›

Đồ án Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống

pdf 99 trang thiennha21 12/04/2022 5010
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_bien_di_di_truyen_cua_nguon_tom_su_penaeus_mo.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐ T NGHIỆP ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CỦA NGUỒN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) BỐ MẸ THẾ HỆ ĐẦU TIÊN CHO CHƢƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG Nghành: CÔNG NGH Ệ SINH HỌC Chuyên nghành: CÔNG NGH Ệ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn: Th.S BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ LÝ MSSV: 1151110018 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu thực nghiệm và dưới sự hỗ trợ từ người hướng dẫn khoa học là Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà, thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Các số liệu, hình ảnh, những kết quả trong bài báo cáo là trung thực. Đề tài có sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng đã được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Lý
  3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn thầy Th.s Phạm Minh Nhựt - Giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã giới thiệu em vào làm đề tài ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường. Và đồng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị thuộc Phòng Sinh học thực nghiệm đã chỉ bảo ân cần và tận tình giúp đỡ em hoàn thành tốt thời gian làm đề tài. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn bên em, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được học tập và đạt kết quả như ngày hôm nay. Trong quá trình nghiên cứu cũng như trong quá trình làm báo cáo, khó tránh khỏi những khiếm khuyết nhất định, em rất mong nhận được sự phê bình cũng như các ý kiến đóng góp của quý thầy cô giáo. Em xin chân thành cảm ơn ! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 8 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Lý
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH viii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về tôm sú 3 1.1.1. Phân loại 3 1.1.2. Cấu tạo 3 1.1.3. Phân bố 4 1.1.4. Chu kì sống 5 1.1.5. Sinh sản 7 1.1.6. Đặc điểm sinh trưởng 8 1.2. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền 9 1.2.1. Đa dạng di truyền 9 1.2.2. Quần thể 10 1.2.3. Sự đa dạng di truyền trong quần thể 11 1.2.4. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể 11 1.2.5. Vai trò của di truyền và di truyền quần thể trong nuôi trồng thủy sản 12 1.3. Kỹ thuật Microsatellite 14 1.3.1. Định nghĩa về Microsatellite 14 1.3.2. Giới hạn của Microsatellite 15 1.3.3. Các loại Microsatellite 16 1.3.4. Sự phát triển của Primer Microsatellites 17 1.3.5. Cơ chế hình thành Microsatellite 17 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.6. Vai trò của Microsatellite 19 1.3.7. Các phương pháp phát hiện Microsatellite 20 1.4. Tình hình nghiên cứu 24 1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước 25 1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới 26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 2.2. Vật liệu nghiên cứu 28 2.2.1. Nguyên liệu 28 2.2.2. Hóa chất thí nghiệm 30 2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA 31 2.2.4. Hóa chất chạy PCR 32 2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose 32 2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản 32 2.2.7. Dụng cụ và thiết bị 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 33 2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số 33 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA 35 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 36 2.3.5. Phương pháp điện di 43 2.3.6. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat. 46 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Kết quả trích ly DNA 48 3.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi Microsatellite 50 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite W10 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, GT3, NG12, đại diện cho 16 phép phối. 50 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. 52 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. 53 3.3. Khảo sát nồng độ MgCl2 54 3.3.1. Microsatellite W10 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR 55 3.3.2. Microsatellite P1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR 55 3.3.3. Microsatellite L1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR 57 3.4. Khảo sát hàm lượng DNA 58 3.4.1. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite W10 58 3.4.2. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite P1 59 3.5. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi Microsatellite . 60 3.5.1. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR 60 3.5.2. Sàng lọc các các cặp mồi Microsatellite 62 3.6. Khảo sát đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con phân tích. 64 3.6.1. Tính đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con 64 3.6.2. Kiểm tra cân bằng Hardy - Weinberg 69 3.6.3. Sự khác biệt di truyền của các phép phối trong mẫu phân tích 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 4.1. Kết luận 73 4.2. Kiến nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Tài liệu Tiếng Việt 75 Tài liệu Tiếng Anh 76 Tài liệu từ Internet 77 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC A. Kết quả xử lý số liệu trên hai phần mềm Fstat và cervus 1 A.1. Chỉ số phong phú alen của 16 phép phối trên 10 microsatellite loci 2 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp A.2. Chỉ số cận huyết giữa 16 phép phối trên 10 microsatellite loci 2 A.3. Sự khác biệt di truyền của 16 phép phối trong mẫu phân tích 3 A.4. Các chỉ số đánh giá biến dị di truyền của 16 phép phối 6 PHỤ LỤC B. Một số hình ảnh phân tích DNA từ máy điện di mao quản 7 B.1. Microsatellite P1: Mẫu D9, đồng hợp tử 134 - 134 7 B.2. Microsatellite P4: Mẫu E9, đồng hợp tử 211 - 211 8 B.3. Microsatellite W10: Mẫu A10, dị hợp tử 116 - 112 8 B.4. Microsatellite L1: Mẫu A8, dị hợp tử 165 - 179 9 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT : Không cân bằng di truyền Hardy - Weinberg với mức ý nghĩa sau khi hiệu chuẩn với Bonferroni p < 0,0042. µg: Microgram µl: Microlite µM: Micromol/lite AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism Ar: Allelic richness (mức độ phong phú alen) Bp: Base pair CE: Capillary Electropherosis (Điện di mao quản) DMS: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EBV: Estimated Breeding Value (giá trị chọn giống ) EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid EFF: Electric Field Force EOF: Electro - Osmotic Flo Fis: Chỉ số cận huyết Fst: Sự sai khác di truyền GTE: Glucose - Tris - EDTA He: Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi) Ho: Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện) HWE: Cân bằng Hardy - Weinberg ISSR: Inter Simple Sequence Repeats M: Ladder DNA Marker: Chỉ thị mM: Milimolar (milimol/lite) Na: Number of alleles per locus (số lượng alen trên locus) NS: Không khác biệt có ý nghĩa v
  9. Đồ án tốt nghiệp NST: Nhiễm sắc thể PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content (thông tin đa hình) RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SDS: Sodium Dodecyl Sulphate SSR: Single sequence repeat - Microsatellite STE: Sodium Chloride - Tris - EDTA Ta: Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) TBE: Tris Borate EDTA Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy) VNCNTTS I: Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II VNTR : Variable Number Tamdem Repeat vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con 28 Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite 30 Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp mồi microsatellite 40 Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 41 Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 41 Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. 42 Bảng 3.1. Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA 48 Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) thích hợp cho các cặp mồi microsatellite 54 Bảng 3.3. Nồng độ MgCl2 tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR 57 Bảng 3.4. Hàm lượng DNA khuôn tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR 60 Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số alen của 19 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu 60 DNA tôm sú. 60 Bảng 3.6. Đặc điểm đa dạng di truyền chung trên microsatellite của 16 tổ hợp tôm sú đàn con trong nghiên cứu. 64 Bảng 3.7. Biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (He) của 16 tổ hợp tôm sú đàn con 67 Bảng 3.8. Chỉ số phong phú alen (Allelic richness) 68 Bảng 3.9. Giá trị Fst được phân tích các tổ hợp tôm sú đàn con 70 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 và nồng độ DNA cho 10 cặp mồi microsatellite 73 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) 3 Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org) 5 Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon 6 Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon 7 Hình 1.5. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân 18 Hình 1.6. Mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) 18 Hình 1.7. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 22 Hình 1.8. Vùng flanking (vùng sườn) ở hai bên trình tự microsatellite 22 Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp 31 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction 34 Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 38 Hình 2.4. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồimicrosatellite 43 Hình 2.5. Điện di trên Agarose 44 Hình 2.6. Mô tả hệ điện di mao quản dạng đơn giản 46 Hình 3.1. Kết quả ly trích DNA các mẫu chân bơi tôm ngẫu nhiên đại diện cho 16 phép phối 48 Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite W10 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. 51 Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. 52 Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. 53 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite W10 55 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite P1 56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite L1 57 Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite W10 58 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.9. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite P1 59 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR của 19 cặp mồi microsatellite 61 Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số alen của mỗi cặp mồi microsatellite. 62 Hình 3.12. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite L1 63 Hình 3.13. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P4 63 Hình 3.14. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P1 64 Hình 3.15. Đồ thị so sánh giá trị đa hình các alen trên mỗi locus 66 ix
  13. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản là một trong những nghành trọng điểm phát triển tại Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hằng năm, lĩnh vực này đã mang lại một giá trị kim ngạch xuất khẩu lớn cho đất nước và tạo thu nhập ổn định cho người nuôi trồng thủy sản. Theo Tổng cục Thủy sản Thống kê, ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 (tính theo giá so sánh 2010) ước đạt 188 nghìn tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kì năm 2013, trong đó giá trị nuôi trồng thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ đồng (chiếm 61,2%). Các đối tượng nuôi trồng thủy sản phổ biến bao gồm: cá tra, cá rô phi, tôm sú, tôm càng xanh, cá chép Ấn Độ, ốc hương, rong câu Trong đó nghề nuôi tôm được nuôi trồng rộng rãi nhất và ngày càng thu hút mạnh sự đầu tư của các hộ dân đặc biệt là tôm sú (Penaeus monodo), loài tôm có giá trị kinh tế lớn được liệt kê bởi tổ chức nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization - FAO), tính đến cuối tháng 11/2013, giá trị xuất nhập khẩu tôm 10 tháng năm 2013 đạt gần 2,5 tỷ USD, tăng gần 32,7% so với cùng kì năm 2012, chiếm 44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản đất nước ( Hiện nay, nghành nuôi trồng sản xuất tôm sú ngày càng mở rộng và phát triển thì nhu cầu tôm giống càng tăng cao. Để đáp ứng một lượng lớn tôm giống, nhiều trại sản xuất tôm giống đã được hình thành và thực hiện trên quy mô lớn. Tuy nhiên, tôm sú bố mẹ cung cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn bố mẹ từ tự nhiên và nhập nội. Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn thụ động, tự nhiên, chủ quan và phụ thuộc vào các yếu tố khác do điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các trại tôm giống này là khác nhau dẫn tới chất lượng của tôm sú giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng sau các thế hệ nuôi, mang các mầm bệnh tiềm tàng, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm. Để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi 1
  14. Đồ án tốt nghiệp sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần thiết. Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này. Mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt đòi hỏi vào những nghiên cứu cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền. Để giải quyết các vấn đề trên, các nghiên cứu xác định biến dị di truyền phải kết hợp với so sánh các biến dị hình thái thể hiện về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú, giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết, ứng dụng cao. Vì thế nhóm nghiên cứu tham gia vào đề tài “Đánh giá biến dị di truyền của nguồn tôm sú (Penaeus monodon) bố mẹ thế hệ đầu tiên cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà. 2. Mục đích nghiên cứu Chương trình chọn giống truyền thống dựa vào kiểu hình kết hợp với chỉ thị sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền hỗ trợ trong việc chọn lọc giống bố mẹ, hoặc xác định con cái của chúng có tiềm năng tạo ra những con giống tốt, có năng suất cao. Tích lũy những gia đình mang tính đa dạng di truyền cao cho mục đích chọn lọc nhiều tính trạng phù hợp trong những điều kiện khác nhau. 3. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi Microsatellite qua quy trình PCR. - Phân tích đa dạng di truyền của các tổ hợp phối đàn con tôm sú trong chọn giống thông qua chỉ thị Microsatellite. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về tôm sú 1.1.1. Phân loại Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương nuôi để dùng làm thực phẩm. Theo Hothuis (1980) và Bames trích dẫn bởi Trần Ngọc Hải và cộng sự (1999) thì tôm sú được định loại như sau: Nghành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: Penaeus Monodo (Fabricius , 1798) Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius Tên tiếng anh: Tiger Shrimp Tên tiếng việt: Tôm sú, tôm cỏ Hình 1.1. Tôm sú (Penaeus monodon) 1.1.2. Cấu tạo Cơ thể tôm sú chia 2 phần: Phần đầu ngực và phần bụng. 3
  16. Đồ án tốt nghiệp Phần đầu ngực gồm có: - Chủy: Dạng lưỡi kiếm, cứng, có răng cưa. Chủy cong xuống rất ít, phía trên chủy có 7 - 8 răng, dưới chủy có 3 răng. - Mũi khứu giác và râu: Cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. - 3 cặp chân hàm: Giúp tôm lấy thức ăn và bơi lội. - 5 cặp chân ngực (chân bò): Đây là cơ quan giúp lấy thức ăn và di chuyển của tôm sú (bò). Phần bụng gồm có: 6 đốt bụng và 1 đốt đuôi, mỗi đốt có 1 vùng vỏ, có 5 đôi chân bơi giúp tôm bơi lội dễ dàng trong thủy lực. Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái, thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài. - Con đực: Cơ quan sinh dục chính của tôm đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực số 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi. - Con cái: Buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp háng đôi chận ngực số 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm. 1.1.3. Phân bố Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Tây Châu Phi và phía Nam Châu Úc (Motoh, 1981). Nhìn chung loài này phân bố hầu hết vùng Đông Nam Á từ 30 kinh độ Đông đến 155 kinh độ Đông và từ 35 vĩ độ Bắc đến 35 vĩ độ Nam xung quanh các vùng xích đạo đặc biệt như: Philipines, Malaysia, Indonesia và Việt Nam. Tại Việt Nam tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Đông và vùng Đảo Phú Quốc nhưng tập trung chủ yếu ở các vùng Miền Trung và Nam Bộ. Tôm sú (Post Larvae), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển 4
  17. Đồ án tốt nghiệp và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành sẽ di chuyển ra xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn Hình 1.2. Bản đồ phân bố tôm sú (Fao.org) 1.1.4. Chu kì sống Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm và con cái khoảng 2 năm. Có 2 đặc điểm cần chú ý đến vòng đời tôm sú: - Tăng trưởng từ hậu ấu trùng đến lúc trưởng thành xảy ra vùng cửa sông (đặc trưng ở vùng nước lợ). - Sự chín sinh dục, kết cặp, đẻ trứng và sự phát triển ấu trùng đều xảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối dao động trong khoảng 18 - o 32 /oo và ổn định. 5
  18. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Vòng đời của tôm sú Penaeus monodon Vòng đời tôm sú được chia làm các giai đoạn: Phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và trưởng thành (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 1999). Giai đoạn phôi: Bắt đầu giai đoạn từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành 2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở. Thời gian hoàn tất giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ nước. Nauplli: Gồm 6 giai đoạn, giai đoạn phụ kéo dài từ 36 - 51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghĩ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàn không cần thức ăn. Giai đoạn đầu có chiều dài 0,4 mm và chiều dài tăng dần đến giai đoạn cuối đạt 0,61 mm, bề dày 0,2 mm. Zoea: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 105 - 120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phiêu sinh. Giai đoạn bắt đầu xuất hiện hai phần đầu và bụng rõ rệt, dài khoảng 1mm, giai đoạn kế tiếp xuất hiện mặt và chủy dài 1,9 mm, khi đạt chiều dài 2,7 mm thì thấy xuất hiện gai trên bụng dày 0,45 mm. Mysis: Gồm 3 giai đoạn kéo dài 72 giờ, các Mysis bơi hướng sâu, đuôi đi trước, đầu đi sau. Tôm có hình dạng của tôm trưởng thành dài 3,4 mm xuất hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại. Đến khi tôm đạt chiều 6
  19. Đồ án tốt nghiệp dài khoảng 4,4 mm chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy. Postlarvae (giai đoạn hậu ấu trùng): Giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đó biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng. Giai đoạn này tôm bám thành bể, sống đáy, có hình dạng giống như tôm trưởng thành. Tôm ăn động vật, mùn bã hữu cơ, sinh vật đáy: Oligochaeta, Polychaeta, Bivalvia, 5 - 6 tuần sau trở thành tôm giống. Juvenile (giai đoạn trưởng thành): Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu chuẩn tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 1999). Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển của tôm sú Penaeus monodon 1.1.5. Sinh sản Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ. Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, thường dựa vào trọng lượng để xác định khi con đực nặng từ 50 g trở lên, chỉ khi nào tìm thấy được tinh trùng ở cuối ống dẫn tinh. 7
  20. Đồ án tốt nghiệp Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH - Gonal Inhibiting Hormone) được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tới tuyến giáp synap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục sinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt tức là thúc đẩy chu kì lột xác, đem lại sự thành thục mau chóng hơn. Số lượng trứng đẻ của tôm cái nhiều hay ít phụ thuộc vào chất lượng buồng trứng và trọng lượng cá thể, trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng. Nếu cắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thành thục và đẻ cho số lượng trứng từ 200.000 - 600.000 trứng. Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14 - 15 giờ, ở nhiệt độ 27 - 28oC sẽ trở thành ấu trùng (Nauplii). Tôm sú đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kì chính đó là vào tháng 3 - 4 và tháng 7 - 10 hàng năm (Phạm Văn Tình, 2004). 1.1.6. Đặc điểm sinh trưởng Tôm sú là loài giáp xác có lớp vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể, nên sự sinh trưởng của tôm mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về kích thước và trọng lượng. Tôm muốn gia tăng kích thước phải tiến hành lột bỏ lớp vỏ cũ và mang tính đặc trưng riêng biệt cho loài cùng với giai đoạn sinh trưởng của tôm. Mỗi lần lột xác tôm trưởng thành về chiều dài và trọng lượng, chiều dài trung bình từ 10 - 15% so với trước lột xác. Chu kì lột xác sẽ ngắn ở giai đoạn tôm con và kéo dài khi tôm càng lớn, thường xảy ra vào ban đêm. Sự lột xác của tôm do một loại hormone ở cuống mắt quy định. Cuống mắt còn lại chứa các tế bào kết tủa ion canxi và ion photpho làm cho vỏ tôm cứng lại sau khi lột xác được 0,5 - 1 giờ. Các tế bào này hoạt động dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Khi loại bỏ được lớp vỏ kitin bám vào lớp biểu bì bám cơ thể tôm, giai đoạn lột vỏ chỉ xảy ra trong vài phút, lớp vỏ cũ vỡ ra ở phần lưng nơi tiếp giáp giữa vùng đầu ngực và phần bụng, sau đó tôm được thoát ra từ vị trí hở của vỏ. Tiếp theo tôm sẽ hút nước để tăng kích cỡ cơ thể khi lớp vỏ mới bên ngoài còn mềm, sau đó lớp 8
  21. Đồ án tốt nghiệp vỏ mới cứng nhanh nhờ các nguyên tố vi lượng và protein. Các mỡ dự trữ sẽ chuyển hóa vào trong tuyến ruột giữa. Các tế bào phân chia nhanh chóng, các mARN được hình thành và sau đó là sự tổng hợp của các protein mới. Giữa hai lần lột xác thì các phần chiếm chỗ bởi nước trong lúc gia tăng đột ngột sẽ dần thay thế bằng tế bào mới hình thành. Tuổi thọ của tôm có sự thay đổi theo loài và theo giới tính nên tuổi thọ của tôm sú nuôi thí nghiệm trong ao và các mẫu thu ngoài tự nhiên từ 1,5 năm đối với tôm đực và 2 năm đối với tôm cái (Hothius, 1980). 1.2. Giới thiệu chung về đa dạng di truyền 1.2.1. Đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gien giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gien di truyền trên tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật. Những hình thái khác nhau của gien được thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gien trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới được thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gien và alen trong một quần thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu gien - kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể được biểu hiện bởi các đặc điểm về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định. Số lượng khác biệt nhau về gien trong một quần thể được xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thường mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép 9
  22. Đồ án tốt nghiệp các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận được những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng được với sự thay đổi của môi trường. 1.2.2. Quần thể Trong tiến hóa, cá thể không được xem là đơn vị thích hợp bởi vì kiểu gien của một cá thể được giữ nguyên trong quãng đời của nó, hơn nữa cá thể có tính tạm bợ. Ngược lại, một quần thể thì có tính liên tục qua thời gian và thành phần di truyền của nó có thể thay đổi tiến hóa qua các thế hệ. Sự hình thành các quần thể địa phương tại những vùng lãnh thổ khác nhau chính là phương thức thích ứng của loài trước tự nhiên. Quần thể vì vậy được xem là đơn vị tiến hóa cơ sở. Có nhiều khái niệm “quần thể” khác nhau: Đối với các loài sinh sản hữu tính, quần thể là một tập hợp các cá thể cùng loài, trải qua nhiều thế hệ, cùng chung sống trong một khoảng không gian xác định, trong đó các cá thể có thể giao phối tự do với nhau và được cách ly ở mức độ nhất định với các nhóm cá thể lân cận thuộc loài đó (Lê Đình Lương và Phan Cự Nhân, 2004). Quần thể là một nhóm các cá thể cùng loài có khả năng giao phối tự do với nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một khoảng thời gian tiến hoá lâu dài để hình thành nên một hệ thống di truyền độc lập và một khu vực sinh thái riêng (Yablokov, 1986). Nói ngắn gọn, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại và cùng chia sẻ một vốn gien chung (Ridley, 1993). Nó còn được gọi là quần thể Mendel, mà tập hợp lớn nhất là loài (species). Quần thể hình thành dưới ảnh hưởng của các điều kiện sinh tồn trên cơ sở tác dụng tương hỗ giữa ba nhân tố tiến hóa: di truyền, biến dị và chọn lọc. Định luật Hardy Weinberg phát biểu rằng: “Trong một quần thể toàn phối có số lượng cá thể lớn và không bị tác động bởi chọn lọc, đột biến hay di nhập gien, tần số alen và tần số kiểu gien sẽ không thay đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác” (Hardy và Weinberg, 1908) 10
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Sự đa dạng di truyền trong quần thể Biến dị di truyền hay còn gọi là đa dạng di truyền trong quần thể là tất cả thông tin có thể kế thừa từ thế hệ này sang thế hệ khác được chứa trong bộ gien của bất kì một quần thể hay loài nào (Kottelat và Whitten, 1996). Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gien giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gien có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể hay hình thái thay thế của gien quan tâm được tìm thấy trong quần thể đang khảo sát. Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của acid nucleic, tạo thành mã di truyền (Griffiths, 2000). Di truyền quần thể là một lĩnh vực sinh học mà những nghiên cứu của nó tập trung vào thành phần di truyền của quần thể sinh học (tần xuất phân bố của alen) và sự thay đổi về thành phần di truyền được bắt nguồn từ áp lực của tiến hóa, chọn lọc tự nhiên (natural selection), xu hướng chuyển đổi kết cấu di truyền (genetic drift), đột biến (mutation) và sự phiêu bạt gien (gene flow) được quan tâm như những ảnh hưởng chủ đạo trong tần xuất phân bố alen trong cả quần thể nuôi gia hóa và quần thể tự nhiên (Hartl và Clark, 1997). 1.2.4. Nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng di truyền trong quần thể Trong quần thể ngẫu phối, bằng cách chọn lọc và lai các dạng được chọn với nhau có thể tạo ra các dòng có mức độ biểu hiện tính trạng khác hẳn ở quần thể ban đầu. Điều đó chứng tỏ tính bất đồng nhất về mặt di truyền trong quần thể. Trong quần thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu gien thì rất đa dạng. Sự đa dạng gien chủ yếu do đột biến tạo gien dị hợp tử và quá trình giao phối tái tổ hợp. Tái tổ hợp là nhân tố biến dị quan trọng nhất và đột biến xảy ra ngẫu nhiên. Các đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) và sự thay đổi về số lượng NST có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành loài. Đồng thời sự cách ly địa lý 11
  24. Đồ án tốt nghiệp ngăn cản sự giao phối tự do, tạo điều kiện hình thành quần thể mới phân hóa thành loài mới. Nhưng những đột biến gien lặn thì không bị mất đi, chúng là nguồn dự trữ biến dị quần thể. Hệ thống gien mỗi loài mang tính đặc trưng, tồn tại những gien có nhiều trạng thái biểu hiện tức locus có nhiều trạng thái alen (từ 2 trở lên). Bộ gien của mỗi cá thể góp phần vào hệ thống gien của loài. Các trạng thái thể hiện di truyền khác nhau của một locus chỉ có thể được phát hiện khi quan sát trên nhiều cá thể trong quần thể. Sự đa dạng di truyền của quần thể liên quan tới các trạng thái thể hiện di truyền ổn định của locus và sự đa dạng này xuất hiện khi có đột biến gien (Griffiths, 2000). 1.2.5. Vai trò của di truyền và di truyền quần thể trong nuôi trồng thủy sản Không như hầu hết các loài động vật trên cạn, nguồn đa dạng vật liệu di truyền của động vật dưới nước rất dễ bị tổn thương và nhanh chóng suy giảm hay mất đi do bởi đặc tính thừa kế của chúng có những điểm rất khác biệt. Ví dụ: Hầu như các loài thủy sản được sử dụng trong nuôi thuần thường rất mắn đẻ, mỗi cá thể có thể sinh sản ra một lượng rất lớn giao tử như con cái thường sản sinh ra hàng triệu trứng chỉ trong một lần giao phối. Trong khi đó ở ngoài tự nhiên, tỷ lệ sống cực kỳ thấp ( 90%). Chính vì điều này mà một lượng rất lớn con giống được truyền lại cho thế hệ sau có thể chỉ là từ một cặp bố mẹ trong điều kiện nuôi nào đó. Điều này rất quan trọng trong việc quản lý trại giống vì thông thường các trại giống chỉ cần một lượng rất ít giống bố mẹ cho sinh sản nhân tạo là có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp ấu trùng hay con giống. Như vậy yếu tố đa dạng rõ ràng sẽ thấp so với tập hợp con giống tương đương từ nguồn tự nhiên nơi mà với tỷ lệ sống thường rất thấp. Mặt khác, trong nuôi trồng thủy sản các quần thể bố mẹ tương đối nhỏ thường được lưu giữ riêng biệt, đây là nguyên nhân làm cấu trúc di truyền của nguồn giống thủy sản nuôi có thể thay đổi nhanh chóng theo thời gian chỉ qua vài thế hệ. Vì khi quần thể quá nhỏ, việc bắt cặp ngẫu nhiên sẽ không có nhiều lựa 12
  25. Đồ án tốt nghiệp chọn. Xu hướng bắt cặp lẫn nhau giữa các cá thể có quan hệ huyết thống là không thể tránh khỏi. Do đó, nguy cơ mất dần những biến dị di truyền sẽ nhanh chóng xảy ra vì không tích lũy đủ nhiều các biến dị chung cho đáp ứng kịp sự thay đổi môi trường sống (Gjedrem, 2005). Kích thước quần thể nhỏ, sinh sản cùng dòng hay giao phối các cá thể có họ hàng gần gũi là những tác nhân góp phần gia tăng cấp độ cận huyết dẫn đến suy thoái cận huyết; do đó cho đến thời điểm hiện tại, khả năng hạn chế duy nhất là các nhà tạo giống động vật thủy sản cần duy trì thông tin phả hệ các thế hệ con giống. Trong thực tiễn, chiến lược phát triển nhằm duy trì nguồn vật liệu di truyền cơ bản và bền vững cho nuôi trồng rất cần thiết được đưa vào quy chế và áp dụng rộng rãi (Reisenbichler và Rubin, 1999). Đây là vấn đề then chốt trong nuôi trồng thủy sản, vì thành quả di truyền đạt được từ một chương trình chọn giống sẽ phụ thuộc chủ yếu vào sự tích lũy đầy đủ đa dạng di truyền có mặt trong nguồn bố mẹ. Mức độ biến dị di truyền hiện diện trong quần thể khảo sát sẽ được chi phối chủ yếu bởi cấp độ đa dạng của bố mẹ và hệ thống giao phối. Biến dị di truyền là điều kiện tối cần thiết cho sự tồn tại của quần thể vì một quần thể có yếu tố đa dạng di truyền càng cao càng có tiềm năng thích nghi và cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho chương trình chọn giống (Kottelat và Whitten, 1996; Mable và Adam, 2007). Ứng dụng phương pháp luận di truyền quần thể một cách chính xác có thể giải quyết được những trở ngại liên quan đến tác động bất lợi trong thực tiễn nuôi thả gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến yếu tố đa dạng di truyền để lại hậu quả mất dần tính thích nghi “fitness” trong quần thể động vật nuôi thủy sản. Những nguy cơ được tìm thấy trong quá trình thuần hóa, đặc biệt trong sinh sản nhân tạo các loài tôm trong thời gian gần đây đang là mối lo ngại hàng đầu trong nghiên cứu di truyền quần thể. Nhiều giống tôm nuôi đang trong trạng thái biến dị di truyền tương đối thấp so với tổ tiên hoang dại của chúng. Một khi biến dị di truyền dần mất đi gây suy giảm khả năng sinh sản, hiện tượng suy thoái do cận huyết đang xảy ra (các alen quy định tính thích nghi kém có thể được tích lũy trong con giống do bởi sự tác động kết hợp của phiêu bạc gien và hiện tượng cận huyết). Việc sử dụng chỉ một số 13
  26. Đồ án tốt nghiệp lượng hạn chế bố mẹ cho sinh sản sẽ dẫn đến hiện tượng cận huyết trong quần thể rất cao và hậu quả để lại là nguy cơ nhanh chóng mất dần yếu tố đa dạng di truyền trong quần thể. Điều này được phản ánh qua những biến đổi ngẫu nhiên tần xuất alen hay thậm chí là mất hẳn alen then chốt đảm nhận việc giải mã những tính trạng quan trọng. Tầm quan trọng của việc duy trì yếu tố đa dạng di truyền trong bất kỳ nguồn bố mẹ hậu bị đều được đánh giá cao, phổ biến rộng rãi và được xem là hết sức cần thiết trong quản lý sản xuất con giống lâu dài và bền vững (Mustafa, 2003). Việc tìm hiểu đặc điểm di truyền từng cá thể đóng góp trong nuôi thuần sẽ hỗ trợ nhiều mặt cho các nhà khoa học và người nuôi nhằm cung cấp giải pháp tốt hơn trong việc xử lý vấn đề hiện tại. Do đó cách tiếp cận của cải tiến con giống truyền thống và di truyền hiện đại trong nuôi trồng thủy sản có thể được tận dụng từ giả thuyết và phương pháp luận trong di truyền quần thể nhằm định dạng, kiểm soát và bảo tồn đa dạng di truyền các dòng vật nuôi. 1.3. Kỹ thuật Microsatellite 1.3.1. Định nghĩa về Microsatellite Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn hay gọi là đơn vị lặp lại (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 - 7 “alen” khác nhau, mà mỗi alen có nhận biết tùy thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alen này có thể phát hiện bởi PCR, sữ dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alen được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại. Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn SSR đã 14
  27. Đồ án tốt nghiệp được lập bản đồ trong nhiều loại khác nhau. Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR hay VNTR. Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 - 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gien lớn và phân bố đều trên genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant - al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 - 5.106 tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài nào khác có quan hệ họ hàng. 1.3.2. Giới hạn của Microsatellite Microsatellite được chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong nghiên cứu quần thể, thế nhưng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite được phát triển cho những chủng đặc trưng có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố alen không giá trị (null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu, sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alen đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị). Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alen không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thước alen 15
  28. Đồ án tốt nghiệp cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng hoặc sự cố trong vùng exon của gien dưới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alen microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong trường hợp có một đoạn alen lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alen nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thước, trong khi một alen lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước, sự ép buộc này đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alen của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 1.3.3. Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 - 6 lần), phân loại microsatellite gồm: - Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA - Dinucleotide SSR (GT) 6GTGTGTGTGTGT - Trinucleotide SSR (CTG) 4CTGCTGCTGCTG - Tetranucleotide SSR (ACTC) 4ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa. 16
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.3.4. Sự phát triển của Primer Microsatellites Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này được chèn vào plasmid hoặc phage vector và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, khi nó hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được đọc trình tự và primer PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác định vị trí đặc trưng. Quy trình này liên quan đến những thí nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellite phải được dự đoán trước và primers được thu nhận ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhập từ sự thoái hóa DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alen) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking - vùng nằm ở hai bên trình tự microsatellite để thiết kế primer được bảo tồn trong quá trình di truyền loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 1.3.5. Cơ chế hình thành Microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over during meiosis) và quá trình trượt lỗi trong sao mã. 17
  30. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân Trong quá trình giảm phân sự trao đổi chéo giữa các NST không tương đồng đã tạo nên những đoạn có trình tự lặp của các microsatellite. Hình 1.6. Mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên 18
  31. Đồ án tốt nghiệp phân tử DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. 1.3.6. Vai trò của Microsatellite Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite được dùng như một chỉ thị di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gien. Tuy nhiên, có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gien và chức năng của gien. Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của chất trợ xúc tác (promotor). Vị trí của microsatellite gần hay xa chất trợ xúc tác cũng làm hoạt động của chất trợ xúc tác thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gien. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gien, khi trình tự này được giải phóng thì gien được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gien, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể. 19
  32. Đồ án tốt nghiệp Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gien. Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và cộng sự, 1990). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gien đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và cộng sự, 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 1.3.7. Các phương pháp phát hiện Microsatellite Có 3 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai, phương pháp PCR và phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite 1.3.7.1. Phương pháp lai Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phương pháp nhuộm bạc. - Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ: Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Người ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end - labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation - labelling). Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém. 20
  33. Đồ án tốt nghiệp - Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ): Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 1.3.7.2. Phương pháp PCR Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end - labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Người ta có thể đánh dấu bằng ba loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của alen, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A 1.3.7.3. Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc trưng cho một locus trong bộ gien. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite. 21
  34. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số Ở hình 1.7 hai mồi của PCR (hai mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm hai bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116 bp). Hình 1.8. Vùng flanking (vùng sườn) ở hai bên trình tự microsatellite Mồi Microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alen) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng 22
  35. Đồ án tốt nghiệp flanking (vùng sườn - vùng nằm ở hai bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel. Thông thường sản phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp (Murray và cộng sự, 1993). Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA Polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách này thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alen. Ưu điểm của phương pháp xác định microsatellite bằng cặp mồi microsatellite: Microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều trên bộ gien. Các thông tin về đa alen của một locus cũng như trên nhiều locus cùng một lúc có thể được phân tích một cách đơn giản và nó đủ lớn cho các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích, ứng dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ bộ gien của các loài; phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dưới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt, tìm hiểu về cấu trúc quần thể, phả hệ, khoa học hình sự, các gien liên quan đến năng suất và chất lượng, ngoài ra còn giúp tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gien gây bệnh, từ đó nghiên cứu ra phương pháp điều trị phù hợp. SSR nằm trong số những chỉ thị mạnh nhất để phát hiện sự đa hình. Nhóm chỉ thị SSR này rất đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định. Tương đối đơn giản, dễ thực hiện. Có độ lặp lại rất cao, có thể phân tích hàng loạt, tự động. Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co - dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại (Satoni và cộng sự, 2000). Chỉ thị mồi microsatellite có các ưu điểm nổi bật sau: 23
  36. Đồ án tốt nghiệp - Di truyền đa alen và đồng trội. - Có tính chỉ thị cao (non - abundant). - Có ở tận hai đầu của bộ gien (tính chỉ thị rộng). Microsatillite (Simple Sequence Repeats, SSRs) có độ đa hình cao, chỉ thị đồng trội, hiệu quả này đã được chứng minh qua nhiều mục đích ứng dụng bao gồm kỹ thuật finger - printing (Smith và Devey, 1994), nghiên cứu di truyền quần thể (Haymer 1994; Tsumura và cộng sự, 1996; Thomas và cộng sự, 1999), kiểm tra sự phân bố di truyền cho đời sau (Dow và cộng sự, 1995), kiểm tra sự thuần hóa (Morchen và cộng sự, 1996). Khi so sánh với các phương pháp khác thì SSR dễ dàng sử dụng hơn sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs) chỉ giải quyết được số lượng nhỏ DNA, sự đa hình cao và khả năng phân tích nhanh. SSR phân tích nhanh hơn sự khuếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) và sự chuyển đổi tốt hơn AFLP. SSR hiện giờ thay thế cho RFLP trong lập bản đồ di truyền các cây trồng trong nông nghiệp. Sự kết hợp của SSR với AFLP tạo nên bản đồ di truyền chi tiết. Sự đồng trội tự nhiên của SSR cũng là điểm mạnh trong lập bản đồ di truyền. Trong khi đó, chỉ thị RAPD thì dễ dàng phát triển nhưng giới hạn trong nhiều mục đích ứng dụng (Haymer, 1994). Tuy nhiên, việc xác định những đoạn mồi bọc chuyên biệt là một công việc khá nặng nề đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ thuật cao. Hơn nữa kỹ thuật này đòi hỏi chi phí rất cao (Gupta và cộng sự, 1999). 1.4. Tình hình nghiên cứu Trong lĩnh vực nghiên cứu đa dạng di truyền trên động vật thủy sản trong nước và thế giới. Trước những yêu cầu cấp thiết về nguy cơ mất dần sự đa dạng nguồn lợi sinh vật, sự thoái hóa giống vật nuôi, cây trồng .v.v Vấn đề cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu di truyền là phải nhanh chóng tìm hiểu và giải quyết các vấn đề trên. Ngoài ra, còn phải đưa ra những giải pháp công nghệ nâng cao chất lượng con giống, tăng nguồn lợi thực phẩm cho cả hai mặt chất và lượng. Đã có rất 24
  37. Đồ án tốt nghiệp nhiều nghiên cứu đi sâu tìm hiểu cấu trúc phân tử của vật liệu di truyền và một số đã mang lại thành công ngoài mong đợi. Tuy nhiên, vấn đề phục hồi nguồn đa dạng sinh học đã bị mất đi thì còn phải cần nhiều thời gian. Dưới đây là một số ứng dụng sinh học phân tử vào lĩnh vực di truyền chọn giống. 1.4.1. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trong nước Trong phạm vi nước ta, có những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II - “Khảo sát đa dạng di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD và mtDNA PCR - RFLP”. Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá di truyền một số quần thể tự nhiên. Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gien tôm càng xanh tại Việt Nam. Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD” nhằm kiểm tra sự khác biệt di truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD (Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012). Nghiên cứu “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsatellite” đã phân tích tính đa hình trên 83 cá thể với số lượng quần đàn: quần đàn I (n = 30) thu ở Rạch Gốc, quần đàn II (n = 32) thu ở Phú Yên, quần đàn 3 (n = 21) có nguồn gốc ở Singapore. 8 locus microsatellite lấy từ ngân hàng gien (CSCUP mo1, CSCUP mo2, CSCUP mo3, CSCUP mo4, CSCUP mo6, CSCUP mo7, CSCUP mo18, CSCUP mo386). Kết quả mà tác giả phân tích cho thấy 6 locus đầu tiên có tính đa hình bên trong mỗi quần đàn đang rất cao với giá trị thông tin đa hình PIC > 0,5 (Nguyễn Thị Thảo và cộng sự, 2004). Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân 25
  38. Đồ án tốt nghiệp tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004); “25 Microsatellite loci khảo sát QTL (Quantitative Trait Loci) trên tính trạng tăng trưởng ở đàn cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Điền, 2005).v.v 1.4.2. Những nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới Hiện nay trên thế giới, có những đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Nghiên cứu “Genetic diversity of intensive cultured and wild tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite markers” (Nahavandi và cộng sự, 2011). Các tác giả sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo cáo của Pongsomboom và cộng sự (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan. Đề tài “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp” (Wuthi và cộng sự, 2003), được đăng trên tạp chí khoa học ngành thủy sản số 224 vào tháng 5/2003. Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp được 30 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú (penaeus monodon) dựa trên 9 trình tự lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8, (GATA)8, (TCAG) và thực nghiệm trên 30 mẫu tôm. Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan, cho kết quả chỉ số thông tin đa hình (PIC) dao động từ 0,4275 - 0,9264. Báo cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic microsatellite markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (penaeus monodon)” (Pan và cộng sự, 2004). Với việc sử dụng các công cụ gần giống như (Wuthi và cộng sự, 2003), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite đặc hiệu để phân tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả cho thấy, số alen dao động cao từ 15 - 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình Ho = 0,936. Báo cáo này đã được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và phát triển khoa học Đài Loan, và đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào tháng 7/2004. 26
  39. Đồ án tốt nghiệp “Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations” ( Li và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng 90 trình tự gien của tôm sú có kích thước 100 - 350 bp từ ngân hàng gien và thiết kế 13 cặp mồi microsatellite bao gồm 3 và 4 đơn vị lặp lại bằng cách sử dụng primer v.3 (Rozen và Skatetsky, 2000) để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở Australia và Thái Lan. Kết quả cho thấy, số alen của quần đàn tôm sú ở Australia khá cao dao động từ 7 - 27, số dị hợp tử quan sát dao động lớn được từ 0,16 - 0,91. Đối với quần đàn tôm sú ở Thái Lan số alen từ 6 - 15, số dị hợp tử quan sát dao động lớn từ 0,09 - 0,90. Báo cáo này được đăng trên tạp chí Aquaculture vào 1/2007. Khảo sát ban đầu nhận thấy sự ổn định và chất lượng cao của các cặp mồi từ những bài báo tin cậy trên nhóm nghiên cứu đã chọn ra được 19 cặp mồi: W2, W3, W4, W5, W6, W10 (Wuthi và cộng sự, 2003), P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7 (Pan và cộng sự, 2004), L1, L2, L3, L4, L5, L6 (Li và cộng sự, 2007), tiếp tục khảo sát và sàng lọc ra những cặp mồi có tính đặc hiệu cao nhất để phân tích đánh giá biến dị đa dạng di truyền có độ tin cậy cao cho 16 phép phối tôm sú đàn con trong chương trình chọn giống. 27
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: Từ ngày 02/02/2015 đến ngày 30/06/2015. Các thí nghiệm được tiến hành ở phòng thí nghiệm di Truyền Phân Tử thuộc Phòng Sinh Học Thực Nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu Bảng 2.1. Danh sách 69 gia đình mẫu tôm sú đàn con STT Tên mẫu STT Tên mẫu STT Tên mẫu 1 AA4 24 NA10 47 GT4 2 AA5 25 NG9 48 TA1 3 AA6 26 NG10 49 TA2 4 AA7 27 NG11 50 TA3 5 AA8 28 NG12 51 TA4 6 AA9 29 NG13 52 TG1 7 AG4 30 NG14 53 TG2 8 AG5 31 NN5 54 TG3 9 AG6 32 NN6 55 TG4 10 AG7 33 NN7 56 TN1 11 AG8 34 NN8 57 TN2 12 AN3 35 NN9 58 TN3 13 AN4 36 NN10 59 TN1 14 AN5 37 NT4 60 TN2 15 AN6 38 NT5 61 TN3 16 AT2 39 NT6 62 TN4 17 AT3 40 NT7 63 TT1 18 AT4 41 NT8 64 TT2 19 AT5 42 GG6 65 TT3 28
  41. Đồ án tốt nghiệp 20 NA7 43 GG7 66 TT4 21 NA8 44 GN8 67 TT5 22 NA9 45 GN9 68 TT6 23 GA6 46 GA7 69 AN3 Mẫu: 69 gia đình mẫu chân bơi đã được thực hiện trên 16 phép phối với nhau qua các quần thể Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa, Nội Địa (AA, AG, AN, AT, GA, GN, GG, GT, TA, TN, TG, TT, NA, NG, NT, NN). Mẫu được bảo quản trong cồn 70o, được cung cấp bởi chương trình tích hợp các dòng Tôm sú khác nhau cho chương trình chọn giống Tôm sú thuộc Trung tâm Quốc Gia Giống Hải sản Nam Bộ ( TTQGGHSNB) và tương ứng với số lượng như sau: 6 gia đình AA: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Ấn Độ Dương 5 gia đình AG: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Gia Hóa 5 gia đình AN: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Nội Địa 4 gia đình AT: Phối giữa mẹ Ấn Độ Dương với bố Thái Bình Dương 4 gia đình NA: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Ấn Độ Dương 6 gia đình NN: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Nội Địa 6 gia đình NG: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Gia Hóa 5 gia đình NT: Phối giữa mẹ Nội Địa với bố Thái Bình Dương 2 gia đình GG: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Gia Hóa 2 gia đình GN: Phối giữa mẹ Gia Hóa với bố Nội Địa 2 gia đình GA: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Ấn Độ Dương 3 gia đình GT: Phối giữa mẹ Gia hóa với bố Thái Bình Dương 4 gia đình TA: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Ấn Độ Dương 4 gia đình TN: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Nội Địa 4 gia đình TG: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Gia hóa 6 gia đình TT: Phối giữa mẹ Thái Bình Dương với bố Thái Bình Dương 29
  42. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Hóa chất thí nghiệm 2.3.5.1. Mồi Mười cặp mồi microsatellite sử dụng cho nghiên cứu có chiều dài từ 18 - 27 bp được sàng lọc ra từ 19 cặp microsatellites (hãng Sigma) phân tích đặc hiệu cho 69 gia đình tôm sú, có kí hiệu L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, W10, W2. Trong đó, các cặp mồi L1, L2, L3 được tham khảo từ Li (Li và cộng sự, 2007), các cặp mồi P1, P2, P4, P5, P7 được tham khảo từ Pan (Pan và cộng sự, 2004) và các cặp mồi W10, W2 được tham khảo từ Wuthi (Wuthi và cộng sự, 2003). Thông tin về trình tự và kích thước của mồi được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi microsatellite Tác giả Kí hiệu Trình tự mồi F 5’TGCAGCTTCACACACCCATACACG3’ L1 R 5’TATGACAGGCAGTTGCGCCAGGTA3’ Li và Lion F 5’GAAGGAGAAGGAGGAGGATTACAAGGA3’ (2007) L3 R 5’TCGGGCGGAGAATATGCAAATTAAA3’ F 5’GTCTGTCCATCCTTCCGTCTGACC3’ L4 R 5’TGGGAGTAAACAAAGCGTTTGAGATTG3’ F 5’GTGTTATTTTCCACGGGTGC3’ P1 R 5’GCTGCAGGAAGTGTAGGGAG3’ F 5’GTTGCGACGGGTTGATTC3’ P2 R 5’TTTATGGCTATGGCTGACAC3’ F 5’ TAATGGGCGTAAGTCTTCGG3’ P4 R 5’TGAAAGGAGTCGGGATATGC3’ Pan (2004) F 5’CTTTTTGAAATCGCCCTGTT3’ P5 R 5’CATTCATCCCGCTCTTCTGT3’ 30
  43. Đồ án tốt nghiệp F 5’AAAAGCCAGAGGAAACGTG3’ P7 R 5’ACAGTGCACGTACCCACAAA3’ F 5’TCTATTGTCTGCCAGTTTGTCC3’ W10 R 5’TAGCACGGGATTTATGAAGTGA3’ Wuthi F 5’TTATCCGTATAGCCGCGTTATC3’ (2003) W2 R 5’TTACAGGACCTGCATTTGTGTC3’ 2.2.2.2. Thang Sử dụng thang M (Ladder) DNA để làm chỉ thị xác định kích thước phân tử DNA các mẫu tôm khảo sát. Kích thước thang M sử dụng trong thí nghiệm là 100 bp DNA ladder - Promega. Hình 2.1. Thang chuẩn 100bp 2.2.3. Các hóa chất ly trích DNA - Dung dịch ly trích 1 (Solution 1): 50 mM Tris - HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2% SDS. - Dung dịch ly trích 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M. - Proteinase K (bảo quản - 24oC) - Ethanol 70% lạnh (bảo quản ở - 24oC) - Ethanol tuyệt đối lạnh (bảo quản ở - 24oC) 31
  44. Đồ án tốt nghiệp - Nước cất 2 lần, hấp khử trùng 2.2.4. Hóa chất chạy PCR - 10 X PCR buffer (Fermentas) - 25 mM MgCl2 (Fermentas) - 10 mM dNTP mix (Fermentas) - Taq DNA polymerase 5 u/µl (Fermentas) - Primer 100 M (Sigma) - DNA mẫu (ly trích từ mẫu chân bơi tôm sú) 2.2.5. Hóa chất chạy điện di agarose - Agarose (Bio basic) - TBE 0,5 X - 6 X DNA Loading Dye (Promega) - 100 bp DNA Ladder (Promega) 2.2.6. Hóa chất chạy điện di mao quản - QIAxcel DNA Sreening Kit (Qiagien) - QX DNA Size Marker 50 - 800 bp (50 ul) (Qiagien) - QX Aligment Marker 15 bp/1 kb (1,5 ml) (Qiagien) - QX DNA Dilution Buffer (Quiagien) - QX Separation Buffer (Qiagien) - QX Wash Buffer (Qiagien) - QX Nitrogien Cylinder (Quigien) 2.2.7. Dụng cụ và thiết bị - Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml; 2,0 ml. - Đầu tip các loại (Eppendorf) - Plates 96 well PCR (Eppendorf) - Máy đo OD SmartSpecTMPlus (Bio - rad) - Bồn ủ nhiệt (block heater Bio - rad) - Lò viba (Electrolux - Thụy Điển) - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Astec Microflow). 32
  45. Đồ án tốt nghiệp - Micropipet các loại: 100 - 1000 µl; 0,5 - 10 µl; 10 -100 µl; (Bio - rad) - Máy ly tâm lạnh. - Máy PCR (Bio - rad) - Bồn điện di Agarose (Bio - rad) - Máy chụp ảnh điện di Geldoc X (Bio - rad) - Lò vi sóng (Electrolux - Thụy Điển) - Tủ mát, tủ âm (- 2oC, - 80oC) (Sanyo - Nhật) - Máy điện di mao quản - QX 0,2 ml tube trip (Qiagien) - QX 0,2 ml tube trip caps (Qiagien) - QX Color 0,2 ml tube Strip (Quiagien) - Các vật dụng trong tách chiết: chày, crack . 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu Mẫu tôm sú được chọn là những cá thể trưởng thành, khỏe mạnh, đã tham gia sinh sản trong quần thể, thu tại hiện trường được cố định ngay bằng cồn 70o theo tỉ lệ tôm: cồn = 1: 3. Mẫu được thu bằng cách dùng vợt vớt ngẫu nhiên ít nhất tại 5 vị trí khác nhau ở cùng một bể giống và mỗi cá thể tôm sú chọn lấy 1 chân bơi (có cả phần vây và phần thịt), sau đó cho chân bơi vào từng eppendorf 1,5 ml riêng biệt có chứa sẵn cồn 70o và được đánh kí hiệu tên cụ thể cho từng con, đem lưu giữ mẫu trong tủ lạnh phòng thí nghiệm. 2.3.2. Phương pháp ly trích DNA tổng số Tách chiết DNA dựa vào quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và cộng sự, 1988). 33
  46. Đồ án tốt nghiệp Mẫu chân bơi Cắt nhỏ mẫu cho vào efpendorf 1,5 ml 5µl Protein K + 500µl dung dịch 1 và lắc mạnh Ủ 550C trong 2 giờ hoặc qua đêm ở 37oC Để lạnh 10 phút và hút 250 µl dung dịch 2 Để lạnh 5 phút rồi Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút (bỏ cặn) Thu 500 µl dịch nổ i và thêm 1 ml ethanol 100% để lạnh sau đó ủ - 4oC /2 giờ Ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút (bỏ dịch) Hút 500 µl ethanol 70% lạnh Ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút (bỏ dịch) Làm khô tủa bằng block heater ở 50oC và cho 100 µl dung dịch TE Dung dịch DNA Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction Hóa chất: dung dịch 1 (50 mM Tris HCl pH 8, 20 mM EDTA pH 8, 2% SDS); dung dịch 2 (saturated NaCl solution 6 M). 34
  47. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng mẫu chân bơi có kích thước xấp xỉ 5 x 5 mm. Rửa trong STE hoặc GTE nếu cần (nếu mẫu được cất giữ trong một khoảng thời gian dài trong cồn hoặc dung dịch DMSO). Tiến hành ly trích DNA bằng cách cắt nhỏ mẫu chân bơi cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch 1. Sau đó, thêm 5 µl proteinase K, vortex nhanh. Ủ các eppendorf trên ở 55oC trong 2 giờ (hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng). Sau 2 giờ (qua đêm), các eppendorf được chuyển sang để lạnh 10 phút. Tiếp theo, thêm 250 µl dung dịch 2 và trộn đều dung dịch, để lạnh 5 phút. Sau 5 phút, tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Sau khi ly tâm, cẩn thận thu 500 µl dịch trong tránh cặn cho vào eppendorf 1,5 ml mới có dán nhãn, thêm 1000 µl Ethanol tuyệt đối được giữ lạnh. Sau đó, các eppendorf mới này được giữ lạnh ở - 4oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ, tiến hành ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi ly tâm, tiến hành loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf với 500 µl Ethanol 70%. Tiếp tục ly tâm 11000 vòng/phút trong 5 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô eppendorf bằng máy gia nhiệt ở 55oC hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, thêm 50 - 200 µl TE (nước cất vô trùng) vào mỗi eppendorf (trung bình là 100 µl). Dán nhãn và bảo quản lạnh - 25oC. Quy trình ly trích DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng Protinase K và dung dịch 1 có vai trò như một dung dịch đệm gồm: Tris HCl, EDTA, SDS, phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70% và 100% cho hiệu quả rửa giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra. 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA Sau khi tách chiết DNA tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng của DNA bằng máy đo quang phổ (SmartSpec Plus - Bio rad). Hút 5 µl dung dịch DNA sau khi tách chiết pha loãng với 495 µl nước cất để đạt độ pha loãng là 100 lần. Sau khi pha loãng tiến hành cho mẫu vào cuvet và đưa vào máy đo quang phổ, chỉnh bước sóng 260/280 nm, đợi máy hiển thị và đọc kết quả. Máy đo quang 35
  48. Đồ án tốt nghiệp phổ sẽ hiển thị hai kết quả là tỷ lệ giữa bước sóng 260/280 nm và số OD 260 nm để tính hàm lượng DNA. Nếu tỷ lệ bước sóng 260/280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2 thì DNA được xem là không bị lẫn tạp chất đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Xác định hàm lượng DNA để tiến hành pha loãng DNA thành hàm lượng mong muốn để tiến hành các thí nghiệm tiếp. 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR. Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA là có thể thực hiện được. Nhược điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dương tính giả. Trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính. Nguyên tắc: Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc của một phản ứng sinh hóa: tổng hợp nhiều bản sao DNA từ trình tự DNA xác định nhờ enzyme. Một phản ứng khuếch đại đặc trưng bao gồm: trình tự DNA cần quan tâm, một enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, hai đoạn nucleotid mồi, 4 loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP), dịch đệm cho phản ứng và magnesium. Các thành phần phản ứng nói trên được trộn đều và phản ứng được đặt vào máy luân nhiệt. Máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng thông qua một chuỗi các nhiệt độ khác nhau trong những lượng thời gian khác nhau. Sự hài hòa giữa chuỗi nhiệt độ và thời gian do các bước trong chu kỳ khuếch đại quyết định. Hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn do các enzyme tổng hợp DNA (DNA Polymerase) với sự hiện diện của những mồi chuyên biệt thực hiện. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. DNA polymerase đến, gắn vào và nối dài mồi để hình thành 36
  49. Đồ án tốt nghiệp mạch mới. Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt gắn vào hai đầu của một trình tự DNA quan tâm, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi, một mồi xuôi (sense primer) và mồi ngược (antisense primer). Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR: Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR bao gồm: DNA mẫu, taq polymerase, mồi, nhiệt độ lai, dNTP, MgCl2, số chu kì của phản ứng PCR. Mẫu DNA: Mẫu DNA được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5 - 10 ng DNA thuần khiết. Mồi (Primer): Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F - primer (mồi xuôi) và R - primer (mồi ngược). Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Mồi phải đạt được sự khuếch đại đặc trưng, chuyên biệt và cho hiệu quả cao. Để đạt được các chỉ tiêu trên mồi phải đạt được các đặc điểm sau: - Mồi được tổng hợp hóa tự động, khoảng 18 - 24 base. - Mồi xuôi và mồi ngược không bắt cặp với nhau. - Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không quá chênh lệch. - Khi sử dụng enzyme thông dụng như hiện nay (Taq polymerase) trình tự nằm giữa hai mồi là không quá lớn (>3 kb). Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lập lại trên gien. Nồng độ Mg 2+: cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá trình PCR, Mg2+ cần cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg2+ thấp thì không được hoạt hóa thành công, nồng độ Mg2+ cao làm phản ứng PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm tạo ra. Không có quy luật chung cho nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR. Do đó, nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm. 37
  50. Đồ án tốt nghiệp dNTP: thường sử dụng trong khoảng 20 - 200 µM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”. Ngoài ra, theo kết quả tham khảo từ nghiên cứu của các tác giả Muhammad, Barry Jaquish và Khasa, các yếu tố: nồng độ mồi, Taq polymerase khá ổn định và việc tăng các yếu tố trên cũng không làm tăng chất lượng của phản ứng PCR. Đối với điện di cũng cần khảo sát nồng độ phần trăm (%) agarose, hiệu điện thế và thời gian thích hợp để sản phẩm khuếch đại và thang phân tách rõ ràng. Từ những vấn đề nêu trên, yếu tố nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA khuôn được chọn để tiến hành tối ưu hoá phản ứng PCR. Quy trình PCR: PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ (cycle) kế tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài. Hình 2.3. Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR (1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính. 38
  51. Đồ án tốt nghiệp (2) Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55 - 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp. (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao. Tiến hành kiểm tra tính hoạt động của 19 cặp mồi microsatellite và tối ưu hóa các phản ứng PCR cho chỉ thị microsatellite bằng cách chọn ngẫu nhiên 4 mẫu DNA (AA4, TT1, GT3, NG12), trong 28 mẫu đã ly trích (AA4, AA6, AG5, AG7, AN3, AN4, AT4, AT6, GA6, GG7, GN8, GT3, GT4, NA9, NA10, NG12, NG13, NN6, NT5, NT6, TT1, TT6, TA3, TA4, TN2, TN3, TG2, TG3) để chạy phản ứng PCR với 4 mẫu đã chọn lọc theo gradient nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA mạch khuôn để kiểm tra hoạt động của các cặp microsatellite. Đồng thời, phân tích và chọn ra nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và hàm lượng DNA mạch khuôn phù hợp cho các cặp mồi microsatellite để phản ứng PCR đạt điều kiện ổn định hơn. Tiếp theo thực hiện phản ứng PCR với 28 mẫu DNA ly trích ở nhiệt độ, nồng độ MgCl2, và hàm lượng DNA mạch khuôn tối ưu đã chọn ra cho các cặp mồi microsatellite. Từ đó đánh giá tính ổn định của phản ứng PCR, sàng lọc chọn ra các cặp mồi cho tỉ lệ khuếch đại sản phẩm cao và đa hình cao. 2.3.4.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi là cần thiết để phản ứng PCR. 39
  52. Đồ án tốt nghiệp Đề tài sử dụng 19 cặp mồi Microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú từ ba nhóm tác giả (Li và cộng sự, 2007; Pan và cộng sự, 2004; Wuthi và cộng sự, 2003), đã khảo sát và công bố nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi. Tuy nhiên đề tài này được thực hiện ở điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt.v.v Khác với điều kiện mà ba nhóm tác giả thực hiện, vì vậy việc khảo sát lại nhiệt độ bắt cặp cho các cặp mồi từ nhiệt độ tối ưu của ba tác giả đã đưa ra là cần thiết để phù hợp với điều kiện hóa chất, máy luân nhiệt của phòng thí nghiệm mà đề tài thực hiện. Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho từng cặp mồi microsatellite Dãy nhiệt độ khảo sát. Nhóm 1 2 3 4 5 6 7 8 tác giả Nhiệt độ tối ưu (theo tác giả) Wuthi 55oC 58,5 58,2 57,5 56,4 54,9 53,8 53,0 52,5 (2003) Pan 52oC 55,0 54,6 53,8 52,5 50,8 49,5 48,6 48,0 (2004) 56oC 61,0 60,7 60,0 58,9 57,4 56,3 55,5 55,0 Li 60oC 64,0 63,6 62,7 61,2 59,1 57,7 56,7 56,0 (2007) 40
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 Đối với nồng độ MgCl2, tiến hành thay đổi thể tích MgCl2 trong khoảng 1 - 3 µl với nồng độ gốc của MgCl2 là 25 mM, được thể hiện trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 5 Thể tích MgCl2 (µl) 1 1,5 2 2,5 3 Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25 1,875 2,5 3,125 3,75 Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích MgCl2 tương ứng với nồng độ MgCl2 gốc, hiệu chỉnh thể tích H2O sao cho tổng thể tích của phản ứng PCR là 20 µl/1 phản ứng. 2.3.4.3. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn Hàm lượng DNA quá cao hay quá thấp cũng ảnh hưởng đến sản phẩm khuếch đại PCR. Hàm lượng DNA quá cao sẽ làm cho khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không muốn, hàm lượng quá thấp thì sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ mờ và không được rõ (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997). Vì vậy tiến hành khảo sát hàm lượng DNA là cần thiết để phản ứng PCR được tối ưu. Bảng 2.5. Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite Phản ứng 1 2 3 4 Thể tích DNA (µl) 0,5 1,0 1,5 2,0 Hàm lượng DNA khuôn trong 20 µl thể tích phản ứng (ng) 25 50 75 100 Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio - rad ) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích của phản ứng là 20 µl/l phản ứng. 41
  54. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.4. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite sau khi đã tối ưu các yếu tố nhiệt độ bắt cặp, nồng độ Mg2+ và nồng độ DNA Sau khi đã có kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi, nồng độ Mg2+ tối ưu và hàm lượng DNA tối ưu cho mỗi cặp mồi của phản ứng PCR, tiếp tục thực hiện phản ứng PCR của các cặp mồi microsatellite đặc trưng cho loài tôm sú trên 28 mẫu DNA (AA4, AA6, AG5, AG7, AN3, AN4, AT4, AT6, GA6, GG7, GN8, GT3, GT4, NA9, NA10, NG12, NG13, NN6, NT5, NT6, TT1, TT6, TA3, TA4, TN2, TN3, TG2, TG3) nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của primer microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa. Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên các Plates 96 well PCR và thực hiện trên thiết bị luân nhiệt PCR iCycle (Bio - rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 µl, bao gồm các thành phần: buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn và nước cất 2 lần tiệt trùng, nồng độ và thể tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.6. Bảng 2.6. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. Thành phần Thể tích (µl) PCR buffer 10 X 2,5 dNTP 10 mM 1 MgCl2 25 mM Nồng độ tối ưu Forward Primer 10 µM 1 Reverse Primer 10 µM 1 Taq polymerase 5 U/µl 0,25 DNA khuôn 50 ng/µl Hàm lượng tối ưu 42
  55. Đồ án tốt nghiệp Nước cất 2 lần tiệt trùng Định mức đủ 20 Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR iCycle (Bio - rad) với chu kỳ nhiệt. Hình 2.4. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồimicrosatellite 2.3.5. Phương pháp điện di 2.3.5.1. Điện di trên Agarose Điện di là kỹ thuật dùng để phân tích và tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. 43
  56. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Điện di trên Agarose Nguyên tắc: Dựa vào sự tích điện nhất định và khối lượng khác nhau của các phân tử protein hay nucleic nên khi đặt chúng trong một điện trường chúng sẽ di chuyển. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn. Nhờ có chất nhuộm thích hợp như ethidium bromide và quan sát dưới tia UV mà có thể biết được vị trí các phân tử trên gel. Các bước thực hiện gel: Đổ gel agarose: Chuẩn bị lượng agarose và dung dịch điện đệm thích hợp  Gia nhiệt cho đến khi agarose tan hoàn toàn  Để nguội tự nhiên đến khoảng 50 - 60oC rồi cho dung dịch ethidium bromide  Rót gel vào khuôn đã cài sẵn lược (không để có bọt khí)  Chờ đến khi gel rắn hoàn toàn thì tháo lược ra khỏi gel (cẩn thận để không bể gel). Điện di gel agarose: Đặt khuôn gel trong chậu điện di, rót dung dịch điện đệm vào cho ngập gel, đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode (cực âm) Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu  Hút mẫu nucleic acid nhỏ vào lỗ răng lược  Bật điện một chiều 50 - 150 V để thực hiện điện di. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp Kiểm tra bằng DNA: Bật UV và kiểm tra vệt sáng, dựa vào khoảng cách 2 vệt sáng, ước tính được khối lượng, độ tinh sạch. Sản phẩm DNA sau khi được khuếch đại thì tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%, hiệu điện thế 100 V, trong thời gian 40 phút, TBE 0,5 X, thể tích mẫu là 8 µl. Dùng thang DNA 100 bp để so sánh kích thước đoạn DNA, với thể tích thang là 2 µl. 2.3.5.2. Điện di mao quản Điện di mao quản CE là phương pháp phân tách các chất dựa vào sự khác nhau về tốc độ chuyển động của chúng dưới tác dụng của lực điện trường trong một mao quản hẹp. Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất phân tích trong mao quản (ɸ: 25 - 100 mm) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn điện thế cao một chiều (V: 10 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Có nghĩa CE là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xảy ra nhanh và hiệu quả cao. Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (EOF), các phân tử chất tan sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau. Phương pháp CGE sử dụng mạng lưới gel trong mao quản để tách các chất phân tích. Mạng lưới gel có những lỗ xốp kích thước cỡ phân tử chứa đầy dung dịch đệm, với mạng lưới lỗ xốp như vậy sẽ tạo cho mao quản như một cái “rây” để phân loại các phân tử chất phân tích theo kích thước. 45
  58. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.6. Mô tả hệ điện di mao quản dạng đơn giản 2.3.6. Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat. Microsatellite alen được xác định bằng cách thống kê kích thước của các sản phẩm khuếch đại. Việc xác định kích thước được dựa vào kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose và so sánh với thang chuẩn. Các thông số về biến động di truyền bên trong quần thể như tần số alen (A), số alen trung bình của mỗi locus (A), thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC), dị hợp tử quan sát và mong đợi (Ho và He), cân bằng Hardy - Weinberg (HW) dựa vào Cervus (version 3.0.3). Mức độ phong phú alen (allelic richness: Ar), chỉ số cận huyết (Fis), giá trị khác biệt di truyền (Fst) được ước lượng bằng phần mềm Fstat (version 2.9.3) bằng cách chuẩn hóa biến dị alen về nhóm mẫu có số lượng thống nhất dựa vào FSTAT for Windows v. 2.9.3. Thêm vào đó sự vượt quá của đồng hợp tử đã xảy ra trong tất cả các quần thể được kiểm định về số alen trơ (null alleles) cũng đã được đánh giá bởi Cervus (version 3.0.3), và sau đó tần số kiểu gien đã được kiểm tra và hiệu chỉnh lại theo đề nghị từ chương trình này. Đánh giá mức khác biệt bên trong và giữa các quần thể, các giá trị thống kê F(Fis, Fst) được ước lượng qua phân tích phương sai phân tử (ANOVA), FST sau đó cũng được kiểm định để so sánh sự khác biệt ý nghĩa so với giá trị 0 bằng 46
  59. Đồ án tốt nghiệp bootstrapping trong FSTAT v .2.9.3 và cũng được xét lại dựa trên hiệu chỉnh Bonferroni. 47
  60. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả trích ly DNA Các mẫu chân bơi tôm ngẫu nhiên đại diện cho 16 phép phối tôm sú đàn con sau khi ly trích theo quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Motoh, 1981) được kết quả minh họa ở hình 3.1. Hình 3.1. Kết quả ly trích DNA các mẫu chân bơi tôm ngẫu nhiên đại diện cho 16 phép phối Kiểm tra đại diện 28 mẫu DNA tách chiết đạt yêu cầu và được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo. Trong đó các mẫu thuộc giếng từ 1 đến giếng 28 (AA4, AA6, AG5, AG7, AN3, AN4, AT4, AT6, GA6, GG7, GN8, GT3, GT4, NA9, NA10, NG12, NG13, NN6, NT5, NT6, TT1, TT6, TA3, TA4, TN2, TN3, TG2, TG3). Từ kết quả hình ảnh cho thấy vạch DNA đều, sản phẩm DNA tách chiết ít bị đứt gãy và chứa các DNA cùng kích thước. Sau khi có kết quả điện di trên agarose thì tiến hành đo OD để kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ của DNA sau khi tách chiết. Kết quả đo OD thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA Mẫu OD260/OD280 Nồng độ ng/µl 1 1,832 145,2 48
  61. Đồ án tốt nghiệp 2 1,906 124,3 3 1,821 137,1 4 1,947 155,4 5 1,550 187,3 6 1,913 159,7 7 1,985 117,3 8 1,933 127,7 9 1,897 175,2 10 1,736 138,7 11 1,851 121,3 12 1,920 152,5 13 1,834 161,7 14 1,996 140,9 15 1,831 125,7 16 1,989 145,8 17 1,875 142,8 18 2,011 110,4 19 1,899 135,7 20 1,901 153,6 21 1,845 177,5 22 1,778 182,4 23 1,869 139,5 24 1,882 138,6 25 1,925 129,3 26 1,997 165,5 27 1,823 175,9 28 1,871 148,2 49
  62. Đồ án tốt nghiệp Từ bảng 3.1 cho thấy hầu hết các mẫu DNA sau khi tách chiết đều cho kết quả tỷ lệ OD 260/280 nằm trong khoảng 1,8 - 2 (khoảng cho phép DNA không bị nhiễm tạp chất), chỉ có vài mẫu như mẫu số 5, 10, 22 là có tỷ số OD 260/280 nằm ngoài khoảng cho phép 1,8 - 2 có thể do trong quá trình hút dịch nổi không cẩn thận hút lẫn cặn đáy dẫn tới việc DNA sau khi tách chiết không tinh sạch, ngoài ra cũng có thể do cắt mẫu quá nhiều nhưng sử dụng lượng Proteinase K không đủ để phân hủy hết protein. Ba mẫu 5, 10, 22 được xử lý bằng cách tách chiết lại và tăng lượng Proteinase K để tăng hiệu quả của quá trình tách chiết DNA, sau đó kiểm tra trên gel agarose và đo quang thì kết quả DNA của 3 mẫu đều đạt chất lượng tốt để thực hiện phản ứng PCR. Từ kết quả trên cho thấy quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Motoh, 1981) là thích hợp để có được chất lượng DNA tốt và nồng độ cao để thực hiện phản ứng PCR. 3.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi Microsatellite Dựa vào nhiệt độ bắt cặp của 19 cặp mồi microsatellite mà các tác giả đã tối ưu và công bố, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát lại dựa trên nhiệt độ tối ưu của ba tác giả đã công bố và dao động trong khoảng ± 4oC nhằm tìm ra nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho 19 cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị, hóa chất ở phòng thí nghiệm. 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite W10 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, GT3, NG12, đại diện cho 16 phép phối. 50
  63. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite W10 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. Từ kết quả hình 3.2 cho thấy các vạch DNA được đánh số 7 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 53°C) của cặp mồi microsatellite W10 đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác, các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.3.4.1. Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi microsatellite W10 là 53,0◦C. 51
  64. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite P1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. Hình 3.3. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. Từ kết quả hình 3.3 cho thấy các vạch DNA được đánh số 5 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 57,4oC) của cặp mồi microsatellite P1 đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác, các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.3.4.1. Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi microsatellite P1 là 57,4oC. 52
  65. Đồ án tốt nghiệp 3.2.3. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1 trên 4 mẫu tôm sú AA4, TT1, NG12, GT3 đại diện cho 16 phép phối. Hình 3.4. Tối ưu nhiệt độ bắt ở cặp mồi Microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ. Từ kết quả hình 3.4 cho thấy các vạch DNA được đánh số 4 (tương ứng với nhiệt độ bắt cặp 61,2oC) của cặp mồi microsatellite L1 đều cho vạch DNA rõ nét hơn so với các vạch DNA khác, các vạch DNA này tương ứng với nhiệt độ bắt cặp đã nêu ở bảng 2.3 mục 2.3.4.1. Từ đó, có thể chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho cặp mồi microsatellite L1 là 61,2oC. Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite trên 4 mẫu DNA bất kì đã tách chiết và tinh sạch 28 mẫu chân bơi đại diện cho 16 phép phối tôm sú đàn con (độ lặp lại hai lần). Kết quả cho thấy nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W2, W3, W4, W5, W6, W10 là 53oC, nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1, P2 là 57,4oC, P3, P4 là 55,8oC, nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P5, P6, P7 là 49,4oC, nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite L1, L2, L3, L4, L5, L6 là 61,2 oC. Đối với tác giả Wuthi (Wuthi và cộng sự, 2003), công bố nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi W là 55oC, nhiệt độ khảo sát lại là 53oC thì chênh lệch 2oC. Đối với các cặp mồi kí hiệu P mà tác giả Pan (Pan 53
  66. Đồ án tốt nghiệp và cộng sự, 2004), công bố nhiệt độ là 52oC và 56oC nhiệt độ khảo sát lại lần lượt là 49,4oC và 57,4oC chênh lệch với tác giả là 2,6oC và 1,6oC. Đối với các cặp mồi kí hiệu L mà tác giả Li (Li và cộng sự, 2007), công bố là 60oC, nhiệt độ khảo sát lại là 61,2oC chênh lệch với nhiệt độ tác giả công bố là 1,2oC. Nhiệt độ mà nhóm nghiên cứu khảo sát lại không chênh lệch quá nhiều so với các tác giả đã công bố, điều này chứng tỏ nhiệt độ mà nhóm nghiên cứu khảo sát là tối ưu cho từng cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị và hóa chất tại nơi thí nghiệm. Kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu của 19 cặp mồi microsatellite sau khảo sát được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Nhiệt độ bắt cặp (Ta) thích hợp cho các cặp mồi microsatellite Tên mồi Nhiệt độ bắt cặp Tên mồi Nhiệt độ bắt cặp oC oC W2 53 P5 49,4 W3 53 P6 49,4 W4 53 P7 49,4 W5 53 L1 61,2 W6 53 L2 61,2 W10 53 L3 61,2 P1 57,4 L4 61,2 P2 57,5 L5 61,2 P3 55,8 L6 61,2 P4 55,8 3.3. Khảo sát nồng độ MgCl2 Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.2, tiếp tục tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho 19 cặp mồi microsatellite. Ba kết quả minh họa khảo sát nồng độ MgCl2 của microsatellite W10, microsatellite P1 và microsatellite L1 được thể hiện ở mục 3.3.1, 3.3.2 và 3.3.3 dưới đây: 54
  67. Đồ án tốt nghiệp 3.3.1. Microsatellite W10 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite W10 Hình 3.5 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite W10. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.3.4.2. Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ 1,25 mM; 1,875 mM; 3,125 mM; 3,75 mM băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite W10. Vạch DNA với thể tích 2 µl tương ứng với nồng độ 2,5 mM cho băng vạch DNA rõ và đậm chứng tỏ nồng độ MgCl2 2,5 mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite W10. 3.3.2. Microsatellite P1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR 55
  68. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite P1 Hình 3.6 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite P1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.3.4.2. Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ 1,25 mM; 2,5 mM; 3,125 mM; 3,75 mM, băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite P1. Vạch DNA với thể tích 2 µl tương ứng với nồng độ 1,875 mM cho băng vạch DNA rõ và đậm chứng tỏ nồng độ MgCl2 1,875 mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite P1. 56
  69. Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Microsatellite L1 với các nồng độ MgCl2 trong phản ứng PCR Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 với cặp mồi microsatellite L1 Hình 3.7 minh họa cho kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 của cặp mồi microsatellite L1. Thể tích và nồng độ MgCl2 khảo sát lần lượt được thể hiện theo bảng 2.4 mục 2.3.4.1. Ta thấy MgCl2 ở các nồng độ 1,25 mM; 1,875 mM; 3,125 mM; 3,75 mM, băng vạch DNA mờ, không rõ chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite L1. Vạch DNA với thể tích 2 µl tương ứng với nồng độ 2,5 mM cho băng vạch DNA rõ và đậm chứng tỏ nồng độ MgCl2 2,5 mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite L1. Sau khi khảo sát nồng độ MgCl2 của 19 cặp mồi microsatellite ta đưa ra được nồng độ MgCl2 tối ưu cho từng cặp mồi như bảng 3.3. Bảng 3.3. Nồng độ MgCl2 tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR Tên mồi Nồng độ (mM) Tên mồi Nồng độ (mM) W2 2,5 P5 1,875 W3 2,5 P6 1,875 W4 2,5 P7 1,875 57
  70. Đồ án tốt nghiệp W5 2,5 L1 2,5 W6 2,5 L2 2,5 W10 2,5 L3 2,5 P1 1,875 L4 2,5 P2 1,875 L5 2,5 P3 1,875 L6 2,5 P4 1,875 3.4. Khảo sát hàm lƣợng DNA 3.4.1. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite W10 Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite W10 Nhìn vào hình 3.8, ta thấy hàm lượng DNA là 25 ng, 75 ng, 100 ng trong thể tích 1 phản ứng là 20 µl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 µl; 1,5 µl; 2 µl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi microsatellite W10 mờ, không rõ vạch. Điều này chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi W10 chưa tối ưu. Ở hàm lượng DNA 50 ng trong thể tích phản ứng là 20 µl tương ứng với thể tích DNA là 1,0 µl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp 58
  71. Đồ án tốt nghiệp mồi W10 rõ nét nhất và đậm chứng tỏ hàm lượng DNA 50 ng trong thể tích 20 µl là tối ưu cho cặp mồi microsatellite W10. 3.4.2. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho cặp mồi Microsatellite P1 Hình 3.9. Khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của cặp mồi microsatellite P1 Nhìn vào hình 3.9, ta thấy hàm lượng DNA là 25 ng, 50 ng, 100 ng trong thể tích 1 phản ứng là 20 µl tương ứng với thể tích DNA là 0,5 µl; 1,0 µl; 2 µl, thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi microsatellite P1 mờ, không rõ vạch. Điều này chứng tỏ ở các hàm lượng DNA này thì phản ứng khuếch đại PCR của cặp mồi P1 chưa tối ưu. Ở hàm lượng DNA 75 ng trong thể tích phản ứng là 20 µl tương ứng với thể tích DNA là 1,5 µl thì băng sản phẩm khuếch đại DNA của cặp mồi P1 rõ nét nhất và đậm chứng tỏ hàm lượng DNA 75 ng trong thể tích 20 µl là tối ưu cho cặp mồi microsatellite P1. Tiến hành khảo sát hàm lượng DNA khuôn tương tự cho các cặp mồi Microsatellite còn lại được bảng kết quả hàm lượng DNA khuôn tối ưu các cặp mồi như bảng 3.4. 59
  72. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Hàm lượng DNA khuôn tối ưu của các cặp mồi microsatellite cho một phản ứng PCR Hàm lượng DNA Hàm lượng DNA Tên mồi Khuôn (ng/20 µl thể Tên mồi Khuôn (ng/20 µl thể tích phản ứng PCR tích phản ứng PCR W2 50 P5 75 W3 50 P6 75 W4 50 P7 75 W5 50 L1 75 W6 50 L2 75 W10 50 L3 75 P1 75 L4 75 P2 75 L5 75 P3 75 L6 75 P4 75 3.5. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi Microsatellite 3.5.1. Khảo sát tính hoạt động của phản ứng PCR Sau khi có kết quả nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 tối ưu và hàm lượng DNA khuôn tối ưu cho mỗi cặp mồi microsatellite, thực hiện phản ứng PCR với các mẫu DNA ly trích từ 28 mẫu chân bơi tôm sú được lựa chọn ngẫu nhiên. Mục đích của việc thực hiện phản ứng PCR này nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của từng cặp mồi microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa. Bảng 3.5. Hiệu suất PCR và số alen của 19 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu DNA tôm sú. Tên Tổng số mẫu Hiệu Số Tên Tổng số mẫu Hiệu Số alen mồi có sản phẩm suất alen mồi có sản phẩm suất PCR PCR PCR PCR 60
  73. Đồ án tốt nghiệp W2 24 85,71 4 P5 25 89,28 5 W3 22 78,57 5 P6 23 82,14 5 W4 25 89,28 4 P7 28 100 4 W5 24 85,71 2 L1 26 92,86 5 W6 26 92,86 3 L2 22 78,57 5 W10 28 100 4 L3 25 89,28 4 P1 27 96,43 5 L4 25 89,28 5 P2 28 100 5 L5 22 78,57 5 P3 22 78,57 5 L6 23 82,14 2 P4 25 89,28 5 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR của 19 cặp mồi microsatellite Nhìn vào biểu đồ của hình 3.10 ta có thể thấy hiệu suất PCR của 19 cặp mồi microsatelle tương đối đồng đều và ổn định, dao động trong khoảng 78 - 100%. Trong đó có các cặp mồi microsatellite W10, W6, P1, P2, P7, L1 có hiệu suất cao nhất, dao động từ 92 - 100%, các cặp mồi còn lại có hiệu suất PCR vẫn nằm trong khoảng cao, dao động từ 78 - 89%. Từ kết quả trên có thể kết luận rằng việc tối ưu các yếu tố như nhiệt độ bắt cặp mồi, nồng đồ MgCl2, hàm lượng DNA khuôn đã giúp hiệu suất PCR được tăng cao, đồng thời phản ứng PCR được ổn 61
  74. Đồ án tốt nghiệp định. Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện số alen của mỗi cặp mồi microsatellite. Nhìn vào biểu đồ hình 3.11 ta thấy số alen của từng cặp mồi microsatellite dao động từ 3 - 5 alen. Các cặp mồi microsatellite được chọn để đánh giá biến dị di truyền cho các quần thể đòi hỏi các cặp mồi đó phải có tính đa hình cao (các cặp mồi có từ 5 alen trở lên). Vì vậy các cặp mồi microsatellite W10, W2, W6, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, L1, L2, L3, L4, L5 là phù hợp cho việc phân tích đánh giá biến dị di truyền của quần thể. Tuy nhiên, trong phân tích di truyền nếu xuất hiện quá nhiều null alleles sẽ ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Vì thế ngoài tính đa hình cao thì hiệu suất PCR của các cặp mồi cũng ảnh hưởng tới kết quả phân tích di truyền. Từ đó chọn ra các cặp mồi vừa có tính đa hình cao (có 5 alen trở lên) vừa đạt hiệu suất PCR lớn như các cặp mồi W2, W10, L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7 để tiếp tục phân tích, đánh giá biến dị di truyền cho 69 gia đình mẫu tôm sú trên 16 phép phối nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia. 3.5.2. Sàng lọc các các cặp mồi Microsatellite Mục đích sàng lọc là chọn ra các cặp mồi có tính đa hình cao và kết hợp đồng thời chỉ số hiệu suất PCR. Dựa vào bảng 3.5 nhóm nghiên cứu đã chọn ra 10 cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất tiếp tục phân tích hàng loạt trên 69 gia đình mẫu DNA tôm sú để phân tích biến dị di truyền của 16 phép phối. Kết quả minh họa được thể hiện trong hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14 dưới đây: 62
  75. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite L1 Hình 3.13. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P4 63
  76. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Khảo sát tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi Microsatellite P1 Từ kết quả ở hình 3.12, hình 3.13 và hình 3.14, các vạch PCR đều sáng và rõ nét, không có hiện tượng bị nhòe và tạo sản phẩm phụ nhiều, cho thấy tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite ổn định. Các kết quả về nhiệt độ bắt cặp tối ưu, nồng độ MgCl2 tối ưu và hàm lượng DNA tối ưu góp phần ổn định phản ứng PCR. 3.6. Khảo sát đa dạng di truyền của mƣời sáu phép phối tôm sú đàn con phân tích. 3.6.1. Tính đa dạng di truyền của mười sáu phép phối tôm sú đàn con Tính đa dạng di truyền được đánh giá qua các chỉ số như: giá trị đa hình các alen trên locus (Na), dị hợp tử phát hiện (Ho), dị hợp tử mong đợi (He), phong phú alen (Ar), thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC) và cân bằng di truyền Hardy - Weinberg. Sau khi xử lý bằng phần mềm Cevus và phần mềm Fstat thì các chỉ số trên được trình bày ở bảng 3.6 như sau. Bảng 3.6. Đặc điểm đa dạng di truyền chung trên microsatellite của 16 tổ hợp tôm sú đàn con trong nghiên cứu. Locus Na Ho He PIC Ar HWE P1 4 0,371 0,701 0,646 3,637 P2 3 0,242 0,608 0,530 2,865 P4 5 0,210 0,600 0,525 4,137 64