Đồ án Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase

Nội dung text: Đồ án Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GÓP PHẦN XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP LACTASE Ngành : Công nghệ Sinh học Mã ngành : 111 GVHD : PGS TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG SVTH : PHẠM NGUYÊN HIẾU MSSV : 0851110082 Lớp : 08DSH2 -Tp.HCM, tháng 7 năm 2012-
2. Chương 1 MỞ ĐẦU Xu hướng của con người ngày nay là quay về sử dụng các sản phẩm mang tính thiên nhiên, khai thác những kinh nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật hiện đại và hạn chế tối đa việc đưa hoá chất vào cơ thể. Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm có bổ sung các chủng vi sinh vật giúp con người tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá và giúp chống lại rất nhiều bệnh tật phát sinh từ bên trong cơ thể. Tuy nhiên các sản phẩm thực phẩm này không phải là thuốc, mà được xếp vào nhóm thực phẩm chức năng. Chính vì những lợi ích trên và theo quan điểm phòng bệnh hơn chữa bệnh, ở các nước phát triển có xu hướng sử dụng các loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe nhiều hơn là sử dụng thuốc điều trị. Sữa là thực phẩm chính của trẻ em và người già, do thói quen không sử dụng sữa nên enzyme lactase bị mất dần, dẫn đến bệnh không dung nạp lactose. Sự thiếu hụt lactase phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Trong cơ thể người, lactase hoạt động khoảng năm năm. Ở Bắc Châu Âu và những người sống ở phía Tây Bắc của tiểu lục địa Ấn Độ, lactase có xu hướng bảo tồn ở người lớn, do việc sử dụng các sản phẩm từ sữa như pho mát trong suốt mùa đông khi nguồn cung cấp lương thực có thể bị hạn chế. Chúng ta có thể kết luận rằng việc thiếu hụt lactase (được gọi là không dung nạp lactose hoặc alactasia) không phải là một bệnh, nhưng sự tồn lưu của lactase vào tuổi trưởng thành là sự thích ứng sinh học với việc sử dụng các sản phẩm từ sữa. Lactase là một enzyme được tìm thấy ở mép của ruột non. Nó phân hủy lactose thành đường glucose và galactose. Tần số thiếu hụt lactase trên toàn thế giới khác nhau. Mức độ lactase trong ruột và các triệu chứng không có sự hòa hợp. Hình ảnh điển hình là khó chịu ngay sau khi dùng sữa hoặc các sản phẩm từ sữa. Điều này có thể thấy từ việc bị đau bụng, buồn nôn, cảm giác đầy hơi ngắn, nhanh, chảy nước mắt và tiêu chảy [57]. Khi bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả là 1
3. đường lactose không tiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy [57]. Ngoài ra, trình trạng kém hấp thu lactose do bệnh đường tiêu hóa tại một số quốc gia là khá chính xác, có thể gây kém hấp thu lactose - hội chứng ruột ngắn, kém hấp thu đường galactose bẩm sinh. Trong thực tế, trạng thái bất thường hoặc sai lệch là việc duy trì hoạt động lactase trong suốt giai đoạn trưởng thành. Có 3 nguyên nhân cơ bản dẫn đến bất dung nạp lactose: (A) nguyên phát, (B) thứ phát, (C) bẩm sinh [58]. (A) Nguyên phát: Đây là nguyên nhân thường gặp nhất của bất dung nạp lactose do thiếu lactase tương đối, xuất hiện ở trẻ em vào những độ tuổi khác nhau trong những nhóm chủng tộc khác nhau. (B) Thứ phát: Do tổn thương ruột non sau viêm dạ dày ruột do siêu vi (Rotavirus), trẻ bị bất dung nạp lactose thoáng qua, có thể hồi phục sau khi vấn đề bệnh viêm dạ dày ruột đã được giải quyết hoặc trẻ bị tiêu chảy kéo dài dẫn đến niêm mạc ruột tổn thương, men lactase không sản sinh đủ nên cơ thể trẻ không thể hấp thu được lactose dẫn đến triệu chứng bất dung nạp. Khi ấy sẽ khiến cho tình trạng tiêu chảy kéo dài và trầm trọng hơn là trẻ bị suy dinh dưỡng. Khi trẻ bị suy dinh dưỡng thì lượng men lactase càng giảm, vì vậy suy dinh dưỡng và tiêu chảy là vòng luẩn quẩn khó giải quyết. (C) Bẩm sinh: Nguyên nhân này rất hiếm gặp, biểu hiện ngay sau sinh do rối loạn nhiễm sắc thể, gây ngăn cản sản xuất men lactase. Trong hệ tiêu hóa của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất lớn, trong đó có hơn 400 loài vi sinh vật khác nhau (Melissa peterson et al., 2002), chúng được xếp vào 2 loại: vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật có ích. Các loài vi sinh vật sống chung với nhau tạo thành hệ sinh thái ổn định, cân bằng và là hàng rào bảo vệ, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh đường ruột cũng như duy trì một số hoạt động chuyển hóa của cơ thể. Vi sinh vật có ích càng nhiều thì cơ thể càng khỏe mạnh. Để tăng dung nạp lactose trong sữa, lý tưởng nhất là tăng sinh tổng hợp được enzyme này ngay trong cơ thể người. Tuy nhiên con đường này rất khó khăn. Enzyme từ nguồn vi sinh vật vẫn là nhu cầu trước mắt. Do đó lựa chọn nguồn 2
4. enzyme vi sinh là hiệu quả hơn tuy nhiên phải chọn loại enzyme có hoạt động pH tối ưu tương tự như sữa để tránh hiện tượng đông tụ sữa. Trên thế giới, lactase được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm lactase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyverromyces lactics, Kluyverromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Saccharomyces fragilis, Candida pseudotropicalis. Ngoài ra lactase còn được sản xuất từ: vi khuẩn (chủ yếu là Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactoccoccus, Bacillus và vi khuẩn Gram âm là E.coli ), nấm sợi (Trichoderma sp, Fusarium sp, Asperigillus sp) Trong khi ở Việt Nam, việc nghiên cứu enzyme lactase chưa thật sự được quan tâm và còn nhiều hạn chế. Đề tài: “Góp phần xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật sinh tổng hợp lactase” - Phân lập, thu thập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase từ nhiều nguồn. - Định danh các chủng vi khuẩn. - Kiểm tra hoạt tính enzyme lactase của những chủng vi sinh vật phân lập được. - Bước đầu bảo quản giống vi khuẩn có hoạt tính lactase. 3
5. Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. Enzyme lactase 2.1.1. Lactose Lactose (β-D-galactopyranosyl –(1Æ 4)-α-D-glucopyranose) là đường đôi có ở động vật có vú, ngoại trừ một vài loài, nồng độ trong khoảng 2 – 10%. Hàm lượng lactose trung bình ở sữa bò khoảng 4,8%, khoảng 4,4 – 5,2% (theo Ganzle, 2008). Trong quá trình sản xuất phomai, phần lớn lactose trong sữa có trong dịch whey. Khác với trước đây, whey không được xem như phụ phẩm. Ngày nay, whey được sử dụng hiệu quả hơn. Whey có thể được sấy khô để sản xuất các loại bột whey khác nhau hoặc phân đoạn bằng kỹ thuật lọc màng để sản xuất sản phẩm whey protein và phần đi qua màng giàu lactose (theo Fox 2009; Lifran, 2009). Lactose là một loại đường có nhiều trong sữa. Để cơ thể hấp thu được thì đường lactose phải được phân tách thành đường glucose và galactose trước. Quá trình này xảy ra ở phần trên của ruột non bởi men lactase. Vì thế, bất dung nạp đường lactose thật ra là trong cơ thể chúng ta thiếu men lactase để chuyển lactose thành hai loại đường như đã trình bày trên. Nếu thiếu men lactase ở ruột non thì đường lactose không được phân tách và sẽ không được hấp thu vào máu mà bị tồn đọng ở ruột, dẫn đến những rối loạn tiêu hóa, gọi là bất dung nạp đường lactose. Đây là nguyên nhân làm cho ta không uống được sữa. Nhiều người nhầm lẫn giữa bất dung nạp đường lactose và dị ứng sữa. Bản chất của dị ứng sữa là do hệ miễn dịch của cơ thể phản ứng với protein có trong sữa dẫn đến những rối loạn. Lactase được mã hóa bởi một locus gen trên nhiễm sắc thể số 2, thể hiện độc quyền trong ruột động vật có vú nhỏ, và ở mức độ rất thấp trong ruột kết của quá trình phát triển thai nhi. Con người được sinh ra với mức lactase cao. Sau khi cai sữa gen sinh tổng hợp lactase ở trạng thái bất hoạt vì vậy lactase trong ruột non giảm. Việc giảm lactase đồng nghĩa với việc gây ra các triệu chứng phổ biến như không dung nạp hypolactasia hoặc không dung nạp lactose. 4
6. Bất dung nạp đường lactose không liên quan đến hệ miễn dịch, chỉ vì cơ thể chúng ta thiếu lactase để tiêu hóa lactose vì thế lactose bị tống ra ngoài dưới dạng tiêu chảy. Ở người, vấn đề khó khăn trong tiêu hóa lactose tăng theo lứa tuổi, ở độ tuổi thanh thiếu niên chiếm khoảng 70% số thanh thiếu niên thế giới (Paige 2005). Enzym thương mại có xu hướng phát triển mạnh, β-galactosidase cho phép sản xuất sản phẩm chứa hàm lượng lactose thấp (Gekas và Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amach 1999; Rehman 2009). Khi đó, lactose ít hòa tan và ít ngọt, sự thủy phân lactose làm giảm các tinh thể lactose ở các sản phẩm giàu lactose trong quá trình bảo quản và làm tăng độ ngọt (Gekas và Lopez-Leiva 1985; Pivarnik, 1995; Nakayama và Amachi 1999; Rehman 2009). 2.1.2. Lactase và chức năng Enzyme thủy phân lactose có tên lactase thuộc nhóm β-galactosidase (E.C.3.2.1.23). Enzyme này có hoạt tính chủ yếu là thủy phân liên kết β 1-4 glucosidic của phân tử đường đôi lactose để tạo thành 2 phân tử đường đơn có độ ngọt cao hơn đường lactose. Do vậy, enzyme lactase chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp các sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, một thành phần cacbonhydrat chính trong sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả năng dung nạp rất kém và đặc biệt một số ít người lớn kể cả trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose. Hơn nữa, phân tử lactose dễ dàng bị kết tinh dạng hạt cát ở nhiệt độ lạnh nên gây khó khăn cho sản xuất một số sản phẩm sữa lạnh như kem, vì vậy người ta sử dụng enzyme này để giảm hàm lượng lactose đồng thời tăng độ ngọt của sản phẩm nhờ các đường đơn tạo thành [49]. Enzyme lactase trong một số trường hợp còn có hoạt tính transgalactosyl hóa, trước tiên enzyme phá vỡ liên kết β 1-4 glucosidic tạo thành galactosyl và sau đó chuyển cho phân tử một hợp chất chứa nhóm hydroxyl. Do vậy người ta đã sử dụng hoạt tính này để tổng hợp galactooligosaccharide, có hoạt tính dược học [49]. Lactase có thể được tìm thấy ở nhu động ruột non người và động vật, trong một số thực vật (dưa hấu, trái mơ ) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm sợi). Tùy theo nguồn gốc lactase sẽ có kích thước phân tử khác nhau, các chuỗi peptide (tiểu phần theo cấu trúc bậc 4) dài ngắn và số lượng cũng rất khác nhau. Mặc dù vậy 5
7. nhưng chuỗi peptide chính mang hoạt tính lactase thông thường có trọng lượng phân tử khoảng 120kDa và chứa tâm xúc tác và tâm này có cấu trúc tương tự giữa các loài (được bảo tồn qua tiến hóa) và trong đó là vai trò không thể thay thế của các “tay” Glu trong phản ứng xúc tác axit – base hoặc tấn công vào nhân [49]. Hình 2.1. Enzyme lactase ở ruột non người [53]. Hoạt tính phân hủy lactose được xác định bằng 2 cách, hoặc là thông qua sự mất đi của cơ chất là lactose, hoặc là thông qua sự tạo thành của sản phẩm đặc trưng do phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng cơ chất đặc hiệu ONPG (o- nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác định lượng ONP (o-nitrophenyl) tạo thành [49]. Các lactase khác nhau có dải hoạt động pH từ axit yếu đến trung tính từ khoảng 4.0 – 6.5 tùy thuộc vào nguồn gốc. Lactase của nấm sợi có pH hoạt động gần axit hơn, còn lactase của các vi khuẩn và nấm men ưa pH gần trung tính hơn [49]. Bảng 2.1. Một số đặc trưng của chuỗi peptide đóng vai trò xúc tác trong enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình Nguồn gốc enzyme K.lactic E.coli E.coli A.niger Trọng lượng phân tử 117618 116351 118016 119160 Chiều dài 1025 1023 1031 1006 Nguyên tử proton Glu482 Glu461 Glu449 Glu200 Nucleophile/bazơ Glu551 Glu537 Glu512 Glu298 [49] 6
8. Phần lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình), một số khác từ 45-650 C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở nhiệt độ lạnh 40C. Dưới đây là tổng hợp một số đặc tính của lactase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau (Bảng 2.2). Đặc biệt một số enzyme đòi hỏi ion kim loại để hoạt hóa [49]. Người và động vật có khả năng dung nạp lactose là do trong thời kỳ trẻ mới sinh, ruột non có khả năng tổng hợp lactase để tiêu hóa lactose trong sữa mẹ, thành phần chính cho trẻ sinh trưởng. Đến tuổi trưởng thành các gen này hầu như ngưng hoạt động do vậy cơ thể tiêu hóa lactose rất kém. Điều này cũng đúng cho động vật. Nghiên cứu chỉ ra rằng sự dung nạp latose có thể được hỗ trợ bởi hệ vi sinh niêm mạc ruột non, trong đó có vai trò của các vi sinh vật lên men lactose như Lactococcus và Bifidobacterium. Đây chính là cơ sở của việc đưa các vi sinh vật này vào một số dòng sản phẩm sữa chua uống có men sống để hỗ trợ tiêu hóa [49]. Bảng 2.2. Một số đặc trưng của enzyme lactase ở một số loài vi sinh điển hình Giá trị pH Giá trị nhiệt Trọng Hoạt hóa ion. Nguồn lượng Chú Chú thích Tối ưu độ tối ưu phân tử khác A.niger 3,0-4,0 55-60 124 A.oryzae 5,0 50-55 90 Mn+2 , K+ K.fragilus 6,9-7,3 37 201 Mn+2 , Na+ K.lactic 7,2 35 135 K+ , Na+ E.coli 6,2-7,1 40 540 L.thermophilus 3,4-4,3 55-57 530 C.inaegualis 6,0 30-55 Hoạt động cao B.circulans 6,8 60-65 ở sữa không béo Bacillus sp 6,5-7,5 65 L.bulgaricus 42-45 S.thermophilus 55 500-600 [49] 7
9. 2.1.3. Cơ chế, cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp Lactase có thể thủy phân một loạt các chất nền. Trong đó đáng chú ý nhất là lớp enzyme β –galactosidase, lactase cũng có glucosidase và glycosylceramidase hoat động. Trong quá trình trao đổi chất, β-glycosidic trong D-lactose thủy phân để tạo thành D-galactose, D-glucose, có thể được hấp thu qua thành ruột vào máu. Phản ứng xúc tác lactase tổng thể là : C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6H 12 O 6 + Q Lactase cũng xúc tác chuyển đổi phlorizin phloretin và glucose. Cơ chế xúc tác thuỷ phân lactose D – giữ lại cấu hình chất nền anomeric trong các sản phẩm. Trong khi các chi tiết của cơ chế là không chắc chắn, để đạt được phải thông qua một phản ứng chuyển đổi. Các nghiên cứu về lactase của vi khuẩn E.coli đã đề xuất rằng: quá trình thủy phân được bắt đầu khi một tác nhân nucleophin glutamate tấn công enzyme từ phía bên trục carbon galactosyl của β-glycosidic. Vì Mg phụ thuộc vào axit xúc tác nên việc loại bỏ các nhóm rời D-glucose có thể được thuận lợi, enzyme được giải phóng từ phân nửa α-galactosyl khi tấn công nucleophin sẽ sản xuất D- galactose. Hình 2.2. Cơ chế thủy phân lactose [54]. Các nghiên cứu về chất nền đã chứng minh rằng 3’-OH và 2’-OH trên vòng galactopyranose là rất cần thiết để thủy phân enzyme. Nhóm 3'- hydroxy được tham gia ngay từ ban đầu trong khi nhóm 2’ là không cần thiết, nhưng cần thiết trong các bước tiếp theo. Điều này được chứng minh bởi thực tế rằng 2-deoxy là một chất ức 8
10. chế cạnh tranh hiệu quả (K i= 10mM), loại bỏ các nhóm hydroxyl trên phân nửa glucopyranose, không hoàn toàn loại bỏ chất xúc tác. Pre-pro-lactase có cấu trúc polypeptide chính duy nhất bao gồm 1927 axit amin chia thành 5 nhánh: (1) 19 amino axit chia tín hiệu theo thứ tự, (2) chuỗi miền lớn không hiện diện lactase ở giai đoạn trưởng thành, (3) các phân khúc lactase ở giai đoạn trưởng thành, (4) một mảng trải dài kị nước, (5) một đoạn ngắn ưa nước ở cacboxyl cuối. Chuỗi tín hiệu được phân tách trong lưới nội chất, pro-LHP đạt chiều dài 215kDa được chuyển sang bộ máy Golgi, nơi có nhiều glycoxyl hóa và protein thủy phân. Các prodomain được hiển thị để hoạt động như một chaperone intramolecular trong ER, ngăn ngừa sự phân tách trypsin và cho phép LPH áp dụng các cấu trúc 3-D cần thiết để vận chuyển đến bộ máy Golgi. Hình 2.3. Quá trình sản sinh lactase ở người [54]. 2.1.4. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Lactase được sinh tổng hợp bởi một số loại nấm men (Kluyverromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulautilis sp, Torulopsis spherica, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis). Ngoài ra, còn có các vi khuẩn Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, nhóm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia coli Nissle 1917. Bên cạnh đó thì nấm sợi cũng được quan tâm nhiều (Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp) nhưng loài Aspergillus sp được nghiên cứu nhiều hơn cả. Tuy nhiên quá trình tổng hợp lactase ở cả quy mô nghiên cứu và quy mô sản xuất chủ yếu là từ nấm men Kluyveromyces và vi khuẩn lactic. Các enzyme lactase được sinh tổng hợp bao gồm cả ngoại bào và nội 9
11. bào, loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt, đặc biệt loại lactase chịu lạnh để ứng dụng trong làm kem. Sử dụng lactase (cố định hoặc tự do) chủ yếu để sản xuất sữa tươi và sữa bột không chứa (hoặc chứa rất ít) lactose hoặc sinh tổng hợp các hợp chất galacto-ooligosaccharides. Bảng 2.3. Hệ vi sinh vật sinh tổng hợp lactase Nấm men Vi khuẩn Nấm sợi Kluyverromyces lactic Lactobacillus acidophilus Aspergillus sp Kluyveromyces maxianu Lactobacillus sp Aspergillus niger Kluyveromyces sp Lactococcus lactic Aspergillus oryzea Torulopsis spherical Bacillus subtilis Aspergillus candidus Torulopsis Bacillus curculans Fusarium sp pseudotropicalis Streptococcus salivarius Fusarium moniliforme Torulautilis sp Streptococcus Trichoderma sp Saccharomyces fragilis thermophilus Trichoderma reesei Rut-C30 Candida pseudotropicalis E.coli Zygosaccharomyces lactic [49] Những tế bào niêm mạc ở phần trên của ruột non (là những tế bào sản xuất ra men lactase) bị tổn thương. Hiện tượng này hay gặp ở trẻ em và thường xảy ra sau khi bị tiêu chảy, viêm dạ dày ruột hoặc có thể do hóa trị liệu. Khi trẻ bị tiêu chảy, các tác nhân gây bệnh hoặc độc tố của chúng gây tổn thương niêm mạc thành ruột, khiến men tiêu hoá đường lactose bị mất đi, và hậu quả là đường lactose không tiêu hoá được tích luỹ trong lòng ruột, tiếp tục gây nên tiêu chảy và bệnh ngày càng trầm trọng hơn. Thống kê cho thấy 50% -70% trẻ em nhập viện do tiêu chảy nặng có biểu hiện bất dung nạp lactose. Lactose là đường chủ yếu có trong sữa mẹ và các sữa công thức. Lactose là nguồn cung cấp đường glucose cho sự hoạt động của não và cơ thể, làm phân mềm, tạo sự vượt trội của các Bifidus và Lactobacillus là những vi khuẩn 10
12. có lợi giúp cho sự phát triển hệ miễn dịch và tiêu hoá trong cơ thể trẻ. Men lactase ở màng ruột là men tiêu hoá biến đường lactose trở thành đường glucose. Khi trẻ bị tiêu chảy cấp, màng ruột bị tổn thương bởi vi khuẩn, virút hoặc độc tố của chúng sẽ làm thiếu men lactase. Do thiếu men lactase làm đường lactose không tiêu hoá được trong ruột gây bất dung nạp lactose. Đường lactose không được tiêu hoá sẽ ứ đọng lại trong ruột, hút nước làm tiêu chảy tăng thêm và kéo dài. Trường hợp này gọi là thiếu lactase thứ phát, khác với thiếu men lactase tiên phát thường xuất hiện ngay sau khi trẻ sinh và rất hiếm gặp (chỉ 1 trong số 1000 trẻ). Bất dung nạp lactose thứ phát thường kéo dài trong 1-2 tuần nhất là ở trẻ tiêu chảy kéo dài. Hậu quả là trẻ bị suy dinh dưỡng nặng, kém ăn cộng thêm tập quán kiêng ăn làm chậm hồi phục niêm mạc ruột. Bất dung nạp lactose có thể gặp trong những trường hợp tiêu chảy do nhiễm vi khuẩn, virút, đặc biệt tiêu chảy do Rota virút, dị ứng sữa bò là những bệnh lý rất thường xảy ra ở trẻ nhỏ dưới 3 tuổi [57]. 2.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) 2.2.1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, axit lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong các thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocin ức chế sinh vật gây bệnh (Klnhammer, 1987). Hơn nữa, axit lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần làm tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm. Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. 11
13. Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que, trong đó các giống sau đây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae, một nhóm vi khuẩn Gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic. Hình 2.4. Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic [26]. Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần nhau - Trong đó nhóm được đóng khung được xem là nhóm vi khuẩn an toàn Việc phân loại vi khuẩn axit lactic chỉ khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất axit lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được axit hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần axit béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. 12
14. 2.2.2. Đặc tính chung Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và axit. Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác. Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axit lactic trong môi trường, và sức chịu axit (hay độ bền axit) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao hơn (khoảng 2-3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8-4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5-6. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25-350C, ưa nhiệt là 40-450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 6-800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10÷30 phút. Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, nước, không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt ). Mặc dù cơ chế vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên LAB được cho là có một số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch. LAB có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng các phương tiện của sự ức chế cạnh tranh, đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003) tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA – kháng thể chính trong chất nhầy cơ thể, hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ T lympho (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặc dù chưa có cơ chế cụ thể) (O'Toole và Cooney, 2008). 13
15. Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong. Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì những chức năng quan trọng của tế bào như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết. Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng cho con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase. Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng. Bacteriocin class I (đại diện: nisin của Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) – protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích (Riley và Chavan, 2007), (Cotter et al., 2005). Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Ở những phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn khác nhau. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có VSV chứa lactase, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn. Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh: Nguyên nhân là do kháng sinh làm mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột và khi đó Clotridium difficle và Klebsiela oxytoca tăng lên nhanh chóng và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh, kết quả cho thấy chủng S. bolardii, 14
16. S. boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006). Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh. Các loại thực phẩm bổ sung LAB được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002). Những lợi ích của chủng LAB là ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh. Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi LAB lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới. 2.2.3. Đặc điểm hình thái một số chủng LAB Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. 2.2.3.1. Giống Lactobacillus Phân loại khoa học: (Beijerinck, 1901) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Lactobacillaceae Giống : Lactobacillus 15
17. Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như : L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus Hình 2.5. Lactobacillus sp [52]. Đặc điểm: Tế bào có dạng hình que thường dài và thon, không di động, Gram dương, hiếm khi tạo sắc tố (màu gỉ sắt và màu đỏ gạch). glucose, các aldehydic hexose tương tự, cacrbohydrate là đường đơn và các rượu đa chức được chuyển hóa bằng con đường lên men lactic đồng hình và cả dị hình tạo ra axit lactic, axit acetic, rượu và CO2. Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L. plantarum khi ở điều kiện nhất định. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Kỵ khí không bắt buộc, không tạo ra catalase, không hóa lỏng gelatin, không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan. Không tạo indole và H2S. Tế bào còn non cho kết quả Gram dương và trở thành Gram âm khi đã già. Không có khả năng di động. Được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa. Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men đồng hình: Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình: Lactobacillus brevis, L. pentoaceticus, L. lycopersici, L. fermenti 16
18. 2.2.3.2. Giống Streptococcus Phân loại khoa học: (Rosenbach, 1884) Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Streptococcaceae Giống : Streptococcus Gồm các loài: S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. equi, S. iniae, S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. parasanguinis, S. peroris, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. ratti, S. salivarius, S. salivarius ssp thermophilus, S. sanguinis Hình 2.6. Streptococcus [52]. Đặc điểm: Có dạng hình tròn hoặc hình trứng (ovan), ít khi kéo dài thành dạng que. Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi khuẩn không nha bào, Gram dương, không di động, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, đường kính tế bào 0.5-1µm. 17
19. Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường. Trên môi trường agar, khuẩn lạc thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng mịn và tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi. Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, axit acetic, axit formic khi lên men glucose trong môi trường có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942). Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có trong nhóm enterococcus. Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các amino axit trong khi số khác có nhu cầu về các axit béo không no và gia tăng lượng CO2. Vì vậy nhu cầu về dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài. (Dubos, 1948). Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus được đề nghị bởi (Sherman, 1937). Theo đó, chúng được chia ra thành 4 nhóm: nhóm sinh mủ (pyogenic), viridans, Enterococcus và nhóm lactic. Sự phân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng tương ứng với mỗi nhóm, đặc biệt là khoảng nhiệt độ phát triển. Tuy nhiên với các loài mới được công nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trở nên ít khác biệt nhau vì chúng cùng lúc mang nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm. Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc điểm mà ta có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus. Trong khi Streptococcus acidominimus Ayers và Mudge cũng thuộc nhóm viridans nhưng cũng có thể xem như thuộc nhóm pyogenic. Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophillus, Streptococcus salivarius sub sp thermophilus Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình: Streptobacterium brassicae fermentati 2.2.3.3. Giống Leuconostoc Phân loại khoa học: (Van Tieghem, 1878) emend. (Hucker và Pederson, 1930).(Orla-Jensen, 1919). 18
20. Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Lactobacillales Họ : Leuconostocaceae Giống : Leuconostoc Gồm các loài như: L. carnosum, L. citreum, L. durionis, L. fallax, L. ficulneum, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis Hình 2.7. Leuconostoc [50]. Đặc điểm: Leuconostoc có tế bào thường có dạng hình cầu hay oval đơn lẻ, cặp đôi hay dạng chuỗi ngắn. Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính axit, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que. Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứa sucrose. Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ. Leuconostoc là một loài ky khí không bắt buộc. Khi lên men tạo ra một lượng hạn chế axit lactic. L-lactic axit luôn được tạo ra và đôi khi cũng xuất hiện D-lactic axit. Axit acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng ¼ lượng glucose lên men được chuyển thành CO2. 19
21. Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm thấy trong lên men sữa và rau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides (Cienkowski) Van Tieghem. 2.2.3.4. Giống Pediococus Phân loại khoa học: (Claussen, 1903).( Balcke, 1884) Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Pediococcus Gồm các loài như: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, P. damnosus, P. ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P. stilesii. Đặc điểm: Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẽ hoặc thậm chí chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, catalase âm. Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25-32oC, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí. Quá trình trao đổi chất chủ yếu là quá trình lên men đồng hình, không có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém vì vậy chúng có nhu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường. 20
22. Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae Balcke. Hình 2.8. Pediococcus sp [51]. 2.2.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 2.2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ. b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. 21
23. c. Nhu cầu về vitamin Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men d. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit citric, axit oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai axit hữu cơ trên, axit axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng axit axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. e. Nhu cầu các muối vô cơ khác Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. f. Nhu cầu dinh dưỡng oxi Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. + Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP. 22
24. + Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 2.2.4.2. Quá trình trao đổi chất Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là axit lactic (từ 50% carbon của đường). LAB có khả năng lên men các loại đường hexcose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ); pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. (Owen R. Fennema et al. 2004). a. Lên men lactic đồng hình Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận chuyển đường tự do (transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi glucokinase (cần 1 ATP). Một số loài sử dụng phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system (PTS), mỗi phosphoenolpyruvate là một phần tử cho phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một liên kết phosphate có năng lượng cao để hoạt hóa phân tử đường. Con đường glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ Leuconostoc, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành axit lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối 23
25. cùng được tạo ra chủ yếu là axit lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. b. Lên men lactic dị hình Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate và được gọi chung là 6- phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK). Đặc điểm của con đường này là sự khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate.GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra axit lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm khác như CO2, ethanol thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK. Tuy nhiên cần chú ý nhận xét trên không phải dúng cho tất cả các trường hợp. (Owen R. Fennema et al. 2004). 24
26. Hình 2.9. Con đường lên men glucose [26]. (A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis, EMB) (B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase) 25
27. Các enzyme tham gia vào quá trình: 1.Glucokinase; 2.Fructose-1,6- diphosphate aldolase; 3.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4.Pyruvate kinase; 5.Lactate dehydrogenase; 6.Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7.6- phosphogluconate dehydrogenase; 8.Phosphoketolase; 9.Acetaldehyde dehydrogenase; 10.Alcohol dehydrogenase. 2.2.5. Sản phẩm quá trình lên men và khả năng sinh các chất kháng khuẩn ở vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một số lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase. Khi sử dụng chúng có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, phân giải protein và lipid, giúp giảm cholesterol, cải thiện khả năng dung nạp lactose LAB đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, axit folic, biotin (vitamin H), vitamin K. Vi khuẩn sinh axit lactic tạo ra một số các sản phẩm biến dưỡng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh như: H2O2, CO2, diacetyl và các bacteriocin (Bảng 2.4). Vi khuẩn lactic được xem là có khả năng ức chế và cạnh tranh các vi khuẩn gây hại cũng như các mầm bệnh bên trong cơ thể (in vivo) bằng cách sinh ra các chất có tính kháng khuẩn như đã nêu trên. Có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào bacteriocin và phổ kháng khuẩn của bacteriocin, kết quả cho thấy khả năng kháng khuẩn của chúng vẫn còn rất hạn chế, phần lớn chúng chỉ có thể kháng lại các vi khuẩn Gram dương như kháng một số loài có liên quan mật thiết (các chủng Lactobacillus khác) hoặc kháng các vi khuẩn sinh bào tử Gram dương như Bacillus và Clostridium (Holzapfel et al.,1995). 26
28. Bảng 2.4. Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng CO2 Ức chế quá trình decarboxylation, giảm tính thấm của màng. Diacetyl Tác động lên protein gắn arginine. Hydrogen peroxide Oxy hóa các protein cơ bản. Lactoperoxide Axit lactic Axit lactic không bị phân hủy mà thấm vào màng làm giảm pH nội bào. Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như: oxidative phóphotylation. Bacteriocin Tác động lên màng , tổng hợp enzyme và tổng hợp protein. [17] Tuy nhiên vẫn có một số nghiên cứu khác cho thấy LAB có thể kháng lại một số vi khuẩn Gram âm như: Salmonella, Escherichia coli và Helicobacter licobacter (Skytta¨ et al., 1992; Helander et al., 1997; Niku-Paavola et al., 1999) có thể là nhờ vào việc sản sinh ra các chất có trọng lượng phân tử thấp (như H2O2, axit lactic, các hợp chất dễ bay hơi) và các hợp chất thứ cấp trong quá trình trao đổi chất đã làm cho phổ kháng khuẩn của chúng được mở rộng hơn đối với vi khuẩn Gram âm. Chủng L. acidophilus LA1 có khả năng kháng lại cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm như Staphylococcus aureus, L. monocytogens, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter cloacae và Helicobacter pylori (Bernet-Camard et al., 1997), (Michetti et al., 1999). Mặc dù LAB không có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Gram âm nhưng trong thực tế thì người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của LAB hơn vì các vi khuẩn Gram âm thường là những vi khuẩn có hại và gây bệnh cho người như E. coli gây tiêu chảy, Salmonella gây bệnh thương hàn và Helicobacter gây viêm loét dạ dày 27
29. 2.3. Tổng quan về phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic 2.3.1. Nhu cầu tìm kiếm các nguồn mới Trong những năm gần đây, khả năng kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong điều trị bệnh của con người và động vật. Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc. Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh. Trong số đó, việc sản xuất lactase từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự chú ý do LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm. 2.3.2. Phương pháp tìm kiếm các nguồn mới Tuy hầu hết các sản phẩm về lactase trên thị trường đều giống nhau về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất, mà mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau. Vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn lactase, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật. Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất lactase là một quy trình lựa chọn cẩn thận. Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng vi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi. Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan Rogosa Sharpe, 1960) từ nhiều nguồn khác nhau: 28
30. - Từ các sản phẩm thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi . - Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo và từ mề gà - Từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh . Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì việc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào. Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng. Công việc tuyển chọn ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của chúng, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp. Khảo sát tính an toàn của chủng (đối với con người, cho động vật và môi trường) trước khi mang đi sử dụng. 2.3.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật 2.3.3.1. Định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống. Ban đầu “vi khuẩn lactic” được dùng để chỉ các vi khuẩn làm chua sữa và sau đó một dạng vi khuẩn thuần khiết cũng được cho là vi khuẩn lactic (có thể là Lactococcus lactic) được đưa ra bởi J. Lister vào năm 1873. Một bước quan trọng trong phân loại vi khuẩn lactic được hình thành khi có sự giống nhau giữa các vi khuẩn trong sữa chua và các vi khuẩn tạo axit lactic khác có trong các nguồn khác nhau. Tuy nhiên vẫn còn nhiều nhầm lẫn khi chuyên khảo của Orla-Jensen xuất hiện (Orla-Jensen. 1919) và nó có ảnh hưởng lớn đến hệ thống phân loại của LAB, mặc dù đã có sự sửa đổi dáng kể nhưng cơ sở cho việc phân loại vẫn không thay đổi, Orla- Jensen vẫn phân loại dựa trên phương pháp cổ điển như: so sánh hình thái vi khuẩn (cocci, rod hoặc dạng tetrad), hình thức lên men glucose (đồng hình, dị hình), khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau (10oC và 45oC), khả năng lên men các nguồn đường khác nhau. Năm 1985 có thêm nhiều giống LAB mới được mô tả, tuy nhiên việc phân tích theo phương pháp truyền thống dựa vào hình thái vi khuẩn vẫn giữ vai trò quan trọng trong phân loại LAB. 29
31. Các giống LAB cũng đã được mô tả lại trong Bergey’s manual 1986, đây được xem như là phiên bản cuối cùng và chủ yếu tiếp tục phản ánh kết quả của Orla-Jensen 1919. Trong đó có sự phù hợp với các mô tả chung của các giống LAB điển hình: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Sự thay đổi chính trong Bergey’s manual 1986 là giống Streptococcus lần đầu tiên được chia thành 3 nhóm: Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus sensu stricto (Schleifer. 1987). Một vài giống LAB giống với Lactococci được đề nghị xếp vào giống Vagococcus, các giống Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus không có thay đổi nhiều, tuy nhiên một vài loài trong Lactobacills được xếp vào giống Carnobacterium, và loài Pediococcus halophilus được đưa lên cấp giống là Tetragenococcus, một số LAB lên men dị hình trong Lactobacillus và Leuconostoc được xếp vào giống Weissella, ngoài ra một số giống mới cũng được mô tả có liên quan nhiều đến LAB như Alloiococcus, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Eremococcus, Facklamia, Globicatella, Helcococcus, Ignavigranum và Lactosphaera Bản sửa đổi được thực hiện vào năm 1986 cũng đã hỗ trợ nhiều trong việc phân loại vi sinh vật dựa trên thành phần hóa học và di truyền. (Owen R. Fennema et al. 2004) 2.3.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống Như đã đề cập, cơ sở chung cho việc phân loại LAB vào các giống khác nhau chủ bằng phương pháp định danh truyền thống và so sánh với khóa phân loại của Bergey’s manual 1986, tuy nhiên việc này ngày càng gặp khó khăn để đạt kết quả tin cậy khi phân loại một số giống mới nhưng nó lại là bước quan trọng trước khi tiến hành các phân tích sâu hơn. LAB được phân chia theo hình thái như sau: dạng trực khuẩn (rod) gồm Lactobacillus và Carnobacterium; dạng cầu khuẩn gồm tất cả các giống còn lại và một ngoại lệ là đối với giống Weissella được mô tả gồm cả dạng trực khuẩn và cầu khuẩn; thêm vào đó, sự phân chia tế bào theo hai hướng vuông góc trên cùng một mặt phẳng dẫn đến sự hình thành dạng tứ cầu khuẩn (tetrad) và nó cũng được sử dụng để mô tả một dạng khác của cầu khuẩn, bao gồm các giống Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus. 30
32. Phân chia theo hình thức lên men glucose, LAB được chia vào 2 nhóm: lên men đồng hình chuyển hóa glucose chủ yếu thành axit lactic và lên men dị hình tạo axit lactic, ethanol, axit acetic và CO2. Trong thực nghiệm, kiểm tra sự sinh khí CO2 để phân biệt giữa 2 nhóm: nhóm (Sharpe. 1979) Leuconostoc, Oenococci, Weissella và phân nhóm của Lactobacilli là lên men dị hình, tất cả các LAB khác là lên men đồng hình. Sự phát triển ở các nhiệt độ khác nhau cũng góp phần phân biệt một số giống thuộc cầu khuẩn: Enterococci phát triển ở 10oC và 45oC, Lactococci và Vagococci phát triển được ở 10oC nhưng không thể sống ở 45oC, Streptococci thường không phát triển ở 10oC trong khi lại có thể phát triển ở 45oC tùy vào loài. Sự chịu muối (6,5% NaCl) cũng được sử dụng để phân biệt giữa Enterococci và Lactococi, Vagococci và Streptococci (Mundt. 1986). Đặc biệt khả năng chịu muối (18% NaCl) được giới hạn trong Tetragenococcus. Khả năng chịu axit ở kiềm cũng rất hữu ích trong việc phân loại. Aerococci, Carnobacteria, Enterococci, Tetragenococci và Vagococcicos thể phát triển ở pH cao những không phát triển ở pH = 9.6. Ngoài ra sự hình thành các dạng đồng phân của axit lactic trong quá trình len men glucose cũng được sử dụng trong phân biệt giữa Leuconostocs (chỉ tạo D-lactic axit) và Lactobacilli lên men dị hình (tạo axit lactic cả 2 dạng D và L). Tuy nhiên Weissella có thể gây nhầm lẫn trong vấn đề này. (Owen R. Fennema et al. 2004) a. Dựa trên đặc điểm hình thái: - Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến). - Kiểm tra khả năng di động: nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm. - Nhuộm bào tử: nhuộm lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton), nhuộm Carbolic Fuchsin. - Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo và phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet). - Nhuộm vi khuẩn kháng axit 31
33. b. Dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý: - Hình thái khuẩn lạc. - Nhiệt độ sinh trưởng, chịu axit, chịu muối mật - Nhu cầu oxygen. c. Dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: khả năng đồng hóa các nguồn carbon, khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/oxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng Methyl - Methyl Red, phản ứng V.P. (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như: + API20E KIT : dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân: trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến làm sai kết quả. + Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác 32
34. nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. + Phân biệt theo Typ huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng có hạn chế là: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. + Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. 2.3.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại Việc phân loại LAB chủ yếu dựa trên hình thái và đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Tuy nhiên trong thực nghiệm, các đặc điểm này không đủ để định danh chính xác một chủng đến cấp loài cụ thể. Ngày nay với công nghệ xác định trình tự DNA một cách tự động và nhanh chóng, người ta đã trực tiếp xác định được trình tự của gen mã hóa cho 16S rRNA và tạo phương tiện dễ dàng cho phân loại vi khuẩn (Owen R. Fennema et al. 2004) Việc xác định trình tự của gen 16S rRNA để phân tích sự phát sinh loài của LAB đã được thực hiện vào những năm 1990, bắt đầu từ sự phát triển các đầu dò DNA để định danh vi khuẩn. Việc phân loại LAB bằng các đầu dò 16S hoặc 23S RNA đã được phát triển và sử dụng đối với Lactococci, Enterococci, Lactobacilli, Carnobacteria và phân biệt Vagococci với các LAB khác Dữ liệu về trình tự các gen 16S rRNA của LAB đã được tích lũy trong suốt nhiều năm qua và danh mục các đầu dò hiện có được đưa ra bởi Pot et al,.1994. 33
35. 2.4. Các nghiên cứu về lactase trong và ngoài nước 2.4.1. Trong nước Các nghiên cứu về lactase ở Việt Nam có thể kể đến: Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cộng tác viên (2006) nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme lactase ở 2 chủng Lactobacilus reuteri L103 và L461. Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme biểu hiện ở 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa). Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 ( chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103). Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứ V, Trường Đại học Khoa học Hà Nội, 2006, và đã đăng trong tạp chí quốc tế. Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galactooligosaccharides mang hoạt tính sinh học. Nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Văn Giang (2009) có 2 nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu enzyme tái tổ hợp. Một là nghiên cứu biểu hiện β-glucosidase trong E.coli BL21. Một nghiên cứu khác là nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa B- glucosidase từ chủng Bacillus subtilis G1. 2.4.2. Ngoài nước 2.4.2.1. Nghiên cứu lactase từ nấm men Được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm lactase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulopsis spherical, Torulautilis sp, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis. Lactase từ Sacchromyces fragilis được nghiên cứu từ rất sớm, 1956, khi đó Davids. A đã biết rằng lactase trong nấm men này là dạng nội bào và tìm ra phương pháp phá tế bào bằng hóa chất để tăng hoạt tính enzyme. Nghiên cứu này cũng chỉ ra là lactase bị ức chế bởi nồng độ đường Glc, Suc, nhưng kém ức chế hơn với Gal và Lac [47] . Về lactase của Candida pseudotropicalis, nghiên cứu của Sonia a. de Bales và Francisco J. Castillo, 1979 , nuôi trong canh trường chứa 10-12% nước chiết rút sản 34
36. xuất phomai (whey) bổ sung thêm khoáng và nước chiết nấm men. Hoạt tính enzyme thu được là 468 U/ml và 4.35 U/g sinh khối. Hoạt tính enzyme tối ưu ở pH 6.2 và nhiệt độ 470C. Hoạt tính này có thể bảo tồn 95% sau 3 tháng bảo quản ở -200C [46]. Gần đây nhất là Tovar-castro (2008), nghiên cứu về sinh tổng hợp lactase từ Kluyveromyces marxianus cố định trên giá thể rắn với nồng độ cơ chất lactose là 50g/L, bổ sung thêm nguồn nitơ và phosphor. Sau 30h nuôi cấy, 90% cơ chất bị chuyển hóa và thu được hoạt tính lactase nội bào là 1147.7 UI/g sinh khối [6] . 2.4.2.2. Nghiên cứa lactase từ vi khuẩn Chủ yếu là từ Gram dương, thuộc giống Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, vi khuẩn Gram âm là E.coli. Chang B.S và cộng tác viên (1989) đã tinh sạch lactase từ Streptococcus salivarius thermophilus đến mức độ 109 lần so với ban đầu, với hiệu suất là 41% và hoạt tính là 592UI/mg protein ở 370C. Nếu đặt enzyme trong sữa thì hoạt tính này bền nhiệt (60-650C) tới 146 phút tức gấp 40-80 lần khi môi trường phản ứng không phải là sữa [41]. Năm 2005, một nghiên cứu ở Ấn Độ, S.K.Akolkar và cộng tác viên đã sinh tổng hợp lactase từ Lactobacillus acidophilus, chủng phân lập từ sản phẩm len men ragi, một món ăn truyền thống. Vi sinh được nuôi trong canh trường lỏng 5L, chứa nồng độ lactose rất thấp 0.75% cho thêm có 1% ragi nên hiệu quả về kinh tế. Enzyme thu được có hoạt tính 5400U/ml-1 tức là thậm chí cao hơn chủng đã sản xuất công nghiệp là nấm men Kluyveromyces lactis [7]. Lactase trong E.coli được biết đến từ năm 1941, khi đó người ta phải phá tế bào vi khuẩn để thu dung dịch lactose thô . Enzyme nay đặc biệt có giải pH trung tính, tại pH 5.0 đã gần như mất hoạt tính . Nhiệt độ tối ưu là 360C. Gen mã hóa cho β- galactosidase của E.coli sau này được tách dòng, tái tổ hợp lại trong vectơ đặc hiệu với mục đích làm công cụ trong kĩ thuật di truyền để tuyển chọn các tế bào biểu hiện gen thông qua sàng lọc khuẩn lạc xanh trong môi trường chứa X-gal [48]. 2.4.3.3. Nghiên cứu lactase từ nấm sợi Điển hình là từ Trichoderma sp, Aspergillus sp, Fusarium sp. Đặc trưng chung là các enzyme này là ngoại bào nên quy trình tinh sạch khá dễ dàng. Phần lớn là 35
37. enzyme chịu nhiệt và chịu pH axit yếu (3.0-5.0). Bên cạnh ưu điểm trên thì nhược điểm lớn nhất là hoạt tính riêng của enzyme khá thấp so với vi khuẩn và nấm men. Lactase từ Aspergillus sp được nghiên cứu nhiều hơn cả đó là các enzyme từ loài Aspergillus niger và Aspergillus oryzae. Một vài nghiên cứu tiêu biểu sau: Park, Y.K và cộng tác viên (1979) đã tinh sạch lactase từ Aspergillus oryzae bằng kết tủa amon sulphate và sau đó là sắc kí cột thu được enzyme khá ổn định pH 3.0-8.0 và hoạt động tốt ở nhiệt độ 500c. Tuy nhiên enzyme này trong môi trường bò sữa đã giảm hoạt tính đáng kể [45] . Sanjeev Agrawal và cộng tác viên (1982) đã phân lập được 48 chủng nấm sợi có hoạt tính lactase, trong đó có 8 chủng thuộc Aspergillus sp. Nghiên cứu cũng cho thấy là enzyme ngoại bào và thuộc tính enzyme thuộc dạng chịu nhiệt [43]. Gần đây Zhang W và công tác viên (2005) đã chuyển gene lactase của Aspergillus candidus vào nấm men Pichia pastoris, tinh sạch enzyme và thu được enzyme có trọng lượng 113kDa, hoạt tính là 3600U/mg, tối ưu ở pH 5.2 và nhiệt độ 600C [40]. Đối với lactase từ Trichoderma sp, Francisco J. Castillo và cộng sự (1984) đã nuôi chìm Trichoderma reesei Rut-C30 trong môi trường chứa lactose thu được hoạt tính enzyme ngoại bào 27.3U/L. Hoạt tính enzyme đạt được cưc đại ở 600C và pH 4.6. Loại lactase này được gọi là lactase axit và phù hợp dùng trong môi trường có pH tương đối axit như nước chiết rút từ len men phomai [42]. Lactase cũng có thể tách chiết từ nấm sợi Fusarium sp. Macris BJ, Markakis P (1981) đã thu nhận enzyme ngoại bào từ chủng Fusarium moniliforme nuôi bằng nước chiết rút từ sản xuất phomai (whey) và tủa bằng amonium sulphate. Kết quả là enzyme có hoạt tính tốt nhât ở pH 3.8 và nhiêt độ 500C. Tương tự như với enzyme từ Trichoderma sp, enzyme này thuộc dạng lactase axit và thích hợp để thủy phân lactose trong nước chiết. Trong điều kiện thích hợp, 10 đơn vị hoạt tính enzyme có thể thủy phân 50% lượng lactose trong vòng 5h [44]. 36
38. 2.4.3.4. Một số chủng đã được thương mại hóa Tác động đến con Chủng Tên sản phẩm Nhà sản xuất người Bifidobacterium animalis Chr. Hansen subsp. lactis BB-12 Bifidobacterium breve Bifiene Yakult Yakult Bifidobacterium infantis Procter & Align 35624 Gamble Bifidobacterium lactis Howaru Bifido Danisco HN019 (DR10) Bifidobacterium longum Morinaga Milk BB536 Industry Escherichia coli M-17 ProBactrix BioBalance Escherichia coli Nissle Mutaflor Ardeypharm 1917 Lactobacillus acidophilus Chr. Hansen LA-5 Lactobacillus acidophilus Danisco NCFM Lactobacillus casei DN114-001 (Lactobacillus Actimel/DanActive Danone casei Immunitas(s)/Defensis) Lactobacillus casei Chr. Hansen CRL431 Cải thiện sức khỏe tiêu hóa, kích thích miễn dịch, làm giảm kháng sinh-liên quan đến tiêu chảy, điều Lactobacillus casei F19 Cultura Arla Foods chỉnh sự cân bằng men vi sinh trong ruột già, làm giảm sự tăng cân (Burrington, Kimberlee. 2007). Lactobacillus casei Shirota Yakult Yakult Lactobacillus paracasei Lactobacillus fortis Nestlé Dành cho trẻ em St11 (or NCC2461) Lactobacillus johnsonii Nestlé La1 (Lactobacillus LC1) Lactococcus lactis L1A Norrmejerier Kích thích miễn dịch, 37
39. cải thiện tiêu hóa, làm giảm kháng sinh - tiêu chảy Lactobacillus plantarum GoodBelly / NextFoods Probi 299V ProViva/ TuZen Ferring Phòng, chống và giảm Lactobacillus reuteri thiểu tiêu chảy ở trẻ ATTC 55730 BioGaia em, cải thiện hệ tiêu (Lactobacillus reuteri Biologics hóa. Phòng bệnh ở tẻ SD2112) em và người lớn Lactobacillus rhamnosus ATCC 53013 Vifit và một số mặt Valio (discoveredby Gorbach & hàng khác Goldin (LGG) Kích thích miễn dịch, Lactobacillus rhamnosus cải thiện tiêu hóa, làm Verum Norrmejerier LB21 giảm kháng sinh-tiêu chảy Lactobacillus salivarius UCC118 Chống lại kháng sinh- được liên kết và tiêu Wren chảy [Clostridium Saccharomyces cerevisiae DiarSafe và một số Laboratories và difficile] bệnh nhiễm (boulardii) lyo mặt hàng khác một số hảng khác trùng, để điều trị tiêu chảy cấp tính ở người lớn & trẻ em Hỗn hợp: Bion Flore Intime Lactobacillus rhamnosus Ngăn ngừa viêm âm Jarrow Fem- Chr. Hansen GR-1 & Lactobacillus đạo Dophilus reuteri RC-14 Hỗn hợp : mixture of 8 strains of Sigma-Tau Streptococcus VSL#3 Pharmaceuticals, thermophilus & four Inc. Lactobacillus spp & three Bifidobacterium spp strains Hỗn hợp: Lactobacillus acidophilus CUL60 & Bifidobacterium bifidum CUL 20 38
40. Cải thiện sức khỏe tiêu hóa. Ngăn ngừa Tiêu chảy Có liên hệ Antiobic (AAD) và Clostridium (C Difficile). Kiềm hãm In vitro ở Hỗn hợp: những chủng Listeria Lactobacillus acidophilus Bio-K+ monocytogenes và L. BioK Plus CL1285 & Lactobacillus International innocua, Escherichia casei coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis và Enterococcus faecium. tiêu hóa đường lactose và kích thích miễn dịch Lactobacillus helveticus A'Biotica và một số R0052 & Lactobacillus Institut Rosell mặc hàng khác rhamnosus R0011 Hỗn hợp pha trộn từ 16 chủng: Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium breve Bifidobacterium infantis Bifidobacterium lactis Bifidobacterium longum Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Flora Source® Lactobacillus bulgaricus Nutri-Health® Multi-Probiotic® Lactobacillus casei Lactobacillus gasseri Lactobacillus paracasei Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus salivarius Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus [58] 39
41. 2.4.3.5. Sản xuất chế phẩm lactase trên thế giới Lactose hiện diện ở nồng độ khoảng 4,7% (w / v) trong sữa và whey (nổi trên mặt) còn lại sau giai đoạn đông tụ làm pho mát. Sự hiện diện của lactose trong sữa không phù hợp với phần lớn dân số người trưởng thành trên thế giới, đặc biệt ở những khu vực không có truyền thống về ngành công nghiệp sữa. Bất dung nạp lactose được giới hạn chủ yếu ở dân tộc có nguồn gốc nằm ở Bắc Âu hay tiểu lục địa Ấn Độ và nhờ ổn định lactase, tất cả các động vật có vú trẻ rõ ràng có thể tiêu hóa sữa, nhưng trong nhiều trường hợp khả năng này giảm sau khi cai sữa. Thái Lan, Trung Quốc và người Mỹ đen tương ứng với 97%, 90% và 73%, được báo là không dung nạp lactose, trong khi người Mỹ trắng và dân số Thụy Điển tương ứng với 84% và 96%. Thêm vào đó, chỉ có rất hiếm một số cá nhân không dung nạp lactose chuyển hóa bẩm sinh hoặc thiếu lactase, cả hai đều có thể nhận thấy khi sinh. Sự cần thiết của sữa có hàm lượng lactose thấp đặc biệt quan trọng trong chương trình viện trợ thực phẩm như mất nước mô nghiêm trọng, tiêu chảy và thậm chí tử vong do ăn sữa có chứa lactose, trẻ em không dung nạp lactose và người lớn bị suy dinh dưỡng protein có hàm lượng calo thấp. Trong tất cả các trường hợp, thủy phân lactose thành glucose và galactose sẽ ngăn chặn các vấn đề tiêu hóa (nặng) [56]. Mặt khác, khả năng hòa tan thấp của lactose dẫn đến hình thành tinh thể ở nồng độ cao hơn 11% (w / v) (4C). Điều này ngăn cản việc tập trung sử dụng xi-rô whey trong quá trình sản xuất thực phẩm, tạo nhiều kết cấu phức tạp và dễ dàng bị hư hỏng vi sinh. Thêm vấn đề nữa là việc xử lý chất thải whey như vậy là rất đắt tiền do nhu cầu oxy sinh học của nó cao. Những vấn đề này có thể được khắc phục bằng cách thủy phân lactose trong sữa, sản phẩm có các yếu tố như độ ngọt, hòa tan, khả năng hình thành, tập trung, an toàn vi sinh và xi-rô (70% (w / v)) [56]. 40
42. Lactose có thể được thủy phân bởi lactase, một β-galactosidase: Hình 2.10. Quá trình thủy phân lactose [55]. Lactase thương mại có thể được chế biến từ sữa nấm men Kluyveromyces fragilis ( K. marxianus var. marxianus), với độ pH tối ưu (pH 6,5-7,0), hoặc từ các loại nấm Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus niger, với Optima pH (pH 4,5-6,0 và 3,0-4,0 hoặc tương ứng) sẽ phù hợp với thủy phân whey hơn. Các men này có thể có mức độ khác nhau về sự ức chế sản phẩm của galactose. Ngoài ra, ở nồng độ lactose và galactose cao, lactase cho thấy khả năng truyền enzyme đáng kể và sản xuất β-1,6 liên kết với oligosaccharides galactosyl [56]. Lactase đang được sử dụng trong sản xuất kem, sữa cô đặc có hương vị ngọt. Khi được thêm vào sữa cô đặc hay sữa lỏng (2000 U/kg -1 ) và để khoảng một ngày 5C sẽ có khoảng 50% lactose được thủy phân, đưa ra một sản phẩm có độ ngọt không bị kết tinh nếu ngưng tụ hoặc đông lạnh. Phương pháp này cho phép không lãng phí whey để thay thế một số hoặc tất cả các loại sữa bột tách kem được sử dụng trong công thức nấu kem đá ăn truyền thống. Nó cũng cải thiện khả năng mở rộng và tính mượt của sản phẩm. Số lượng lactase nhỏ hơn có thể được thêm vào sữa tiệt trùng để sản xuất một sản phẩm lactose tương đối rẻ tiền (ví dụ như 20 U/kg -1, 20C). Nói chung, việc sử dụng lactase không đạt được tiềm năng đầy đủ của nó, vì enzyme hiện nay tương đối đắt tiền và chỉ có thể được sử dụng ở nhiệt độ thấp [56]. Lactase từ tế bào động vật, thực vật, nấm men và vi khuẩn là dạng nội bào, còn từ nấm mốc là dạng ngoại bào. Vị trí tồn tại của enzyme trong tế bào sẽ quyết định phương pháp tinh sạch cũng như từ đó dự toán chi phí cho công đoạn này, thông thường chiếm tỷ trọng lớn trong quá trình sản xuất . 41
43. Trong công nghiệp hiện nay chủ yếu sản xuất enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật do thời gian sinh trưởng nhanh. Lactase từ vi khuẩn có nguồn gốc đặc trưng, thông thường có hoạt tính cao hơn nhiều và lượng enzyme cũng tạo ra nhiều hơn so với lactase có nguồn gốc từ vi nấm, tuy nhiên phương pháp tinh sạch và tốn kém hơn. Các sản phẩm lactase có thể : - Dạng lỏng: sử dụng trực tiếp nhỏ vào sữa để phân hủy lactose. - Dạng cố định: để sản xuất sữa nghèo lactose. - Dạng viên nén: để uống hỗ trợ tiêu hóa lactase tại ruột non. Đối với enzyme cho sản xuất sữa thì chủ yếu là enzyme từ nấm men còn để hỗ trợ tiêu hóa thì enzyme từ nấm sợi được sử dụng nhiều hơn [49]. Bảng 2.5. Các công ty sản xuất enzyme lactase Chủng được sử dụng Công ty sản xuất enzyme Sản phẩm Kluyveroymces hoặc Gist – brocades, Hà Lan Maxilact Sacchromyces lactic Nutritional Biochemical, Mỹ Lactaid Kluyveromyces hoặc Kyowa Hakko Koygo, Nhật Lactase-Y Sacchromyces fragilis Novo A/S, Đan Mạch Lactozym Aspergillus niger hoặc Baxte Laboratories lnc, Mỹ Lactase-LP Aspergillus oryzae Dairy Food Lab, Mỹ Plexazym L1 Dainylad Food Labs, Mỹ Kyowa Hakko Koygo, Nhật Seishu Pharmaseutical, Noda, Nhật Rhom Pharma (Weiterstadt, FRG) Escherichia coli CF-Boeringer GmnH, Mannheim, Đức b-galactosidase Tập đoàn Northington Biochemical, (tinh sạch dung Mỹ cho nghiên cứu) [49] 42
44. Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 03/2012 đến ngày 07/2012. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA). - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản). - Autoclave (Memmert – Đức). - Kính hiển vi quang học Olympus – (Nhật Bản). - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức). - Pipetman 100 – 1000 l. - Bếp điện. - Bông thấm nước, bông không thấm nước. - Giấy lọc, lame, lamell - Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, đĩa Petri, que cấy, đền cồn, bình định mức, ống đông, becher, pipette, crucible, giấy lọc. - Bộ Kit API 50 CHL V5.1. 3.3.2. Hóa chất + Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm : Tím kết tinh (Crystal violet), ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen, etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH, AgNO3,NH4OH, H2O2, dung dịch Tetramethy-p- phenylene diamine dihydrochloride. 43
45. + Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS (phụ lục 5). Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson. 2007). + Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong nước, thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím. + ONPG 3.4. Phương pháp thí nghiệm Sơ đồ thí nghiệm: Mẫu Phân lập Định danh sơ bộ Sàng lọc hoạt tính lactase Định danh bằng Kit 44
46. Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic. Sữa chua Nem chua Nước cải chua Tăng sinh trong MRS broth Cấy truyền sang MRS agar Phân lập giống thuần khiết Quan sát hình thái khuẩn lạc Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào + Hình que Hình cầu Nhuộm bào tử Quan sát Quan sát Catalase Định tính axit lactic + Kiểm tra khả năng di động Vi khuẩn lên men lactic Lên men đường Sàng lọc hoạt tính lactase Đinh danh bằng Kit 45
47. 3.4.1. Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm lên men có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn phân lập vi khuẩn lactic gồm: sữa chua, nem chua, nước cải chua. 3.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 3.4.2.1. Tăng sinh Mục đích: Kích hoạt các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản các mẫu. Trong đó, các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi khuẩn lactic. Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp thu lượng sinh khối vi khuẩn phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Môi trường sử dụng MRS broth, đã hấp khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. Với các mẫu là dạng dịch như: sữa chua, nước cải chua , hút 1ml cho vào ống nghiệm chứa khoảng 10ml MRS broth, còn lại đối với các với các mẫu là dạng rắn lấy khoảng 2g, đánh tơi cho vào ống nghiệm chứa MRS broth. Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nắp ống nghiệm cho kín đem ủ ở 370C, 24 giờ. 3.4.2.2. Phân lập Mục đích: Tách các khuẩn lạc riêng lẻ khác nhau, giúp chọn lựa ra các chủng vi khuẩn đồng nhất. Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10-9. Gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ: sử dụng môi trường phân lập là môi trường MRS agar. Tiến hành cấy trang ở các độ pha loãng từ 10-8 ÷ 10-9, mỗi nồng độ sẽ cấy trang 3 đĩa, sau đó cấy truyền các khuẩn lạc đã đồng nhất vào các ống thạch nghiêng ủ ở 370C, 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C. 46
48. 3.4.3. Phương pháp định danh vi khuẩn lactic 3.4.3.1. Nhuộm Gram. Mục đích: Giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn Gram dương (Gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Sau khi thu được các chủng vi khuẩn đồng nhất, ta tiến hành nhuộm Gram và loại bỏ các vi khuẩn Gram âm, giúp sàng lọc ra các vi khuẩn Gram dương có khả năng là vi khuẩn lactic. 3.4.3.2. Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ. Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương nhưng không sinh bào tử. 3.4.3.3. Thử nghiệm catalasa Mục đích: Kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalasa. Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm kháng axit được tiến hành thử nghiệm catalase. Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa để ghi nhận kết quả. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic. 47
49. 3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh axit Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh axit của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Trong thí nghiệm này các chủng cho catalase âm tính thu được từ bước trên sẽ được kiểm tra với thuốc thử Uffelmann. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi chúng tạo axit lactic và làm đổi màu tím của thuốc thử thành màu vàng nhạt. 3.4.3.5. Thử nghiệm khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này ta sẽ loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. 3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 Mục đích : kiểm tra khả năng sinh, là một chất tham gia vào hoạt động kháng khuẩn của của vi sinh vật. Nguyên tắc : H2O2 là một chất vừa có tính khử vừa có tính oxy hóa. Trong môi trường axit, H2O2 có tính oxy hóa mạnh, khi tác dụng với chất khử KI tạo ra I2, nhận biết phản ứng bằng cho thêm hồ tinh bột. H2O2 + 2KI I2 + 2KOH Tiến hành : - Nuôi ủ các chủng vi khuẩn trong môi trường lỏng 24 giờ - Lấy mỗi mẫu 5ml dịch nuôi cấy, thêm 1ml H2SO4 1M và 1ml KI, sau đó thêm 3 giọt hồ tinh bột - Quan sát sự chuyển màu và ghi kết quả. 48
50. 3.4.3.7. Thử nghiệm khả năng len men đường và sinh khí Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey. Tiến hành: sử dụng bộ Kit API 50 CHL V5.1 3.4.3.8. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Mục đích: Những vi sinh vật lactic là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính đó, trong đó vi khuẩn E. coli được chọn làm vi sinh vật chỉ thị. Nguyên tắc: chất kháng sinh do vi sinh vật kiểm định làm cho vi sinh vật không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. Cách tiến hành: Dùng phương pháp khuếch tán trên thạch - Cách thu dịch sinh kháng sinh: + Nuôi cấy chủng vi khuẩn phân lập được trong môi trường lỏng, ủ 3-5 ngày ở 370C. + Đem lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc để thu dịch sinh kháng sinh. - Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml môi trường lỏng có chứa vi sinh vật kiểm định nhỏ vào đĩa petri chữa môi trường dinh dưỡng tương ứng. - Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch vi sinh vật kiểm định trên bề mặt thạch. - Dùng dụng cụ đục lỗ vô trùng (bằng inox, d = 6 mm) khoan các lỗ trên môi trường thạch có chứa vi sinh vật kiểm định. - Dùng micropipet vô trùng hút 0,1 ml dịch chiết kháng sinh nghiên cứu cho vào lỗ khoan. 49
51. - Để các đĩa petri vào tủ lạnh ở 40C trong 6-8h để dịch kháng sinh khếch tán vào trong thạch rồi chuyển sang tủ ấm ở 370C. Kiểm tra vòng ức chế sau 24h. Kiểm tra kết quả: Khả năng sinh kháng sinh được đánh giá bằng hiệu số [(D-d), mm] D: đường kính vòng phân giải D: đường kính lỗ khoan Quy ước: - (D-d) >= 25mm: hoạt tính kháng sinh rất mạnh. - (D-d) >= 20mm: hoạt tính kháng sinh mạnh. - (D-d) >= 10-19,5mm: hoạt tính kháng sinh trung bình. - (D-d) <= 10mm: hoạt tính kháng sinh yếu. (Egorov, 1969) 3.4.3.9. Sàng lọc hoạt tính lactase. Mục đích: sàng lọc và chọn ra những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lactase. Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính của enzyme -galactosidase (U) là tổng lượng enzyme xúc tác chuyển hóa ONPG thành 1 mol ONP trên 1 ml canh trường trong 1 phút ở 370C. Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật lý hoặc hóa học. Các phương pháp: so màu, đo khí, đo độ phân cực, 50
52. đo độ nhớt, chuẩn độ, quang phổ kế, sắc kí, phóng xạ, đo huỳnh quang được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme. Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau: 1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. 2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định. 3. Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Đơn vị hoạt độ enzyme: Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1µmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1µmol cơ chất (10-6mol)/ phút. Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 1 mol cơ chất/giây = 60 mol/phút = 60 x 106 µmol/phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanoKatal) Trong bài luận văn này, ta xác định hoạt độ enzyme lactase bằng phương pháp đo huỳnh quang với cơ chất ONPG. Nguyên tắc: ONPG (O-nitrophenyl-β-D-glucoside) là hợp chất không màu có công thức hóa học gần giống lactose. Khi trong môi trường có sự hiện diện của β- galactosidase sẽ xảy ra quá trình thủy phân ONPG tạo galactose và Ortho-nitrophenol có màu vàng, được đo ở bước sóng 420 nm, cường độ của màu sắc tỷ lệ với nồng độ enzyme. Tiến hành: Khảo sát hoạt tính β-galactosidase Dựng đường chuẩn ONP 51
53. 0,001M ONP: Hòa tan 139,1mg ONP vào 50ml ethanol, định mức đến 1000ml nước. Hút 10,0ml nồng độ 0,001M ONP định mức lên 100ml như vậy 1ml dung dịch ONP này chứa 0,1mol ONP Nước cất (ml) 10 8,0 6,0 4,0 2,0 0 ONP(ml) 0 2,0 4,0 6,0 8,0 10 Na2CO3 10% (ml) 1 1 1 1 1 1 Hàm lượng ONP (µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Đo ở bước sóng 420nm. Xác định hoạt tính: Cấy 7% giống vào môi trường MRS đã ủ 370C, 24 giờ. Thu dịch nuôi cấy, lắc đều, lấy X ml dịch nuôi cấy đem đồng nhất với áp suất 2000pisg. Sau đó ly tâm 10000/ phút trong 20 phút, thu dịch nổi để xác định hoạt tính enzyme. Qui trình xác định hoạt tính lactase Thử thật Thử không ONPG 0.2 ml Enzyme 1 ml Enzyme 1 ml Na2 CO3 1ml 500C, 10 phút Na2 CO3 1ml ONPG 0.2 ml Đo OD ở bước song 420nm ΔOD= ODtt-ODtk ` Công thức xác định hoạt tính lactase (U/ml) an.2,2. H (U/ml) 11.X .10 a: hàm lượng ONP suy ra từ đường chuẩn (µmol) X: thể tích canh trường (ml) n: số lần pha loãng. 52
54. ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) là một cơ chất dùng để xác định hoạt tính của enzyme lactase. Hợp chất này bình thường không màu. Tuy nhiên dưới tác dụng của enzyme lactase, ONPG sẽ được chuyển hóa thành ONP (ortho-nitrophenol) và galactose. Hợp chất màu vàng này có thể được hấp thụ ở bước sóng 420nm. Vì vậy, để khảo sát được hoạt tính của lactase chúng tôi tiến hành xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và hàm lượng ONP (Phụ lục 4) 3.4.3.10. Định danh chủng vi sinh vật bằng Kit Trong bài luận văn này, sử dụng bộ Kit API 50 CHL V5.1 Kit API 50 CHL: Đây là bộ dụng cụ thử nghiệm dùng để xác định các chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm men đến cấp độ loài. Bộ dụng cụ này dùng kèm với hệ thống chuẩn API 50 CH. Hệ thống này cung cấp một cơ sở dữ liệu rộng lớn và tiêu chuẩn hóa thông qua APIwedTM dựa trên dịch vụ Internet. APIwedTM là phần mềm có chứa tất cả các cơ sở dữ liệu API và cho kết quả giải thích tự động đáng tin cậy khi được sử dụng trên bất kỳ máy tính tương thích. Đây là phần mềm dễ dàng sử dụng và nó cung cấp báo cáo chi tiết kết quả được hiển thị trên màn hình và có thể in được. Bộ Kit API 50 CHL bao gồm 50 xét nghiệm sinh hóa dựa trên các nghiên cứu chuyển hóa cacbonhydrat của vi sinh vật. Hệ thống API 50 CH được sử dụng kết hợp với bộ dụng cụ thử nghiệm API 50 CHL để xác định dải chi Lactobacillus và thực hiện theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất (Biomerieux, Marcy l’ Etoile, Pháp) (Ghanbari et al, 2009) Tiến hành: 10ml nước tinh khiết được phân phát vào hộp ủ với strip được đặt trong hộp ủ, sau đó vi khuẩn được phân phối vào hệ thống API 50 CHL trong bộ dụng cụ thử nghiệm API 50 CHL (5ml), nồng độ 2 McFarland. Hệ thống được thiết lập và ủ ở nhiệt độ thích hợp (350C, 48h). Các chủng vi khuẩn được xác định dựa trên sự lên men cacbonhydrat. Kết quả được xác định dựa vào sự thay đổi màu sắc trong bảng đánh giá kết quả của phản ứng dải API (+/-). Loài đã được chỉ định được xác định bằng cách đánh giá với phần mềm xác định APIwebTM. 53
55. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Phân lập vi khuẩn lactic Việc phân lập vi khuẩn lactic được tiến hành trên nhiều nguồn khác nhau. Các nguồn phân lập chủ yếu là các loại thực phẩm lên men truyền thống như sữa chua và nem chua. Đây là những nguồn phổ biến đã được sử dụng trong rất nhiều đề tài phân lập hay nghiên cứu về vi khuẩn lactic, và cụ thể hơn là các nguồn được chọn lựa để phân lập trong đề tài này hoàn toàn khác với các nguồn đã được chọn trong các đề tài tốt nghiệp trước đây của khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Hutech. Nguồn phân lập ở đây là các sản phẩm tự làm với mong muốn thu thập được những chủng vi khuẩn lactic mới có khả năng sinh tổng hợp lactase, đóng góp thêm vào bô sưu tập giống. Cùng với việc chọn lựa từ những nguồn mới, các sản phẩm lên men đã được công nhận, những kết quả nghiên cứu có sẵn với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của nhà sản xuất thì việc phân lập cũng tiến hành trên các sản phẩm lên men tự làm: sữa chua, cải chua, nem chua Một nguồn phân lập khác nữa là từ phân của trẻ sơ sinh đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi khuẩn đường ruột sống do cơ thể trẻ nhận được trong lúc quá trình bào thai và sau khi bú sữa mẹ (Rocío Martín et al, 2003), (E. Vlková et al, 2003), (J. Agric, 2002). Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960). Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ được vi khuẩn hiếu khí và ngược lại. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn vi hiếu khí và nên chúng tôi đã tăng điều kiện kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa Petri bằng màng nhựa PVC. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) sẽ được chọn 54
56. (hình 4.1). Từ đó chúng tôi đã chọn lựa và nuôi cấy được 7 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic. Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuần phân lập được Bảng 4.1. Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập được Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập Sữa chua Sữa chua L1, L2, L3, L4 Nem chua Nem chua L5 Cải chua Cải chua L6, L7 4.2. Định danh các chủng vi khuẩn phân lập Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, chúng tôi tiến hành định danh các chủng phân lập bằng phương pháp truyền thống: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa như đã nêu ở mục 2.3.3. 4.2.1. Nhuộm Gram Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh chúng ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm. Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 4.2) và vi khuẩn E. coli Gram âm (hình 4.3) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 12 chủng đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. 55
57. Trong số 12 chủng phân lập được, có 5 chủng thể hiện Gram âm nên số chủng Gram dương rút xuống còn 7. Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn không mong muốn là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E. coli. Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 4.3: Vi khuẩn E. coli Từ việc nhuộm Gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 7 chủng Gram dương thì có : - 5 chủng hình trực khuẩn. - 2 chủng hình cầu trực khuẩn. Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2. Sau bước nhuộm Gram, ta thu được 7 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và tế bào khác nhau, hoặc một số trong đó giống nhau về hình thái khuẩn lạc nhưng khác nhau về hình dạng tế bào và khác cả về nguồn phân lập. Như vậy, dựa vào kết quả nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn, từ 12 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic được lựa chọn ban đầu, ta đã rút ra được 7 chủng có nhiều khả năng là vi khuẩn lactic hơn. Tiếp tục tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo đối với 7 chủng trên để sàng lọc ra những chủng mang đặc điểm của vi khuẩn lactic dựa vào những mô tả trong Berger’s manual. Bảng 4.2. Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x10 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 56
58. Kí hiệu chủng Quan sát nhuộm Gram và Mô tả khuẩn lạc và quan sát khuẩn lạc phân lập mô tả hình thái vi khuẩn L1 Khuẩn lạc tròn, to, nhẵn bóng, màu Vi khuẩn có hình ovan, trắng đục, lồi rất nhiều dạng đôi. L2 Vi khuẩn hình que, thon, Khuẩn lạc tròn, to, lồi nhiều, trắng ngắn, có thắt ở giữa. đục, nhẵn bóng, mép đều, có rìa xung quanh L3 Vi khuẩn hình que, thon, Khuẩn lạc tròn, to, trắng đục, nhẵn ngắn, không có thắt ở giữa. bong, mép trơn đều, lồi ít L4 Vi khuẩn hình ovan, đơn Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, dẹp 57
59. L5 Vi khuẩn hình que,thon, Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, láng bóng, dài, kết đôi hay tạo thành hơi lồi chuỗi L6 Vi khuẩn hình que, thon, Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bờ đều, bóng, dài, không có thắt ở giữa màu trắng đục, lồi ít L7 Khuẩn lạc rất to, (quan sát ở vật kính Vi khuẩn hình que, thon, 4X), màu trắng đục, bóng, dẹp ngắn, có thắt ở giữa 4.2.2. Nhuộm bào tử Bên cạnh nấm mốc còn có các vi khuẩn cũng có khả năng sinh bào tử, bào tử được sinh ra khi vi khuẩn sống trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp suất, dinh dưỡng không còn phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng dương, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục nằm rãi 58
60. rác do các bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm malachite (hình 4.4), đồng thời sử dụng vi khuẩn E.coli không sinh bào tử để làm đối chứng âm (hình 4.5). Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, Gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 7 chủng Gram dương, tiến hành nhuộm bào tử mẫu vi khuẩn (hình 4.6) sau đó so sánh với đối chứng thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.4 Kết quả: Các tế bào của mỗi chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc nhuộm bổ sung. Như vậy, tất cả 7 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. Hình 4.4. Vi khuẩn Hình 4.5. Vi khuẩn E.coli Hình 4.6. Mẫu vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử không sinh bào tử phân lập không sinh bào tử 4.2.3. Thử nghiệm catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình 4.8). Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus, Corynebacterium spp là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E. coli gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. 59
61. Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, tất cả 7 chủng đều không tạo bọt (O2) chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase (hình 4.7). Như vậy, 7 chủng đều cho catalase âm tính. Hình 4.7. Mẫu vi khuẩn phân lập Hình 4.8. Chủng Bacillus subtilis có catalase âm tính có catalase dương tính 4.2.4. Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh axit lactic, vì vậy để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn đó có sinh axit lactic hay không bằng thuốc thử Uffelmann. Sử dụng chủng Bacillus subtilis không axit và không làm đổi màu tím của thuốc thử, làm đối chứng âm (hình 4.9). Từ 7 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, lấy một ít khuẩn lạc cho lên miếng kính lame, sau đó cho trực tiếp thuốc thử lên khuẩn lạc hoặc cho vào dịch lên men trong môi trường MRS của các chủng vi khuẩn. Quan sát thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập đều làm đổi màu thuốc thử từ màu tím sang màu vàng (hình 4.10) Kết quả: tất cả 7 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh axit lactic. Điều này còn được thể hiện qua mùi axit đặc trưng được sinh ra trong tất cả các môi trường sau khi đã cấy vi khuẩn được 24 giờ. 60
62. Hình 4.9. Vi khuẩn Bacillus Hình 4.10. Chủng vi khuẩn subtilis không sinh axit phân lập có sinh axit 4.2.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường hơn khi đem so sánh với môi trường khi chưa cấy vi khuẩn (ống 1 hình 4.11). Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiêm mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy (ống 2 hình 4.11). Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày, do ống nghiệm được bịt kín nên khí sinh ra sẽ đẩy phần thạch trồi lên so với đáy ống. Cho nên ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh hay yếu. Trong hình 4.11 vi khuẩn từ ống 4 sinh khí mạnh hơn ống 3. Kết quả thử nghiệm tính di động của 7 chủng đã qua định tính acid lactic dương tính. Quan sát vết cấy và so sánh với môi trường đối chứng, tất cả các chủng đều mọc theo vết cấy và ko làm đục môi trường xung quanh. Như vậy 7 chủng đều không có khả năng di động. 61
63. Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Hình 4.11. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn phân lập được (Ống 1: Ống môi trường không cấy vi khuẩn, Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di động, Ống 3;4: Vi khuẩn không di động và có sinh khí) Thông qua các bước kiểm tra trên trong mục 4.2, tất cả 7 chủng vi khuẩn Gram dương phân lập được đều mang những đặc điểm chung của vi khuẩn lactic đã được mô tả trong Bergey’s manual như: không sinh bào tử, catalase âm tính, sinh axit lactic và không di động. Như vậy, trong trường hợp này ngay từ việc chọn nguồn phân lập đảm bảo chắc chắn có chứa vi khuẩn lactic mong muốn, việc chọn những khuẩn lạc đặc trưng và nhuộm Gram để loại bỏ vi khuẩn Gram âm ở các bước đầu tiên đã làm tăng lên rất nhiều khả năng thu nhận được nguồn vi khuẩn lactic. Mặc dù trình tự các bước kiểm tra có sự khác biệt so với trình tự kiểm tra trong đồ án phân lập của khóa trước đây nhưng vẫn chung mục đích là nhằm sàng lọc ra các vi khuẩn lactic. Đến đây ta xem như đã hoàn tất việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic, tiếp theo ta tiến hành kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí của từng chủng và so sánh với khóa phân loại của Bergey để có thể định danh chúng đến cấp giống. 4.2.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 H2O2 là một trong những chất sinh ra trong quá trình lên men và cũng góp phần vào khả năng kháng khuẩn của LAB. Khảo sát khả năng tạo H2O2 của các chủng vi khuẩn được phân lập giúp ta hiểu rõ thêm về cơ chế kháng khuẩn của chúng. 62
64. Sử dụng môi trường không cấy vi khuẩn có bố sung vài giọt H2O2 làm đối chứng dương (ống nghiệm 2 hình 4.12). 7 chủng vi khuẩn sau khi được nuôi ủ 24 giờ trong MRS broth được tiến hành kiểm tra, quan sát sự đổi màu của dung dịch và ghi nhận kết quả. Kết quả : dịch nuôi ủ của 7 chủng vi khuẩn đều không đổi màu, như vậy không có chủng nào có khả năng sinh H2O2. . I II Hình 4.12. Kiểm tra khả năng sinh H2O2 (I: Môi trường không cấy vi khuẩn có bổ sung H2O2, II: môi trường nuôi cấy vi khuẩn không sinh H2O2) Tuy cả 7 chủng đều không sinh H2O2 nhưng chúng vẫn có khả năng kháng khuẩn vì ngoài H2O2 còn có những hợp chất khác tham gia tạo nên hoạt tính kháng khuẩn như: các acid hữu cơ, bacteriocin, CO2, diacetyl, Trong trường hợp này khả năng kháng khuẩn nhờ vào H2O2 của 7 chủng vi khuẩn sẽ bị loại trừ. 4.2.7. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn * E.coli Bảng 4.3. Khả năng sinh kháng sinh kháng E.coli của các chủng vi khuẩn phân lập 63
65. Hoạt tính kháng khuẩn STT Chủng (D-d, mm) 1 L1 2,5 2 L2 4 3 L3 4 4 L4 5 5 L5 4,67 6 L6 5 7 L7 5 Hình 4.13. Hoạt tính kháng E.coli của chủng vi khuẩn phân lập Qua thử nghiệm này, đã xác định được cả 7 chủng đều có khả năng kháng E.coli. Trong đó 7 chủng phân lập, có 3 chủng có khả năng kháng khuẩn cao nhất là L4; L6; L7, 1 chủng có khả năng kháng khuẩn thấp nhất là L1. Tuy nhiên, nhìn chung khả năng sinh kháng sinh kháng E.coli của cả 7 chủng đều rất yếu (< 10mm) (Bảng 4.3). 4.2.8. Thử nghiệm khả năng lên men đường và sinh khí Tất cả các chủng phân lập được tiến hành test thử nghiệm với 49 loại đường thông qua bộ Kit API 50 CHL V5.1. Kết quả cho thấy cả 7 chủng đều len men tốt các loại đường phổ biến: ribose, galactose, glucose, fructose, mannose, manitol, sucrose, lactose và sinh khí mạnh (2/3 ống Durham) nên cả 7 chủng đều là chủng lên men lactic dị hình. Ngoài ra, cả 7 chủng còn lên men tốt một số loại đường khác ( Phụ lục 2) 64
66. 4.2.9. Kết quả định danh bằng Kit Tổng cộng có 7 chủng được phân lập từ sữa chua, nem chua, nước cải chua, chúng đều được định danh bằng Kit API 50 CHL V5.1. Trong đó có 4 loài Lactobacillus và 2 loài Lactococcus. Chủng L1, L2, L3, L4 được phân lập từ sữa chua, chủng L5 được phân lập từ nem chua, chủng L6, L7 được phân lập từ nước cải chua. Chương trình nhận dạng APIwedTM cho thấy mức độ giống nhau của chủng L1 với chủng Lactobacillus brevis có độ tương đồng (99,9%), chủng L2 với chủng Lactobacillus plantarum có độ tương đồng (98,9%), chủng L3 với chủng Lactobacillus casei có độ tương đồng (99,1%), chủng L4 với chủng Lactococcus raffinolactis có độ tương đồng (99,9%), chủng L5 với chủng Lactococcus lactis spp lactis 1 có độ tương đồng (99,4%), riêng 2 chủng L6; L7 có mức độ tương đồng với chủng Lactobacillus acidophilus 1 có độ tương đồng (99,5%) nên từ 7 chủng phân lập được ta rút xuống còn 6 chủng, trong đó có 5 chủng có khả năng sinh tổng hợp lactase (L2, L3, L4, L5, L6). Tất cả các chủng trên đều là những chủng có lợi và được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men như: chủng Lactobacillus plantarum thường được sử dụng trong sản xuất nem chua, chủng Lactobacillus casei được sử dụng trong sữa lên men sống Kết quả thu được ở nghiên cứu này cũng góp phần hỗ trợ phục hồi các loài Lactobacillus và Lactococcus đã được báo cáo trước đó (Gronlund et al, 1999; Ahrne et al, 2005). 65
67. Bảng 4.4. Bảng tổng hợp các kết quả định danh. 66
68. 4.2.10. Sàng lọc hoạt tính lactase Bảng 4.5. Hoạt tính enzyme lactase của các chủng vi khuẩn Hoạt tính Kí Sinh khối Test Tên chủng enzyme/g sinh hiệu khô (g/l) ONPG khối khô L1 Lactobacillus brevis 0,0804 - - L2 Lactobacillus plantarum 0,0766 + 560 U/g L3 Lactobacillus casei 0,0912 ++ 975 U/g L4 Lactococcus raffinolactis 0,0643 + 640 U/g Lactococcus lactis spp L5 0,0648 + 560 U/g Lactic 1 L6 Lactobacillus acidophilus 1 0,0941 ++ 2615 U/g Biểu đồ 4.1. Hoạt tính lactase của các chủng vi khuẩn phân lập Để đánh giá khả năng sinh lactase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn, ta tiến hành xác định hoạt tính enzyme lactase. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 và biểu đồ 4.1. Cụ thể là: chủng Lactobacillus brevis có lượng sinh khối khô là 0,0804 g/l và không thể hiện hoạt tính enzyme lactase với cơ chất ONPG. Chủng Lactobacillus plantarum có lượng sinh khối khô là 0,0766 g/l và hoạt tính enzyme là 560 U/g. Chủng Lactobacillus casei có lượng sinh khối khô là 0,0912 g/l và hoạt tính enzyme là 975 U/g. Chủng Lactococcus raffirolactis có lượng 68