›

Đồ án Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần Edwardsiella ictaluri

pdf 53 trang thiennha21 12/04/2022 6810
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần Edwardsiella ictaluri", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_dang_gia_muc_do_anh_huong_cua_tao_haematococcus_pluvia.pdf

Nội dung text: Đồ án Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần Edwardsiella ictaluri

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO Haematococcus pluvialis LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CÁ TRA NUÔI (Pangasianodon hypophthalmus) ĐỐI VỚI BỆNH GAN THẬN MỦ DO VI KHUẨN (Edwardsiella ictaluri) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. VÕ MINH SƠN Sinh viên thực hiện : NGÔ THANH PHONG MSSV: 0851110182 Lớp: 08DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là một trong những loài thủy sản nước ngọt xuất khẩu chiến lược của Việt Nam.Theo Tổng cục Thủy sản năm (2011), diện tích nuôi cá tra đạt 5.400 ha và sản lượng đạt trên 1,141 triệu tấn trong năm 2010; diện tích nuôi và sản lượng cá tra ước đạt 6.000 – 6.300 ha và 1,2 – 1,3 triệu tấn năm 2011 (Phạm Thị Kim Oanh, 2011). Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự suy thoái môi trường do nước thải và bùn ao nuôi cá tra thâm canh, dẫn đến bùng phát dịch bệnh gây thiệt hai cho người nuôi cá tra. Trong đó bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri xảy ra thường xuyên gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi cá. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của người nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên việc làm dụng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn đã dẫn đến hệ lụy là tạo ra những chủng vi khuẩn, virus có khả năng kháng lại kháng sinh, tăng độc lực. Do đó nhiều phương pháp thân thiện với môi trường đã và đang được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như vaccine, probiotic, chất tăng cường hệ miễn dịch. Trong đó chất kích thích miễn dịch cũng đang được sử dụng rất rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích tăng cường sức đề kháng thông qua tăng cường hệ miễn dịch không đặc hiệu, tiết ra các chất kháng khuẩn, kích thích khả năng sinh trưởng và phát triển. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề tài “Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần Edwardsiella ictaluri” nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của cá tra đối với vi khuẩn gây bệnh. 1
  3. Đồ án tốt nghiệp 1.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên của cá tra nuôi kháng bệnh gan thận mủ. 1.3 Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis đến khả năng kháng bệnh bệnh gan thận mủ của cá tra nuôi. - Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên cá tra nuôi thông qua các thông số miễn dịch . Hoạt động thực bào (Phagocyte activity) - . Sản sinh O2 (Superoxide anion production) . Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity assay) 2
  4. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.1.1 Giới thiệu chung Cá tra 2.1.1.1 Phân bố Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở một số quốc gia như: Việt Nam, Lào, Thái Lan, Campuchia Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang (Đồng Thanh Hà và ctv, 2009). 2.1.1.2 Phân loại Giới: Animalia Ngành: Chordata Phân ngành: Vertebrata Lớp: Actinopterygii Phân lớp: Neopterygii Liên bộ: Ostariophysi Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Hình 2.1: Cá Tra [ 50] Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) 2.1.2 Đặc điểm cá Tra 2.1.2.1 Đặc điểm sinh lý Cá tra có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, miệng rộng và có 2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10%0), chịu đựng được nước phèn có pH > 4. Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể 3
  5. Đồ án tốt nghiệp sống được trong các ao hồ chật hẹp, thiếu oxi nên nuôi được mật độ rất cao (Phạm Văn Khánh và ctv, 2011). 2.1.2.2 Đặc điểm sinh học cá tra Hiện nay đã có 11 loài thuộc họ cá tra được tìm thấy ở Việt Nam. Khi nuôi trong ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn: mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp. Trong tự nhiên, cá tra có thể sống trên 20 năm. Tuổi thành thục của cá tra từ 3 - 4 năm. Vào mùa thành thục từ tháng 4 trở đi cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông MêKông của Việt Nam. Bãi đẻ của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia trở lên. Tại các bãi đẻ, cá bố mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy tinh ven bờ. Sau khi nở, cá bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi dòng theo sông MêKông về phía Việt Nam (Phạm Văn Khánh và ctv, 2011). 2.1.3 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có hệ thống sông rạch chằng chịt, là điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp và đánh bắt thủy sản. Từ năm 1940 nghề nuôi cá nước ngọt bắt đầu phổ biến và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá basa (Pangasius bocourti) là loài nuôi trồng thủy sản được nuôi thông dụng nhất đang đươc phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL (chủ yếu ở 2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp). Đến nay, cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh thành như Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang (Tạp chí thủy sản, 2012). 4
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.1.4 Một số bệnh thường gặp trên cá tra  Bệnh đốm đỏ Tác nhân gây bệnh Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễn trùng máu, bệnh sởi Là bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra. Ngoài ra, một số trường hợp phân lập được vi khuẩn A. sobria, A. caviae hoặc Pseudomonas sp trên cá bị bệnh đốm đỏ. Dấu hiệu bệnh lý Bệnh đốm đỏ có 4 loại hình biểu hiện qua mức độ và trạng thái bệnh của cá: bệnh cấp tính, bệnh thứ cấp tính, bệnh ác tính, bệnh mãn tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).  Bệnh nấm thủy mi Tác nhân gây bệnh Nguyên nhân gây ra bệnh này là 2 giống nấm thường có trong nước, nhất là nước bẩn và trong bùn ao là Saprolegnia và Achlya, thuộc họ Saprolegniaceae. Sợi nấm dài và trong, có phân nhánh hoặc không phân nhánh, không có vách ngăn. Phần dưới cắm sâu vào tổ chức cơ thể cá, phần trên lơ lửng trong nước trông như bông, vì thế người nuôi cá miền Nam gọi là bệnh "bệnh bọ gòn". Dấu hiệu bệnh lý Khi mới ký sinh, mắt thường khó nhìn thấy, phần cuối sợi nấm đâm sâu vào khe của tổ chức da và mang của cá. Phần đầu lơ lửng trong nước có màu trắng. Cá có cảm giác ngứa ngáy, gầy, đen sẫm. Bệnh thường xảy ra ở cá mè, rô phi, tra bị thương Khi nấm đã phát triển trong tổ chức của cá, điều kiện phục hồi bệnh này khó khăn. Nấm ngày càng phát triển lớn hơn. Vi khuẩn có điều kiện xâm nhập vào làm bệnh nặng thêm. Kết quả dẫn đến sự chết của các tổ chức của cá và làm chúng rời ra khỏi cơ thể, tuy cá còn sống mà trên thân có chỗ chỉ còn xương. 0 Khi ấp trứng cá gặp thời tiết lạnh, nhiệt độ nước dưới 20 C trong một thời gian ngắn nấm thủy mi phát triển bao phủ toàn bộ trứng. Nấm làm hư trứng vì nấm hút chất 5
  7. Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng của trứng và tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng trong nước phát triển trên bề mặt của vỏ trứng, làm cho trứng bị ung và thối rữa nhanh (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).  Bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra Tác nhân gây bệnh Tác nhân chính gây bệnh được xác định là Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv, 2002). Dấu hiệu bệnh Dấu hiệu bên ngoài: Cá bệnh nổi trên mặt nước , bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt nhạt nhưng chỉ có dấu hiệu giảm ăn trong một thời gian ngắn sau đó ăn trở lại bình thường. Trên cơ thể có những đốm xuất huyết ở mõm, các gốc vi, nắp mang, hậu môn, mang màu sắc nhạt, bụng chướng to, đôi khi có những hiện tượng mắt lồi (Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv, 2008). Dấu hiệu bên trong: Cá bệnh dạ dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng hơi đỏ bên trong xoang nội quan. Trên gan, thận, tỳ tạng có những đốm nhỏ màu trắng đục kích cỡ không đều (đường kính khoảng 1-3 mm). Đôi khi có hiện tượng nhũng thận ở cá bệnh nặng. Cá mới chớm bệnh chỉ thấy xuất hiện những đốm trắng trên thận (Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv, 2008). Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006) cá bệnh còn có dấu hiệu bụng trương to, xuất huyết gốc vây, mắt lồi, xung quanh miệng xuất hiện các đốm xuất huyết. Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra Bệnh xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá tra thâm canh trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó lan rộng ra hầu hết các tỉnh ĐBSCL trong thời gian gần đây (Từ Thanh Dung và ctv, 2009). Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá tra, tập trung ở giai đoạn cá giống và cá thịt có khối lượng nhỏ hơn 300 gram. Bệnh có thể gây chết tích 6
  8. Đồ án tốt nghiệp lũy 10-90% cá nuôi nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời khi bênh xảy ra (Từ Thanh Dung và ctv, 2009). Phòng và trị bệnh E.ictaluri trên cá tra Trong quá trình nuôi tác phòng ngừa dịch bệnh luôn được xem là quan trọng hơn chữa trị. Việc phòng ngừa bệnh tốt không những hạn chế sự xuất hiện của dịch bệnh mà còn là tiêu chí hàng đầu làm tăng giá trị sản phẩm cá tra, giảm chi phí nuôi và tăng lợi nhuận cho người nuôi. Có thể áp dụng các biện pháp sau để phòng trị bệnh mủ gan trên cá tra: quản lý tốt môi trường ao nuôi, mật độ thả nuôi thích hợp, chế độ dinh dưỡng phù hợp, sử dụng chế phẩm vi sinh học, sử dụng vaccine để phòng (Từ Thanh Dung và ctv, 2005). 2.2 Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2.1 Hệ thống phân loại theo Bergey Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Edwardsilla Loài: Edwardsiella ictaluri Hình 2.2: Vi khuẩn 2.2.2 Đặc điểm sinh hóa Edwardsiella ictaluri [48] Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi, có dạng hình que, kích thước 1 x 2-3 µm, không sinh bào tử. Trên môi trường Blood agar sau 48 giờ khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn, bờ đều bóng, đường kính từ 1,5 – 2 mm. Phát triển tốt trên môi trường thạch máu, BHI, nhiệt độ thích hợp ở 28 - 300C, pH 6 - 7 (Holt và ctv, 1994) 7
  9. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1: Bảng thử nghiệm sinh hóa của Edwardsiella ictaluri (Holt và ctv, 1994) Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Indol - Methyl red - Simmons Citrate - H2S - Lysine decarboxylase + Ornithin decarboxylase D Motility - Malonate - D-Glucose, gas production D Acid production from: L-Arabinose - Lactose - D-Mannitol - Melblose - L-Rhamnose - D-Sorbitol - Trehalose - D-Xylose - ONPG - Chú thích: D (Depend): phụ thuộc tùy từng nơi mà có kết quả dương hoặc âm. 8
  10. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Con đường xâm nhiễm của Edwardsiella ictaluri Từ nguồn nước vi khuẩn có thể xâm nhập vào cá qua 2 con đường:  Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não. Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến sọ và da (thường được gọi là “hole in the head”) (Shotts và ctv, 1986).  E.ictaluri có thể theo đường tiêu hóa và đi vào trong máu xuyên qua ruột dẫn đến bệnh nhiễm trùng máu. Bằng con đường này, vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến những mạch mao quản bên trong da, đây là nguyên nhân dẫn đến hoại tử và làm mất sắc tố của da cá (Shotts và ctv, 1986). Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn. A B Hình 2.3: Cá Tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Cá Tra bị bệnh mũ gan thận với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B). 9
  11. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4 Mùa vụ xuất hiện bệnh và mức độ gây thiệt hại Bệnh thường xuất hiện trên cá tra ở các mô hình nuôi thâm canh trong điều kiện môi trường bất lợi. Theo Plumb (1999) khả năng gây bệnh của E. ictaluri trên cá nheo Mỹ tùy theo điều kiện nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 18- 28oC. Ở nước ta nhiệt độ nước dao động là từ 26-28 oC vì thế đây là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) bệnh mủ gan thường xuất hiện vào mùa lũ và cao điểm từ tháng 7, 8. Cũng theo Lê Thị Bé Năm (2002) bệnh xuất hiện vào mùa lũ trong năm khi nước mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm, giảm khả năng đề kháng với bệnh, chính vì thế bệnh dễ dàng bộc phát. Tuy nhiên trong 2 năm gần đây, bệnh này hầu như xuất hiện trên cá tra quanh năm. Trong 1 vụ nuôi, bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 – 4 lần. Tỉ lệ hao hụt từ 10 – 50%, tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và quản lý. 2.3 Tổng quan tảo Haematococcus pluvialis 2.3.1 Phân loại Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Bộ: Volvocales Họ: Haematococcaceae Giống: Haemotococcus Loài: Pluvialis (Lorenz và Cysewski, 2000) Hình 2.4: Haematococcus pluvialis [49] 10
  12. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Đặc điểm Haematococcus pluvialis là loài vi tảo nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi. Loài tảo này có vòng đời phức tạp với 2 dạng tế bào. Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn là các tế bào sinh dưỡng màu xanh có hai roi, có thành tế bào, kích thước từ 10 - 20 µm, có khả năng chuyển động. Khi điều kiện môi trường không thuận lợi (thiếu dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng cao, nhiệt độ cao ), tế bào tảo chuyển sang dạng nang bào tử hình cầu, mất roi, không có khả năng chuyển động. Ở giai đoạn này, đường kính tế bào tảo tăng mạnh từ 10 - 20 µm lên 40 - 50 µm, thành tế bào dầy và chứa 1 lượng lớn astaxanthin (4 - 6% trọng lượng khô) có thể tích lũy (Đặng Diễm Hồng và ctv, 2010). Hình 2.5: Vòng đời tảo Haematococcus pluvialis. (A) Giai đoạn tảo có màu xanh và 2 roi; (B) Giai đoạn trung gian không thể di động; (C) Giai đoạn trung gian tạo một lượng carotenoid; (D) Giai đoạn nang chứa một lượng lớn carotenoid (Kamath, 2007). 11
  13. Đồ án tốt nghiệp Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về điều kiện nuôi trồng tảo H.pluvialis để tách chiết hợp chất astaxanthin đã được công bố. Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào nuôi trồng thành công tảo H.pluvialis trong phòng thí nghiệm lẫn qui mô lớn. Khó khăn lớn nhất khi nuôi trồng loại tảo này là tốc độ sinh trưởng rất chậm, chu trình sống phức tạp, chuyển qua nhiều giai đoạn khác nhau, xen kẽ giữa các tế bào chuyển động và không chuyển động Mặc khác, để sản xuất astaxanthin một cách có hiệu quả từ tảo H.pluvialis đòi hỏi qui trình công nghệ nuôi cấy 2 pha: pha đầu tảo được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, các tế bào chủ yếu là pha sinh dưỡng, có màu xanh. Sau khi đạt mật độ nhất định, tảo được chuyển sang nuôi cấy ở pha thứ 2 bất lợi về điều kiện môi trường như đói dinh dưỡng (nito hoặc photpho), nhiệt độ hay cường độ chiếu sáng cao Lúc này tế bào tảo từ màu xanh chuyển sang dạng nang bào, màu đỏ chứa chủ yếu astaxanthin (Đặng Diễm Hồng và ctv, 2010). 2.3.3 Ứng dụng tảo Haematococcus pluvialis Từ những năm 1930, tảo H.pluvialis đã được biết đến rộng rãi là nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên. Trong những năm gần đây, loài tảo này lại thu hút sự quan tâm nghiên cứu do nhu cầu sử dụng astaxanthin ngày càng cao. Nhiều vi sinh vật như nấm, địa y, vi khuẩn, vi tảo, khác cũng có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm lượng astaxanthin ở tảo H.pluvialis là cao nhất. Astaxanthin được sử dụng bổ sung vào thức ăn cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản như cá hồi, tôm hùm nhằm tăng chất lượng thịt hoặc tạo màu sắc rực rỡ cho cá cảnh. Astaxanthin được tách chiết từ tảo còn được bổ sung vào các loại sản phẩm mỹ phẩm, dược phẩm cho con người (Đặng Diễm Hồng và ctv, 2010). Tảo H.pluvialis được ứng dụng như một sắc tố ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản. Ngoài ra nó còn có khả năng như một chất chống oxi hóa, tiền vitamin A, tăng cường miễn dịch, tiền thân hormone, sinh sản và phát triển (Lorenz và ctv, 2000). 12
  14. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4 Astaxanthin 2.3.4.1 Đặc điểm Astaxanthin là sắc tố thuộc họ xanthophyll (Higuera–ciapara và ctv, 2006), có nguồn gốc là lycopen (Olaizola, 2003). Astaxanthin tổng hợp keto - carotenoid (3,3’- dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) phổ biến nhất sắc tố màu hồng đỏ có nhiều ở sinh vật sông hồ và biển, cá hồi (Dragos và ctv, 2010). Carotenoid là những sắc tố tan trong lipid, tham gia vào các quá trình của quang hợp của sinh vật. Đến nay có hơn 700 carotenoid trong tự nhiên được xác định. Nó chịu trách nhiệm tạo màu sắc cam và đỏ cho thực vật và tảo và cho nhiều màu xanh, đỏ, tím ở động vật thủy sản. Chỉ có thực vật phù du, tảo, một số vi khuẩn và nấm tổng hợp carotenoid. Astaxanthin có mặt nhiều ở một số loài thủy sản như cá hồi, cá vền biển, tôm và tôm hùm ( Wiener và ctv, 2003). Bảng 2.2: Nguồn Astaxanthin trong tự nhiên Nguồn Astaxanthin tự nhiên Nồng độ Astaxanthin (ppm) Cá hồi 5 Phiêu sinh vật 60 Nhuyễn thể 120 Tôm Arctic 1.200 Nấm Phaffia 8.000 Haematococcus pluvialis 40.000 Trong tự nhiên, thực vật, nấm, vi khuẩn, tảo đặc biệt sản xuất astaxanthin. Sắc tố này thông qua chuỗi thức ăn như vi tảo được tiêu thụ bởi động vật phù du và động vật giáp xác khác sau đó được tiêu thụ bởi cá. Một số loài động vật giáp xác (Penaeus japonicus và Penaeus monodon) có khả năng tiết ra enzyme để phân giải carotenoid thành astaxanthin (Lorenz và ctv, 2000). 13
  15. Đồ án tốt nghiệp Astaxanthin có mối liên hệ chặt chẽ với các carotenoid khác như: β - carotene, zeaxanthin và lutein. Sự hiện diện của hydroxyl và keto kết thúc trên mỗi vòng ionone giải thích khả năng este hóa, chống oxi hóa cao hơn, khả năng phân cực cao hơn các carotenoid khác. Astaxanthin tự do đặc biệt nhạy cảm với quá trình oxy hóa (Guerin và ctv, 2003). Astaxanthin rất được quan tâm nghiên cứu bởi nó được phát hiện có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn β-caroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Một số nghiên cứu khác chứng minh astaxanthin còn có khả năng chống oxi hóa mạnh hơn cả tocopherol (Higuera–ciapara và ctv, 2006). Astaxanthin còn được xem như là chất có khả năng chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các chất chống oxy hóa khác như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β–carotenoid, và gấp 500 lần so với α-tocopherol. Một ứng dụng khác của astaxanthin là làm tăng hoạt động của các tế bào B và tế bào T–helper để sản xuất kháng thể như immunoglobulin A, M, G (Cysewski và ctv, 2004). Do đó astaxanthin đang ngày càng được sử dụng nhiều trong y dược và công nghệ mỹ phẩm như tạo ra những sản phẩm bảo vệ da tránh tia cực tím (O’Connor và O’Brien, 1998), chống tác nhân gây ung thư bằng hóa học (Nishino và ctv, 1998), tăng cường hệ miễn dịch (Jyonouchi và ctv, 1996) và nhiều ứng dụng khác trên lĩnh vực sức khỏe và dinh dưỡng cho người (Guerin và ctv, 2003). 2.3.4.2 Tính chất hóa học Astaxanthin là một tetraterpenoids, trong phân tử của chúng có 2 carbon bất đối xứng ở vị trí 3 và 3’ của vòng bezenoid do đó nó có 4 dạng đồng phân lập thể, cấu trúc của nó có một số điểm đặc trưng riêng so với một số hợp chất thuộc nhóm carotenoids khác như -caroten, zeaxanthin, luetin đó là có sự hiện diện nhóm hydroxy và nhóm keto cuối mạch trên vòng ionone, điều đó cho thấy chúng có khả năng tạo ester hóa và khả năng chống oxi hóa cao hơn các hợp chất carotenoid khác (Orosa và ctv, 2005; Zhao và ctv, 2009). Tên hóa học: 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione 14
  16. Đồ án tốt nghiệp Công thức phân tử: C40H52O4 Khối lượng phân tử: 596.82 Hình 2.6 Cấu hình đồng phân của Astaxanthin (Kamath, 2007) 15
  17. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.3 Vai trò Astaxanthin  Chất chống oxy hóa Carotenoid là chất chống oxy hóa mạnh có thể hấp thụ năng lượng kích thích oxi nguyên tử vào trong chuỗi carotenoid ngăn chặn các phân tử hoặc các mô bị hư hỏng. Astaxanthin bảo vệ màng photpholipid và các acid béo chống lại quá trình peroxy hóa. Đặc tính chống oxi hóa của astaxanthin có một vai trò quan trọng bảo vệ chống tia cực tím, ung thư, nhiễm trùng Helicobacter pylorri gây viêm loét (Guerin và ctv, 2003). Carotenoid là chất chống oxi hóa cực kì hiệu quả, nó có khả năng loại bỏ các gốc tự do bằng các phản ứng lại với chúng để tạo ra các sản phẩm vô hại hoặc bằng các phá vỡ các gốc tự do của phản ứng dây chuyền (Dutta và ctv, 2005). Các chất chống oxi hóa có thể làm giảm nguy cơ gây đột biến còn đối với các tế bào ung thư thì ngăn chặn các tế bào phân chia liên tục. Trong tế bào người có một mảng nội sinh chất chống oxi hóa như catalase, superoxide dismutase. Tuy nhiên, các chất ngoại sinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxi hóa được bổ sung vào cơ thể thông qua chế độ ăn như ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol (vitamin E), carotenoid (Dore và ctv, 2008). Astaxanthin bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxi hóa thông qua cơ chế . Ngăn chặn các oxi nguyên tử và tiêu hao năng lượng dưới dạng nhiệt. . Phá vỡ các phản ứng dây chuyền của peroxide (Lorenz và ctv, 2000).  Tăng cường hệ miễn dịch Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ sung vào thức ăn. Astaxanthin không chỉ dùng để cung cấp sắc tố cho cá mà còn giúp tăng sức đề kháng và khả năng sinh sản (Cysewski and Lorenz, 2004). Một yếu tố quan trọng khác trong hệ thống miễn dịch chính là T-helper (tế bào Th) mà chủ yếu là kích hoạt tế bào kháng nguyên. Astaxanthin kích thích việc sản sinh tế bào T-heper kháng thể. Trong các thí nghiệm nuôi cấy tế bào, astaxanthin kích thích 16
  18. Đồ án tốt nghiệp sự gia tăng tế bào tuyến ức và tế bào lá lách sản xuất globulin miễn dịch và yếu tố gây hoại tử Interleukin - 1A. Bên cạnh đó, astaxanthin cũng kích thích kháng nguyên T sản xuất kháng thể ở loài chuột. Ở người, astaxanthin cũng tăng cường sản xuất ra các immunoglobulin ở các tế bào đơn nhân ngoại vi để đáp ứng sự gia tăng kháng thể. Tóm lại, những nghiên cứu về astaxanthin đều có khả năng kích thích miễn dịch cả trong môi trường in vivo và in vitro (Dore và ctv, 2008). Astaxanthin kích thích hệ thống miễn dịch mạnh mẽ bởi các nhân tố sau . Kích thích sự sinh sản của tế bào bạch huyết . Tăng số lượng tế bào T . Không gây hại đến DNA . Tăng cường khả năng giết các tế bào gây độc (Capelli và ctv, 2007). 2.3.5 Độ an toàn Tảo Haematococcus đã được Nhật Bản sử dụng để bổ sung vào thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, Haematococcus cũng được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản như một sắc tố và nguồn vitamin cho cá hồi, tôm, cá cảnh (Lorenz và ctv, 2000). Astaxanthin tự nhiên được bổ sung vào chế độ ăn của người với một lượng rất nhỏ đặc biệt là từ cá hồi và các động vật giáp xác. Astaxanthin được tách chiết và bổ sung vào thức ăn từ năm 1999. Nguồn astaxanthin được chiết xuất phổ biến nhất là tảo Haematococcus pluvialis (Dore và ctv, 2008). 17
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.7 Con đường chuyển hóa astaxanthin trong Haematococcus pluvialis (Kamath, 2007) Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về sự an toàn của astaxanthin vào chế độ ăn nhưng nó ít được biết về khả năng chuyển hóa carotenoid trong cơ thể con người. Sự chuyển hóa các carotenoid ở động vật có vú có liên quan đến một vài các yếu tố sau: sự vận chuyển của các mixen lipid trong ruột non, sự hấp thu bởi các tế bào niên mạc ruột vận chuyển đến hệ thống bạch huyết và cuối cùng là sự lắng đọng của các carotenoid chuyển hóa cụ thể đến các mô. Quá trình hấp thụ và chuyển hóa astaxanthin khá tốt được nghiên cứu nhiều ở chim, cá, động vật giáp xác. Nhưng chỉ có một vài nghiên cứu đề cập đến sự hấp thụ trên người và 1 vài động vật có vú khác. Trong tế bào gan 18
  20. Đồ án tốt nghiệp chuột, astaxanthin được chuyển hóa ở 2 dạng hợp chất: 3-hydroxy-4-oxo-β-ionone và 3-hydroxy-4-oxo-7,8-dihydro- β-ionone. (Dore và ctv, 2008). 2.3.6 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản Astaxanthin hay beta-carotene (100 - 200 mg/kg thức ăn) từ tảo Dunaliella salina và red yeast Phaffia rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên của cá hồi rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) (Amar và ctv, 2004). Cùng tác giả (Amar và ctv 2000, Amar và ctv, 2001) nghiên cứu sử dụng β - carotene và astaxanthin tổng hợp có khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên trên cá hồi (Rainbout trout). 19
  21. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU 3.1.1 Mẫu thí nghiệm 3.1.1.1 Mẫu cá dùng cho thí nghiệm thực nghiệm Cá có trọng lượng 20 g/con (mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam Bộ), được kiểm tra và xác định không nhiễm E. ictaluri trước khi thí nghiệm. Cá được thuần dưỡng trong bể compozit 20 m3 trong 4 tuần tại phòng thí nghiệm ướt của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II. Trước khi tiến hành thí nghiệm bắt ngẫu nhiên 10 con cá để kiểm tra bằng cách mổ và cấy trên môi trường thạch máu kiểm tra vi khuẩn. Sau thời gian thuần trong bể compozit cá được chuyển vào bể kính ít nhất 1 tuần trước khi bố trí thí nghiệm với mật độ 30 cá/bể. Hệ thống nuôi bán tuần hoàn sử dụng máy lọc khí và có sục khí liên tục. Cá được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp dạng viên nổi . Địa điểm nuôi thử nghiệm nuôi trồng thủy sản ở số 139/1552 Lê Đức Thọ Phường 13 Quận Gò Vấp. 3.1.1.2 Tảo Haematococcus pluvialis khô Sinh khối tảo Haematococcus pluvialis khô được phòng Công Nghệ Tảo, Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cấp cho Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II (RIA II). Khối lượng : 1,3 kg. 20
  22. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1 Thức ăn GP và sinh khối tảo khô Haematococcus pluvialis 3.1.1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Gly09M từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thùy sản II để làm vật liệu nghiên cứu. Hình 3.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluria trên môi trường thạch máu 21
  23. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2 Môi trường và hóa chất Môi trường Blood agar (BA) Brain Heart Infusion Broth (BHI broth) Hóa chất Cồn; NaCl; H2SO4, NaOH, KOH L-fifteen (Sigma) Dung dich PBS Dịch lòng trắng trứng gà Đệm natriphosphat Dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus luteus Dung dịch poly-L-lysine Zymosan (Sigma) Nitroblue tretrazolium (NBT) McHBSS Dimethylsulfoxide (DMSO) Thuốc nhuộm fluorescent latex 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ Tủ cấy vô trùng (Microflow). Máy lắc (Orbital incubator SI 50). Máy li tâm lạnh (Hermle) Tủ sấy (Memmert). Tủ ấm (Memmert). Tủ lạnh SANYO. Cân điện tử bốn số lẻ Precise XB 220A. Nồi hấp vô trùng (HIRAYAMA). Các loại micropipet (20 µl,100-1000 µl, 20-200 µl). 22
  24. Đồ án tốt nghiệp Các loại đầu típ. Erlen loại 1000 ml, 500ml, 250 ml. Ống đong 100 ml, 1000 ml. Đĩa petri. Ống nghiệm, eppendort Bộ lọc 0,2 µm Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX 50, Tokyo, Japan Microrray 96 giếng, 24 giếng, 12 giếng. Kim tiêm 1ml; 5 ml; 10ml. Hồ kiếng kích cỡ (0,35m; 0,2m; 0,2m) Bộ lọc nước, hệ thống cung cấp oxy liên tục. Máy Elisa. Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy thủy tinh. 23
  25. Đồ án tốt nghiệp 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm 3.2.1.1 Chuẩn bị thức ăn Chuẩn bị thức ăn cho cá: cân thức ăn Green fish cho vào 4 hủ mỗi hủ 172,8 gam. Sinh khối tảo đem đi pha loãng ở 2 nồng độ: 100 mg và 200 mg Bảng 3.1 Mật độ tảo và khối lượng tảo cân trộn vào thức ăn Nghiệm thức Nồng độ tảo Khối lượng thức ăn Khối lượng tảo (mg/kg) (gram) (gram) NT 100 mg/kg 100 170 0.864 NT 200 mg/kg 200 170 1.73 Đối chứng 170 0 Sau khi cân khối lượng tảo cho vào nước muối sinh lý 0.9% pha loãng vortex đều phối trộn với thức ăn. Trộn đều thức ăn bổ sung thêm dầu mực sấy 30oC trong 15 phút  thành phẩm. Hình 3.3 Thức ăn trộn Haematococcus pluvialis 24
  26. Đồ án tốt nghiệp 3.2.1.2 Chuẩn bị chủng vi khuẩn gây bệnh Chủng Edwardsiella ictaluri được hoạt hóa trong môi trường Blood agar, ủ ở 28oC – 30oC trong 24 giờ - 36 giờ. Thu sinh khối E .ictaluri trên môi trường thạch máu. Sau đó huyền phù cho vào dung dịch nước muối đo OD tiến hành xác định mật độ vi khuẩn. 3.2.1.3 Xác định LD50 Xác định mật độ vi khuẩn gây chết 50% (LD50) dựa trên phương pháp của Reed and Muench (1938). Khảo sát tỉ lệ chết của cá sau khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri Gly 09M (tiêm vào xoang bụng) với mật độ: 1x103, 1x104, 1x105, 1x106 cfu/ml. Từ đó xác định liều gây chết gấp 2xLD50 cho thí nghiệm cảm nhiễm (Newaj- Fyzul và ctv, 2007).  Bố trí thí nghiệm 25
  27. Đồ án tốt nghiệp Cá tra giống 20 gam/con Thuần trong bể composite 20m3 trong 4 tuần Cho ăn với thức ăn bình thường Thử nghiệm 4 nồng độ vi khuẩn E .ictaluri khác nhau. Mỗi bể 15 con cá, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần 103 cfu/ml 104 cfu/ml 105 cfu/ml 106 cfu/ml Đếm số cá chết Tính toán kết quả 26
  28. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Hệ thống bố trí thí nghiệm thực nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại. Chuẩn bị 12 bể kính mỗi bể 15 con cá có khối lượng trung bình 20 gam/con. Thử nghiệm với 4 nồng độ khác nhau: 103 cfu/ml, 104 cfu/ml, 105 cfu/ml, 106 cfu/ml trong 20 lít nước ngâm trong 60 phút sau đó nâng mực nước lên 50 lít. Theo dõi và ghi nhận cá chết hàng ngày cho đến khi cá không chết liên tục trong 3 ngày thì kết thúc thí nghiệm. Trong quá trình thí nghiệm, nhiệt độ nước và pH được theo dõi liên tục dao động từ 26 – 28oC, pH dao động từ 6 – 7. Công thức xác định LD50 của Reed và Muench (1938) PD = (lũy thừa gây chết trên 50% cao nhất - PD) LD50 = 10 27
  29. Đồ án tốt nghiệp 3.2.1.4 Hiệu quả kháng bệnh gan thận mủ của tảo Haemtococcus pluvilis bằng phương pháp gây bệnh thực nghiệm Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) với nồng độ 0,2 ppt trong 3 – 5 phút. Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho cá 10 – 40 g để đảm bảo an toàn cho cá khi thử nghiệm. Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá ở vị trí giữa hai vây bụng cá tra và chếch một góc 45o. Thể tích tiêm của mỗi con cá là 0,2 ml.  Bố trí thí nghiệm thực nghiệm 28
  30. Đồ án tốt nghiệp Cá thuần trong bể compozit trong 30 ngày Khối lượng trung bình mỗi con cá 20 gam/con Chuyển vào bể kính có sử dụng hệ thống sục khí Mỗi nghiệm thức 30 con cá Cho ăn thức ăn có bổ sung H.pluvialis trong 28 ngày rồi cảm nhiễm Đối NT 1 NT 2 Đối chứng (thức ăn (thức ăn chứng dương bổ sung bổ sung âm (thức ăn tảo tảo (thức ăn GF) 100mg) 200mg) GF) Tiêm 0.2ml vi khuẩn Tiêm 0,2 ml E.ictaluri nước muối sinh lý 2xLD50 Đếm tổng số cá chết Tính toán kết quả 29
  31. Đồ án tốt nghiệp Cá có trọng lượng 20 g/con (mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam Bộ) được thuần 2 tuần trong bể composite 20 m3, cho ăn bằng thức ăn Green Fish. Giai đoạn cho cá ăn thức ăn bổ sung H.pluvialis trong 28 ngày: Thí nghiệm được tiến hành trong bể kính 100 lít (dung tích 150 lít), mỗi bể chứa 30 con/bể, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Thí nghiệm bao gồm: nghiệm thức đối chứng dương (thức ăn không bổ sung H.pluvialis), nghiệm thức bổ sung H.pluvialis (100 mg/kg thức ăn và 200 mg/kg thức ăn), và nghiệm thức đối chứng âm (thức ăn bổ sung 200mg/kg thức ăn). Cá được cho ăn theo tỉ lệ 5% trọng lượng thân, cho ăn 2 lần/ngày. Nước thay 20-30%/tuần. Sau 28 ngày cho ăn, cá được phân bổ lại trong bể với 15 con/bể, tiêm 0,2ml dịch vi khuẩn tương đương với (2xLD50) cho nghiệm thức đối chứng dương và nghiệm thức thử nghiệm, riêng nghiệm thức đối chứng âm được tiêm nước muối sinh lý thay cho dịch vi khuẩn gây bệnh. Hàng ngày đếm số cá chết trong mỗi bể và thu mẫu cá vừa chết kiểm tra vi khuẩn gây bệnh trong thận và gan. Thí nghiệm kết thúc khi cá trong cá nghiệm thức không chết trong vòng 3 ngày liên tục. 3.2.2 Phương pháp khảo sát khả năng đề kháng của cá tra 3.2.2.1 Thu nhận mẫu máu cá Gây mê cá trước khi thu thập máu từ tĩnh mạch đuôi bằng ống kim tiêm 1ml vô trùng. Mẫu máu thu tại hiện trường, giữ lạnh ở 4oC trước khi đưa về phòng thí nghiệm để tiến hành ly tâm 1500 vòng/ 10 phút ở 4oC. Huyết thanh được trích lấy từ các mẫu máu được giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành phân tích các thông số miễn dịch. Giải phẫu cá thu mẫu thận giữ lạnh 4oC đem về phòng thí nghiệm thu nhận bạch cầu. 30
  32. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.2 Thu nhận bạch cầu từ thận trước của cá Thận trước thu nhận từ cá sẽ cắt ra thành những miếng nhỏ và rửa 1ml môi trường L-15, rửa lặp lại 2 lần, sau đó dung dịch rửa được lọc qua lưới (màng lọc có đường kính 100 µm và cho thêm 3 ml môi trường L-15. Dịch lọc tiến hành phân lớp được thực hiện trong ống tube dài 15ml chứa 30/51% Percoll (sigma) nhờ sự khác biệt tỉ trọng, sau đó ống tube 15ml đem ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở 4oC. Những tế bào nằm ở dãy band 30/51% Percoll được thu nhận và rửa lại 2 lần với môi trường L-15, sau đó ly tâm 400 vòng trong 10 phút ở 4oC. Kiểm tra khả năng tồn tại của bạch cầu với dung dịch 0,1% trypan blue (T6146, Sigma) nếu có sự hiện diện của bạch cầu sẽ bị mất màu xanh của trypan. Mật độ tế bào được điều chỉnh 1x106 tế bào/ml trong dung dịch L-15 và được dùng tất cả các thông số đo như hoạt động thực bào, oxy hoạt hóa. Tế bào bạch cầu Leucocyte Hình 3.4. Thu tế bào bạch cầu nằm xen giữa hai lớp percoll 30% và 51%. 31
  33. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2.3 Hoạt động thực bào 500µl dịch bạch cầu (Mật độ 1x106 trong môi trường L-15) cho vào microarray 12 giếng Ủ 28oC / 60 phút Rửa giếng 2 lần với L-15 Thêm 500µl hạt huỳnh quang Ủ tối 28oC trong 2 giờ Rửa giếng bằng PBS Cho 500µl dung dịch formalin để trong tối 30 phút Nhuộm màu với iot 0.1% trong 10 phút Rửa giếng 2 lần bằng PBS Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang đếm tất cả số lượng tế bào trong pham vi 100 tế bào Tính toán kết quả 32
  34. Đồ án tốt nghiệp Hoạt động thực bào được xác định dựa trên phương pháp mô tả bởi Yeh và ctv (2008). Tiến hành lấy 500 µl dịch bạch cầu (bạch cầu từ thận trước cho 2x106 tế bào trong môi trường L-15) cho vào 12 giếng được đặt vào đĩa vô trùng ủ 60 phút ở 28oC trong buồng ẩm. Rửa giếng 2 lần với dung dịch L-15. Sau đó thêm 500 µl hạt huỳnh quang dạng huyền phù cho vào các giếng ủ trong tối 2 giờ ở 28oC, các giếng sẽ được rửa PBS. Các giếng được cho vào 500 µl dung dịch formalin để trong tối 30 phút, sau đó nhuộm màu với iot 0.1% trong 10 phút rửa các giếng 2 bằng PBS và để khô ở nhiệt độ phòng. Nhỏ dầu soi kính lên giếng và đếm số lượng tấ cả tế bào trong phạm vi 100 tế bào (tế bào thực bào và không thực bào) bằng kính hiển vi huỳnh quang (Olympus IX 50, Tokyo, Japan). Tính toán kết quả PA = 3.2.2.4 Hoạt tính lysozyme Hoạt động lysozyme trong huyết thanh được đo theo phương pháp của Ellis (1990) dựa trên ly giải của vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus (Sigma) nhạy cảm với lysozyme. Tóm tắt như sau: 10 µl dịch lòng trắng trứng gà (16 µg/ml) được pha loãng bậc 2 với các nồng độ 0, 2, 4, 8 trong dung dịch đệm natri phosphat tiến hành đo OD và lập đường chuẩn lysozyme. Thêm vào 10µl huyết thanh cá cho vào 96 giếng. Bổ sung 200µl vi khuẩn Micrococcus luteus dịch huyền phù là 0.2 mg/ml trong dung dịch đệm cho vào các giếng đem ủ ở 25oC. Sau đó nhanh chóng đo độ đục các giếng ở bước sóng 530nm trong 1 phút và 6 phút. Một đơn vị lysozyme được định nghĩa là số lượng enzyme sản xuất giảm trong sự hấp thụ của huyết thanh phút/ml được xác định thông qua đường chuẩn lysozyme. 33
  35. Đồ án tốt nghiệp - 3.2.2.5 Hoạt động sản sinh O2 Sử dụng microplate 96 giếng Bổ sung 100 µl poly-L-lysine (ủ 30 phút) Sau 1 giờ rửa poly-L-lysine bằng dung dịch L-15 (100 µl) Bổ sung 100 µl bạch cầu vào giếng (mật độ 1x106 cfu/ml) ủ 37oC trong 2 giờ Rửa dịch nổi Bổ sung 100 µl Zymozan (0,1%) (ủ 30 phút) Bổ sung 100 µl NBT (0.3%) Ủ 25oC trong 30 phút Dừng phản ứng với 100 µl methanol 100% Rửa 3 lần với 100 µl methanol 70% Bổ sung 120 µl KOH 2M + 140 µl DMSO 630nm ELISA 34
  36. Đồ án tốt nghiệp Hoạt động oxy hoạt hóa được tạo ra từ tế bào bạch cầu thận trước được phân tích theo phương pháp của (Cheng và ctv, 2006) bằng cách sử dụng cơ chất nitroblue - tretrazolium (NBT) tạo thành formazan dùng để đo việc sản sinh oxy hoạt hóa (O2 ) bên trong tế bào bạch cầu. Tiến hành lấy 100µl dung dịch poly-L-lysine được hòa tan (0.2%) cho vào 96 giếng để yên từ 30 – 60 phút cho tế bào kết dính. Sau đó các giếng được rửa một lần với 100 µl L-15 và cho vào 100 µl bạch cầu từ thận trước 1x106 tế bào trong môi trường L-15 đem ủ ở nhiệt độ phòng 37oC trong 2 giờ. Rửa sạch 2 lần với L-15. Bổ sung 100 µl Zymosan ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút tiếp tục cho 100 µl nitroblue tretrazolium (NBT) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. Phản ứng được ngừng lại bằng cách thêm vào 100µl methanol (100%) và các bạch cầu được rửa 3 lần với 100 µl methanol (70%). Các giếng để khô tự nhiên, sau đó thêm vào 120 µl KOH và 140 µl - dimethylsulfoxide (DMSO) trong 2 phút. Hoạt động sản sinh oxy hoạt hóa (O2 ) được biểu thị bằng lượng giảm cơ chất NBT được đo ở bước sóng 630 nm. 3.3 Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm SPSS 3.0 dể xử lý số liệu về sự khác biệt của các nghiệm thức. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kế p < 0,05. 35
  37. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát tỉ lệ sống của cá bằng phương pháp thực nghiệm 4.1.1 Xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá tra giống khi gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E.ictaluri Bảng 4.1 Kết quả khảo sát LD50 bằng phương pháp tiêm Tổng số Tổng số Tỉ lệ chết Liều gây nhiễm Tổng số cá Tổng số cá cá chết cá sống cộng dồn (cfu/ml) chết sống cộng dồn cộng dồn (%) 103 23 22 23 32 41,82 104 38 7 61 10 85,92 105 43 2 104 3 97,20 106 44 1 148 1 99,33 PD 0,81446 3 LD50 1,53x10 CFU/ml Kết quả khảo sát LD50 cho thấy tỉ lệ chết 50% của cá tra sau khi cảm nhiễm E.ictaluri Gly09M ở mật độ 1,53x103 cfu/ml cá sau 8 ngày cảm nhiễm. Do đó liều vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm chính thức gấp 2 lần LD50, cụ thể là 3,07x103cfu/ml cá. 36
  38. Đồ án tốt nghiệp 4.1.2 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ Bảng 4.2 Bảng tỉ lệ sống cá tra sau 10 ngày cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Tỉ lệ sống của cá tra sau khi cảm nhiễm vi khuẩn (%) sau 10 ngày cảm nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp tiêm 1,2,3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC (+) 100 ± 0.0 96.7± 5.8 76.7±5.8 70±10.0 60±10.0 60±10.0 60±10.0 60±10.0 100mg/kg 100 ± 0.0 100 ± 0.0 100±0.0 93.3±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8 86.7±5.8 200mg/kg 100 ± 0.0 96.7±5.8 96.7±5.8 90 ± 0.0 83.3±5.8 83.3±5.8 83.3±5.8 83.3±5.8 ĐC (-) 100 ± 0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 100±0.0 37
  39. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.1 Khả năng kháng bệnh gan thận mủ của cá tra sau 28 ngày cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis Kết quả cho thấy ở nghiệm thức đối chứng âm cá hoạt động bình thường chứng tỏ yếu tố môi trường không ảnh hưởng đến cá. Ở các nghiệm thức 100 mg/kg, 200 mg/kg, nghiệm thức đối chứng dương cá có biểu hiện đặc trưng do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn cho thấy, chỉ xuất hiện khuẩn lạc của vi khuẩn E.ictaluri trên môi trường nuôi cấy BHIA. Điều này chứng tỏ các chết ở các nghiệm thức là do vi khuẩn này gây ra. Hình 4.1 thể hiện tỷ lệ sống của cá từ ngày đầu tiên cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Nghiệm thức đối chứng dương cho tỉ lệ cá chết là cao nhất tiếp đến là nghiệm thức 200 mg/kg và nghiệm thức 100 mg/kg. Trong đó nghiệm thức 100 mg/kg tỉ lệ cá còn sống là cao nhất đạt 86,7%. Tỉ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm với Edwardsiella ictaluri giữa các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt ý nghĩa (p<0,05). Nghiệm thức 100 mg/kg, nghiệm thức 38
  40. Đồ án tốt nghiệp 200 mg/kg và nghiệm thức đối chứng âm không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Tuy nhiên, sự khác biệt về tỉ lệ sống giữa nghiệm thức đối chứng dương so với nghiệm thức 100 mg/kg và nghiệm thức 200 mg/kg là có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05). Điều này chứng tỏ, nâng cao tỉ lệ sống của cá tra khi bổ sung thức ăn 100 mg/kg và 200 mg/kg tảo Haematococcus pluvialis có khả năng giúp cá kháng lại bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra nhờ thành phần astaxanthin có trong tảo. Mặc khác, Lê Thanh Nga tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng sản phẩm Nutribull lên sự tăng trưởng và sức khỏe cá tra nuôi. Sau khi cho ăn thức ăn bổ sung Nutribull thì tỉ lệ sống của cá tra tăng lên cụ thể. Khi bổ sung 0,2% Nutribull thì tỉ lệ sống cá tra tăng đến 23,75% so với đối chứng khi không bổ sung Nutribull. Điều này chứng tỏ thức ăn có bổ sung 0,2% Nutribull có khả năng nâng cao tỉ lệ sống của cá tra kháng lại bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra sau 14 ngày cảm nhiễm. Cũng có kết quả tương tự, Trương Quốc Phú và ctv (2005) sử dụng Aflatoxin nâng cao tỉ lệ sống cá tra khi cảm nhiễm với vi khuẩn E. ictaluri. Trong thí nghiệm này, khi cá ăn aflatoxin với hàm lượng 50 mg/kg thức ăn thì cho tỉ lệ sống cao hơn so thức ăn không bổ sung aflatoxin. 39
  41. Đồ án tốt nghiệp 4.2 Ảnh hưởng Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên 4.2.1 Hoạt động thực bào A B Hình 4.2 Hoạt động thực bào của tế bào bạch cầu của cá sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis ở các lô đối chứng (A), 100 mg/kg (B) Tế bào thực bào Hình 4.3 Hoạt động thực bào của tế bào bạch cầu của cá sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis 200mg/kg 40
  42. Đồ án tốt nghiệp a a a Hình 4.4 Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B) Tỉ lệ thực bào (A) và chỉ số thực bào (B) của cá tra được cho ăn thức ăn trộn 41
  43. Đồ án tốt nghiệp Haematococcus pluvialis sau 28 ngày. Mỗi cột biểu thị số trung bình của 6 lần lặp lại và độ lệch chuẩn. Số liệu ở cùng thời điểm thu mẫu có kí hiệu chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0.05). Bảng 4.3 Tỉ lệ thực bào (PA) và chỉ số thực bào (PI) của cá tra sau khi cho ăn thức ăn đối chứng và thức ăn trộn Haematococcus pluvialis trong 28 ngày Nghiệm thức Thời gian cho ăn (ngày) PA PI 0 28 0 28 ĐC dương 11.7 ± 6.4 8.3 ± 3.5b 1.25 ± 0.12 1.44 ± 0.05a 100 mg/kg 11.7 ± 6.4 31.4 ± 5.0a 1.25 ± 0.12 1.50 ± 0.13a 200mg/kg 11.7 ± 6.4 27.3 ± 10.8a 1.25 ± 0.12 1.44 ± 0.21a Kết quả tỉ lệ thực bào sau khi bổ sung tảo vào thức ăn thì có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Điều này chứng tỏ việc bổ sung tảo vào thức ăn làm tăng hệ miễn dịch tự nhiên của cá tra bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh. Nghiệm thức đối chứng dương tỉ lệ thực bào là thấp nhất (8,3%) so với 2 nghiệm thức 100 mg/kg (31,4%) và 200 mg/kg (27,3%). Nghiệm thức 100 mg/kg tăng 3,78 lần so với nghiệm thức đối chứng dương và không có sự khác biệt so với nghiệm thức 200 mg/kg. Tỉ lệ thực bào nghiệm thức 100 mg/kg cao nhất so với các nghiệm thức 200 mg/kg và nghiệm thức đối chứng dương. Sự khác biệt này có thể được giải thích do tác động của astaxanthin lên hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cá, làm gia tăng số lượng và hoạt động của đại thực bào. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy khi cá bị vi khuẩn gây bệnh xâm nhập thì trong máu và dịch gian bào, vi khuẩn gặp phải một hàng rào rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ không đặc hiệu của cá bao gồm các tế bào thực bào như: bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng lên nhanh chóng Vũ Triệu An (2003). Theo Newman và ctv (1993), đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được thực hiện bởi việc gia tăng các tế bào bạch cầu chống lại tác nhân gây bệnh. 42
  44. Đồ án tốt nghiệp Trong khi đó chỉ số thực bào (PI) của cá tra ở 0 ngày và sau 28 ngày cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (p>0,05). Chỉ số thực bào của nghiệm thức 100 mg/kg có tăng nhưng không đáng kể so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 200 mg/kg. - 4.2.2 Sản sinh O2 Hình 4.5 Sản xuất oxi hoạt hóa của cá sau khi cho ăn Haematococcus pluvialis sau 28 ngày Bảng 4.4 Oxy hoạt hóa của cá tra sau khi cho ăn thức ăn đối chứng và thức ăn trộn Haematococcus pluvialis trong 28 ngày Oxy hoạt hóa (OD 630nm), thời gian nuôi (ngày) Nghiệm thức 0 28 Đối chứng 0.16 ± 0.11 0.19 ± 0.05b 100mg/kg 0.16 ± 0.11 0.29 ± 0.02ab 200mg/kg 0.16 ± 0.11 0.35 ± 0.11a 43
  45. Đồ án tốt nghiệp Kết quả hoạt động oxy hoạt hóa ở thời gian 0 ngày không có sự khác biệt về mặt thống kê (p>0.05). Nhưng sau 28 ngày cho ăn thức ăn có bổ sung tảo Haematococcus pluvialis thì có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Nghiệm thức 200 mg/kg sản xuất oxi hoạt hóa tăng 1,2 lần so với 100 mg/kg và 1,84 lần so với nghiệm thức đối chứng. Kết quả trên chứng minh việc bổ sung Haematococcus pluvialis vào thức ăn làm tăng khả năng sản xuất oxi hoạt hóa trong cá. Đồng thời cũng kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh. Oxy hoạt hóa được sản sinh bởi tế bào thực bào phagocyte (hay tế bào bạch cầu, leucocyte) có tác dụng tiêu diệt mầm bệnh trong suốt quá trình thực bào và cũng là một cơ chế bảo vệ vật chủ xảy ra thường xuyên nhằm chống lại khả năng xâm nhiễm của mầm bệnh. Tuy nhiên, sự hoạt động quá mức của các chất hoạt hóa dẫn xuất từ oxy (ROIs) có thể gây hại và độc cho tế bào chủ Dalmo và ctv (1997). Do đó, tế bào vật chủ có cơ chế bảo vệ và chuyển hóa các chất độc được tạo ra từ quá trình ROIs bằng - các enzyme chống oxy hóa như Superoxide dismutase (SOD) chuyển hóa O2 thành H2O2, glutathione peroxidase và catalase chuyển hóa H2O2 thành nước có lợi cho tế bào Sampaio và ctv (2008), Scandalios và ctv (2005). Tăng hoạt động thực bào và oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu của cá hồi sau khi chúng được cho ăn với thức ăn có bổ 6 sung Lactobacillus. Lactic và Lactobacillus mesenteroides với mật độ 10 cfu/g khoảng 14 ngày Balcázar và ctv (2007b). Tuy nhiên trong nghiên cứu này sự tăng có khác biệt có ý nghĩa của hoạt động thực bào, chỉ số thực bào, đồng thời tăng oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu sau khi cho cá tra thức ăn bổ sung tảo. Điều này chứng tỏ rằng sự gia tăng oxy hoạt hóa có tương quan với hoạt động thực bào. 44
  46. Đồ án tốt nghiệp 4.2.3 Hoạt tính lysozyme Kết quả khảo sát hoạt tính lysozyme theo phương pháp Elis (1990) ta có như sau: Hình 4.6 Hoạt động lysozyme sau 28 ngày cho ăn tảo Haematococcus pluvialis Bảng 4.5 Hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis sau 28 ngày Nồng độ lysozyme (µg/ml), thời gian nuôi (ngày) Nghiệm thức 0 28 Đối chứng 2.86 ± 0.17 2.65 ± 0.17a 100 mg/kg 2.86 ± 0.17 3.08 ± 0.01a 200 mg/kg 2.86 ± 0.17 3.13 ± 0.65a Qua biểu đồ ta nhận thấy được ở 0 ngày cả 3 nghiệm thức đối chứng và 100 mg/kg, 200 mg/kg đều cho nồng độ lysozyme như nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. 45
  47. Đồ án tốt nghiệp Hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá tra sau 28 ngày cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis cũng không có sự khác biệt về mặt thống kê của cả 3 nghiệm thức: đối chứng, 100 mg/kg và 200 mg/kg. Việc bổ sung tảo H.pluvialis vào trong thức ăn không ảnh hưởng đến hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá. Lysozyme là một trong những yếu tố bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm các mầm bệnh ở các động vật có xương sống Osserman và ctv (1974). Lysozyme có khả năng phân giải vi khuẩn gram dương và tiêu diệt vi khuẩn gram âm sau khi phá vỡ vỏ ngoài tế bào Hjelmeland và ctv (1983). Ngoài ra hoạt động bổ thể cũng tham gia bảo vệ tế bào từ sự xâm nhiễm các vi khuẩn, nấm, virus và ký sinh trùng. Muller-Eberhard và ctv (1988). Một số nghiên cứu của Thompson (1994) trên đối tương cá hồi ở Đại Tây Dương chứng tỏ việc bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn cũng không ảnh hưởng đến nồng độ lysozyme trong huyết thanh. 46
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Thức ăn bổ sung 100 mg/kg Haematococcus pluvialis giúp nâng cao khả năng đề kháng của cá tra đối với Edwardsiella ictaluri với tỷ lệ sống cao nhất là 86,7±5,8 %. Ngoài ra việc bổ sung tảo vào trong thức ăn còn nâng cao hệ miễn dịch không đặc hiệu của cá tra cụ thể là: - Hoạt động thực bào (PA) của tế bào bạch cầu cá cho ăn với thức ăn có bổ sung astaxanthin từ tảo Haematococcus pluvialis 100 mg/kg (31.4 ± 5.0) và 200 mg/kg (27.3 ± 10.8) tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng (8.3 ± 3.5) - Sản sinh oxi hoạt hóa: Hoạt động oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu của cá tra sau khi cho ăn thức ăn có bổ sung Haematococcus pluvialis ở nồng độ 200 mg/kg (0.35 ± 0.11a) tăng cao khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, hoạt động oxy hoạt hóa của tế bào bạch cầu ở nghiệm thức 100 mg/kg (0.29 ± 0.02ab) khác biệt không có ý nghĩa đối với nghiệm thức đối chứng (0.19 ± 0.05b) . - Hoạt động lysozyme trong huyết thanh của cá tra sau khi cho ăn thức ăn bổ sung Haematococcus pluvialis không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa giữa các nghiệm thức. 5.2 Đề nghị Cần nghiên cứu thêm về liều lượng, tần xuất và thời gian sử dụng trên cá tra nhằm tìm ra chiến lược cho ăn thích hợp để tăng sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ. Nghiên cứu ảnh hưởng của Haematococcus pluvialis lên màu sắc của cá tra. Cần có những công trình nghiên cứu nhiều hơn về loại tảo này trên nhiều đối tượng khác nữa. 47
  49. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Vũ Triệu An, 2003. Miễn dịch học. Nhà xuất bản y học Hà Nội, trường Đại Học Y Hà Nội. Bộ môn miễn dịch và sinh lý bệnh. 376 trang. [2] Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn, 2009. “Hiện trạng đa kháng trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở Đồng bằng sộng Cửu Long”. Trang 219-227 [3] Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình “Bệnh Học Thủy Sản”. 162 trang [4] Đồng Thanh Hà, Đỗ Thị Hòa, 2008 - 2009. “Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh mủ ở gan thận trên cá tra Pangasius hypophthalmus nuôi tại Bến Tre”. Kỷ yếu hội nghị sinh viên NCKH 2008-2009. Trang 1-7 [5] Đặng Diễm Hồng và, Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thủy, Hoàng Thị Lan Anh, 2010. Tạp chí sinh học: “Lựa chọn môi trường tối ưu để nuôi trồng vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu Astaxanthin”. 32 (2): 43-53 [6] Phạm Văn Khánh, 2011. “Kỹ thuật nuôi cá tra và basa trong bè”. Nhà xuất bản nông nghiệp. [7] Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2008. Tìm hiểu sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản. Khoa Thủy Sản. Trường Đại học Cần Thơ. Trang 202-211. [8] Lê Thị Nga, Nguyễn Hữu Thịnh, Lê Thanh Hùng. ‘Đánh giá tác dụng của sản phẩm Nutribull lên tăng trưởng và cải thiện tình trạng sức khỏe của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”. Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Trang 139 - 149. 48
  50. Đồ án tốt nghiệp [9] Phạm Thị Kim Oanh, Trương Hoàng Minh, 2011. “Thực trạng nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878) có liên kết và không liên kết ở Đồng Bằng Sông Cửu Long”. Tạp chí khoa học 2011: 20b 48 - 58. [10] Trương Quốc Phú, Nguyễn Anh Tuấn, Dương Thúy Yên, Phạm Trần Nguyên Thảo, Trần Thị Thanh Hiền, Nguyễn Quốc Thịnh, 2005. Ảnh hưởng của Aflatoxin lên tỉ lệ sống và tốc độ sinh trưởng của cá tra (Pangasius hypophthalmus). Báo cáo khoa học. Đề tài cấp Bộ. Trang 1-33. [11] Lê Hồng Phước, Nguyễn Thị Hiền, Võ Hồng Phượng, Ngô Thị Bích Phượng, Nguyễn Phạm Hoàng Huy, 2011. Phân lập và kiểm tra độc lực Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn. Tháng 12/2011. Trang 80 – 81. [12] Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I. Tài liệu Tiếng Anh [13] Bader A. Joel , Shoemaker A.Craig , Phillip H. Klesius, 2004. “ Immune response induced by N-lauroylsarcosine extracted outer-membrane proteins of an isolate of Edwardsiella ictaluri in channel catfish”. 16. Page 415 – 428. [14] Balcázar, J.L., I. de Blas, I. Ruiz-Zarzuela, D. Vendrell, O. Girones, and J.L. Muzquiz (2007b) Enhancement of the immune response and protection induced by probiotic lactic acid bacteria against furunculosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). FEMS Immunology and Medical Microbiology 51:185- 193. [15] Capelli Bob, Cysewski Gerald; 2007. “ Natural Astaxanthin: King of the carotenoids”. Trang 1 – 132. [16] Cheng Ann-Chang, Chen Chia-Yung, Liou Chying-Hwa, Chang Ching-Fong, 2006. Effects of dietary protein and Lipids on blood Parameters and superoxide Annion production in the Grouper, Epinephelus coioides. Zoological Studies 45(4): 492 -502. 49
  51. Đồ án tốt nghiệp [17] Crumlish. M, Dung T.T, Turnbull J F , Ngoc N.T.N, Ferguson H .W, 2002. “ Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage) cultured in the Mekong Delta, VietNam”. Trang 733-736. [18] Cysewski and Lorenz, 2004. Industrial production of microalgal cell-mass and secondary product – species of high potential. Haematococcus. Trang 281 -288. [19] Dalmo, R.A., K. Ingebrigtsen, and J. Gwald (1997) Non-specific defence mechanisms in fish, with particular reference to the reticuloendothelial system (RES). Journal of Fish Diseases 20:241-273. [20] Dore E John and Cysewski R. Gerald, 2008. “ Haematococcus algae meal as a source of natural astaxanthin for aquaculture feeds”. Trang 1-5 [21] Dore E. John, Ph.D; 2008. “ Astaxanthin and cancer chemoprevention”. Trang 1 – 45. [22] Dragos .N, Bercea. V, Adriana Bica, Drugă .B, Ana Nicoată, Coman .C, 2010. “Astaxanthin production from a new strain of Haematococcus pluvialis grown in batch culture”. Vol .XV, Issue 2. [23] Ellis, A.E. (1990) Lysozyme assays. Techniques in Fish Immunology, 101 -103. [24] Guerin Martin, Huntley Mark E, Olaizola Miguel, 2003. “ Haematococcus Astaxanthin: applicantions for human health and nutrition”. Trang 210-216 [25] Higuera-Ciapara, L.Felix-Valenzuela, Goycoolea F.M.; 2006. “Astaxanthin: A review of its chemistry and applicantions”. Critical reviews in food science amd nutrition, 46: 185 – 196. [26] Hjelmeland, K., Christie, M., Raa, J. (1983). Skin mucus protease from rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, and its biological significance.J.Fish Biol. 23:13-22. [27] Holt, J.G., Noel, R.K (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Chapper V, pp. 178, 222. 50
  52. Đồ án tốt nghiệp [28] Lorenz R.Todd, Cysewski Gerald . R, 2000. “Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin”. Vol 18. Trang 160-167. [29] Muller-Eberhard, H.J. (1988) Molecular organization and function of the complement system. Annual Review of Biochemistry 57:321-347. [30] Newaj-Fyzul, A., Adesiyun, A. A., Mutani, A., Ramsubhag, A., Brunt, J., and Austin, B. (2007). Bacillus subtilis AB1 controls Aeromonas infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Journal of Applied Microbiology 103, 1699-1706. [31] Olaizola, M. 2000. Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreators. Joumal of Applied Phycology 12:499 – 506. [32] Orosa, M., D. Franqueira, A. Cid, and J. Abalde. 2005. Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology 96: 373 – 378. [33] Osserman, E.F., Canfield, R.E., Beychok, S. (1974). editors. "Lysozyme" Academic Press, New York, 641p. [34] Parris Kidd, 2011. “Astaxanthin, Cell Membrance Nutrient with Diverse Clinical benefits and Anti-Aging Potential”. Volume 16. Trang 355 – 363. [35] Plumb, J,A., 1999. Fish diseases and disorders. Aquaculture and aquatic Environment, Aburn University, Alabana 36849 USA. [36] Reed L.J, Muench .H, 1938. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Vol. 27. Trang 493 – 497. [37] Sampaio, F.G., C.L. Boijink, E. Oba, L.B. dos Santos, A.L. Kalinin, and F.T. Rantin (2008) Antioxidant defenses and biochemical changes in pacu (Piaractus mesopotamicus) in response to single and combined copper and hypoxia exposure. Comparative Biochemistry and Physiology 147C:43-51. 51
  53. Đồ án tốt nghiệp [38] Scandalios, J.G (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38:995-1014. [39] Shotts, E.B, Blazer, VS., Watlman, W.D, 1986. “Pathogenesis of experimental Edwardsiella ictaluri in channel catfish (Ictalurus punctatus). Can.J.Fish Aquat. Sci. 43: 36 – 42 [40] Thompson, G. Choubert, D.F. Houlihan, C.J. Secombes; 1995. “The effect of dietary vitamin A and Astaxanthin on the immunocompetence of rainbow trout”. Trang 91 – 102. [41] Wiener Harold , Amir Drory, Algatechnologyies Ltd and Larry Line, 2003. “ Astaxanthin from the Microalga Haematococcus – a superb natural antioxidant for human health”. Trang 22 – 23 Tài liệu trang web [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] 52