Đề tài Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase từ Aspergillus Niger CF2

50 trang phuongvu95 4720

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase từ Aspergillus Niger CF2", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

de_tai_nghien_cuu_cac_dieu_kien_thich_hop_sinh_tong_hop_pect.docx

Nội dung text: Đề tài Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase từ Aspergillus Niger CF2

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập tại Viện. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Kim Dung – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp đã tận tình định hướng và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công trong cuộc sống cũng như trong sự nghiệp nghiên cứu và giảng dạy. Tôi xin chân thành cảm ơn! Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS. Vũ Kim Dung Phạm Nhật Thành
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase 2 1.1.1. Cơ chất pectin 2 1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase 3 CHƯƠNG 2MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 25 2.2. Nội dung nghiên cứu 25 2.3. Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.1. Vật liệu 25 2.3.2. Hóa chất 25 2.3.3. Thiết bị 25 2.3.4. Môi trường nuôi cấy 26 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu 26 CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2 31 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectinase 31 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin 31 3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường 32 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 33 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men 34 3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2 36 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme 36 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme 37 3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme 39
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1. Kết luận 41 4.2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase 4 Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp 20 Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme 20
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin 3 Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc 16 Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger 22 Hình 2.1: Môi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khoáng 27 Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan 29 Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC 31 Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase 31 Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD 32 Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2 33 Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 34 Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger CF2 34 Hình 3.7: Môi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày 35 Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày 35 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2 36 Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của pectinase từ A. niger CF2 37 Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger CF2 38 Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger CF2 39 Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme 40
ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase, xúc tácthủyphân các phân tử pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt phải kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trên đối tượng cà rốt. Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích khá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ. Trước đây nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì không ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọn hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành, tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009). Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sản xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp. 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase 1.1.1. Cơ chất pectin Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid galacturonic bằng liên kết -1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà pectin có khối lượng phân tử 80.000 200.000 Da. Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri, glycerine nóng. Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thành các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid, vì vậy các pectin tan này không đồng dạng vớinhau. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: - Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là -D-galacturonan hay -D-galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D- galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4). Mặt khác, mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl. - Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm 2
carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid. Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid. - Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hòa tan. 1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase 1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol, đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin 1.1.2.2. Phân loại Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng như bảng 1.1. - Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vị 3
galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+. Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase Enzym (tên gọi theo Enzym(tên STT Phản ứng xúc tác hệ thống) thường gọi) Pectin + H2O = n metanol + 1 Pectin-pectinhydrolase pectinesterase pectic acid Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4 Endopoly galacturonid trong 2 galacturonid-glycano galacturonase galacturonid không theo một hydrolase-PG (endo-PG) trật tự nào Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4-D- Exopoly galacturonid trong pectat, 3 galacturonidgalacturo galacturonase trong galacturonic với sự n-hydrolase (exo-PG) đứt mạch của acid galacturonic Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4-D- Endopolymetil- galacturonid trong pectin 4 galacturonidmetilester galacturonase không theo một trật tự nhất -glycanohydrolase (Endo-PMG) định. Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4-D- galacturonid trong pectat với Exo-pectatliase 5 galacturonid sự tạo thành -4,5 (exo-PKTE) digalacturonoliase aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định. Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4-D- galacturonid trong pectat, Endopectatlias 6 galacturonid trong galacturonic với sự tạo e (PETE) glicanoliase thành nối đôi không theo một trật tự nhất định Thủy phân liên kết -1,4-D- Poly- -1,4-D- galacturonid trong pectin galacturonid Endopectinlias 7 với sự tạo thành nối đôi metylester e (Endo-PTE) không theo một trật tự nhất glicanoliase định 4
- Polygalacturonase (PG): còn có tên gọi khác là poly 1,4- galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4- glycoside. Các exo-PG (exo-poly -1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ đầu không khử, và endo-PG (endo- poly -1,4-D-galacturonide) glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. - Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không không bị ester hóa. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4- -D- galacturonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly (1,4- -D-galacturonic) lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. Ngoài ra còn có: - Pectin-transeliminase (poly 1,4- -galaturonid-methylesteglucanolise) là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid. - Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4- - galaturonid– glucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid. - Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hóa. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme. 1.1.2.3. Ứng dụng của enzyme pectinase - Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase duới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường 5
nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%. - Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng thành phẩm. - Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáu nhóm enzyme sau: Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được luợng sản phẩm lớn. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và thuỷ phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang. Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong sản suất siro thành phẩm. 6
Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây được chia làm hai loại:  Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi  Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận đen, dâu  Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzyme sau: - Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả. - Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly - Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc. 1.1.2.3.1. Làm trong nước quả - Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm lượng pectine đáng kể. Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như sau: •Syrup mơ: 0,107% •Syrup mận: 0,153% •Nước mận: 0,452% Lượng pectin này làm cho syrup quả bị keo và đục, có độ nhớt cao, nhất là khi quả có độ acid và hàm lượng đường cao như các lọai syrup kể trên - Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì pectinase phải có enzym endo và exo-polygalacturonase, enzym 7
pectinestenase. Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm. Vì endo và exo- polygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũng góp phần vào tác dụng của enzym này. Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của cellulase và hemicellulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép có enzyme pectinaseliminase và enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống. Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả trong cũng không được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase, poliphenoloxydase). Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase và cellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm.Trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ protopectin của mô quả. Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm không chứa enzym oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoxian thì không chứa enzym phá huỷ các chất này. Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase, người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhanh được đem xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho 8
tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá trình ép sau này. Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn toàn. Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất hoà tan. Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại trừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn. Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn toàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn. Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm 3 giai đoạn: + Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ” + Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi kết tủa hoàn toàn. + Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các pectin kết tủa bởi ion canxi - Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt độ 1,950 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp so màu). Dưới tác dụng của pectinase, pectine - một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử acid galacturonic (C6H10O7) mà một phần đã được este hoá với rượu metylic (CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic. Pectine là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc theo chiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (- COO-) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong 9
toàn bộ dung dịch có chứa pectin. Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó phần tử thịt quả có kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn nên không bền vững về mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng là những phân tử tích điện nên dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành những phân tử lớn dễ dàng lắng xuống. Trong nước quả, sự có mặt của hợp chất polyphenol (đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa không tan v.v Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên. Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thời gian để so sánh tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu. - Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Khi ta cho pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03- 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ. Dịch quả thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ. 1.1.2.3.2. Trong sản xuất rượu vang Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ. Enzyme pectin được thêm vào các loại trái cây trước khi bổ sung các men rượu trong quá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục. Rượu vang đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme. Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme. 1.1.2.4. Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase 1.1.2.4.1. Nguồn gốc thu nhận Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú. Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:  Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus 10
 Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii  Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum 1.1.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bề mặt Quy trình sản xuất Môi trường Dụng cụ nuôi cấy Hấp khử trùng Hấp khử trùng Để nguội Để nguội Phối vào dụng cụ Cấy vào môi trường Nhân Giống vi giống sinhvật Nuôi cấy trong 36 giờ Thu nhận enzyme thô 11
Thuyết minh quy trình: Môi trường nuôi cấy Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác (mầm mạ, nước khoai tây để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali ). Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh. Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm. Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30 0C thì tiến hành cấy giống. Giống Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh nhiễm tạp. Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín. 12
Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kg môi trường. Nuôi cấy Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió. Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32 0C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 24 0C thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme. Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau:  Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.  Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ.  Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ: giai đoạn này có những thay đổi sau: Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 40 0 - 450C. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O 2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 30 0 C và độ ẩm trong phòng khoảng 90%. 13
Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng. Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này có những biến đổi Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở 300C. Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn được hình thành ở giai đoạn này. Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô. 1.1.2.4.3. Thu nhận enzyme a. Phương pháp thu nhận Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách và thu nhận riêng: Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch. Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch. 14
Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào Khó tách Dễ tách Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào Thường lẫn chung với các chất khác của tế Không lẫn chung với các thành bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất phần nội bào, nếu có chỉ là một nguyên sinh, lipid ) vài enzyme ngoại bào khac Chỉ bền vững trong môi trường nội bào Bền vững hơn Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt hơn + Từ môi trường nuôi cấy bề mặt Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28 0C. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C. Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì vậy, các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống. Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme dịch phải được làm lạnh xuống 3 – 5 oC. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa, lắng xuống dưới cần tách ly ngay. 15
Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc + Từ môi trường nuôi cấy bề sâu Phương pháp hiếu khí Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ 2-10%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm 16
được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 oC. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm. Phương pháp yếm khí Môi trường: bã củ cải 2%; (NH 4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%; nước chiết ngô 0.5% Clostridium pectinofermentants15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC. C.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO40,4%; K2HPO4 0,7%; KH2PO4 0,3%; NaCl 0,1%; MgSO4 0,025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid 0,5%. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa 17
bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0,9-1,0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase. 1.1.2.5. Đặc điểm của enzyme pectinase  Pectinesterase: Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0 đến6,5. Trái lại pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật là từ 6 đến 7,5 – 8. Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45 0C. Từ 55 đến 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinesterase từ thực vật cao hơn: từ 55 – 600C. Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có o o nhiệt độ tối ưu là 30 – 45 C, pHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62 C và từ o o thực vật (pHopt=7,5-8, t opt= 55-60 C). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger. Trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhôm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase  Polygalacturonase: Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis, Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, 18
neurosrora crassa, các loàiAscomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum. pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6. Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6. Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5. Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 - 450C. Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô hoạt khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C. 1.1.2.6. Trung tâm hoạt động của pectinase Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vòng xoắn kép về phía phải với 2 vòng tạo thành khe liên kết với cơ chất. Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme. 1.1.2.7. Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme loài người đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong công nghiệp. Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Các enzyme quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày qua bảng sau: 19
Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme 1.1.3. Tổng quan về Aspergillus niger 1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu A. niger đã là chủ đề được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp trong nhiều thập kỷ qua. Năm 1919, A. niger được sử dụng để sinh tổng hợp citric acid và đánh dấu tầm quan trọng trong sản xuất citric acid trong quy mô công nghiệp. Ngoài ra, A. niger còn có khả năng sinh tổng hợp acid gluconic, acid fumaric. Tuy nhiên, kể từ năm 1960, A. niger đã trở thành nguồn sinh tổng hợp một loạt các enzyme tham gia vào kỹ thuật chế biến hoa quả, bánh và trong các ngành công nghệ tinh bột và thực phẩm. Công nghệ gen đã áp dụng thành công để cải thiện quy trình sản xuất và sử dụng các chủng A. niger 20
như một hệ thống biểu hiện các protein ngoại lai. Các nghiên cứu đẩy mạnh trong thập kỷ qua đã mang lại nhiều thành công và các sản phẩm mới (E. Shuster và cs,2002). A. niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như citric acid, acid gluconic, (Pansear và cs,2010). 1.1.3.2. Đặc điểm, phân bố A. niger là một loại nấm sợi và một trong những loài phổ biến của chi Aspergillus có nhiều công dụng trong công nghệ sinh học, A. niger phát triển ở nhiệt độ tối ưu 35–37oC, pH từ 1,4–9,0. Cơ quan sinh sản của A. niger có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 1015 m là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già. Bào tử đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4 – 5m nhưng thường nhỏ hơn (Onions và cs, 1981). Loài A. niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen. 21
A, Cấu tạo A. niger B, Hệ sợi nấm A. niger Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger *Đặc điểm sinh hóa: A. niger có khả năng sản xuất các enzyme: + -amylase: A. niger có khả năng tổng hợp -amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose. + Protease: A. niger có khả năng tạo protease và polypeptidase. Protease phân giải protein thành polypeptid, pepton; peptidase chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin. + Cellulase: A. niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx và -glucosidase hay cellobiase. + Pectinase, Xylanase: A. niger có khả năng tạo pectinase, xylanase ở nhiệt độ tối thích 25oC, pH 5,6. Bên cạnh đó, A. niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme khác như: lipase, mananase, *Phân bố: A. niger là vi sinh vật hiếu khí phát triển trên các chất hữu cơ, do đó nó có thể được tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi trong môi trường có chứa đất. Ngoài ra, A. niger được tìm thấy trong chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy và phân hữu cơ trong môi trường ngoài trời. A. niger được nuôi cấy để sản xuất nhiều chất trong công nghiệp. Các chủng khác nhau của A. niger cũng được sử dụng trong sản xuất citric acid trên quy mô công nghiệp. 22
1.1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận pectinase từ A. niger Các nhà khoa học đã xác định được rằng sự tổng hợp pectinase thường xảy ra đồng thời với sự sinh trưởng của A. niger. Trong khi đó pectinesterase bị chậm lại do tác dụng ức chế của các sản phẩm thủy phân pectin (Maldonado M.C., 1998). Môi trường dinh dưỡng bao gồm: nguồn carbon, nito, phospho ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và A. niger nói riêng. Môi trường dinh dưỡng còn ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme và thành phần enzyme trong chế phẩm. Như vậy, lựa chọn môi trường đặc hiệu sẽ đảm bảo sự tổng hợp định hướng enzyme. 1.1.3.4. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn carbon Hệ pectinase một mặt là enzyme bản thể, nhưng mặt khác lại là enzyme cảm ứng như các enzyme thủy phân khác. Do đó, một trong các yếu tố quan trọng của sự sinh tổng hợp pectinase là chọn đúng cơ chất đặc hiệu cho A. niger. Pectin được bổ sung vào môi trường sẽ cảm ứng sự tổng hợp pectinase. Như vậy, sự có mặt pectin trong môi trường dinh dưỡng là điều kiện bắt buộc. Cơ chất pectin cảm ứng có thể dùng bột cà rốt, bột linh lăng, bột táo, cam, Chủng A. niger được nuôi cấy trên nguồn carbon khác nhau (pectin, tinh bột, inulin, maltose, galactose ở nồng độ 2%, 4% và 6%) tạo pectinase cao nhất còn môi trường có monosaccharide và glycerin hoàn toàn không thu được enzyme này (Akhter N, 2011). Bổ sung glucose vào môi trường có lactose và pectin sẽ gây hiện tượng ức chế sự tổng hợp pectinase (Phutela U, 2005). Với nguồn carbon là saccharose khi có thừa trong môi trường (>2%) sẽ ức chế sự tổng hợp cảm ứng pectinase. Cũng cần lưu ý rằng tỷ lệ giữa pectin và carbohydrate cũng có ý nghĩa, đặc biệt là các tỷ lệ 1:2, 3:2 và 4:2 thường có tác dụng tốt cho sự sinh trưởng của A. niger cũng như cho quá trình tổng hợp pectinase. 23
1.1.3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp pectinase bởi vi sinh vật. Nguồn nitơ vô cơ chủ yếu dưới dạng muối nitrate và muối amonium. Đối với A. niger sử dụng sulphate amonia là hiệu quả hơn cả. Khi sử dụng nguồn nitơ này, dịch canh trường bị acid hóa đến pH 2,5 - 3,0. Ở pH này có sự tích lũy pectinase tốt hơn (Akhter N, 2011). Tuy nhiên, muối nitrate của kim loại kiềm sẽ ức chế sự tổng hợp pectinase. Khi sinh trưởng trên môi trường có thêm muối nitrate của kim loại kiềm sẽ làm pH tăng 5,5 - 5,8 nên khả năng tiêu thụ nitơ nitrate của A. niger sẽ giảm. Các dạng nitơ hữu cơ (dịch whey, pepton, cám ) phối hợp với nguồn nito vô cơ có tác dụng tốt đến sự tổng hợp pectinase(Phutela U, 2005). Trong môi trường có muối amonium sulphate ảnh hưởng đến sự tổng hợp EPG của chủng A. niger có thể tăng từ 7 - 10%. Tỷ lệ tối thích giữa C và N cho sự tổng hợp enzyme nằm trong giới hạn 7:1 đến 13:1. 1.1.3.6. Ảnh hưởng của các yếu tố khác Các nguyên tố vô cơ có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp pectinase bởi A. niger mà trước tiên là trạng thái sinh lý của A. niger. Nói chung hàm lượng phospho trong môi trường phải không được ít hơn 8 - 10 mg. Khi sử dụng nguồn nitơ của phosphate diamonium thì nhu cầu về phosphor của A. niger hoàn toàn được thỏa mãn. Môi trường tổng hợp pectinase có tỷ lệ tối ưu giữa nitơ và carbon, pectin và carbohydrate bã củ cải là 3 - 4%, bột ngô 0,5%, (NH4)2HP04 0,7%, MgS04 0,05%. Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy, đều có ảnh hưởng đến sự tổng hợp pectinase. Sự sinh trưởng cực đại của A. niger và sự tổng hợp polygalacturonase diễn ra ở điều kiện nhiệt độ 30 oC, trong 2 - 5 ngày, còn polymethylesterase trong 5 - 7 ngày (Martos M.A., 2009). 24
CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến môi trường và điều kiện lên men sinh tổng hợp pectinase từ chủng A. niger CF2. 2.2. Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men sinh tổng hợp pectinase từ chủng A. niger CF2: - Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng pectin - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ - Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm  Xác định đặc tính của pectinase từ chủng A. niger CF2 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu Chủng Aspergillus niger CF2từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học, Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam. 2.3.2.Hóa chất Các hóa chất dùng trong thí nghiệm có độ tinh sạch và chất lượng cao từ các hãng uy tín: 3,5 – Dinitrosalisilic, Diagalacturonic acid, Mono galatacturonic acid, Pectin, Polygalacturonic acid, Trigalacturonic acid, Butanol, Đệm pH 4,5, DNS 2.3.3. Thiết bị Trong quá trình thí nghiệm, một số trang thiết bị và máy móc đã được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp như: Cân phân tích, nồi hấp khử trùng, tủ cấy vi sinh vật vô trùng, tủ lạnh để giữ giống, tủ ấm nuôi 25
cấy vi sinh vật, kính hiển vi quang học, máy lắc ổn nhiệt, máy đo OD, máy ly tâm nhỏ Micro Centrifuge II. Ngoài ra còn sử dụng một số dụng cụ cần thiết như đĩa petri, pipet, bình tam giác, ống nghiệm 2.3.4. Môi trường nuôi cấy - Môi trường hoạt hóa và nhân giống +Môi trường Crapeck Hàm lượng Hàm lượng Thành phần Thành phần (g/l) (g/l) NaNO3 2,00 Saccharose 30 K2HPO4 1,00 Agar 15 MgSO4 0,50 Nước cất 1000ml KCl 0,50 pH 6,0 FeSO4 0,01 - Môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase (%): cám gạo (70), trấu (20), pectin (8-16), dịch khoáng * 2 ml * Dịch khoáng (g/L): (NH4)SO4 (4), KH2PO4 (2), MgSO4.7H2O (1), -5 -5 -6 FeSO4.H2O (6,3.10 ), ZnSO4 (6,2.10 ), MnSO4 (1.10 ) 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu 2.3.5.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc và giữ giống trong ống nghiệm Đổ môi trường Crapeck lên đĩa petri, sử dụng que cấy đã khử trùng bằng cồn cấy chuyển bào tử nấm từ ống nghiệm ra đĩa thạch bằng phương pháp cấy chấm điểm.Sau đó đem đĩa đặt trong tủ ấm nuôi ở điều kiện nhiệt độ 30oC trong 3 – 5 ngày. 2.3.5.2. Nhân giống chủng A. niger Sử dụng bình tam giác có dung tích 100ml chứa 20ml môi trường nhân giống. 26
Sử dụng que cấy để cấy chuyển nấm (bào tử) từ trên đĩa thạch vào trong bình tam giác (chú ý đo OD để xác định lượng các bào tử bằng nhau). Nuôi trong điều kiện môi trường lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30 oC. Sau 3 ngày nuôi cấy, thu nhận hệ sợi (pellet) của các chủng A. niger đưa vào lên men. 2.3.5.3. Điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp pectinase từ A.niger Chủng A.niger CF2 được nuôi lắc trong môi trường Crapeck ở 30oC.Sau 3 ngày, cấp giống vào bình tam giác chứa cơ chất cám – trấu tỷ lệ (7:2) với tỷ lệ 2.106 bào tử/g môi trường. Hàm lượng pectin: được khảo sát ở các nồng độ 8, 12, 16% (w/w) tương ứng với độ ẩm 50%, sau 3 ngày nuôi ở 30 oC mẫu được đánh giá hoạt độ enzyme. Độ ẩm môi trường: được khảo sát ở các mốc 50, 60, 70% (w/w) khi nuôi chủng thí nghiệm trong bình 250ml chứa 16g môi trường có bổ sung 12% (w/w) pectin. Nhiệt độ: được thử nghiệm với các mốc nhiệt độ 24, 30, 37oC trong 16g môi trường bổ sung 12% pectin và độ ẩm 60%. Thời gian lên men: chủng được lên men theo các điều kiện thích hợp tìm được ở trên, định kì các khoảng thời gian 3, 5 và 7 ngày, mẫu canh trường được xác định hoạt độ pectinase. Các bố trí thí nghiệm nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase được biểu diễn ở bảng 2.1. 27
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase STT Hàm lượng Độ ẩm Nhiệt độ Thời gian lên pectin (%) (%) (oC) men (giờ) 1 8 2 12 60 30 72 3 16 4 Hàm lượng 50 5 pectin thích 60 30 72 6 hợp 70 7 Hàm lượng 24 Độ ẩm thích 8 pectin thích 30 72 hợp 9 hợp 37 10 Hàm lượng 72 Độ ẩm thích Nhiệt độ 11 pectin thích 120 hợp thích hợp 12 hợp 168 Hình 2.1: Môi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khoáng 2.3.5.4. Thu dịch enzyme thô Dịch enzyme được chiết tách bằng đệm phosphate pH 4,5 (tỷ lệ chiết đệm: môi trường nuôi là 7:1) trên máy lắc 200 vòng/ phút trong 1 giờ, lọc qua 28
vải màn sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1. Dịch sau khi lọc được ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC và thu dịch nổi (enzyme thô). 2.3.5.5. Kết tủa enzyme bằng ethanol Dịch enzyme sau khi ly tâm được sổ sung ethanol lạnh (0 oC) theo tỷ lệ 1:3, để dịch ổn định 2 tiếng ở 0 o – 4oC, sau đó ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC. Hòa tan kết tủa trong đệm pH 4,5 và xác định hoạt độ Pectinase. 2.3.5.6. Định lượng đường khử bằng DNS Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller G.L (1959) - Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitro salisilic. Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dịch đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan suy ra hàm lượng đường khử của dịch nghiên cứu. - Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: pha các mẫu đường monogalacturonan có nồng độ xác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1 ml thuốc thử DNS trong thời gian 10 phút. Kết quả được đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. Từ đó lập ra được đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD. Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonan được biểu diễn trong đồ thị dưới đây: Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan 29
Từ đồ thị trên, có thể tính được nồng độ đường khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phương trình sau: y + a x = b (mg/ml) Trongđó: x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD) 2.3.5.7. Xác định hoạt độ Pectinase Hoạt độ Pectinase được xác định với cơ chất pectin. Phản ứng enzyme được thực hiện với 180 µl dung dịch pectin 1% (w/v) và 20 µl dung dịch enzyme (được pha loãng tới nồng độ thích hợp), ở 50 oC trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Tiếp đến, li tâm hỗn dịch phản ứng ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho loại cặn nếu có). Đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme. Một đơn vị hoạt độ Pectinase là lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa pectin tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme. Hoạt độ pectinase được xác định bằng công thức: X ∗ f ∗ 1000 H = (U/ml) 600 ∗ t Trong đó: X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml) f: hệ số pha loãng 1000: hệ số quy đổi 600: khối lượng phân tử pectin t: thời gian thủy phân (10 phút) 2.3.5.8. Khảo sát đặc tính của Pectinase Nhiệt độ tối ưu của enzyme được tiến hành theo phương pháp xác định hoạt độ Pectinase ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 – 70 oC. Để khảo sát độ bền nhiệt, enzyme được ủ trong dung dịch đệm citrate photphat 30
0,1M pH 4,5 ở các nhiệt độ khác nhau (trong khoảng từ 30 - 70 oC). Sau những khoảng thời gian 1 – 7 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase còn lại. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được xác định ở nhiệt độ tối ưu của enzyme với cơ chất được pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0 đến 7,0. Để khảo sát độ bền pH, enzyme được pha loãng và ủ ở 40 oC với dung dịch đệm trên có các giá trị pH khác nhau, sau những khoảng thời gian 1 – 6 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH 4,5). Ảnh hưởng của ion đến hoạt tính enzyme được nghiên cứu bằng cách ủ dung dịch enzyme với các ion kim loại Ca2+, Fe2+, Mn2+ (nồng độ cuối 10 mM) trong đệm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5) ở 50oC trong 10 phút, sau đó xác định hoạt độ Pectinase còn lại và so sánh với mẫu không bổ sung ion kim loại (đối chứng). 2.3.5.9. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp.Các kết quả nghiên cứu là trung bình của 3 lần lặp lại. 31
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2 A.niger CF2 sau 72 giờ hoạt hóa trong môi trường Czapeck có hình thái hệ sợi và bào tử như hình 3.1. Bào tử hình tròn, màu nâu đậm, mật độ hệ sợi trung bình D=2-3cm có màu trắng đục, dạng hình tròn. Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectinase 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin Pectin đóng vai trò là cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp pectinase. Với phương pháp lên men rắn, lượng pectin sử dụng được khảo sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, hoạt độ pectinase cao nhất đạt 2,231 U/g ở hàm lượng pectin 12% (w/w) (hình 3.2). 2.5 2 1.5 1 0.5 0 enzyme (U/g) Hoạt độ enzyme 8 12 16 Hàm lượng pectin (%) Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase 32
Kết quả nghiên cứu cũng tương ứng với công bố của nhóm sinh viên thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, Trường Đại học Thủ Dầu Một [1]. Theo báo cáo nghiên cứu, hoạt độ enzyme thu được cao nhất trong môi trường rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin. Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD Có thể thấy, ống Efpendort chứa hỗn hợp dung dịch gồm enzyme thu được tại hàm lượng pectin 12% có màu đậm nhất rồi đến ống 16% và ống 8% có màu sáng nhất. 3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường Độ ẩm môi trường ban đầu có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cơ chất. Độ ẩm môi trường sẽ thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trường rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ không đủ lượng nước cho nấm sinh trưởng, ngược lại độ ẩm quá cao cũng ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng do độ thoáng khí giảm. Kết quả hình 3.4 cho thấy ở độ ẩm 60% chủng A.niger CF2 cho khả năng sinh tổng hợp pectinase cao nhất đạt 3,422 U/g. Giá trị hàm ẩm 60% cũng được xác định cho chủng A.niger CF2 khi nuôi trên môi trường rắn. 33
4 3.5 3 2.5 2 1.5 enzyme (U/g ) Hoạt độ enzyme 1 0.5 0 50% 60% 70% Độ ẩm (%) Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2 Báo cáo của Nazneen Akhter cùng cộng sự cũng cho thấy hoạt độ enzyme pectinase thu được cao nhất với giá trị hàm ẩm 60% [3] 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thể sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme mục tiêu trong một phạm vi nhất định. Mặc dù, A. niger là chủng nấm mốc hoạt động trong vùng nhiệt độ ưa ấm khoảng 20 – 40 oC nhưng qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp pectinase của các chủng A. niger rất khác nhau. Bai ZH và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger ở 30 oC cho sinh tổng hợp pectinase[2], trong khi đó Akhter N. và cộng sự lại chọn 40oC cho nuôi cấy A. niger IM-6 [3], Leda R Castilho và cộng sự nuôi cấy A. niger ở 35oC [4]. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của chủng A. niger CF2 được thực hiện trong khoảng 24 - 37 oC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5 cho thấy ở nhiệt độ 30 oC A. niger CF2 phát triển mạnh nhất và cũng sinh tổng hợp pectinase cao nhất (5,4 U/g). Do đó lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo. 34
6 5 4 3 2 enzyme (U/g) Hoạt độ enzyme 1 0 24 30 37 Nhiệt độ (oC) Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme 3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian lên men có ảnh hưởng lớn trong sản xuất enzyme. Thời gian lên men để đạt hoạt độ pectinase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp. Kết quả hình 3.6 cho thấy chủng A. niger CF2 có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao nhất 5,572 U/g sau 72 giờ. Kết quả của Mukesh kumar D J. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger từ chủng Bacillus sp. MFW7 cũng cho hoạt độ pectinase cao nhất sau 72 giờ [8]. Do vậy lựa chọn thời gian nuôi cấy 72 giờ để thu nhận enzyme A. niger CF2 [10][12] 6 5 4 3 2 1 enzyme (U/g) Hoạt độ enzyme 0 72h 120h 168h Thời gian lên men (giờ) Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger CF2 35
Từ kết quả khảo sát cho thấy 3 thông số hàm lượng pectin, hàm ẩm và nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ peptinase. Với hàm lượng pectin 12%, độ ẩm 60% và nhiệt độ 30oC hoạt độ pectinase thu được cao nhất sau 72 giờ lên men. 3 ngày 5 ngày 7 ngày Hình 3.7: Môi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày Ta có thể thấy sau 3 ngày, hệ sợi nấm phát triển và ăn lan khá dày đặc trên bề mặt cơ chất tuy nhiên so với ngày thứ 5, ngày thứ 7; hệ sợi nấm an lan rộng hơn, dày hơn, đâm sâu vào cơ chất hơn nhưng hoạt độ enzyme ở ngày thứ 3 lại cao nhất. Điều đó chứng minh qua những hình ảnh sau khi có sự chênh lệch độ đậm nhạt ở hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%): 3 ngày – màu dung dịch đậm hơn 5 ngày – màu dung dịch nhạt hơn Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày 3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme pH ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh 36
hưởng của pH đến hoạt tính pectinase của A. niger CF2 qua đó xác định được pH tối ưu của enzyme.  pH tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 Để xác định pH tối ưu, pectinase của chủng A. niger CF2 được phản ứng với cơ chấtđược pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0 đến 7,0 trong thời gian 10 phút. Mối quan hệ giữa pH và hoạt độ tương đối của enzyme thu được thể hiện ở hình 14. 6 5 4 3 enzyme Hoạt độ enzyme 2 (U/g) 1 0 pH3 PH4 pH5 pH6 pH7 Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2 Kết quả hình 3.9 cho thấy enzyme pectinase từ chủng A.niger CF2 hoạt động trung vùng pH từ 4 – 5 và hoạt độ enzyme thu được cao nhất pử pH = 5. Ở pH này, hoạt tính của pectinase là tối đa và sự thay đổi pH cao hơn hoặc thấp hơn đều làm hạ thấp đáng kể độ hoạt động của enzyme. Một số tác giả khi nghiên cứu đặc tính của pectinase từ A. niger cũng tìm được dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm trong khoảng từ 3,5 - 5,5 và pH tối ưu là 4,5 – 5,5[04, 05,06,11]. Xác định độ bền pH: 37
- Khảo sát độ bền pH hoạt tính pectinase bằng cách ủ enzyme ở 40 oC trong dung dịch đệm pH từ 3 – 7, sau những khoảng thời gian khác nhau, lấy mẫu xác định hoạt độ pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH = 4,5). Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.10. 6 5 4 pH3 3 pH4 pH5 2 pH6 pH7 1 enzyme (U/ml ) Hoạt độ enzyme 0 0h 1h 2h 3h 4h 5h Thời gian Hình 3.10:Ảnh hưởng của pH đến(giờ) độ bền củapectinase từ A. nigerCF2 Kết quả cho thấy pectinase từ chủng A.niger CF2 bền trong vùng pH 4 – 5. Sau 6 giờ ủ ở 40 oC trong đệm pH 4 - 5 hoạt độ enzyme vẫn còn giữ hơn 60% so với ban đầu [12] Ở pH 6, 7 hoạt độ enzyme không ổn định và giảm đáng kể sau 6 giờ. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme  Nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 Mỗi enzyme đều có một giá trị nhiệt độ tối ưu mà ở đó hoạt tính của nó được thể hiện mạnh nhất cũng như có vùng nhiệt độ mà ở đó hoạt tính enzyme ít bị ảnh hưởng nhất gọi là vùng bền nhiệt của enzyme. Với mục đích xác định được nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2, dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70oC. 38
6 5 4 3 2 1 enzyme (U/g) Hoạt độ enzyme 0 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC Nhiệt độ Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger CF2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của pectinase từ chủng A. niger CF2 thấy khi tăng nhiệt độ từ 30 oC – 40oC, hoạt độ enzyme tăng và đạt cực đại tại 40oC. Khi nhiệt độ lớn hơn 40oC, hoạt độ enzyme giảm rất nhanh. Như vậy, nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 là 40oC, cao hơn so với nhiệt độ tối ưu (35oC) của peptinase từ Bacillus sp. MFW7[8], bằng nhiệt độ của pectinase từ A. niger sử dụng nguồn cacbon từ vỏ cam[9].  Độ bền nhiệt: Dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70 oC ở pH 4,5 trong khoảng thời gian 5h, cứ 1h tiến hành xác định hoạt độ enzyme và biểu diễn kết quả trên hình 39
6 5 4 30oC 40oC 3 50oC 60oC 2 70oC 1 0 0h 1h 2h 3h 4h 5h Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger CF2 Kết quả khảo sát cho thấy pectinase từ cả chủng A.niger CF2 là enzyme không bền nhiệt. Khi nhiệt độ tăng hoạt độ của pectinase giảm dần và enzyme chỉ bền ở 30 - 50ºC. Khi nhiệt độ lớn hơn 50 oC hoạt độ của enzyme giảm rất nhanh và sau 5 giờ thì hoạt độ enzyme còn rất thấp. 3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme Enzyme được ủ trong đệm có bổ sung ion kim loại nồng độ 10mM. Xác định hoạt độ và biểu diễn kết quả trên hình 3.13: 40
120 100 100 80 79 85 74 60 40 20 Hoạt độ tương đối (%) 0 ĐC Ca2+ Fe2+ Mn2+ Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme Từ kết quả hình 3.13 cho thấy, các ion Ca2+, Mn2+, Fe2+ không ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ của pectinase từ A. niger CF2 nhưng lại có tác dụng ức chế hoạt độ của enzyme. Báo cáo của A. Rasheedha Banu và cộng sự cho rằng Mg2+, Ca2+ không làm ảnh hưởng nhiều đến hoạt động pectinase, làm ức chế sự hoạt động của pectinase từ chủng Penicillium chrysogenum [7]. Kết quả thu được từ các thí nghiệm xác định mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt độ của enzyme pectinase ta có thể đưa ra kết luận về điều kiện môi trường cơ bản tối ưu nhất cho hoạt động của enzyme. Enzyme peptinase hoạt động tốt nhất trong môi trường cơ chất có pH bằng 5, ở nhiệt độ là 30oC, thời gian lên men là 72 giờ và môi trường lên men có hàm lượng pectin 12% enzyme này khá là bền nhiệt vì qua thời gian 2 giờ, hoạt độ enzyme đo được vẫn ở mức cao. 41
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, báo cáo đã rút được một số kết quả sau: - Tìm được điều kiện lên men rắn thích hợp để A. niger CF2 sinh tổng hợp pectinase (5,57 U/g tại 30oC, pectin 12%, 72 giờ). - Đã xác định được đặc tính xúc tác của pectinase: bền ở pH 4-5, 30- 50ºC và pH tối ưu 5, nhiệt độ tối ưu 40oC. 4.2. Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng khác đến hiệu suất lên men tạo enzyme pectinase của A. niger CF2. - Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme pectinase - Nghiên cứu ứng dụng enzyme pectinase của chủng A.niger CF2 vào quá trình sản xuất nước quả, rượu vang và bóc vỏ cam, quýt, để có thể phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Anh Dũng, Mai Thị Ngọc Lan Thanh, Trần Thị Ngọc Như –Nghiên cứu thu nhận pectinase từ A.niger nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nang cao hiệu quả bóc vỏ tiêu - Trường ĐH Thủ Dầu Một. 2. Akhter N., Morshed M.A., Uddin A., Begum F., Sultan T., Azad K.A. (2011). Producrion of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media. International Journal of Biosciences 1(1), pp. 33 - 42. 3. A. Rasheedha Banu, M. Kalpana Devi, G. R. Gnanaprabhal, B. V. Pradeep and M. Palaniswamy - Production and characterization of pectinase enzyme from Penicillium chrysogenum - Department of Microbiology, Karpagam University, Coimbatore - 641 021, Tamil Nadu, India m.palaniswamy@gmail.com 4. Bai ZH, Zhang HX, Qi HY, Peng XW, Li BJ-Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance- Department of Environmental Bio-Technology, The Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, P.O. Box 2871, Beijing 100085. 5. Hannan A., Bajwa R., Latif Z. (2009). Status of Aspergillus niger strains for pectinases production potential. Pakistan Journal of Phytopathology 21(1), pp. 77 - 82. 6. Ishtiaq Ahmeda, , , Muhammad Anjum Ziaa, Muhammad Azhar Hussaina, Zain Akramb, Muhammad Tahir Naveedc, Azin Nowrouzid – Bioprocessing of citrus waste peel for induced pectinase production by Aspergillus niger; its purification and characterization. 7. Leda R Castilhoa, , Ricardo A Medronhob, Tito L.M Alvesa - Production and extraction of pectinases obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger.
8. Maciel M.H.C., Herculano P.N., Porto T.S., Teixeira M.F.S., Moreira K.A., Souza-Motta C.M. (2011). Production and partial characterization of pectinases from palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of Biotechnology 10(13), pp. 2469 - 2475. 9. Maldonado M.C., Saad A.M.S. (1998). Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state systems. Journal of Industrial Micro biology & Biotechnology, pp. 34- 38. 10. Martos M.A., Vazquez F.M., Benassi F.O., Hours R.A. (2009). Production of pectinase by A. niger: Influence of fermentation conditions. Brazilian Archives of Biology and Technology 52(3), pp. 567 - 572. 11. Mukesh kumar D J1,*, Saranya G M2 , Suresh K2 , Andal Priyadharshini D2 , Rajakumar R2 and Kalaichelvan PT1 1 - Production and Optimization of Pectinase from Bacillus sp. MFW7 using Cassava Waste- Centre for Advanced Studies in Botany, University of Madras, Guindy Campus, Chennai, TN, India 2A.V.V.M. Sri Pushpam College (Autonomous), Poondi, Thanjavur District, TN, India 12. Nazneen Akhter1, M. Alam Morshed1,3*, Azim Uddin3 , Feroza Begum2 , Tipu Sultan1 , Abul Kalam Azad1 1- Production of Pectinase by Aspergillus niger Cultured in Solid State Media- Department of Biotechnology and Genetic Engineering, Faculty of Applied Science and Technology. 13. Obechukwu C. Ezike. Sabinus Oscar O. Eze. Chukwunonso A. Nsude. Ferdinand C. Chilaka -Production of Pectinases from Aspergillus niger using submerged fermentation with orange peels as
carbon source- Department of Biochemistry, University of Nigeria Nsukka) 14. Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S. (2005). Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels. Brazilian Journal of Microbiology 36, pp. 63 - 69. 15. S. Mrudula and R. Anitharaj -Pectianse Production in Solid State Fermentation by Aspergillus niger Using Orange Peel as Substrate.