›

Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L.)

pdf 105 trang thiennha21 13/04/2022 6570
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_va_hoat_tinh_khang_oxy.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L.)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ CÂY BỒ CÔNG ANH (Lactuca indica L.) Ngành: CÔNG NGHÊ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện : ĐOÀN LÊ THẢO TRANG MSSV: 1311100787 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết và dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Sau quá trình học tập, nghiên cứu tại khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, em đã tiếp thu được rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu nhờ sự giảng dạy, hướng dẫn tận tình của các thầy cô bộ môn. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã giúp đỡ, định hướng và tận tình hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cảm ơn thầy vì đã truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu để hoàn thành bài khóa luận này. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học HUTECH, quý thầy cô hiện đang giảng dạy và làm việc tại Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã truyền dạy rất nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và các anh chị đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên ĐOÀN LÊ THẢO TRANG ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh 3 1.1.3. Thành phần hóa học của cây bồ công anh 4 1.1.4. Công dụng 19 1.2. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật 20 1.2.1. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 20 1.2.2. Những hợp chất kháng khuẩn điển hình ở thực vật 22 1.3. Đại cương một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 27 1.3.1. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 27 1.3.1.1. Các vi khuẩn thuộc nhóm Escherichia Coli 27 1.3.1.2. Các vi khuẩn thuộc nhóm Samonella spp. 29 1.3.1.3. Các vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. 30 1.3.1.4. Các vi khuẩn thuộc nhóm Shigella spp. 31 1.3.1.5. Các vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp. 31 1.3.2. Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 32 1.4. Hoạt tính chống oxi hóa 36 1.4.1. Khái niệm về gốc tự do 36 1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 36 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể 37 1.4.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật 38 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Địa điểm và thời gian 39 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 39 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 39 2.2. Vật liệu 39 2.2.1. Nguồn mẫu 39 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 39 2.2.3. Hóa chất, dung môi 39 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 41 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 41 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 41 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 42 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu 43 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 43 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết. 44 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 46 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu 49 2.4. Bố trí thí nghiệm 50 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh. 51 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE. 53 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng oxy của LiEE 54 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của LiEE 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1. Kết quả hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% từ Bồ công anh (LiEE) 58 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với vi khuẩn chỉ thị 59 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng nhóm E.coli của LiEE 59 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Salmonella của LiEE 60 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Shigella của LiEE 61 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp. của LiEE 63 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác của LiEE 64 3.2.6. Tổng hợp kết quả kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh đối với vi khuẩn chỉ thị 66 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh. 67 3.3.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên sự loại bỏ gốc tự do DPPH của vitamin C 67 3.3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của LiEE 69 3.4. Kết quả xác định sơ bộ thành phần hoá học của LiEE 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 v
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh 4 Hình 1.2: Sơ đồ phân loại carbohydrate theo từng nhóm 6 Hình 1.3: Một vài disaccharide tiêu biểu 7 Hình 1.4: Các polysaccharide thường gặp ở thực vật A) amylose, B) amylopectin, C) cellulose, D) chitin 8 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của một số chất thuộc nhóm alkaloid 13 Hình 1.6: Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). 15 Hình 1.7: Một số euflavonoid thường gặp 17 Hình 1.8: Một số chất thuộc nhóm steroid thường gặp 18 Hình 1.9: Sơ đồ phân loại tannin 19 Hình 1.10: Vị trí các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên vi khuẩn 22 Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine 23 Hình 1.12: Cấu trúc hóa học của phân tử: quinone (A); anthraquinone (B); hypericin (C) 24 Hình 1.13: Cấu trúc hóa học của phân tử capsaicin 26 Hình 1.14: Methol từ cây bạc hà (Nguyễn Tiến Thắng, 2012) 26 Hình 1.15: E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm (Bact, 2005) 28 Hình 1.16: Vi khuẩn Salmonella typhi (Nguyễn Thúy Hương, 2011). 29 Hình 1.17: Vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Thúy Hương, 2011) 26 Hình 1.18: Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 31 Hình 1.19: Vi khuẩn Listeria spp. 32 Hình 1.20: Vi khuẩn Pseudomonas 33 Hình 1.21: Vi khuẩn Enterococcus 34 Hình 1.22: Vi khuẩn Staphylococus aureus 35 Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 44 Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH 45 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 50 Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L 51 Hình 2.5: Mẫu lá bồ công anh 52 Hình 2.7: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 55 Hình 2.8: Quy trình định tính một số thành phần hóa học của LiEE 56 Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Công Anh (LiEE) 58 Hình 3.2: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với E.coli. 59 Hình 3.3: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Salmonella. 61 Hình 3.4: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Shigella. 62 Hình 3.5: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Vibrio. 63 Hình 3.6: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị khác. 65 Hình 3.7: Đường chuẩn khảo sát khả năng kháng oxy hoá của vitamin C 68 Hình 3.8: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của LiEE ở các nồng độ khác nhau 69 vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất 9 Bảng 3.1: Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của LiEE từ các nồng độ khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 66 Bảng 3.2: Hàm lượng chất kháng oxy hoá tương đương g/ml vitamin C ở các nồng độ cao chiết khảo sát 67 Bảng 3.3: Hiệu quả loại bỏ 50% gốc tự do của LiEE và vitamin C 71 Bảng 3.4: Kết quả định tính một số thành phần hóa học trong LiEE 72 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TSB: Trypticase Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl sulfoxide LiEE: Lactuca indica L ethanolic extract NA: Non Activity DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl RNA: Ribonucleic Acid DNA: Deoxyribonucleic Acid ix
  11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên nhằm mục đích trị bệnh, vì đây là một liệu pháp an toàn, dễ tìm, đồng thời mang đến hiệu quả cao. Khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn là các loại thuốc kháng sinh. Mặc dù kháng sinh giải quyết rất nhiều vấn đề liên quan đến trị bệnh và mang lại lợi ích rất lớn cho con người, nhưng cũng chính việc sử dụng kháng sinh cũng dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra nhiều hơn. Nguyên nhân chủ yếu là do việc lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện, tràn lan của con người. Dẫn đến hiện tượng xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới. Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu quả điều trị bệnh vừa đảm bảo an toàn đồng thời phòng ngừa hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Đất nước ta vốn nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới có nền thực vật vô cùng phong phú, nguồn dược liệu cùng với nền y học lâu đời. Chính vì điều đó nên việc ứng dụng các loại thực vật vào trong thuốc chữa bệnh là một thành phần không thể thiếu trong cuộc sống. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10000 loài và theo tác giả Võ Văn Chi nước ta có khoảng 3200 loài cây thảo dược. Không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, việc nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật đã giúp các nhà khoa học tìm hiểu sâu hơn và sử dụng hiệu quả hơn nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh hơn. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện đại việc nghiên cứu các loại thảo dược ở nước ta những năm gần đây đã có nhiều bước phát triển. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại thảo dược đã được nghiên cứu song song cùng việc xác định những thành phần các hoạt chất có trong thực vật. Các loại thảo dược 1
  12. Đồ án tốt nghiệp điển hình như trầu không (Piper betle L.), sống đời (Kalanchoe pinnata), lô hội (Aloe barbadensis), dâu tằm (Morus acidosa Griff), khổ qua (Momordica charantia L.) đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. Cây bồ công anh (Lactuca indica L.) là một cây thuốc mọc hoang ở khắp nước ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến. Mặc dù bồ công anh đã được sử dụng từ lâu đời nhưng những công trình nghiên cứu về cây vẫn còn hạn chế. Việc đánh giá hoạt tính sinh học của bồ công anh là điều hết sức cần thiết, góp phần hoàn thiện một phương thuốc dân gian có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa của cao chiết ethanol 70% từ cây bồ công anh (Lactuca indica L)”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết Lactuca indica L. - Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ cao chiết từ ethanol của bồ công anh (Lactuca indica L). - Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết ethanol từ bồ công anh. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết cao từ lá bồ công anh bằng ethanol 70%. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết. - Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ethanol 70% từ lá bồ công anh. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn chỉ thị Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp - Bước đầu định tính và định lượng thành phần hóa học của cao chiết. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh (Lactuca indica L) 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố 1.1.1.1. Nguồn gốc Cây bồ công anh Việt Nam có tên khoa học là Lactuca indica L, thuộc họ Cúc [3]. Hiện nay, Lactuca indica L được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới, ở Việt Nam bồ công anh còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như diếp dại; mót mét; rau mũi cày; rau chuôi; bồ công anh mũi mác theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2008) hay cây mũi mác, diếp trời, rau bồ cóc, rau mét, phắc bao [5] 1.1.1.2. Phân loại khoa học Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Asterales Họ : Asteraceae Chi : Lactuca Loài : Lactuca indica L 1.1.1.3. Phân bố Cây bồ công anh mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Indonesia, Philippinnes, Trung Quốc Tại Việt Nam bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi. Từ miền núi như Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo (thường ở độ cao dưới 1000m) trung du đến đồng bằng Bắc bộ [3,4,5,8,9]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây bồ công anh Bồ công anh là cây thân thảo, thân nhẵn, thẳng không lông, có tuổi thọ trung bình từ 1 đến 2 năm, cao từ 60 cm đến 200 cm, thân thường đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên, ít phân cành. Lá mọc so le, gần như không đều. Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thước phiến lá dài khoảng từ 13 – 25 cm, rộng từ 1,5 – 11 3
  14. Đồ án tốt nghiệp cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thường ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá. Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng cưa thô to. Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dưới có màu xanh xám. Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh ngọn sinh hoa thường nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn và đầu cành. Hoa tự hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng. Kích thước chùm hoa thường cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá ngoài hình trứng, dài 2 – 3 mm, các lá trong hình trứng – mũi mác. Hoa thường màu vàng, kích thước hoa 12 – 13 mm. Quả bế màu đen hình elip, phẳng, kích thước quả dài 4 – 4,5 mm, rộng 2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm. Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n = 18 (Peng & Hsu, 1978). Mùa hoa vào khoảng tháng 6 – 7 và mùa quả vào tháng 8 – 9. Hình 1.1: Thân và hoa của cây bồ công anh 1.1.3. Thành phần hóa học của cây bồ công anh Trong cây bồ công anh chứa nhựa, tinh dầu, acid béo (acid melissic) và sáp (ceryl palmitat) [4]. Ngoài ra còn có chứa flavonoid, saponin thuộc nhóm steroid, coumarin, serquiterpen lacton, tanin và sterol [10]. Lá tươi và hoa của cây có chứa khoảng 90,8% nước; 0,6% protein; 3,7% carbohydrate, và 73mg/100g vitamin C [4,7]. Năm 1995, Park Hee Juhn đã phát hiện trong cây Lactuca indica L. có 3 dạng sterol là β- sitosterol, compesterol, stigmasterol và 4 triterpen là β- amyrin, lupeol, pseudotarasterol, taraxasterol [22]. Trên thế giới một số nghiên cứu về cây cùng chi bồ công anh cho thấy trong rễ cây Lactuca virosa L. có serquiterpen lacton [23]. Cây Lactuca saligna L. và cây 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Lactuca savita L xác định có serquiterpen lacton, triterpen, sterol, coumarin, flavonoid [15, 21]. 1.1.3.1. Carbohydrate a) Định nghĩa Carbohydrate là hợp chất sinh học tham gia rộng rãi trong các cấu trúc sống của cơ thể sinh vật, được cấu tạo từ 3 nguyên tố là C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường có giá trị m = n. Hàm lượng carbohydrate ở động vật chiếm khoảng 2% ( Phùng Trung Hùng và ctv, 2013), thấp hơn thực vật và thường tồn tại ở dạng glycogen. Ở thực vật carbohydrate chiếm trên 75 %, tập trung chủ yếu ở thành tế bào, mô nâng đỡ và mô dự trữ. Tùy từng loài, từng giai đoạn sinh trưởng và sinh trưởng sẽ có hàm lượng carbohydrate khác nhau. Từ CO2 và H2O thực vật xanh có khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng thực hiện quá trình quang hợp để tổng hợp carbohydrate. Ngày nay thường gọi là dẫn xuất polyhydroxyaldehyde hay polyhydroxycetone. b) Vai trò Carbohydrate đóng vai trò quan trọng trong hóa học hữu cơ kể từ khi khám phá của Emil Fischer (1884-1891). - Thành phần chính trong việc cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican ). - Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. - Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể). Dựa vào cấu tạo, tính chất, số lượng carbon, và bản chất của nhóm carbonyl mà carbohuydrate được chia thành ba nhóm lớn. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2: Sơ đồ phân loại carbohydrate theo từng nhóm Monosaccharide Nhóm các carbohydrate đơn giản nhất và không bị thủy phân nên còn được gọi là đường đơn. Chúng là các aldehyde (-CHO) hoặc keton (-C=O) có chứa một hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl (-OH). Công thức chung của nhóm monosaccharide là (CH2O)n với số n dao động từ 3 đến 7. Monosaccharide đơn giản nhất là các dihydroxyacetone và D- và L-glyceraldehyde có ít nhất 3 carbon. Đường 6 carbon là glucose, fuctose đóng vai trò quan trọng trong hoạt đông sống của tế bào. Oligosaccharide Còn gọi disaccharide là hợp chất trung gian giữa monosaccharide và polysaccharide. Oligosaccharide có từ 2 – 10 monosaccharide liên kết với nhau bằng các liên kết O –glycoside. Công thức hóa học của disaccharides là C12H22O11. Mặc dù có trong tự nhiên tồn tại nhiều dạng disaccharide nhưng chỉ một số ít được chú ý như sucrose, lactose,maltose , cellobiose. 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3: Một vài disaccharide tiêu biểu Polysaccharide Là một trong các chất phổ biến nhất trong cuộc sống. Trong thành phần của polysaccharide có rất nhiều monosaccharide. Các monosaccharide này được nối với nhau bởi các liên kết glycoside có thể là dạng α- hoặc β-glycoside. Tinh bột là polysaccharide dự trữ thực vật phổ biến nhất, là một hỗn hợp của amylose và amylopectin, trong đó amylopectin chiếm khoảng 80%. Polysaccharide trong động vật là glycogen tồn tại chủ yếu ở trong gan, trong mô và cơ có chức năng dự trữ. 7
  18. Đồ án tốt nghiệp A) α-1,4-glycoside B) α-1,6-glycoside α-1,4-glycoside C) D) Hình 1.4: Các polysaccharide thường gặp ở thực vật A) amylose, B) amylopectin, C) cellulose, D) chitin 1.1.3.2. Amino acid a)Định nghĩa: Amino acid (acid amin) là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino Acid là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng chứa nhóm chức amin (-NH2) và acid cacboxylic (-COOH), cùng với một nhóm biến đổi (nhóm R) khác nhau cho mỗi animo acid. Các amino acid tồn tại chủ yếu trong tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid có nhóm amine đứng ở bên trái trục, được gọi là amino acid dạng L. Ngoài các nhóm –NH2, −COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhóm chức khác như: −OH, HS−, −CO− 8
  19. Đồ án tốt nghiệp b)Vai trò - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất. - Tăng tính hữu hiệu sinh học của các nguyên tố dinh dưỡng và vi lượng. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Nâng cao khả năng thụ phấn và kéo dài thời gian sống của hạt phấn - Tăng khả năng ra hoa và tỷ lệ đậu trái. Bảng 1.1: Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Amino Acid Hoạt động sinh hóa Glycine Là tiền chất của cholorophyll. Giúp cân bằng sinh trưởng trong cây trồng. Proline và Proline có ích cho mạch dẫn và các mô liên kết, tạo nhiều Hydroxyproline năng lượng cho thân cành mập hơn và tạo thêm tế bào mới Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước. Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action). Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái). Glutamic và Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và Glutamine protein thông qua phản ứng trao đổi. Glutamine cải thiện sự phát triển và sự tập trung. Đây là nguồn năng lượng quan trọng cho các cơ quan như mạch dẫn, thân và tế bào. Serine Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng cho quá trình tổng hợp cholorophyll. Tái tạo năng lượng cho tết bào, giúp ích cho sự phát triển đồng bộ và cải thiện sự trao đổi chất nhanh và hiệu quả, giúp tăng khả năng miễn dịch. Arginine Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân chia tế bào. Giúp ích cho cây tạo hormone tăng trưởng, cải thiện hệ miễn dịch, tạo ra tế bào mới và khỏe mạnh. 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Phenylalanine Tiền chất cấu tạonên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn Alanine Vai trò rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus Tryptophan Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Aspartic Chuyển hóa (tinh bột) thành năng lượng cho cây trồng. Tăng cường sức đề kháng và hạn chế lượng độc tố trong cây sau mỗi năm. Cystine Tăng sức đề kháng và giúp cải thiện quá trình tự phục hồi cây, tái tạo cho cây trồng già nua và kém phát triển. Hạn chế tác hại của vô cơ và thuốc bảo vệ thức vật, giúp tạo diệp lục tố. Ornithine Tạo hormone tăng trưởng, hỗ trợ quá trình tái tạo, tăng cường sức miễn dịch và hỗ trợ cây tăng đề kháng sâu bệnh và các lọai nấm. Tyrosine Tiền thân của dopamine và epinephrine. Kéo dài sự sống cho hạt phấn, giúp tạo hormone tăng trưởng. Leucine Làm lành và tái tạo vùng da tổn thương cho cây trồng. Lysine Giúp phát triển các cành và thân cây nhờ làm tăng lượng collagen. Histadine Vai trò quan trọng trong việc tái tạo các mô và tế bào mới cho cây trồng. c)Phân loại Trong tự nhiên có khoảng 150 loại acid amin khác nhau nhưng chỉ có 22 loại acid amin đóng vai trò quan trọng. E. coli, tảo và hầu hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả amino acid từ các tiền chất. Trong đó, cơ thể người có thể tự tổng hợp từ các nguyên liệu sẵn có (các acid béo, amiac, amid ) thành 14 loại acid amin (arginin, taurin, cystein, tyrosin ), còn 8 acid amin (leucin, isoleucin, lysine, phenylalanine, threonin, tryptophan, valin, methionon) rất cần thiết cho cơ thể để 10
  21. Đồ án tốt nghiệp cho quá trình sinh trưởng và phát triển nhưng cơ thể không tự tổng hợp được và phải thường xuyên đưa từ bên ngoài vào. Dựa vào cấu tạo của gốc R các amino acid cơ bản chia thành 4 nhóm (Hồ Chí Tuấn, 2009): - Các amino acid có gốc R không phân cực kị nước: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P). - Các amino acid có gốc R là nhân thơm: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W). - Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dương: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H). Tích điện âm: Aspartate (D), Glutamate (E). - Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q). 1.1.3.3. Alkaloid a) Định nghĩa Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, là amin nguồn gốc tự nhiên thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Các alkaloid thông thường là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng. Chúng được tìm thấy như là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, trừ một số trường hợp như cây canhkina hàm lường alkaloid đạt 6 – 10%, trong nhựa thuốc phiện (20 – 30%). Một dược liệu chứa 1 – 3% alkaloid đã được coi là có hàm lượng alkaloid khá cao. Trong một các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10%. Dưới tác động của nấm mốc, vi khuẩn, ánh sáng, khoai tây sản sinh nhiều loại alkaloid nhưng trong đó nguy hiểm nhất là solamin và chaconin. Nhiều alkaloid có thể được tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phương pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với một lượng nhỏ có alkaloid là chất độc gây chết 11
  22. Đồ án tốt nghiệp người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu. Hầu hết các alkaloid là dễ dàng hòa tan trong rượu, ít hòa tan trong nước nhưng muối của chúng thường tan. Alkaloids có ứng dụng dược lý như thuốc mê và các chất kích thích thần kinh trung ương (Madziga và ctv, 2010). Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do (alkaloid base), mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrate, tactat, malat, oxalate, acetate (đôi khi có ở dạng muối của acid vô cơ) tan trong dịch tế bào, ở một số cây alkaloid kết hợp với tannin hoặc kết hợp với acid đặc biệt của chính cây đó như acid meconic trong thuốc phiện, acid tropic trong một số cây họ cà, acid aconitic có trong cây ô đầu Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalcaloid như solasonin và solamacgin trong cây cà lá xẻ (Solanum laciniatum). Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998). b) Vai trò Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần kinh như morphin, codein, cocain, Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thư (Vũ Xuân Tạo, 2013). c) Phân loại Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa trên kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Alkaloid có phổ biến trong thực vật tồn tại lượng lớn trong hạt và rễ, ngày nay đã biết khoảng trên 6000 alkaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết lở thực vật bậc cao chiếm khoảng 15 – 20% tổng số các loài cây, tập trung ở một số họ: Apocynaceae 12
  23. Đồ án tốt nghiệp (họ Trúc đào) có gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid, Rutaceae (họ Cam) gần 30 alkaloid, Liliaceae (họ Hành) gần 250 alkaloid. Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm: - Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin. - Nhóm isoquinolin: morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin. - Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin. - Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin. - Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin, cevadin. - Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin. - Nhóm indol: Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin. Các ergolin: Các ancaloit từ cựa ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, acid lysergic. Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin , emetin. - Nhóm purin: Các xanthin như caffein, theobromin, theophyllin. nicotine reserpine saxitoxin strychnine caffeine coniine D-tubocurarine vinblastine Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của một số chất thuộc nhóm alkaloid 13
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.4. Glycoside Khái niệm Glycoside là những hợp chất sản phẩm ngưng tụ của đường, dạng phổ biến của nhiều hợp chất tự nhiên với cấu trúc gồm hai thành phần – phần đường và phần không đường. Phần đường của glycoside gọi là glycon, phần không đường gọi là aglycon hoặc genin. Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Phần đường trong glycoside chủ yếu là monosaccarid hoặc oligosaccarid, thường là glucose, rhamnose, galactose Phần aglycon của các glycosid có thể thuộc các nhóm chất hữu cơ khác nhau ví dụ ethanol, andehyde, acid, phenol, dẫn chất anthracen đôi khi có các aglycon có chứa nitơ, lưu huỳnh song thường chứa carbon, hydro, oxy. Glycoside thường là dạng rắn, chất kết tinh được, một số ở dạng vô định hình hoặc lỏng sánh. Hợp chất này thường không màu hoặc có một số có màu, thường tan trong nước, cồn, ít hoặc không tan trong dung môi hữu cơ (ether, chloroform). Độ tan của chúng phụ thuộc vào mạch đường dài hay ngắn và các nhóm ái nước trong phần aglycon. Phân loại: có 3 nhóm - Phần đường: có nhiều loại đường nhưng thường là glucose và đồng phân đường. - Liên kết giữa phần đường và không đường: C-glycosidic, O-glycosidic, N- glycosidic, S-glycosidic. - Nhóm hợp chất không đường : Saponin, Cardiac glycoside, Anthraquinone glycoside, Flavonoid glycoside, Phenolic glycoside, Cyanogenic glycoside, Alcoholic glycoside, Coumarin glycoside, Chromone glycoside, Steviol glycoside, Thioglycoside. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp Một số glycosise quan trọng: a) Saponin Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Hòa tan saponins vào nước  giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt. Hình 1.6: Sơ đồ phân loại saponin (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). Vai trò - Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng). - Một số saponin có tác dụng chống viêm. - Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt. b) Cardiac glycoside Cardiac glycoside là các glycoside thực vật, có ảnh hưởng kích thích tim và thường có độc tính cao. Chúng thường là những hợp chất kết tinh, không màu, có vị đắng,tan trong các dung môi phân cực và dễ bị thủy phân trong môi trường acid. 15
  26. Đồ án tốt nghiệp Vai trò - Ở nồng độ thấp có tác dụng điều hòa nhịp tim. - Ở nồng độ cao sẽ gây nôn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bóp của tim. c) Flavonoid Flavonoid được khám phá bởi nhà sinh hóa Albert Szent-Gyorgyi là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa. Bộ khung cơ bản kiểu C6C3C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng, tuy nhiên một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác lại không màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm. Tuỳ thuộc vào cấu tạo của mạch C trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau - Euflavonoid: Flavonoid, flavonol, flavanon, flavanol ( flavan-3-ol ), chalcon, antocyanin, anthocyanidin, auron, dihydrochalcon - Isoflavonoid: isolavon, isoflavanon, rotenoid. - Neoflavonoid: calophylloi 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7: Một số euflavonoid thường gặp Vai trò - Là chất bảo vệ, chống oxy hoá, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản 1 số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng ) - Tham gia lọc tia cực tím (UV), cộng sinh cố định đạm - Tạo ra sức hấp dẫn để dụ ong bướm đến thụ phấn góp phần cho cây tồn tại và phát triển. Trong việc tạo màu các flavonon, flavonol, chalcon cho màu vàng trong khi các autoxyanin cho màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm. 1.1.3.5. Steroid Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, có nhiểu trong thiên nhiên và tạo thành một nhóm hợp chất phân phối rộng khắp trong động thực vật. Đặc điểm cấu tạo có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của hệ vòng cyclopentanoperhyrophenantren, có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. Khi đun nóng với Se ở 3600C sẽ tạo hợp chất hidrocacbon diel có công thức C18H16. Những loại quan trọng trong steroid là sterol (cholesterol, stigmasterol), acid mật, kích thích tố nội tiết sinh dục (estron, progestron, hocmon sinh dục nam, nữ), 17
  28. Đồ án tốt nghiệp hocmon tuyến thượng thận, glucoside trợ tim (có gắn thêm đường trong cấu trúc), saponin (chất hoạt động bề mặt), alkaloid steroid. Vai trò - Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. - Thường dùng làm các thuốc kích thích, thuốc trợ tim. Hình 1.8: Một số chất thuộc nhóm steroid thường gặp 1.1.3.6. Tannin Tannin được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của đa sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thường gặp chủ yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm. Tannin tan trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt). Tannin bị oxi hóa sâu sắc và triệt để khi tác dụng với KMnO4 trong môi trường acid hoặc với dung dịch iot trong môi trường kiềm. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp Vai trò - Tannin sẽ tạo kết tủa tannat với protein và các chất keo tự nhiên khác. Sử dụng kết hợp với gelatin để làm trong dịch ép trái cây và rượu vang. - Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. - Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. - Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy, phòng chống lão hóa Phân loại Dựa vào phân loại của Poker và các kết quả nghiên cứu, nhà khoa học Freukebberg đã chia tannin thành 2 nhóm - Tannin thủy phân được hay tanin pyrogalli (Gallic acid). - Tannin ngưng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone). Tannin thủy Tannin Ellagic phân (Ellagi-Tannin) Tannin Pyrogallic Tannin (Gallo-Tannin) Tannin ngưng tụ Hình 1.9: Sơ đồ phân loại tannin 1.1.4. Công dụng 1.1.4.1. Theo y học cổ truyền Cây bồ công anh có vị cam khổ, tính hàn, quy vào các kinh can, tỳ, vị. Công năng: giải độc, tiêu viêm, thanh nhiệt, lương huyết, tán ứ, trợ tiêu hoá, lợi sữa. Có khả năng trị tỳ vị có hoả uất, sưng vú, tràng nhạc, đinh độc nhiệt ung nhọt, ghẻ lở, đầy bụng, khó tiêu. Kiêng kị dùng cho người có ung nhọt đã vỡ [2,7Error! Reference source not found.]. 1.1.4.2. Theo y học hiện đại Về độc tính, nước lá cây bồ công anh liều 200g/kg trọng lượng chuột không gây ngộ độc [10]. Flavonoid của bồ công anh đã được chứng minh có khả năng ức 19
  30. Đồ án tốt nghiệp chế men oxy hóa khử peroxidase và catalase máu chuột cống trắng [3], kìm hãm hoạt động của peroxydase và làm tăng lượng nhóm thiol tự do trong huyết thanh thỏ [19, 20]. Cao lá với liều lg dược liệu/20g chuột có tác dụng giảm đau và tác dụng này mạnh hơn là flavonoid toàn phần với liều 0,07g flavonoid /20g chuột (thử tác dụng giảm đau nội tạng - theo phương pháp của Kosteng) [10]. Trên thế giới các nhà khoa học sử dụng dịch chiết methanol và ethanol của cây bồ công anh để thử tác dụng dược lý, kết quả cho thấy cả 2 dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh tương đương nhau [22]. Ngoài ra thành phần serquiterpen lacton là lactucain c, lactucasid trong cây còn có tác dụng chống đái tháo đường [25]. 1.2. Tổng quan cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc thực vật 1.2.1. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 1.2.1.1. Khái niệm Hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật (Kháng khuẩn thực vật) là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hay kìm hãm, ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 1.2.1.2. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã được nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003). Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn. Gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. Ức chế chức năng của màng tế bào. Gồm có: colistin, polymycin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. 20
  31. Đồ án tốt nghiệp Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phân 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phân 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic: Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin). Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p aminobenzoic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nucleic. Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác được thể hiện ở hình 1.10. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.10: Vị trí các hợp chất trong tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn tác động lên vi khuẩn Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008). 1.2.2. Những hợp chất kháng khuẩn điển hình ở thực vật 1.2.2.1. Nhóm alkaloid a) Solamargine Solamargine là một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 22
  33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.11: Cấu trúc hóa học của phân tử Solamargine b) Berberine Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp., Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này 1.2.2.2. Hợp chất phenolic Nguyên nhân dẫn đến độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là do sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein. a) Quinones Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao. Quinone có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Vì lí do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật. Người ta nhận thấy rằng anthraquinone được lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với Pseudomonas pseudomalliae. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp A) B) C) Hình 1.12: Cấu trúc hóa học của phân tử: quinone (A); anthraquinone (B); hypericin (C) b) Flavonoid Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được. Các flavonoid càng ưa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật. Catechin là những hợp chất flavonoid được nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt trong trà xanh oolong. Qua những nghiên cứu, người ta nhận thấy trà xanh có hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella spp., và các vi sinh vật khác. Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng ức chế virus (RSV). Người ta đã tìm ra hoạt tính và phương thức hoạt động của quercetin, naringin, hesperetin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus type 1(HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phương thức khác nhau. Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chế sự lây nhiễm nhưng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV-1, quercetin là chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm các loại 24
  35. Đồ án tốt nghiệp bệnh do vi sinh vật gây ra. Người ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. c) Tannin Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị. Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các protein này có thể là enzymes, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptids Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông đưa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này, tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia cực tím (UV) ở mức ánh sáng kích hoạt bước sóng khoảng 320 đến 400 nm. Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng tannin có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngược quá trình phiên mã DNA của virus. 1.2.2.3. Nhóm terpenoids và tinh dầu Terpenenes và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Cơ chế tác động của tecpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes. Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế được HIV. a) Capsaicin Capsaicin là một hợp chất có trong ớt. Hoạt tính kháng khuẩn của capsaicin khá mạnh, nên chất này thường được dùng để bảo quản thực phẩm tránh những tác 25
  36. Đồ án tốt nghiệp động của vi sinh vật. Cơ chế kháng khuẩn của capsaicin được dự đoán là rất phức tạp chủ yếu là phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Hình 1.13: Cấu trúc hóa học của phân tử capsaicin Gần đây, Cichewicz và Thorpe cho rằng capsaicin có thể thúc đẩy sự tăng trưởng của Candida albicans nhưng nó thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn rất rõ ràng và tùy thuộc vào từng loại vi khuẩn mà mức độ ức chế sẽ khác nhau. Tính chất được quan tâm nhất của capsaicin là khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Helicobacter pylori (HP), là vi khuẩn chủ yếu gây viêm loét dạ dày. b) Monoterpene Monoterpene chủ yếu có mặt trong tinh dầu, có mùi thơm và thường được tách chiết bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. một vài đại diện tiêu biểu của monoterpene là menthol, geraniol và citral được sử dụng rất rộng rãi trong y học, mỹ phẩm và thực phẩm. Hình 1.14: Methol từ cây bạc hà (Nguyễn Tiến Thắng, 2012). c) Sesquiterpene 26
  37. Đồ án tốt nghiệp Sesquiterpene có cấu tạo từ pharnesylpyrophosphate thường có mặt trong tinh dầu và nhựa thực vật. Một số loại serquiterpene là hormone ảnh hưởng đến quá trình lột xác của sâu bọ, chất thơm và chất gay ngán ăn ở thực vật. Farnesol, abscisic acid và phaseic acid là một số hợp chất sesquiterpene thường thấy.(Nguyễn Tiến Thắng, 2012). 1.2.2.4. Nhóm lectins và polypeptides Cơ chế kháng khuẩn của lectins and polypeptides là do có sự hình thành của các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan nhận cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đó chúng còn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất. Thionins là peptide thường được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì, bao gồm 47 amino acid. Chúng có khả năng ức chế nấm men, vi khuẩn gram âm và gram dương. Fabatin là một loại peptide có trong đậu fava, có cấu trúc liên quan tới γ- thionins từ ngũ cốc và nó ức chế được E. coli, P. aeruginosa, và Enterococcus hirae nhưng lại không ức chế Candida hoặc Saccharomyces. 1.3. Đại cương một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 1.3.1. Nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy 1.3.1.1. Các vi khuẩn thuộc nhóm Escherichia Coli a) Đặc điểm Escherichia coli là trực khuẩn gram âm hình que thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi truờng nuôi cấy trực khuẩn dài 6 – 8 µm. Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (có thể một số chủng không di động), không sinh bào tử. Trực khuẩn E. coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 –7,4 ; phát triển được ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). 27
  38. Đồ án tốt nghiệp - Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli đã làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. - Trên môi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2 – 3 mm. Hình 1.15 : E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm (Bact, 2005) b) Khả năng gây bệnh E. coli là vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí sống ở đường tiêu hóa. Tuy là vi khuẩn cộng sinh với người nhưng E. coli có thể gây bệnh cơ hội. Khi cơ thể bị nhiễm E. coli với số lượng lớn kèm theo độc tố sẽ gây tiêu chảy, ngoài ra chúng có thể gây viêm đường tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp và nhiễm khuẩn huyết. Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật yếu phải dựa một số lượng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết được súc vật. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.2. Các vi khuẩn thuộc nhóm Samonella spp. Hình 1.16: Vi khuẩn Salmonella typhi (Nguyễn Thúy Hương, 2011). a) Đặc điểm Salmonella spp. là nhóm trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy nghi, có dạng hình que thẳng, nhỏ kích thước khoảng 2–3 × 0,4–0,6 μm, có tiêm mao di động, không sinh bào tử, S.enteritidis được Gaeter phân lập từ bò mắc bệnh năm 1888 (Nguyễn Thế Hùng và ctv, 1997). - Nuôi cấy trên môi trường lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trường đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có màng mỏng trên bề mặt môi trường (Nguyễn Như Thanh, 1997). - Nuôi cấy trên môi trường thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa. b) Khả năng gây bệnh Salmonella spp. gây bệnh cho người: bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhii gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạch Các bệnh khác (không phải thương hàn) thường là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S. typhimurium, S. enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thương ở ngoài đường tiêu hóa như viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm: trên gia cầm, vi khuẩn Salmonella gây 3 thể bệnh: bệnh thương hàn, phó thương hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc, S. choleraesuis chủng Kunzendorf và S. typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó thương hàn cho heo, S. enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thương hàn cho bò, bê, S. abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S. gallinarum – pullorum gây bệnh thương hàn cho gà (Nguyễn Như Thanh, 1997). 1.3.1.3. Các vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. Hình 1.17: Vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Thúy Hương, 2011) a) Đặc điểm Vibrio spp. thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trường bổ sung muối (NaCl) và không sinh H2S. b) Khả năng gây bệnh Vibrio spp. gây bệnh cho người: bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng đường ruột do V. cholerae gây ra, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng kèm theo mất nước, ói mửa và có thể dẫn đến tử vong trong một số trường hợp. Bệnh do một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã được công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tượng thủy sản (Austin & Austin 1993). Một số bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra như bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác, gây chết ở 30
  41. Đồ án tốt nghiệp ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đường ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 1.3.1.4. Các vi khuẩn thuộc nhóm Shigella spp. a) Đặc điểm Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đường ruột) là trực khuẩn gram âm, nhỏ, dài 1-3 µm, không sinh bào tử, không di động, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. - Trong môi trường lỏng, sau 18-24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục đều môi trường. - Trên môi trường đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính khoảng 1mm, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều. Hình 1.18 : Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) b) Khả năng gây bệnh Trực khuẩn Shigella spp. gây bệnh lỵ ở người biểu hiện với các triệu chứng: đau bụng quặn, tiêu chảy nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu, sốt cao, suy hô hấp và có thể dẫn đến tử vong. 1.3.1.5. Các vi khuẩn thuộc nhóm Listeria spp. a) Đặc điểm Listeria spp. là nhóm trực khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ 1- 450C, hình que mảnh có kích thước 0,5µm ×1-2 µm, không sinh bào tử, có khả năng di động, và phát triển ở pH rộng 4,3 - 9,6. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19 : vi khuẩn Listeria spp. b) Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở người với các triệu chứng rất nguy hiểm và có tỷ lệ tử vong cao. Người nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ như sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi người mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống như bị cảm cúm nhưng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp. tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng như viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 1.3.2. Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 1.3.2.1. Các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp. a) Đặc điểm Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc; có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1–5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm 32
  43. Đồ án tốt nghiệp mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 370C, phát triển được ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trường đặc, thường có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Hình 1.20 : vi khuẩn Pseudomonas b) Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho người - Trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thương hở, - Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng đường tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xương Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1 –0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần được hình thành những ổ mủ. 33
  44. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Các vi khuẩn thuộc nhóm Enterococcus spp. a) Đặc điểm Enterococcus spp. là nhóm cầu khuẩn Gram dương thuộc nhóm vi khuẩn lactic acid, có hình cầu hoặc oval kéo dài, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày. Enterococcus spp. phát triển tốt trong điều kiện kị khí, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển 30-350C, pH = 4,5-10, nồng độ NaCl cao. Hình 1. 21: Vi khuẩn Enterococcus b) Khả năng gây bệnh Một số bệnh do Enterococcus spp. gây ra: viêm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng vết thương, các bệnh nhiễm trùng khác ảnh hưởng đến van tim, viêm nội tâm mạc và bộ não với các triệu chứng thường gặp như sốt, mẩn đỏ da, tiêu chảy, nôn mửa. 1.3.2.3. Các vi khuẩn thuộc nhóm Staphylococcus spp. a) Đặc điểm Tụ cầu đã được R. Koch mô tả từ năm 1878. Sau đó, Pasteur (1880) và Ogston (1881) gọi vi khuẩn này là tụ cầu khuẩn và xếp vào loài Staphylococcus. Tụ cầu khuẩn có dạng hình cầu, đường kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả năng sinh nội độc 34
  45. Đồ án tốt nghiệp tố. Chúng phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). - Trong môi trường lỏng , sau 5– 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 24 giờ môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều. - Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh, khuẩn lạc dạng S, có sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm. - Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan huyết và có sắc tố vàng. Hình 1.22 : vi khuẩn Staphylococus aureus b) Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thường gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thường sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Tuy nhiên, trong một số điều kiện nhất định, loại không gây bệnh có thể trở nên gây bệnh. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh cho người - Các bệnh ngoài da: gây nhiều bệnh nhiễm trùng như bệnh mụn nhọt, chốc lở, viêm da, đầu đinh, đinh râu - Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người có sức đề kháng yếu hoặc trẻ em. Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở thành mãn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng ngoài tim, viêm màng não, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu. 35
  46. Đồ án tốt nghiệp - Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh xảy ra nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mữa dữ dội. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 1.4. Hoạt tính chống oxi hóa 1.4.1. Khái niệm về gốc tự do Trong tự nhiên oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống. Ngày nay các nghiên cứu khoa học dần chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species). Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như hydroxyl, hydroperoxyl, peroxyl, alkoxyl, lipoperoxyde, H2O2 . Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA, gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền. Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine và ngay cả oxy. 1.4.2. Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu được kiểm soát, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị 36
  47. Đồ án tốt nghiệp giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường hệ miễn dịch. 1.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể Ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT) để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis). Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo 37
  48. Đồ án tốt nghiệp điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. 1.4.4. Chất chống oxy hóa trong thực vật Chất kháng oxy hóa tự nhiên có trong ngũ cốc, rau, quả. Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc thực vật như vitamin E, vitamin C, carotenoid, acid phenolic, phytate và estrogen đã được chứng minh làm giảm nguy cơ mắc các bệnh liên quan đến quá trình lão hóa như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh Alzheimer (Moskovitz and Yim, 2002). Một nghiên cứu khác cũng cho thấy chất kháng oxy hóa có trong trái cây, trà, rau quả và rượu vang làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính (Prakash et al., 2000). Ngày nay, nhu cầu sử dụng các loại thuốc chống lão hóa ngày càng tăng cao nhưng các loại thuốc làm đảo ngược đồng hồ sinh học này chưa có những bằng chứng đáng tin cậy về tác dụng của nó cũng như tác dụng phụ có thể có. Các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn trong cơ thể như các chất carotenoid, flavonoid, phenol, vitamin C, vitamin E, đang trở thành mối quan tâm của nền khoa học hiện đại (Đỗ Thị Túy Phượng, 2007). 38
  49. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 02/2017 đến 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu lá bồ công anh được thu tại hộ nông dân xã Cộng Hòa, huyện Hưng Hà , tỉnh Thái Bình 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Escherichia coli: E. coli, ETEC, E.coli 0208, E.coli O157:H7. - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V.cholerae. - Nhóm vi khuẩn Listeria: L. monocytogenes, L. innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.2.3. Hóa chất, dung môi a) Hóa chất: - Môi trường TSB (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (HiMedia - Ấn Độ). - NaCl tinh khiết 39
  50. Đồ án tốt nghiệp - Một số loại thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner, Ninhydrin, Natri nitro prusside. - DPPH (Đức) b) Dung môi: - Methanol - Ethanol 50%, 70%, 90% (Việt Nam) - DMSO (Trung Quốc) 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ a) Dụng cụ - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ (d = 6 mm) - Ống nghiệm lớn, nhỏ. - Thước đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không thấm nước - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Eppendoff 2 ml - Micropipette 100 µL, 1000 µL, 5000 - Chai nắp xanh 250 ml, 500 ml, µL 1000 ml - Các loại dụng cụ khác như: bao chịu - Que cấy trang nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, - Đèn cồn dao, thun, b) Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo UV – VIS (Hach) -Tủ ấm 300C, 370C (Memmert - Cân phân tích (Orbital Germany) mermany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy nước cất (Branstead USA) - Máy cô cách thủy - Thiết bị cô quay chân không 40
  51. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật được thu một lượng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá và cành mang đi rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến khi khối lượng không đổi. Mẫu khô được tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lượng bột mẫu thu được sẽ được đóng gói trong túi nhựa và bảo quản ở nhiệt độ 40C để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2. Phương pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật được tách chiết trong dung môi ethanol 70 % bằng phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ phòng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung môi của dịch chiết. Nguyên tắc: Mẫu thực vật được ngấm kiệt trong lượng lớn dung môi (w/v) trong khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi, đây là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng gồm 3 giai đoạn: thâm nhập dung môi vào dược liệu, hoà tan các chất trong mẫu, khuếch tán các chất tan (khuếch tán nội bào, khuếch tán phân tử, khuếch tán đối lưu). Tiến hành: Ngâm một lượng bột mẫu vào dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu được ngâm trong thời gian xác định; thỉnh thoảng có khuấy trộn hoặc lắc sau đó đem đi lọc hoặc ly tâm, thu nhận dịch chiết. Phần dịch chiết được cô đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cô quay chân không (đối với dung môi methanol) và cô cách thủy (đối với dung môi ethanol, nước). Tiếp tục cho thêm lượng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu. Sau khi thu hồi mẫu cao được bảo quản ở nhiệt độ -40C. 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, dễ thực hiện, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (từ -30C 41
  52. Đồ án tốt nghiệp đến -50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh vật thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ ở nhiệt độ 40C. Sau 1 đến 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đó đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ dao động từ 48 – 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật được bảo quản trong tủ lạnh ở - 40C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Mục đích: Hoạt hoá các chủng vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì trong quá trình bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài chúng có thể bị suy yếu. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật, đảm 42
  53. Đồ án tốt nghiệp bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (cfu/ml). 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch dựa trên phương pháp của Anonymous (1996) và Hadacek, ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm . Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng 43
  54. Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đường kính vòng ức chế (mm). Tiến hành: - Các chủng vi khuẩn được hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trường lỏng TSB, lắc qua đêm. Cấy trang 100 µL dịch khuẩn (mật độ tế bào tương đương 106 cfu/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường TSA và tiến hành đục giếng với đường kính 6 mm. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. - Đối chứng là dung dịch kháng sinh Ciprofloxacin. 2.3.7. Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết. 2.3.7.1. Phương pháp DPPH Nguyên tắc: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu ánh sáng của các gốc tự do tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [6]. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517nm (Pisoschi and Negulescu, 2012). Hình 2.1: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 44
  55. Đồ án tốt nghiệp chất kháng oxy hóa DPPH DPPHH Hình 2.2: Phản ứng trung hòa gốc DPPH Khả năng kháng oxy hóa của một chất được biểu hiện bằng giá trị EC50, nồng độ chất kháng oxy hóa để có thể ức chế 50% gốc tự do DPPH. Giá trị EC50 càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh. EC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. EC50 (Effective Concentration of 50%) được định nghĩa là nồng độ (µg/mL) của chất kháng oxy hoá mà tại đó nó có thể loại bỏ 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị EC50 sẽ càng thấp. Giá trị EC50 được xác định bằng phương pháp lập phương trình đường chuẩn y = ax + b. Với các giá trị x bao gồm nhiều nồng độ khác nhau. Khi phần trăm (%) ức chế tuyến tính với nồng độ mẫu, cho y = 50% và thay vào phương trình đã có, từ đó được giá trị x chính là EC50. Tiến hành Chuẩn bị mẫu chiết ở các nồng độ khác nhau trong DMSO. Mẫu đối chứng được sử dụng là axit ascorbic. Sau đó, 1,0 ml DPPH với nồng độ thích hợp được pha trong methanol vào 0,2 ml dung dịch của mẫu chiết và mẫu đối chứng. Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong buồng tối khoảng 30 phút. Sự thay đổi màu sắc từ màu tím đậm sang vàng sau đó được đo ở 517 nm [18]. 45
  56. Đồ án tốt nghiệp Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm ức chế Q (%) được tính theo công thức sau Q% = Với ODtrắng: giá trị mật độ quang của mẫu trắng (control) ODmẫu: giá trị mật độ quang của mẫu thử (sample). 2.3.8. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Các nhóm hợp chất hữu cơ có trong mẫu cao chiết được định tính cơ bản bằng phương pháp tiến hành một số thử nghiệm hóa học của chúng với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng (N.Raaman, 2006). Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hóa học theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lương Văn Tiến và ctv, 2015). Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.3.8.1. Định tính thành phần carbohydrate - Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 5-6 giọt thuốc thử Molisch. Sau đó, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc trên thành ống nghiệm và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành vòng màu đỏ - tím ở lớp ngăn cách cho thấy có sự hiện diện của carbohydrates. - Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B. Ống nghiệm được đun cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Quan sát phần đáy ống nghiệm nếu xuất hiện kết tủa màu đỏ của Cu2O chứng tỏ có sự hiện diện của carbohydrate. - Thử nghiệm Barfoed: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm, tiến hành thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Sau đó, đun cách thủy ống nghiệm chứa hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và quan sát kết quả. Thử nghiệm Barfoed dương tính (+) khi đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu đỏ gạch. 46
  57. Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.2. Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer: Cho vài giọt thuốc thử Meyer vào ống nghiệm có chứa 2 ml dịch mẫu, quan sát hiện tượng và đọc kết quả. Thử nghiệm Mayer dương tính (+) khi kết tủa màu trắng hoặc trắng đục được tạo thành. - Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch lọc mẫu cho vào ống nghiệm sau đó thêm 1 hoặc 2 ml thuốc thử Dragendorff và quan sát hiện tượng. Nếu hình thành kết tủa màu vàng cam chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm alkaloid trong mẫu cao, thử nghiệm dương tính (+). - Thử nghiệm Hager: Thêm 2 ml thuốc thử Hager vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu. Nếu kết tủa màu vàng được tạo thành dưới đáy ống nghiệm thì cho biết thử nghiệm Hager dương tính (+). - Thử nghiệm Wagner: Tiến hành hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2ml thuốc thử Wagner và đọc kết quả.Thử nghiệm Wagner dương tính (+) khi phần đáy ống nghiệm có sự hình thành kết tủa màu nâu đỏ. 2.3.8.3. Định tính thành phần saponin - Thử nghiệm Foam (xà phòng): Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và lắc mạnh. Sau 10 - 15 phút, nếu lớp bọt hình thành sau khi lắc vẫn còn, cho thấy sự hiện diện của saponin, thử nghiệm Foam (xà phòng) dương tính (+). 2.3.8.4. Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal: 2 ml dịch cao mẫu được cho vào ống nghiệm, sau đó thêm lần lượt 1 ml pyridine và 1 ml Natri nitro prusside, và tiếp tục nhỏ 5 – 6 giọt NaOH 10% vào ống nghiệm, sau đó quan sát và đọc kết quả. Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng đến đỏ đậm thì chứng tỏ có sự hiện diện của cardiac glycoside, thử nghiệm Legal dương tính (+). - Thử nghiệm Keller Killiani: Thêm 2 ml acid acetic glacial vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu và tiếp tục thêm 1 ml dung dịch FeCl3. Sau đó cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm trên và quan sát hiện tượng. Thử nghiệm Keller Killiani dương tính (+) khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp 2.3.8.5. Định tính thành phần anthraquinone glycoside - Thử nghiệm Bontrager: Hút 2 ml dịch cao mẫu cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml H2SO4 loãng và đun sôi ống nghiệm, tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc. Tiếp tục thêm vào dung dịch trên 3 ml benzene và lắc đều rồi để yên.Tiến hành tách lấy lớp benzene và thêm vào 2 ml ammonia và quan sát. Nếu màu trong lớp ammonia chuyển sang màu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của Anthraquinone glycoside, thử nghiệm Bontrager dương tính (+). 2.3.8.6. Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng. Sau đó, tiếp tục thêm vào vài giọt HCl loãng và quan sát. Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu vàng khi bổ sung NaOH và mất màu khi cho HCl chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. Nên thực hiện mẫu cao với đối chứng nước cất để so sánh. - Thử nghiệm Ferric chloride: Thêm 2 ml dịch cao mẫu và vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% cho vào ống nghiệm. Nếu trong ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím thì chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. 2.3.8.7. Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Chì acetate: Cho 1,5 ml Chì acetate 10% vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch mẫu và quan sát hiện tượng. Nếu có xuất hiện kết tủa trắng ở phần đáy ống nghiệm thì chứng tỏ sự hiện diện của hợp chất phenolic. - Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm một vài giọt gelatin 1% và đọc kết quả. Thử nghiệm Gelatin dương tính (+) nếu trong ống nghiệm có xuất hiện kết tủa trắng. 2.3.8.8. Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt ferric chloride 10%. Quan sát hiện tượng nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu xanh chứng tỏ có sự hiện diện của tannin. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp - Thử nghiệm Chì acetate: 2 ml dịch cao được cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm lần lượt 2 ml NaCl 10% và 4 giọt chì acetate 10%. Quan sát hiện tượng nếu trong ống có xuất hiện kết tủa màu vàng thì chứng tỏ có sự hiện diện của tannin. 2.3.8.9. Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski: 2 ml dịch mẫu được cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml chloroform. Sau đó, nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc,và lắc mạnh ống nghiệm rồi để yên cho tách thành 2 lớp. Tiến hành đọc kết quả ở mặt phân cách. Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của sterol. Nếu hình thành màu vàng ở lớp dưới cho thấy sự hiện diện của triterpenoid. - Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml mẫu cho vào ống nghiệm và thêm vào 2 ml acetic anhydride. Ống nghiệm được đem đi đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó, nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm và quan sát, đọc kết quả. Nếu trong ống xuất hiện màu đỏ ở mặt phân cách cho thấy sự hiện diện của sterol. Nếu hình thành vòng màu nâu đỏ đậm cho thấy sự hiện diện của triterpenoid. 2.3.8.10. Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhydrin: Thêm vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu và một vài giọt thuốc thử Ninhydrin. Đun sôi cách thủy ống nghiệm trong 5 phút và đọc kết quả. Thử nghiệm dương tính khi dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm SAS version 9.4 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phương sai One- way ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê. 49
  60. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của dung môi EtOH 70% đến hoạt tính của cây Lactuca indica L được trình bày ở hình 2.3. Mẫu lá bồ công anh Ngâm trong dung môi EtOH 70% Tách chiết và thu hồi cao Cao chiết bồ công anh (LiEE) Khảo sát hoạt tính Khảo sát khả năng Định tính một số kháng khuẩn kháng oxy hóa thành phần hóa học Định lượng một số thành phần hóa học Đánh giá kết quả Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 50
  61. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh. Mẫu lá bồ công anh Sấy khô, xay nhuyễn Ngâm với ethanol 70% (1:20) (w/v) Lọc Dịch lọc Bã Cô cách thủy ở nhiệt độ 700C Cao chiết Đánh giá hiệu suất thu hồi Bảo quản Hình 2.4: Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây Lactuca indica L Thuyết minh quy trình - Bồ công anh sau khi được thu nhận tiến hành xử lý mẫu. Trước tiên lá được rửa sạch và đem đi sấy khô ở nhiệt độ 400C rồi tiến hành xay nhuyễn. 51
  62. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5: Mẫu lá bồ công anh Ngâm mẫu bột lá bồ công anh trong dung môi EtOH 70% theo tỷ lệ 1:20 (w/v) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi khoảng 24 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết mất màu. Sau đó, dịch chiết EtOH 70% của mẫu lá bồ công anh được cô cách thủy ở nhiệt độ 700C để phần dung môi bay hơi, thu cao chiết (LiEE) có dạng bột màu nâu đen. Xác định hiệu suất thu hồi cao. Lượng cao của các loại dung môi khác nhau sau khi được cô, đem đi cân để xác định hiệu suất thu hồi cao so với khối lượng bột mẫu ban đầu: Hàm lượng cao thuốc thu được tính như sau: X = (%) Trong đó: m1: Khối lượng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g) m0: Khối lượng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: Khối lượng mẫu bột dùng để ngâm với dung môi (g) 52
  63. Đồ án tốt nghiệp - Sau khi xác định hiệu suất thu hồi cao chiết LiEE được bảo quản ở nhiệt độ - 40C trong tủ lạnh để chuẩn bị cho các thí nghiệm khác. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE. Mẫu LiEE thực hiện đánh giá khả năng kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Quy trình thí nghiệm Hình 2.6: Cách thức đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE ở các nồng độ khác nhau 53
  64. Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong môi trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nước muối sinh lý vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn, các chủng Vibrio spp. môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl. Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng. Dùng ống trụ kim loại đã khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục các giếng trên bề mặt đĩa thạch. LiEE được pha bằng DMSO 1% theo nồng độ 200 mg/ml. Sau đó pha loãng mẫu cao theo dãy nồng độ 100 – 50 mg/ml. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao ở các nồng độ khảo sát. Các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 – 24 giờ và đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn. Các công đoạn trên đều thực hiện trong điều kiện vô trùng với ngọn lửa đèn cồn. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần trên từng chủng vi sinh vật chỉ thị. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng oxy của LiEE Thí nghiệm khảo sát khả năng oxy hóa của LiEE được trình bày ở hình 2.7. Mẫu LiEE được pha trong dung dịch DMSO đậm đặc theo nồng độ 100 mg/ml. Sau đó tiếp tục pha loãng mẫu theo dãy nồng độ 1000 μg/ml; 800 μg/ml; 600 μg/ml; 400 μg/ml; 200 μg/ml; 100 μg/ml. Dung dịch DPPH hoà tan trong dung môi methanol tuyệt đối ở nồng độ 6 mM. Hút 100 μl dung dịch DPPH vào 2800 μl methanol tuyệt đối, sau đó bổ sung 100 μl dịch mẫu. Mẫu chứng dương (ascorbic acid) được pha trong DMSO đậm đặc theo nồng độ ban đầu 3 mg/ml. Hút 100 μl dung dịch DPPH nồng độ 6 mM vào 2800 μl methanol, sau đó bổ sung 100 μl dung dịch ascorbic acid. Mẫu trắng: Hút 100 μl DPPH vào 2900 μl methanol. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Cả ba mẫu dung dịch được tiến hành ủ dung dịch trong điều kiện tối ở 370C trong 30 phút, sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Mẫu LiEE Mẫu chứng dương Mẫu trắng Khảo sát ở các nồng độ từ 1000 g/ml đến 100 μg/ml. 100 μL DPPH + 2800 μL methanol + 100 μL DPPH + 2900 μL 100 μL mẫu methanol Ủ ở điều kiện tối trong 30 phút Đo OD517nm Tính toán kết quả Hình 2.7: Quy trình đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 55
  66. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của LiEE Quy trình thí nghiệm Cao chiết Hòa tan trong dung dịch Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10 % DMSO 1 % Lọc Lọc Dịch trong Dịch trong Phân tích thành Phân tích thành phần hóa học phần hóa học Alkaloid Saponin Cardiac Phenolic Steroid glycoside Carbohydrate Athraquinone Flavonoid Tannin Amino glycoside acid Hình 2.8: Quy trình định tính một số thành phần hóa học của LiEE Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu: Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao chiết được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao được hòa trong dung dịch DMSO 1% cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, lọc dung dịch cao qua giấy lọc và thu dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. - Thành phần carbohydate được định tính bằng các thử nghiệm phản ứng với thuốc thử đặc trưng: Molisch, Fehling, và Barfoed. - Thành phần alkaloids được định tính bằng các thử nghiệm phản ứng thuốc thử đặc trưng: Mayer, Dragendorff, Hager, và Wagner. - Thành phần saponin được định tính bằng thử nghiệm xà phòng (thử nghiệm Foam). - Thành phần cardiac glycoside được định tính bằng thử nghiệm Legal và thử nghiệm Keller Killiani. - Thành phần anthraquinone glycoside được định tính bằng thử nghiệm phản ứng với thuốc thử Bontrager. - Thành phần flavonoids được định tính bằng các thử nghiệm như: thử nghiệm Alkaline, thử nghiệm shinoda, và thử nghiệm Ferric chloride phản ứng với một số loại hóa chất đặc trưng. - Hợp chất phenolics được định tính bằng các thử nghiệm phản ứng với chì acetate và gelatin. - Thành phần tannins được định tính bằng thử nghiệm phản ứng với ferric chloride và chì acetate. - Thành phần steroids được định tính bằng thử nghiệm Salkowski và thử nghiệm Libermann Burchard với một số hóa chất đặc trưng. - Thành phần amino acid được định tính bằng các thử nghiệm phản ứng với thuốc thử Ninhydrin. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi cao chiết EtOH 70% từ Bồ công anh (LiEE) Mẫu lá bồ công anh sau khi thu về được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 400C đến khối lượng không đổi rồi tiến hành chiết cao trong dung môi ethanol 70% bằng phương pháp ngấm kiệt. Hiệu suất thu hồi cao chiết ethanol 70% từ lá bồ công anh là 13,62 0,62 (%). Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn lựa ethanol 70% để tách chiết cao từ lá bồ công anh vì cồn là một dung môi phân cực nên có thể hoà tan rất nhiều các hợp chất trong thực vật bao gồm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Đồng thời, việc sử dụng cồn 70% trong việc tách chiết các hợp chất từ thực vật cũng được rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam sử dụng. Việc sử dụng cồn 70% có một số thuận lợi như chi phí tương đối thấp, an toàn hơn đối với người sử dụng và khả năng bay hơi nhanh nên quá trình cô mẫu cao cũng gặp nhiều thuận lợi, đồng thời phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm. Hình 3.1: Mẫu cao chiết ethanol từ Bồ Công Anh (LiEE) Tuy nhiên, để có thể đánh giá chính xác hiệu quả tách chiết cao của cồn 70% từ lá bồ công anh thì hoạt tính sinh học của cao chiết cần phải được xác định. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hoá của LiEE. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với vi khuẩn chỉ thị Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với 20 chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Kết quả kháng khuẩn của cao chiết được trình bày như sau: 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng nhóm E.coli của LiEE Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết trên nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm 4 chủng: E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli và ETEC. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của LiEE đối với nhóm E.coli được thể hiện trên Hình 3.2. 35 a 30 ) m 25 m ( ế h c c 20 ứ 50 mg/ml g n 100 mg/ml ò v a 200 mg/ml h 15 n a a í b Ciprofloxacin k b g c b b b n b ờ 10 ư Đ 5 c 0 E.coli E.coli O157: H7 E.coli 0208 ETEC Hình 3.2: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với nhóm E.coli. Dựa vào kết quả hình 3.2 nhận thấy rằng LiEE có khả năng đối kháng với 4/4 chủng vi khuẩn E.coli khảo sát với mức độ đối kháng phụ thuộc vào nồng độ LiEE khảo sát. Ở nồng độ 50 mg/ml, LiEE không thể hiện hoạt tính ức chế với 4/4 chủng, nồng độ 100 mg/ml, LiEE ức chế ¾ chủng, trong khi đó ở nồng độ khảo sát là 200 59
  70. Đồ án tốt nghiệp mg/ml, LiEE kháng với 4/4 chủng. Điều này chứng tỏ rằng nồng độ LiEE sử dụng có ảnh hưởng đến khả năng ức chế vi khuẩn E.coli. Khi so sánh kết quả kháng khuẩn của LiEE ở các nồng độ với ciprofloxacin (500 g/ml) về phương diện thống kê cho thấy rằng, mức độ ức chế của LiEE ở nồng độ 200 mg/ml đối với E.coli, E.coli 0208 và ETEC thấp hơn ciprofloxacin có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tuy nhiên, LiEE ở nồng độ 200 mg/ml lại có mức độ ức chế cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin (500 g/ml). Trong một nghiên cứu của Okwulehie và ctv (2013) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Laportia ovalifolia, Spondias mombin, Ficus exasperata và Ageratum conyzoides đối với vi khuẩn E.coli, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng cao chiết từ EtOH ở nồng độ 100 mg/ml của L. ovalifolia, A. conyzoides không có hoạt tính ức chế E.coli, trong khi đó, F. exasperata và S. mombin có đường kính vòng ức chế lần lượt là 10,0 và 11,4 mm (đường kính lỗ là 6 mm); còn trong thí nghiệm này, đường kính vòng ức chế của LiEE từ EtOH 70% đối với vi khuẩn E.coli là 10,5 mm, điều này cho thấy của cao chiết ethanol từ lá bồ công anh có hiệu quả kháng E.coli khá tốt so với một số loại thảo dược khác. 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Salmonella của LiEE Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của LiEE. ở nồng độ lần lượt là 50 mg/ml; 100 mg/ml và 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Salmonella spp. gồm các chủng: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, và S. dublin. Kết quả đường kính vòng ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Salmonella spp. được thể hiện ở Hình 3.3. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp 20 a 18 16 ) m m 14 ( b a a ế h c a 12 c b ứ 50 mg/ml g n 10 100 mg/ml ò v 200 mg/ml h n í 8 Ciprofloxacin k g n ờ 6 ư Đ 4 2 0 S.typhii S.typhimurium S.dublin S.enteritidis Hình 3.3: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Salmonella. Kết quả đánh giá hoạt tính đối kháng nhóm Salmonella của LiEE ở các nồng độ khác nhau được thể hiện ở Hình 33. Kết quả thí nghiệm này cho thấy rằng LiEE không có hiệu quả kháng Salmonella khi khảo sát ở nồng độ 50 mg/ml và 100 mg/ml. Trong khi đó ở nồng độ 200 mg/ml, LiEE chỉ kháng được 2/4 chủng là S. typhii và S. enteritidis. Kết quả này cho thấy rằng phổ kháng của LiEE đối với nhóm Salmonella không rộng. Ở nồng độ 200 mg/ml, mức độ kháng của LiEE đối với S. typhii khá tốt và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin (500 g/ml) nhưng mức độ kháng đối với S. enteritidis lại thấp hơn. 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Shigella của LiEE Đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE ở nồng độ lần lượt là 50 mg/ml; 100 mg/ml và 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Shigella spp. gồm các 61
  72. Đồ án tốt nghiệp chủng: S. boydii, S. flexneri và S. sonnei. Kết quả đường kính vòng ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Shigella spp. được thể hiện ở Hình 3.4. 35 a 30 ) m 25 m ( ế h c c 20 ứ 50 mg/ml g n a 100 mg/ml ò v 200 mg/ml h 15 n b í Ciprofloxacin k a g b n b c ờ c c 10 ư Đ 5 c c d 0 Shi.boydii Shi.flexneri Shi.sonnei Hình 3.4: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Shigella. Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn Shigella spp. của LiEE được trình bày ở Hình 3.4 Kết quả này cho thấy rằng LiEE thể hiện được hoạt tính ức chế Shigella ở các nồng độ khảo sát khác nhau. Ở nồng độ 50 mg/ml, LiEE chỉ kháng được 1/3 chủng khảo sát, trong khi đó nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml, LiEE ức chế được 3/3 chủng khảo sát với đường kính vòng ức chế từ 9,67 mm đến 14,5 mm. Khi so sánh kết quả kháng khuẩn của LiEE với ciprofloxacin ở nồng độ 500 g/ml đối với Shigella, nhận thấy rằng LiEE ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính ức chế S. flexneri cao hơn ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) nhưng ở nồng độ 100 mg/ml lại thấp hơn ciprofloxacin. Đối với S. sonnei, 62
  73. Đồ án tốt nghiệp chủng này khá mẫn cảm với ciprofloxacin (500 g/ml) nên chúng bị ức chế khá mạnh, do đó mặc dù LiEE thể hiện hoạt tính ức chế khá tốt ở cả 3 nồng độ khảo sát nhưng vẫn thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin (500 g/ml). Trong nhóm vi khuẩn Shigella khảo sát, S. boydii kháng lại kháng sinh ciprofloxacin ở nồng độ 500 g/ml, nhưng LiEE lại thể hiện được tính kháng đối với chủng này ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml. Do đó, LiEE có thể xem là một ứng cử viên thay thế cho ciprofloxacin trong việc phòng trị các bệnh do S. boydii gây ra. 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng nhóm Vibrio spp. của LiEE Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn của LiEE ở nồng độ lần lượt là 50 mg/ml; 100 mg/ml và 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp. gồm các chủng V. parahaemolyticus, V. cholerae, V. harveyi và V. alginolyticus thông qua đường kính vòng ức chế được thể hiện ở Hình 3.5. 20 a 18 a 16 a ) m a b m 14 ( b ế b h c 12 b c c ứ 50 mg/ml g n 10 100 mg/ml ò v 200 mg/ml h n í 8 Ciprofloxacin k g n ờ 6 ư Đ 4 2 0 V.parahaemolyticus V.cholerae V.harveyi V.alginolyticus Hình 3.5: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với Vibrio. 63
  74. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả đánh giá hoạt tính ức chế Vibrio spp. của LiEE ở các nồng độ khảo sát được trình bày ở Hình 3.5 nhận thấy rằng, LiEE thể hiện hoạt tính ức chế đối với nhóm Vibrio spp. khảo sát ngoại trừ chủng V. cholerae ở nồng độ khảo sát là 100 mg/ml và 200 mg/ml. Đối với chủng V. parahaemolyticus, ở nồng độ 100 mg/ml, LiEE ức chế với đường kính vòng ức chế là 11,33 mm ngang bằng với hoạt tính ức chế của ciprofloxacin (500 g/ml) nhưng lại thấp hơn nồng độ 200 mg/ml có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Đối với chủng V. harveyi, nồng độ LiEE 100 mg/ml và 200 mg/ml đều thể hiện hoạt tính ức chế nhưng thấp hơn một cách có ý nghĩa thống kê so với ciprofloxacin (500 g/ml). Trong khi đó, đối với chủng V. alginolyticus, LiEE chỉ ức chế ở nồng độ 200 mg/ml, còn nồng độ 100 mg/ml hoàn toàn không thể hiện hoạt tính ức chế, nhưng hoạt tính ức chế của nồng độ 200 mg/ml vẫn thấp hơn về phương diện thống kê so với ciprofloxacin (500 g/ml). Theo kết quả nghiên cứu của Wei (2010) trên cả 4 chủng vi khuẩn Vibrio spp. cao chiết của Colocasia esculenta ở nồng độ 250 mg/ml có đường kính vòng kháng khuẩn từ 9,00 mm đến 11,00 mm, thấp hơn LiEE ở nồng độ 200 mg/ml với đường kính vòng ức chế từ 10,00 mm đến 13,67 mm (đường kính giếng là như nhau). Điều này chứng tỏ rằng cao chiết ethanol từ Bồ Công anh có hoạt tính kháng Vibrio spp. khá tốt. 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn khác của LiEE Nhóm vi khuẩn khác được sử dụng trong nghiên cứu này gồm có 5 chủng là L. monocytogenes, L. innocua, S. aureus, P. aeruginosa và E. feacalis. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế của LiEE ở các nồng độ khảo sát đối với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị được thể hiện ở hình 3.6. 64
  75. Đồ án tốt nghiệp 18 a 16 a 14 ) m a a a b b m ( a 12 ế b b a h c b b c c ứ 50 mg/ml 10 g n 100 mg/ml ò v 8 200 mg/ml h n í Ciprofloxacin k g n 6 ờ ư Đ 4 2 0 L.mono L.innocua E.feacalis P. aeuginosa S.aureus Hình 3.6: Đường kính vòng ức chế của LiEE ở các nồng độ khác nhau đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị khác. Kết quả đánh giá khả năng ức chế 5 chủng vi khuẩn chỉ thị của LiEE ở các nồng độ được thể hiện ở Hình 3.6 cho thấy rằng khả năng ức chế của LiEE vẫn phụ thuộc vào nồng độ khảo sát. LiEE ở nồng độ 50 mg/ml hoàn toàn không thể hiện hoạt tính ức chế đối với 5 chủng vi khuẩn khảo sát, trong khi đó LiEE ở nồng độ 100 mg/ml ức chế 4/5 chủng vi khuẩn khảo sát, và nồng độ 200 mg/ml ức chế 5/5 chủng vi khuẩn khảo sát với đường kính vòng kháng từ 9,50 mm đến 16,17 mm. Khi so sánh kết quả ức chế vi khuẩn chỉ thị của LiEE ở nồng độ 200 mg/ml so với ciprofloxacin (500 g/ml) cho thấy rằng, LiEE ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính ức chế L. monocytogenes, L. innocua, P. aeruginosa thấp hơn ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) nhưng lại thể hoạt tính ức chế S. aureus và E. feacalis cao hơn ciprofloxacin có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Theo kết quả nghiên của Bayoub (2010) và Emanuel (2011), 2 chủng vi khuẩn L. monocytogenes và L. innocua đều bị ức chế bởi cao chiết ethanol từ Matricaria chamomilla và A-ti- sô (Cynara scolymus) với đường kính vòng ức chế là 15 mm. Trong kết quả thí nghiệm này, cao chiết EtOH70% từ Bồ Công anh có khả năng ức 65
  76. Đồ án tốt nghiệp chế được sự phát triển của L. innocua và L. monocytogenes - 2 chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm ở phụ nữ - với đường kính vòng ức chế lớn nhất lần lượt là 10,67 mm (L. innocua) và 10,50 mm (L. monocytogenes), tuy hoạt tính ức chế của LiEE không cao nhưng vẫn thể hiện tiềm năng rất lớn trong việc sử dụng cao chiết bồ công anh trong điều trị bệnh do Listeria. 3.2.6. Tổng hợp kết quả kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ Bồ Công anh đối với vi khuẩn chỉ thị Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Bồ Công anh từ các dung môi ethanol ở nồng độ 50 mg/ml; 100 mg/ml; 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh, kết quả tổng hợp đường kính vòng ức chế của LiEE được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) của LiEE từ các nồng độ khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn chỉ thị 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml Ciprofloxacin E. coli O157:H7 NA 10,50 ± 0,50c 14,83 ± 0,29a 13,17 ± 0,29b E. coli 0208 NA 10,67 ± 0,58b 10,00 ± 1,00b 12,33 ± 0,29a E.coli NA NA 10,67 ± 1,15b 13,17 ± 0,29a ETEC NA 10,67 ± 0,58b 10,00 ± 0,00b 31,00 ± 0,50a L. innocua NA 9,50 ± 0,50c 10,05 ± 0,00b 12,00 ± 0,50a L. monocytogenes NA 10,33 ± 0,29b 10,67 ± 0,58b 12,17 ± 0,29a S. dublin NA NA NA 12,17 ± 0,76a S. enteritidis NA NA 10,00 ± 1,00b 13,00 ± 0,50a S. typhii NA NA 16,50 ± 1,32a 12,50 ± 0,50b S. typhimurium NA NA NA 11,00 ± 0,00a S. boydii NA 10,00 ± 0,00b 11.83± 0.29a NA S. flexneri NA 9,50 ± 0,71c 14,50 ± 2.29a 13,17 ± 0,29b S. sonnei 10,00 ± 0,00c 9,67 ± 0,29c 11,17 ± 0,76b 33,00 ± 0,50a V. alginolyticus NA NA 12,00 ± 2,65b 16,17 ± 0,29a V.cholerae NA NA NA 13,33 ± 0,58a V. harveyi NA 10,00 ± 1,00c 13,17 ± 0,76b 18,00 ± 0,50a V. parahaemolyticus NA 11,33 ± 1,15b 13,67 ± 1,53a 11,33 ± 0,29a P. aeruginosa NA 10,50 ± 1,32a 11,00 ± 0,50a 12,17 ± 0,58a S. aureus NA 11,00 ± 0,50b 13,33 ± 1,53a 12,17 ± 0,29b a b E. feacalis NA NA 16,17 ± 1,76 12,00 ± 0,50 NA: non activity 66