›

Đồ án Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước từ bồ công anh (L actuca Indica L)

pdf 106 trang thiennha21 13/04/2022 6220
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước từ bồ công anh (L actuca Indica L)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_buoc_dau_khao_sat_mot_so_thanh_phan_hoa_hoc_va_danh_gi.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước từ bồ công anh (L actuca Indica L)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT NƢỚC TỪ BỒ CÔNG ANH (LACTUCA INDICA L) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trịnh Thị Phƣơng Thảo MSSV: 1311100687 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi đƣợc thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp.Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017. Sinh viên Trịnh Thị Phƣơng Thảo
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời đã định hƣớng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2017 Sinh viên Trịnh Thị Phƣơng Thảo
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Phạm vi nghiên cứu 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý 4 1.1.1. Phân loại 4 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố 4 1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh 5 1.1.4. Tác dụng dƣợc lý 5 1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh 6 1.1.5.1. Flavonoid 6 1.1.5.2. Alkaloid 8 1.1.5.3. Carbohydrate 10 1.1.5.4. Glycoside 11 1.1.5.5. Saponin 12 1.1.5.6. Tannin 13 1.1.5.7. Amino acid 14 1.1.5.8. Isoprenoid 15 1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 16 1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn 16 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn 16 1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 19 1.2.3.1. Hợp chất phenolic 19 1.2.3.2. Nhóm alkaloid 21 1.3. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 23 1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 23 1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 24 1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. 26 1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. 27 1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 28 1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. 29 1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. 30 1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus 31 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Địa điểm và thời gian 33 2.1.1. Địa điểm 33 2.1.2. Thời gian 33 2.2. Vật liệu 33 2.2.1. Nguồn mẫu 33 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 33 2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng 33 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị 34 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu 35 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật 35 2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 36 2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 36 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 37 2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 38 2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết 38 2.3.7.1. Định tính carbohydrate 39 2.3.7.2. Định tính alkaloids 39 2.3.7.3. Định tính saponin 39 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside 39 2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside 40 2.3.7.6. Định tính flavonoid 40 2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol 41 2.3.7.8. Định tính tannin 41 2.3.7.9. Định tính steroid 41 2.3.7.10.Định tính amino acid 41 2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH 42 2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học 42 2.3.9.1. Định lượng vitamin C 42 2.3.9.2. Định lương Alkaloid 43 2.3.9.3. Định lượng Flavonoid 44 2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 2.4. Bố trí thí nghiệm 44 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Bồ công anh 46 2.4.1.1. Sơ đồ thí nghiệm 46 2.4.1.2. Thuyết minh quy trình 47 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. 48 2.4.2.1. Sơ đồ thí nghiệm 48 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Thuyết minh quy trình 50 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh. 50 2.4.3.1. Sơ đồ thí nghiệm 50 2.4.3.2. Thuyết minh quy trình 51 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh. 51 2.4.4.1. Sơ đồ thí nghiệm 51 2.4.4.2. Thuyết minh quy trình 53 2.4.5. Thí nghiệm 5: Định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh 53 2.4.5.1. Sơ đồ thí nghiệm 53 2.4.5.2. Thuyết minh quy trình 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc 56 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh 56 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 56 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp. 58 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Samonella Spp. 58 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Shigella Spp. 60 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 61 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp 3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. 62 3.3. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh đối với 20 vi khuẩn gây bệnh 63 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc Bồ công anh 64 3.5. Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc Bồ công anh 66 3.6. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 67 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1. Kết luận 71 4.2. Đề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 1 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide RNA: Ribonucleic acid TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth LiWE: Lactuca indica Water extract NA: Non Activity DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 18 Bảng 3.1 Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết nƣớc Bồ công anh trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh 63 Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh. 65 Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của Bồ công anh 67 Bảng 3.4. Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C 69 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid 7 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid 9 Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate 10 Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside 12 Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin 13 Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) 17 Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi 23 Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. 25 Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. 26 Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. 27 Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. 28 Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas 30 Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp. 31 Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 32 Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 37 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 45 Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây bồ công anh 46 Hình 2.4. Mẫu Bồ công anh sau khi sấy khô 47 Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh 49 Hình 2.6. Quy trình khảo sát kháng oxy hóa của cao chiết 51 Hình 2.7. Sơ đồ định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc 52 Hình 2.8. Sơ đồ định lƣợng vitamin C, alkaloid và flavonoid 54 Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 57 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp. 58 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 59 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 60 Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 61 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với vi khuẩn E. feacalis 62 Hình 3.7. Hiệu quả kháng oxy hóa của vitamin C 68 Hình 3.8. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 68 ix
  13. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo các nhà phân loại thực vật, nƣớc ta có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 3.948 loài đƣợc dùng làm dƣợc liệu (Viện dƣợc liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 loài cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số loài cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10% là cây thuốc trồng. Tác dụng chữa bệnh của cây cỏ là do các hợp chất tự nhiên có ở trong chúng quyết định. Do đó, nói tới nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú trên đất nƣớc ta cũng là nói tới khả năng sinh tổng hợp, chuyển hóa và tích lũy các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học của nguồn gen thực vật. Ngày nay, các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh đã và đang đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc quan tâm do tính ít độc và khả năng dung nạp tốt của chúng với cơ thể sống. các hợp chất thiên nhiên từ thực vật cũng nhƣ các sinh vật khác rất phong phú về mặt cấu trúc hóa học và thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: kháng sinh, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thƣ, kìm hãm HIV, điều hòa miễn dịch, chống sốt rét. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), từ năm 2009 đến nay, số lƣợng bán thuốc kháng sinh ở Việt Nam ra ngoài cộng đồng đã tăng gấp 2 lần so với thời điểm hiện tại. Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc kháng sinh của ngƣời dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên tới 91%, tỉ lệ sử dụng kháng sinh ở các bệnh viện tuyến trung ƣơng chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%. Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị bệnh đã khiến quá trình kháng kháng sinh của vi khuẩn đẩy mạnh làm mất đi vai trò của kháng sinh trong điều trị bệnh. Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nƣớc đang phát triển. Các 1
  14. Đồ án tốt nghiệp bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa, đƣờng hô hấp, các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nƣớc đang phát triển. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Bồ công anh còn có tên gọi khác là rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp trời, rau mũi cày. Là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae), sống một năm hoặc hai năm, không lông. Thân cao 60-200 cm, đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên. Lá dài 30cm rộng 5 – 6cm, mép có răng cƣa thƣa. Bấm vào lá và thân đều thấy tiết ra nhũ dịch màu trắng đục nhƣ sữa. Bồ công anh mọc hoang nhiều ở các tỉnh phía Bắc. Thƣờng dùng lá bồ công anh, thu hoạch lá về dùng tƣơi hay phơi hoặc sấy khô, dùng tƣơi tốt hơn. Cũng có thể dùng rễ, toàn cây phơi khô. Dùng để chữa một số bệnh nhƣ: chữa sung vú, tắc tia sữa, chữa đau, viêm loét dạ dày, tá tràng, mắt đau sung đỏ, mụn nhọt, viêm họng, viêm phổi, phế quản Sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật để thay thế các loại thuốc kháng sinh hóa học là một giải pháp cho vấn đề kháng kháng sinh. Tuy nhiên, loại cây này đƣợc con ngƣời sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian và truyền miệng từ đời này sang đời khác. Do đó, hoạt tính trị liệu và độc tính vẫn chƣa đƣợc xác định cụ thể. Vì thế việc đánh giá hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây thuốc là điều hết sức cần thiết. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu khảo sát một số thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nƣớc từ Bồ công anh (Lactuca indica L)”. Đề tài này đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá một số hoạt tính sinh học từ cao chiết nƣớc của cây bồ công anh. - Xác định một số thành phần hóa học hiện diện trong cao nƣớc. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bồ công anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây bồ công anh. - Xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học của cao chiết bồ công anh. - Định lƣợng các chất vitamin C, alkaloid, flavonoid. 4. Phạm vi nghiên cứu - Mẫu cây bồ công anh đƣợc tách chiết cao từ dung môi nƣớc và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các nhóm vi khuẩn: Escherichia Coli, Samonella spp., Vibrio spp., Shigella spp., Listeria spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp. - Định tính các thành phần hóa học: carbohydrate, saponin, alkaloid, cardiac glycoside, antharaqinone glycoside, flavonoid, phenolic compound, tannin, steroid, amino acid. - Định lƣợng các chất: vitamin C, alkaloid, flavonoid. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thuốc thử DPPH. 3
  16. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây bồ công anh và tác dụng dƣợc lý 1.1.1. Phân loại Bồ công anh hay rau bồ cóc, diếp hoang, diếp dại, mót mét, mũi mác, diếp trời, rau mũi cày, là một loài cây thân thảo thuộc họ Cúc (Asteraceae). Bộ (ordo): Asterales (Cúc) Họ (familia): Asteraceae (Cúc) Chi (genus): Lactuca Loài (species): L.indica Tên tiếng Anh: The common dandelion (thƣờng gọi là "dandelion") Tên khoa học: Lactuca indica L Tên đồng nghĩa: Brachyramphus sinicus Miq. Chondrilla squarrosa (Thunb.) Poir. Lactuca amurensis Regel & Maxim. Lactuca amurensis Regel Lactuca bialata Griff. Lactuca brevirostris Champ. Lactuca brevirostris Champ. ex Benth. Lactuca brevirostris var. brevirostris Lactuca brevirostris var. foliis laciniatis Hemsl. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố Nguồn gốc: Cây bồ công anh (Lactuca indica L) có nguồn gốc từ đại lục Á – Âu, và ngày nay đƣợc trồng khắp Châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á), Bắc Mỹ, Nam Phi, Nam Mỹ, New Zealand, Australia, và Ấn Độ. Phân bố: cây mọc hoang, phân bố chủ yếu ở các vùng ẩm thuộc các nƣớc Châu Á nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và các nƣớc Đông Dƣơng. Ở 4
  17. Đồ án tốt nghiệp Việt Nam, Bồ công anh phân bố rải rác khắp mọi nơi (thƣờng ở độ cao dƣới 1000 mét) đến trung du và đồng bằng. Cây thƣờng mọc ở nơi đất ẩm, trong vƣờn, ven đƣờng đi, bãi sông hoặc trên các thửa ruộng, nƣơng rẫy đã bỏ hoang. Thu hái vào khoảng tháng 5 – 7, lúc câu chƣa ra hoa hoặc bắt đầu ra hoa, loại bỏ lá già, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. 1.1.3. Đặc điểm chung của Bồ công anh Cây bồ công anh sống một năm hoặc hai năm. Thân không lông, cao 60 – 200 cm, thân thƣờng đơn hoặc chẻ nhánh ở phần trên. Các lá phía dƣới không lông, lá đơn mọc cách. Phiến lá thuôn dài hoặc dạng hình mũi mác, kích thƣớc phiến lá dài từ 13 – 25 cm, rộng từ 1,5 – 11 cm, đầu lá nhọn, đuôi lá hình nêm hoặc men cuống, cuống lá thƣờng ngắn hoặc men cuống tới tận nách lá. Mép lá nguyên hoặc xẻ thùy hoặc có răng cƣa thô to. Mặt trên phiến lá màu xanh lục, mặt dƣới xanh xám. Các lá mọc ở phía trên gần đỉnh ngọn sinh hoa thƣờng trên nhỏ hơn và thẳng. Hoa mọc ở đầu ngọn, đầu cành. Hoa tựa hình chùy, đầu cụm hoa rộng khoảng 2 cm; cuống dài 10 – 25 mm, mọc thẳng. Tổng bao hình trụ, kích thƣớc chùm hoa thƣờng cao 10 – 13 cm, rộng 5 – 6 mm, các lá bắc không lông, màu tía, các lá ngoài hình trứng, dài 2 – 3 mm, các lá trong hình trứng – mũi mác, các lá bắc tận trong cùng khoảng 8, hình mũi mác. Hoa tự thƣờng có 21 – 27 bông, màu vàng nhạt, kích thƣớc hoa 12 – 13 mm, rộng mm. Quả bế hình elip, phẳng, màu đen, kích thƣớc quả dài 4 – 4,5 mm, rộng 2,3 mm; mỏ quả dài 1 – 1,5 mm. Mào lông màu trắng gắn liền quả dài 7 – 8 mm. Bồ công anh có số nhiễm sắc thể 2n = 18 (Peng & Hsu, 1978). 1.1.4. Tác dụng dƣợc lý Flavonoid của Bồ công anh đã đƣợc nghiên cứu tác dụng sinh học thấy có tác dụng ức chế men oxy hóa khử peroxydase và catalase máu chuột cống trắng. Những thí nghiệm tiến hành với huyết thanh ngƣời cũng cho những kết quả ức chế men oxy hóa khử rõ rệt. Bồ công anh (Đông y cho là thuộc về hàn lƣơng) đƣợc áp dụng phƣơng pháp lồng cử động đã thể hiện tác dụng an thần. Theo tài liệu nƣớc ngoài, tại một số nƣớc, ngƣời 5
  18. Đồ án tốt nghiệp ta có sử dụng và nghiên cứu những loài Lactuca khác nhƣ L.virosa, L. sativa (rau diếp ăn của Việt Nam), thấy những cây này không độc và có tác dụng trên hệ thần kinh trung ƣơng gây ngủ nhẹ. Tác dụng tiêu độc, chữa bệnh sƣng vú, tắc tia sữa, mụn nhọt đang sƣng mủ. Còn dùng uống để chữa bệnh đau dạ dày, ăn kém tiêu. Theo Y học cổ truyền, Bồ công anh có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thấp thông lâm, chủ trị các chứng ung nhọt, sang lở, nhũ ung (viêm vú), trƣờng ung (viêm ruột), đau họng (hầu tý), mắt sƣng đỏ đau, chứng thấp nhiệt hoàng đản (viêm gan vàng da), nhiệt lâm (viêm tiết niệu). 1.1.5. Thành phần hóa học của bồ công anh 1.1.5.1. Flavonoid a. Khái niệm: Flavonoid là 1 nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong thực vật, đây còn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A và B đƣợc nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng, tuy nhiên 1 số có màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại không màu. Trong thực vật cũng có 1 số hợp chất không thuộc flavonoid cũng có màu vàng nhƣ carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011). Chúng thƣờng đƣợc cải biến bằng cách gắn thêm các gốc (-OH) hoặc (-OCH3) và thƣờng ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này có những nhóm chất phổ biến nhƣ flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone Chỉ riêng hai nhóm flavon, flavonone với các nhóm thế là OH và OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38 627 chất (Ngô Văn Thu, 1998). Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ƣa béo thì càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011). b. Phân loại: Dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C nên các flavonoid đƣợc chia thành 3 nhóm chính: 6
  19. Đồ án tốt nghiệp - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid. - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid. - Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngô Văn Thu, 2011). Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid c. Vai trò: - Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa bởi các gốc tự do nhƣ OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hóa, ) làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. - Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl, giúp bảo vệ sinh vật chống lại quá trình oxy có hại nhƣ những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hóa. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thƣơng do bức xạ. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thƣơng tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan. 7
  20. Đồ án tốt nghiệp - Flavonoid còn có tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự phóng thích hay tổng hợp các hợp chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng nhƣ histamine, serine protease, prostaglandin, leukotrien, (Quỳnh Ngọc, 2011). 1.1.5.2. Alkaloid a. Khái niệm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật. Thông thƣờng các alkaloid kiềm không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ. Trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nƣớc và hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Từ đó, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Alkaloid là amin có nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhƣng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng đƣợc gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid có các tác động dƣợc lý học đối với con ngƣời và các động vật khác. Các alkaloid thông thƣờng là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng có vị đắng. Chúng đƣợc tìm thấy nhƣ là các chất chuyển hóa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tôm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid có thể đƣợc tinh chế từ các dịch chiết thô bằng phƣơng pháp chiết acid - base (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Alkaloid có 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có 2 nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhóm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nƣớc, tủa này sinh ra hầu hết là do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhóm anion lớn thƣờng là anion phức hợp của thuốc thử và nhóm thứ hai cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, có 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết những chất có trong alkaloid (Phạm Thanh Kỳ, 1998). b. Phân loại 8
  21. Đồ án tốt nghiệp Các nhóm alkaloid hiện nay bao gồm: - Nhóm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, nicotin, spartein, pelletierin. - Nhóm isoquinolin: các ancaloit gốc thuốc phiện nhƣ morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin. - Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin. - Nhóm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine. - Nhóm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine, brucin, veratrin, cevadin. - Nhóm phenothylamin: mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine. - Nhóm indole: Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin Các ergolin: Các ancaloit từ nhựa ngũ cốc/cỏ nhƣ ergin, ergotamine, acid lysergic v.v Các beta-cabolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin - Nhóm purin: Các xanthin nhƣ caffeine, theobromin, theophylline (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số chất thuộc nhóm alkaloid 9
  22. Đồ án tốt nghiệp c. Vai trò Đa số các alkaloid đều có tác dụng diệt khuẩn, một số loại có tác động lên hệ thần kinh nhƣ morphin, codein, cocain, Ngoài ra, alkaloid còn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thƣ (Vũ Xuân Tạo, 2013). 1.1.5.3. Carbohydrate a. Khái niệm Carbohydrate là một nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật. Đƣợc cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với công thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thƣờng m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013).Nhìn chung hàm lƣợng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo loài, giai đoạn sinh trƣởng và phát triển. - Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận nhƣ củ, quả, lá, thân, cành. - Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). b. Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate đƣợc chia làm ba nhóm lớn: monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Hình 1.3. Sơ đồ phân loại nhóm carbohydrate 10
  23. Đồ án tốt nghiệp c. Vai trò: Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trò quan trọng: - Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lƣợng cho các quá trình sống. - Có vai trò cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidglican ). - Có vai trò bảo vệ (mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) (Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh, 2011). 1.1.5.4. Glycoside a. Khái niệm Glycoside là những sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng. Cấu tạo gồm 1 phần đƣờng (glycon) kết hợp với 1 phần không phải là đƣờng (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv (2011). Hai phần liên kết với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside dễ bị phân huỷ khi có nƣớc dƣới ảnh hƣởng của các enzyme (men) có chứa trong cây. Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây là dạng tinh thể không màu và tác dụng của glycosides phụ thuộc vào phần aglycon còn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hòa tan trong nƣớc, có vị đắng và tạo mùi thơm đặc trƣng (Trần Trƣờng Hận, 2010). b. Phân loại Glycoside có 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011). 11
  24. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Sơ đồ phân loại glycoside c. Vai trò Glycoside giữ vai trò là nguồn dinh dƣỡng cho cơ thể. Ngoài ra chúng còn có vai trò bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra một số chất kháng khuẩn thƣờng tập trung ở vỏ và hạt nhƣ độc tố Solanine ở khoai tây (Trần Trƣờng Hận, 2010). 1.1.5.5. Saponin a. Khái niệm Saponin là một glycoside tự nhiên thƣờng gặp trong nhiều loài thực vật.Dƣới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponins bị thuỷ phân thành genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngô Văn Thu, 2011). Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan đƣợc trong nƣớc, alcohol và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hòa tan saponin vào nƣớc sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). b. Phân loại Saponin đƣợc chia thành 2 nhóm là saponin triterpenoid và saponin steroid (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). 12
  25. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Sơ đồ phân loại nhóm saponin c. Vai trò - Tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng). - Một số saponin có tác dụng chống viêm. - Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt. 1.1.5.6. Tannin a. Khái niệm “Tannin” đƣợc dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin đƣợc định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát đƣợc phát hiện dƣơng tính với “thí nghiệm thuộc da”. Tannin có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thƣờng gặp chủ yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm. 13
  26. Đồ án tốt nghiệp Tannin tan trong nƣớc, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, đa số không tan trong các dung môi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt). b. Phân loại Tannin có thể chia thành hai loại chính: - Tannin thủy phân đƣợc hay còn gọi là tanin pyrogalli (Gallic acid). - Tannin ngƣng tụ hay còn gọi là tanin pyrocatechic (Flavone). c. Vai trò - Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng nhƣ thuốc trừ sâu. - Tác dụng kháng khuẩn, thƣờng dùng làm thuốc súc miệng. - Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Ngô Thị Thùy Dƣơng, 2012). 1.1.5.7. Amino acid a. Khái niệm Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử chứa cả nhóm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide hay polypeptides.Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc loại α-amino acid, nhóm amino (-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngoài các nhóm –NH2, −COOH, trong amino acid tự nhiên còn chứa các nhómchức khác nhƣ: −OH, HS−, −CO− b. Phân loại Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhóm. Một trong các cách phân loại là 20 amino acid đƣợc phân thành 5 nhóm nhƣ sau (Hồ Chí Tuấn, 2009): - Nhóm 1: Các amino acid có gốc R không phân cực kị nƣớc, thuộc nhóm này có 6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P). 14
  27. Đồ án tốt nghiệp - Nhóm 2: Các amino acid có gốc R là nhân thơm thuộc nhóm này có 3 amino acid: Phenylanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W). - Nhóm 3: Các amino acid có gốc R bazơ, tích điện dƣơng, thuộc nhóm này có 3 amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H). - Nhóm 4: Các amino acid có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q). - Nhóm 5: Các amino acid có gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E). c. Vai trò Vai trò của amino acid trong cơ thể thực vật: - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Tăng khả năng ra hoa và quả. 1.1.5.8. Isoprenoid a. Khái niệm Isoprenoid (terpene)là một nhóm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon đƣợc tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene-C5H8.Terpene có nhiều ở thực vật đặc biệt là loài họ thông. b. Phân loại Phân loại dựa và số đơn vị isoprene cấu thành phân tử - Sesterterpenoid (5 đơn vị) - Triterpenoid (6 đơn vị) - Tetraterpenoid (8 đơn vị) - Polyterpenoid (n đơn vị) - Monoterpenoid (2 đơn vị) - Sesquiterpenoid (3 đơn vị) 15
  28. Đồ án tốt nghiệp - Diterpenoid (4 đơn vị) c. Vai trò - Ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thƣ - Bảo vệ thực vật - Có khả năng xua đuổi côn trùng 1.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật 1.2.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ có trong thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thƣờng có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thƣờng rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật đã đƣợc nghiên cứu. Chúng có thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá trình trao đổi chất hoặc có thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đƣờng truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003). Không phải tất cả các cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và một số vùng khác của tế bào có thể bị ảnh hƣởng bởi các cơ chế khác (Hình 1.7). 16
  29. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) Cao chiết từ các loại thực vật có thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau nhƣ sự can thiệp vào các lớp đôi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lƣợng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nói chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên có liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dòng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đông tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008) cụ thể ở Bảng 1.1. 17
  30. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Những nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) Nhóm Phân nhóm Ví dụ Cơ chế Catechol Phá vỡ màng sinh chất Phenol đơn Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolic acid Cinnamic acid ? Liên kết bám dính, tạo Quinone Hypericin phức hợp với thành tế bào, làm bất hoạt enzyme Flavonoid Chrysin Liên kết bám dính - Tạo phức hợp với thành tế bào Flavone Khử hoạt tính enzyme Phenolic Abyssinone Ức chế phiên mã ngƣợc HIV Flavonol ? Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chếenzyme Tannin Ellagitannin Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế bào Phá vỡ vách tế bào 18
  31. Đồ án tốt nghiệp Tạo phức kim loại-ion Tƣơng tác với DNA nhân Coumarin Warfarin thực (hoạt tính kháng vius) Terpenoid - Phá vỡ vách tế bào Capsaicin Tinh dầu - Berberine Xen vào thành tế bào hoặc Alkaloid DNA Piperine - Mannose- Khóa sự kết hợp của virus Lectin specific hoặc hấp phụ Polypeptide agglutinin Falxatin Hình thành cầu Disulfide - 8s-heptadeca- ? 2(Z),9(Z)- Polyacetylen diene-4,6- diyne-1,8-diol 1.2.3. Một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật 1.2.3.1. Hợp chất phenolic Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua sự tƣơng tác không đặc hiệu của các chất này với protein. Quinone Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone. Chúng là những hợp chất màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trƣng cao. 19
  32. Đồ án tốt nghiệp Quinone có thể tạo phức không thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein, thƣờng dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein. Do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng đƣợc cho các vi sinh vật. Ngƣời ta nhận thấy rằng anthraquinone đƣợc lấy từ một loài cây có nguồn gốc từ Pakistan có khả năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, có khả năng diệt khuẩn đối với Pseudomonas pseudomalliae.Hypericin, một anthraquinone cho thấy là có khả năng chống bệnh trầm cảm và có hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Flavonoid Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loài vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp đƣợc. Các flavonoid càng ƣa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Catechin là những hợp chất flavonoid đƣợc nghiên cứu rộng rãi do chúng có mặt trong trà xanh oolong. Qua những nghiên cứu, ngƣời ta nhận thấy trà xanh có hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans, Shigella spp., và các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S.mutans, cơ chế tác dụng cũng là do khả năng tạo phức nhƣ đƣợc mô tả ở phần quinone. Hoạt động nghiên cứu gần đây đƣợc tiến hành trên cơ thể chuột. khi chuột đƣợc cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0,1% catechine có nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của chuột do S.mutans gây ra giảm 40% (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). 20
  33. Đồ án tốt nghiệp Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones có khả năng ức chế virus (RSV). Ngƣời ta đã tìm ra hoạt tính và phƣơng thức hoạt động của quercetin, naringin, hesperetin và catechin. Trong khi naringin không ức chế virus type 1 (HSV-1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavanoid khác lại có tác dụng theo những phƣơng thức khác nhau. Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các loài virus trên, catechin ức chếsự lây nhiễm nhƣng không làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV-1, quercetin là chất có hiệu quả tốt trong việc giảm tính lây nhiễm cácloại bệnh do vi sinh vật gây ra. Ngƣời ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hƣởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Tannin Một trong những tính chất rất đặc trƣng của tannin là tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu nhƣ liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị. Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ông đƣa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này, tannin có thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng khuẩn của tannin đƣợc tăng cƣờng bởi tia cực tím (UV) ởmức ánh sáng kích hoạt bƣớc sóng khoảng 320 đến 400nm.Ngoài ra, có ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra rằng tannin có thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngƣợc quá trình phiên mã DNA của virus. 1.2.3.2. Nhóm alkaloid Solamargine Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Thƣờng có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum) và các 21
  34. Đồ án tốt nghiệp alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Berberine Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid có trong các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên có tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp., Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhóm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chínhđiều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại vi khuẩn gây bệnh này. Nhóm terpenoid và tinh dầu Terpenene và terpenoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, có nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu có khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế đƣợc vi khuẩn. Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid có khả năng ức chế đƣợc HIV. Cơ chế tác động của tecpen chƣa đƣợc khẳng định rõ ràng, nhƣng đƣợc suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogene. Theo Mendoza, việc tăng nhóm ƣa nƣớc (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật có ích trong việc kiểm soát Listeria monocytogenes. Dầu húng quế, một thảo dƣợc đƣợc thƣơng mại hóa, đƣợc xác định là hiệu quả kháng khuẩn tƣơng đƣơng với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tôn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). 22
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Tổng quan về một số nhóm vi khuẩn gây bệnh 1.3.1. Nhóm vi khuẩn Escherichia coli Đặc điểm hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thƣớc dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 – 3 µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuôi cấy không thích hợp (ví dụ trong môi trƣờng có kháng sinh) trực khuẩn có thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli có vỏ, không sinh bào tử, hầu hết có lông và có khả năng di động (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). Trực khuẩn E.coli hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 150C – 400C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 370C với pH = 7,2 – 7,4 ; phát triển đƣợc ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 1997). Trong môi trƣờng lỏng, sau 4 – 5 giờ, E.coli đã làm đục nhẹ môi trƣờng, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trƣờng, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trƣờng thạch thƣờng, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đƣờng kính 2 – 3 mm. Hình 1.7. E.coli quan sát dƣới kính hiển vi Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở ngƣời nhƣ tiêu chảy, gây viêm đƣờng tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục, đƣờng mật, đƣờng hô hấp. Là một trong những nguyên nhân 23
  36. Đồ án tốt nghiệp chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thƣờng gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhƣng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất đƣợc biết đến trên ngƣời, làm hủy hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mô ruột. Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân nhƣ máu. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hải Hòa, 2012). E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh cho súc vật tƣơng đối thấp, phải cần một số lƣợng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đƣờng tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết đƣợc súc vật. 1.3.2. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Đặc điểm hình thái Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thƣớc trung bình 3,0 x 0,5 µm. Có nhiều lông xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), có khả năng di động, không có vỏ, không sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005). Là vi khuẩn kị khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Vi khuẩn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 - 42oC và pH từ 6 – 9 , nhƣng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2. Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng: sau khi cấy vài giờ Salmonella spp. làm môi trƣờng đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuôi cấy lâu sẽ có cặn ở đáy ống nghiệm và có màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, nhỏ, trong hoặc xám, nhẵn, bóng hay lồi lên ở giữa. 24
  37. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8. Hình thái vi khuẩn Salmonella spp. Khả năng gây bệnh Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay còn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thƣờng gặp nhƣ tiêu chảy, co thắt dạ dày, đau đầu, sốt, nôn mửa và mất nƣớc (mất dịch cơ thể). Triệu chứng có thể tiến triển từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thƣờng kéo dài trong vòng từ 4 – 7 ngày và sau đó tự hồi phục. Tuy nhiên 1 số ít trƣờng hợp có thể diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013). Salmonella spp. còn gây bệnh thƣơng hàn chủ yếu do S.typhii gây thƣơng tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột; ngoài ra, còn gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, biến chứng trụy tim mạch Các bệnh khác (không phải thƣơng hàn) thƣờng là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa chủ yếu là do 2 tác nhân S.typhimurium, S.enteritidis gây ra, bệnh có biểu hiện gây sốt, nôn, tiêu chảy. Ngoài ra, Salmonella có thể gây nên các tổn thƣơng ở ngoài đƣờng tiêu hóa nhƣ viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể bệnh: bệnh thƣơng hàn, phó thƣơng hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc, S.choleraesuis chủng Kunzendorf và S.typhisuis chủng Voldagsen gây bệnh phó thƣơng hàn cho heo, S.enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phó thƣơng hàn 25
  38. Đồ án tốt nghiệp cho bò, bê, S.abortusovis gây bệnh sẩy thai ở cừu, S.gallinarum – pullorum gây bệnh thƣơng hàn cho gà (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). 1.3.3. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. Đặc điểm hình thái Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đƣờng ruột) là trực khuẩn gram âm, nhỏ, dài với kích thƣớc 0.5-0.6 x 1 – 3 µm, không sinh bào tử, không di động, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu hoặc kỵ khí tùy nghi nhƣng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. Chúng có thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hóa khắc nghiệt nhƣ trong tủ lạnh, đông đá, trong môi trƣờng chứa 5% NaCl hay trong môi trƣờng có pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phƣơng pháp khử trùng Pasteur. - Trong môi trƣờng lỏng, sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục đều môi trƣờng. - Trên môi trƣờng đặc, sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đƣờng kính khoảng 1mm, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều. Hình 1.9. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn Shigella spp. thƣờng chỉ giới hạn ở đƣờng tiêu hóa. Chỉ cần số lƣợng nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn công lớp biểu mô 26
  39. Đồ án tốt nghiệp niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ngày và kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thƣờng kéo dài dƣới 7 ngày (Nguyễn Văn Minh Hoàng, 2013). Ngoài ra, Shigella spp. còn gây các bệnh ở ngoài đƣờng tiêu hoá nhƣ viêm kết mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, theo Nguyễn Đức Hiền (2013). 1.3.4. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. Đặc điểm hình thái Các loài Listeria spp. là trực khuẩn Gram dƣơng, có kích thƣớc ngắn (0,4 – 0,5 x 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 200C chúng di chuyển bằng lông mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhƣng sự di dộng không quan sát đƣợc ở 370C. Chúng là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có thể sinh trƣởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 450C (tối ƣu là 30 – 360C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng có thể mọc ở pH 9,6, nhƣng đạt điều kiện tối ƣu ở pH hơi kiềm hoặc môi trƣờng trung tính (Nguyễn Hữu Liêm, 2013). Hình 1.10. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. 27
  40. Đồ án tốt nghiệp Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở ngƣời với các triệu chứng rất nguy hiểm và có tỷ lệ tử cong cao. Ngƣời nhiễm bệnh sẽ có các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ nhƣ sốt, viêm dạ dày-ruột. Đồng thời L.monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dƣới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những ngƣời nhận mô cấy ghép và có hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi ngƣời mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì có triệu chứng rõ ràng hoặc có những triệu chứng giống nhƣ bị cảm cúm nhƣng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp .tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng nhƣ viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 1.3.5. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. còn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhóm vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thƣớc 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm.Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển trong môi trƣờng bổ sung muối (NaCl) và không sinh H2S. Hình 1.11. Hình thái vi khuẩn Vibrio spp. 28
  41. Đồ án tốt nghiệp Khả năng gây bệnh Bệnh tả là 1 bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholerae gây ra. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là nôn nhiều lần, dịch nôn lúc đầu là nƣớc và thức ăn, về sau giống nhƣ dịch phân. Cơ thể bị sốt, sôi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngoài phân lỏng có mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nƣớc, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời. Ngoài ra, khi ta ăn phải thức ăn có chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng nhƣ tiêu chảy nhiều lần trong ngày, đau bụng, buồn nôn và nôn (Hoàng Ngân, 2013). Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp. đã đƣợc công bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tƣợng thủy sản (Austin & Austin 1993).Một số bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra nhƣ sau: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm, bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh khác nhƣ: gây chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đƣờng ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 1.3.6. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Pseudomonas spp. Đặc điểm hình thái Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình thẳng, hai đầu tròn, dài 1 – 5 µm, rộng 0,5 – 1 µm. Trực khuẩn ít khi có vỏ, có một tiêm mao đơn cực, di động, không sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ phát triển tối ƣu ở 370C, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 50C – 420C. Trên môi trƣờng đặc, thƣờng có hai loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. 29
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.12. Vi khuẩn Pseudomonas Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho ngƣời: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh có điều kiện nhƣ khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thƣơng hở, Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh). Khi có điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh toàn thân nhƣ nhiễm trùng hệ thống hô hấp, nhiễm trùng máu hoặc nhiễm trùng đƣờng tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xƣơng Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1 – 0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần đƣợc hình thành những ổ mủ. 1.3.7. Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Enterococcus spp. Đặc điểm hình thái Enterococcus faecalis có đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn gram dƣơng thuộc nhóm liên cầu khuẩn, có đƣờng kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển là 30 – 350C. 30
  43. Đồ án tốt nghiệp Enterococcus faecalis có thể sống sót trên các bề mặt môi trƣờng, không chịu đƣợc sự thành trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng. Không sinh độc tố. (Dƣơng Văn Sĩ, 2010). Hình 1.13. Vi khuẩn Enterococcus spp. Khả năng gây bệnh Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thƣờng của ngƣời, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ thể ngƣời khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thƣờng gây nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu, gây nhiễm trùng vết thƣơng (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn huyết. 1.3.8. Nhóm vi khuẩn Staphylococcus aureus Đặc điểm hình thái Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) có hình cầu, đƣờng kính 0,8 – 1µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho, có thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đôi hay thành từng chuỗingắn. Staphylococcus spp. là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có vỏ, không di động, không sinh bào tử và có khả 31
  44. Đồ án tốt nghiệp năngsinh nội độc tố. Chúng phát triển đƣợc trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 100C – 450C). Hình 1.14. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn có nhiều loại: có loại gây bệnh, thƣờng gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và có loại bình thƣờng sống trên da và niêm mạc, không gây bệnh. Staphylococcus aureus cƣ trú trên ngƣời và động vật, có trong sữa bò bị bệnh, thịt heo tƣơi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất. Vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn nhƣ tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng nhƣ: nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thƣơng hậu phẩu, tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 32
  45. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian 2.1.1. Địa điểm Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu cây Bồ công anh (cành, lá) đƣợc thu ở vƣờn trồng tại tỉnh Thái Bình. 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn đƣợc cung cấp bởi Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7. - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, S.dublin. - Nhóm vi khuẩn Shigella: S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.harveyi, V.cholerae. - Nhóm vi khuẩn Listeria: L.monocytogenes, L.innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da: E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.2.3. Môi trƣờng và hóa chất sử dụng Môi trường nuôi cấy và tăng sinh vi khuẩn - Môi trƣờng TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Hóa chất 33
  46. Đồ án tốt nghiệp - H2SO4 đậm đặc, HCl đậm đặc, chloroform. - Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. - Acid acetic glacial, acetic anhydride, benzene, bột Magnesium. - NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%. - Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. - Hồ tinh bột, KNO3/ KI 0,001N - NH4OH, NH4OH 10% - DPPH Dung môi - Ethanol 70 %, 96% (Việt Nam). - Methanol 85%. - Nƣớc cất. - Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc). 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ - Đĩa petri - Ống trụ kim loại (d= 6 mm) - Ống nghiệm lớn, nhỏ - Thƣớc đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 thấm nƣớc ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1 ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Bình môi trƣờng 250 ml, 500 ml, - Eppendorf 1000 ml - Các loại dụng cụ khác nhƣ: bao - Que cấy trang chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp - Đèn cồn gấp, muỗng, dao, thun, 34
  47. Đồ án tốt nghiệp Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Cân phân tích (Orbital - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert Germany) mermany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy nƣớc cất (Branstead USA) - Máy cô cách thủy - Thiết bị cô quay chân không. - Máy đo UV – VIS (Hach) - Tủ an toàn sinh học (Biosafety - Tủ hút (Fumehood) cabinet) 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phƣơng pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu bồ công anh đƣợc thu một lƣợng lớn toàn bộ các bộ phận thân, lá mang đi rửa sạch và sấy ở 400C đến khi có đƣợc khối lƣợng không đổi. Mẫu sau khi đƣợc sấy khô tiến hành cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lƣợng bột mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói trong túi nhựa và lƣu trữ trong một bình kín hơi dùng để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận cao thực vật Mẫu bồ công anh đƣợc tách chiết bằng phƣơng pháp ngâm kiệt ở nhiệt độ thƣờng và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lƣợng dung môi của dịch chiết bằng các thiết bị cô thích hợp. Nguyên tắc: sử dụng phƣơng pháp ngâm kiệt, mẫu thực vật đƣợc ngâm trong lƣợng lớn dung môi ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hòa tan vào dung môi. Cách tiến hành: ngâm một lƣợng bột mẫu vào lƣợng lớn dung môi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phòng. Mẫu đƣợc ngâm trong khoảng 24h, thỉnh thoảng đƣợc lắc đều sau đó đem đi lọc, ép bã thu dịch chiết. Tiếp tục cho thêm lƣợng dung môi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi dịch lọc thu đƣợc có màu trong suốt. Phần dịch chiết đƣợc cô đặc, thu hồi cao bằng 35
  48. Đồ án tốt nghiệp phƣơng pháp cô cách thủy ở 70oC (đối với dung môi nƣớc). Cao chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phƣơng pháp giữ giống trên môi trƣờng thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phƣơng pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nƣớc trong tế bào. Để khắc phục nhƣợc điểm này ngƣời ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh nhƣ glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phƣơng pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Nhằm hoạt hoá các vi khuẩn đƣợc giữ giống phát triển lại bình thƣờng vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: Sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Môi trƣờng dinh dƣỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dƣỡng (đa lƣợng và vi lƣợng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trƣờng. Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị đƣợc giữ trên môi trƣờng TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB trong điều kiện vô trùng. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trƣờng nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 36
  49. Đồ án tốt nghiệp Mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 600nm. Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (cfu/ml) 2.3.5. Phƣơng pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng có vai trò quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật. Phƣơng pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lƣợng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta đƣợc nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phƣơng pháp pha loãng mẫu 37
  50. Đồ án tốt nghiệp 2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phƣơng pháp của Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) có sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào môi trƣờng thạch và tác động lên các chủng khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vòng ức chế). Từ đó, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đƣờng kính vòng ức chế (mm). Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn đƣợc hoạt hóa từ ống giống gốc trong môi trƣờng lỏng TSB, lắc qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã đƣợc hoạt hóa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng đƣờng kính 6 mm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hòa tan lƣợng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 1% theo nồng độ yêu cầu 200 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch cao đƣợc khuếch tán đều vào môi trƣờng thạch. Sau đó, ủ các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết bằng cách đo giá trị đƣờng kính vòng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.3.7. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hóa học theo các phƣơng pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã đƣợc chuẩn hóa để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lƣơng Văn Tiến và ctv, 2015). Cách tiến hành: Cao chiết đƣợc đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trƣng. 38
  51. Đồ án tốt nghiệp 2.3.7.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 2 – 3 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 1 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả đƣợc xem là dƣơng tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lƣợt 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O. Thử nghiệm Barfoed: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013). 2.3.7.2. Định tính alkaloids Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi quan sát đƣợc kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 1 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013). 2.3.7.3. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml nƣớc cất vào lắc mạnh. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định (Abba và ctv, 2009). 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside 39
  52. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Legal: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml pyridine hoặc 0,5 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 2 – 3 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu đỏ đậm. Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml acid acetic glacial và 0,5 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 0,5 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic (Yadav và ctv, 2013) 2.3.7.5. Định tính anthraquinone glycoside Thử nghiệm Bontrager: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch H2SO4 loãng và đun sôi, sau đó tiến hành lọc nóng và để nguội dịch lọc, bổ sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống nghiệm khác, tiếp tục thêm 1 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009). 2.3.7.6. Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline reagent: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tƣơng tự, thay NaOH 10% thành nƣớc cất). Kết quả dƣơng tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dƣơng thay NaOH thành nƣớc cất. Thử nghiệm Shinoda: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột Magnesium vào, cho từ từ vài giọt HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đó thêm 3 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính là khi mẫu có xuất hiện cam, hồng, đỏ đến tím, Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012). 40
  53. Đồ án tốt nghiệp 2.3.7.7. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1.5 ml chì acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa trắng. (Mamta và ctv, 2012). 2.3.7.8. Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml NaCl 10%, cho 2 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh (Abba và ctv, 2009). Thử nghiệm lead acetate: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 1 ml NaCl 10%, cho 2 giọt chì acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi ống nghiệm xuất hiện kết tủa màu vàng (Mamta và ctv, 2012). 2.3.7.9. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 1 ml chloroform và nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: ở lớp dƣới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 1 ml acid anhydride, sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định đƣợc chia thành 2 trƣờng hợp: Xuất hiện vòng màu nâu ở mặt phân cách và lớp trên có màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là triterpenoid (Mamta và ctv, 2012) 2.3.7.10. Định tính amino acid 41
  54. Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dƣơng tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013). 2.3.8. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH Nguyên tắc: Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl) bằng cách cho hydrogen sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bƣớc sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm. Cách tiến hành: Bổ sung 100l DPPH (6mM) và 2800l methanol vào mỗi ống nghiệm đã chứa 100l mẫu cao chiết tại các nồng độ khác nhau (0-1000g/ml). Ủ 30 phút trong điều kiện không có ánh sáng, sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại bƣớc sóng 517nm. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu. Chứng dƣơng trong thí nghiệm là acid ascorbic (3 mg/ml), chứng âm là nƣớc cất. Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa đƣợc xác định theo công thức sau: Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = x 100 Trong đó, ODC : là giá trị mật độ quang OD của đối chứng âm; ODm : là giá trị mật độ quang OD của mẫu thử. 2.3.9. Phƣơng pháp định lƣợng thành phần hóa học 2.3.9.1. Định lượng vitamin C Nguyên tắc: Acid ascorbic là một hợp chất không no có chứa nhóm endiol dễ bị oxy hóa khử thuận nghịch, bị phá hủy nhanh dƣới tác dụng của các chất oxy hóa và bền trong môi trƣờng acid. Cách tiến hành: Cân 10g lá cây bồ công anh, nghiền nhỏ trong dung dịch HCl 1%. Chuyển dịch vào bình định mức 100ml, trích ly và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 1%. Lắc trộn đều và lọc, ta có dung dịch phân tích. Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức cho vào erlen, thêm 5 giọt hồ tinh bột và đem định phân bằng KIO3/KI 0,001N cho tới khi xuất hiện màu xanh. 42
  55. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành song song mẫu kiểm chứng thay dịch chiết vitamin C bằng dung dịch HCl 1%. Tính kết quả: Hàm lƣợng vitamin C trong mẫu thí nghiệm đƣợc tính bằng công thức: ( ) Trong đó: X: hàm lƣợng vitamin C, mg% a là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân dịch chiết vitamin C b là số ml KIO3/KI 0,001N dùng định phân mẫu kiểm chứng 100: thể tích bình định mức 0.088: số mg acid ascorbic tƣơng ứng với 1ml dung dịch KIO3/KI 0,001N m : là khối lƣợng mẫu nguyên liệu, g 2.3.9.2. Định lương Alkaloid Nguyên tắc: Định lƣợng alkaloid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của Harbone (1973). Tách alkaloid ra khỏi nguồn nguyên liệu, do có tính kiềm nên trong thực vật alkaloid thƣờng tồn tại ở dạng muối và acid hữu cơ. Để chiết rút các alkaloid trong nguyên liệu thƣờng sử dụng các dung dịch đã đƣợc acid hóa. Sau đó làm bay hơi một phần dung môi, muối alkaloid trong môi trƣờng acid tiếp tục đƣợc trích ly bằng dung môi hữu cơ, làm bay hơi dung môi thu đƣợc alkaloid. Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 40ml acid acetic 10% và để yên trong 4 giờ sau đó cô cách thủy ở 700C đến khi còn ¼ thể tích. Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc vào cho đến khi tạo tủa. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng NH4OH 10% rồi đem đi sấy đến khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính toán hàm lƣợng alkaloid nhƣ sau: ( ) 43
  56. Đồ án tốt nghiệp Trong đó, X: Hàm lƣợng alkaloid có trong mẫu (%) ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu alkaloid (g) mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g) 2.3.9.3. Định lượng Flavonoid Nguyên tắc: Định lƣợng flavonoid có trong cao chiết theo phƣơng pháp của Bohm và Kocipai – Abyazan (1994) (Mir và ctv, 2013). Chiết xuất và tinh chế thành phần flavonoid trong dƣợc liệu. Ứng dụng đối với nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít tạp chất. Ƣu điểm là thực hiện nhanh, để thực hiện tuy nhiên sai số mắc phải lớn. Cách tiến hành: Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 25ml dung dịch methanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy lắc 150vòng/phút trong 1 giờ. Lọc thu dịch, sấy đến khi khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính hàm lƣợng flavonoid nhƣ sau: ( ) Trong đó, X: Hàm lƣợng flavonoid có trong mẫu (%) ma: Khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa mẫu flavonoid (g) mb: Khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: Khối lƣợng mẫu cao ban đầu (g) 2.3.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm SAS. với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phƣơng sai One-way ANOVA (P < 0,05) có ý nghĩa thống kê. 2.4. Bố trí thí nghiệm 44
  57. Đồ án tốt nghiệp Mẫu Bồ công anh Xử lý mẫu Tách chiết và thu hồi cao Cao chiết nƣớ c Bồ công anh Khảo sát hoạt tính Xác định sự hiện diện Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao một số thành phần hóa kháng oxy hóa của cao học c ủa cao Định lƣợng một số thành phần của cao Đánh giá kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 45
  58. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao chiết từ Bồ công anh 2.4.1.1. Sơ đồ thí nghiệm Mẫu bồ công anh Xử lý mẫu: sấy khô, xay nhuyễn Ngâm với nƣớc (1:20) (w/v) Dịch lọc Bã Cô cách thủy 70oC Cao chiết Đánh giá hiệu suất thu hồi cao Bảo quản lạnh 40C Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ cây bồ công anh 46
  59. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1.2. Thuyết minh quy trình Bồ công anh sau khi đƣợc thu nhận tiến hành xử lý mẫu cây. Trƣớc tiên cây đƣợc rửa sạch và đem đi sấy ở 400C đến khối lƣợng không đổi, sau khi khô đem xay nhuyễn. Hình 2.4. Mẫu Bồ công anh sau khi sấy khô Tiến hành ngâm mẫu với dung môi nƣớc cất theo tỉ lệ 1:20 (w/v). Mẫu đƣợc ngâm với lƣợng lớn nƣớc cất chứa trong erlen thủy tinh. Cách 4 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã bột tiếp tục đƣợc ngâm và lọc với lƣợng nƣớc cất nhƣ lần đầu cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cô cách thủy ở 700C để thu nhận cao chiết. Xác định hiệu suất thu hồi cao: Lƣợng cao sau khi đƣợc cô, đem đi cân để xác định hiệu suất thu hồi cao so với khối lƣợng bột mẫu ban đầu. Hiệu suất thu hồi cao đƣợc tính theo công thức sau: (%) 47
  60. Đồ án tốt nghiệp Trong đó H: hiệu suất cao thu đƣợc (%) m1: khối lƣợng cốc thủy tinh có chứa bột cao (g) m0: khối lƣợng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: khối lƣợng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) Sau khi xác định hiệu suất thu hồi các loại cao thu hồi đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. 2.4.2.1. Sơ đồ thí nghiệm 48
  61. Đồ án tốt nghiệp Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong môi trƣờng TSB Môi trƣờng TSA Lắc nhiệt độ phòng (18 – 24 giờ) Hấp tiệt trùng 1210C – 1 atm trong 15 phút Đo OD600nm Đổ đĩa Pha loãng về Hút 100 µl dịch Cao chiết nƣớc 106 cfu/ml vi khuẩn Cấy trang Hòa tan Đục lỗ (d= 6 mm) DMSO 1% Nhỏ dịch Nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml Ủ 370C/24 giờ Đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh 49
  62. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Thuyết minh quy trình Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch. Các chủng vi khuẩn chỉ thị đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trƣờng TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vòng/phút từ 18 - 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi lắc đƣợc đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha loãng bằng các ống nƣớc muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã đƣợc pha loãng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. môi trƣờng TSA có bổ sung 1,5% NaCl). Tiến hành trang khô, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vô trùng, dán nhãn các chủng vi khuẩn tƣơng ứng. Dùng que đục đã khử trùng có đƣờng kính d = 6 mm, đục 3 hoặc 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Dùng dao vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. Cao chiết đƣợc hòa tan bằng DMSO 1% theo nồng độ 200 mg/ml và 100 mg/ml. Hút 100 µl cao chiết ở mỗi nồng độ khảo sát cho vào các giếng. Sau khi hoàn thành các đĩa petri đƣợc để yên ở nhiệt độ phòng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn, sau đó ủ ở tủ ấm 370C trong thời gian 18 - 24h và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thông qua vòng ức chế vi khuẩn chỉ thị. Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 µg/ml với chủng Vibro spp. và 500 µg/ml với các chủng còn lại. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh. 2.4.3.1. Sơ đồ thí nghiệm 50
  63. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cao chiết nƣớc Mẫu acid ascorbic Mẫu trắng 100µl DPPH + 2800µl methanol + 100µl mẫu Ủ tối trong 30 phút Đo OD 517nm Hình 2.6. Quy trình khảo sát kháng oxy hóa của cao chiết 2.4.3.2. Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu: Đối với mẫu cao chiết: cao chiết đƣợc hòa tan bằng DMSO theo các nồng độ 1000 µg/ml; 800 µg/ml; 600 µg/ml; 400 µg/ml; 200 µg/ml; 100 µg/ml. Đối với mẫu acid ascorbic: pha loãng bằng DMSO nồng độ 3mg/ml Đối với mẫu trắng: sử dụng methanol 80%. Hút 100µl mẫu vào các ống nghiệm, sau đó, bổ sung thêm 2800µl methanol và 100µl DPPH. Sau đó đem ống nghiệm đi ủ tối trong vòng 30 phút và đo mật độ quang OD ở bƣớc sóng 517nm và đánh giá tỉ lệ kháng oxy hóa theo 2.3.8. Mỗi mẫu với các nồng độ đƣợc lặp lại thí nghiệm 3 lần. 2.4.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh. 2.4.4.1. Sơ đồ thí nghiệm 51
  64. Đồ án tốt nghiệp Cao chiết nƣớc từ Bồ công anh Hòa tan trong dung dịch Hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% DMSO 1% Lọc Lọc Dịch trong Dịch trong Phân tích thành phần Phân tích thành phần hoá học hoá học Alkaloid Saponin Cardiac Phenolic Steroid glycoside Carbohydrate Athraquinone Flavonoid Tannin Amino glycoside acid Hình 2.7. Sơ đồ định tính thành phần hóa học của cao chiết nƣớc 52
  65. Đồ án tốt nghiệp 2.4.4.2. Thuyết minh quy trình a. Chuẩn bị mẫu • Đối với chỉ tiêu alkaloid: mẫu cao chiết đƣợc hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. • Đối với các chỉ tiêu còn lại: mẫu cao đƣợc hòa trong dung dịch DMSO 1% cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, lọc dung dịch cao qua giấy lọc và thu dịch trong để tiến hành các thử nghiệm. b. Xác định sự hiện diện của một số thành phần hóa học trong cao chiết - Định tính thành phần carbohydrate (Thử nghiệm Molisch, Fehling, Barfoed ) - Định tính thành phần saponin (Thử nghiệm tạo bọt) - Định tính thành phần alkaloid (Thử nghiệm Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner ) - Định tính thành phần cardiac glycoside (Thử nghiệm Legal, Keller Killiani) - Định tính thành phần anthraquinone glycoside (Thử nghiệm Bontrager) - Định tính thành phần flavonoid (Thử nghiệm Alkaline, Shinoda, Ferric chloride) - Định tính hợp chất phenolic (Thử nghiệm Lead acetate, Gelatin) - Định tính thành phần tannin (Thử nghiệm Ferric chloride, Lead acetate) - Định tính thành phần steroid (Thử nghiệm Salkowski, Libermann Burchard) - Định tính thành phần amino acid (Thử nghiệm Ninhydrin) 2.4.5. Thí nghiệm 5: Định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ cây Bồ công anh 2.4.5.1. Sơ đồ thí nghiệm 53
  66. Đồ án tốt nghiệp Mẫu cao chiết nƣớc Nghiền nhỏ 40ml acid acetic 10% 25ml Methanol 80%, trong HCl 1% nhiệt độ phòng Để yên 4h Định mức đến Lắc, 1 giờ 100ml Cô cách thủy 700C đến Lọc, thu dịch Lắc đều và lọc ¼ thể tích Nhỏ giọt NH4OH đậm Hút 10ml dung Sấy đặc dịch vào erlen Lọc thu tủa Cân khối lƣợng Thêm hồ tinh bột Rửa tủa bằng NH 4OH 10% Định phân bằng Tính hàm lƣợng phƣơng pháp flavonoid chuẩn độ Sấy Tính hàm lƣợng Cân khối lƣợng vitamin C Tính hàm lƣợng alkaloid Hình 2.8. Sơ đồ định lƣợng vitamin C, alkaloid và flavonoid 54
  67. Đồ án tốt nghiệp 2.4.5.2. Thuyết minh quy trình a. Định lƣợng vitamin C Cân 10g lá cây bồ công anh, nghiền nhỏ trong dung dịch HCl 1%. Chuyển dịch vào bình định mức 100ml, trích ly và định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 1%. Lắc trộn đều và lọc, ta có dung dịch phân tích. Lấy 10ml dung dịch từ bình định mức cho vào erlen, thêm 5 giọt hồ tinh bột và đem định phân bằng KIO3/KI 0,001N cho tới khi xuất hiện màu xanh. Tiến hành song song mẫu kiểm chứng thay dịch chiết vitamin C bằng dung dịch HCl 1%. Tính kết quả hàm lƣợng vitamin C theo công thức ở mục 2.3.9.1. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. b. Định lƣợng Flavonoid Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 25ml dung dịch methanol 80% ở nhiệt độ phòng, sau đó cho vào máy lắc 150 vòng/phút trong 1 giờ. Lọc thu dịch, sấy đến khi khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính kết quả theo công thức ở mục 2.3.9.2. c. Định lƣợng Alkaloid Cân 0,5g mẫu cao chiết nƣớc vào cốc thủy tinh ngâm trong 40ml acid acetic 10% và để yên trong 4 giờ sau đó cô cách thủy ở 700C đến khi còn ¼ thể tích. Nhỏ giọt NH4OH đậm đặc vào cho đến khi tạo tủa. Lọc thu tủa, rửa tủa bằng NH4OH 10% rồi đem đi sấy đến khối lƣợng không đổi và cân khối lƣợng. Tính kết quả theo công thức ở mục 2.3.9.3. 55
  68. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết Bồ công anh từ dung môi nƣớc Mẫu bồ công anh sau khi đƣợc xử lý, tiến hành tách chiết và thu hồi cao với dung môi nƣớc. Để khảo sát sự ảnh hƣởng của loại dung môi tách chiết đến quá trình thu nhận cao chiết từ bồ công anh thì cần xác định hiệu suất thu hồi cao. Hiệu quả chiết cao của dung môi phụ thuộc vào độ phân cực và khả năng khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong lớp nguyên liệu (Trần Thị Ngọc Thanh, 2012). Dung môi tách chiết có ảnh rất lớn đến hiệu suất quá trình tách chiết, thu hồi cao cũng nhƣ hoạt tính sinh học. Mẫu bồ công anh đƣợc tách chiết bằng dung môi nƣớc cho hiệu suất thu hồi cao chiết là 12% Việc sử dụng các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực là do các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất có trong thực vật nhƣ các glycosides, các muối của alkaloids, saponins hay các hợp chất polyphenol (flavonoids, tannin, ), Ngoài ra, khả năng bốc hơi trong quá trình cô mẫu cũng nhanh hơn so với các dung môi không phân cực. Việc sử dụng dung môi nƣớc trong quá trình tách chiết an toàn hơn so với các dung môi không phân cực đồng thời phù hợp với cách dân gian sử dụng. Kết quả này cho thấy nƣớc là dung môi có thể sử dụng để tách chiết cao từ bồ công anh, tuy nhiên cần tiến hành thêm các thí nghiệm khảo sát hoạt tính sinh học để có thể đánh giá đƣợc nƣớc là dung môi tốt hay không? 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh trên các chủng vi khuẩn gây bệnh 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 56
  69. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli Dựa vào kết quả thí nghiệm trên hình 3.1 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh (nồng độ 200 mg/ml) thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với 3/4 chủng vi khuẩn E. coli khảo sát là E.0208, E.coli và ETEC với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ 9,7mm đến 10mm. Riêng cao chiết nƣớc ở nồng độ 100 mg/ml không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Cao chiết nƣớc ở nồng độ 200 mg/ml cho khả năng ức chế tốt đối với chủng E.coli và E.0208 với đƣờng kính trung bình 9,8 – 10mm và có hoạt tính kháng khuẩn gần tƣơng đƣơng với đối chứng Ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phƣơng diện thống kê (p > 0,05). Nhƣng đối với chủng ETEC, lại cho khả năng kháng khuẩn thấp hơn với đƣờng kính kháng khuẩn là 9,7mm. Theo nghiên cứu của Bhat và Al-Daihan (2014), hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Lactuca sativa đối với E.coli cho kết quả vòng ức chế là 11 ± 0,23 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với E.coli là 10 ± 0,87 mm. 57
  70. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp. Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Listeria Spp. Kết quả nghiên cứu ở hình 3.2 cho thấy cao chiết nƣớc từ bồ công anh (nồng độ 100 mg/ml, 200 mg/ml) có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn Listeria spp. với đƣờng kính vòng ức chế từ 8,7 mm đến 9,5 mm. Riêng cao chiết nƣớc ở nồng độ 100 mg/ml chỉ thể hiện khả năng ức chế đối với chủng vi khuẩn L.innocua. Đánh giá mức độ ức chế của LiWE ở các nồng độ so với Ciprofloxacin (500 µg/ml) nhận thấy rằng mặc dù LiWE ở nồng độ 200 mg/ml ức chế cả 2 chủng vi khuẩn L.monocytogenes và L.innocua tuy nhiên mức độ ức chế vẫn thấp hơn Ciprofloxacin 1 cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). 3.2.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Samonella Spp. Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Salmonella spp. gồm 58
  71. Đồ án tốt nghiệp các chủng: S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, và S. dublin. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở hình sau: Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Dựa vào hình 3.3 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chỉ chỉ ức chế đƣợc 2/4 chủng vi khuẩn khảo sát là S.enteritidis và S.typhii với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ 10,5mm đến 11,5 mm, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn thể hiện ở cả hai nồng độ 100 mg/ml và 200mg/ml. Bên cạnh đó, cao chiết nƣớc từ bồ công anh ở 2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml cho khả năng ức chế tốt đối với chủng vi khuẩn S.typhii với đƣờng kính trung bình 11,2 – 11,5 mm và có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng đƣơng với đối chứng Ciprofloxacin (500 µg/ml) không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê (p > 0,05). Theo nghiên cứu của Francis Mugweru Gitau và các cộng sự (2016) hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Senna spectabilis đối với chủng S.typhii có vòng ức chế là 9,6 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng S.typhii là 11,5 mm. 59
  72. Đồ án tốt nghiệp 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Shigella Spp. Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Dựa vào kết quả ở hình 3.4 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh chỉ ức chế đƣợc 2/3 chủng khảo sát là Shi.flexneri và Shi.sonnei với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ 9,3 – 10,7 mm. Cao chiết nƣớc cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn khá tốt đối với chủng vi khuẩn Shi.flexneri nhƣng chỉ ở nồng độ 200 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế trung bình 10,3 mm. Riêng với chủng vi khuẩn Shi.sonnei, chúng khá nhạy cảm với kháng sinh Ciprofloxacin ở nồng độ 0,5 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế lên đến 33 mm. Đồng thời, Shi.sonnei cũng bị ức chế ở cả 2 nồng độ cao chiết 100 mg/ml và 200mg/ml với đƣờng kính trung bình từ 9,3 mm đến 10,7 mm. Theo nghiên cứu của F.M Gitau và các cộng sự (2016) hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Maytenus putterlickoides đối với chủng Shi.flexneri có vòng ức 60
  73. Đồ án tốt nghiệp chế là 9,2 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng Shi.flexneri là 10,3 mm. 3.2.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Dựa vào hình 3.5 nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ bồ công anh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn khá tốt, ức chế đƣợc 4/4 chủng vi khuẩn nhóm Vibrio spp. với đƣờng kính trung bình từ 8,3 mm đến 11,2 mm. Ở 3 chủng vi khuẩn V. alginolyticus, V.cholera và V.harveyi cao chiết nƣớc chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml. Chủng vi khuẩn V.alginolyticus cho kết quả kháng khuẩn thấp nhất với đƣờng kính vòng ức chế trung bình là 8,3 mm. Riêng đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt ở cả 2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml với đƣờng kính vòng ức chế trung bình từ 61
  74. Đồ án tốt nghiệp 9,7 mm đến 10,2 mm và ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính kháng khuẩn tƣơng đƣơng với đối chứng Ciprofloxacin (0,008mg/ml) về phƣơng diện thống kê (p > 0,05). Theo nghiên cứu của A.A.Shamsuddin và cộng sự (2013) hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Avicennia alba đối với chủng V.alginolyticus và V.parahaemolyticus có vòng ức chế là 8,7 và 9,3 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng V.alginolyticus và V.parahaemolyticus là 8,3 và 10,2 mm. 3.2.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ bồ công anh và Ciprofloxacin đối với vi khuẩn E. feacalis Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có phổ kháng khuẩn hẹp, chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở 1/3 chủng vi khuẩn khảo sát với nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da với đƣờng kính vòng kháng từ 10,5 mm đến 10,2 mm. 62
  75. Đồ án tốt nghiệp Nhận thấy rằng cao chiết nƣớc từ Bồ công anh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở cả 2 nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml đối với chủng vi khuẩn E. feacalis tuy nhiên mức độ ức chế vẫn thấp hơn Ciprofloxacin một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Theo nghiên cứu của Richa Arora và các cộng sự (2012) hoạt tính kháng khuẩn từ cao chiết nƣớc của cây Hippophae rhamnoides L. (củ cải đƣờng) đối với chủng E. faecalis có vòng ức chế là 11,3 mm. Trong thí nghiệm này, kết quả đƣờng kính vòng ức chế trung bình của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh đối với chủng E. faecalis là 10,5 mm. 3.3. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc Bồ công anh đối với 20 vi khuẩn gây bệnh Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh, kết quả tổng hợp đo đƣờng kính vòng ức chế đƣợc trình bày ở Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết quả đƣờng kính vòng ức chế (mm) của cao chiết nƣớc Bồ công anh trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh Ciprofloxacin Vi khuẩn chỉ thị 100 mg/ml 200 mg/ml (µg/ml) E.coli 0157:H7 NA NA 13,2 ± 0,29 a E.coli 0208 NA 9,8 ± 0,29b 12,3 ± 0,29 a E.coli NA 10 ± 0,87b 13,2 ± 0,29 a ETEC NA 9,7 ± 0,29b 31,0 ± 0,5 a L.innocua 8,7 ± 0,58b 9,3 ± 0,29b 12,0 ± 0,5 a L.monocytogenes NA 9,5 ± 0,5b 12,2 ± 0,29 S.dublin NA NA 12,2 ± 0,77 a S.enteritidis 11,5 ± 0,5b 10,5 ± 0,5b 13 ± 0,5 a S.typhii 11,2 ± 0,76a 11,5 ± 0,5a 12,5 ± 0,5 63
  76. Đồ án tốt nghiệp S.typhimurium NA NA 11,0 ± 0 Shi.boydii NA NA NA a Shi.flexneri NA 10,3 ± 0,29b 13,2 ± 0,29 a Shi.sonnei 9,3 ± 0,76b 10,7 ± 0,58b 33 ± 0,5 a V.alginolyticus NA 8,3 ± 0,58b 16,2 ± 0,29 a V.cholerae NA 11,2 ± 0,29b 13,3 ± 0,58 a V.harveyi NA 10,8 ± 0,58b 18,0 ± 0,5 a V.parahaemolyticus 9,7 ± 0,76b 10,2 ± 0,58ab 11,3 ± 0,29 P.aeruginosa NA NA 12,2 ± 0,58 S.aureus NA NA 12,2 ± 0,29 a E.feacalis 10,2 ± 0,29b 10,5 ± 0,5b 12,0 ± 0,5 Chú thích: NA: non activity. Dựa vào Bảng 3.1 có thể kết luận rằng cao nƣớc từ Bồ công anh ở nồng độ 100 mg/ml và 200 mg/ml có phổ hoạt động và hoạt tính kháng khuẩn khác nhau trên 6 nhóm vi khuẩn gây bệnh với đƣờng kính vòng ức chế từ 8,3 mm đến 11,5 mm. Tất cả các kết quả nhận đƣợc trong những thí nghiệm cho thấy rằng: cao chiết nƣớc từ Bồ công anh nồng độ 200 mg/ml có khả năng ức chế đƣợc 14/20 chủng vi khuẩn gây bệnh khảo sát với đƣờng kính vòng kháng từ 8,3 mm – 11,5 mm. Đồng thời, cao chiết nƣớc ở nồng độ này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở tất cả các nhóm vi khuẩn Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm gây bệnh cơ hội trên da 3.4. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết nƣớc Bồ công anh Từ kết quả các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có khả năng ức chế các loại vi khuẩn. Dựa vào cơ sở trên, tiến hành 64
  77. Đồ án tốt nghiệp thực hiện các thử nghiệm để xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học có khả năng kháng khuẩn trong mẫu cao chiết nƣớc Bồ công anh. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh. Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả Molisch + Carbohydrate Fehling ++ Barfoed ++ Saponin Foam + Mayer + Dragendorff ++ Alkaloid Hager ++ Wagner + Legal ++ Cardiac glycoside KellerKilliani + Anthraquinone glycoside Bontrager - Alkaline + Flavonoid Shinoda + Ferric chloride ++ Lead acetate - Phenolic compound Gelatin - Ferric chloride + Tannin Lead acetate + Salkowski + Steroid Libermann Burchard + Amino acid Ninhydrin ++ Chú thích: (+): dƣơng tính, (-): âm tính 65
  78. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết Bồ công anh từ nƣớc đƣợc trình bày ở Bảng 3. nhận thấy rằng trong dung môi nƣớc có khả năng tách chiết đƣợc rất nhiều hợp chất từ cây Bồ công anh bao gồm các hợp chất thông thƣờng và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất thông thƣờng đƣợc tìm thấy trong cao chiết nƣớc của cây Bồ công anh thấy có sự hiện diện của hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dƣơng tính) nhƣng không thấy có sự hiện diện của nhóm các hợp chất phenol. Trong cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm các loại hợp chất trong alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin và nhóm steroid. Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Bồ công anh nói riêng là do chúng có các thành phần alkaloids, flavonoid, tannin và triterpenoid quyết định. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloids có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Trong khi đó, hợp chất của flavonoids có dẫn chất flavone và flavonols, ngoài ra còn có hợp chất tannin có dẫn chất ellagitannin, ở hợp chất terpennoids, tinh dầu thì có dẫn chất là capsaicin. Tất cả các dẫn chất trên đều có chức năng phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein, các chức năng trên giúp tiêu diệt vi sinh vật. Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao chiết nƣớc Bồ công anh có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid. 3.5. Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của cao chiết nƣớc Bồ công anh Từ kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản ta thấy trong Bồ công anh có sự hiện diện của các chất nhƣ alkaloid, flavonoid . 66
  79. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3 Kết quả định lƣợng một số thành phần hóa học của Bồ công anh Thành phần hóa học n Hàm lƣợng (%) Vitamine C 3 1,61 ± 0,25 Alkaloid 3 14,67 ± 1,15 Flavonoid 3 42,0 ± 4,0 Lƣợng vitamin C trong bồ công anh (0,16 mg/g) đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ tƣơng ứng với số lƣợng đƣợc xác định bởi Mueeay và Stratton (0,19 mg/g, 0,12 mg/g, 0,15 mg/g) (MUEEAY và STRATTON). Vitamin C là một chất kích hoạt enzyme, có thể gia tăng sự hoạt động của một số kim loại, là một chất khử và một chất chống oxy hóa có khả năng hòa tan nhiều trong nƣớc. Từ kết quả trên bảng 3.3 có thể thấy cao chiết nƣớc từ Bồ công anh có hàm lƣợng flavonoid khá cao. Flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thƣờng. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thƣờng là các gốc tự do nhƣ OH[SUP]•[/SUP], ROO[SUP]•[/SUP] (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thƣ, tăng nhanh sự lão hoá ). 3.6. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh a. Kết quả hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C Hoạt động trung hòa gốc tự do DPPH đƣợc đánh giá dựa trên lƣợng gốc tự do DPPH còn lại sau khi đã kết hợp với chất kháng oxy hóa. Tỷ lệ giảm của mật độ quang đo đƣợc ở bƣớc sóng 517 nm khi có và không có chất kháng oxy hóa đƣợc xem nhƣ nhƣ hiệu suất kháng oxy hóa của mẫu thí nghiệm. 67
  80. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7. Hiệu quả kháng oxy hóa của vitamin C Dựa vào khả năng kháng oxy hóa của vitamin C để xây dựng đƣờng chuẩn và tính hàm lƣợng chất kháng oxy hóa có trong cao chiết nƣớc từ Bồ công anh. b. Kết quả khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh Hình 3.8. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh 68
  81. Đồ án tốt nghiệp Nhƣ vậy, theo sự tăng dần nồng độ từ 100 µg/ml – 1000 µg/ml, khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết đều tăng dần. Điều đó chứng tỏ, khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết tăng tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ với tỉ lệ trung bình từ 4,99 – 30,98%. Nồng độ 1mg/ml có hoạt tính kháng oxy cao nhất với tỉ lệ trung bình 30,98%. Mặc dù khả năng chống oxy hoá của cao chiết nƣớc từ Bồ công anh thấp hơn so với acid ascorbic (P <0,05) nhƣng kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng LiWE có hoạt tính chống oxy hoá. Phân tích cây bồ công anh (Taraxacum officinale) cho thấy khả năng chống oxy hoá cao nhất trung bình là 80,664% ức chế dung dịch DPPH, các bộ phận khác của cây (hoa, lá và thân) có khả năng ức chế dung dịch DPPH khoảng 69% (Paduret và cộng sự, 2016). Đánh giá hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo hàm lƣợng vitamin C có trong cao chiết nƣớc từ Bồ công anh. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.4 Bảng 3.4. Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa theo vitamin C Nồng độ (µg/ml) Hàm lƣợng (µg/ml) 1000 13,60 ± 1,99 800 10,88 ± 1,77 600 7,95 ± 1,34 400 6,44 ± 1,75 200 2,95 ± 1,01 100 1,43 ± 1,90 Hàm lƣợng chất kháng oxy hóa trong LiWE tăng dần tỉ lệ thuận với nồng độ mẫu khảo sát. Khi so sánh với kết quả hàm lƣợng chất kháng oxy hóa trong cao chiết ethanol 70% từ Bồ công anh (Đoàn Lê Thảo Trang, 2017) ở nồng độ 100 – 1000 µg/ml có hàm lƣợng chất kháng oxy hóa tƣơng đƣơng với vitamin C là 20,07 – 34,74 µg/ml thấy rằng LiWE có hiệu quả kháng oxy hóa thấp hơn, điều này do ảnh hƣởng của dung 69
  82. Đồ án tốt nghiệp môi tách chiết đến khả năng tách các chất có hoạt tính kháng oxy hóa, cụ thể là nƣớc hòa tan ít các chất có hoạt tính kháng oxy hóa hơn so với ethanol 70%. 70
  83. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Từ mẫu cây bồ công anh thực hiện tách chiết để thu hồi cao với dung môi nƣớc, hiệu suất thu hồi cao đạt 12% - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nƣớc bồ công anh trên 20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết nƣớc bồ công anh có phổ hoạt động rộng và có khả năng ức chế tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời, có hoạt tính kháng khuẩn với đƣờng kính vòng ức chế từ 8,3 – 11,5 mm. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết nƣớc bồ công anh ở các nồng độ khác nhau, nồng độ 1000 µg/ml thể hiện tính kháng cao nhất với tỉ lệ 30,98%. Hàm lƣợng các chất kháng oxy hóa tƣơng đƣơng vitamin C ở các nồng độ 100 – 1000 µg/ml là 1,43 – 13,60 µg/ml. - Thử nghiệm xác định thành phần hóa học của cao chiết nƣớc từ bồ công anh thấy sự hiện diện của các hợp chất: carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin và nhóm steroid. - Kết quả định lƣợng hàm lƣợng vitamin C đạt 1,61%, flavonoid chiếm 42% và alkaloid chiếm 14,67%. 4.2. Đề nghị - Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết từ bồ công anh ở nhiều loại dung môi khác nhau để tìm đƣợc loại dung môi tách chiết tốt nhất. - Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây bồ công anh với nhiều vi sinh vật gây bệnh khác. - Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ các loại dung môi khác nhau. - Tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của LiWE ở các nồng độ cao hơn để xác định giá trị EC50 71
  84. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng và Dƣơng Văn Hợp (2007). Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội. Trần Trƣờng Hận (2010). Hợp chất thiên nhiên. Nguyễn Thị Hằng và ctv (2015). Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của loài tầm gửi năm nhị (Dendrophthoe Pentandra (L.) MIQ.). Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012). Phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Hà Nội. GV Bùi Thi Hải Hòa và sinh viên thực hiện (2012), Chuyên Đề: Độc Tố E.coli, Viện Đại học Mở Hà Nội. TS. Đặng Văn Hoài (2009 – 2010), Hóa hữu cơ NK Bài 2: steroid và cholesterol, Đại học Y dƣợc TPHCM. BS Nguyễn Văn Minh Hoàng (2013), Đặc Điểm Shigella.sp gây tiêu chảy tại bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM, Bệnh viện Nhiệt Đới TP HCM. chay-cap-tai-benh-vien-nhiet-doi-thanh-pho-ho-chi-minh-40933/ Phùng Trung Hùng và cộng tác viên (2013), Đại cương carbohydrate. Phạm Thanh Kỳ (1998). Bài giảng dược liệu – tập II. Nhà xuất bản Trung tâm thông tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh (2011). Cấu tạo, tính chất và vai trò của carbohydrate. 72