đã kích thích miên trạng của chúng. Từ khi mới được phát hiện, ABA được xem là chất gây nên sự rụng lá, trái và hoa. Thật ra điều đó không hoàn toàn đúng và ABA không trực tiếp ảnh hưởng lên sự rụng. ABA có thể tác động gián tiếp lên quá trình lão hóa trước trưởng thành và làm gia tăng sự sản sinh ethylene và ethylene đánh thức một số gene liên quan đến sự rụng. Ngày nay người ta biết rằng ABA có nhiều ảnh hưởng về mặt sinh lý, sinh hóa và phân tử trong hột cũng như có mặt phổ biến trong lúc hột phát triển. Tuy nhiên vai trò trực tiếp của ABA đối với các quá trình này vẫn còn chưa rõ. Ethylene Những người Ai Cập đã không biết rằng ethylene chính là tác nhân gây chín trái khi họ tạo vết thương trên trái. Ngày nay, ethylene đã được biết là hormone điều hoà sự chín trái. Năm 1901, Neljubow chứng minh ethylene ức chế sự vươn dài, kích thích sự phát triển theo chiều ngang. Ngày nay, người ta biết được ethylene có khả năng kích thích hoặc ức chế sự vươn dài của thân, rễ hoặc những cơ quan khác. 19
35. 1.2.2.2. Sơ lược về than hoạt tính và nước dừa trong nhân giống in vitro Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng than hoạt tính và nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết chuối xanh, khoai tây, cà chua và dịch chiết nấm men, casein thủy phân, để nhân giống nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Hiệu quả thúc đẩy quá trình tăng trưởng này được giải thích bằng những vitamin, amino acid và những chất điều hòa khác chứa trong chúng (Perik, 1987). Nước dừa Năm 1941, Van Ovebeck đã xác nhận tác dụng kích thích của cây dừa trong nuôi cấy phôi họ Cà. Năm 1948, Steward cũng thu được kết quả như vậy ở mô cà rốt. Nước dừa vô trùng đã được Trung tâm Sâm Việt Nam dùng làm một thành phần trong môi trường nuôi cấy mô tạo sinh khối mô Sâm K5 thành công từ năm 1983. Ngoài ra đã sử dụng trong nuôi cấy thành công trong các loài cây khác như đảng sâm di thực, phong lan, Nhiều công trình nghiên cứu xác định trong nước dừa ngoài khối lượng nước chiếm 90% còn có các chất đường, amino acid, lipid, vitamin, các nguyên tố vi và đa lượng, acid hữu cơ, các chất kích thích sinh trưởng. Theo Tuleke, amino acid ở nước dừa xanh chiếm hơn 40% amino acid tổng số là glutamine, ở nước dừa già cũng có một số lượng lớn acid glutamic, glutamine, serin, leucin, acid amino butyric. Ngoài ra trong nước dừa còn có các acid hữu cơ có chứa acid hữu cơ có chứa acid malic, sikimic, quinic và các nguồn hydrate carbon khác như saccharose, glucose, fructose. Theo Vandebelt (1954), trong nước dừa có nhiều vitamin như acid nicotinic, acid pantotenic, biotin, riboflavin, acid folic, thiamin và pyridoxine. Theo Paris, Duhamat (1953) trong nước dừa có chứa IAA. Còn Radiey (1958) phát hiện cả gibberellin trong dịch thực vật này. Nước dừa có chứa một số hợp chất hữu cơ và chất dinh dưỡng khoáng chất quan trọng trong sự phát triển của thực vật, đóng một vai trò quan trọng như bộ 20
36. đệm sinh lý. Nước dừa giàu Magnesium, Phosphate và chứa lượng đường cao khoảng 2,5% (w / v). Bên cạnh đó, nước dừa còn chứa nhiều acid amin, vitamin, khoáng và hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng cao, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Krikorian, 1991), (Ge et al, 2005; Yong et al, 2009). Trong những năm qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng nước dừa bổ sung vào môi trường vi nhân giống của các loài thực vật có giá trị kinh tế cao như chanh dây (Hall et al., 2000), cà phê (Ismail et al., 2003) và hoa lan (Santos -Hernandez et al., 2005) Trevisan et al. 2005 cũng đã chứng minh những ưu điểm của nước dừa cho sự phát triển chiều cao của chanh dây. Villa et al. (2010) làm việc với các giống cây ô liu 'Ascolano 315' báo cáo rằng bổ sung 25ml/ L nước dừa kết hợp với 500 μg/L BAP tạo ra cây con có chiều dài thân và sinh khối tươi nặng hơn so với cây con trồng theo phương pháp truyền thống. Peixe và cộng sự., 2007 báo cáo rằng việc sử dụng nước dừa như một thành phần của môi trường nuôi cấy có thể cải thiện sự tăng trưởng của phôi cây ô liu. Các tác giả quan sát thấy rằng nước dừa kết hợp với BAP thay thế thành công zeatin trong nuôi cấy in vitro của cây trồng ô liu Galega vulgar. Nasib và cộng sự., 2008 cũng đã chứng minh việc sử dụng 20% (v / v) nước dừa kết hợp với BAP trong nhân giống in vitro cây Kiwi giúp tăng trưởng chiều cao và số lượng lá. Theo báo cáo trong Grigoriadou et al. (2002), sự kết hợp của nước dừa với cytokinin là cách hiệu quả nhất để có thể cải thiện đáng kể số lượng chồi trong nhân giống cây phỉ Corylus avellana L. Sandoval Prando, 2014 cho biết, bổ sung 20% nước dừa kết hợp với 2 mg / L BAP, 0,01 mg / L IAA và 0,5 mg / L GA3 là hiệu quả nhất trong nhân nhanh số lượng chồi cây phỉ Corylus avellana L. Từ các công trình trên nó có thể được quan sát thấy vai trò của nước dừa trong nuôi cấy in vitro. Vì vậy, mục đích của thí nghiệm này là để xác định liều 21
37. lượng tốt nhất của nước dừa bổ sung vào môi trường MS giúp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà. Than hoạt tính: Trước đây, than hoạt tính thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng. Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật (Pan and Staden., 1998). Vai trò của than hoạt tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy (Biniak S., Kazmierczak và Swiatkowski., 1990, Pan và Staden., 1998). Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin (Ebert và Taylor., 1990, Fridborg., Pederson., Landstrom và Eriksson T., 1978), làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường (Wann., Veazey và KaphammerJ., 1997). Từ khi than hoạt tính được ứng dụng trong nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường nuôi cấy (Buter ., Pescitelli., Berger., Schmid và Stamp., 1993, Wann., Veazey và Kaphammer., 1997), tăng cường khả năng tái sinh cây (Krajňáková., Gömöry và Häggman., 2009), phát sinh phôi (Johansson và Eriksson., 1977, Mathews., Schopke., Carcamo., Chavarriaga., Fauquet và Beachy., 1993), tăng sinh tế bào trần (Kunitake H., Nakashima T., Mori K., Tanaka M. và Mii M., 1995), ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con (Ziv và Gadasi., 1986), kích thích quá trình hình thành và phát triển chồi (Kee-Yoeup và Eun-Joo., 2000), thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ (Christopher., Veronica và Roberto., 2012, Dumas and Monteuuis., 1995 , Takayama và Misawa., 1980); ngoài ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài thực vật (Debergh Harbaoui và Lemeur., 1981). 22
38. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Nhật Linh và cộng sư, 2012 cho biết đối với sự sinh trưởng và phát triển cây in vitro, nồng độ than hoạt tính thích hợp nhất bổ sung vào môi trường MS cho sự sinh trưởng phát triển chồi với mật độ khí khổng gia tăng đáng kể và sự hình thành rễ của chồi Hồng môn là 2 g/l và Cúc là 3 g/l. Vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới với thể tích 20 ml là tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của cây Hồng môn và Cúc nuôi cấy in vitro. Đối với sự định hướng rễ in vitro, sự phát triển và kéo dài của đa số các rễ đều phụ thuộc vào vị trí lớp than hoạt tính và hầu hết các rễ của hai loại cây trồng này đều chỉ tăng trưởng trong lớp than hoạt tính (Hồng môn trên 95%, Cúc trên 80%). Ngoài ra, ở Hồng môn thì vị trí lớp than hoạt tính nằm dưới cho thấy hệ thống mạch dẫn tăng kích thước rõ ràng hơn Cúc. Hơn nữa, ở rễ Cúc khi thay đổi vị trí lớp than hoạt tính sẽ ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của lông hút và tại vị trí lớp môi trường nằm dưới cho thấy số lượng lông hút hầu như không giảm so với ở môi trường không có than hoạt tính. Theo Nguyễn Thị Kim Yến và Dương Tấn Nhựt, 2013, môi trường MS 1 lớp có bổ sung 1 g/l than hoạt tính là thích hợp nhất cho giai đoạn tạo rễ cây hoa Đồng tiền in vitro. Tuy nhiên, khi sử dụng than hoạt tính ở nồng độ thấp hoặc cao hơn lại không tác động đáng kể đến sự gia tăng sinh trưởng, ở nồng độ than hoạt tính thấp, chưa tạo được môi trường đủ tối cũng như hấp thụ các chất độc trong môi trường. Mặt khác, nồng độ 2,0 g/l than hoạt tính quá cao, đã làm thay đổi các thành phần của môi trường nuôi cấy cũng như hấp thu các hợp chất và chất điều hòa tăng trưởng cần thiết cho sự sinh trưởng của cây và trở nên không hiệu quả trong việc kích thích sự sinh trưởng của cây. Than hoạt tính không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng có thể làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thu nhiều hợp chất khác nhau, mà các chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường, hấp thu các chất tiết ra từ mẫu cấy cũng như các chất điều hòa sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, ngăn chặn sự phát triển mô sẹo không mong đợi. Ngoài ra than hoạt tính còn góp phần đẩy mạnh sự phát sinh phôi và sự hình thành rễ. Trong một số nghiên cứu về ảnh hưởng của than hoạt tính khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đã thấy sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường 23
39. nuôi cấy rất quan trọng trong việc làm tăng chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và trọng lượng khô, và làm giảm sự hình thành chồi nách từ mô cấy một cách rõ rệt. Ngoài ra, mẫu cấy được nuôi cấy trong môi trường có than hoạt tính khỏe mạnh, có màu xanh đậm, còn ở môi trường không có than hoạt tính mẫu cấy yếu hơn và lá hơi vàng. 1.3. Giới thiệu sơ lược về cây Bạc hà Bạc hà là một vị thuốc rất phổ biến ở nước ta, được sử dụng rộng rãi cả trong Tây y và Đông y. Bạc hà có tên khác là kim tiền bạc - thạch Bạc hà - liên tiền thảo, Trong tinh dầu có chứa menthol, từ đó người ta đã chế ra nhiều loại thuốc như: dầu cù là, dầu cao con hổ, kẹo ngậm ho Bạc hà, rượu Bạc hà, thuốc đánh răng Bạc hà Cây Bạc hà là một loại cây trồng có giá trị kinh tế lớn. nó mọc dại và được trồng cây Bạc hà cũng không quá phức tạp trên thế giới và ở Việt Nam. Kỹ thuật trồng Bạc hà cũng không quá phức tạp vì vậy có thể tận dụng tròng trong vườn thuốc gia đình hay trồng tập trung thành các khu lớn nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người. Tuy nhiên cũng như nhiều loại cây thuốc khác, cây Bạc hà chưa thực sự được quan tâm đúng với giá trị của nó 1.3.1. Phân loại: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Lamioles Họ : Lamiaceae Chi : Mentha Loài : Mentha Arvensis L. Hình 1.1: Cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Họ Hoa môi (danh pháp khoa học: Lamiaceae hay Labiatae), còn được gọi bằng nhiều tên khác như họ Húng, họ Bạc hà, là một họ thực vật có hoa. Loại cây này từng được coi là có họ hàng gần với họ Verbenaceae nhưng một số nghiên cứu phát sinh loài gần đây đã chỉ ra rằng một loạt các chi được phân loại 24
40. trong họ Verbenaceae thực chất là thuộc về họ Lamiaceae, trong khi các chi cốt lõi của họ Verbenaceae thì không có quan hệ họ hàng gần với Lamiaceae mà là có quan hệ họ hàng gần hơn với các thành viên khác của bộ Lamiales. Họ Lamiaceae có khoảng 200 chi và khoảng 3500 loài (theo hệ thống phân loại APG III. Trong hầu hết các phần của thực vật trong họ này đều có hương thơm và bao gồm nhiều loài cây thân thảo được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực, như húng quế, Bạc hà, hương thảo, xô thơm, hương Bạc hà, ô kinh giới, ngưu chí, bách lí hương, oải hương, tía tô, hương nhu. Một số loài là cây bụi hay cây gỗ, hiếm gặp hơn là các dạng dây leo. Nhiều loài được gieo trồng rộng rãi, không chỉ vì hương thơm của chúng mà còn vì dễ gieo trồng, dễ nhân giống nhất bằng các giâm cành. Bên cạnh những loài lấy lá để ăn, làm gia vị còn một số loài được trồng làm cảnh như húng chanh. Một số loài khác được trồng vì mục đích lấy hạt (chứ không phải lá) làm thực phẩm, như hạt cây Chia. Tên gọi nguyên gốc của họ này là Labiatae, do hoa của chúng thông thường có các cánh hoa hợp thành môi trên và môi dưới.Tên gọi này hiện nay vẫn là hợp lệ, nhưng phần lớn các nhà thực vật học hiện tại thích sử dụng tên gọi "Lamiaceae" hơn khi nói về họ này. Bạc hà là cách gọi của người Việt ta. Ở một số địa phương khác còn có cách gọi khác là Bạc hà nam. Đây là loài phổ biến nhất ở nước ta. Có tên khoa học là Mentha arvensis L. Tùy theo từng khu vực khí hậu ở mỗi nước cũng như mỗi châu lục mà Bạc hà có đặc điểm và thành phần tinh dầu khác nhau. Do đó, chi Bạc hà (Mentha) được phân loại với hơn hàng trăm loài, với các loài phổ biến như: + Mentha piperita L. (Bạc hà âu) cho tinh dầu với tên thương phẩm là peppermint oil (Oleum Menthae piperita), thành phần chính của tinh dầu là menthol (50-68%). + Mentha arvensis L. (Bạc hà á) cho tinh dầu với tên thương phẩm là Cornmint oil (Oleum Menthae arvensis), thành phần chính của tinh dầu là menthol (>70%). 25
41. + Mentha spicata L. (Bạc hà bông) cho tinh dầu với tên thương phẩm là Native Spearmint, thành phần chính của tinh dầu là carvon (>50%). + Mentha cardiaca Gérard ex Baker (Bạc hà bông) cho tinh dầu với tên thương phẩm là Scotch Spearmint, thành phần chính của tinh dầu là carvon (>50%). + Mentha citrate Ehrh., (Bạc hà chanh) cho tinh dầu với tên thương phẩm là Bergamot mint oil, thành phần chính của tinh dầu là linalyl acetat (33 74%) và linalool (25 52%). + Mentha pulegium L. (Bạc hà bông) cho tinh dầu với tên thương phẩm là Pennyroyal oil, thành phần chính của tinh dầu là pulegon (80%). 1.3.2. Nguồn gốc, phân bố, và đặc điểm hình thái sinh học 1.3.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố Trên thế giới hiện nay có 2 loại bà hà chính và cho 2 loại tinh dầu khác nhau. Đã được trồng cách đây khoảng 2000 năm, tại các quốc gia khác nhau: Bạc hà Châu Âu: được trồng nhiều ở nước Anh (vùng Mitsam). Tại Pháp bạc hà được trồng có nguồn gốc là ở Mitsam (Anh) đây cũng là giống lai được vẫn được giữ nguyên được tính chất từ thế kỷ XIX đến nay (theo Emperrot). Vào cuối những năm của thế kỷ XIX (1840) và đầu của thế kỷ XX các nước Pháp, Italia, Đức, Bungari, Nam Tư và Liên Xô cũ cũng đã trồng được Bạc hà trên diện rộng để lấy tinh dầu và thị trường quốc tế cũng đã có nhiều nước bắt đầu xuất khẩu tinh dầu Bạc hà. Trong thời gian này các nước Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, đã có mặt hàng này xuất khẩu, vào năm 1986 Nhật Bản dẫn đầu khi có sản lượng tinh dầu xuất khẩu lớn, chiếm 50% sản lượng tinh dầu toàn thế giới Bạc hà châu á (hay còn được gọi là bạc hà nam): được trồng nhiều tại các nước Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Brazil. Tại Việt Nam, Bạc Hà châu á được phát hiện mọc hoang ở Việt Bắc như Lào Cai, Sơn La, Lai Châu, được đưa về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển. Vì vậy, đã di thực nhiều chủng bạc hà có năng suất cao hơn như: Bạc hà 974, 975, 976 và Bạc hà Đài Loan. Riêng đối với chủng 974 được trồng nhiều ở cả hai miền Nam Bắc vì chủng này có nhiều ưu điểm: chịu hạn, chịu sâu bệnh, chịu rét. 26
42. Bac hà á ở Việt Nam có 2 nguồn gốc chính: Bạc hà bản địa: mọc hoang ở các tỉnh Lào Cai, Sơn La, Lai Châu. Cây có thể cao đến 1,50m. Thân màu xanh, xanh lục hoặc màu tím. Loại này đưa về đồng bằng trồng cho năng suất cây xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng methol trong tinh dầu thấp nên không đạt giá trị kinh tế. Ngoài ra, còn phát hiện các chủng mọc hoang khác ở một số vùng khác nhau, phổ biến nhất là chủng giàu piperiton oxyd và pulegon Hiện nay ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại Bạc hà hoa màu trắng hồng, mọc vòng quanh kẽ lá. Thành phần menthol trong tinh dầu loài Bạc hà này rất thấp (3,6 – 8,2%), trong khi đó tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 –56,5%). Loại này được bán trong vùng để sử dụng làm thuốc. Bạc hà di thực có rất nhiều chủng loại: Bạc hà 974 là giống Bạc hà 974 được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và các tỉnh phía Nam, Bạc hà 976, Bạc hà Đài Loan, Một số giống đang nghiên cứu TN8 và TN26, Bạc Hà Nhật. 1.3.2.2. Đặc điểm hình thái sinh học Rễ: Rễ Bạc hà thuộc loại rễ chùm. Rễ mọc từ các đốt thân ngầm dưới mặt đất và phân bố ở tầng đất có độ sâu 20 – 30cm. Thân ngầm phát triển đến đâu thì bộ rễ lan rộng tới đó. Do bộ rễ phân bố nông nên khả năng hút dinh dưỡng và nước yếu cho nên trong trồng trọt phải chú ý đến biện pháp kỹ thuật làm đất trước khi trồng đảm bảo cho đất tơi xốp thông thoáng, việc lên luống tạo tầng đất mặt dày, tơi xốp; tưới nước đủ và trồng mật độ thích hợp là rất cần thiết để cây Bạc hà đạt sinh khối lớn. Rễ cây Bạc hà thích hợp với ẩm độ đất khá cao khoảng 70 – 80 %. Tuy nhiên chúng không chịu được ngập úng, kể cả vùng đất úng ngập cục bộ. Khi bị úng ngập thường ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cả bộ rễ và các thân ngầm, trong điều kiện ẩm độ đất quá lớn cả thân ngầm và bộ rễ đều có thể bị nấm gây bệnh thối thân, thối rễ. Thân và cành: Thân Bạc hà là loại cây thân thảo, chiều cao của cây, chiều dài của cành gồm có nhiều đốt, các đốt ở thân, cành đều có khả năng phát sinh rễ và phát sinh các 27
43. mầm cành thứ cấp tại các mắt đốt. Chiều cao của cây biến động trung bình từ 0,6 – 1,2 m và là cây trồng một năm. Các mầm cành phát sinh và trở thành đoạn thân trên mặt đất (thân khí sinh). Ở phần thân này mỗi mắt đốt mang một đôi lá, mỗi nách có hai mầm cành (mọc đối nhau từng đôi một, bên dưới mỗi mầm cành có nhiều mầm rễ và có khả năng phát triển thành các rễ ở một vài đốt gần mặt đất. Thân, cành Bạc hà có góc cạnh khá rõ, màu sắc tuỳ thuộc vào giống (xanh đậm, xanh nhạt hoặc tím). Màu sắc của thân cành cũng tương ứng với màu sắc của lá và hoa. Tuy phát sinh trong đất nhưng các thân ngầm này vẫn tiếp tục phân các nhánh thân ngầm cấp 2. Đốt thân ngầm càng nhiều thì khả năng ra rễ cũng như các nhánh thân càng nhiều. Khi phần thân trên mặt đất ở giai đoạn ra hoa thì phần thân ngầm và rễ đã phát triển mạnh đan xen nhau nhiều trong tầng đất mặt từ 0 – 20 cm. Lá: Lá là bộ phận chính chứa tinh dầu nên đây là bộ phận kinh tế của cây Bạc hà. Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất, không chỉ thực hiện các chức năng quang hợp, thoát hơi nước mà còn chứa các túi tinh dầu. Lá là bộ phận thu hoạch để chưng cất tinh dầu, chiếm 50% tổng khối lượng phần sinh khí trên mặt đất. Tỷ lệ tinh dầu trong lá phụ thuộc vào bản chất di truyền của giống và thường dao động 2 – 6% so với khối lượng khô. Lá Bạc hà là lá đơn, mọc đối trên thân, có màu xanh hoặc đỏ tím, chiều dài lá 4 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm, phía trên và phía dưới của bề mặt lá đều có các túi tinh dầu, thường thì số lượng túi tinh dầu ở phía trên nhiều hơn. Túi tinh dầu ở dạng lông tiết (loại lông ngắn chủ yếu chứa tinh dầu), loại lông tiết dài chủ yếu làm nhiệm vụ che chở cho cây. Trên bề mặt phiến lá số lượng túi tinh dầu tăng từ mũi lá đến gốc lá, từ hai bên mép vào giữa phiến lá. Trên cây, lá từ đốt thứ 8 từ dưới lên phát triển nhất và chứa nhiều tinh dầu nhất trong cây. Hoa: Hoa Bạc hà là loại hoa chùm, hoa lưỡng tính nên có các bộ phận như đài, cánh hoa, nhị và nhuỵ. Đài có 5 cánh đối xứng hai bên, màu sắc của cánh hoa có màu tím, hồng nhạt hay trắng. Hoa có 4 nhị nhưng chỉ có 2 nhị là phát triển và có 28
44. hai bao phấn, 2 nhị kia thoái hoá phát triển kém trở thành nhị lép cho nên khả năng thụ phấn thụ tinh thấp. Trong điều kiện Việt nam không thể kết hạt được, do đó phương pháp nhân giống Bạc hà chủ yếu là nhân giống vô tính. Các loài Bạc hà châu Âu (M. piperita L.) là loại ra hoa hữu hạn, các hoa sắp xếp thành cụm trên đầu cành nở hoa trước. Bạc hà châu Á (M. avensis) hoa ra theo hình xim ở hai nách lá tạo thành vòng và ra hoa vô hạn (các đốt dưới của thân cành ra hoa trước). Khi Bạc hà bắt đầu có hoa là lúc cho thân lá cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg thân lá/ha) và hàm lượng tinh dầu trong lá cao. Đây là thời điểm thu hoạch tốt nhất, nếu để trên cây đã có 100% số hoa nở thì năng suất chất xanh giảm do lá bị rụng ở các đốt ra hoa sớm. Tinh dầu Bạc hà được chưng cất từ cây Bạc hà. Nó là một hỗn hợp có hàng chục các hợp chất có nguồn gốc khác nhau; trong đó có Menthol và Menthola là thành phần chính. Tinh dầu tập trung chủ yếu trong lá của cây Bạc hà và khối lượng lá thường chiếm khoảng 40 – 50 % tổng lượng phần cây trên mặt đất (thân, cành, lá, hoa, quả). Hàm lượng tinh dầu trong cây Bạc hà đạt từ 0,50% – 5,6%. Sự biến động này phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh. Giống Bạc hà châu Âu có hàm lượng tinh dầu cao hơn Bạc hà Châu Á. Tuy nhiên do lai tạo hiện nay một số giống Bạc hà Châu Á cũng có lượng tinh dầu cao. Tinh dầu Bạc hà là một chất lỏng linh động trong suốt hoặc có màu vàng nhạt hay xanh vàng, có khối lượng riêng (ở 20oC) từ 0,897 – 0,940, có mùi thơm đặc trưng và vị mát lạnh. + Hoạt chất Menthol và Menthola Menthol có công thức hóa học là C10H18O, Menthola là C10H10OH. Khi đem tinh dầu chiết xuất thì hai hoạt chất này là một chất rắn dạng tinh thể màu trắng, còn ở trong tinh dầu chưng ở dạng tự do hay kết hợp. Hàm lượng các hoạt chất này trong tinh dầu biến động từ > 80 – 90%. Menthola trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do, phần còn lại kết hợp với acid acetic. Loài Bạc hà nào có lượng menthola tự do cao sẽ cho chất lượng tinh dầu cao. Vì vậy Menthola là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dầu. 29
45. 1.3.2.3. Điều kiện sinh thái • Nhiệt độ và độ ẩm Cây Bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 27oC, trong thời kỳ ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 27oC. Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt độ < 10oC cây vẫn có thể sinh trưởng được. Trong thời kỳ tiềm sinh, Bạc hà có thể chịu được nhiệt độ rất thấp dưới -1oC. • Độ ẩm Cây Bạc hà không yêu cầu ẩm độ một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt năng suất cao về chất xanh và tỷ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu nước, do rễ cây Bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng kém hơn so với các loại cây trồng khác. Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất cao của cây Bạc hà quá trình sinh trưởng phát triển của cây cần đảm bảo đủ độ ẩm đất, ẩm độ biến động lớn sẽ gây rụng lá và tích lũy tinh dầu kém. Ẩm độ đất thích hợp là 70 – 75 %, ẩm độ không khí từ 75 – 80 %. • Ánh sáng Cây Bạc hà rất mẫn cảm với thời gian chiếu sáng (ngày dài, ngày ngắn) và cường độ chiếu sáng mạnh, đầy đủ. Để cây sinh trưởng và phát triển bình thường thì yêu cầu độ chiếu sáng trong ngày ≤ 12h. Độ dài ngày chiếu sáng 8 – 10 h, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa, hầu hết các dạng thân ngầm không chuyển sang dạng thân khí sinh, số cây trên đơn vị diện tích sẽ làm giảm năng suất chất xanh và lượng tinh dầu. Cây Bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ. Trong quá trình trồng Bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ, không trồng xen để đảm bảo ánh sáng hợp lý cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt. Ở nước ta thời vụ trồng thích hợp nhất là vụ xuân hàng năm. • Đất đai: Cây Bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt. Các loại đất phù sa ven sông suối, các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho Bạc hà. Các loại đất có thành phần cơ giới nặng như đất sét, đất không có cấu tượng như đất cát không thích hợp với Bạc hà. 30
46. Độ pH thích hợp cho Bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 – 3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỷ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất. • Dinh dưỡng: Trong từng giai đoạn sinh trưởng Bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau. Chú ý bón phân vào các thời kỳ: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh. Nguyên tố kali cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng tới tích lũy tinh dầu. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và ở việt nam 1.3.3.1. Trong nước Cây Bạc hà được đưa vào Việt Nam từ 9/1974. Cây Bạc hà đã được trồng nhiều ở các ngoại thành các thành phố lớn như Hà Nội, Nam Hà, Quảng Nam, Đà Nẵng, Tp Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An để khai thác tinh dầu. Năm 1977, nước ta đã có thể tự sản xuất được 50 tấn tinh dầu và 10 tấn methol chiết xuất từ tinh dầu mỗi năm. Cũng như nuôi cấy các cây vật liệu quý để bảo tồn duy trì nguồn gene và tạo dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng đang được phát triển (Phan Huy Báo và Lê Thị Xuân, 1998, Phan Thị Bảy và cộng sự, 1995, Bùi Ba Đồng, 1995). Năm 1998, DS Trần Việt Hưng cho biết rằng: Bạc hà là vị thuốc cảm thông dụng nhất trên thế giới trong cuốn “Thuốc Nam trên đất Mỹ”. Tháng 5 năm 2008, Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ (trường đại học Nông Lâm) nghiên cứu khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone ở Mentha Arvensis L. bằng nhiều phương pháp Năm 2009, Viện hóa học Công nghiệp nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tách menthol tinh thể từ tinh dầu Bạc hà Việt Nam phục vụ ngành Dược và Mỹ phẩm. 1.3.3.2. Ngoài nước Từ xa xưa, người Hy Lạp và La Mã đã biết cho Bạc hà vào sữa để bảo quản sữa lâu không bị chua, và dùng lá Bạc hà để hổ trợ hệ tiêu hóa. Còn người Do Thái rải lá Bạc Hà trong các thánh đường để tạo hương thơm dịu mát. 31
47. Năm 1771 tinh dầu Bạc hà bắt đầu nghiên cứu và sản xuất ở các nước phương Tây bởi Gaubiu. Theo nghiên cứu thực vật học thì Bạc hà lục có trước, sau đó là Bạc hà cay do được lai tạo tự nhiên (Bạc hà cay được chính thức ghi nhận là một giống mới vào năm 1696 và được ghi nhân vào Dược Điển Anh năm 1721) Những năm sau đó tiến sĩ Muhiy cho rằng: tinh dầu Bạc hà không màu hoặc màu vàng xanh, có mùi hương đặc trưng và vị hơi đắng. Bạc hà chứa nhiều hợp chất như acetate, mentyl, menthone và lượng nhỏ α-pinen, β-phellandrene, terpinene, cineole, ester, limoninecarfon, Bạc hà được người Pilgrims đưa sang Mỹ vào những năm của thế kỷ XVII. Bắt đầu từ năm 1816, Bạc hà đã được trồng trong vùng Rochester, New York. Năm 1840, Bạc hà đã phát triển ở Ohio, Michigan và sau đó là phát triển khắp miền Bắc Hoa Kỳ. Đến hôm nay, Bạc hà được trồng tại California, Oregon, Washington và nhiều tiểu bang khác nữa. Năm 1990, Erk và Kitto đã tiến hành nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh Bạc hà. Nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo của Mentha piperita và mentha spicata đã được báo cáo nhằm cho phép sản xuất và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp (Lin và Staba, 1961; Wang và Staba, 1963). Huyền phù tế bào đã được báo cáo sau đó để biến đổi tiền chất vào monoterpene (Aviv và Gulan, 1978; Aviv và etal, 1983). Triterpene được sản xuất bởi các mô sẹo của Mentha arvensis L. (Karasawa và Shimzu, 1980). Năm 1986, Rech và Pires nghiên cứu nhân chồi từ chồi nách của Mentha spp bởi các kỹ thuật nuôi cấy mô. Năm 1986, Repcakoa và cộng sự nghiên cứu vi nhân giống Mentha piperita L. thông qua nuôi cấy mô Herba hungarica. Năm 2013, Maity nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Mentha Arvensis L. thông qua nuôi cấy mô sẹo. 32
48. Năm 2014, Dar và cộng sự tiến hành sàng lọc hóa thực vật và khả năng chống oxy hóa của rễ cây Mentha Arvensis L. từ khu vực Kashmir. 33
49. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật, Khoa CNSH – TP – MT, trường Đại Học Công nghệ Tp.HCM Thời gian tiến hành Đề tài từ tháng 2/2016 đến tháng 8/2016 2.2. Phương pháp thí nghiệm 2.2.1. Chọn mẫu thí nghiệm Các đoạn cắt từ các chồi cây Bạc hà thu nhận từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng làm mẫu cấy. Độ dài các đoạn cắt khoảng 1cm - Các chồi để lấy mẫu cấy phải đáp ứng các điều kiện và yêu cầu sau - Cây phát triển hoàn chỉnh, cao trên 5 cm được cấy trên 2 tháng - Mẫu cấy phải vô trùng không bị nhiễm khuẩn, nấm và các vi sinh vật - Cây trong bình mô lấy mẫu cấy phát triển khỏe mạnh, bình thường, hình thái đồng đều, phát triển khỏe mạnh. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường để tiến hành thí nghiệm là môi MS (Murashige và Skoog 1962), SH (Schenk và Hildebrandt 1972), N6 (Chu et al, 1975). Môi trường này được bổ sung thêm 30 g/l đường, và các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau theo từng thí nghiệm. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8 bằng NaOH (1N), hoặc HCl (1N). Sau đó, được đổ vào bình thủy tinh được đậy kín (đã được khử trùng 2 lần ở nhiệt độ 121oC, 30 phút), rồi quấn giấy bên ngoài nút. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 20 phút. Sau đó được đặt lên giá sạch sẽ, khô thoáng. 34
50. 2.2.3. Bố trí thí nghiệm 2.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích quan sát tác động của môi trưởng MS (Murashighe và Skoog, 1962) lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Sau thí nghiệm này, tôi sẽ sử dụng kết quả của thí nghiệm này để so sánh với kết quả của các thí nghiệm sau. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS (Murashighe và Skoog, 1968) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (3mg/l), NAA (1mg/l), (30g/l) sucrose, thêm giá thể và tỉ lệ môi trường nuôi cấy thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.1 Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của MS cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà Nghiệm thức MS cải tiến A1 MS A2 ¾ MS A3 ½ MS A4 ¼ MS 35
51. 2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk và Heldebrandt, 1972) cải tiến lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích quan sát tác động của môi trưởng MS (Schenk và Heldebrandt, 1972) lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Sau thí nghiệm này, tôi sẽ sử dụng kết quả của thí nghiệm này để so sánh với kết quả của các thí nghiệm sau. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cách cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường SH (Schenk và Heldebrandt, 1968) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (3mg/l), NAA (1mg/l), (30g/l) sucrose, thêm giá thể và tỉ lệ môi trường nuôi cấy thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.2 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà Nghiệm thức SH cải tiến B1 SH B2 ¾ SH B3 ½ SH B4 ¼ SH 36
52. 2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích quan sát tác động của môi trưởng N6 (Chu et al, 1975) lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Sau thí nghiệm này, tôi sẽ sử dụng kết quả của thí nghiệm này để so sánh với kết quả của các thí nghiệm sau. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cắt cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường N6 (Chu et al, 1975) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (3mg/l), NAA (1mg/l), (30g/l) sucrose, thêm giá thể và tỉ lệ môi trường nuôi cấy thay đổi theo từng nghiệm thức bảng 2.3 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của N6 cải tiến lên quá trình hình thành chồi và sự phát triển tạo cây con hoàn chỉnh từ các đoạn cắt thân Bạc hà Nghiệm thức N6 cải tiến C1 N6 C2 ¾ N6 C3 ½ N6 C4 ¼ N6 37
53. 2.2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á Mentha Arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích quan sát tác động và xác định nồng độ thích hợp của việc bổ sung nước dừa, nhằm theo dõi sự tăng trưởng về chiều cao và sinh chồi của cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. so với điều kiện nuôi cấy cây truyền thống. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cách cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, bổ sung (30g/l) sucrose thêm giá thể nuôi cấy là agar và nồng độ nước dừa thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.4 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Nồng độ nước dừa Nghiệm thức (%) D0 0 D1 10 D2 20 D3 30 D4 40 38
54. 2.2.3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á Mentha Arvensis L. • Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp giúp tăng cường khả năng tái sinh cây thúc đẩy sự tăng trưởng, hình thành rễ kích thích quá trình hình thành, phát triển chồi ở cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và kích thích sự tăng trưởng của mẫu cấy so với điều kiện nuôi cấy cây truyền thống. • Tiến hành thí nghiệm Đoạn cách cây Bạc hà được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA (3mg/l), NAA (1mg/l), (30g/l) sucrose, thêm giá thể nuôi cấy và nồng độ than hoạt tính thay đổi theo từng nghiệm thức như bảng 2.5. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Nồng độ than hoạt tính Nghiệm thức (g/l) E0 0 E1 0,5 E2 1,0 E3 1,5 E4 2,0 39
55. 2.4. Chỉ tiêu theo dõi Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Chiều cao (cm) Chiều dài rễ (rễ/mẫu) Số lá (lá/cây) Số rễ (rễ/mẫu) Số chồi (chồi/mẫu) Chiều dài lá (cm) Đường kính lá (cm) Đặc điểm hình thái của mẫu 2.5. Thống kê và xử lý số liệu Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiênn, đơn yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Kết quả ghi nhận số liệu là giá trị trung bình. Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 40
56. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân Bạc hà có chiều dài 1,5 cm được dùng làm mẫu thủy canh in vitro để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) cải tiến lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái đoạn cắt thân Bạc hà dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không khác biệt nhiều về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Đến tuần thứ 8 ở các nghiệm thức khác nhau sự khác biệt về khả năng tăng trưởng của mẫu cấy rất rõ, có thể quan sát bằng mắt thường. Chúng tôi tiến hành thu thập kết quả, xử lý số liệu và trình bày ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, 3.2 và hình 3.1, 3.2. 41
57. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng MS Chiều Chiều Tổng Chiều Số chồi Chiều Nghiệm lượng lượng Số lá cải dài lá rộng lá số rễ dài rễ (chồi/ cao Đặc điểm thức tươi khô (lá/mẫu) tiến (mm) (mm) (rễ/mẫu) (mm) mẫu) (mm) (g) (g) cây phát triển ổn định, xanh, a a a a a a a a a chồi nhiều và mập. Chiều cao A1 1 2,95 0,22 88,667 7,667 7,333 73,667 51,000 7,333 87,333 cây chuẩn lại sau 7 tuần nuôi cấy 2,32b 0,18b 82,333b 6,667ab 6,667ab 58,000b 46,333b 6,000ab 78,000b A2 ¾ cây phát triển ổn định, lá xanh rễ ngắn hơn, sợi rễ dày và mập 2,09c 0,14c 68,333c 6,333b 6,333ab 38,333c 34,333c 4,333c 58,333c hơn. Số lá và số chồi tiếp tục A3 ½ giảm. Chiều cao cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy cây phát triển chậm, lá nhỏ, chồi 1,05d 0,09d d 5,667b 5,667b 30,333d 36,333c 2,667d 42,333d ít, thấp và mảnh, rễ mảnh. Chiều A4 ¼ 50,667 cao cây chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sai khác thống kê p < 0.05 42
58. 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 A1 A2 A3 A4 Khối lượng Khối lượng tươi (g) khô (g) Biểu đồ 3.1. ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với A1, A2, A3, A4, lần lượt tương ứng với các loại môi trường MS cải tiến khác nhau MS, ¾ MS, ½ MS, ¼ MS) 43
59. 100.000 90.000 80.000 70.000 60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.000 A1 A2 A3 A4 Số lượng Đường kính Chiều dài Số lượng Chiều dài Số lượng Chiều cao (mm) lá (lá/cây) lá (mm) lá (mm) rễ (rễ/cây) rễ (mm) chồi (chồi/cây) Biểu đồ 3.2. ảnh hưởng của môi trường MS lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với A1, A2, A3, A4, lần lượt tương ứng với các loại môi trường MS cải tiến khác nhau MS, ¾ MS, ½ MS, ¼ MS) 44
60. Hình 3.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến MS lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy. (Với A1, A2, A3, A4 lần lượt tương ứng với các loại MS, ¾ MS, ½ MS, ¼ MS) 45
61. Hình 3.2. Ảnh hưởng của môi trường MS cải tiến lên khả năng tăng trưởng từ đoạn cắt thân cây Bạc hà Á Mentha Arvensis L. không qua gia đoạn cảm ứng sau 8 tuần nuôi cấy ( A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với các loại môi trường MS, ¾ MS, ½ MS, ¼ MS) 46
62. • Kết quả và thảo luận Dựa vào kết quả ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, 3.2 hình 3.1, 3.2 cho thấy trong nhân giống in vitro cây Bạc hà, môi trường MS thích hợp cho sự tăng trưởng của chồi và cây. Nghiệm thức A1 cho kết quả tốt nhất về mọi chỉ tiêu. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 4 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, cây ở nghiệm thức A1, A2; sức sống của mẫu bị chậm ở nghiệm thức A3 và A4. Ở các giá thể khác nhau thì thái của cây cũng có sự khác nhau, cụ thể: ▪ Nghiệm thức A1: Môi trường MS toàn phần cây phát triển ổn định, xanh, chồi nhiều và mập. Chiều cao cây chuẩn lại sau 7 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức A2: Môi trường ¾ MS, cây phát triển ổn định, lá xanh, tuy nhiên không tốt như ở môi trường MS toàn phần. Các chỉ sổ sinh trưởng giảm. Chiều cao cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức A3: Môi trường ½ MS cây phát triển kém hơn A2, rễ ngắn hơn, sợi rễ dày và mập hơn. Số lá và số chồi tiếp tục giảm. Chiều cao cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức A4: Môi trường ¼ MS cây phát triển chậm, lá nhỏ, chồi ít, thấp và mảnh, rễ mảnh. Chiều cao cây chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy. Môi trường dinh dưỡng cơ bản là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự thành công của trong việc nuôi cấy in vitro thực vật (Gamborg et al., 1976), việc cắt giảm lượng môi trường khoáng ảnh hưởng tới sự phát triển của mẫu cấy do đó mẫu phát triển chậm. Kết quả này khác với kết quả của Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) khi nhân giống cây hoa hồng cơm (Rosa Cericea Lindl) môi trường tốt nhất là môi trường ½ MS. Năm 2009, Naphaporn khi cảm ứng ra rễ cho giống hoa hồng Rosa hybrid cv. “Heirloom” môi trường 1/4 MS cũng là môi trường thích hợp nhất. Môi trường 100% MS là thích hợp nhất trong nhân giống in vitro Bạc hà. Tóm lại, trong nghiên cứu này, môi trường MS ở nghiệm thức 1 cho kết quả tốt nhất cây phát triển ổn định, xanh, chồi nhiều và mập. Chiều cao cây chuẩn lại sau 7 tuần nuôi cấy 47
63. 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân Bạc hà có chiều dài 1,5 cm được dùng làm mẫu thủy canh in vitro để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường SH (Schenk et Hildebrandt, 1972) lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái đoạn cắt thân Bạc hà dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không khác biệt nhiều về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Đến tuần thứ 8 ở các nghiệm thức khác nhau sự khác biệt về khả năng tăng trưởng của mẫu cấy rất rõ, có thể quan sát bằng mắt thường. Chúng tôi tiến hành thu thập kết quả, xử lý số liệu và trình bày ở bảng 3.2, biểu đồ 3.3, 3.4 và hình 3.3, 3.4. 48
64. Trọng Trọng SH Chiều Chiều Tổng Chiều Chiều Nghiệm lượng lượng Số lá Số chồi cải dài lá rộng lá số rễ dài rễ cao Đặc điểm thức tươi khô (lá/mẫu) (chồi/ mẫu) tiến (mm) (mm) (rễ/mẫu) (mm) (mm) (g) (g) số lượng chồi nhiều lá xanh dày cây khỏe và a a a a a a a a b B1 1 3,39 0,22 158,000 7,333 7,667 49,000 44,333 8,667 53,000 cứng cáp chiều cao chồi có sự tăng nhẹ, số chồi giảm đi 2,40a 0,15b 53,333b 6,333ab 6,667ab 47,667a 41,667a 4,667b 60,333a một nửa, ít lá và kích thước lá nhỏ, cây xanh B2 ¾ tươi. 1,80c 0,12c 46,667c 6,333ab 6,333b 28,667b 31,333b 4,333b 51,667b rễ ngắn và chiều cao giảm xuống B3 ½ 1,08d 0,08d 38,333d 5,667b 5,667b 22,333c 32,667b 2,333c 44,333c cây bị ức chế hoàn toàn, lá chồi ít, yếu. Cây B4 ¼ chậm phát triển. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường SH cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sai khác thống kê với p < 0,05 49
65. 4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 B1 B2 B3 B4 Khối lượng Khối lượng tươi (g) khô (g) Biểu đồ 3.3. ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với B1, B2, B3, B4, lần lượt tương ứng với các loại môi trường SH cải tiến khác nhau SH, ¾ SH, ½ SH, ¼ SH) 50
66. 180.000 160.000 140.000 120.000 100.000 80.000 60.000 40.000 20.000 0.000 B1 B2 B3 B4 Số lượng Đường kính Chiều dài Số lượng Chiều dài Số lượng Chiều cao (mm) lá (lá/cây) lá (mm) lá (mm) rễ (rễ/cây) rễ (mm) chồi (chồi/cây) Biểu đồ 3.4. ảnh hưởng của môi trường SH lên sự tăng trưởng của cây bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với B1, B2, B3, B4, lần lượt tương ứng với các loại môi trường SH cải tiến khác nhau SH, ¾ SH, ½ SH, ¼ SH) 51
67. Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy. (Với B1, B2, B3, B4 lần lượt tương ứng với các loại SH, ¾ SH, ½ SH, ¼ SH) 52
68. Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến SH lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy. (Với B1, B2, B3, B4 lần lượt tương ứng với các loại SH, ¾ SH, ½ SH, ¼ SH) 53
69. • Kết quả và thảo luận Từ kết quả ở bảng 3.2, biểu đồ 3.3, 3.4, hình 3.3, 3.4 cho thấy việc môi trường SH có thể sử dụng với mục đích thu chồi và tạo rể trong nhân giống in vitro cây Bạc hà. Mẫu cấy xanh, khỏe, phát triển ổn định, nhưng không cao. SH thuộc nhóm môi trường có hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS, nhưng đặc biệt có hàm lượng muối nitrat kali cao. Nhóm môi trường này thích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành callus và phân hóa chồi. Ở các tỷ lệ SH khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể là: ▪ Nghiệm thức B1, sử dụng môi trường SH 100% để nuôi cấy thì số lượng chồi được tạo ra nhiều, lá xanh nhiều và dày, cây khỏe và cứng cáp. Nhưng sau khoảng 5 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm và chiều cao cây bắt đầu chuẩn lại. ▪ Nghiệm thức B2, sử dụng môi trường ¾ SH để nuôi cấy thì chiều cao chồi có sự tăng nhẹ, số chồi giảm đi một nửa, ít lá và kích thước lá nhỏ, cây xanh tươi. Chiều cao của cây bị chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy ▪ Nghiệm thức B3, sử dụng môi trường ½ SH để nuôi cấy thì xuất hiện sự ức chế tạo rễ, rễ ngắn và ít, các chỉ số khác tương tự B2 nhưng chiều cao lại giảm xuống gần bằng B1. Chiều cao cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức B4, sử dụng môi trường 1/4 SH để nuôi cấy thì cây bị ức chế hoàn toàn, lá chồi ít, yếu. Cây chậm phát triển. Chiều cao cây chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy. Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng có thể nuôi cấy cây Bạc hà trên môi trường SH kết quả này tương tự kết quả của Alma V. Neri-Soto. (2015) khi ông nhân giống in vitro thành công cây Chihuahuana Picea qua việc nuôi cấy hạt cây này trên môi trường SH. Tuy nhiên khi giảm tỷ lệ SH xuống cây sẽ chậm phát triển điều này khác với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hồ và cộng sự (2014) khi ông dùng dùng môi trường ½ SH nhân sinh khối mô sẹo sinh phôi đối tượng sâm ngọc linh không dùng chất điều hòa sinh trưởng trong bình tam giác và bioreactor. 54
70. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của môi trường N6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Đoạn cắt thân Bạc hà có chiều dài 1,5 cm được dùng làm mẫu thủy canh in vitro để nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường N6 (Chu et al, 1975) lên khả năng sinh chồi, sự phát triển, và đặc điểm hình thái đoạn cắt thân Bạc hà dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ ngày. Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không khác biệt nhiều về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Đến tuần thứ 8 ở các nghiệm thức khác nhau sự khác biệt về khả năng tăng trưởng của mẫu cấy rất rõ, có thể quan sát bằng mắt thường. Chúng tôi tiến hành thu thập kết quả, xử lý số liệu và trình bày ở bảng 3.3, biểu đồ 3.5, 3.6 và hình 3.5, 3.6. 55
71. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường N6 cải tiến lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Trọng Trọng Tỷ Chiều Chiều Tổng Chiều Số chồi Chiều Nghiệm lượng lượng Số lá lệ dài lá rộng lá số rễ dài rễ (chồi/ cao Đặc điểm thức tươi khô (lá/mẫu) N6 (mm) (mm) (rễ/mẫu) (mm) mẫu) (mm) (g) (g) cây phát triển ổn định, ít chồi, lá C1 1 3,23ab 0,23a 87,333a 8,333a 8,667a 19,000a 19,333a 2,667a 67,333a dày, cây sinh trưởng kém. Cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. cây phát triển chậm, thấp, lá b b b b ab b b b b mỏng, ít chồi các chồi có chiều C2 ¾ 2,69 0,18 77,667 6,667 7,667 14,000 13,667 1,333 54,000 cao tương đương. Cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. cây bị ức chế, các cây gần như a ab c b b c c b c không sinh chồi, chồi mỏng, ít C3 ½ 3,25 0,22 66,000 5,667 7,000 10,333 9,667 1,000 36,667 lá, cây ngả vàng. Cây chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy. C4 ¼ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Cây chết toàn bộ Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sai khác thống kê với p < 0,05 56
72. 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.500 0.000 C1 C2 C3 C4 Khối lượng Khối lượng tươi (g) khô (g) Biểu đồ 3.5. ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với các loại N6, ¾ N6, ½ N6, ¼ N6) 57
73. 100.000 90.000 80.000 70.000 60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.000 C1 C2 C3 C4 Số lượng Đường kính Chiều dài Số lượng Chiều dài Số lượng Chiều cao (mm) lá (lá/cây) lá (mm) lá (mm) rễ (rễ/cây) rễ (mm) chồi (chồi/cây) Biểu đồ 3.6. ảnh hưởng của môi trường N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy (Với C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với các loại N6, ¾ N6, ½ N6, ¼ N6) 58
74. Hình 3.5. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy. (Với C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với các loại N6, ¾ N6, ½ N6, ¼ N6) 59
75. Hình 3.6. Ảnh hưởng của các loại môi trường cải tiến N6 lên sự tăng trưởng của cây Bạc hà từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy. (Với C1, C2, C3, C4 lần lượt tương ứng với các loại N6, ¾ N6, ½ N6, ¼ N6) 60
76. • Kết quả và thảo luận Dựa vào kết quả ở bảng 3.3, biểu đồ 3.5, 3.6 và hình 3.5, 3.6 cho thấy trong nhân giống in vitro cây Bạc hà, môi trường khoáng nền hoàn toàn là N6 không thích hợp trong nhân giống in vitro cây Bạc hà Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 3 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng kém, càng giảm tỷ lệ bổ sung N6 cây càng phát triển chậm vì thiếu chất dinh dưỡng. Ở các tỷ lệ sử dụng N6 khác nhau thì thái của cây cũng có sự khác nhau, cụ thể: ▪ Nghiệm thức C1: Môi trường sử dụng tỷ lệ N6 là 100%, cây phát triển ổn định, ít chồi, lá dày, cây sinh trưởng kém. Cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức C2: Môi trường sử dụng tỷ lệ ¾ N6, cây phát triển chậm, thấp, lá mỏng, ít chồi các chồi có chiều cao tương đương. Cây chuẩn lại sau 6 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức C3: Môi trường sử dụng tỷ lệ ½ N6, cây bị ức chế, các cây gần như không sinh chồi, chồi mỏng, ít lá, cây ngả vàng. Cây chuẩn lại sau 5 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức C4: 98,9% cây chết. Kết quả này khác hoàn toàn với kết quả của Trần Đình Giỏi cùng cộng sự (2002) khi ông nuôi cây thành công mô sẹo cây lúa cao sản trên môi trường N6. Cũng trên môi trường N6, theo Jaruwan Summart và cộng sự (2008) để tăng tốc độ tăng trưởng trong nuôi cấy mô sẹo cây lúa thì bổ sung thêm bổ sung thêm 4% sucrose trong môi trường nhân giống. Kết quả cho thấy việc sử dụng môi trường N6 không thích hợp trong nhân giống in vitro cây Bạc hà Á (Mentha avensis L.) 61
77. 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần. Đoạn cắt thân Bạc hà có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro để nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà dưới điều kiện chiếu sáng 24 giờ/ ngày. Nước dừa có chứa một số hợp chất hữu cơ và chất dinh dưỡng khoáng chất quan trọng trong sự phát triển của thực vật, đóng một vai trò quan trọng như bộ đệm sinh lý chứa hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng cao, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Krikorian, 1991), (Ge et al, 2005; Yong et al, 2009). Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức xuất hiện sự khác biệt về hình thái nhưng còn chậm và không rõ ràng. Sau 8 – 9 tuần, sự phân hóa và khác biệt về hình thái có sự khác về hình thái cũng như tốc độ tăng trưởng rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành bổ sung nước dừa ở các nồng độ 0; 10; 20; 30; 40 % vào môi trường thủy canh in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự phát triển của chồi. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.4; biểu đồ 3.7, 3.8; hình 3.7, 3.8 62
78. Hình 3.7. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 63
79. Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 64
80. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nước dừa lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha Arvensis L. từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy Nồng Trọng Trọng Chiều độ Chiều Tổng Chiều Số chồi Chiều Nghiệm lượng lượng Số lá rộng nước dài lá số rễ dài rễ (chồi/ cao Đặc điểm thức tươi khô (lá/mẫu) lá dừa (mm) (rễ/mẫu) (mm) mẫu) (mm) (g) (g) (mm) (%) cây phát bình thường nhưng chậm, cây 0,30a 4,76a 78,667b 7,667c 7,333b 21,000e 47,333b 3,333ab 82,667b D0 0 xanh tươi, không có nhiều đặc biệt. c b b b b d d ab b D1 10 1,60 0,13 80,333 10,000 6,667 37,000 35,333 3,333 80,667 Cây có sự tăng trưởng nhanh về rễ bc b a b b c c a a cây phát triển hơn. Số rễ tăng, có sự D2 20 2,05 0,16 94,667 10,000 7,333 57,667 42,333 4,333 89,000 tăng nhẹ về lá và số chồi. b b a a a a a a a cây phát triển tốt nhất, số rễ vẫn tiếp D3 30 2,48 0,16 98,333 12,000 10,333 71,667 52,667 4,333 90,333 tục tăng, lá xanh và lớn. bc b ab a a b d b c Chiều cao giảm, các chỉ số về số lá, D4 40 1,97 0,16 87,000 13,000 10,667 65,000 36,333 2,333 67,333 chồi, rễ và chiều cao giảm. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sai khác thống kê với p < 0,05 65
81. 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 D0 D1 D2 D3 D4 Khối lượng Khối lượng tươi (g) khô (g) Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng trưởng của Bạc hà Á 66
82. 120.000 100.000 80.000 60.000 40.000 20.000 0.000 D0 D1 D2 D3 D4 Số lượng Đường kính Chiều dài Số lượng Chiều dài Số lượng Chiều cao (mm) lá (lá/cây) lá (mm) lá (mm) rễ (rễ/cây) rễ (mm) chồi (chồi/cây) Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa lên sư tăng trưởng của Bạc hà Á 67
83. • Kết quả và thảo luận Từ kết quả ở bảng 3.5, biểu đồ 3.7, 3.8 hình 3.7, 3.8 cho thấy việc bổ sung nước dừa vào môi trường thủy canh in vitro cây Bạc hà giúp mẫu cấy có sự tăng trưởng rõ rệt. Đặc biệt, khi bổ sung nước dừa chồi Bạc hà phát triển to và cao, số lá và kích thước lá tăng, các chồi xanh tốt, các lá có xu hướng căng rộng ra, lá xanh. Ở các nồng độ nước dừa khác nhau thì hình thái của cây cũng khác nhau, cụ thể như sau: ▪ Nghiệm thức D0, không bổ sung nước dừa thì cây vẫn phát bình thường nhưng chậm, cây xanh tươi, nhiều chồi và lá nhưng kích thước lá và chiều cao không có nhiều đặc biệt. ▪ Nghiệm thức D1, môi trường bổ sung nước dừa với nồng độ 10% l thì cây không có sự khác biệt nhiều so với nghiệm thức đối chứng D0. Cây có sự tăng trưởng nhanh về rễ. Cây sau khoảng 6 tuần tăng trưởng ổn định thì bắt đầu tăng trưởng chậm và chiều cao cây bắt đầu chuẩn lại. ▪ Nghiệm thức D2, khi tăng nồng độ bổ sung nước dừa lên 20% thì cây phát triển hơn. Số rễ tiếp tục tăng, có sự tăng nhẹ về chiều cao, lá và số chồi. Chiều cao của cây bị chuẩn lại sau 8 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức D3, khi tăng nồng độ bổ sung nước dừa lên 30% thì cây phát triển tương đương cây D2, số rễ vẫn tiếp tục tăng, lá xanh và lớn. Đây là nghiệm thức tốt nhất. Cây tăng trưởng và ổn định sau 7 tuần nuôi cấy. ▪ Nghiệm thức D4, khi nồng độ nước dừa trong môi trường tăng lên 40% cây bị ức chế. Chiều cao giảm, các chỉ số về số lá, chồi, rễ và chiều cao giảm, tuy nhiên cây không có giấu hiệu vàng lá hay chết, các chồi cây mập. Sau 6 tuần nuôi cấy cây bắt đầu phát triển kém hơn so với nghiệm thức D3. Qua thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng nước thích hợp cho sự kích thích phát triển của các mẫu cấy cây Bạc hà Á, Nồng độ nước dừa bằng 30% là thích hợp nhất. 68
84. Kết quả trên khác so với kết quả của Nasib et al. (2008) theo ông, sử dụng 20% (v / v) nước dừa kết hợp với BAP trong nhân giống in vitro cây Kiwi giúp tăng trưởng chiều cao và số lượng lá. Bên cạnh đó, theo báo cáo trong Grigoriadou et al. (2002), sự kết hợp của nước dừa với cytokinin là cách hiệu quả nhất để có thể cải thiện đáng kể số lượng chồi trong nhân giống cây phỉ Corylus avellana L. Không những thế, M.A. Sandoval Prando (2014) cho biết, bổ sung 20% nước dừa kết hợp với 2 mg / L BAP, 0,01 mg / L IAA và 0,5 mg / L GA3 là hiệu quả nhất trong nhân nhanh số lượng chồi cây phỉ Corylus avellana L. 69
85. 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của than hoạt tính lên sự tăng trưởng của Bạc hà, tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần. Đoạn cắt thân Bạc hà có chiều dài 1,5 – 2 cm được dùng làm mẫu in vitro để nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà dưới điều kiện chiếu sáng 24 giờ/ ngày. Bổ sung than vào môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến sự ra rễ, kéo dài chồi và phát sinh phôi (Webb D. T., 1988). Ngoài ra, khi bổ sung than vào môi trường nuôi cấy có thể thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng của thực vật in vitro; các tác động của than bao gồm: tạo điều kiện tối trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất ức chế trong môi trường nuôi cấy, hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợp chất hữu cơ khác đồng thời phóng thích các cơ chất có lợi cho sự sinh trưởng của thực vật nuôi cấy in vitro (Pan M. J. et al., 1998). Sau 1 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy không có nhiều sự khác biệt về hình thái. Sau 2 tuần, các mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi. Sau 3 tuần, ở các đốt thân xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy nhờ nuôi trong điều kiện ánh sáng liên tục. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức xuất hiện sự khác biệt về hình thái nhưng còn chậm và không rõ ràng. Sau 8 – 9 tuần, sự phân hóa và khác biệt về hình thái có sự khác về hình thái cũng như tốc độ tăng trưởng rõ rệt. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành bổ sung nước dừa ở các nồng độ 0; 10; 20; 30; 40 % vào môi trường thủy canh in vitro Bạc hà nhằm tìm ra nồng độ thích hợp cho sự phát triển của chồi. Các kết quả thí nghiệm thu được và trình bày ở bảng 3.4; biểu đồ 3.9, 3.10; hình 3.9, 3.10. 70