›

Đồ án Bước đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

pdf 87 trang thiennha21 12/04/2022 5620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_buoc_dau_nghien_cuu_san_xuat_carrageenan_tu_rong_sun_k.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Th.S. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THU MSSV: 107111174 Lớp: 07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2011
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Chương Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1.GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN 3 1.1.2.Nguồn gốc 3 1.1.3.Đặc điểm sinh học của rong sụn 4 1.1.3.1.Hệ thống phân loại của rong sụn 4 1.1.3.2.Đặc điểm hình thái, cấu tạo 4 2.1.5.Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của rong sụn. 6 2.1.5.1.Thành phần hóa học 6 1.1.5.2.Giá trị dinh dưỡng của rong sụn 9 1.1.6.Tình hình phát triển rong sụn trên thế giới và trong nước. 10 1.2.GIỚI THIỆU CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 14 1.2.1.Lịch sử phát hiện 14 1.2.2.Giới thiệu về carrageenan 14 1.2.2.1.Kết cấu đơn vị 14 1.2.3.Tính chất của carrageenan 18 1.2.3.1.Tính chất hóa lý 18 1.2.3.2.Tính chất tạo gel 21 1.2.3.3.Tính chất hóa học 22 1.2.4.Ứng dụng của carrageenan 31 1.2.4.1.Ứng dụng trong công nghiệp bơ sữa 32 1.2.4.2.Ứng dụng trong các ngành thực phẩm khác 33 1.2.4.3.Các ứng dụng trong kĩ thuật 35 1.2.4.4.Ứng dụng trong mỹ phẩm và kem đánh răng 35 1.2.4.5.Ứng dụng trong y, dược học 36 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM KHẢO SÁT THÍ NGHIỆM 38 2.2.1.Đối tượng nghiên cứu 38 2.2.2.Thiết bị-dụng cụ 38 SVTH: NGUYỄN THỊ THU iii
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 2.2.3.Hóa chất 38 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.3.1.Sơ đồ tách chiết carrageenan từ rong sụn 39 2.3.2.Phương pháp xác định độ ẩm . 41 2.3.4.Phân tích các chỉ tiêu 45 2.3.1.1.Xác định hàm lượng protein của carrageenan bằng phương pháp Bradford.46 2.3.1.2.Xác định hàm lượng carrageenan 47 2.3.1.3.Xác định hàm lượng sulfate 49 2.3.1.4.Xác định hàm lượng carbohydrate 51 2.3.1.5.Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm 52 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1.Xác định độ ẩm nguyên liệu 53 3.2.Xác định hàm lượng protein tổng tổng 53 3.3.Xác định hàm lượng protein 54 3.4.Xác định hàm lượng carrageenan 56 3.5.Xác định hàm lượng sulfate 58 3.6.Xác định hàm lượng carbohydrate 60 3.7.Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm 62 3.8.Đánh giá chất lượng sản phẩm 63 Chương 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1.KẾT LUẬN 64 4.2.KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 71 SVTH: NGUYỄN THỊ THU iv
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i-carrageenan: iota-carrageenan k-carrageenan: kapa-carrageenan λ-carrageenan: lamda-carrageenan TN : thí nghiệm Đơn vị G: 3-β-D-galactose Đơn vị D: 4-α-D-galactose đơn vị DA: 4-3,6-anhydro-α-D-galactose D6s: α-glactose-6 sulfate SVTH: NGUYỄN THỊ THU v
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn 4 Bảng 1.2. Sự thay đổi hàm lượng protein theo các tháng trong năm 8 Bảng 1.3. Sản lượng rong sụn trên thế giới năm 2001 10 Bảng 1.4. Sản lượng rong sụn của các nước 13 Bảng 1.5. Một số loài rong đỏ chứa carrageenan 25 Bảng 1.6. Cơ cấu thị trường tiêu thụ carrageenan năm 2001 31 Bảng 1.7. Các ứng dụng điển hình của carrageenan trong thực phẩm bánh kẹo . 34 Bảng 2.1. Chế độ nấu chiết 40 Bảng 2.2. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin .47 Bảng 2.3. Các bước chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng protein 47 Bảng 2.4. Số liệu dựng đường chuẩn carrageenan 49 Bảng 2.5. . Các bước chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng carrageenan 49 Bảng 2.6. Số liệu dựng đường chuẩn sulfate 51 Bảng 2.7. Các bước chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng sulfate 51 Bảng 2.8. Số liệu dựng đường chuẩn carbohydrate 52 Bảng 2.9. Các bước chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng carbohydrate 53 Bảng 3.1. Độ ẩm nguyên liệu 54 Bảng 3.2. Hàm lượng protein 54 Bảng 3.3. Hàm lượng protein của carrageenan 55 Bảng 3.4. Hàm lượng carrageenan của rong sụn 57 Bảng 3.5. Hàm lượng sulfate của carrageenan 59 Bảng 3.6. Hàm lượng carbohydrate 61 Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi carrageenan 63 SVTH: NGUYỄN THỊ THU vi
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein của carrageenan 56 Biểu đồ 3.2. Biểu đồ biễu diễn hàm lượng carrageenan 58 Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biễu diễn hàm lượng sulfate của carrageenan 60 Biểu đồ 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng carbohydrate của carrageenan 62 Biểu đồ 3.5. Biểu đồ biểu diễn hiệu suất thu hồi của carrageenan 63 SVTH: NGUYỄN THỊ THU vii
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Rong sụn Kappaphycus alvarezii .6 Hình 1.2. Cấu tạo của carrageenan 8 Hình 1.3. Doanh thu từ các hydrocolloid năm 1978 và năm 1993 .12 Hình 1.4. Kết cấu của Carrageenan 15 Hình 1.5. κ-carrageenan 16 Hình 1.6. i-carrageenan 17 Hình 1.7. λ-carrageenan 17 Hình1.8.Tương tác tĩnh điện các nhóm sulfate của carrageenan và casein 20 Hình 1.9. Các hình thức liên kết của carrageenan với protein .20 Hình 1.10. Tác dụng của nhiệt độ đối với cơ chế chuyển đổi dung dịch sang gel 22 Hình 1.11.Quá trình chuyển hóa của carrageenan trong môi trường kiềm mạnh. 23 Hình 1.12. Các ứng dụng của carrageenan 25 Hình 1.13. Đa dạng hóa các sản phẩm từ rong sụn và sản phẩm cuả nó .37 Hình 2.1. Tủ sấy 42 Hình 2.2. Nồi hút ẩm 42 Hình 2.3. Màu trước chuẩn độ 44 Hình2.4. Màu sau chuẩn độ 44 Hình 2.5. Phân tích các chỉ tiêu methylen blue 46 Hình 2.6. Cấu trúc của methylen blue 48 Hình 3.1. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng protein 55 Hình 3.2. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng carrageenan 57 Hình 3.3. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng sulfate 59 Hình 3.4. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng carbohydrate 61 Hình 3.5. Sản phẩm carrageenan dạng khô 64 SVTH: NGUYỄN THỊ THU viii
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THỊ THU ix
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, với chiều dài bờ biển hơn 3260 km và có nhiều nhánh sông, vùng triều, các vùng vịnh, đầm phá đây là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của các sinh vật biển. Một trong những loài góp phần vào sự đa dạng này là loài rong biển. Ở Việt Nam đã có gần 800 loài rong biển thuộc tất cả bộ phận của các ngành rong đã được công bố trên thế giới [16]. Rong biển thuộc vào loại tài nguyên quý hiếm, có giá trị về mặt kinh tế và đã được khai thác nhiều năm nay để phục vụ cho những mục đích khác nhau. Trong rong biển có chứa các polysaccharide (agar, alginate ) là những thành phần quan trọng rất có giá trị Tuy nhiên polysaccharide quan trọng nhất chính là carrageenan. Nhờ vào các tính chất đặc trưng của carrageenan như có độ bền cơ học cao, có khả năng tạo gel ở nồng độ thấp, có độ nhớt cao dễ tạo màng và có tính nhũ hóa cao, các hoạt tính kháng viêm và chống lão hóa, có thể giải độc chữa các bệnh mãn tính, nên carrgeenan được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế như công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược và ứng dụng trong cả các ngành kĩ thuật. Carrageenan là polysacchride được chiết xuất từ rong đỏ, đặc biệt là rong sụn. Ngoài ra, rong sụn còn có các tính ưu việt về hàm lượng các nguyên tố hữu ích (Mg, Cu, Fe ) và một số thành phần khác như protein, vitamin, glucid Chính vì vậy, nhiều nước trong khu vực và trên thế giới như Philippin, Indonesia, Tazania đã dầu tư và nghiên cứu cho sản xuất loài rong này [11, 13,15]. Từ đó việc sản xuất carrageenan đã nhanh chóng phát triển trên thế giới, sản lượng hàm năm tăng lên rõ rệt [16]. Hiện nay sản lượng rong thu được của chúng ta chủ yếu mới được dùng cho xuất khẩu thô, dưới dạng rong khô. Trong khi đó một số ngành sản xuất tiêu dùng, các ngành công nghiệp trong nước phải nhập từ nước ngoài các sản phẩm như carrageenan để phục vụ cho sản xuất. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 1
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Với những lý do trên, đối với nước ta việc nghiên cứu thu nhận các nguồn lợi từ rong biển có ý nghĩa to lớn về khoa học cũng như thực tiễn, đặc biệt là polysaccharide từ rong biển. Do đó cần nghiên cứu để tiến tới sản xuất các polysaccharide này ở quy mô công nghiệp phù hợp với nền kinh tế quốc dân. 2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình tách chiết rong sụn, nhằm tìm ra quy trình công nghệ thích hợp để có thể sản xuất ra carrageenan có hiệu suất và chất lượng tốt nhất. Chính vì vậy mà tôi chọn tên đề tài: "Bước đầu nghiên cứu sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii". 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kiềm lên hàm lượng và chất lượng của carrageenan. Khảo sát nhiệt độ và thời gian nấu chiết lên hàm lượng và chất lượng của carrageenan. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 2
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN 1.1.1. Phân bố Kappaphycus là chi thuộc nhóm carragenophyte quan trọng phân bố Philippin, vùng nhiệt đới châu Á và khu vực Tây Thái Bình Dương. Kể từ khi du nhập vào nước ta năm 1993 cây rong sụn tỏ ra thích hợp với khí hậu Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền Trung. Trước đây loài rong sụn Kappaphycus alvarezii đang được di giống trồng thử nghiệm ở một số vùng biển như Cát Bà (Hải Phòng), Vân Đồn (Quảng Ninh) [5]. Hiện nay rong sụn được trồng rộng rãi ở một số vùng trong tỉnh Ninh Thuận và các tỉnh khác như Khánh Hòa, Phú Yên, Phú Quốc, Bình Thuận. 1.1.2. Nguồn gốc Rong sụn có nguồn gốc từ Philippin. Tháng 2 năm 1993 trong chương trình hợp tác khoa học Việt Nam và Nhật Bản phân viện khoa học vật liệu Nha Trang đã nhập về Việt Nam một bụi rong sụn 240g. Tháng 10 năm 1993 với sự giúp đỡ của viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang, trung tâm khuyến ngư Ninh Thuận đã nhận 5 kg rong sụn về trồng thử nghiệm tại đầm Sơn Hải Ban đầu chỉ có khoảng 15 hộ trồng rong sụn đến nay con số đó đã lên đến 500 hộ với tổng diện tích là 6000 ha diện tích mặt nước. Khi tỉnh Ninh Thuận thành công trong việc trồng rong sụn một số địa phương khác cũng học hỏi làm theo. Vì vậy có thể khẳng định rằng rong sụn là đối tượng phù hợp nhiều loại hình mặt nước được đánh giá là có nhiều ưu điểm so với một số loài rong biển hiện có ở địa phương. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 3
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.1.3. Đặc điểm sinh học của rong sụn 1.1.3.1. Hệ thống phân loại của rong sụn Rong sụn kappaphycus alvarezii (Doty), có tên thương mại là Cottonii, kí hiệu là KA thuộc [4, 5, 9] Ngành: Rhodophyta Lớp: Rhodophyceae Phân lớp: Florideophycidae Bộ: Gigartinales Họ: Areschougiaceae Chi: Kappaphycus Loài: Alvarezii Hình 1.1. Rong sụn Kappaphycus alvarezii 1.1.3.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Hình thái Thân dạng trụ tròn, đường kính thân chính có thể đạt tới 20 mm, phân nhánh rậm rạp kiểu tự do không theo quy luật, đỉnh nhánh nhọn. Màu lục vàng hay lục thẫm Tản rong giòn dễ gãy khi tươi, có tập tính bò lan hoặc mọc thẳng, có ba dạng tản [4] : - Dạng vô tính mang 2n nhiễm sắc thể. - Dạng đơn bội mang 1n nhiễm sắc thể. - Dạng lưỡng bội (hợp tử 2n) rất nhỏ, ký sinh trên tản giao tử cái. Thể chất trơn nhớt keo sụn, khi khô thành sợi cứng như sừng. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 4
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Từ trọng lượng 100g ban đầu sau một năm rong sụn có thể tăng trưởng thành bụi rong, nặng 14-16 kg. Rong sụn có tốc độ tăng trưởng tới 10%/ngày. Cấu tạo Cấu tạo trong của rong sụn gồm nhiều hàng tế bào có kích thước khác nhau: tế bào trụ, tế bào vây trụ, tế bào bì [5]. 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của rong sụn. Độ mặn Rong sụn là loài ưa mặn, chỉ sinh trưởng và phát triển tốt ở vùng nước có độ mặn cao (28-32 ‰, ở độ mặn thấp(18-20 ‰). Rong sụn chỉ có thể tồn tại trong thời gian ngắn (5-7 ngày) và nếu kéo dài thêm thì rong sẽ ngừng phát triển và dẫn đến tàn lụi. Dòng chảy và lưu thông nước Rong phát triển tốt ở vùng nước thường xuyên trao đổi và luân chuyển (tạo ra dòng chảy, dòng triều hay sóng gió bề mặt). Nước bị tù hay sự di chuyển kém làm cho tốc độ của rong sụn phát triển chậm lại, đặc biệt nếu kết hợp với nhiệt độ cao, chất huyền phù trong nước lớn, hàm lượng các muối dinh dưỡng trong nước thấp sẽ dẫn đến sự tàn lụi của rong một cách nhanh chóng. Nhiệt độ Rong sụn sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 200C trở lên. Nhiệt độ thích hợp cho rong sụn phát triển và sinh trưởng nằm trong khoảng 25-280C [27], nhiệt độ cao hơn 30 hay thấp hơn 20 sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của rong, nhiệt độ của nước cao (32-340C) tốc độ phát triển của rong thấp, bình quân đạt từ 2-3% / ngày, nếu nhiệt độ thấp hơn 15-180C rong ngừng phát triển. Cường độ ánh sáng Yêu cầu ánh sáng của rong sụn không cao, thích hợp nhất là khoảng 30.000- 50.000 Lux, ánh sáng cao quá hay thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của rong. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 5
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Yêu cầu dinh dưỡng Trong điều kiện nhiệt độ không quá cao ( 12.000 Lux), nhu cầu của rong sụn cao lên rõ rệt (hấp thụ tới 57.8 % lượng N). Đối với nguồn P nhu cầu của rong sụn đều cao (hấp thụ 85,3%- 89.2% lượng phospho) ở cả nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao và thấp. 1.1.5. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của rong sụn. 1.1.5.1. Thành phần hóa học Thành phần hóa học của rong sụn luôn thay đổi phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, thời gian sinh trưởng điều kiện sống (cường độ bức xạ, thành phần hóa học của môi trường). Trong rong sụn, hàm lượng nước chiếm 77-91% còn lại vài phần trăm chất là khô. Trong chất khô chứa chủ yếu là: Glucide, protein, chất khoáng, lipit, sắc tố, enzyme [12, 14]. Trong thành phần protein của rong có chứa 11 acid amin với hàm lượng khá cao, trong đó có 5 acid amin không thay thế. Vì vậy protein của rong sụn có giá trị dinh dưỡng khá cao. Hàm lượng tro của rong sụn cũng đáng kể. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rong sụn. Thành phần hóa học trong chất khô % khối lượng Glucide 44-45% Chất khoáng 20% Protein 5-22% Thành phần hóa học khác 13-35% a. Nước Nước chiếm tỉ lệ khá cao trong các thành phần của cơ thể sinh vật, trong rong biển tỉ lệ đó càng lớn hơn. Trong các kết quả đã phân tích ở các loài rong đã được SVTH: NGUYỄN THỊ THU 6
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG nghiên cứu, hàm lượng nước rong sụn chiếm khoảng 77-91 %. Tỉ lệ nước giảm dần theo thời gian sinh trưởng, ở giai đoạn tích lũy các chất dinh dưỡng nước đạt khoảng 79%, ở rong khô hàm lượng nước 18-20%. b. Glucide Glucide bao gồm: Monosacharide và disaccharide và polysaccharide. Mannoza Ở trạng thái kết hợp với acid glyceric và natri tạo hợp chất là disaccarit tỉ lệ là 15%. Polysaccharide: - Agar Agar là polysaccharide có trong tế bào vây trụ của rong. Hàm lượng agar trung bình của rong trên thế giới dao động từ 20 -40%. Trong khi đó thì rong của Việt Nam chứa từ 24 -45% khối lượng rong khô. - Carrageenan Carrageenan là polysaccharide có trong rong sụn [16,40]. Carrageenan có tính chất tương tự agar. Dịch keo carrageenan có thể đông thành thạch như agar nhưng ở nồng độ cao hơn agar. Thạch carrageenan có nhiệt độ nóng chảy cao hơn thạch agar [3]. Carrageenan cấu tạo từ các gốc D-galactose và 3,6-anhydro D-galactose. Các gốc này liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 và 1,3 luân phiên nhau. Các gốc D- galactose được sulfate hóa với tỉ lệ cao. Các loại carrageenan khác nhau về mức độ sulfate hóa. Galactose ở trạng thái kết hợp với acid glyceride tạo hợp chất không bền có thể bị chiết xuất bởi ancol cao độ (>90 độ). Mạch polysaccharide của các carrageenan có cấu trúc xoắn kép. Mỗi vòng xoắn do 3 đơn gốc disacchride tạo nên. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 7
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 1.2. Cấu tạo của carrageenan[1] c. Protein Hàm lượng protein trong rong sụn dao động trong khoảng 5-22% [3]. Hàm lượng protein dao động với biên độ khá lớn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng, vị trí địa lý, môi trường sống. Theo nghiên cứu hàm lượng protein tăng dần theo thời gian sinh trưởng và đạt giá trị cực đại ở giai đoạn sinh sản Bảng 1.2. Sự thay đổi hàm lượng protein theo các tháng trong năm [12]. Tháng trong năm 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 Hàm lượng protein(%) 7.52 9.55 19.15 16.30 16.18 13.19 d. Lipid Hàm lượng lipid trong rong sụn không đáng kể nhưng một số nhà nghiên cứu cho rằng mùi tanh của rong là do lipit gây ra. Đặc điểm của lipide trong rong sụn phần lớn là nhưng lipid chưa no, vô hại, có steron mà các thực vật khác không thấy [18]. e. Sắc tố Trong rong sụn có chứa một số sắc tố như sắc tố vàng (xanthophyll), sắc tố xanh lam (phycocyanin), sắc tố diệp lục tố (chlcorophyl). Sắc tố của rong sụn kém SVTH: NGUYỄN THỊ THU 8
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG bền hơn sắc tố của các loại rong khác, vì vậy loại rong này có thể được tẩy màu bằng phương pháp tự nhiên là phơi nắng. f. Chất khoáng Hàm lượng chất khoáng trung bình trong rong sụn khoảng 20% trọng lượng khô. Thành phần chủ yếu của chất khoáng trong rong sụn là Ca, K, S và các nguyên tố khác như: Mg, Al, Ba, Sn, Fe, Si Nồng độ iod trong rong sụn nhỏ hơn nhiều so với rong nâu. Hàm lượng khoáng phụ thuộc vào điều kiện sống giai đoạn sinh trưởng, rong sống trong đầm thường có hàm lượng khoáng thấp hơn rong trồng trên biển vì trong nước biển hàm lượng chất khoáng nhiều hơn nước trong đầm. g. Enzyme Trong rong sụn có thể chiết tách được enzyme protease phân giải protein. Dựa vào sự hoạt động của protease trong rong sụn trên nhiều cơ chất khác nhau người ta xếp nó vào enzyme papain hay cathepsin [16]. Ngoài ra trong rong sụn còn chứa enzyme thủy phân glucide gồm hai loại enzyme oxydase: - Một loại chuyển hóa đường đơn thành acid tương ứng như glucose thành gluconic. - Loại thứ 2 chuyển hóa đường thành ozon. 1.1.5.2. Giá trị dinh dưỡng của rong sụn Trong rong sụn chứa hàm lượng chất khoáng chất vi lượng (Ca, K, S, Fe ) cùng một số acid amin cần thiết và nhiều vitamin quan trọng như vitaminA,vitaminC, vitaminB12 Thực tế khoa học đã chứng minh rằng rong biển đã hấp thụ từ biển hơn 90 loại chất khoáng với hàm lượng muối thấp và hàm lượng Ca cao chính vì lẽ đó mà rong sụn được ưu tiên hành đầu đối với những người bị cao huyết áp. Rong sụn có thành phần chủ yếu là carrageenan chiếm 40%-55%. Carrageenan có trong thành phần của các loại rong đỏ, lượng chất khô có trong rong sụn chất này có đặc tính liên kết rất tốt các phân tử protein của động thực vật có thể dùng SVTH: NGUYỄN THỊ THU 9
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG carrageenan với một hàm lượng thích hợp làm phụ gia giò chả để tăng mức độ liên kết protein của thịt thay thế hàn the. 1.1.6. Tình hình phát triển rong sụn trên thế giới và trong nước. 1.1.6.1. Trên thế giới Trên thế giới, rong sụn đã được biết đến từ rất lâu để tách chiết carrageenan. Vào những năm 30 quá trình tách chiết carrageenan nguyên chất đã được tiến hành ở Mỹ. Sau chiến tranh thế giới lần thứ hai, do sự phát triển của các ngành công nghiệp thực phẩm, nhu cầu carrageenan trên thế giới đã và đang ngày càng tăng lên. Hình 1.3. Doanh thu từ các hydrocolloid năm 1978 và năm 1993 [22]. T heo những thống kê gần đây (FAO, 1997) sản lượng thu hoạch rong biển kinh tế trên thế giới đạt 7 triệu tấn tươi/năm, còn theo CEVA (AlgoRythme, 2000) là 8 triệu tấn. Trong số đó khoảng 20% được dùng để sản xuất ra các loại keo rong biển alginate, agar và carrageenan, chế biến thức ăn cho vật nuôi và làm phân bón, số còn lại chủ yếu được dùng làm thức ăn cho người (Ohno và Critchley, 1997). Doanh thu hàng năm từ kinh tế rong biển trên thế giới ước khoảng trên 5 tỷ USD. Carrageenan được ứng dụng trong công nghiệp đầu tiên vào năm 1940 như là chất làm bền nhũ tương cho chế biến kẹo sữa sôcôla. Nhưng vì nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành, nên sản lượng hàng năm của carrageenan trên thế giới tăng lên rõ rệt. Năm 1992 là 10.000 tấn, năm 1996 là 20.000 tấn, năm 1997 là 26.000 tấn. Trong năm 2000, riêng châu Á sản xuất 33.000 tấn. So với các SVTH: NGUYỄN THỊ THU 10
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG polysaccharide khác, carrageenan có giá trị thương phẩm lớn nhất (triệu USD) carrageenan-263, agar-200, pectin-147, alginat-130, guar-77 [16]. Hiện nay công nghiệp sản suất carrageenan không chỉ phát triển ở các nước Mỹ, Tây Âu mà còn phát triển mạnh ở các quốc gia Châu Á, trong đó phải kể đến Trung Quốc, Nhật Bản, Philippine Đặc biệt là các vùng biển nước như Philipine, Indonesia, Brazil, New Zealand có điều kiện thuận lợi cho các loài rong đỏ phát triển Cũng chính vì vậy, Philipine là đất nước có thị phần carrageenan cao nhất, chiếm 80 % trên thế giới. Trên thị trường có khoảng 4.000 sản phẩm hàng hoá có sử dụng carrageenan, trong đó công nghệ thực phẩm sử dụng nhiều nhất. Ngày nay, người ta biết thêm nhiều loại rong có khả năng sản xuất carrageenan. Những nghiên cứu chi tiết về loài rong này đã cho phép người ta có thể trồng ở trên quy mô lớn và do đó đáp ứng được nhu cầu nguyên liệu cho ngành công nghiệp sản xuất carrageenan. Theo thống kê trong vòng 25 năm qua, nhu cầu carrageenan trên thế giới tăng bình quân 5-7%/năm và dự báo sẽ tiếp tục tăng như vậy trong nhiều năm tới. Nhu cầu carrageenan cao gấp 3 lần so với alginate và gấp hơn 20 lần so với agar.  Thị trường hiện nay và các công ty sản xuất carrageenan Nghiên cứu thị trường buôn bán carrageenan trên thế giới cho thấy tốc độ phát triển sản xuất carrageenan trong thời gian gần đây là 3%/ năm . Hiện nay trên thế giới có 6 công ty sản xuất cung cấp trên 80% carrageenan.  Có hai loại công ty có thể phân biệt như sau: Công ty sản xuất polyme sinh học truyền thống, bao gồm: - Tổng công ty FMC của MỸ, www.fmcbiopholyme.com. - Cp kelco của Mỹ, hình thành năm 2000 qua sự hợp nhất copenhagen pectin/ food gum đã sát nhập của hercules và nhóm polyme sinh học Kelco của công ty Mónanto/ pharmacia, www.cpkelco.com. Các công ty sản xuất các thành phần hoàn thiện Ngoài carrageenan, các công ty còn tạo các chất như tạo nhũ tương, tạo hương vị. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 11
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG - Công ty Degussa của Đức, hình thành từ hệ sinh học SKW, www.degussa.com hoặc www.texturantsystems.com - Công ty Danisco của Đan Mạch, www.danisco.com - Công ty Quest international của Thụy Sĩ, một phần của ICI, www.questntl.com. [16]. Bảng 1.3. Sản lượng rong sụn trên thế giới năm 2001 STT Nước Sản lượng (tấn khô) 1 Indonesia 25.000 2 Philipines 115.000 3 Tazania (Zanzibar) 8.000 4 Khác 1.000 5 Tổng cộng 149.000 Nguồn: H. Porse, CP Kelco ApS, 2002, pers.comm. Sự phát triển nhanh chóng của ngành rong đã giúp tăng sản lượng rong nguyên liệu đáp ứng nhu cầu thi trường trong các năm. Bảng 1.4. Sản lượng rong sụn của các nước (tấn khô/ năm) [34]. TT Tên nước năm 2004 năm 2005 1 Philipines 110.000 2 Indonesia 55.000 80.000 3 Tazania 10.000 10.000 4 Campuchia 16.000 20.000 5 Việt Nam 1.000 2.000 6 Malaysia 6.000 6.000 7 Ấn Độ 200 1.1.6.2. Trong nước SVTH: NGUYỄN THỊ THU 12
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Những năm trước nghề trồng rong sụn vẫn còn hạn chế do người dân chưa nắm bắt được kĩ thuật trồng rong sụn dẫn đến năng suất thấp. Trong những năm gần đây rong sụn đang từng bước phát triển mang lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho người trồng, và đã thu hút rất nhiều hộ dân đầu tư vào trồng rong. Hàng năm người dân đã cung cấp cho thị trường trong nước và trên thế giới hơn 300 tấn rong. Hiện nay, nhu cầu rong sụn ở trong nước và trên thế giới đang ngày một tăng. Các công ty rong biển Việt Nam đã tậ trung thu mua rong biển 1500 tấn/tháng nhưng thị trường chưa đủ để đáp ứng. Vì vậy trung tâm khuyến ngư của các tỉnh ven biển, có điều kiện thuận lợi cho phát triển ngành rong đã và đang khuyến khích đầu tư mở rộng diện tích trồng rong sụn, tạo hướng phát triển mới cho ngành sản xuất và chế biến rong sụn. Sản lượng rong sụn của nước ta năm 2005 khoảng 2.000 tấn rong khô và vẫn còn tiếp tục tăng vào các năm tới. Gần đây ở nước ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất carrageenan ứng dụng thực phẩm: - TS Trần Thị Hồng, Nguyễn Bích Thủy, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xuân Nguyên (2003). Nghiên cứu tách chiết carrageenan thô và tinh chế phục vụ cho ngành công nghệ thực phẩm và phi thực phẩm. - PGS. TS Trần Thị Luyến giảng viên trường ĐH Thủy Sản Nha Trang cùng sinh viên Nguyễn Thành Thoại (2007) đã nghiên cứu thành công sử dụng carrageenan thay thế hàn the trong sản xuất giò chả. - TS. Đồng Thị Anh Đào, trường ĐH Bách Khoa TP Hồ Chí Minh (2007), nghiên cứu thành công sản xuất bánh, mứt, gia vị từ rong sụn. Hiện nay các nhà khoa học cũng đang tập trung nghiên cứu các đặc điểm, tính chất, thành phần hoá học của rong biển chứa carrageenan để đưa ra quy trình tách chiết vừa đảm bảo chất lượng vừa có hiệu suất thu hồi cao. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 13
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.2. GIỚI THIỆU CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 1.2.1. Lịch sử phát hiện Carrageenan bắt đầu được sử dụng hơn 600 năm trước đây, được chiết xuất từ rêu Irish moss (loài rong đỏ chondrus crispus) tại một ngôi làng trên bờ biển phía nam Ireland trong một ngôi làng mang tên Carraghen. Vào những năm 30 của thế kỉ XX, carrageenan được sử dụng trong công nghiệp bia và hồ sợi. Cũng trong thời kỳ này những khám phá về cấu trúc hóa học của carrageenan được tiến hành mạnh mẽ. Sau này, carrageenan được chiết xuất từ một số loài rong khác như Gigartina Stelata thuộc chi rong Gigartina. Nhiều loài rong khác cũng được nghiên cứu trong việc chiết tách carrageenan để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Ngày nay, sản xuất công nghiệp carrageenan không còn giới hạn chỉ tách chiết từ Irish moss, mà còn rất nhiều loài rong đỏ thuộc ngành rhodophyta đã được sử dụng, những loài này gọi chung là carrageenophyte. Qua nhiều nghiên cứu đã có hành chục loài rong biển được khai thác tự nhiên hay nuôi trồng để sản xuất carrageenan [16]. 1.2.2. Giới thiệu về carrageenan 1.2.2.1. Kết cấu đơn vị Carrageenan là một polysaccharide của galactose-galactan. Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfate được gắn vào carrageenan ở vị trí và số lượng khác nhau. Carrageenan không phải là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà carrageenan nói chung là một galactan sulfate. Mỗi galactan sulfate là một dạng riêng của carrageenan và có kí hiệu riêng. Thí dụ: i- carrageenan, λ-carrageenan, κ-carrageenan. Về cấu trúc carrageenan cung như agarose, carrageenan là polysaccharide có cấu tạo từ galactose và 3,6-anhydrogalactose, nhưng khác agarose ở chỗ là carrageenan chỉ chứa D- galactose và mức độ sulfate hóa cao hơn, còn agarose chứa 3,6-anhydrose-L-galactose. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 14
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Carrageenan có đơn vị cấu trúc được cấu tạo bởi hai đơn vị hợp phần. Đơn vị hợp phần có thể là vòng 3-β-D-galactose (đơn vị G), vòng 4-α-D-galactose (đơn vị D) hoặc vòng 4-3,6-anhydro-α-D-galactose (đơn vị DA) xen kẽ luân phiên nhau bằng các liên kết α(1 3) và β(1 4). Như vậy cấu trúc của carrageenan (disaccharide) có thể là (G+D) hoặc (G+DA) [16, 21]. Hình 1.4. Kết cấu của Carrageenan. 1.2.2.2. Phân loại carrageenan Carrageenan được phân loại theo hàm lượng 3,6-anhydrogalactose và vị trí nhóm ester sulfate, tạo nhiều sản phẩm có độ đông khác nhau. Việc thay đổi thành phần 3,6 - anhydrogalactose sẽ ảnh hưởng đến quá trình hydrat hóa, cấu trúc và độ bền của chất đông, nhiệt độ đông và nóng chảy. Nhìn chung, carrageenan có ba loại chính sau:  Kappa carrageenan (κ-carrageenan ) SVTH: NGUYỄN THỊ THU 15
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG κ-carrageenan là một polyme của -(1 3)-β-D-galactopyranose-4-sulfate- (1 4)-3,6-anhydro-α-D-galactopyranose-(1 3)-. κ- carrageenan được sản xuất bằng loại bỏ kiềm từ μ-carrageenan [21, 41]. - Hoà tan ở nhiệt độ cao. - Tạo khối đông (gel) cứng. - Độ bền của khối đông tăng lên khi có mặt của muối kali. Hình 1.5. κ-carrageenan [21].  Iota-carrageenan (i-carrageenan) i-carrageenan -1 3)-β-D-galactopyranose-4-sulfate(1 4)-3,6-anhydro- α-D-galactopyranose-2-sulfate-(1 3)-. i-carrageenan được sản xuất bằng loại bỏ kiềm từ ν-carrageenan[41]. - Có thể tan một phần ở nhiệt độ thấp. - Chỉ hòa tan hoàn toàn khi đun nóng dung dịch. - Độ bền của gel tăng lên khi có mặt của muối kali. - Hình thành khối đông dẻo và đàn hồi SVTH: NGUYỄN THỊ THU 16
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 1.6. i-carrageenan [21].  Lambda carrageenan (λ-carrageenan ) λ-carrageenan có monome hầu hết là -(1 3)-β-D-galactopyranose-2- sulfate-(1 4)-α-D-galactopyranose-2 ,6-disulfate-(1 3). λ-carrageenan (tách chiết chủ yếu là từ Gigartina pistillata hoặc Chondrus crispus) được chuyển thành θ-carrageenan (theta-carrageenan) bằng cách loại bỏ tính kiềm, nhưng ở một tốc độ chậm hơn nhiều so với việc sản xuất i-carrageenan và κ-carrageenan. - Có thể tan hoàn toàn ở nhiệt độ thấp. - Tạo dung dịch có độ nhớt cao mặc dù khong tạo đông. - Tương tác với protein tạo sự ổn định cho nhiều sản phẩm. Hình 1.7. λ-carrageenan [21]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 17
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.2.3. Tính chất của carrageenan 1.2.3.1. Tính chất hóa lý - Màu hơi vàng, màu nâu vàng nhạt hay màu trắng. - Carrageenan là chất kết tinh không định hình, hút nước trương nở, không tan trong nước lạnh, không tan trong ethanol và nước ấm, tan trong nước ở nhiệt độ trên 800C tạo thành một dung dịch sệt hay dung dịch màu trắng đục có tính chảy; phân tán dễ dàng trong nước hơn nếu ban đầu được làm ẩm với cồn, glycerol, hay dung dịch bão hòa glucose và sucrose trong nước. Khi làm nguội thì đông lại tạo thể gel khối có tính đàn hồi. - Ở thể gel carrageenan có thể chịu lực (sức đông). Và carrageenan lại có thể bị thủy phân cắt mạch khi tiếp xúc một trong các điều kiện: H+, OH-, t0 [6]. - Dạng bột thô, bột mịn và gần như không mùi. - Độ nhớt của dung dịch tùy thuộc vào loại carrageenan, khối lượng phân tử, nhiệt độ, các ion có mặt và hàm lượng carrageenan. - Cũng như những polymer mạch thẳng có mang điện tích khác, độ nhớt tỉ lệ thuận với hàm lượng. - Carrageenan có khả năng tương tác với nhiều loại gum, đặc biệt là locust bean gum, trong đó tùy thuộc vào hàm lượng nó sẽ có tác dụng làm tăng độ nhớt, độ bền gel và độ đàn hồi của gel. - Ở hàm lượng cao carrageenan làm tăng độ bền gel của guar gum nhưng ở hàm lượng thấp, nó chỉ có thể làm tăng độ nhớt. - Khi carrageenan được cho vào những dung dịch của gum ghatti, alginate và pectin nó sẽ làm giảm độ nhớt của các dung dịch này. - Carrageenan ổn định ở pH >7, phân hủy ở pH = 5-7, phân hủy nhanh ở pH< 5. a. Độ tan Carrageenan tan trong nước nhưng độ tan của nó phụ thuộc vào dạng, nhiệt độ, pH, nồng độ ion và các chất tan khác. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 18
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Nhóm carrageenan có cầu nối 3,6-anhydro không ưa nước, do đó các carrageenan này không tan trong nước. Nhóm carrageenan không có cầu nối thì dễ tan hơn. Thí dụ: λ-carrageenan không có cầu nối 3,6 anhydro và có thêm 3 nhóm sulfat ưa nước nên nó tan trong nước ở điều kiện bất kỳ. Đối với κ-carrageenan thì có độ tan trung bình [16]. Muối natri của κ-carrageenan tan trong nước lạnh nhưng muối kali của κ-carrageenan chỉ tan trong nước nóng. b. Độ nhớt Độ nhớt của dung dịch carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ, dạng, trọng lượng phân tử và sự hiện diện của các ion khác trong dung dịch. Khi nhiệt độ và lực ion của dung dịch tăng thì độ nhớt của dung dịch giảm. Các carrageenan tạo thành dung dịch có độ nhớt từ 25-500 Mpa, riêng κ-carrageenan có thể tạo dung dịch có độ nhớt tới 2000 Mpa. Sự liên quan tỉ lệ thuận giữa độ nhớt và trọng lượng phân tử của carrageenan có thể mô tả bằng công thức cân bằng của Mark-Houwink như sau [,16, 28, 35]: α [η] = K ( Mw ) Trong đó: η: độ nhớt Mw:trọng lượng phân tử trung bình K và α hằng số phụ thuộc vào dạng carrageenan và dung môi hòa tan. c. Tương tác giữa carrageenan với protein Đây là một trong những tính chất quan trọng của carrageenan và cũng là đặc trưng cho tất cả các chất tạo gel cũng như các chất không tạo gel và xuất hiện phản ứng với protein. Phản ứng này xảy ra nhờ các cation có mặt trong các nhóm protein tích điện tác dụng với nhóm sulfat mang điện âm của carrageenan và có tính quyết định đến độ bền cơ học của gel [16]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 19
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 1.8.Tương tác tĩnh điện giữa các nhóm sulfate của carrageenan và casein [16]. Trong công nghiệp sữa, nhờ vào tính chất liên kết của đặc biệt với các protein trong sữa mà carrageenan được sử dụng với nồng độ rất thấp 0.015-0.025% cũng đủ làm tác nhân để ngăn chặn sự tách lỏng và làm ổn định các hạt coca trong sữa socola [11,16]. Tương tác hiệp lực giữa carrageenan và protein trong sữa là tương tác tĩnh điện. Nhóm sulfate tự do trong carrageenan gây ra điện tích âm. Hình 1.9. Các hình thức liên kết của carrageenan với protein[16]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 20
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.2.3.2. Tính chất tạo gel Carrageenan có một tính chất vô cùng quan trọng là tạo gel ở nồng độ thấp (nhỏ hơn 0.5%). Dung dịch nóng của κ-carrageenan và i-carrageenan sẽ tạo gel khi được làm nguội xuống từ 400C–60oC dựa vào sự có mặt của các cation. Gel carrageenan có tính thuận nghịch về nhiệt và có tính trễ nhiệt, có nghĩa là nhiệt độ tạo gel và nhiệt độ nóng chảy của gel khác nhau. Gel này ổn định ở nhiệt độ phòng nhưng khi gia nhiệt cao hơn nhiệt độ tạo gel từ 5 – 12oC thì gel có thể chảy ra. Khi làm lạnh sẽ tạo gel lại. Ở dạng gel, các mạch polysaccharide xoắn vòng như lò xo và cũng có thể xoắn với nhau tạo thành khung xương không gian ba chiều vững chắc, bên trong có thể chứa nhiều phân tử nước (hay dung môi). Từ dạng dung dịch chuyển sang dạng gel là do tương tác giữa các phân tử polyme hòa tan với các phân tử dung môi ở bên trong, nhờ tương tác này mà gel tạo thành có độ bền cơ học cao. Phần xoắn vòng lò xo chính là những mầm tạo gel, chúng lôi kéo các phân tử dung môi vào vùng liên kết. Sự hình thành gel có thể gây ra bởi nhiệt độ thấp hoặc thêm các cation ở nồng độ nhất định. Quá trình hình thành gel diễn ra phức tạp, được thực hiện theo hai bước: Bước 1: Khi hạ nhiệt độ đến một giới hạn nào đó trong phân tử carrageenan có sự chuyển cấu hình từ dạng cuộn ngẫu nhiên không có trật tự sang dạng xoắn có trật tự. Nhiệt độ của quá trình chuyển đổi này phụ thuộc vào dạng và cấu trúc các carrageenan, cũng như phụ thuộc vào dạng và nồng độ của muối thêm vào dung dịch carrageenan. Do đó mỗi một dạng carrageenan có một điểm nhiệt độ tạo gel riêng. Bước 2: Gel của các polyme xoắn có thể thực hiện ở các mức độ xoắn. . Trong trường hợp đầu, sự phân nhánh và kết hợp lại sẽ xuất hiện cấp độ xoắn thông qua sự hình thành không đầu đủ của xoắn kép, theo hướng đó mỗi chuỗi tham gia vào xoắn kép với hơn một chuỗi khác. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 21
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG . Trong trường hợp thứ hai, các phần đã phát triển đầy đủ của đa xoắn tụ hợp lại tạo thành gel. Còn dưới các điều kiện khônng tạo gel, ở các nồng độ polyme thấp sự hình thành và hợp lại của các xoắn sẽ dẫn đến tăng độ nhớt. - Qua đó có thể mô tả cơ chế tạo gel như sau: Trước hết là sự xuất hiện chuyển đổi cấu hình từ dạng cuộn sang xoắn lò xo. Tiếp sau là sự kết hợp của các xoắn và tập trung lại một cách có trật tự tạo thành xoắn kép–gel. Như vậy gel sẽ tập hợp các xoắn có trật tự hay cong gọi là xoắn kép [16]. Hình 1.10. Tác dụng của nhiệt độ đối với cơ chế chuyển đổi từ dung dịch sang gel. Khả năng hình thành gel của carrageenan phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ dung dịch và hàm lượng muối có trong dung dịch,các ion kim loại. Ngoài ra còn phụ thuộc vào loại rong tách chiết, độ nhớt, sự hình thành và phân bố các gốc galactose trong mạch polymer và phụ thuộc nhiều vào công nghệ tách chiết [15]. 1.2.3.3. Tính chất hóa học Quá trình hình thành liên kết 3,6- anhydro: Đối với carrageenan, có một quá trình đáng lưu ý là chuyển đổi carrageenan từ nhóm cấu trúc không có cầu nối 3,6 anhydro D-galactose (G,D) (như ν, μ, λ, SVTH: NGUYỄN THỊ THU 22
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG carrageenan) thành các carrageenan thuộc nhóm cấu trúc có cầu nối 3,6 anhydro – D- galactose ( G,DA ) như κ, i, θ). ν và μ được xem như là tiền thân sinh học tự nhiên của κ, i-carrageenan tương ứng. Còn λ- không phải là tiền thân sinh học tự nhiên của θ-carrageenan vì trong λ-carrageenan có 3 nhóm este sulfate cụm lại xung quanh nhóm hydroxyl trên C3 của đơn vị 4-α-D-galactopyranose bảo vệ, ngăn chặn khỏi bị ion hóa và phân cực hóa làm giảm tốc độ phản ứng đóng vòng. Hơn thế nữa λ-carrageenan mang nhóm este sulfate ở vị trí C2 của đơn vị 3-β-D-galactopyranose sẽ có một ảnh hưởng khác nữa sinh do tương tác giữa các nhóm sulfate này với nhóm hydroxyl trên vị trí C3 của đơn vị 4-α-D-galactopyranose. Điều này có thể giải thích tại sao trong tự nhiên không có các dẫn xuất đóng vòng của λ- carrageenan, muốn có được phải thực hiện bằng con đường tổng hợp hóa học với các xúc tác đặc biệt. Hình. 1.11. Tương tác giữa các nhóm este sulfate trên C2 của đơn vị 3-β-D- galactopyranose và hydroxyl trên đơn vị 4-α-D-galactopyranose. Quá trình chuyển nhóm cấu trúc này được thực hiện trong môi trường kiềm mạnh, cầu nối 3,6 anhydro được hình thành do mất nhóm sulfate tại C6 của tiền thân và đồng thời hình thành cầu nối 3,6-anhydro. Cơ chế của sự hình thành này gồm hai bước: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 23
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 4 - Đầu tiên α-glactose-6 sulfate (D6s) chuyển từ sự cấu hình C1 thành cấu 1 0 0 hình C4 bởi việc tăng nhiệt độ (80 C-90 C), điều này đặt cả hai nhóm 6-O-SO3-Gal và C3 OH vào vị trí quanh trục. Sự có mặt của kiềm mạnh, xúc tác (NaBH4) sẽ ion hóa đồng thời các nhóm hydroxyl tự do (tại C2, C3 trong κ-carrageenan; tại C3 trong i-carrageenan) của liên kết (1-4) α-D-galactose, sản xuất ra anion O-. - Bước thứ hai, phản ứng đổi chuỗi nucleophil của C6-sulfate bởi sự tấn công của anion O- dẫn đến sự hình thành cầu nối 3,6 anhydro trong gốc galactose tương tự (DA) và sự biến mất nhóm sulfate tại C6. Sự hình thành liên kết cầu nối 3,6-anhydro trong tự nhiên được xúc tác bởi các enzyme sulphohydrolase. Các enzyme này ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp thành tế bào. Các tiền thân sinh học hình thành gel κ-carrageenan, i-carrageenan là µ và ν- carrageenan tương ứng Đối i-carrageenan quan hệ sinh tổng hợp giữa tiền thân và sản phẩm rõ ràng, nhưng với κ-carrageenan điều này còn mơ hồ bởi vì một số mẫu lai hóa κ-/i- carrageenan có chứa chỉ ν-carrageenan như một tiền thân sinh học. Sự có mặt của ν-carrageenan trong mẫu của κ-carrageenan từ kappaphycus alvarezii cho thấy các sản phẩm của nó chủ yếu là κ-carrageenan nguyên chất. Điều này khẳng định ν-carrageenan là tiền thân sinh học chung cho cả κ-, i-carrageenan và mỗi carrageenan khác nhau có qua trình sinh tổng hợp trong các giai đoạn khác nhau. Hai enzyme sulphohydrolase I và sulphohydrilase II xúc tác quá trình hình thành cầu nối 3,6 anhydro. Sulphohydrolase I nhường sulfate mà không biến đổi độ nhớt của polyme, các enzyme này tấn công một cách ngẫu nhiên. Còn sulphohydrolase II tách sulfate từ việc xử lý ν-carrageenan dẫn đến việc hình thành các chuỗi dài liên tục của dimer i-carrageenan và làm tăng đáng kể tính tạo gel của polysachride, chứng tỏ có sự hình thành cấu trúc xoắn lò xo [16]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 24
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 1.12. Quá trình chuyển hóa của carrageenan trong môi trường kiềm mạnh [41]. [Typ Bảng 1.5. Một số loài ronge a đỏ chứa carrageenan [3] quot Rong đỏ e Loại carrageenan chủ yếu from Chondrus crispus the Hỗn hợp của κ và λ docu Kappaphycus alvarezii ment Chủ yếu là κ. or Eucheuma denticulatum the Chủ yếu là i. sum mary Gigartina skottsbergii Chủ yếu là κ, một số λ of an inter Sarcothalia crispata estin Hỗn hợp của κ và λ. g Iradaea spp point Hỗn hợp của κ và i . You can 1.2.3.4. Quy trình tách chiếtposit carrageenan ion Nhìn chung quy trình tách chiết carrageenanthe từ rong biển trên thế giới cũng như Việt Nam đều có các công đoạn chủ yếutext sau: box - Xử lý rong trước khi nấu chiết.anyw here - Nấu chiết carrageenan. in the docu SVTH: NGUYỄN THỊ THU ment 25 . Use the Text Box
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG - Xử lý dịch chiết carrageenan. - Tách nước và làm khô carrageenan.  Xử lí kiềm - Rong sau khi ngâm, rửa các bụi bẩn sau đó xử lí bằng dung dịch kiềm có chế độ nhiệt độ và thời gian hợp lý. - Có nhiều phương pháp để xử lí rong trước khi nấu chiết như môi trường nước ấm, môi trường acid, môi trường kiềm. Tuy nhiên qua nghiên cứu cho thấy xử lý rong trong môi trường kiềm cho hiệu suất thu hồi cao nhất. - Mục đích của công đoạn này là dùng các yếu tố có khả năng khử các tạp chất (chất khoáng, chất màu, protein,cellulose, lipid ) không có lợi cho sản phẩm carrageenan. Đồng thời dung dịch kiềm còn có tác dụng bào mòn phần da của cây rong, làm suy giảm màng liên kết tế bào chứa carrageenan, dung dịch kiềm cũng giúp chuyển hóa D-galactose sulfate thành 3,6 anhydrogalactose trong carrageenan và làm tăng sức đông của carrageenan, từ đó tạo điều kiện cho việc rút ngắn thời gian nấu chiết, nâng cao hiệu suất và chất lượng sản phẩm.  Nấu chiết Nấu chiết là khâu quan trọng trong quá trình sản xuất carrageenan. Mục đích của công đoạn này là phải đạt hiệu suất thu hồi cao đồng thời vẫn đảm bảo chất lượng của carrageenan. Trong quá trình nấu chiết có nhiều yếu tố ảnh hưởng như môi trường nấu, nhiệt độ, thời gian, lượng nước, thiết bị.  Môi trường nấu chiết Môi trường nấu chiết là môi trường trung tính hay sử dụng môi trường có kiềm loãng, là môi trường cho sức đông của carrageenan cao. Do cấu trúc thân rong mềm yếu nên không nên nấu chiết trong môi trường có tính acid và môi trường kiềm và ở nhiệt độ cao sẽ phá vỡ mạch polyme của carrageenan, từ đó sẽ làm cho sức đông, độ nhớt và hiệu suất của carrageenan giảm xuống.  Nhiệt độ nấu chiết SVTH: NGUYỄN THỊ THU 26
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Carrageenan không tan trong nước lạnh và nước ấm, do đó muốn nâng cao hiệu suất thì nấu chiết ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hòa tan của nó. Nếu nhiệt độ quá cao thời gian nấu chiết giảm nhưng carrageenan bị thủy phân cắt mạch, làm sức đông giảm, nhiều tạp chất do cellulose của rong thủy phân cũng làm giảm chất lượng của carrageenan. Nếu nhiệt độ thấp, thời gian nấu kéo dài carrageenan cũng thủy phân cắt mạch làm sức đông của carrageenan giảm. Bên cạnh đó mức độ hòa tan và hiệu suất thu hồi của carrageenan cũng bị giảm. Khi nấu chiết ở nhiệt độ phù hợp sẽ làm cho tốc độ chiết rút nhanh, độ nhớt của dung dịch thấp nên dễ lọc.  Thời gian nấu chiết Phụ thuộc vào phương pháp xử lí rong trong khi nấu chiết, môi trường nấu chiết và nhiệt độ nấu chiết. Nếu thời gian quá dài làm một số phân tử carrageenan bị thủy phân phân cắt mạch làm độ chắc của thạch giảm. Nhiệt độ quá thấp không hòa tan hoàn toàn rong sẽ dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp.  Tỉ lệ nước nấu Lượng nước nấu ảnh hưởng lớn đến tỉ lệ thu hồi và độ chắc của carrageenan. Nếu lượng nước quá lớn thì tạo dung dịch keo có nồng độ thấp, độ chắc kém không thao tác được các công đoạn sau nhất là khâu ép, thể tích thạch lớn, cồng kềnh, gây tốn kém cho thao tác tách nước nhưng có ưu điểm là dễ lọc và có hiệu suất cao. Nếu lượng nước ít thạch chắc khắc phục được các nhược điểm trên nhưng có nhược điểm như do nồng độ dịch keo cao, độ nhớt lớn rất khó lọc tốc độ hòa tan của carrageenan từ nguyên liệu kém do độ nhớt cao hệ số khuếch tán giảm, chênh lệch nồng độ giữa nguyên liệu và dung dịch giảm. Do vậy trong thực tế cần xác định lượng nước nấu phù hợp để thõa mãn được những nhu cầu sau: dịch keo dễ lọc, thạc đông chắc với cường độ vừa phải có thể thao tác với các công đoạn sau dễ dàng.  Thiết bị chiết SVTH: NGUYỄN THỊ THU 27
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Trong phòng thí nghiệm có thể dùng cốc thủy tinh. Ngoài ra ở quy mô công nghiệp người ta thường dùng nồi hai vỏ hay thùng inox có nắp đặt hệ thống dẫn hơi nước hay các nồi inox, nồi gang đun lửa trực tiếp.  Xử lý hỗn hợp sau nấu chiết Thành phần hỗn hợp dịch keo rong sau khi nấu chiết bao gồm: Carrageenan hòa tan và là thành phần chính là sản phẩm sau này. Bã rong( tạp chất cơ học). Tạp chất hòa tan gồm có khoáng, sắc tố, các chất hữu cơ tan như: glucose, acid amin Do độ nhớt cao làm kìm hãm quá trình lắng của các hạt. Do đó lắng phải tiến hành ở nhiệt độ dưới 900C, thời gian lắng kéo dài ảnh hưởng chất lượng của carrageenan. Biện pháp hiệu quả là lọc. Nếu chọn vật liệu thích hợp thì tạp chất cơ học sẽ loại bỏ được hoàn toàn, dịch lọc sẽ trong. Tách tạp chất hòa tan người ta dùng phương pháp lọc hấp phụ. Chất hấp phụ thường là than hoạt tính có độ xốp cao, tẩy màu trong điều kiện liên tục khuấy đảo ở nhiệt độ 95-980C. Tốt nhất đun sôi hỗn hợp 15- 20 phút, rồi lọc tách tạp chất bằng máy lọc ép có lớp màng ngăn lọc bằng cellulose. Lượng than phụ thuộc vào tính hấp thụ của than và màu sắc của dịch. Lọc thô carrageenan được lọc ở nhiệt độ khoảng 700C-750C. Tuy nhiên cách lọc này có nhược điểm như không lọc được được các chất lơ lửng, không tẩy được màu. Sau khi quá trình lọc xong ta được dịch lọc và bổ sung thêm KCl, cồn vào cho phép ta thu được sản phẩm với hiệu suất thu hồi cao.  Lạnh đông, tan đá Dung dịch carrageenan là dịch keo nhớt chứa 95-99% là nước. Do đó trước khi làm khô phải có công đoạn tách nước cho carrageenan. Để tách nước cho carrageenan có thể thực hiện phương pháp lạnh đông tan đá. Nguyên lí của phương pháp: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 28
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Khi hạ nhiệt độ xuống dưới -150C nước liên kết trong carrageenan bị đóng băng còn carrageenan ở dạng keo tụ. Khi tan nước đóng băng chảy ra còn carrageenan không tan, kết quả nước tách khỏi carrgeenan.  Phương pháp lạnh đông Có thể sử dụng phương pháp lạnh đông nhanh hoặc lạnh đông chậm để lạnh đông dịch keo. Khi lạnh đông nhanh: Tinh thể nước đá nhỏ và các trung tâm kết tinh trong lòng khối keo. Khi lạnh đông chậm: Kích thước tinh thể đá lớn phân bố dày ở lớp ngoài các miếng carrageenan kết hợp với nhau thành kích thước lớn, khi tan giá làm khả năng hút nước trở lại.  Tan đá tách nước Trong quá trình rã đông, một phần hơi nước tách khỏi khối thạch nhờ sự thăng hoa hơi nước ở điều kiện nhiệt độ thấp, lượng nước còn lại tách khỏi khối keo theo chiều hướng tan đá và bay hơi, tan đá tách nước có thể tiến hành theo 2 cách: Tan giá tự nhiên (bằng không khí) Nước đá tan ra tự lách qua khe hở của colagen chảy nhỏ giọt xuống. Bản thân carrageenan có phin lọc cao phân tử, nên nó thúc đẩy quá trình tan nước đá. Như vậy nước sẽ tách khỏi colagen theo đường hướng một phần thăng hoa, một phần bay hơi và phần lớn sẽ tan nhỏ giọt. Tan giá bằng hơi nước Thông thường người ta sử dụng tan giá trong nước rồi sau đó ly tâm để tách lấy carrageenan. Sau khi tan giá trọng lượng của carrageenan giảm đi khoảng 75%. Điều kiện chạy đông và tan đá, tan giá thạch đông ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách nước. Sau khi sản phẩm đã đóng đá rồi ta đưa ra ngoài xả đá tách lấy sản phẩm (nếu sợi sản phẩm xốp có chứa nhiều nước thì dùng cồn để tách phần nước còn lại và cũng loại bỏ một phần màu làm cho sản phẩm sáng hơn).  Phương pháp sấy khô carrageenan SVTH: NGUYỄN THỊ THU 29
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sấy khô đến độ ẩm 20-22 % là công đoạn cuối cùng của công nghệ sản xuất tạo đông. Quá trình làm khô carrageenan có thể tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp hay nhiệt độ cao dưới áp suất thường hay trong chân không hoặc bằng các tia bức xạ Chế độ sấy, phương pháp chuẩn bị gel trước khi sấy khô sản phẩm quyết định nhiều đến màu sắc hình dạng và chất lượng của chất tạo đông khô Vì vậy việc chọn phương pháp sấy, chế độ sấy, thiết bị sấy đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các loại keo rong. Trong quá trình sấy các yếu tố: Thời gian, nhiệt độ sấy, pH của carrageenan ướt là các yếu tố chính quyết định đến tính chất lý, hóa học và chất lượng của sản phẩm. Thường sử dụng phương pháp sấy carrgeenan ở nhiệt độ thấp. - Làm khô tự nhiên: Trải carrageenan trên các giàn phơi với độ dày 3mm đem phơi nắng sau 2-3 ngày nắng tốt carrageenan khô hoàn toàn. Kiểu làm khô này đơn giản nhưng carrageenan dễ nhiễm tạp do tiếp xúc với môi trường xung quanh. - Làm khô bằng quạt thổi thông khí: Tốc độ gió 15-20m/s, sấy trong 5-6h. Cách này it bị nhiễm tạp và chất lượng cao nhưng tốn nhiều thời gian. Và cuối cùng cũng phải sấy lại hay phơi nắng để đạt độ ẩm 20-22%. - Ngoài ra để giảm thời gian sấy người ta có thể sử dụng thiết bị sấy phun. Cô đặc carrageenan trong nồi chân không với nồng độ 7% không nên cô đặc hơn vì lúc ấy dịch keo có độ nhớt cao, tính lưu động kém dễ đóng vón làm giảm năng suất của máy. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 30
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.2.4. Ứng dụng của carrageenan Bảng 1.6. Cơ cấu thị trường tiêu thụ carrageenan năm 2001. STT Lĩnh vực ứng dụng Tấn % 1 Bơ sữa 11.000 33 2 Thịt và gia cầm 5.000 15 3 Nước giải khát 5.000 15 4 Thực phẩm sử dụng 8.000 25 carrageenan tinh khiết 5 kem đánh răng 2.000 6 6 Khác 2.000 6 7 Tổng cộng 33.000 100 Nguồn: H. Porse, CP Kelco ApS, 2002, pers.comm. Carrageenan được ứng dụng ở nhiều dạng khác nhau trong nhiều sản phẩm mà chúng ta sử dụng hàng ngày, nhất là trong lĩnh vực thực phẩm bánh kẹo, tính phổ biến của carrageenan như vậy, chính vì carrageenan là sản phẩm có độ an toàn cao bảo đảm sử dụng không độc hại trong thực phẩm cũng như trong nhiều ngành khác. Các sản phẩm của carrageenan được sử dụng như một thành phần thực phẩm trong nhiều thế kỷ. Thực phẩm carrageenan với một trong lượng phân tử trung bình điển hình trên 100kDa, đã được chứng minh là hoàn toàn là không độc, không có dấu hiệu gây viêm loét trên cơ thể, có thể sử dụng trong thực phẩm với những lượng không giới hạn. Ban quản lý thuốc và thực phẩm của Mỹ cũng đã cho rằng thực phẩm có chứa carrageenan đã được công nhận chung là thực phẩm an toàn không có chất độc hoặc chất gây ung thư. Carrageenan đã được đưa vào danh mục các chất an toàn đối với việc sử dụng trong thành phần các sản phẩm thực phẩm. Tính phổ biến của carrageenan trong các sản phẩm được thể hiện trong bốn đặc điểm sau: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 31
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG - Carrageenan tham gia như một chất làm đông đặc đối với một số sản phẩm như kem, sữa, bơ, pho mat. - Carrageenan là một chất làm bền nhũ tương để giúp cho các dung dịch ở trạng thái nhũ tương cân bằng với nhau mà không bị tách lớp riêng rẽ. - Carrageenan làm thay đổi kết cấu của sản phẩm với tính chất hóa lý cơ học mong muốn, tạo ra các sản phẩm đông đặc có độ bền dai. - Carrageenan cũng giúp làm ổn định các tinh thể trong các sản phẩm như bánh kẹo để ngăn chặn đường hoặc nước đá kết tinh lại.Chính vì thế carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế quốc dân. Ứng dụng trong công nghiệp bơ sữa Ứng dụng trong mỹ Ứng dụng trong phẩm và kem đánh các ngành thực răng. Ứng dụng của phẩm khác carrageenan Ứng dụng trong Các ứng dụng trong y, dược học. kĩ thuật. Các ứng dụng của carrageenan. 1.2.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp bơ sữa Carrageenan có tác động đáng kể với protein của sữa, làm cho các hạt nhũ tương sữa nước bền vững. Chính vì yếu tố này mà carrageenan không thể thiếu trong công nghiệp chế biến sữa . Sữa nóng có chứa carrageenan được làm lạnh sẽ tạo gel. Gel giữ cho nhũ tương sữa với nước được bền vững, không bị phân lớp. Tạo gel chính là sự tương tác giữa các ion sulphat với các đuôi mang điện của các phân tử protein và các cation Ca 2+, K + có mặt trong sữa . Mức độ tạo gel với sữa của các carrageenan cũng khác nhau κ -carrageenan và i-carrageenan không tan trong sữa lạnh, do đó gel chỉ được tạo thành trong quá trình chuyển biến từ nóng (đun) sang lạnh, λ-carrageenan hòa tan trong sữa lạnh, do đó SVTH: NGUYỄN THỊ THU 32
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG không cần đun nóng vẫn tạo nhũ tương bền vững với sữa. Chính vì vậy λ- carrageenan được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến bơ, sữa, với tính năng [15]: - Tạo cảm giác mềm, dịu của sản phẩm, Tạo cho sản phẩm có cấu trúc mịn. - Là chất ổn định, lâu chảy, khả năng chịu nhiệt tốt. - Carageenan có tác dụng ổn định, nhũ hóa sữa và coca. - Với pho mát, giúp cho sản phẩm dễ cắt lát và lâu chảy. - Trong công nghệ sản xuất chocolate, yogurt, jelly: Bổ sung carrageenan vào để làm tăng độ đồng nhất, độ đặc nhất định[39]. 1.2.4.2. Ứng dụng trong các ngành thực phẩm khác Vì có gía trị nên carrageenan có thể thấy trong các loại thực phẩm khác nhau mà chúng ta sử dụng hàng ngày. Carrageenan đóng vai trò là chất phụ gia trong thực phẩm để tạo đông tụ, tạo tính mềm dẻo, đồng nhất cho sản phẩm và cho điểm nóng chảy thấp. Carrgeenan được dùng trong các món ăn trong thực phẩm: các món thạch, hạnh nhân, nước uống Trong sản xuất bánh mì, bánh bicquy, bánh bông lan carrageenan tạo cho sản phẩm có cấu trúc mềm xốp. Trong sản xuất kẹo: Làm tăng độ chắc, độ đặc cho sản phẩm,sản xuất các loại như mứt đông, mứt dẻo[39] Đặc biệt ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chế biến thủy sản: Carrageenan được ứng dụng tạo lớp màng cho sản phẩm đông lạnh, làm giảm hao hụt về trọng lượng và bay hơi nước, tránh sự mất nước của thịt gia cầm khi bảo quản đông . Trong bảo quản đóng hộp các sản phẩm thịt, bổ sung vào surimi và giò chả SVTH: NGUYỄN THỊ THU 33
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng 1.7. Các ứng dụng điển hình của carrageenan trong thực phẩm bánh kẹo [16] Dạng thực Dạng Chức năng của Nồng độ phẩm có thêm carrageenan carrageenan (% trọng lượng) carrageenan Nước gel ngọt κ-, i- Tạo gel. 0.6 - 0.9 Sữa trứng lạnh κ-, i- Đông tụ, tạo gel. 0.2 – 0.3 Sữa socola λ – Huyền phù tạo miếng. 0.01 – 0.03 Sữa i-, λ- Tạo nhũ tương. 0.05 Kem sữa κ-, i- Tăng độ bền nhũ tương. 0.01 –0.05 Kem κ- Ôn định nhũ,chống tách 0.01-0.02 lỏng. Sữa đậu nành κ-, i-, Huyền phù, tạo miếng. 0.02-0.04 Chế biến phomat κ- Nâng khả năng cắt lát 0.5 – 3.0 mỏng. Giữ độ ẩm, nâng khả Đóng hộp và chế κ- 0.6 biến thịt năng cắt lát mỏng. Nước chấm κ- Bia hoặc rượu κ- Tạo hương vị Một số trong nhiều thực phẩm có chứa carrageenan bao gồm: Kem, sữa, pho mát làm từ sữa đã gạn kem, bánh pudding (một loại bánh ăn tráng miệng), sirô, đồ uống lạnh, mứt ít đường và sữa chua. Các công ty chế biến thịt cũng đã sử dụng carrageenan trong quá trình chế biến các loại thịt thông thường và ít béo, bởi vì carrageenan có khả năng tăng hiệu suất các sản phẩm bằng cách giữ nước ở bên trong sản phẩm. Điều này cũng cho SVTH: NGUYỄN THỊ THU 34
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG phép cắt thành các lát thịt cứng và khô. Ngoài ra carrageenan đã được phát triển thành các sản phẩm thay thế các sản phẩm béo dựa trên cơ sở carrageenan có khả năng hình thành một gel khỏe và có vị béo rất tự nhiên. Theo xu hướng này, carrageenan có khả năng bắt chước kết cấu và tính cố hữu của chất béo để tiếp cận mới vào các thực phẩm ít béo và không béo. κ-carrageenan còn được sử nhiều trong các đồ uống. Carrageenan này được thêm vào rượu hoặc bia để tạo phức với protein có mặt trong đó và kết lắng cải thiện quá trình lọc đáng kể, giảm lượng vẩn gây đục bia, tăng hương vị của bia thành phẩm, tăng khả năng ổn định của bia lạnh. Như vậy carrageenan sẽ làm cho sản phẩm được trong hơn. 1.2.4.3. Các ứng dụng trong kĩ thuật Ngoài việc ứng dụng trong thực phẩm, carrageenan còn được ứng dụng nhiều trong kĩ thuật. Thí dụ: κ-carrageenan, i-carrageenan (0.15-0.25%) được sử dụng để ổn định và ngăn chặn sự lắng các hạt màu của sơn nước và mực. Việc thêm carrageenan cũng làm cải tiến khả năng tan chảy của sơn . Người ta còn thêm i- carrageenan (0.25-0.8%) để làm ổn định các chất không tan trong huyền phù mài mòn dịch và men gốm sứ. Trong công nghệ khoan giếng dầu, carrageenan và các polysachride khác đã được sử dụng để làm tăng độ nhớt của dung dịch khoan [16]. Carrageenan cũng được ứng dụng trong công nghiệp nhân tạo, phim ảnh, sản xuất giấy. Ngoài ra carrageenan là môi trường cố định enzyme là chất xúc tác trong công nghiệp tổng hợp và chuyển hóa các chất khác. 1.2.4.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm và kem đánh răng Không giống như các loại tinh bột và cellulose, carrageenan không bị phá hủy bởi enzyme cellulase, bởi vậy carrageenan cũng có thể sử dụng trong các hướng khác mà không liên quan đến thực phẩm. Do các đặc tính tạo gel và khả năng tạo màng mà carrageenan còn có các ứng dụng khác như để chế tạo các sản phẩm kem đánh răng ở các vùng nhiệt đới, chất dưỡng tóc, dầu gội đầu, phim ảnh. Mô hình kem đánh răng là hỗn hợp phức của các thành phần vô cơ và hữu cơ tạo nên thể huyền phù trong một pha liên tục, được làm ổn định bởi một chất keo tụ. Để ngăn chặn sự phân tách pha lỏng và pha rắn trong sản phẩm người ta thêm i- SVTH: NGUYỄN THỊ THU 35
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG carrageenan (0.8-1.2% trong lượng) làm chất keo tụ và hỗn hợp. λ-carrageenan (0.1-1% trong lượng) được sử dụng trong các dung dịch mỹ phẩm ở dạng lỏng và kem. Các dạng carrageenan tự nhiên có trọng lượng phân tử thấp đều được sử dụng để làm chất ổn định và đông tụ trong các loại nước gội đầu. Có trong thành phần của kem dưỡng da, sữa rửa mặt giúp và kem đánh răng giúp: Hoạt động như một chất tạo đông, kết dính, đồng nhất và làm chất nền cho mỹ phẩm. Chống kết tủa, tạo dạng nhũ tương hay hạt rắn nhỏ đồng nhất. Bổ sung vào kem đánh răng để chống lại sự tách lỏng, sự bào mòn trạng thái tạo các đặc tính tốt cho sản phẩm, tạo cấu trúc đồng nhất cho kem đánh răng. Dễ ứng dụng, dễ rửa sạch bằng nước. 1.2.4.5. Ứng dụng trong y, dược học Ngoài những ứng dụng nêu trên, hiện nay người ta đang chú ý đến hoạt tính sinh học của polysaccharide này để sử dụng trong y dược nhằm sản xuất các loại dược phẩm quan trọng. Carrageenan là chất nhũ hóa trong ngành dược phẩm để sản xuất ra các loại dược phẩm như các loại thuốc nhờn, nhũ tương để thoa lên các vết thương mau lành, làm màng bao cho thuốc. Cũng dựa vào tính chất carrageenan mang điện tích âm nên được ứng dụng trong việc điều chế thuốc loét dạ dày và đường ruột [9, 12]. Tóm lại carrageenan giúp: Ổn định dịch nhũ hóa dùng cho chế phẩm dung dịch thuốc hòa tan. Tăng độ đồng nhất cho chất keo. Có chức năng như một tác nhân tạo màng bao trong thuốc con nhộng. Đã có công trình nghiên cứu phát hiện thấy λ-carrageenan, κ-carrageenan từ rong đỏ gigartina, Carrageenan từ hypnea muskiformis wulfen và một số loài rong đỏ khác có tính chất chống khoáng bổ trợ, hạn chế phát triển huyết khối, chống huyết khối chống đông tụ [16]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 36
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 2.13. Đa dạng hóa các sản phẩm từ rong sụn và sản phẩm cuả nó. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 37
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM KHẢO SÁT THÍ NGHIỆM Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2011 tại phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học.Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. 2.2. VẬT LIỆU 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Rong sụn-Kappaphycus alvarezii dạng khô được mua ở vùng biển Tháp Chàm, Ninh Thuận tháng 3 năm 2011. 2.2.2. Thiết bị-dụng cụ Máy đo quang UV-vis. Bộ chưng cất Kjeldahl. Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ủ Pipet, đũa khuấy, nhiệt kế, giấy đo độ pH, cốc thủy tinh, bình định mức, ống nghiệm, ống đong Bếp đun, nồi hút ẩm 2.2.3. Hóa chất KOH (4, 6, 8)% HCl 2.5mM HCl 6M Phenol Sorbitol 70% Thanol tuyệt đối H2SO4 đđ Ethylen blue 0.41mM H2SO4 0.1N NaOH 45% BaCl2 NaOH 0,1 N K2SO4 Thuốc thử Bradford HCl 0.001N Thuốc thử Tashiro SVTH: NGUYỄN THỊ THU 38
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Sơ đồ tách chiết carrageenan từ rong sụn Quy trình: Rong sụn khô Rửa sạch Rong/nước (w/v): Ngâm qua đêm 1/50 KOH(%): 4%, 6%, 8%. Rong/dd KOH(w/v): 1/20. Xử lý kiềm Thời gian 120 phút. 0 Nhiệt độ 50 C. Rửa trung tính HCl 0.001N Rong/nước (w/v): 1/40. Thời gian: 60phút, 70phút, Nấu chiết 80phút. Nhiệt độ: 800C, 900C. Lọc Bã rong Dịch lọc Phân tích các chỉ tiêu (protein, Lạnh đông, tan giá carrageenan, carbohydrate, sulfate) Phơi sấy Carrageenan SVTH: NGUYỄN THỊ THU 39
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Thuyết minh quy trình  Rửa sạch, ngâm nước - Cân các mấu rong, mỗi mẫu 5g rong khô rửa sạch, loại bỏ tạp chất. - Ngâm qua đêm bằng nước máy, ở nhiệt độ thường, với tỉ lệ rong/nước (w/v) là 1/50 cho trương nở.  Xử lí kiềm - Rong sau khi ngâm và rửa các bụi bẩn được xử lí bằng KOH với tỉ lệ rong/ dung dịch KOH (w/v) là 1/20. Hỗn hợp rong/KOH được ủ ở nhiệt độ 500C, trong thời gian 120 phút, thỉnh thoảng có khuấy đảo và giúp lưu chuyển dung dịch kiềm đều cho mẫu rong.  Rửa trung tính Tiến hành rửa trung tính bằng nước sạch đến khi nước trong, tiếp theo dùng acid HCl (0.001M) để trung hòa hết lượng kiềm còn dư đến khi dung dịch có độ kiềm loãng khoảng 7,5-8.0.  Nấu chiết Các mẫu rong sau khi được xử lý, tiến hành chế độ nấu chiết ở bảng 2.1 Bảng 2.1. Chế độ nấu tách chiết carrageenan từ rong sụn KOH xử lý (%) Nước/ rong Nhiệt độ nấu (0C) Thời gian nấu (phút) (v/w) 4 40/1 80 60 4 40/1 80 70 4 40/1 80 80 4 40/1 90 60 4 40/1 90 70 4 40/1 90 80 6 40/1 80 60 6 40/1 80 70 6 40/1 80 80 6 40/1 90 60 6 40/1 90 70 6 40/1 90 80 8 40/1 80 60 8 40/1 80 70 8 40/1 80 80 8 40/1 90 60 8 40/1 90 70 8 40/1 90 80 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 40
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Các mẫu được nấu chiết bằng cách đun lửa trực tiếp trên bếp đun.  Lọc Sau khi nấu với thời gian và nhiệt độ tương ứng, thu được hỗn hợp dịch keo rong gồm các thành phần: Carrageenan hòa tan. Bã rong (tạp chất cơ học). Tạp chất hòa tan gồm có khoáng, sắc tố, các chất hữu cơ tan như glucose, acid amin Hỗn hợp này sau đó được lọc thủ công với 20 lớp vải màn. Nhiệt độ của dung khi dịch lọc khoảng 700C-750C.  Lạnh đông, tan đá - Lạnh đông: Dịch carrageenan sau khi lọc được thu nhận sau đó để nguội và cho vào ngăn mát của tủ lạnh để keo ổn định. Tiếp tục cho vào tủ đá khoảng 48 giờ để keo đông cứng, rồi đưa ra tan đá tách nước. - Tan đá tự nhiên (bằng không khí): Lấy carrageenan được lạnh đông để trên cái giá được để trong chậu nước ấm khoảng 600 C. Sau 2-3h nước chảy xuống chậu và một phần nước cũng bị bốc hơi, còn lại là carrageenan.  Phương pháp sấy khô carrageenan Làm khô tự nhiên: Carrageenan sau khi tan đá cắt thành những mẫu dày 3mm, trải carrageenan trên các giàn phơi có các lỗ nhỏ, đem phơi nắng. Sau 3 ngày nắng tốt, carrageenan khô hoàn toàn. 2.3.2. Phương pháp xác định độ ẩm [10]. Để xác định hàm lượng ẩm trong rong sụn ta có thể sử dụng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi. Ngoài ra ta có thể xác định hàm lượng ẩm của rong sụn bằng máy đo độ ẩm. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 41
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 2.1. Tủ sấy Hình 2.2. Nồi hút ẩm Nguyên tắc Sấy mẫu ở nhiệt độ thích hợp để đuổi nước ra khỏi mẫu cho đến khi phần còn lại của mẫu có khối lượng không đổi. Tiến hành Xác định độ ẩm nguyên liệu: - Sấy cốc ở 1050C đến khối lượng không đổi, cân cốc, sau đó cân 3g rong sụn khô cho vào cốc và đem đi sấy ở 850C. - Sau 3h lấy ra cho vào rồi hút ẩm khoảng 15 phút và cân lại cốc chứa mẫu. Sau đó tiếp tục sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi. Công thức tính độ ẩm: 1 − 2 Độ ẩm (%) = × 100 1− Trong đó: M : Khối lượng của dụng cụ sấy (cốc) (g). M1 :Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g). M2 :Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g). SVTH: NGUYỄN THỊ THU 42
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 2.3.3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl [8, 10] Nguyên lý: Vô cơ hóa mẫu phân tích bằng acid H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Dùng kiềm mạnh đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng một acid. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa như sau: 2H2SO4 = 2H2O + 2SO2↑+ O2 Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein phân hủy thành các acid amin, carbon và hydro của acid amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca chuyển thành dạng oxid: P2O5, K2O, CaO Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng chứa H2SO4. NH4OH + H2SO4 = (NH4)2SO4 + H2O Tiến hành a. Vô cơ hóa mẫu Cân 0.2g rong cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc sẽ xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). Cho 0.2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. (Giai đoạn này được thực hiện trong tủ hút , đặt bình hơi nghiêng trên bếp đun, tránh trường hợp khi sôi hóa chất bắn ra ngoài. Khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và amoniac không bị bay mất). Khi đun theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hóa vào trong dung dịch, tiếp tục đun cho đến khi dịch trong SVTH: NGUYỄN THỊ THU 43
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. b. Cất đạm Chuyển 25 ml dung dịch bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 20ml NaOH 45% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu lá mạ (thêm 5ml NaOH 45% nếu dung dịch chưa chuyển qua màu lá mạ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn, bật công tắc cất đạm. Kiểm tra hơi sinh ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không nếu không thêm NaOH 45%. Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được, ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội đem hệ thống đi rửa. c. Chuẩn độ Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1N sử dụng . Hình 2.3. Màu trước Hình 2.4. Màu sau chuẩn độ. chuẩn độ. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 44
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG d. Tính kết quả Hàm lượng % nitơ tổng số 1.42 ×( 1− 2)×100 N (mg%) = × k Với: V1: Số ml H2SO4 cho vào bình hứng. V2: Số ml NaOH 0.1N cho vào chuẩn độ. a: Số g nguyên liệu. 1,42: Hệ số, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương 1,42g nitơ. k: Hệ số pha loãng. Hàm lượng % protein tổng số: P (mg%) = N × b N: Hàm lượng % nitơ tổng số. b: Hệ số chuyển đổi trung bình là 6.25. 2.3.4. Phân tích các chỉ tiêu Dịch lọc carrageenan Xác định hiệu suất thu hồi Pha loãng carrageenan Phân tích các chỉ tiêu của dịch carrageenan Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng protein carrageenan carbohydrate sulfate Hình .2.5. Phân tích các chỉ tiêu của dịch lọc carrageenan SVTH: NGUYỄN THỊ THU 45
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 2.3.1.1. Xác định hàm lượng protein của carrageenan bằng phương pháp Bradford. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine Serum Albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế. Tiến hành Dựng đường chuẩn albumin: Chuẩn bị 6 ống nghiệm, sau đó hút lần lượt các hóa chất vào các ống nghiệm theo bảng 3.2. Chuẩn bị dung dich albumin gốc có nồng độ 0.1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn. Bảng 2.2. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin. Ống nghiệm Đối 1 2 3 4 5 chứng Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch albumin chuẩn 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (0.1mg/ml) Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 46
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sau khi cho đầy đủ các chất như bảng 3.2. Lắc đều các ống nghiệm, để yên trong 10 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm. Đo mẫu thu được tính hàm lượng protein chuẩn bị mẫu: pha loãng mẫu đến nồng độ 10-1. Mỗi lần tiến hành thực hiện ba mẫu và được thực hiện theo bảng 2.3 Bảng .2.3. Các bước chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượngprotein STT Đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Vmẫu (ml) 0 1 1 1 VH2O (ml) 1 0 0 0 VThuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 Các mẫu sau khi chuẩn bị được lắc đều để yên khoảng 20 phút, và đo độ hấp thu của mẫu ở bước sóng 595nm. Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. Tính kết quả: Hàm lượng protein được tính theo công thức: Hàm lượng protein(mg/ml) = X×10-3 × n Với: X: Nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (mg /ml). n: Hệ số pha loãng. 2.3.1.2. Xác định hàm lượng carrageenan[24] Chuẩn bị: Dung dịch Methylen Blue 0.41mM. Dung dịch HCl 2.5 mM. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên bước sóng hấp thu của thuốc nhuộm Methylen Blue khi tạo phức với carrageenan. Khi Methylen Blue tương tác với carrageenan ở nồng độ thấp sẽ tạo ra một phức màu. Tương tác này làm cho phức màu từ màu xanh (có bước sóng hấp thụ cực đại 610nm và 664nm) thành phức màu tím có bước sóng hấp thụ là 559nm [24] SVTH: NGUYỄN THỊ THU 47
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Hình 2.6. Cấu trúc của Methylen Blue [ 24] Tiến hành Dựng đường chuẩn carrageenan Chuẩn bị dung dịch carrageenan gốc: Đun nóng 200 ml dung dịch HCl 2.5 mM, sau đó cho từ từ 1g bột carrageenan vào cốc và khuấy liên tục. Tiếp tục đun dung dịch cho đến khi dung dịch tan hoàn toàn. Sau đó dung dịch sẽ được làm nguội, cho thêm dung dịch HCl 2.5 mM cho tổng thể tích của dung dịch là 250ml (dung dịch gốc), đậy cốc để ngăn sự thoát hơi nước. Pha loãng dung dịch gốc thành nồng độ 0.02% (dung dịch chuẩn). Chuẩn bị 11 bình định mức và thực hiện như bảng 2.4 Bảng 2.4. Số liệu dựng đường chuẩn carrageenan. STT Nồng độ Dung dịch VH2O (ml) VMethylen Blue carrageenan(μg/ml) carrageenan chuẩn (ml) (0.02%) (ml) 0 0 0 10 10 1 0.01 1 10 10 2 0.02 2 10 10 3 0.03 3 10 10 4 0.04 4 10 10 5 0.05 5 10 10 6 0.06 6 10 10 7 0.07 7 10 10 8 0.08 8 10 10 9 0.09 9 10 10 10 0.10 10 10 10 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 48
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sau khi hút xong các chất và định mức các bình đến vạch bằng nước cất và tiếp sau lắc đều để yên 15 phút cho màu ổn định và đi so màu ở bước sóng 559 nm. Chuẩn bị mẫu: mẫu được pha loãng 200 lần. Chuẩn bị 4 bình định mức 100ml và tiến hành theo bảng 2.5. Bảng 2.5. Bảng chuẩn bị mẫu phân tích carrageenan STT Đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Vmẫu (ml) 0 10 10 10 VH2O (ml) 10 10 10 10 VMethylen Blue (ml) 10 10 10 10 Thực hiện xong các bước ở bảng 2.5 tiến hành định mức các mẫu bằng nước cất, lắc đều và để yên trong 15 phút. Sau đó đi đo độ hấp thu ở bước sóng 559nm. Dựa vào phương trình hồi quy tính hàm lượng của mẫu. Công thức tính hàm lượng carrageenan Hàm lượng carrageenan (mg/ml) = X×10-3×n Trong đó: X: Nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (g/ml). n: Hệ số pha loãng của dịch carrageenan. 2.3.1.3. Xác định hàm lượng sulfate [37] Nguyên tắc: Hàm lượng ion sulfate được xác định bằng phương pháp đo độ đục. Trong môi trường acid ion sulfate sẽ được phản ứng với Barium Chloride (BaCl2) hình thành các tinh thể BaSO4. Hỗn hợp BaSO4 kết tủa trắng sau đó được đo độ hấp thu ở bước sóng 470nm. Phương trình phản ứng: Tiến hành: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 49
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Dựng đường chuẩn K2SO4: Cân 0.01g K2SO4 thêm vào 10ml nước làm dung dịch chuẩn 1mg/ml. Khi tiến hành phân tích ta pha loãng dung dịch thành các nồng độ 10, 20 50µg/ml bằng nước cất. Chuẩn bị 6 ống nghiệm theo bảng 2.6 Bảng 2.6. Số liệu dựng đường chuẩn sulfate Stt Đối chứng 1 2 3 4 5 Nồng độ 0 10 20 30 40 50 K2SO4(µg/ml) Nồng độ K2SO4 chuẩn 0 0.5 0.1 1.5 2.0 2.5 (0.1mg/ml) VH2O (ml) 5 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 V HCL6M (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Vsorbitol (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 BaCl2 (mg) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Lắc đều các ống nghiệm rồi để yên khoảng 15 phút và so màu ở bước sóng 470nm . Chuẩn bị mẫu: mẫu phân tích được pha loãng với nồng độ 10-1. Sau đó chuẩn bị 4 ống nghiệm và thực hiện theo bảng 2.7. Bảng 2.7. Bảng chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng sulfate STT Đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Vmẫu (ml) 0 2.5 2.5 2.5 H2O (ml) 5 2.5 2.5 2.5 VHCL6M (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 Vsorbitol (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 BaCl2 (mg) 0.5 0.5 0.5 0.5 Sau khi hút các chất ở bảng 2.7, lắc đều các ống nghiệm. Sau 20 phút đi đo độ hấp thu ở bước sóng 470nm. Công thức tính hàm lượng sulfate của carrageenan: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 50
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG X (mg/ml) = A × n × 10-3 Trong đó: X: Hàm lượng sulfate của carrageenan (mg/ ml) A: Nồng độ sulfate suy ra từ đường chuẩn (g/ml) n: Hệ số pha loãng của dịch chiết carrageenan. 2.3.1.4. Xác định hàm lượng carbohydrate [39] Nguyên tắc: trong môi trường acid mạnh carbohydrate (các loại đường đơn, oligosaccharide, polysaccharide và các dẫn xuất của chúng) tạo ra các dẫn xuất của furan. Những dẫn xuất này ngưng kết với phenol hình thành hỗn hợp có màu vàng tương đối bền. Hỗn hợp này sau đó sẽ được đo độ hấp thu ở bước sóng 490nm [39]. Tiến hành: Dựng đường chuẩn D-galactose Cân 0.01g D-galactose pha trong 10ml nước cất, khi phân tích pha loãng dung dịch chuẩn thành các nồng độ 20, 40 100µg/ml. Sau đó chuẩn bị 6 ống nghiệm, thực hiện theo bảng 2.8. Bảng 2.8. Số liệu dựng đường chuẩn carbohydrate Stt Đối chứng 1 2 3 4 5 D-galactose 0 20 40 60 80 100 V H2O(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 V-D-galactose chuẩn 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0,2mg/ml(ml) V phenol 10% 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 V H2SO4 đđ(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 490nm Chuẩn bị mẫu: mẫu phân tích được pha loãng 50 lần. Chuẩn bị 4 ống nghiệm và thực hiện theo bảng 2.9. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 51
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng.2.9. Bảng chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng carbohydrate STT Đối chứng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 V H2O (ml) 0.5 0 0 0 V mẫu (ml) 0 0.5 0.5 0.5 V phenol 10% 0.5 0.5 0.5 0.5 V H2SO4 đđ(ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 Sau khi hút xong các chất ở bảng 2.9, lắc đều các ống nghiệm, để yên trong 30 phút đo độ hấp thu ở bước sóng 490nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định nồng độ của carbohydrate của mẫu. Công thức tính hàm lượng của carbohydrate : Hàm lượng carbohydrate (mg/ml) = A × n × 10-3 Trong đó: A: Nồng độ carbohydrate suy ra từ đường chuẩn (g/ml) n: Hệ số pha loãng của dịch chiết carrageenan. 2.3.1.5. Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm Dịch chiết chứa carrageenan sau khi thu hồi, sẽ được để đông và cho vào lạnh đông và đưa ra tan giá, sau đó cắt carrageenan thành những miếng dày khoảng 3mm tiếp theo là rải đều trên khay và phơi 2-3 ngày dưới ánh sáng mặt trời, rồi đem đi cân và tính hiệu suất suất thu hồi của carrageenan [9, 31]. Công thức xác định hiệu suất thu hồi carrageenan: X (%) = × 100 Trong đó: X: Hàm lượng carrageenan so với rong (%). A: Khối lượng carrageenan thu được sau khi phơi (sấy) khô (g). B: Khối lượng rong sụn khô đem đi chiết carrageenan (g). 2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm statgraphic và Excel. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 52
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu Bảng 3.1. Độ ẩm của rong nguyên liệu STT Thí nghiệm Độ ẩm (%) 1 TN1 19.5 2 TN2 20.66 3 GTTB 20.08 TN: Thí nghiệm. GTTB: Giá trị trung bình. Nhận xét: Qua bảng 3.1 cho thấy không có sự khác biệt giữa các lần lặp lại thí nghiệm. Độ ẩm trung bình của nguyên liệu khảo sát có cao hơn độ ẩm của các nghiên cứu khác [12,14] (18-20%) nhưng không đáng kể. 3.2. Xác định hàm lượng protein tổng tổng Bảng 3.2. Hàm lượng protein tổng số STT Thí nghiệm Hàm lượng mg % protein tổng số 1 TN1 11.66 2 TN2 11.58 3 TN3 12.74 4 GTTB 11,99 TN: Thí nghiệm. GTTB: Giá trị trung bình. Nhận xét: Qua kết quả bảng 3.2 cho thấy không có sự khác biệt đáng kể khi tiến hành lặp lại các thí nghiệm. Hàm lượng protein trung bình (11,99%) của mẫu khảo sát nằm trong khoảng dao động cuả hàm lượng protein và cho thấy rong nguyên liệu có thể là thu hoạch vào khoảng tháng 11-12. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 53
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 3.3. Xác định hàm lượng protein đ/c: mẫu đối chứng. A: mẫu được xử lý kiềm %. B: mẫu được xử lý kiềm 6%. C: mẫu được xử lý kiềm 8%. Hình 3.1. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng protein. Hàm lượng protein của carrageenan được đo bằng phương pháp đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm, được thể hiện qua bảng 3.3 và biểu đồ 3.1. Bảng 3.3. Hàm lượng protein của carrageenan. KOH (%) Nhiệt độ Thời gian Hàm lượng protein nấu (0C) nấu (phút) (mg/ml) 4 80 60 0.4 4 80 70 0.62 4 80 80 0.54 4 90 60 0.44 4 90 70 0.64 4 90 80 0.53 6 80 60 0.38 6 80 70 0.59 6 80 80 0.56 6 90 60 0.49 6 90 70 0.61 6 90 80 0.5 8 80 60 0.35 8 80 70 0.54 8 80 80 .52 8 90 60 0.48 8 90 70 0.45 8 90 80 0.37 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 54
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Biểu đồ 3.1.Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein của carrageenan. Nhận xét: Qua đồ biểu đồ 3.1.đã cho thấy hàm lượng protein của carrageenan sự thay đổi khi được xử lý bằng các chế độ khác nhau: Trong cùng một nhiệt độ và thời gian nhưng khác nhau về nồng KOH cho thấy phần lớn hàm lượng protein tỉ lệ nghịch với nồng độ kiềm (ngoại trừ thời gian 60’900 và 80’800 thì hàm lượng protein tăng khi nồng độ KOH tăng(4-6%) và giảm khi nồng độ KOH tăng (6-8%). Điều này cho thấy hàm lượng protein cũng chịu ảnh hưởng của các yếu tố (thời gian, nhiệt độ, nồng độ kiềm) nhưng ở các mức độ khác nhau. Trong cùng nồng độ và thời gian nhưng khác nhiệt độ thì hàm lượng protein tăng dần nhưng ở 70’900 và 80’900 thì hàm lượng protein có phần giảm xuống. Trong cùng nồng độ và nhiệt độ nhưng khác nhau về thời gian cho thấy hàm lượng protein chủ yếu là giảm xuống. Trừ mẫu ở 60’900 và 80’800 có sự thay đổi. Hàm lượng protein cao nhất (0,64mg/ml) ở nồng độ kiềm xử lý 4%, nhiệt độ nấu 900 phút và thời gian nấu 70 phút. Hàm lượng protein thấp nhất là 0,35 mg/ml ở nồng độ kiềm xử lý là 8%, thời gian nấu 60 phút và nhiệt độ nấu 800. Về mặt thống kê thì chỉ có thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng protein ở mức ý nghĩa 0.05. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 55
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 3.4. Xác định hàm lượng carrageenan đ/c: mấu đối chứng. A: mẫu được xử lý kiềm 4%. B: mẫu được xử lý kiềm 6% C: mẫu được xử lý kiềm 8%. Hình 3.2. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng carrageenan. Hàm lượng carrageenan cũng được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 559nm, được biểu diễn ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.2. Bảng 3.4. . Hàm lượng carrageenan của rong sụn. KOH Nhiệt độ nấu Thời gian Hàm lượng (%) (0C) nấu (phhút) carrageenan (mg/ml) 4 80 60 17.55 4 80 70 1.55 4 80 80 21.3 4 90 60 20.95 4 90 70 23.95 4 90 80 23.18 6 80 60 19.25 6 80 70 22.35 6 80 80 22.05 6 90 60 23.05 6 90 70 24.65 6 90 80 24 8 80 60 19.65 8 80 70 19.68 8 80 80 20.5 8 90 60 22.2 8 90 70 23.75 8 90 80 23.15 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 56
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Biểu đồ 3.2. Biểu đồ biễu diễn hàm lượng carrageenan Nhận xét: Qua biểu đồ 3.2 cho thấy hàm lượng carrageenan của mẫu rong: Trong cùng một nhiệt độ và thời gian nhưng khác nhau về nồng KOH cho thấy phần lớn hàm lượng carrageenan cao nhất là khi được xử lý với kiềm 6%. Chỉ có ở điều kiện thời gian nấu 60 phút và nhiệt độ nấu 800 thì nồng độ kiềm xử lý 8% là hàm lượng carrageenan cao nhất. Trong cùng nồng độ và thời gian nhưng khác nhiệt độ thì hàm lượng carrageenan tăng dần. Trong cùng nồng độ và nhiệt độ nhưng khác nhau về thời gian cho thấy hàm lượng carrageenan tăng. Ngoại trừ mẫu 70phút 800và 80phút 800 có sự thay đổi giảm xuống. Hàm lượng carrageenan cao nhất là 24,65mg/ml ở nồng độ kiềm xử lý 6%, nhiệt độ nấu 90 phút và thời gian nấu 70 phút. Hàm lượng carrageenan thấp nhất là 60 phút, 800, nồng độ kiềm xử lý 4%. Về mặt thống kê các yếu tố đều ảnh hưởng lên hàm lượng carrageenan ở mức ý nghĩa 0.05. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 57
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 3.5. Xác định hàm lượng sulfate đ/c: mẫu đối chứng. 1: mẫu được xử lý kiềm 4%. 2: mẫu được xử lý kiềm 6%. 3: mẫu được xử lý kiềm 8%. Hình .3.3. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng sulfate. Bảng 3.5. Hàm lượng sulfate của carrageenan. KOH (%) Nhiệt độ nấu Thời gian nấu (phút) Hàm lượng sulfate (0C) (mg/ml) 4 80 60 0.1171 4 0 70 0.13 4 80 80 0.11 4 0 60 0.1284 4 90 70 0.1286 4 90 80 0.1357 6 80 60 0.1163 6 80 70 0.1285 6 80 80 0.105 6 90 60 0.1156 6 90 70 0.1204 6 90 80 0.1237 8 80 60 0.1214 8 80 0 0.1165 8 80 80 0.095 8 90 60 0.1035 8 90 70 0.1172 8 90 80 0.1203 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 58
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG . Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biễu diễn hàm lượng sulfate của carrageenan Nhận xét: Qua biểu đồ ta nhận thấy rằng: Hàm lượng sulfate của carrageenan được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 470nm, được ghi nhận ở bảng 3.5 và biểu đồ 3.3. Trong cùng một nhiệt độ và thời gian nhưng khác nhau về nồng KOH cho thấy phần lớn hàm lượng sulfate giảm dần (ngoại trừ các mẫu được xử lý ở thời gian 60’800 thì có sự thay đổi). Trong cùng nồng độ và thời gian nhưng khác nhiệt độ thì mẫu được xử lý kiềm 4% thì tỉ lệ thuận với nhiệt độ và thời gian.còn ở các chế độ xử lý khác có sự dao động (0.095mg/ml ở 80’800, nồng độ kiềm 6% đến 0,1285mg/ml ở 70’800, nồng độ kiềm xử lý là 6%. Trong cùng nồng độ và nhiệt độ nhưng khác nhau về thời gian cho thấy hàm lượng sulfate giảm xuống. Trừ mẫu 60’800 có sự thay đổi. Hàm lượng sulfate cao nhất 0.1357mg/ml ở nồng độ kiềm xử lý 4%, nhiệt độ nấu 900 phút và thời gian nấu 80 phút. Hàm lượng sulfate thấp nhất 0.095mg/ml là 80phút, 800, nồng độ kiềm xử lý 8%. Về mặt thống kê các yếu tố không có ảnh hưởng đáng kể lên hàm lượng sulfate ở mức ý nghĩa 0.05. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 59
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 3.6. Xác định hàm lượng carbohydrate đ/c: mẫu đối chứng. 1: mẫu được xử lý kiềm 4%. 2: mẫu được xử lý kiềm 6%. 3: mẫu được xử lý kiềm 8% Hình 3.4. Sự hiện màu phản ứng xác định hàm lượng carbohydrate. Hàm lượng carbohydrate của carrageenan được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 490nm và được thể hiện qua bảng 3.6. và biểu đồ 3.4. Bảng 3.6. Hàm lượng carbohydrate của carrageenan. KOH Nhiệt độ Thời gian nấu Hàm lượng (%) nấu (0C) (phút) carbohydrate (mg/ml) 4 80 60 3.79 4 80 70 4.17 4 80 80 4.125 4 90 60 5.455 4 90 70 8.04 4 90 80 7.375 6 80 60 4.26 6 80 70 4.845 6 80 80 4.605 6 90 60 5.935 6 90 70 8.705 6 90 80 8.315 8 80 60 4.41 8 80 70 5.365 8 80 80 4.685 8 90 60 6.07 8 90 70 8.89 8 90 80 8.1 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 60
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Biểu đồ 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng carbohydrate của carrageenan. Nhận xét: Qua biểu đồ 3.4. thì hàm lượng carbohydrate của carrageenan khi được xử lý ở các điều kiện khác nhau về nhiệt độ nấu, thời gian nấu và nồng độ kiềm xử lý có sự khác biệt. Trong cùng một nhiệt độ và thời gian nhưng khác nhau về nồng KOH cho thấy hàm lượng carbohydrate tăng dần (ngoại trừ các mẫu được xử lý ở thời gian 80’900 thì có sự thay đổi). Trong cùng nồng độ và thời gian nhưng khác nhiệt độ thì hàm lượng carbohydrate tỉ lệ thuận với nhiệt độ và thời gian (ngoại trừ các mẫu được xử lý ở thời gian 80’900 thì có sự thay đổi). Trong cùng nồng độ và nhiệt độ nhưng khác nhau về thời gian cho thấy hàm lượng carbohydrate tăng lênkhi thời gian là 70 phút và giảm xuống khi thời gian lên 80 phút. Hàm lượng carbohydrate cao nhất 8.89mg/ml ở nồng độ kiềm xử lý 8%, nhiệt độ nấu 900 phút và thời gian nấu 70 phút. Hàm lượng carbohydrate thấp nhất là 3.79mg/ml ở nồng độ kiềm là 4%, nhiệt độ 800, thời gian 60 phút. Về mặt thống kê chỉ có yếu tố nhiệt độ nấu và thời gian nấu có ảnh hưởng đáng kể lên hàm lượng carbohydrate ở mức ý nghĩa 0.05. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 61
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 3.7. Xác định hiệu suất thu hồi sản phẩm Kết quả hiệu suất thu hồi carrageenan với nồng độ xử lý kiềm và nhiệt độ khác nhau được thể hiện qua bảng 3.7. và biểu đồ 3.5. Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi carrageenan. KOH (%) Nhiệt độ nấu Thời gian nấu Hiệu suất (%) (0C) (phút) 4 80 60 25.02 4 80 70 29 4 80 80 32.2 4 90 60 30.04 4 90 70 43.08 4 90 80 35.02 6 80 60 27 6 80 70 31.14 6 80 80 36.46 6 90 60 33.08 6 90 70 51.06 6 90 80 42.1 8 80 60 28.74 8 80 70 33.16 8 80 80 34.92 8 90 60 32 8 90 70 49 8 90 80 39 Biểu đồ 3.5. Biểu đồ biểu diễn hiệu suất thu hồi của carrageenan. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 62
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Nhận xét: Qua biểu đồ 3.5. cho thấy : Trong cùng một nhiệt độ và thời gian nhưng khác nhau về nồng KOH cho thấy hiệu suất thu hồi tăng khi nồng độ kiềm tăng từ 4-6% và giảm dần khi nồng độ kiềm tăng từ 6-8%, ( ngoại trừ các mẫu được xử lý ở thời gian 80’900 thì có sự thay đổi). Trong cùng nồng độ và thời gian nấu nhưng khác nhiệt độ nấu thì hiệu suất hu hồi tăng dần. Trong cùng nồng độ và nhiệt độ nhưng khác nhau về thời gian cho thấy hiệu suất tăng lên. Hiệu suất cao nhất 51.06% ở nồng độ kiềm xử lý 6%, nhiệt độ nấu 900 phút và thời gian nấu 70 phút. Hiệu suất thu hồi thấp nhất 25.06% ở thời gian nấu 60 phút, nhiệt độ nấu 800C và nồng độ kiềm xử lý 4%. Về mặt thống kê các yếu tố nhiệt độ nấu và thời gian nấu có ảnh hưởng đáng kể lên hiệu suất thu hồi ở mức ý nghĩa 0.05. Điều này cho thấy nồng độ kiềm cao quá đã ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi carrageenan, dưới tác động của dung dịch kiềm đã làm chuyển đổi cấu trúc và hòa tan một số chất có trong rong làm giảm hiệu suất thu hồi. Qua bảng 3.7 cũng cho thấy rằng hiệu suất thu hồi đã có sự khác biệt khi xử lý ở các chế độ khác nhau. So với kết quả nghiên cứu ở Nam Kenya (59.1%) thì hiệu suất thu hồi 50.06% là thấp hơn. 3.8. Đánh giá chất lượng sản phẩm Sản phẩm carrageenan có màu hơi vàng. Nó ở dạng thô và gần như không mùi. Sản phẩm chỉ đạt chất lượng loại khá, do quá trình xử lý kiềm ở nhiệt độ thấp nên khả năng khử màu chưa đạt. Bên cạnh đó còn do giai đoạn phơi nắng bị nhiễm tạp, bụi bẩn, do đó cần có quá trình khử màu và tinh sạch. Tuy nhiên cũng tùy vào mục đích sử dụng mà áp dụng phương pháp khử màu và tinh sạch hợp lý. Hình 3.5. Sản phẩm carrageenan dạng khô. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 63
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Từ kết quả thí nghiệm của các yếu tố (nồng độ kiềm xử lý, nhiệt độ nấu và thời gian nấu chiết) ảnh hưởng đến chất lượng và hàm lượng của carrageenan được chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii mua ở Ninh Thuận, ta có kết luận sau: Quá trình xử lý kiềm có ảnh hưởng đến carrageenan làm thay đổi cấu tạo hóa - học của carrageenan tùy thuộc vào mức độ khử -OSO3 sẽ cho cấu trúc khác nhau và sẽ tạo thành các loại carrageenan khác nhau. Nhiệt độ nấu chiết cũng có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của carrageenan, do đó cần tuân thủ theo một quy trình nấu chiết nghiêm ngặt để mang lại hàm lượng và chất lượng cao nhất . Thời gian nấu chiết cũng ảnh hưởng không nhỏ đến hàm lượng và chất lượng của carrageenan. Thời gian cũng làm thay đổi cấu trúc hóa học và ảnh hưởng đến tính chất của carrageenan. Kết quả: đây chỉ là bước đầu nghiên cứu nên chưa đánh giá đúng được chất lượng của carrageenan. Màu sắc sản phẩm hơi vàng. Chất lượng dịch carrageenan tách chiết theo quy trình này được thể hiện qua các chỉ tiêu chất lượng sau: Chỉ tiêu Nồng độ KOH Thời gian Nhiệt độ Hàm lượng cao xử lý(%) nấu(phút) nấu(0C) nhất (mg/ml) Protein 4 70 90 0.64 Carrageenan 6 70 90 24.65 Carbohydrate 8 70 90 8.89 Sulfate 4 80 90 0.1357 Hiệu suất 6 70 90 51.06 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 64
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Có thể tùy vào mục đích sử dụng carrageenan trong các sản phẩm khác nhau mà người ta sẽ xử lí với nồng độ kiềm phù hợp. 4.2. KIẾN NGHỊ Đây mới là kết quả nghiên cứu ban đầu. Đề tài được thực hiện trong thời gian ngắn nên vẫn con nhiều hạn chế. Rong là ngành đang phát triển ở trên thế giới, rong khi đó nước ta có lợi thế về bờ biển nên nguồn nguyên liệu tương đối dồi dào vì vậy: Phân tích các chỉ tiêu của carrageenan thành phẩm. Mở rộng nghiên cứu, khảo sát thêm một số yếu tố khác nhằm đưa ra quy trình tốt nhất trong công nghệ tách chiết cũng như chế biến. Đẩy mạnh công tác nghiên cứu sử dụng rong sụn, sản phẩm của rong sụn và tiếp tục đưa sản phẩm carrageenan vào các ngành thực phẩm, công nghiệp, dược phẩm Tinh sạch carrageenan để sử dụng trong các ngành đòi hỏi carrageenan tinh khiết. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 65
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước [1]. Ths Lê Vân Anh, bài giảng hóa sinh thực phẩm, trường ĐH Kĩ Thuật Công Nghệ. [2]. Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Văn Ninh, 2008. Bước đầu tinh sạch carrageenan thu nhận từ rong sụn( Kappaphycus alvarezii) nuôi trồng tại Cam Ranh Khánh Hòa. Tạp chí khoa học công nghệ thủy sản, pp 30-35. [3]. Nguyễn Anh Dũng, 2009. Polysaccharide hoạt tính sinh học và ứng dụng. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. [4].Nguyễn Hữu Đại,1999. Thực vật thủy sinh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. [5]. Trần Thị Hà, 2000. Giáo trình kĩ thuật nuôi trồng rong biển. NXB nông nghiệp. [6]. Lê Như Hậu, Nguyễn Hữu Đại. Rong câu Việt Nam nguồn lợi và sử dụng. NXB khoa học tự nhiên và công nghệ. [7].Th. Sĩ Đào Trọng Hiếu. Tối ưu hóa quy trình công nghệ tách chiết carrageenan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii). Phòng CBBQ thủy sản, cục chế biến, thương mại nông lâm thủy sản và nghề muối. [ 8]. Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thị Thư, 2000. Hóa sinh học nông nghiệp. Nhà xuất bản giáo dục,tr.168-172. [9]. Nguyễn Thanh Hùng, 2009. Nghiên cứu xây dựng mô hình và kĩ thuật trồng rong sụn Kappaphycus alvarezii năng suất và chất lượng cao ở hai thủy vực bãi ngang Sơn Hải và Mỹ Hiệp. Luận văn thạc sĩ sinh học. [10]. TS. Nguyễn Hoài Hương, Th.S Nguyễn Thị Thu Hương. Bài giảng thực hành công nghệ sản xuất nguyên liệu thực phẩm. Trường ĐH Kĩ Thuật Công Nghệ, 2010. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 66
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG [11]. Phạm Quang Long, Châu Văn Minh, 2005. Lipide và các acid béo hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên. Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật. [12]. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, 2004. Chế biến rong biển. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. [13]. Đỗ Văn Ninh, Bùi Huy Chích, 2010. Bước đầu nghiên cứu thủy phân carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty bằng enzyme amylase. Tạp chí khoa học- công nghệ thủy sản. [14]. Hoàng Thị Hồng Phúc, 2008. Nghiên cứu thành phần sinh hóa của đối tượng rong sụn Kappaphycus alvarezii. Luận văn thạc sĩ hóa học. [15]. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, 2005. Rong biển dược liệu Việt Nam. Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật. [16]. Trần Đình Toại, Nguyễn Xuân Nguyên, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bích Thủy, Trần Thị Hồng, 2006. Carrageenan từ rong biển sản xuất và ứng dụng. NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội. [17]. Nguyễn Thanh Tùng, 1999. Tài nguyên và sinh thái rong . Tủ sách đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. [18]. Lê Nhã Uyên,2008. Nghiên cứu tách chiết alginate từ rong nâu đạt tiêu chuẩn ứng dụng trong y học. Luận văn thạc sĩ sinh học. Tài liệu nước ngoài: [19]. Dubois, Michel; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, Fred, 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. (1956), 28, pp 350-356. [20]. Fred van de Velde, Nidia D. Lourenco, Helena M Pinheiro, Martin Bakker, 2002. Carrageenan: A Food-Grade and Biocompatible Support for Immobilisation Techniques.Adv. Synth.Catal. 2002, 344, pp 815-835. [21]. Gerhard A. De Ruiter and Brian Rudolph, 1997. Carrageenan biotechnology. Trends in Food Science & Technology. Pp 389-395. [22]. Harris J. Bixler, 1996. Recent development in manufacturing and marketing carrageenan. Kluver Academic Publisher, pp 35-37. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 67
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG [23]. Harris J. Bixler, Kevin Johndro, Ruth Falshaw(2001). Kappa-2 carrageenan: structure and performance of commercial extracts. Food Hydrocolloid 15, pp 619-630. [24]. Helena S. Soedjak( 1994), Colorimetric Determination of Carrageenans and Other Anionic Hydrocolloids with Methylene Blue. Anal.Chem, 66 (24), pp 4514–4518. [25]. Isabella A. Abbott and Faylla A. Chapman, 1981. Evaluation of Kappa Carrageenan as a Substitite for Agar in Microbiological Media. Arch Microbiol 128, pp 355-359. [26].Joseph G. Wakibia, John J. Bolton, Derek W. Keats and Lincoln M. Raitt, 2006. Seasonal changes in carrageenan yield and gel properties in three commercial eucheumoids grown in southern Kenya. Botanica Maria 49, pp 208-215. [27]. Julieta Munoz, Yolanda Freile-Pelegrín, Daniel Robledo, 2004. Mariculture of Kappaphycus alvarezii ( Rhodophyta, Solieriaceae) color strains in tropical waters of Yucatán, México. Aquaculture 239,pp 161-177. [28]. Kawana F. Wong, Jame S. Craigie, 1978. Sulfohydrolase activity and carrageenan Biosynthesis in chondrus crispus (rhodophyceae). Plant Physiol, 61, 663-666. [29]. L. Hilliou, F. D. S Larotonda, A. M Sereno, and M. P. Goncalves, 2006. Thermal and Viscoelastic Properties of k/i- Hybrid Carrageenan Gels Obtained from the Portuguese Seaweed Mastocarpus Stellatus. J. Agric Food Chem 54, pp 7870-7878. [30]. Lella Hayashi, Edison José de Paula & Fungyl Chow, 2007. Growth rate and carrageenan analyes in four strains of Kappaphycus alvarezii( Rhodophyta, Gigartinales) farmed in the subtropical waters of Sao Paolo State, Brazil. J Appl Phycol 19, pp 393-399. [31]. Lê Đình Hùng, Kanji Hori, Huỳnh Quang Nang, Trần Kha, Lê Thi Hoa, 2009. Seasonal changes in growth rate, carrageenan yield and letin content in the red alga kappaphycus alvarezii cultivated in Cam Ranh, Việt Nam. Journal of Applied Phycology, 21, 265-272. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 68
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG [32]. Loic Hilliou & Maria P. Goncalves, 2007. Gelling properties of a k/i hybrid carrageenan: effect of concentration and steady shear. International Journal of Food Science and Technology 42, pp 678-685. [33]. M. T. Nickerson, A. T Paulson, 2005. Time-temperature studies of k- carrageenan gelation in the presence of high levels of co-solutes. Carbohydrate Polymers 61, pp 231-273. [34]. Mc Hugh, DJ, 2006. The seaweed industry in the pacific islands. ACIAR working paper No. 61. [35]. Masao Ohno, Huỳnh Quang Nang & Shushumu Hirase,1996. Cultivation and carrageenan yield and quality of Kappaphycus alvarezii in waters of Viet Nam. Journal of Applied Phycology 8, pp 431-437. [36]. Matthew A. Roberts and Bernard Quemener, 1999. Measurement of carrageenans in food: challenges, progress, and trends in analysis. Trends in Food Science & Technology 10, pp 169-181. [37]. NEERI Nagpur & NICD. Guidance manual for drinking water quality monitoring and assessment: second edition, pp 47-54. [38]. Pathik chandramishra, Reeta Jayasankar and C. Seema, 2006. Yield and quality of carrageenan from kappaphycus alvarezii subjected to different physical and chemical treatment. Seaweed Rex. Utiln, 28, pp 113-117. [39]. S. Suzanne. Nielsen, 2010. Food analys laboratory manual. Food science texts series, 47-54. [40]. Thuy T. T. Thành, Yoshiaki Yuguchi, Míturu Mimura, Hidekazu Yasunaga, Ryo Takano, Hiroshi Urakawa, Kanji Kajiwara, 2002. Molecular characteristics and Gelling Properties of the carrageenan Family. Macromol. Chem, Phys, 203, pp 15-23. [41]. Vanessa Leiria Campo, Daniel Fábio Kawano, Dílson Braz da Silva Jr, Ivone Carvalho, 2009. Carbohydrate Polymers, pp 167-180. Các website: [42]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 69
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG [43]. [44]. 31622281.pdf. [45]. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 70
  79. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG PHỤ LỤC Phụ lục A: Các đường chuẩn 0.09 0.08 y = 0.0011x + 0.0213 0.07 R² = 0.9975 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 A 595nm A 0.01 0 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ albumin(µg/ml) Hình 1.Đường chuẩn albumin 0.6 0.5 y = 0.004x + 0.094 R² = 0.9912 0.4 0.3 559nm 0.2 A 0.1 0 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ carrageenan (µg/ml) Hình 2. Đường chuẩn carrageenan. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 71
  80. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG 1.2 y = 0.0109x - 0.072 1 R² = 0.9923 0.8 0.6 497nm 0.4 A 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ D-galactose(µg/ml) Hình 3. Đường chuẩn carbohydrate. 0.35 y = 0.0075x - 0.0456 0.3 R² = 0.9938 0.25 0.2 0.15 A 470nm A 0.1 0.05 0 0 20 40 60 Nồng độ K2SO4(μg/ml) Hình 4. Đường chuẩn sulfate. SVTH: NGUYỄN THỊ THU 72
  81. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Phụ lục B: Các bảng phân tích Bảng 1. Bảng phân tích phương sai của hàm lượng protein SVTH: NGUYỄN THỊ THU 73
  82. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng 2. Bảng phân tích phương sai của hàm lượng carrageenan SVTH: NGUYỄN THỊ THU 74
  83. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng 3. Bảng phân tích phương sai của hàm lượng carbohydrate SVTH: NGUYỄN THỊ THU 75
  84. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng 4. Bảng phân tích phương sai của hàm lượng sulfate SVTH: NGUYỄN THỊ THU 76
  85. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Bảng 5. Bảng phân tích phương sai của hiệu suất thu hồi SVTH: NGUYỄN THỊ THU 77
  86. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THỊ THU 78
  87. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG SVTH: NGUYỄN THỊ THU 79