Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

101 trang thiennha21 12/04/2022 7030

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia Marcescens SH1", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

thiet_lap_moi_truong_dinh_duong_va_dieu_kien_nuoi_cay_san_xu.pdf

Nội dung text: Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia Marcescens SH1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS SH1 Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Ts. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Tâm MSSV: 1051110142 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Các kết quả, số liệu trong đồ án là hoàn toàn trung thực, chưa từng có ai công bố. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tâm
Đồ án tốt nghiệp Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em bao năm qua, trang bị cho em những kiến thức quý giá và tạo dựng cho em nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương, Cô đã luôn bên cạnh giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện và cung cấp hóa chất để em có thể thực hiện được các thí nghiệm. Và cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn ở bên em động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua. Kiến thức còn nhiều hạn chế, chắc chắn sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất mong được sự thông cảm và góp ý chân thành của thầy cô và các bạn. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tâm
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích của để tài 3 1.3. Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài 3 1.4. Nội dung của đề tài 3 1.5. Phƣơng pháp xử lí số liệu 3 1.6. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học 5 2.1.1. Khái niệm và phân loại 5 2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu 6 2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu 7 2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn và tuyến trùng EPN 9 2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn 10 2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố diệt côn trùng 11 2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 12 2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens 12 2.3.2. Phân loại Serratia marcescens 13 2.3.3. Đặc điểm sinh lí 13 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa 14 2.3.5. Đặc điểm phân bố 17 2.3.6. Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 19 2.4. Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens 20 2.4.1. Sắc tố 20 2.4.2. Enzyme 21 2.4.3. Biosurfactants 22 2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens 23 2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối 25 2.6.1. Quá trình lên men 25 2.6.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và điều kiện lên men 27 i
Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng 29 2.6.2.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men 30 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32 3.2. Vật liệu – môi trƣờng – thiết bị sử dụng nghiên cứu 32 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu 32 3.2.2. Môi trƣờng 32 3.2.3. Hóa chất 32 3.2.4. Dụng cụ 33 3.2.5. Thiết bị 33 3.3. Phƣơng pháp luận 34 3.4. Bố trí thí nghiệm 34 3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 38 3.5.1. Phƣơng pháp quan sát hình thái sinh lý 38 3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E 39 3.5.3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme 42 3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 42 3.6.1. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng cơ bản Nutrient broth 43 3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen SH1 44 3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia marcescens SH1 45 3.7. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 46 3.7.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescensSH1 47 3.7.2. Khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 47 3.7.3. Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 47 ii
Đồ án tốt nghiệp 3.7.4. Khảo sát ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S. marcescens SH1 48 3.7.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng mớivà điều kiện nuôi cấy mới 49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN 4.1. Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm hóa sinh 50 4.1.1. Quan sát hình thái, sinh lý 50 4.1.2. Kết quả hóa sinh với bộ Kit API 20E 51 4.1.3. Kết quả thử nghiệm enzyme 53 4.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng nuôi cấy S. marcescens SH1 56 4.2.1. Đƣờng cong tăng trƣởng trên môi trƣờng Nutrient broth 56 4.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn Nito lên sự phát triển của S. marcescens SH1 57 4.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens SH1 58 4.3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 59 4.3.1. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 59 4.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện Oxy sự phát triển của S. marcescens SH1 61 4.3.3. Ảnh hƣởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 62 4.3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S. marcescens SH1 63 4.3.5. Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng mới và điều kiện nuôi cấy mới 65 CHƢƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết quả 69 5.2. Kiến nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens 15 Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia 16 Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau 18 Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập đƣợc từ các môi trƣờng khác nhau 18 Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh S. marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E 40 Bảng 3.2. Hàm lƣợng % nitơ tổng của các nguồn nitơ 44 Bảng 3.3. Thành phần môi trƣờng và các nguồn nitơ khảo sát 44 Bảng 3.4. Thành phần môi trƣờng và các nguồn cacbon khảo sát 45 Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát 48 Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng S. marcescens SH1 52 Bảng 4.2. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ 57 Bảng 4.3. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn Cacbon 59 Bảng 4.4. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH. 60 Bảng 4.5. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc 61 Bảng 4.6. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống 63 Bảng 4.7. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trƣờng nuôi cấy 64 Bảng 4.8. Các thông số động học nuôi cấy S. marcescens SH1 trên 2 môi trƣờng 66 Bảng 4.9. Tính toán giá thành của 2 môi trƣờng 67 Bảng 4.10. Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trƣờng 67 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi .13 Hình 2.2. Khuẩn lạc của S.marcescens trên môi trƣờng XLD 17 Hình 2.3. Khuẩn lạc của S. marcescens trên NA 17 Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối 24 Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S. marcescens SH1 35 Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần cho môi trƣờng tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1 36 Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy 37 Hình 4.1. Khuẩn lạc của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng NA 50 Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram 51 Hình 4.3. Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E 52 Hình 4.4. Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20 54 Hình 4.5. Thử nghiệm hoạt tính protease 54 Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin 55 Hình 4.7. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcesces SH1 trên môi trƣờng NB 56 Hình 4.8. Ảnh hƣởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1 57 Hình 4.9. Ảnh hƣởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S. marcescens SH1 58 Hình 4.10. Ảnh hƣởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 60 Hình 4.11. Ảnh hƣởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 61 Hình 4.12. Ảnh hƣởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 62 Hình 4.13. Ảnh hƣởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của S. marcescens SH1 64 v
Đồ án tốt nghiệp Hình 4.14. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 môi trƣờng NB và môi trƣờng mới 65 vi
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày. Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các nhóm vi sinh vật. Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của vi sinh vật thì việc ứng dụng nó trong sản xuất và đời sống ngày càng rộng rãi và có hiệu quả hơn. Ví dụ như việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh. Sử dụng vi sinh vật trong việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại môi trường, làm cân bằng sinh thái. Trong tự nhiên, ngoài những vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật gây hại, ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho con người, động vật và thực vật, các loài gây ô nhiễm nước, thực phẩm. Nhưng nếu ta nắm vững được các mặt lợi hay hại của nó, ta sẽ đưa ra được các biện pháp khoa học để phát huy những mặt lợi và hạn chế những mặt hại do chúng gây ra. Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học như khả năng diệt sâu, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất thứ cấp do nó sinh ra Ngày nay để tăng năng suất và sản lượng trong trồng trọt thì người dân thường sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng này chỉ đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên cạnh đó, những sản phẩm này làm cho đất đai ngày càng bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều loài thiên địch có lợi cho cây trồng, mất cân bằng sinh thái trong đất và một số vi sinh vật trong đất có thể bị tiêu diệt. Các thuốc trừ sâu hóa học này tồn dư rất lâu, chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư và tích đọng lại, ngấm sâu vào trong lòng đất và nước sẽ gây hại không những cho động vật, cây trồng mà cả con người sống sống gần đó. Nếu con người hoăc các loài động vật ăn những loại 1
Đồ án tốt nghiệp cây trồng còn tồn đọng một lượng không nhỏ thuốc trừ sâu hóa học thì lâu dần sẽ ảnh hưởng rất tai hại đến sức khỏe của chính họ. Các ngành hoá học và công nghiệp hoá chất không ngừng phát triển và ngày càng sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại cây trồng. Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn. Sau đó, liều lượng do con người pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng. Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác. Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh học. Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng ) trong môi trường đất nói riêng và trong môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác. Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài. Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển vọng to lớn đối với nền nông nghiệp. Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin). Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; 2
Đồ án tốt nghiệp Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997). Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng như các sản phẩm trao đổi chất của Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn Serratia marcescens SH1”. 1.2. Mục đích của đề tài Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để thu sinh khối cực đại. 1.3. Nội dung của đề tài - Định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme của chủng SH1. - Khảo sát các nguồn cacbon và nitơ phù hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1 - Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1. 1.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu - Sử dụng phần mềm excel để tính toán và biểu diễn đồ thị - Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu 1.5. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài - Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1. - Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1. 1.6. Kết cấu đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm có 5 chương: . Chương 1: Mở đầu . Chương 2: Tổng quan . Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3
Đồ án tốt nghiệp . Chương 4: Kết quả và thảo luận . Chương 5: Kết luận và đề nghị 4
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học 2.1.1. Khái niệm và phân loại Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra, các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là: - Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus. - Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật. Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học. Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè Muốn 5
Đồ án tốt nghiệp có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật sinh học. 2.1.2. Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh. Sau khi vào đất, tuyến trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng. Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở và hậu môn côn trùng. Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào hệ tuần hoàn. Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho côn trùng trong 1-2 ngày. Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang, còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh. Vì thế, tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu hơn. Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng. Bao gồm 2 giống là Steinernema và Heterorhabditis. Bình thường thì EPN sống tự do trong đất và mang theo vi khuẩn cộng sinh. Khi tìm được vật chủ (sâu hại), tuyến trùng sẽ thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ và giải phóng vi khuẩn. Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24 - 48 giờ. Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng. Hiện đã có 17 loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema và 7 loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc bộ Rhabditida có khả năng này. Sau khi xâm nhập, chúng có khả năng gây bệnh và làm chết vật chủ trong 48 giờ. Các EPN có khả năng ký sinh trên 200 loài côn trùng thí nghiệm (có một phần đời sống trong đất) . 6
Đồ án tốt nghiệp 2.1.3. Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu Côn trùng chết trong tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, trong đó hầu hết là chết do vi sinh vật mà vi khuẩn là loài vi sinh vật chiếm đa số. Do đó, trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có tác dụng không nhỏ trong việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu hại. Trong đó một số quần thể vi khuẩn đã được sản xuất thành chế phẩm dùng để phòng trừ sâu hại rừng. Người ta đã phát hiện hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với côn trùng, trong đó có 90 loài gây bệnh cho côn trùng. Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn gây bệnh không phải đều có thể tạo thành chế phẩm trừ sâu và cần có một số tính chất cơ bản về độ độc, tính ổn định, khả năng lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, có thể sản xuất hàng loạt, kinh tế và an toàn. Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại - Clostridium brevifaciens - Clostridium malacosomae - Bacillus cereus - Bacillus thuringienis - Bacillus papillae. Một số loài vi khuẩn không sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại - Serratia marcescens Giới thiệu về chế phẩm thuốc trừ sâu sản xuất từ vi khuẩn Bacillus thuringienis (Bt) Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 và trừ côn trùng năm 1915. Đến 1971, đã có hơn 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác nhau gây hại cho 400 loài côn trùng. Sản phẩm Bt diệt côn trùng có trên thị trường từ đầu những năm 60 của thế kỷ 20. Bt là nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương, bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi. Vi khuẩn di chuyển nhờ roi dài 6 - 8µ. Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ. 7
Đồ án tốt nghiệp Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que. Hầu hết các chủng Bt trong thời gian hình thành bào tử, đều sản sinh ra tinh thể độc delta-endotoxin ( tiền độc tố) và độc tố này được hoạt hoá trong ruột giữa do các men phân giải protein. Ngoài ra, delta-endotoxin còn gây rối màng biểu mô ruột giữa, làm mất cân bằng tính thấm của tế bào, côn trùng bị liệt và chết. Delta-endotoxin còn tương tác với các liposome của màng tế bào biểu mô, làm tăng sự rối loạn màng biểu mô ruột giữa. Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non cánh phấn Lepidoptera và một số loài của Diptera và Coleoptera. Các thuốc thương phẩm của Bacillus thuringiensis đều chứa bào tử và delta-endotoxin có hiệu lực trừ nhiều loài dịch hại trong nông và lâm nghiệp. Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, các protein kết tinh và tạo bào tử ra trong quá trình bào tử nảy mầm. Khi vào bụng côn trùng, vi khuẩn thể hiện hoạt tính trừ sâu với sâu non và trưởng thành bộ cánh vảy Lepidoptera và một số loài thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Trong cơ thể côn trùng, tinh thể protein bị hoà tan và men protease trong ruột côn trùng biến tinh thể độc(tiền độc tố) thành 4 chất độc nhỏ hơn. Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào ruột giữa côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo các amino axit. Quá trình này phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali. Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào. Tính thấm nước tăng, tế bào bị phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa. Tính chọn lọc đặc trưng của các chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các chất nhận. Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt. Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông hơi và nội hấp. Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng ăn và tử vong. 8
Đồ án tốt nghiệp 2.2. Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được gọi là “roundworms”. EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con người, cây trồng và vật nuôi. EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được gọi là “nội ký sinh”. Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng, ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa. Tiêu biểu là hai họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966). Cả 2 họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết cho ký chủ. Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis tương ứng thuộc chi Xenorhabdus và Photorhabdus (Boemare và cộng sự, 1997). Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ. Vi khuẩn sẽ phân hủy ký chủ tạo ra thức ăn cho tuyến trùng và sản xuất các kháng sinh chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật khác. Các kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh sản xuất như xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens và antraquinons (Li và cộng sự, 1998; Fodor và cộng sự, 2010). Mặc dù mối quan hệ rất cụ thể và phụ thuộc lẫn nhau giữa tuyến trùng EPN và vi khuẩn cộng sinh của nó nhưng một số vi khuẩn phụ thuộc đã được báo cáo có liên quan đến tuyến trùng và ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN. Poinar (1966) đã phân lập được Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây nhiễm bởi S.(Neoplectana) carpocapsae và cũng tìm thấy trong đó Alcaligenes 9
Đồ án tốt nghiệp sp., Aerobacter sp., Proteus sp. và Pseudomonas aeruginosa. Thêm Alcaligenes dorans, Pseudomonas fluorescens, P. maltophilia, P. alcaligenes và Acinetobacter sp. cũng được phân lập từ loài tuyến trùng này (Lysenko và Weiser, 1974). Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P. fluorescens Biovar B và Xanthomonas maltophilia đã được tìm thấy liên quan đến S. scapterisci (Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993). Ngoài ra, với chi Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O. Intermedium (Babic và cộng sự, 2000). Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S. liquefaciens, cũng được phát hiện liên quan đến Steinernema spp. và Heterorhabditis spp. (Boemare và cộng sự, 1997). Ngoài S. proteomaculans thì S. marcescens cũng được tìm thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được vận chuyển hoặc mức độ liên kết giữa tuyến trùng và vi khuẩn. Trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae. 2.2.1. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau: - Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 - 48 giờ. Như vậy, thời gian chết của côn trùng vật chủ khác nhau còn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn 10
Đồ án tốt nghiệp thuộc và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn 48 giờ. - Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trông xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng. Nhờ đó mà IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành. Từ thế hệ 2, tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hóa xác chết con trùng. Nhờ các enzyme do vi khuẩn tiết ra mà các mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng. Từ đó thế hệ thứ 2 của tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối các thế hệ tiếp theo. Thông thường trong cơ thể công trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng. - Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng. Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng. 2.2.2. Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm. Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp. và Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố. Nội độc tố do X. poinarii sinh ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với huyết cầu (haemocytes) của côn trùng. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố khác nữa. Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X. enorhabdus nhân nhanh số lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh trong P. Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X. Nematiphilus bằng cách tiêm các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng. 11
Đồ án tốt nghiệp Các vi khuẩn này sản sinh các enzyme ra ngoài tế bào, các chất này chủ yếu là protease, lipase, chitinase. 2.3. Giới thiệu về Serratia marcescens 2.3.1. Lịch sử phát hiện Serratia marcescens Serratia marcescens bắt nguồn từ sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về “máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì. Sau đó, năm 332 trước công nguyên, những người lính của quân đội Macedonian của Alexander thấy rằng bánh mì của họ đôi khi xuất hiện máu trên đó. Năm 1800, Christian Gottfried Ehrenberg (1795–1876) phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm. Nhà sử học và vi sinh vật học ERL Gaughran (1969) đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó sự việc như vậy ghi nhận lần đầu vào năm 1169 tại Đan Mạch. Trong bong tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh được sử dụng trong thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia. Tuy nhiên điều này lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011). Bartholomeo Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya) là người đầu tiên phát hiện và đặt tên là Serratia marcescens cho nguyên nhân của sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu. Ban đầu Bizio mô tả S. marcescens như là một loại nấm do ông nhìn thấy những đốm đỏ dưới kính hiển vi. Sau đó vào những năm 1850, các nhà khoa học đã phân loại lại S. marcescens là vi khuẩn. Từ những năm 1906, các bác sĩ dùng Serratia marcescens như là một điểm đánh dấu sinh học để nghiên cứu về sự di truyền của vi sinh vật vì cho đến những năm 1950 thì S. marcescens vẫn được xem là một mầm vô hại và cũng vì màu hồng đặc trưng của S. marcescens. Đến năm 1960 thì Serratia marcescens được công nhận là tác nhân gây bệnh cơ hội ở người bởi giáo sư Scheurlen của trường đại học Strasbourg. 12
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phân loại Serratia marcescens Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau: - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gamma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Chi: Serratia - Loài: Serratia marcescens 2.3.3. Đặc điểm sinh lí Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, có đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm (David R.C., 2012). Hình 2.1. Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011) Serratia marcescens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5 - 400C và trong ngưỡng pH từ 5 - 9 . Serratia marcescens có thể dễ dàng tìm thấy trong nước, đất, trên thực vật, trong côn trùng, trong cơ thể người và động vật. Được tìm thấy nhiều trong thực 13
Đồ án tốt nghiệp phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của S. marcescens. S. marcescens có thể dễ dàng di động bằng tiên mao và tiêm mao. Chúng có thể bám dính với nhau trên môi thạch thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 - 0,8%). Các cụm tế bào có chiều dài từ 5 – 30µm . S. marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học. S. marcescens có thể phát triển trong sự hiện của oxy hoặc trong trường hợp không có oxy. Chủ yếu sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng, có các enzyme (superoxide dismutase, calatase và peroxides) bảo vệ nó khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa. 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNase, lipase, chitinase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004). Bên cạnh đó, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Thủy phân casein là một đặc điểm chung của S. marcescens. Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo. S. marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein. Ngoài ra, S. marcescens còn có enzyme gelatinase ngoại bào phân hủy gelatine. Các sắc tố màu đỏ được sản xuất bởi S. marcescens được biết đến như là một yếu tố đặc biệt mà điển hình là prodigiosin, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Prodigiosin có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy có thể S. marcescens sống trong cơ thể người sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). 14
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và John, 2010) STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả 1 Di động + 2 Indole - 3 Methyl red - 4 Voges Proskauer + 5 Citrate + 6 Dnase + 7 Catalase + 8 Oxidase - 9 Urease - 10 Gelatinase + 11 Chitinase + 12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang acid, không sinh khí và không sinh H2S 13 Hydrogen sulphide peoduction - 14 Lyine decarboxylase + 15 Ornithine decarboxylase + 16 Lên men glucose + 17 Lên men sucrose + 18 Lên men fructose + 19 Lên men xylose - 20 Lên men rhaminose - 21 Lên men lactose - 22 Lên men arabinose - 15
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia (F. Grimont and P.A.D. Grimont, 2006) S. marcescens s. liquefaciens S. grimesii S. proteamaculans S. quinivorans S. ficaria S. S. rubidaea S. odorifera S. plymuthica S. entomophila S. glossinae S. nematodiphila S. ureilytica fonticola Đặc điểm Dnase + + + + + + - + + + + ND + ND Gelatinase + + + + + + - + + + + - + ND Lipase (Tween 80 + + + + + + + + - + + ND + + hydrolysis) Lipase (corn oil + + + + + + + + + + + ND ND ND hydrolysis) Sản xuất prodigiosin V - - - - - - V - V + - + - Indole - - - - - - - - V - - - - - Urease - - - - - - - - - - - + - + Arginine dihydrolase - - + - - - - - - - - - + + Lysine decarboxylase + + + + + - + V + - - + + + Ornithine + + + + + - + - V - - + + + decarboxylase L-arabinose - + + + + + + + + + - + + - D-Dulcitol - - - - - - + - - - - ND ND ND Lactose - V V V V V + + + + - ND + - D-Sobitol + + + V V + + - + V - + + + Sucrose + + + + + + V + V + + - + + Trong đó: ND: không xác định; V: phản ứng thay đổi 16
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Khuẩn lạc của S. Hình 2.3. Khuẩn lạc của S. marcescens trên XLD (Bizio, 1823) marcescens trên NA (Benzutze) 2.3.5. Đặc điểm phân bố Serratia marcescens khá phổ biến. Nó thường được tìm thấy trong đất, trong nước, thực vật, trong côn trùng cũng như trong ống tiêu hóa của người và động vật - Trong nước và đất: Trong 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông thì Serratia marcescens chiếm 75%, S. marcescens xuất hiện nhiều nhất ở các vùng nước bị ô nhiễm. Bên cạnh đó, S. marcescens có thể đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan vàng và đồng (Pares, 1964). - Trong côn trùng: Sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế (Grimont và cộng sự, 1979). Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006). Bên cạnh đó, cũng có thể tìm thấy Serratia marcescens trong ống tiêu hóa của người và động vật có xương sống, cũng như trong thực vật. 17
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Tỉ lệ các loài Serratia phân lập được từ các môi trường khác nhau (F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006) Động vật Khu vực ở Thực Bệnh nhân có vú của động Nước vật nhập viện vật S. marcescens 10 2 75 10 97 S. plymuthica 4 2 1 5 0 S. liquefaciens 43 55 11 38 2 S. proteamaculans 39 29 8 32 0 S. grimesii 3 10 5 7 0,5 S. rubidaea 0 0 0 1 0,2 S. odorifera 0 0 0 4 0,1 S. ficaria 0 2 0 4 0 Tổng số phần trăm (%) 100 100 100 100 100 Bảng 2.4. Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập được từ các môi trường khác nhau (F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006) Thực vật và động Bệnh nhân nhập Chủng Nước vật gặm nhấm viện A1 12 19 0.1 A2/6 23 5 7 A3 21 38 7 A4 34 38 26 A5/8 7 0 47 TCT 3 0 13 Tổng số phần trăm 100 100 100 18
Đồ án tốt nghiệp 2.3.6. Tình hình nghiên cứu về Serratia marcescens Năm 1997, Hejazi, A., và Falkiner đã nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của Serratia marcescens. Một số enzyme này đã được chứng minh là có khả năng làm suy giảm chitin, vách tế bào chủ yếu của các loại nấm. Năm 2005, R Krausse và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy rằng Serratia marcescens NCTC 10211 có thể làm việc như là một probiotic trong ức chế sự tăng trưởng của H.pylori, tác nhân gây viêm loét dạ dày . Năm 2006, Brigida và Itamar đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của S. marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh. Năm 2007, Jaiganesh và cộng sự đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm gây bệnh trên cây lúa Pyricularia oryzae bằng cách sử dụng Serratia marcescens. 2.4. Một số hợp chất thứ cấp đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens 2.4.1. Sắc tố (prodigiosin) Sắc tố Prodigiosin là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp, được hình thành bởi các enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole và 4-methoxy-2, 2’-methyl-3-amyl-6- methoxyprdigiosene (Williams và Qadri, 1980). Prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự, 1998), được biết đến như là một yếu tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó khả năng ức chế miễn dịch có trong uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCI) (Krishna, 2008). Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8. Hoặc TCT (Grimont, 1997). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 19
Đồ án tốt nghiệp thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont,1997;Wiliams và Qadri, 1980). Prodigiosin được biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thê người, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997). Bên cạnh đó, một sắc tố màu vàng là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde axit, được sản xuất nhờ sự phân cắt 3, 4 - dihydroxy axit (3,4-DHP) do enzyme 3, 4-DHP 2, 3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988). Enzyme này được kích thích bởi tyrosine trong tất cả các chủng S. marcescens. Tuy nhiên, hiện nay chỉ S. marcescens chủng dạng sinh học A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm có thể sản xuất sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006). Hoạt tính sinh học của prodogiosin: Hoạt tính kháng khuẩn Prdigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bảo và khả năng ức chế các enzyme như DNA gryase, topoisomerase IV dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009). Nhiều nghiên cứu đã thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng được nhiều vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012). Hoạt tính chống tế bào ung thư Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự, 2009; Perez- Tomas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư. 20
Đồ án tốt nghiệp Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted. Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế. Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng tế bào này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Hoạt động ức chế miễn dịch Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi Nakamura và cộng sự. Họ cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy Serratia và quan sát sự ức chế chọn lọc sự phát triển của các tế bào T đa giá so với các tế bào B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin và tổng hợp tương tự PNU156804.cPrG.HCl, MAMPDM và prodigiosin thấy sự ức chế tăng sinh tế bào T đa giá so với các tế bào B in vitro trong tế bào lá lách chuột. Prodigiosin ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho kích thích với concanacalin A, chống CD3 và chống CD28, hoặc phorbol myrisate và ionomycin. Những kết quả này cho thấy prodigiosin ức chế cả thụ thể tế bào T phụ thuộc và tăng sinh độc lập với các tế bào (Pandey và cộng sự, 2007) 2.4.2. Enzyme Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase, lipase, DNase, gelatinase. phytase Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có chứa chitin trong quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh 21
Đồ án tốt nghiệp học đối với sâu và nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước (Joshi và cộng sự, 1989). Enzyme chitinase Chitinases có tiềm năng to lớn cho công nghệ sinh học ứng dụng và có thể được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học chống lại nấm bệnh cũng sâu bệnh trong nông nghiệp (Jones và cộng sự, 1986; Kobayashi và cộng sự, 2002; Pan và cộng sự, 2006). Một số chi của vi khuẩn bao gồm Serratia (Suzuki và cộng sự, 2002, Enterobacter ( Chernin và cộng sự, 1995) có thể sản xuất enzymes chitinolytic ở mức cao. Serratia marcescens là một trong những yếu tố làm suy giảm chitin. Nhiều chitinases đã báo cáo là được sản xuất từ S. marcescens, chẳng hạn như chiA, ChiB, và ChiC (Watanabe và cộng sự, 1997), và một loại protein chitin ( CBP21 ), CBP21 tìm thấy là cần thiết cho việc phân giải chitin (Vaaje - Kolstad và cộng sự, 2005 ). Chitinases từ vi khuẩn đã được sử dụng trong việc kháng nấm bệnh như Rhizoctonia solaniand Aspergillus parasiticus (Chernin và cộng sự, 1995). Enzyme phytase Phytase là một enzym ngoại bào có thể xúc tác cho quá trình thủy phân acid phytic và monophosphate vô cơ làm giảm phhosphate myoinositol. Serratia marcescens là một vi sinh vật có thể tiết phytase được phân lập từ đất cây họ đậu và có thể sản xuất phytase. Phytases có thể phân hủy phytate, đó là dạng tồn tại của phosphate trong các nhà máy. Ứng dụng phytase có thể giảm phốt pho thải lên đến 50%, một ứng dụng mà sẽ góp phần đáng kể đối với bảo vệ môi trường. Một loạt các phytases được phát hiện và đặc trưng trong 10 năm qua. Phytase cũng đã được phát hiện trong nhiều vi khuẩn như Aerobacter aerogens, Pseudomonas sp., E.coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescnes. 2.4.3. Biosurfactants Biosurfactants là một nhóm cấu trúc đa dạng của amphipathic hoạt động bề mặt các phân tử với cả hai vùng ưa nước và kỵ nước. Hầu hết các bề mặt của vi sinh 22
Đồ án tốt nghiệp vật là các phân tử phức tạp, bao gồm các cấu trúc khác nhau như: lipopeptides, glycolipid, khu phức hợp polysaccharide-protein, axit béo và phospholipid . Trong vài thập kỷ qua, biosurfactants đã được sự chú ý bởi vì chúng thể hiện một số lợi thế qua tổng hợp hóa học bề mặt. Lợi thế như vậy bao gồm phân hủy sinh học, độc tính thấp, cân bằng sinh thái và khả năng được sản xuất từ chất tái tạo rẻ hơn (Mohan và cộng sự, 2006) và hiệu quả tại các giá trị nhiệt độ và pH cực đoan (Cameotra và Makkar, 1998). Phạm vi ứng dụng công nghiệp của biosurfactants bao gồm tăng cường thu hồi dầu, khoan dầu thô, dầu phế thải, xử lý sinh học của các chất ô nhiễm, chăm sóc sức khỏe và chế biến thực phẩm (Hickey và cộng sự, 2007; Ghojavand và cộng sự, 2008). Hầu như các chủng S. marcescens, từ các chủng sinh sắc tố và các chủng không sinh sắc tố đều có thể sản xuất biosurfactants. Biosurfactants được S. marcescens sản xuất với số lượng lớn ở nhiệt độ 300C, nhưng không sản xuất được ở 370C trong pha cân bằng của quá trình tăng trưởng. Ba aminolipids, từ W1 đến W3 có các hoạt động làm ướt và đã được phân cách bởi sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 được xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide trước đó phát hiện bởi Wasserma và các cộng sự (1961). 2.5. Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens S. marcescens đã được khảo sát cho sự tăng trưởng và khả năng gây bệnh của nó trong các ấu trùng sâu bướm sáp (Galleria mellonella). Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G. mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ. Chủng đã được chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin. Gen mã hóa protein metalloprotease được xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn trùng (Tambong., J.T, và cộng sự, 2014) S. marcescens được biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào như chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease Mặc dù S. marcescens có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm, serralysin. Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò 23
Đồ án tốt nghiệp quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này. Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh. Theo đó, protease vi khuẩn như serralysin đóng một vai trò quan trọng như một yếu tố độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007) Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trưởng thành của loài heliothines-thuộc chi bướm đêm gây hại cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009) Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thường bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó. Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đường máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong. Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm là rất ít. Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ của S. marcescens. Đến giai đoạn sâu trưởng thành, nó có thể được lấy nhiễm bằng cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn trùng và gây chết. Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H. Zea và H virescens . Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ như: O. Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó. Ngoài ra cũng có thể tạo được mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong một khoảng thời gian. Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S. marcescens mang đến hiệu quả diệt 100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ. Mặc dù vậy sự tồn tại của S. marcescens cũng không ảnh hưởng đến vi khuẩn cộng sinh X. Nematophila. 24
Đồ án tốt nghiệp 2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men thu sinh khối 2.6.1. Quá trình lên men thu sinh khối Chuẩn bị môi trường Khử trùng môi trường Giống vi Nhân giống Lên men sinh vật cấp 1,2,3 Thu hồi sản phẩm Hình 2.4. Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối Thuyết minh quy trình: Chuẩn bị môi trường: Nuôi cấy vi sinh vật ở bất cứ quy mô nào (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp 1, 2, 3 hay trong nồi lên men) đều phải đảm bảo đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối cũng như tạo sản phẩm. Tính chất và thành phần của môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào nhu cầu của vi sinh vật cũng như thích hợp cho việc thu hồi sản phẩm sau lên men. Nhân giống Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống và thường xuyên kiển tra chất lượng của giống là điều hết sức cần thiết và không thể thiếu. Muốn làm tốt khâu này cần phải tiến hành các việc sau: - Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men - Kiểm tra khả năng biến đổi của giống - Hoạt hóa giống sau một thời gian sử dụng Để hoạt hóa giống người ta thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng như cao nấm men, hỗn hợp vitamin, acid béo. 25
Đồ án tốt nghiệp - Giữ giống bằng phương pháp thích hợp để có thể duy trì những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính. Mục đích của việc nhân giống là để tăng sồ lượng tế bào vi sinh vật. Trong quy trình lên men, thì tùy chủng giống vi sinh vật khác nhau mà cần nhân theo cơ chất và môi trường nhân khác nhau. Trong công nghiệp, người ta thường nhân với lượng lớn sinh khối vi sinh vật như sau: - Giai đoạn trong phòng thí nghiệm (nhân giốn cấp I) Đây là giai đoạn cấy giống vi sinh vật thuần khiết từ ống giống, đem nhân ở môi trường sinh dưỡng chuyên tính vô trùng, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước tiếp theo. - Giai đoạn ở xưởng (nhân giống sản xuất) Đây là giai đoạn cần nhân một lượng giống lớn để đáp ứng cho khâu giống trong sản xuất. Từ giống cấp 1,2,3 nhân trong nồi lên men hay trong cơ chất đặc (chất mang) Khử trùng môi trường Môi trường trước khi đưa vào cấy giống phải được khử trùng để diệt hết các vi sinh vật cũng như các mầm sống nhằm đảm bảo trong khi nuôi cấy vi sinh vật sẽ không bị tạp nhiễm các chủng loài khác. Quá trình thanh trùng sẽ diễn ra trong các nồi áp suất cao. Môi trường trong các bình nhỏ như bình tam giác hay bình thủy tinh được thanh trung trong nồi áp suất riêng, còn môi trường lớn sẽ thanh trùng trong nồi lên men Lên men Phương pháp lên men phụ thuộc vào các đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi cấy đối với oxy, người ta coi quá trình đó là hiếu khí, kị khí hay kị khí không bắt buộc. Để phù hợp với các đặc điểm sinh lý đó sẽ có các phương pháp lên men phù hợp. 26
Đồ án tốt nghiệp - Phương pháp lên men bề mặt: Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (hay là phát triển trên môi trường dịch thể trong bình nuôi). Phương pháp này thì oxy sẽ được cung cấp trực tiếp từ không khí. - Phương pháp lên men chìm Trong phương pháp nuôi cấy này, các vi sinh vật phát triển trong môi trường dịch thể, đối với các vi sinh vật kị khí thì người ta không cấp khí, còn đối với các vi sinh vật hiếu khí người ta cấp oxy cho vi sinh vật phát triển. Tùy theo nhu cầu oxy của từng loại vi sinh vật mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường, ví dụ như tăng cường lượng khí cấp, sử dụng cánh khuấy với các tốc độ khác nhau Trong quá trình lên men ta sẽ điều chỉnh nhiệt độ, pH và điều kiện oxy phù hợp với sự phát triển của chủng vi sinh vật Thu hồi sản phẩm Ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để thu hồi sinh khối vi sinh vật như ly tâm, tự lắng kết, lắng kết điện trường. Tùy theo mục đích sử dụng mà sinh khối vi sinh vật được bảo quản cũng như tạo các chế phẩm khác nhau 2.6.2. Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện lên men Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 giai đoạn: pha tiềm phát (pha lag), pha tăng tốc (pha log), pha cân bằng và pha suy vong. - Pha Lag (tiềm phát): Pha này được tính từ khi bắt đầu cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh. Trong thời gian này vi khuẩn dần dần làm quen với môi trường và thích nghi với môi trường. Ở giai đoạn này vi khuẩn mới bắt đầu sinh sản với tốc độ chậm. Thời gian của pha này phụ thuộc vào sự thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường. - Pha Log (tăng tốc): Pha này là pha tăng trưởng mạnh nhất. Tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh nhất và sinh khối tế bào được tạo thành theo cấp độ lũy thừa. Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao. Tế bào sinh ra nhanh, lượng cơ chất giảm mạnh và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra. 27
Đồ án tốt nghiệp - Pha cân bằng: việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần. Trong pha cân bằng, quần thế vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, ở pha này thì lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi, sinh khối sinh ra không tăng lên và cũng không giảm.Vì vậy khi nồng độ cơ chất giảm thì tốc độsinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Nguyên nhân tồn tại pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất (như axit hữu cơ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng trong môi trường. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và sốlượng các chất dinh dưỡng sử dụng vào điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa sốlượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu. - Pha suy vong: Trong pha này lượng tế bào ngày càng già và chết đi, sự cân bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự biến đổi về kích thước. Từ việc đánh giá được sự phát triển của các pha, ta có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn. Nhìn vào đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ta có thể thấy rõ vi khuẩn phát triển mạnh nhất ở giai đoạn nào và thời điểm nào là thu được số lượng sinh khối lớn nhất. Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy (như các chất dinh dưỡng cần thiết) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, điều kiện thông khí, thời gian nuôi cấy Vấn đề đặt ra ở đây đó là nên thu sinh khối ở giai đoạn nào là tốt nhất và chất lượng nhất, bởi chọn thời điểm lấy sinh khối nhằm tạo điều kiện cho quá trình phát triển sau này. Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng thì sẽ có nhiều tế bào già và chết. Theo một số tài liệu nghiên cứu thì sinh khối nên được lấy ra ở thời điểm đầu pha cân bằng là tốt nhất. 28
Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của S. marcescens Môi trường nuôi cấy là nguyên liệu cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào và các quá trình trao đổi năng lượng của vi sinh vật. Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật đó. Vi khuẩn muốn sinh trưởng và phát triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N, và O. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon. Trong cơ thể vi sinh vật cacbon chứa 50% khối lượng khô, và nó được tổng hợp từ các hợp chất hữu cơ hoặc CO2, vì vậy vấn đề chuyển hóa các nguồn thức ăn cacbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Serratia marcescens có thể sử dụng được nhiều loại hydrocacbon như sucrose, manitose, maltose, glucose Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Trong cơ thể vi sinh vật nitơ chiếm khoảng 14 % khối lượng khô của tế bào. Nó góp phần vào việc tạo thành các axit amin, nucleotit của axit nucleic và coenzyme, vì vậy nitơ có vai trò không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Lựa chọn một nguồn nitơ thích hợp sẽ góp phần thúc đẩy quá trình phát triển của S. marcescens. 29
Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của Serratia marcescens Ảnh hưởng của pH: Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn. Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt. S. marcescens có thể phát triển trong khoảng pH rộng từ 5-9, nhưng ứng với các môi trường thì S. marcescens sẽ phát triển tốt ở các ngưỡng pH nhất định. Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, sản phẩm của quá trình lên men sinh ra cũng làm giảm pH môi trường. Do đó, nó cũng gây ức chế tới sự phát triển của vi khuẩn. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ môi trường với vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, vì nhiệt độ không chỉ đơn thuần ảnh hưởng đến cường độ phát triển của từng loại vi sinh vật mà chính là khả năng sinh trưởng của chúng ở nhiệt độ đó. Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau. Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. S. marcescens có thể phát triển ở ngưỡng nhiệt độ khá rộng từ 5 - 400C. Ảnh hưởng của Oxy: S. marcescens là vi khuẩn kị khí tùy nghi nên nó có thể sống được cả trong môi trường hiếu khí và kị khí. Nhưng nó phát triển tốt nhất trong môi trường hiếu khí. 30
Đồ án tốt nghiệp Trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn cần hô hấp để sinh trưởng và phát triển. Vì thế trong nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp. Ảnh hưởng của mật độ cấy giống: Mật độ cấy giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn. Nếu mật độ cấy giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp. Nếu mật độ cấy giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn mật độ cấy giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men. 31
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện Địa điểm nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm –Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ ngày 07/04/2014 đến ngày 29/6/2014 3.2. Vật liệu – hóa chất – thiết bị sử dụng nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu ngiên cứu Nguồn vi sinh vật thử nghiệm là chủng SH1 của phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm –Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử có số đăng kí trên Genbank là KF534508.1. 3.2.2. Môi trường ( thành phần môi trường xem phu lục) - Môi trường Nutrient agar - Môi trường Nutrient broth - Môi trường Peptone glycerol broth - Môi trường thạch mềm NA - Môi trường Gelatine - Môi trường Casein - Môi trường huyền phù chitin - Môi trường thử nghiệm họa tính lipase 3.2.3. Hóa chất - Hóa chất dùng để nhuộm Gram - Crystal vilet - Fuchsin - Trichloroacetic acid (TCA) - Đệm phosphate 32
Đồ án tốt nghiệp - KI - K2HPO4 - Iod - KOH - NaCl - HCl - NaOH - Ethanol 70% - Ethanol 96% 3.2.4. Dụng cụ - Cốc thủy tinh - Erlen - Đũa thủy tinh - Chai thủy tinh 100ml - Ống nghiệm - Ống đong - Đĩa petri - Pipette 5ml, 10ml. - Pipetteman - Đầu tuýp - Cuvette - Lame 3.2.5. Thiết bị - Máy đo quang phổ UV-Vis - Máy đo pH - Kính hiển vi quang học - Cân kĩ thuật - Tủ lạnh - Máy nước cất 33
Đồ án tốt nghiệp - Bếp điện từ - Máy lắc - Máy li tâm 3.3. Phƣơng pháp luận Mục đích: Xây dựng quy trình lên men thu sinh khối cực đại vi khuẩn Serratia marcescens SH1. Mục tiêu: Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1. Phương pháp giải quyết vấn đề: Trong thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh thì nguồn cacbon và nito đóng vai trò quan trọng trong thu sinh khối, cần xác định nguồn nito và cacbon thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Về điều kiện lên men thì cần xác định các thông số: pH, điều kiện oxy (số vòng lắc/phút), mật độ cấy giống, thời gian lên men nhằm thu sinh khối cực đại. Nội dung nghiên cứu: - Quan sát hình thái, định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng SH1 - Khảo sát các nguồn cacbon và nito phù hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1 - Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện oxy (số vòng lắc/phút), mật độ cấy giống, thời gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1 3.4. Bố trí thí nghiệm 34
Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn SH1 Soi khuẩn lạc Quan sát hình thái, sinh lí Nhuộm Gram Thử nghiệm sinh hóa Sử dụng bộ Kit Chitinase API 20E Lipase Thử nghiệm các hoạt tính enzyme Protease Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của SH1 Trên sơ đồ hình 3.1 là bố trí thí nghiệm nhằm khẳng định lại chủng SH1 bằng các thử nghiệm sinh hóa với bộ Kit API 20E, soi và kiểm tra hình thái tế bào thông qua nhộm Gram. Kiểm tra lại hoạt tính của một số enzyme ngoại bào của S. marcescens SH1 sau quá trình bảo quản. 35
Đồ án tốt nghiệp Chủng Serratia marcescens SH1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của vi sinh vật trên môi trường NB Chọn thời gian nuôi cấy thích hợp để tiến hành các thí nghiệm sau Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Nitơ lên sự phát triển của vi sinh vật Chọn nguồn Nitơ thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của vi sinh vật Chọn nguồn Cacbon thích hợp nhất cho sự phát triển của vi sinh vật Xác định các thành phần môi trường tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescens SH1 Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần môi trường tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescen SH1 Trên sơ đồ hình 3.2 là bố trí thí nghiệm này nhằm xác định thành phần môi trường (nguồn cacbon và nitơ) nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển sản xuất sinh khối của chủng Serratia marcescens SH1. 36
Đồ án tốt nghiệp Chủng Serratia marcescens SH1 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên sự phát triển của vi khuẩn Chọn pH môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn Khảo sát ảnh hưởng của Oxy lên sự phát triển của khuẩn Chọn điều kiện Oxy thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của vi khuẩn Chọn mật độ cấy giống thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm bổ sung lên sự phát triển của vi khuẩn Chọn nồng độ đệm thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn Chọn được các điều kiện nuôi cấy thích hợp Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy S. marcescens SH1 37
Đồ án tốt nghiệp Trên sơ đồ hình 3.3 là bố trí thí nghiệm này nhằm mục đích xác định các điều kiện nuôi cấy (pH, nồng độ Oxy, mật độ cấy giống, bổ sung đệm) tốt nhất cho sự phát triển sản xuất sinh khối của chủng Serratia marcescens SH1 . 3.5. Phƣơng pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 3.5.1. Phương pháp quan sát hình thái sinh lý Soi khuẩn lạc: Tiến hành cấy ria vi khuẩn trên môi trường Nutrient Agar (NA), ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 4X. Nhuộm Gram: Nguyên tắc: Dựa trên sự khác biệt về cấu tạo của lơp peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn mà người ta chia thành 2 loại là Gram (-) và Gram (+). Các vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím kết tinh (violet) và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+). Các vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram (-). Cách tiến hành: Làm tiêu bản - Chọn lame sạch và khô. Dùng que cấy vô trùng lấy một chút sinh khối vi sinh vật làm vết bôi trên lame. - Dùng kẹp gỗ hơ nhẹ mặt dưới của lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi. 38
Đồ án tốt nghiệp Nhuộm tiêu bản - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhộm lại bằng dung dịch Indine trong 1 phút, rửa nước , thấm khô. - Tẩy cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fuchsin 30 giây, rửa nước, thấm khô. Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính. Vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím. Sử dụng chủng E. Coli để làm đối chứng Gram (-) và Bacillus subtilis để làm đối chứng Gram (+). 3.5.2. Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ kit API 20E Sử dụng bộ Kit API 20E của hãng BioMerieux để định danh chủng SH1, đây là bộ Kit chuyên sử dụng để định danh các vi khuẩn gram âm đường ruột Quá trình định danh được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux) Cách tiến hành: - Tăng sinh chủng vi khuẩn: Tăng sinh chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 trong môi trường NB tiến hành nuôi trong điều kiện lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Pha loãng sao cho OD620 khoảng 0,582. - Cấy trang trên môi trường NA để lấy khuẩn lạc đặc trưng: Chủng vi khuẩn đã tăng sinh sẽ được pha loãng để cấy trang. Sử dụng nước muối sinh lý (0,85%) đã hấp khử trùng để pha loãng, tiến hành pha loãng sinh khối ở các nồng độ 10-1, 10-2 -6 -4 -5 -6 0 10 . Tiến hành cấy trang ở 3 nồng độ 10 , 10 , 10 . Sau đó đem ủ ở 37 C cho đến khi có khuẩn lạc. - Chuẩn bị các dung dịch cho việc định danh API  Chuẩn bị dung dịch Mc Faland, nước muối sinh lý 0,85%, nước cất. Tất cả đem hấp khử trùng 1210C trong 15 phút.  Dầu khoáng ( hay còn gọi dầu paraffin ) sấy ở nhiệt độ 1500C trong 1h. 39
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành test định danh API 20E - Cho một ít nước cất vô trùng vào khay nhựa của bộ Kit để giữ ẩm trong suốt quá trình ủ trong tủ ấm - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý (0,85%) vô trùng, lắc đều sao cho đạt độ đục so với Mc Faland 3M - Dùng pipetman vô trùng hút dịch vi khuẩn vào các ô của bộ Kit. Các ô CIT, GEL và VP thì cho đầy đủ, các ô còn lại cho vừa đủ, 5 ô AHD, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. - Ủ bộ Kit ở 370C từ 18-24 giờ. Sau đó đọc kết quả Bảng 3.1. Các chỉ tiêu định danh bằng bộ Kit API 20E Thử nghiệm Âm tính (-) Dương tính (+) ONPG Không đổi màu Vàng ADH Vàng Đỏ/ cam LDC Vàng Đỏ/cam ODC Vàng Đỏ/ cam CIT Vàng Xanh/xanh lá H2S Không màu Đen URE Vàng Đỏ/cam TDA Vàng Nâu sậm IND Vàng Có vòng đỏ VP Không màu Hồng đỏ GEL Không màu (còn kết tủa Đen đen) GLU Xanh/xanh lá Vàng MAN Xanh/xanh lá Vàng INO Xanh/xanh lá Vàng SOR Xanh/xanh lá Vàng RHA Xanh/xanh lá Vàng 40
Đồ án tốt nghiệp SAC Xanh/xanh lá Vàng MEL Xanh/xanh lá Vàng AMY Xanh/xanh lá Vàng ARA Xanh/xanh lá Vàng Ghi chú: - ONPG: orthor-nitophenyl galactosidase - GEL: gelatin - ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose - LDC: lysine decacboxylase - MAN: manitol - ODC: ornithine decacboxylase - INO: inositol - CIT: citrate - SOR: sorbotol - H2S: sinh H2S - RHA: rhamnose - URE: urea - SAC: sucrose - TDA: tryptophane deaminase - MEL: metibiose - IND: indol - AMY: amygdaline - VP: phản ứng Voges-proskauer - ARA: arabinnose Đọc kết quả: Sau 18 đến 24 giờ Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào bảng trên - Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử  TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả âm tính (-).  IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND, đợi sau 2 phút. Có vòng màu đỏ xuất hiện là dương tính (+), màu vàng là âm tính(-).  VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2, đợi sau 10 phút. Nếu có màu hồng hoặc đỏ là dương tính (+). Nếu không đổi màu hoặc màu hồng nhạt xuất hiện trong 10-12 phút là phản ứng âm tính (-). 41
Đồ án tốt nghiệp Sau 18 giờ thì đọc kết quả của các thông số trừ (TDA, IND, VP). Sau 24 giờ thì đọc lại kết quả của tất cả các phản ứng và hiện tượng của các chỉ tiêu và đọc luôn cả TDA, IND, VP. - Sau 24 giờ đọc lại kết quả thì tiến hành đọc GLU trước, nếu kết quả khác với kết quả nhận được lúc 18 giờ thì tiến hành đọc tiếp, còn giống thì ta không đọc những kết quả đã đọc lúc 18 giờ nữa, tiến hành đọc 3 chỉ tiêu còn lại. 3.5.3. Thử nghiệm các hoạt tính enzyme Thử nghiệm hoạt tính lipase: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NB trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút. Pha môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 500C đổ ra các đĩa petri. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm vào giữa đĩa petri chứa môi trường thử nghiệm hoạt tính lipase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Xem khả năng phân giải và đo đường kính vòng tủa trên bề mặt môi trường. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thử nghiệm hoạt tính protease: Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NB trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút. Pha môi trường geltatine agar và môi trường casein agar, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 500C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong của canh trường tăng sinh vi khuẩn (dịch trong sau khi ly tâm) vào hai giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trường Nutrient broth để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng TCA 10%. Kiểm tra và đo kích thước vòng phân giải (D-d, mm), với D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ đục. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thử nghiệm hoạt tính chitinase: 42
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn thử nghiệm được tăng sinh trên môi trường NB trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút. Pha môi trường thạch huyền phù chitin, hấp 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội đến khoảng 500C đổ ra các đĩa petri. Đục 3 giếng thạch trên mỗi đĩa agar môi trường, đường kính mỗi giếng thạch là 0,7 cm (d). Cho 20 μl dịch trong của canh trường tăng sinh vi khuẩn (dịch trong thu được sau khi ly tâm) vào hai giếng thạch, giếng còn lại cho 20 μl môi trường NB để làm đối chứng. Ủ tất cả các đĩa thạch ở nhiệt phòng trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, tráng thuốc thử lugol. Đo kích thước vòng phân giải (D-d, mm), với D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ đục. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 3.6. Phƣơng pháp khảo sát môi trƣờng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 3.6.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường cơ bản Nutrient broth - Tăng sinh chủng vi khuẩn Serratia marcescens SH1 trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620=0.8 - Sử dụng môi trường NB để khảo sát đường cong tăng trưởng. Mỗi bình 20 ml môi trường,tỉ lệ cấy giống 1% (0,2 ml giống trong 20 ml môi trường). Nuôi lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Tiến hành khảo sát trong 24 giờ, cứ 2 giờ lây mẫu 1 lần. Đo OD ở bước sóng 620 nm và dựng đường cong tăng trưởng. Mỗi nghiệm thực lặp lại 3 lần, Chọn thời gian nuôi cấy tốt nhất để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.6.2. Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen SH1 Dựa vào môi trường ban đầu là Nutrient broth (NB), Peptone được xem là nguồn nito chủ yếu trong môi trường NB. Tiến hành định lượng nito tổng của các nguồn nitơ sử dụng và nitơ đối chứng của môi trường NB bằng phương pháp kjeldahl. Dựa trên môi trường NB, peptone sẽ được lần lượt thay thế bằng các nguồn nitơ khác nhau. 43
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Hàm lượng % nito tổng của các nguồn nito (định lượng bằng phương pháp Kjeldahl) Nguồn Nito Hàm lượng % nito tổng số Peptone 11.36 Tryptone 15.34 Cao nấm men 10.65 Aminoacetic acid 15.9 Casein enzyme hydrolysale 13.06 Dựa vào kết quả kjeldahl của bảng 3.2, tính toán các thành phần môi trường như sau: Bảng 3.3. Thành phần môi trường và các nguồn nitơ khảo sát Môi trường Thành phần Khối lượng (g/l) Nutrient broth (NB) Peptone 5,00 (Đối chứng) Meat 3,00 Meat + Tryptone (MT) Meat 3,00 Tryptone 3,70 Meat + Yeast (MY) Meat 3,00 Yeast extract 5,33 Meat + Casein enzyme Meat 3,00 hydrolysale (MC) Casein enzyme hydrolysale 4,35 Cách tiến hành: - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Sử dụng các môi trường MT, MY, MC, NB tương ứng với các nguồn Nitơ Tryptone, Yeast extract, Casein enzyme hydrolysale và Peptone để tăng sinh, môi trường nuôi cấy sẽ được chuẩn độ đến pH 7,5 trước khi cấy giống. Tất cả sẽ được 44
Đồ án tốt nghiệp nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, lắc 150 vòng/phút, tỉ lệ cấy giống 1% (cấy 0,2 ml giống vào 20 ml môi trường, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈ 0,8). - Sau 15 giờ tiến hành đo OD các dịch nuôi cấy ở bước sóng 620 nm để xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn môi trường (nguồn nitơ) cho mật độ tế bào cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.6.3. Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia marcescens SH1 - Dựa trên môi trường Peptone glycerol để tính toán lượng cacbon trong các môi trường khác sao cho khối lượng cacbon trong các môi trường là như nhau. Các nguồn cacbon được sử dụng để khảo sát là glycerol, sucrose, maltose, manitol, glucose. - Môi trường chính là Meat extract +Yeast extract (môi trường đã được chọn ở thí nghiệm trước) và lần lượt bổ sung các nguồn cacbon khác nhau. Sau khi tính toán ta sẽ có thành phần các môi trường như sau: Bảng 3.4. Thành phần môi trường và các nguồn cacbon khảo sát Tên môi trường Thành phần môi Khối lượng trường (g//l) Meat extract 3,00 MG1 Yeast extract 5,33 Glycerol 10ml Meat extract 3,00 MS Yeast extract 5,33 Sucrose 11.72 Meat extract 3,00 MG2 Yeast extract 5,33 Glucose 12.34 Meat extract 3,00 MM1 Yeast extract 5,33 Maltose 11.72 45
Đồ án tốt nghiệp Meat extract 3,00 MM2 Yeast extract 5,33 Manitol 12,47 Meat + Yeast (MY) Meat extract 3,00 (đối chứng) Yeast extract 5,33 Cách tiến hành: - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Sử dụng các môi trường MG1, MS, MG2, MM1, MM2 tương ứng với các nguồn cacbon là glycerol, glucose, sucrose, maltose, và môi trường đối chứng MY (không bổ sung cacbon) để tăng sinh, môi trường nuôi cấy sẽ được chuẩn độ đến pH 7,5 trước khi cấy giống. Tất cả sẽ được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, lắc 150 vòng/ phút, tỉ lệ cấy giống 1% (cấy 0,2 ml giống vào 20 ml môi trường, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈0,8). - Sau 15 giờ, tiến hành đo OD các dịch nuôi cấy ở bước sóng 620 nm để xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn môi trường (nguồn cacbon) cho mật độ tế bào cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.7. Phương pháp thí nghiệm khảo sát các điều kiện nuôi cấy của Serratia marcescens SH1 Quá trình khảo sát các điều kiện nuôi cấy này sẽ sử dụng môi trường chính là Meat+Yeast+Sucrose (MYS- đây là môi trường với các thành phần phù hợp nhất để Serratia marcescens phát triển đã được chọn từ các thí nghiệm trên) để khảo sát Thành phần môi trường MYS: Meat extract 3,00 g/l Yeast extract 5,33 g/l Sucrose 11,72 g/l 46
Đồ án tốt nghiệp 3.7.1. Xác định pH tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescens SH1 - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Khảo sát khả năng phát triển của chủng vi khuẩn ở điều kiện pH khác nhau. Môi trường tăng sinh là môi trường MYS được điều chỉnh pH về các giá trị pH 6,5; 7,0; 7.5; 8,0 trước khi cấy giống bằng NaOH 1N và HCl 1N. Sử dụng môi trường có pH 7,5 làm môi trường đối chứng. Tất cả sẽ được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, lắc 150 vòng/ phút, tỉ lệ cấy giống 1% (cấy 0,2 ml giống vào 20 ml môi trường, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈ 0,8). - Tiến hành đo OD xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn mốc pH cho mật độ tế bào cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.7.2. Xác định điều kiện oxy tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1 - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Sử dụng môi trường MYS để tăng sinh khảo sát khả năng phát triển của chủng vi sinh vật ở các điều kiện: không lắc, lắc 120 vòng/phút, lắc 150 vòng/phút, lắc 180 vòng/phút, lắc 210 vòng/phút, sử dụng mẫu đối chứng là lắc 150 vòng/phút. Tất cả sẽ được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, tỉ lệ cấy giống 1% (cấy 0,2 ml giống vào 20 ml môi trường, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈ 0,8). - Tiến hành đo OD xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn số vòng lắc/phút cho mật độ tế bào cao nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.7.3. Xác định mật độ cấy giống tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1 Tiến hành khảo sát với các tỉ lệ cấy giống như sau: 47
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Tỉ lệ và mật độ cấy giống khảo sát Thể tích giống Thể tích môi Mật độ tế bào (ml) trƣờng (ml) Tỉ lệ cấy giống (cfu/ml) 0,1 20 0,50% 0,25.106 0,2 20 1,00% 0,5.106 0,4 20 1,96% 1.106 0,8 20 3,84% 1,95.106 1,6 20 7,40% 3,8.106 Cách tiến hành: - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Sử dụng môi trường MYS để tăng sinh chủng vi khuẩn, tiến hành cấy giống với các tỉ lệ cấy 0,5%; 1%; 1,96%; 3,84%; 7,4%, sử dụng giống đã pha loãng có OD620 ≈ 0,8. Sử dụng mẫu đối chứng là tỉ lệ cấy giống 1%. Tất cả sẽ được nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ. - Sau 15 giờ tiến hành đo OD xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chọn tỉ lệ cấy giống tối ưu nhất sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.7.4. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đệm phosphate (pH 7,5) vào môi trường - Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0,8. - Sử dụng môi trường MYS để tăng sinh, đệm phosphate (pH 7,5) sẽ được bổ sung vào môi trường sao cho môi trường có nồng độ đệm phosphate như sau: 0,01M; 0,02M; 0,05M; 0,1M và mẫu đối chứng là môi trường MYS không bổ sung đệm. Tất cả sẽ được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 15 giờ, tỉ lệ cấy giống 1,96% (cấy 0,4 ml giống vào 20 ml môi trường, tỉ lệ cấy giống tốt nhất được khảo sát ở thí nghiệm trước). 48
Đồ án tốt nghiệp - Sau 15 giờ tiến hành đo OD xác định mật độ tế bào. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Kiểm tra xem việc bổ sung đệm có làm tăng mật độ tế bào không và xem ở nồng độ nào là thích hợp nhất. 3.7.5. Xây dựng đường cong tăng trưởng của Serratia marcescens SH1 trên môi trường mới và điều kiện nuôi cấy mới Từ các thí nghiệm trên ta đã lựa chọn được môi trường và các điều kiện nuôi cấy mới thích hợp giúp tăng mật độ tế bào, giờ ta tiến hành xác định lại đường cong tăng trưởng. - Tăng sinh chủng vi khuẩn SH1 trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng. Pha loãng sao cho OD620 ≈ 0.8 - Sử dụng môi trường MYS để khảo sát đường cong tăng trưởng. Mỗi bình 20ml môi trường, môi trường được chuẩn đến pH 7,5 và tỉ lệ cấy giống 1,96% (0,4 ml giống trong 20 ml môi trường). Nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Tiến hành khảo sát trong 36 giờ, cứ 2 giờ lấy mẫu 1 lần. Đo OD ở bước sóng 620 nm và dựng đường cong tăng trưởng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Các thông số từ đường cong tăng trưởng được tính như sau - Tốc độ sinh trưởng: μ = [ln(X/X0)]/(t-t0) = log(X/X0)/[log e*(t-t0)] = (logX – logX0)/0,434(t-t0) = 2,303(log X –log X0)/(t-t0) - Thời gian thế hệ: td= 2,303*log2/μmax= 0,69/μmax 49
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm sinh hóa Chủng vi khuẩn SH1 được phân lập và được giữ trong phòng thí nghiệm đã được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 16s rRNA. Tuy nhiên, sau thời gian bảo quản, trước khi sử dụng cần kiểm tra tính thuần khiết và định danh và xác định lại đó có phải là chủng Serratia marcescens bằng phương pháp thử nghiệm sinh hoá bằng cách sử dụng bộ Kit API 20E. 4.1.1. Quan sát hình thái, sinh lý Hình thái khuẩn lạc: Hình thái khuẩn lạc chủng SH1 quan sát dưới kính hiển vi cho thấy khuẩn lạc có hình tròn, lồi, nhớt và có màu đỏ trên môi trường NA, đường kính khuẩn lạc từ 2,5-3mm. Khuẩn lạc có màu đỏ là do SH1 có khả năng tổng hợp sắc tố trên môi trường NA, theo như mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của Serraria marcescens (Grimont và cộng sự, 2006; Anita và cộng sự, 2006) Hình 4.1. Khuẩn lạc SH1 trên môi trường NA ( dưới vật kính 4X) Kết quả nhuộm Gram: Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn SH1 khi nhuộm Gram bắt màu hồng giống như vi khuẩn đối chứng E.coli. Điều này cho thấy chủng phân lập được là Gram âm, 50
Đồ án tốt nghiệp phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980; Grimont và Grimont, 2006; David R.C., 2012). A B C Hình 4.2. Kết quả nhuộm Gram A. B. subtilis - Đối chứng Gram (+) B. E. Coli - Đối chứng Gram (-) C. Chủng SH1 4.1.2. Thử nghiệm sinh hóa định danh SH1 bằng bộ Kit API 20E 51
Đồ án tốt nghiệp A B Hình 4.3. Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E A. Bộ Kit API 20E đã bổ sung dịch vi khuẩn sau khi ủ 0 giờ B. Bộ Kit API 20E đã bổ sung dịch vi khuẩn sau khi ủ 24 giờ Bảng 4.1. Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng SH1 Thứ tự Thử nghiệm Giải thích từ viết tắt Kết quả 1 ONPG Orthor-nitophenyl + galactosidase 2 ADH Arginine dihydrolase - 3 LDC Lysine decacboxylase + 4 ODC Ornithine decacboxylase + 5 CIT Citrate + 6 H2S Sinh H2S - 7 URE Urea - 8 TDA Tryptophane deaminase - 9 IND Indol - 10 VP Voges-proskauer + 11 GEL Gelatin + 12 GLU Glucose + 13 MAN Mannitol + 52
Đồ án tốt nghiệp 14 INO Inositol + 15 SOR Sorbotol + 16 RHA Rhamnose - 17 SAC Sucrose + 18 MEL Metibiose - 19 AMY Amygdaline + 20 ARA Arabinnose - Từ kết quả hóa sinh trên, tiến hành tra trên API web cho thấy định danh vi khuẩn thử nghiệm là loài Serratia marcescens với tỉ lệ tương đồng 97%. Phương pháp định danh bằng giải mã trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng thí nghiệm thuộc loài S. marcescens với tỉ lệ tương đồng trên 99%. Đồng thời, vi khuẩn thí nghiệm sinh tổng hợp sắc tố màu đỏ đặc trưng nên ta có thể tin tưởng vào kết quả định danh trên. 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính enzyme  Thử nghiệm hoạt tính lipase Lipase xúc tác thủy phân các cầu nối eter của triacylglycerol để tạo ra glycerol và acid béo. Có thể dễ dàng phát hiện enzyme lipase của vi sinh vật trên môi trường đĩa thạch chứa Tween 20 nhờ phức hợp của acid béo-calcium. Lipase sẽ phân phủy Tween 20 trong môi trường tạo ra các acid béo, các acid béo được giải phóng sẽ kết tủa với muối calcium trong môi trường. Phức hợp acid béo – calcium sẽ làm đục môi trường xung quanh điểm cấy. Kết quả khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính lipase cho thấy có sự hiện diện enzyme lipase trong chủng S. marcescens SH1. 53
Đồ án tốt nghiệp Hình 4.4. Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20 Đường kính vòng phân giải lipase của S. marcescens SH1: 67 ± 3 mm  Thử nghiệm hoạt tính protease Sau quá trình ủ, ta thử khả năng phân hủy gelatine và casein của vi sinh vật bằng trichloroacetic acid (TCA). Gelatine hoặc casein sẽ tác dụng với TCA tạo thành phức hợp tủa có màu trắng đục. Vùng có sự phân giải gelatine và casein sẽ trong suốt vì không có phức hợp tủa giữa gelatine hoặc casein với TCA. Kết quả cho thấy SH1 có khả năng phân giải gelatin và casein. A B Hình 4.5. Thử nghiệm hoạt tính protease của SH1 A. Trên môi trường Casein B. Trên môi trường Gelatine Đường kính vòng phân giải casein của SH1 nằm trong khoảng 13 ± 2 mm Đường kính vòng phân giải gelatin của SH1 nằm trong khoảng 16 ± 2 mm 54
Đồ án tốt nghiệp  Thử nghiệm hoạt tính chitinase Sau quá trình ủ ta sẽ thử nghiệm khả năng phân hủy chitin bằng thuốc thử lugol. Khi chitinase có mặt trong môi trường chứa chitin nó sẽ phân giải chitin thành N-acetyl glucosamine và cấu trúc mạch ngắn hơn không bắt màu với thuốc thử lugol. Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh hoạt tính chitinase của chủng vi sinh vật. A B Hình 4.6. Khả năng phân giải chitin A. Bacillus subtilis B. Serratia marcescens Khi tiến hành khảo sát trên môi trường thạch huyền phù chitin chứa 1% chitin, kết quả chủng SH1 không có hoạt tính chitinase, có thể trong thời gian bảo quản đã mất hoạt tính của enzyme chitinase. Theo Brurberg và cộng sự, 2010; Shingh và cộng sự 2007 và nhiều tác giả khác thì S. marcescens có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinnase. Như vậy, trong quá trình bảo quản có thể chủng S. marcescens SH1 đã mất hoạt tính chitinase. Như vậy, trong 3 hoạt tính enzyme ngoại bào liên quan đến khả năng diệt sâu của Serratia marcescens SH1 chủng thí nghiệm còn giữ được 2 trong 3 hoạt tính, 55
Đồ án tốt nghiệp điều này cho thấy quá trình giữ giống gốc vô cùng quan trọng đối vi sinh công nghiệp. 4.2. Khảo sát môi trƣờng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 4.2.1. Đường cong tăng trưởng của Serratia marcescens SH1 trên môi trường nutrien broth Môi trường nuôi cấy quyết định năng suất cũng như mật độ sinh khối vi khuẩn sau quá trình nuôi cấy. Ban đầu, trong các thí nghiệm người ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường cơ bản là NB và dựa trên môi trường này ta sẽ khảo sát các yếu tố khác. Để thu sinh khối điều quan trọng đầu tiên là xác định thời gian thu sinh khối, do đó ta sẽ tiến hành dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường cơ bản NB nhằm xác định thời gian thu sinh khối tốt nhất của chủng vi khuẩn. Đƣờng cong tăng trƣởng của S. marcescens SH1 trên môi trƣờng NB 8.00 7.50 7.00 6.50 Log mật độ tếbào (cfu/ml) 6.00 0 10 20 30 40 Thời gian (giờ) Hình 4.7. Đường cong tăng trưởng của S. marcescens SH1 trên môi trường NB Theo đường cong tăng trưởng hình 4.7 thì vi khuẩn trải qua pha lag trong 2 giờ đầu tiên và nhanh chóng bước vào pha tăng trưởng và kéo dài trong khoảng 14 56
Đồ án tốt nghiệp giờ tiếp theo và bước vào pha cân bằng động lúc 15 giờ. Thông thường thời gian thu sinh khối tốt nhất là giai đoạn đầu của pha cân bằng động nên ta chọn mốc 15 giờ để thu sinh khối để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình phát triển tăng sinh khối của S. marcescens SH1 8.2 7.96 c 8.0 7.91 b 7.80 a 7.78 a 7.8 7.6 t t độ bào tế (cfu/ml) 7.4 mậ 7.2 Log Log 7.0 Peptone (ĐC) Tryptone Yeast extract Casein enzyme Nguồn Nitơ hydrolysale Hình 4.8. Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S. marcescens SH1 Sinh khối thu được sẽ đươc tính dựa vào đường chuẩn tế bào S. marcescens SH1, với phương trình đường chuẩn là y = 1,67x + 6,37 (trong đó y - là log mật độ tế bào, x-OD620 của dịch nuôi cấy) Bảng 4.2. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ Nguồn Nitơ Mật độ tế bào (cfu/ml) Peptone 8,13.107 Tryptone 6,31.107 Yeast extract 9,19.107 Casein enzyme hydrolysale 6,07.107 57
Đồ án tốt nghiệp Theo kết quả thí nghiệm đạt được thì nguồn nitơ hữu cơ từ Yeast extract cho kết quả tốt nhất, với mật độ tế bào đạt được là 9,19.107 cfu/ml, còn môi trường đối chứng NB với nguồn nito là Peptone có mật độ tế bào là 8,13.107 sau 15 giờ nuôi cấy. Mật độ tế bào sau 15 giờ thì môi trường nuôi cấy có nguồn nito là Yeast extract so với peptone cao gấp 1,13 lần (9,9.107/8,13.107). Dựa theo giá hóa chất của thị trường thì giá của 2 loại hóa chất như sau: Yeast extract 980.000đ/1kg Peptone 950.000đ/1kg Sự chênh lệch giá cả của 2 loại hóa chất Yeast exexextract /Peptone là 1,03. Như vậy xét trên cả 2 phương diện, sinh khối tế bào thu được và giá cả của hóa chất thì Yeast extract là nguồn nito thích hợp nhất để bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy S. marcescens SH1. 4.2.3. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon lên quá trình phát triển tăng sinh khối của S. marcescens SH1 8.2 8.1 8.03d 8.03d 7.99c 7.99c 8.0 7.87a 7.91b 7.9 7.8 7.7 Log mật Log độ mật bào tế (cfu/ml) 7.6 7.5 Không bổ Glucose Maltose Manitol Sucrose Glycerol sung cacbon Nguồn Cacbon Hình 4.9. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự phát triển của S. marcescens SH1 58
Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.3. Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn cacbon Nguồn Cacbon Mật độ tế bào (cfu/ml) Không bổ sung Cacbon 7,41.107 Glucose 10,7.107 Maltose 9,77.107 Manitol 9,77.107 Sucrose 10,8.107 Glycerol 8,13.107 Theo kết quả thí nghiệm từ đồ thị hình 4.9 và bảng 4.3 cho thấy môi trư ờng có bổ sung nguồn Cacbon sẽ giúp chủng vi khuẩn phát triển tốt hơn là không bổ sung cacbon. Với nguồn cabon từ sucrose và glucose là thích hợp nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen SH1, mật độ tế bào đạt được tương ứng là 1,08.108 và 1,07.108; sự chênh lệch về sinh khối thu được không có ý nghĩa thống kê, dó đó phải dựa vào giá thành thành của 2 loại hóa chất để quyết định chọn nguồn cacbon nào là thành phần môi trường nuôi cấy. Giá cả của 2 loại hóa chất trên thị trường như sau: Sucrose 18.000đ/kg Glucose 34.000đ/kg Như vậy xét về năng suất sinh khối tạo thành thì môi trường có nguồn cacbon từ sucrose sẽ thu được sinh khối cao hơn và giá của sucrose cũng rẻ hơn do vậy sucrose là nguồn cacbon thích hợp nhất trong thành phần môi trường cho sự phát triển của S. marcescens SH1. Từ kết quả của các thí nghiệm trên ta chọn được môi trường tốt nhất đề lên men thu sinh khối gồm có: Meat extract (3g/l) + Yeast extract (5,33g/l) + sucrose (11,72 g/l). Và môi trường trên sẽ được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm khảo sát các điều kiện nuôi cấy tiếp theo. 4.3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy của Serratia marcescens SH1 4.3.1. Ảnh hưởng của pH lên quá trình phát triển tăng sinh khối của Serratia marcescens SH1 59
Đồ án tốt nghiệp 8.1 8.01 a 8.03 ab 8.04 ab 8.05 b 8.0 7.9 Log mật Log độ mật bào tế (cfu/ml) 7.8 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 (Đc) pH 8.0 Độ pH Hình 4.10. Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S. marcescens SH1 Bảng 4.4. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH. Độ pH Mật độ tế bào (Cfu/ml) pH 6.5 1,03.108 pH 7.0 1,08.108 pH 7.5 1,10.108 pH 8.0 1,12.108 S. marcescens có thể phát triển trong mức pH từ 5-9 (Hajezi A và Falkiner F, 1997). Theo nghiên cứu của Giri và cộng sự, năm 2004 đã ghi nhận sự phát triển tối ưu của tất cả các chủng Serratia spp ở pH môi trường là 9,0. Theo Zeinat và cộng sự, năm 201 đã cho rằng môi trường có pH = 7.6 là tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescens . Trong nghiên cứu này, với môi trường mới (MYS) S. marcescens SH1 phát triển tốt nhất ở ngưỡng pH từ 7-8. Mặc dù sinh khối tạo thành có sự chênh lệch khác nhau nhưng sự sai khác này là không có ý nghĩa thống kê. Do vậy để nuôi cấy 60
Đồ án tốt nghiệp S. marcescesns SH1 thì môi trường nuôi cấy nên điều chỉnh nằm trong khoảng pH 7 - 8. 4.3.2. Ảnh hưởng của oxy lên quá trình phát triển tăng sinh khối của Serratia marcescens SH1 8.27 c 8.4 8.2 8.03 b 8.06 b 8.08 b 8.0 7.8 7.63 a 7.6 7.4 7.2 Log mật Log độ mật bào tế (cfu/ml) 7.0 Không lắc Lắc 120 Lắc 150 Lắc 180 Lắc 210 vòng/phút vòng/phút vòng/phút vòng/phút Điều kiện oxy Hình 4.11. Ảnh hưởng của Oxy lên sự phát triển của S. marcescens SH1 Bảng 4.5. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc Điều kiện oxy Mật độ tế bào (cfu/ml) 0,42.108 Không lắc 1,08.108 Lắc 120 vòng/phút 1,16.108 Lắc 150 vòng/phút 1,86.108 Lắc 180 vòng/phút 1,20.108 Lắc 210 vòng/phút 61
Đồ án tốt nghiệp S. marcescens là vi khuẩn kị khí tùy nghi, do đó điều kiện Oxy (tốc độ lắc) cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của nó. Theo Zeinat và cộng sự, năm 2010 thì tốc độ lắc 160 vòng/phút là tốt nhất cho sự phát triển của S. marcescens Trong thí nghiệm này, với môi trường mới thì tốc độ lắc 180 vòng/phút là tối ưu cho sự phát triển của S. marcescens SH1 4.3.3. Ảnh hưởng của mật độ cấy giống lên quá trình phát triển tăng sinh khối của Serratia marcescens SH1 Mật độ cấy giống cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến thời gian nuôi cấy đặc biệt là với quy mô công nghiệp thì yếu tố này ảnh hưởng đáng kể giá trị kinh tế. Nếu mật độ cấy giống quá cao sẽ dẫn đến nguồn thức ăn trong môi trường nuôi cấy nhanh cạn kiệt dẫn đến quá trình nuôi cấy sẽ kết thúc nhanh và lượng sinh khối tạo thành ít. Ngược lại với mật độ cấy giống thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, kéo theo rất nhiều chi phí sau đó, mặt khác nếu nuôi cấy trong thời gian dài thì quá trình nuôi cấy rất dễ nhiễm các vi sinh vật khác. 8.55 8.45 c 8.48 c 8.50 8.41 bc 8.45 8.34 b 8.40 o o (cfu/ml) 8.35 8.26 a 8.30 độ độ bà tế t t 8.25 mậ 8.20 Log Log 8.15 8.10 0,5% 1,00% 1,96% 3,84% 7,4% TỈ LỆ CẤY GIỐNG Hình 4.12. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S. marcescens SH1 62
Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.6. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống Tỉ lệ cấy giống (%) Mật độ tế bào (cfu/ml) 0,5 1,81.108 1,00 2,20.108 1,96 2,80.108 3,84 3,04.108 7,4 2,59.108 Theo kết quả thí nghiệm hình 4.17 cho thấy tỉ lệ cấy giống 1,96 %; 3,84%; 7,4% là tốt nhất và sự sai khác giữa 3 tỉ lệ cấy giống là không có ý nghĩa thống kê, so với tỉ lệ cấy giống đối chứng 1%, thì sự sai khác này là có ý nghĩa. Vì vậy ta sẽ chọn tỉ lệ cấy giống 1,96% ( tương ứng với mật độ cấy giống là 106 cfu/ml) để cấy giống trong quá trình sản xuất, như vậy sẽ tiết kiệm được nguồn giống. 4.3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung đệm photphate đến quá trình phát triển của Serratia marcescens SH1 - Sau 15 giờ lên men, pH đo được giảm xuống còn khoảng 5.2 đến 5.8, ở mức pH này không thuận lợi cho sự phát triển hay lên men của S. marcescens .Việc bổ sung đệm giúp trung hòa một lượng acid được sinh ra trong quá trình lên men làm cho quá trình lên men ổn định hơn. 63
Đồ án tốt nghiệp 8.6 8.4 8.23a 8.27 a 8.23 a 8.25 a 8.26 a 8.2 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 Log mật Log độ mật bào tế (Cfu/ml) 7.0 Không đệm 0,01M 0,02M 0,05M 0,1M Nồng độ đệm của môi trƣờng Hình 4.13. Ảnh hưởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của S. marcescens SH1 Bảng 4.7. Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trường nuôi cấy Nồng độ đệm Mật độ tế bào (cfu/ml) Không đệm 1,68.108 0,01M 1,88.108 0,02M 1,68.108 0,05M 1,79.108 0,1M 1,81.108 Theo kết quả thí ngiệm như đồ thị hình 4.13, mặc dù việc bổ sung đệm có làm tăng mật độ tế bào nhưng số lượng tăng này không có ý nghĩa thống kê, do đó ta không cần bổ sung đệm vào môi trường nuôi cấy. Từ các thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy ta chọn được các điều kiện lên men thu sinh khối tốt nhất đối với chủng Serratia marcescens SH1 trên môi trường MYS là: pH môi trường từ 7 – 8, điều kiện oxy lắc 180 vòng/phút, tỉ lệ cấy giống là 1,96% (khoảng 106 cfu/ml). 64
Đồ án tốt nghiệp 4.3.5. Khảo sát đường cong tăng trưởng trên môi trường mới và điều kiện mới Môi trường nuôi cấy vi khuẩn mới MYS so với môi trường ban đầu cũng như các điều kiện nuôi cấy có nhiều thay đổi, do vậy cần thiết lập đường cong tăng trưởng trên 2 môi trường để so sánh. Đường cong tăng trưởng của SH1 trên môi trường NB và môi trường mới 8.5 8.0 7.5 7.0 MT MỚI MT NB 6.5 Log mật Log độ mật bào tế (cfu/ml) 6.0 0 10 20 30 40 Thời gian (giờ) Hình 4.14. Đường cong tăng trưởng của S. marcescens SH1 trên 2 môi trường Theo hình 4.14 thì ở môi trường Nutrient broth (NB), đường cong tăng trưởng cho thấy pha lag kéo dài trong 2 giờ, và pha tăng trưởng kéo dài trong 14 giờ, sau 16 giờ vi khuẩn mới bắt đầu bước vào pha cân bằng động. Trong khi đó, ở môi trường mới (MYS), vi khuẩn bỏ pha lag, đi vào pha tăng trưởng ngay. Thời gian pha tăng trưởng là 12 giờ, sau đó vi khuẩn bước vào pha cân bằng động, pha này kéo dài đến 36 giờ (theo thời gian khảo sát trong 36 giờ) mà mật độ tế bào chưa giảm. 65
Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.8. Các thông số động học nuôi cấy S. marcescens SH1 trên 2 môi trường Môi Thời Sinh µ (tốc độ Năng Thời gian Tỉ lệ năng trường gian khối đạt tăng suất sinh thế hệ suất sinh bắt được trưởng khối (giờ) khối so đầu khi bắt riêng trung (cfu/ml/ với đối pha đầu pha bình trong giờ) chứng cân cân thời gian (%) bằng bằng phân chia động động mạnh nhất) (giờ) (cfu/ml) (1/giờ) Môi trường 16 6,7.107 0,44 3,76.106 1,59 100 NB (đối chứng) Môi trường 10 1,1.108 0,55 1,06.107 1,26 282 mới (MYS) Phân tích đường cong tăng trưởng hình 4.14 và bảng 4.8 cho thấy, ở cả 2 môi trường tốc độ tăng trưởng mạnh nhất (μ) là trong 6 giờ đầu của quá trình lên men. So sánh tốc độ tăng trưởng riêng trung bình trong thời gian phân chia mạnh nhất (6 giờ đầu) thì môi trường mới cao hơn môi trường NB 25%, năng suất sinh khối khi của môi trường mới cao hơn môi trường NB 182%, trong khi đó thời gian thu sinh khối của môi trường NB dài hơn môi trường mới 1,6 lần. Như vậy, nếu sử dụng môi trường NB thì thời gian lên men kéo dài 16 giờ, nay khi sử dụng môi trường mới MYS thời gian lên men có thể rút ngắn còn 10 giờ 66
Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.9. Tính toán giá thành của 2 môi trường TP khối TP khối Giá môi Giá môi Hóa chất Giá hóa chất lượng môi lượng môi trường trường trường NB trường mới NB/lít mới/lít Meat extract 1.080.000đ/kg 3 (g/l) 3 (g/l) 3.240đ 3.240đ Peptone 950.000đ/kg 5 (g/l) 0 4.750đ 0 Yeast extraxt 980.000đ/kg 0 5,33 (g/l) 0 5.220đ Sucrose 17.000đ/kg 0 11,72 (g/l) 0 200đ Tổng giá 7.990đ 8.660đ Bảng 4.10. Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trường Môi trường NB Môi trường MYS Sinh khối thu được 37,6.108 106.108 trong 1 lít Chi phí môi trường/đơn vi sinh khối tế bào(108 212,5đ 81,1đ tế bào) Từ kết quả so sánh ở bảng 4.8 cho thấy khi nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường MYS cho sinh khối tăng gấp 1,64 lần so với môi trường NB (đối chứng). Từ bảng 4.9 và bảng 4.10 ta thấy chi phí để sản xuất sinh khối vi khuẩn trên môi trường NB cao hơn môi trường MYS nhiều (cao hơn 2,6 lần). Như vậy khi sản xuất sinh khối vi khuẩn trên môi trường mới ta sẽ tiết kiệm được chi phí sản xuất vừa tiết kiệm đươc thời gian nuôi cấy. Theo R. G. Benedict và cộng sự, năm 1957 với môi trường chứa 5% sữa bột gầy, 3% protopeptone, 2% glucose, lên men ở nhiệt độ 280C, pH ban đầu 7,0; duy trì pH trong quá trình lên men từ 6,7 – 7,7 và lên men trong 20 giờ, với nồng độ oxy hấp thụ (ORA) là 3.0 thì mật độ tế bào thu được là 260 tỉ tế bào/ml. Trong khi 67
Đồ án tốt nghiệp đó kết quả thí nghiệm ta chỉ đạt được 0,11 tỉ tế bào/ml trong 10 giờ với môi trường sử dụng là 0,3% Meat extract; 0,533% Yeast extract; 1,172% sucrose. Khối lượng hóa chất của môi trường mà Bennedict sử dụng, mặc dù không giống nhau nhưng khối lượng cao gấp gần 10 lần so với lượng hóa chất ta sử dụng, giá thành của các thành phần môi trường ông sử dụng cũng khá cao. Xét về điều kiện nuôi cấy so với thí nghiệm của Benedict và cộng sự, 1957 thì trong các thí nghiệm này do thiếu thiết bị nên không thể kiểm soát được nhiệt độ cũng như pH trong quá trình lên men mà chủng vi khuẩn S. marcescens lại khá nhạy cảm với nhiệt độ (nhiệt độ phòng trong thời gian khảo sát từ 30-380C) nên hiệu quả lên men có phần chưa cao. Nhưng so với môi trường NB thì môi trường mới (MYS) vẫn cho kết quả tốt hơn. 68