Luận văn Nghiên cứu cải biến Chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu cải biến Chitosan nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

1. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN Đ TÀI NGHIÊN CU CI BIN CHITOSAN NHM TĂNG CƯNG HOT TÍNH KHÁNG KHUN Đ NG DNG TRONG BO QUN THC PHM LUN VĂN THC SĨ SINH HC Buơn Ma Thut, năm 2009
2. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN . LÊ PHƯƠNG HÀ TÊN Đ TÀI NGHIÊN CU CI BIN CHITOSAN NHM TĂNG CƯNG HOT TÍNH KHÁNG KHUN Đ NG DNG TRONG BO QUN THC PHM Chuyên ngành: Sinh hc Thc nghim Mã s: 60 42 30 LUN VĂN THC SĨ SINH HC NGƯI HƯNG DN KHOA HC: PGS.TS. NGUYN ANH DŨNG Buơn Ma Thut, năm 2009
3. i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi, các s liu và kt qu nghiên cu nêu trong lun văn là trung thc, đưc các đng tác gi cho phép s dng và chưa tng đưc cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. H tên tác gi Lê Phương Hà
4. ii LI CM ƠN ! Trong quá trình hc tp và hồn thành lun văn tt nghip, tơi xin gi li cm ơn chân thành đn: Ban giám hiu trưng Đi hc Tây Nguyên. Các thy cơ Khoa sau Đi hc, Khoa KHKT&CN Trưng Đi hc Tây Nguyên. Các thy cơ phịng thí nghim Sinh hc thc vt – Khoa Nơng Lâm Nghip Trưng Đi hc Tây nguyên đã đng viên và giúp đ cho tơi sm hồn thành lun văn tt nghip. Ban Giám Hiu, tồn th các anh ch, các bn đng nghip và đc bit là Khoa Trng Trt trưng Cao đng Cơng Ngh và Kinh T Bo Lc đã luơn to điu kin thun li và nhit tình giúp đ tơi trong sut thi gian cơng tác và hc tp. Tơi xin bày t lịng bit ơn sâu sc nht đn PGS.TS Nguyn Anh Dũng, ngưi đã trc tip hưng dn, tn tình ch dy và giúp đ trong sut thi gian hc tp và thc hin lun văn. Xin ghi nhn s giúp đ ca các anh ch trong lp Cao hc Sinh Hc Thc Nghim K1 đã luơn đng viên và giúp đ tơi trong sut quá trình hc tp và nghiên cu ti trưng. Cui cùng tơi vơ cùng bit ơn s quan tâm , khích l ca ngưi thân trong gia đình đã luơn luơn đng viên v mi mt đ tơi hồn thành tt khĩa hc này. Xin chân thành cm ơn! LÊ PHƯƠNG HÀ
5. iii MC LC Trang Các ch vit tt i Danh mc nh ii Danh mc bng iv Danh mc hình v M ĐU . 1 Phn 1: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tng quan v chitosan và chitosan oligomer 3 1.1.1. Cơng thc cu to .3 1.1.2. Tính cht ca chitosan 4 1.1.3. Các đc tính ca chitosan 6 1.1.4. ng dng ca Chitosan và các dn sut 7 1.1.5. Tình hình nghiên cu ci bin chitosan 15 1.1.6. Các dn sut ci bin ca Chitosan 20 1.1.6.1. Chitooligosaccharide .20 1.1.6.2. Các dn sut ca Chitosan .21 1.1.7. Kh năng kháng khun ca Chitosan và dn sut 25 1.2. Tình hình bo qun thc phm hin nay 26 1.3. Mt s đc đim ca đi tưng nghiên cu 27 1.3.1. Vi khun Escherichia coli 27 1.3.1.1. Đc đim chung 27 1.3.1.2. Đc đim sinh vt 28 1.3.1.3. Phịng và tr 28 1.3.2. Vi khun Staphylococcus aureus 28
6. iv 1.3.2.1. Đc đim chung 28 1.3.2.2. Phịng bnh và cha bnh 29 Phn 2: NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 2.1. Ni dung nghiên cu 30 2.2. Phương pháp nghiên cu 30 2.2.1. Đa đim nghiên cu 30 2.2.2. Vt liu hố cht 30 2.2.3. Thit k thí nghim 30 2.2.3.1. Phương pháp nuơi cy vi khun 30 2.2.4. Các bưc tin hành 31 2.2.5. Phương pháp nghiên cu ci bin chitosan 32 2.2.5.1. Phương pháp ci bin chitosanglucose 32 2.2.5.2. Phương pháp ci bin chitosanglucosamine 33 2.2.6. Phương pháp nghiên cu kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin 33 2.2.6.1. Xác đnh kh năng kháng khun bng phương pháp đo đ đc 33 2.2.6.2. Xác đnh kh năng kháng khun bng phương pháp khuych tán trên đĩa 34 2.2.7. Phương pháp th nghim các dn sut chitosan ci bin trong bo qun thc phm 34 2.2.8. Phương pháp x lý s liu 37 PHN 3: KT QU VÀ THO LUN 38 3.1. Nghiên cu ch to dn sut Chitosan ci bin 38 3.1.1. nh hưng khi lưng phân t ca chitosan và t l nng đ chitosan/glucose đn phn ng Maillard 38 3.1.2. nh hưng khi lưng phân t ca chitosan và nng đ đưng glucose đn phn ng Maillard gn glucosamine vào mch chitosan 40
7. v 3.2. Nghiên cu kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin trong invitro 41 3.2.1. Nghiên cu kh năng kháng khun ca chitosan – glucose 41 3.2.2. Kt qu nghiên cu kh năng kháng khun chitosan – glucosamine ci bin 52 3.3. Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan ci bin bng phương pháp khuych tán trên đĩa 62 3.3.1. Đi vi chitosan – glucose 62 3.3.2. Đi vi chitosan – glucosamine 65 3.4. Nghiên cu th nghim các dn sut chitosan ci bin trong bo qun thc phm 67 3.4.1. Đi vi chitosan – glucose 67 3.4.1.1. nh hưng ca nng đ chitosan – glucose đn trng thái cm quan ca tht trong quá trình bo qun 67 3.4.1.2. nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine đn trng thái cm quan ca tht trong quá trình bo qun 71 PHN 4: KT LUN VÀ Đ NGH 76 4.1. Kt lun . 76 4.2. Đ ngh 76 TÀI LIU THAM KHO 77 Ting Vit 77 Ting Anh 79 PH LC
8. vi DANH MC CÁC KÝ HIU, CÁC CH VIT TT CGC Chitosan – glucose CT1 Cơng thc 1 CT2 Cơng thc 2 CT3 Cơng thc 3 ĐC Đi chng TCVN Tiêu chun Vit Nam CV Coefficient of Variation Da Daton ppm parts per million CGC chitosan glucose LMWC khi lưng phân t thp PEG polyethylene glycol
9. vii DANH MC BNG Trang Bng1.1: . nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan đn kh năng kháng khun 17 Bng 1.2: Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca chitosan và DEMC 18 Bng 2.1: Cơ s cho đim tht bị theo TCVN 321579 37 Bng 2.2: H s quan trng ca các ch tiêu cm quan ca tht 38 Bng 2.3: Bng phân cp cht lưng tht . 38 Bng 3.1: nh hưng ca khi lưng phân t và nng đ đưng glucose đn mc đ phn ng Maillard 40 Bng 3.2: nh hưng ca khi lưng phân t và nng đ đưng glucosamine đn mc đ phn ng Maillard 41 Bng 3.3: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 30000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 43 Bng 3.4: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 30000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus 45 Bng 3.5: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 300000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 46 Bng 3.6: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 300000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus 48 Bng 3.7: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 50 Bng 3.8: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus 51 Bng 3.9: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 30000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus .53
10. viii Bng 3.10: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 30000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 55 Bng 3.11: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 300000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus 56 Bng 3.12: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 300000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 57 Bng 3.13: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 700000 Da đi vi vi khun Staphylococcus aureus 59 Bng 3.14: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 700000 Da đi vi vi khun Escherichia coli 60 Bng 3.15: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucose bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun S. aureus 62 Bng 3.16: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucose bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun Escherichia coli .63 Bng 3.17: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun Staphylococcus aureus 64 Bng 3.18: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun Escherichia coli .65
11. ix DANH MC HÌNH V, CÁC Đ TH Trang Hình 1.1: Cu trúc ca chitin, chitosan và cellulose 3 Hình 3.1: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 30000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 67 Hình 3.2: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 67 Hình 3.3: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 700000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 68 Hình 3.4: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 30000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 69 Hình 3.5: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 69 Hình 3.6: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 700000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 70 Hình 3.7: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 30000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 71
12. x Hình 3.8: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 300000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 71 Hình 3.9: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 700000Da nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 72 Hình 3.10: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 30000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 72 Hình 3.11: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 300000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 73 Hình 3.12: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 700000Da nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht 73
13. ĐT VN Đ V sinh an tồn thc phm là mt trong nhng mi quan tâm chung ca tồn xã hi và là vn đ thi s đưc dư lun quan tâm, nht là khi các cơ quan chc năng mi phát hin hàng lot nhng vi phm nghiêm trng v v sinh an tồn thc phm. Khi xu hưng s dng các loi thc phm ch bin sn ca th trưng đang gia tăng, đc bit là đi vi các sn phm tht ch bin c truyn ca Vit Nam như giị la, nem chua, lp xưng, xúc xích đưc ngưi tiêu dùng ngày càng ưa chung. Tuy nhiên, theo báo cáo ca Chi cc Thú y Thành ph H Chí Minh (1999) cho thy 5060% mu xét nghim khơng đt tiêu chun vi sinh và sinh hĩa. Ng đc thc phm do vi khun và đc t ca nĩ thưng xy ra do thiu sĩt trong quá trình ch bin, cơng tác kim tra, thanh tra thc phm và nguyên liu dùng đ ch bin thc phm. Loi ng đc này thưng do Salmonella enteritidis , Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Hin nay, đ bo qun các loi thc phm tươi như tht, cá, giị ch phn ln ngưi ta đã s dng các cht hĩa hc như phân urê, hàn the, benzoate natri, trong nưc mm cĩ urê hay s dng formon trong làm bánh ph, hàn the đ làm ch nem, hu ht các cht này khi vào cơ th tích t lâu ngày s gây nh hưng đn sc khe ca con ngưi và nghiêm trng hơn na là gây ra các bnh ung thư và làm gim giá tr ca thc phm. Chitosan là mt polimer sinh hc, đưc tách t v tơm, cua, cơn trùng, giáp xác và t bào nm. Chitosan là mt polyglucosamin đưc cu to t các gc glucosamin kiên kt vi nhau bng liên kt β 1,4 glucoside. Chitosan và các sn phm thy phân ca chitosan là chitosan oligomer là các sn phm ca t nhiên, khơng đc, khơng gây ơ nhim mơi trưng nhưng cĩ hot tính sinh hc rt cao. Chitosan đưc chng minh là mt cht cĩ hot tính kháng khun, chng nm và chng oxi hĩa nh tính cht polycation t nhiên nên cĩ nhiu ng dng trong nơng nghip và bo qun thc phm. Tuy nhiên, enzyme ca
14. 2 mt s vi khun tit ra cĩ kh năng phân hy và làm mt hot tính ca chitosan. Vì vy, đ tăng cưng hot tính kháng khun, hn ch kh năng phân hu ca enzyme do vi sinh vt tit ra, cn phi ci bin thay đi cu trúc ca chitosan. Xut phát t thc tin đĩ, chúng tơi tin hành nghiên cu đ tài: “Nghiên cu ci bin chitosan nhm tăng cưng hot tính kháng khun đ ng dng trong bo qun thc phm ”. Mc tiêu ca đ tài là: 1. Ci bin chitosan nhm nâng cao hot tính kháng khun. 2. Th nghim ng dng chitosan ci bin trong bo qun thc phm.
15. 3 Chương 1: TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Tng quan v chitosan và chitosan oligomer 1.1.1. Cơng thc cu to Chitosan là mt polymer sinh hc vi các đơn phân Nacetyl glucosamine đưc deacetyl hố mt phn, hin din t nhiên trong vách mt s ging nm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42]. Tuy nhiên, phn ln lưng chitosan hin đang đưc thu nhn và s dng li ch yu t quá trình deacetyl hố chitin, thành phn chính ca trong b xương ngồi ca đng vt giáp xác như tơm, cua hay mc. Chitosan d tan trong các acid hu cơ như axít lactic, axít acetic. Khi phân hy chitosan bng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme chitosanase, cellulase hoc bc x gamma s to nên các sn phm cĩ chiu dài mch ngn hơn gi là oligoglucosamine. Hình 1.1 : Cu trúc ca chitin, chitosan và cellulose.
16. 4 Chitosan là dn xut deacetyl hĩa ca chitin, trong đĩ nhĩm (NH 2) thay th nhĩm (COCH 3) v trí C(s 2). Chitosan đưc cu to t các mt xích Dglucosamine liên kt vi nhau bi liên kt b(14glicoside, do vy chitosan cĩ th gi là poly b(1,4)2amino2deoxiDglucose hoc là poly b (14)Dglucosamine (cu trúc bc III). Các đơn v cu to nên phân t chitosan là Dglucosamine hay (1,4) 2amino2deoxyDglucose. 1.1.2. Tính cht ca chitosan a. Tính cht vt lý Chitosan là cht rn, xp, nh, màu trng ngà, khơng mùi, khơng v, hịa tan d dàng trong các acid hu cơ như axít lactic, axít acetic. Ngay t năm 1968, K.Arai và cng s đã xác đnh chitosan hu như khơng cĩ tính đc, khơng gây đc trên đng vt thc nghim và ngưi. Nhiu tác gi ch rõ chitosan, chitosan glucosamine cĩ nhiu ưu đim: tính cht cơ hc tt, khơng đc, d to màng, hịa hp sinh hc khơng nhng đi vi đng vt mà cịn đi vi các mơ thc vt. b. Tính cht hĩa hc Phân t lưng t 10 1000 kDa tùy theo điu kin sn xut. Mc đ deacetyl hố thưng t 70% đn 100%. Nhit đ nĩng chy t 309 oC đn 311 oC tùy theo trng lưng phân t và mc đ deacetyl hố. Chitosan tan trong dung dch lỗng các axít hu cơ như axít acetic, axít formic, axít adipic, axít propionic và mt s axít vơ cơ. Ba thuc tính cơ bn nht ca chitosan là: phân t lưng, mc đ deacetyl hố và đ tinh sch. Trong phân t chitosan cĩ cha các nhĩm chc –OH, NHCOCH 3 trong các mt xích axetylDglucosamine và nhĩm –OH, nhĩm –NH 2 trong
17. 5 mt xích Dglucosamine cĩ nghĩa chúng va là ancol va là amin, va là amit. Phn ng hĩa hc cĩ th xy ra v trí nhĩm chc to ra dn xut th O, dn xut th N hoc dn xut th O, N. Mt khác chitosan là nhng polimer và các monomer đưc ni vi nhau bi các liên kt b(1,4)glicoside, các liên kt này rt d b ct đt bi các cht hĩa hc như: acid, bazơ, tác nhân oxy hĩa và các enzime thy phân. * Các phn ng ca nhĩm –OH Phn ng ca nhĩm –OH cĩ th to ra các dn sut. Dn xut sunfat. Dn xut Oaxyl ca chitin/chitosan. Dn xut Otosyl hĩa chitin/ chitoan. * Phn ng v trí N. Phn ng Nacetyl hĩa chitosan. Dn xut Nsunfat chitosan. Dn xut Nglycochitosan(Nhydroxyletylchitosan). Dn xut acroleylen chitosan. * Các phn ng xy ra ti v trí O, N. Dn xut O,Ncacboxymetylchitosan. Dn xut N,Ocacboxymetylchitosan. Phn ng ct đt liên kt b(1,4) glycoside. c. Các phương pháp thu nhn chitosan oligomer Đ thu nhn chitosan oligomer t chitosan hin nay cĩ 3 phương pháp ch yu: Phương pháp hĩa hc Đây là phương pháp khá đơn gin, s dng các axít clohidric (612N) đ thy phân, nhit đ thy phân t 80100 0C Domard,(1989). Tuy nhiên nhưc đim ca phương pháp này là chi phí dành cho thit b cao, phi cĩ thit b chng ăn mịn axít, gây ơ nhim mơi trưng và nht là hiu sut thu
18. 6 hi các phân đon oligoglucosamine cĩ hot tính thp, sn phm là các monomer là glucosamine cao (>30%). Phương pháp phân hy bng bc x gamma Bc x gamma tăng cưng đ deacetyl hĩa và gim bt trng lưng phân t ca chitosan. Quá trình deacetyl hĩa kim mnh trng lưng phân t ca chitosan gim t 890 kDa đn 380 kDa (bc x 50 kGy ) và 200 kDa (bc x 75 kGy ). Điu ch chitosan oligomer đưc thc hin bi axít clohidric và cellulase N.A.Dzung, (2001)[8]. Phương pháp emzyme Đ thy phân chitosan cĩ th s dng nhiu loi enzyme như chitosanase, celluloase, glucanase. Phương pháp này đưc s dng khá rng rãi hin nay (Muraki, 1993; Aiba, 2002). Phương pháp này cĩ nhiu ưu đim như: + Hiu sut thu hi các phân đon cao. + Điu kin din ra phn ng thy phân nh nhàng, nhit đ thp, pH ơn hịa nên chi phí thit b thp, khơng gây ơ nhim mơi trưng. + Nhưc đim ca phương pháp này là chi phí dành cho enzyme khá cao. 1.1.3. Các đc tính ca chitosan Chitosan cĩ ng dng rt rng rãi trong các ngành cơng, nơng nghip, y dưc, thc phm nh vào nhng đc tính sau Antoni (2005)[73]: - Tính cht đa đin ly mang đin tích dương (cationic polyelectrolyte) cho phép gn kt vi các thành phn sinh hc mang đin tích âm. - Cĩ th tái sinh theo con đưng sinh hc trên trái đt. - Cĩ kh năng thy phân sinh hc bng enzyme trong cơ th. - Cĩ kh năng tương hp sinh hc vi các cơ quan, mơ và t bào đng thc vt. - Cĩ kh năng kích thích quá trình đơng máu và làm lành vt thương.
19. 7 - Cĩ kh năng tương tác chuyên bit vi các thành phn ca cht nn ngoi bào và các nhân t tăng trưng. - Gim cholesterol do liên kt cĩ chn lc vi các lành axít béo. - Khơng gây đc do các sn phm sau thy phân đu là các cht chuyn hố t nhiên. - Khơng gây đáp ng min dch trong mơ và cơ quan đng vt. - Cĩ tác dng h tr trong điu hịa min dch. - Cĩ th x lý to nhiu dng sn phm như dng ming, màng, tm xp, si, ht, bt mn, bơng và gel. 1.1.4. ng dng ca chitosan và các dn sut Hin nay, chitosan, chitin và chitosan oligomer là mt trong nhng vt liu mi đã và đang đưc ng dng rt ph bin trong các lĩnh vc như: cơng nghip thc phm, m phm, nơng nghip, dưc phm, y t, mơi trưng, cơng ngh sinh hc và vt liu mi. Tt c các ng dng ca chitosan ph thuc ch yu vào các tính cht lý hĩa và sinh hc như: các thuc tính lưu bin hc, hot tính kháng khun, điu chnh min dch, làm lành vt thương và đơng máu, liên kt vi enzyme, hp thu kim loi, to màng và gel Tùy vào lĩnh vc ng dng mà ngưi ta s dng chitosan các mc đ tinh sch khác nhau. Chitin, chitosan và oligoglucosamine đu là các sn phm cĩ ngun gc t nhiên, khơng gây đc hi cho con ngưi và gia súc, cĩ kh năng phân hu sinh hc và khơng gây ơ nhim mơi trưng. • ng dng ca chitosan trong cơng nghip + X lý nưc thi, hp thu kim loi nng Hin nay, phương pháp hĩa lý là phương pháp tin dng và ph bin trong h thng x lý nưc thi ca các nhà máy cơng nghip. Tuy nhiên, bt li chính ca phương pháp này là nguy cơ gây ơ nhim mơi trưng. Vì th, vic tìm ra mt phương pháp "xanh" (phương pháp an tồn vi mơi trưng) là
20. 8 rt cn thit. Do cĩ ngun gc t t nhiên và cĩ kh năng thy phân sinh hc, chitosan là mt cht thay th hp lý. Chitosan đã đưc s dng trong quá trình lc nưc t khong 3 thp niên trưc. Các nghiên cu đã cho thy chitosan cĩ kh năng: Hp thu kim loi nng: chitosan mang đin tích dương kt hp vi nhng polymer đa đin âm to phc vi các ion kim loi và kt ta. Chitosan cũng cĩ th đưc s dng như mt cht hp th đ tách các đng v phĩng x nguy him t nưc b nhim phĩng x và thu hi uranium t nưc bin và nưc ngt. Loi b 100% các polyme hin din trong nưc thi. Gim mùi hơi khĩ chu (do làm gim s lưng vi sinh vt gây thi) Mt s ng dng m rng khác bao gm: x lý vt du loang, x lý nưc thi sinh hot, tái s dng nưc h bơi, thu hi protein và khống t nưc thi nơng nghip, phân lp các cht cĩ hot tính sinh hc trong nưc tiu và tách các đc t t dung dch. + Trong cơng nghip sn xut thc phm Chitosan đưc dùng như mt thành phn trong thc phm Nht và Châu Âu t khong 20 năm trưc. Cht này cĩ tác dng n đnh màu, mùi v ca thc phm. Ngồi ra, chitosan cịn th hin tác dng tuyt vi trong bo qun thc phm. M, cht này đưc s dng đ "by" lipid trong thc phm chc năng chng béo phì. Chitosan đưc ưa chung khơng ch vì cĩ tác dng như cht xơ, thành phn quan trng trong khu phn ăn, mà cịn gn vi lipid trong d dày và rut to thành mt dng cht mà cơ th khơng th hp thu và s đưc loi thi ra ngồi. Các nghiên cu cho thy chitosan gn đưc vi lưng cht béo gp 4 ln khi lưng ca chúng Andreu (2003)[14].
21. 9 + Trong cơng nghip m phm Chitosan là loi polymer tích đin dương t nhiên duy nht cĩ kh năng chuyn thành dng dung dch nht khi hịa tan trong mơi trưng acid yu. Nh tính cht này mà chitosan đã đưc ng dng rt nhiu trong sn phm chăm sĩc tĩc như du gi, du x và sn phm to np Harida (1996)[74]. Ngồi ra, chitosan cũng đưc dùng trong m phm chăm sĩc da, mĩng tay do cĩ các tính cht như bo v, duy trì đ m, to màng trên da đng thi gn kt vi các dưng cht cn thit, to điu kin cho các cht này hot đng tích cc trên da. Tính kháng khun ca chitosan cũng gĩp phn vào cơng dng ca chitosan trong các sn phm m phm và chăm sĩc cá nhân. Các ng dng c th ca chitosan trong lĩnh vc này bao gm: Duy trì đ m trên da, tr mn, làm da khe hơn, tươi hơn, bo v lp biu bì. Gim s tích đin trên tĩc (gây thương tn tĩc), tr gàu, giúp cho tĩc mm mi hơn, Andreu (2003)[14]. + Trong mt s cơng nghip khác Tăng đ bn cơ hc và đ mn ca giy, tăng cht lưng in trên giy do thm mc in tt hơn. Chitosan cĩ th đưc dùng làm cht cm màu trong khi nhum và in si dt. Kh năng kháng khun giúp vi bn hơn. Ci tin quá trình in nh khi cĩ mt trong nhũ tương bc cn quang. Chitosan cũng cịn đưc dùng làm cht bt hình đen trng • ng dng ca chitosan trong nơng nghip Chitosan đưc s dng như mt cht thay th an tồn cho các cht hố hc t lâu vn đưc s dng cĩ th gây hi đn mơi trưng và sc khe con ngưi. Chitosan tác đng h tr vào cơ ch phịng v thc vt (như trưng hp vaccine đi vi con ngưi), kích thích s tng hp và tit mt s loi
22. 10 enzyme như phytoalexin, chitinase, pectinase, glucanase và lignin (Andreu, 2003)[14]. Các ng dng ch yu ca chitosan trong nơng nghip gm cĩ: + Phĩng thích chm các hp cht vào trong đt Trong nơng nghip, vic kéo dài thi gian tác dng ca phân bĩn, cht điu hịa tăng trưng hay cht dinh dưng là rt cn thit. Chitosan đưc s dng như cht mang t nhiên đ kp hp và phĩng thích t t các hp cht mong mun vào trong đt. Chitosan b phân hy sinh hc trong đt trong khong 2 tháng, kèm theo s phĩng thích các cht. Do đĩ, ngưi ta tit kim đưc đáng k lưng cht s dng và thi gian bĩn lp khi dùng chitosan làm cht mang. + V bao ca ht Hot đng chitinase đưc gia tăng trong giai đon ny mm khi b mt ca ht ging đưc bao bng mt lp chitosan. Khi s dng chitosan làm v bao ca ht, kh năng kháng nm và vi khun ca chitosan h tr hu hiu cho s ny mm và s phát trin ca cây trng. + Cht b sung vào thc ăn gia súc Các kho sát liên quan đn vic b sung chitin và chitosan vào thc ăn gia súc cho mt s kt qu sau: gà mái và gà giị, chitin và chitosan cho ăn hu như đưc tiêu hố hồn tồn. th khong 30% lưng chitin cho ăn đưc tiêu hố hồn tồn. T l này hu như khơng thay đi sau 25 ngày cho ăn liên tc. Trong khi đĩ, chitosan đưc tiêu hố 35% sau 5 ngày cho ăn và kh năng này tăng ti 80% sau 15 ngày. Điu này cĩ l là do s gia tăng s lưng vi khun đưng rut, Antoni (2005)[73].
23. 11 + Kích thích tăng trưng thc vt Hin nay, oligoglucosamine đưc xp vào nhĩm điu hồ sinh trưng th h mi (Zubay, 1998)[75]. Hin nay đang đưc nghiên cu s dng trong nuơi cy mơ thc vt cho phong lan (Nagasawa, 2002, Khin Lay Nge, 2002). Chvagrit (2002) th nghim chitosan chiu x đ kích thích sinh trưng cho phong lan sau 30 ngày sinh khi r và cây tăng t 2060% so vi đi chng nng đ thích hp nht là 50 ppm. (Sasitorn, 2002) phun chitosan cho rau ci cĩ th tăng năng sut t 1331%. Cơ ch tác đng ca chitosan, oligoglucosamine đã đưc làm sáng t bng k thut sinh hc phân t. (Hadwiger, 2002)[76] đã chng minh oligoglucosamine là tín hiu phân t hot hố và tăng cưng hot đng ca hàng lot gen trong h thng đ kháng ca thc vt và các gen liên quan đn trao đi cht như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cưng tng hp phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cưng tng hp xenlulose, lignin, Tình hình nghiên cu ng dng chitin, chitosan và nht là oligoglucosamine cịn khá mi m. (Nguyn Quc Hin, 1999) cĩ nghiên cu thu nhn các oligoalginate tách ra t rong bin đ s dng trong nơng nghip. Sau đĩ, (Nguyn Quc Hin, Phm Th L Hà, 1999) cũng nghiên cu ch to chitosan oligomer bng k thut bc x gamma. Tuy nhiên, phương pháp này cịn cĩ nhiu nhưc đim so vi phương pháp enzyme là giá thành cao, các phân đon oligomer cĩ khi lưng phân t khơng tp trung, vì vy hot tính sinh hc thưng thp. Ngồi ra, Vit nam chitosan cịn đưc nghiên cu trong bo qun trái cây như chui, vi thiu, cà chua, dưa chut (Châu Văn Minh, 1996). Sn phm đưc bo qun lâu hơn, màu sc tươi t nhiên hơn so vi đi chng. + Thuc bo v thc vt sinh hc Chitosan và chitosan oligomer cĩ hot tính kích thích tăng trưng thc vt, tăng s lưng vi sinh vt cĩ li và hn ch các nm gây hi trong đt, hot hĩa tăng cưng h thng đ kháng ca thc vt.
24. 12 (Suwalee, 2002) th nghim phun chitosan cho cây ngơ đ tr bnh bc lá, kt qu cho thy nu s dng nng đ 80 ppm thì chitosan hiu qu hơn và an tồn hơn so vi các loi thuc bo v thc vt trên th trưng. (Nguyn Anh Dũng, 2006)[62] nghiên cu s dng chitosan oligomer và chitosan oligomer ci bin đ kháng nm Fusarium , vi khun gây bnh héo xanh cho lc Pseudomnas solanacerum và tuyn trùng ký sinh Meloidogine incognita, s lưng tuyn trùng ký sinh gim t 68 ln sau khi tưi chitosan oligomer 3 tháng. (Rabea, 2004) cũng nghiên cu tng hp alkyl và arylchitosan s dng làm thuc tr nm và tr sâu. + Bo qun nơng sn Trong bo qun thc phm, chitosan khơng nhng phát huy kh năng kháng khun và nm, mà cịn giúp điu chnh mơi trưng bên trong rau qu thơng qua kim sốt quá trình trao đi khí gia rau qu và mơi trưng (Nguyn Anh Dũng và các cng s, 1999). Dung dch chitosan đã đưc dùng đ to lp màng bo qun hoa qu và rau c chng vi khun và nm. Nht, dung dch chitosan cũng đưc phun lên táo và cam cho mc đích này. Nghiên cu ca (André Bégin, 2003)[77] cũng đ xut quy trình bo qun dâu bng chitosan. Chitosan cịn đưc s dng đ làm bao bo v chng sương giá (Andreu, 2003)[14]. (Ghaouth, 1996) nghiên cu cho thy chitosan cĩ kh năng c ch các loi nm gây hi sau thu hoch rau qu như Rhizopus, Colletotrichum, chitosan bo qun dâu tươi và các loi trái cây khác lâu hơn do hn ch nm gây hư thi và c ch hơ hp. (Fajado, 1994) cho thy chitosan c ch nm mc sinh đc t A. flavus trên lc, đu tương. S dng chitosan đ bo qun trái cây cũng rt đưc chú ý. Chitosan đã đưc s dng đ bo qun xồi, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002; Varaporn, 2002; Chucheep, 2002). S dng chitosan bao trái cây (coating) cĩ th kéo dài thi gian bo qun 15 ngày nhit đ phịng so vi đi chng.
25. 13 (Hong Kyoon No, Na Young Park, Samuel P. Meyers, 2002) cho thy chitosan cĩ hot tính kháng khn cao hơn chitosan oligomer. Chitosan đã c ch s sinh trưng ca hu ht các loi vi khun và cĩ hiu qu kháng khun đi vi vi khun gram dương cao hơn vi khun gram âm. Chitosan đưc xem như là mt cht ph gia thc phm Hàn Quc và Nht Bn trưc năm 1995 và 1983. Chitosan vi hot tính kháng khun cao s ngăn chn nhng thc phm b hng do vi khun hoc kéo dài thi gian s dng ca thc phm. (Devlieghere, 2004) nghiên cu hot tính kháng khun ca chitosan và ng dng trong bo qun rau qu và thc phm. Chitosan nghiên cu cĩ mc đ deacetyl hĩa 95%, khi lưng phân t 43 kDa. Kt qu cho thy chitosan cĩ kh năng kháng mnh đi vi vi khun gram âm, ch s MIC là < 60 ppm, trong khi đĩ nm men và vi khun gram dương là 100 ppm. • ng dng ca chitosan trong lĩnh vc sinh hc và y hc Đã cĩ rt nhiu th nghim đã đưc tin hành đ xác nhn tính an tồn ca chitosan như: th nghim kh năng gây đt bin; kh năng gây đc cp tính; bán cp tính và mãn tính; kh năng gây st; làm tan máu và gây d ng (Antoni, 2005). S liu ghi nhn trên th, gà mái và gà giị khi đưc cho ăn chitosan vi liu lưng 0,7 0,8g/kg khi lưng cơ th/ngày trong 239 ngày là khơng cĩ triu chng bt thưng nào. Kh năng tiêu hố chitosan biu kin th là 28 38% cịn gà mái, gà giị là hồn tồn. Khi tiêm chitosan và các phân đon chitosan vào th vi liu lưng 4,5mg/kg khi lưng cơ th/ ngày trong 711 ngày, khơng phát hin đưc biu hin bt thưng nào (Antoni, 2005). Trong nghiên cu kéo dài 12 tun trên ngưi, khơng cĩ triu chng lâm sàng nào đưc ghi nhn nhng ngưi ung chitosan trong so vi nhng ngưi ung thuc gi. Ch cĩ 2,6 – 5,4% đi tưng cĩ triu chng bun nơn và táo bĩn tuy nhiên rt nh và tm thi (Lin, 2004). Vi tt c các bng chng trên, vic
26. 14 ng dng các thuc tính qúy giá ca chitosan trong lĩnh vc y sinh là hồn tồn hp lý. + Tác nhân h cholesterol LDL Đã cĩ rt nhiu nghiên cu chng minh kh năng gim cholesterol và m trong máu ca chitosan. Thí nghim trên mơ hình chut quá dư tha cholesterol trong máu do thiu apolipoprotein E đưc tin hành trong 20 ngày. Mi ngày chut thí nghim đưc ăn 5% chitosan trong khu phn thc ăn cịn lơ đi chng thì khơng đưc cho ăn chitosan. Hàm lưng cholesterol trong máu gim đáng k sau 20 tun, ch cịn 64% so vi lơ đi chng. Ngồi ra, kh năng c ch xơ va đng mch ca chut đưc ăn chitosan đng mch ch là 42% và cung đng mch ch là 50%. Chut đưc ăn chitosan cũng ln nhanh hơn rõ rt. Thí nghim này cũng m ra kh năng c ch s phát trin chng xơ va đng mch trong điu tr bnh cho ngưi quá dư tha hàm lưng cholesterol trong máu, (Heller, 1990)[62]. mt nghiên cu khác trên ngưi, chitosan h 5,8 42,6% tng lưng cholesterol trong huyt tương và 15,1 35,1% lipoprotein t trng thp (low density lipoprotein – LDL) trong cơ th (Lin, 2004). + Chitosan dùng làm vt liu sinh hc, y hc và dưc phm Chitosan cĩ kh năng tương hp sinh hc vi mơ và t bào do đĩ cĩ th s dng trong vic cy ghép vào mơ đng vt. Vì vy, ngưi ta đã tin hành ng dng chitosan làm vt liu y sinh hc mi như ch khâu t tan trong phu thut, da nhân to trong điu tr bng và vt thương, kính áp trịng trong điu tr các tt v mt. Gn đây, ngưi ta cũng đã tin hành nghiên cu s dng chitosan dng ng nhm mc đích tái sinh dây thn kinh (Krysteva, 1987). Trong điu tr vt thương, chitosan cĩ tác dng cm máu, đy nhanh quá trình phát trin các t bào vùng mơ b thương, tăng cưng hot đng ca chitinase và lysozyme, dn đn mau lành vt thương và gim nhim
27. 15 trùng[54]. Chitosan đưc báo cáo là bn vi dch mt, dch tu và nưc tiu nên đưc dùng trong ch khâu phu thut thay th cho các loi vt liu khác cĩ th b cht dch trong cơ th tn cơng và đt trưc khi vt thương lành hn Harida (1996). Trong các trưng hp b bng, chitosan cĩ th to thành dng màng xp hút nưc mnh và giúp cho oxy phân tán qua màng vào mơ tn thương rt d dàng, to điu kin cho các mơ này bình phc nhanh chĩng. Trong lĩnh vc dưc phm, chitosan đưc s dng như cht mang an tồn, cĩ kh năng phĩng thích thuc dn dn trong cơ th, kéo dài tác dng ca thuc hay vt liu c đnh enzyme trong sn xut và điu tr. Chitosan cịn đưc dùng đ điu ch các cht làm gim bt đ chua trong d dày và các sn phm ngưng t ca axít benzyl, penicilic vi chitosan đã đưc dùng đ xác đnh đ nhy penicilin trong cơ th ngưi. + Đc tính chng ung thư ca chitosan Chitosan cĩ kh năng trung hịa acid và cĩ hot tính chng ung thư. Điu này đã đưc kim chng chĩ và chut. Ngưi ta cho rng chitosan cĩ đc tính tương t vi các cht bao vùng d dày. Ngồi ra, chitosan cịn đưc ng dng trong điu tr bnh nhân ung thư đưc x tr và hố tr liu. Kt qu cho thy chitosan giúp gim thiu s thay đi v th trng, các ch tiêu huyt hc và sinh hố bnh nhân đưc điu tr bng x và hố tr liu (Nguyn Anh Dũng và cng s, 1996)[1]. + Đc tính kháng khun ca chitosan Hot tính kháng khun ca chitosan và các dn xut ca nĩ đã nhn đưc s quan tâm đáng k trong nhng năm gn đây. Cơ ch kháng khun ca chitosan là nh mt s cơ ch sau: Chitosan là mt polycationic, chúng tương tác vi thành phn polyanion vách t bào (polysaccharides và protein) ca vi sinh vt, kt qu là
28. 16 s rị r thành phn ni bào do các thay đi trong tính thm ca hàng rào (barrier), ngăn cn cht dinh dưng đi vào t bào, ngăn cn s nhp vào t bào (đc bit là chitosan cĩ khi lưng phân t thp LMWC ). Chitosan cĩ kh năng kt hp vi DNA và nh vy chitosan cĩ kh năng c ch tng hp RNA và protein. Chitosan cĩ kh năng gn kt gây đơng t, kt ta t bào vi khun và dn đn git cht t bào. Chitosan cho thy mt ph kháng khun rng kháng li c nm và vi khun gramdương và Gram âm (Vishu Kumar, Varadaraj, Gowda, & Tharanathan, 2005). Hong Kyoon No (2004) nghiên cu nh hưng ca sáu loi khi lưng phân t khác nhau ca chitosan, chitosan oligomer đn kh năng kháng khun trên 7 loi vi khun gram dương và 4 vi khun gram âm. Kt qu thy rng chitosan cĩ khi lưng phân t cao cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan oligomer cĩ khi lưng phân t thp hơn. Hot tính kháng khun ca chitosan mnh hơn vi khun gram âm hơn là vi khun gram dương. Ch s MIC ca chitosan bin đng trong khong 0,050,1% tùy thuc vào khi lưng phân t và loi vi khun. Hong Kyoon No (2004) cũng khng đnh rng hot tính kháng khun ca chitosan th hin tt hơn mơi trưng pH thp.
29. 17 Bng1.1: nh hưng ca khi lưng phân t ca chitosan đn kh năng kháng khun. Vi khun Bt Kim Phân t lưng (kDa) 1 đu sốt 1 1671 1106 746 470 224 28 Gram () Escherichia coli 6,92 8,59 4,94 b 5,59 c 4,28 a 4,66 a 5,48 c 5,61 c Pseudomonas 6,64 8,79 3,76 b 5,47 c 1,57 a 6,45 d 7,70 c 6,17 d flourescens Salmonella 6,54 8,62 4,89 b 8,13 d 5,21 c 4,28 a 8,23 d 8,62 c typhimurium Vibrio 6,64 8,79 5,49 c 5,31 c 4,50 b 3,29 a 5,39 c 5,85 d parahaemolyticus Gram (+) Listeria monocytogenes 6,36 8,31 ND 2a 3,10 d ND a 3,57 c 0,30 b 2,38 c Bacillus megaterium 5,25 8,51 0,99 a 3,62 c 1,69 ab 2,23 b 2,09 b 2,48 b Bacillus cereus 5,72 7,54 2,32 c 1,60 b ND a ND a 2,27 c 2,15 c Staphylococcus aureus 6,55 8,11 0,53 a 1,58 b ND a ND a 1,47 b 2,34 c Lactobacillus 5,69 8,45 3,56 c 0,54 b 0,54 b 4,80 d ND a ND a plantarum Lactobacillus brevis 6,44 9,31 1,78 c ND a 4,55 c 4,29 d 1,09 b 1,08 b Lactobacillus 6,78 9,02 4,62 d 1,93 b 5,92 c 6,48 f 1,01 a 2,40 c bulgaricus af giá tr trung bình trung bình vi mc ý nghĩa (p<0,05) 1 s t bào sng sĩt sau khi nuơi cy khơng cĩ (mu kim chng) và cĩ b sung 0,1% chitosan trong 24h 37 0C 2ND=khơng xác đnh Nguyn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cu kh năng kháng E.coli ca chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer ci bin bng cách gn vi salicylic aldehyde đã làm gia tăng hot tính kháng khun lên nhiu ln. MIC ca chitosan đi vi E. coli khong 250 ppm, oligoglucosamine khong 80 100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) ch cịn 3040 ppm. Mui ammonium bc bn ca chitosan th hin hot tính kháng khun rt cao. Ví d: diethylmethylchitosan cloride th hin hot tính kháng khun cao hơn chitosan. Hydroxypropyl chitosan ghép vi axit maleic natri c ch hơn 99% vi khun S. aureus và E. coli trong 30 phút tip xúc vi nng đ 100 mg/ml.
30. 18 Avadi (2004) nghiên cu ch to dn sut diethylmethylchitosan (DEMC) đ tăng kh năng hịa tan trong dung mơi, nưc và tăng tính kháng khun gp hai ln so vi chitosan khơng ci bin. Bng 1.2: Ch s MIC (g/ml) và MBC (g/ml) ca chitosan và DEMC Mơi trưng Kim chng (mu trng) Chitosan DEMC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Nưc ct 500 500 AcOH 0,25% khi 2500 2500 250 250 125 125 lưng AcOH 0,5% khi 2500 2500 225 225 110 110 lưng AcOH 0,75% khi 1250 1250 158 158 87,5 87,5 lưng AcOH 1,00% khi 1250 1250 125 125 62,5 62,5 lưng 1.1.5. Tình hình nghiên cu ci bin chitosan Theo nhiu nghiên cu khng đnh hot tính kháng khun ca chitosan là nh 3 cơ ch sau: + Chitosan là polycation t nhiên (NH 3 ) cĩ kh năng liên kt cht vi màng vi khun là polyanion, làm ri lon trao đi cht qua màng và gây cht t bào. Chitosan cĩ khi lưng phân t nh cĩ kh năng đi qua màng sinh cht, liên kt vi nhim sc th ca vi khun (đin tích âm), ngăn cn quá trình sao chép, sinh tng hp protein. Chitosan cĩ hot tính gây đơng t (coagulation) các t bào vi khun, c ch vi khun sinh trưng. Tuy nhiên, cĩ mt s vi khun cĩ hot tính chitinase, chitosanase và cellulase ngoi bào nên cĩ kh năng phân hy đưc chitosan, làm gim hot tính kháng khun. Vì vy hin nay trên th gii cĩ 3 xu hưng ci bin
31. 19 chitosan đ làm thay đi cu trúc đ làm gim hot tính ca enzyme ngoi bào ca vi khun và tăng hot tính kháng khun: Ci bin bng cách tăng đin tích dương ca chitosan. Ci bin bng cách to nhánh vi các phân t đưng. Ci bin bng cách to dn sut vi các gc hĩa hc khác như phosphate, sulfate, salicylic, Nguyn Anh Dũng (2003) nghiên cu ci bin to dn sut salicyden chitosan đ nâng cao hot tính kháng khun. Kt qu cho thy ch s MIC ca chitosan oligomer là 100 ppm, trong khi đĩ salicyden chitosan oligomer ch cĩ 30ppm. YingChien Chung và các cơng s (2005) nghiên cu ci bin chitosan khi gn các gc đưng glucose, glucosamine, maltose và fructose bng phn ng Maillard đ tăng kh năng hịa tan và kháng khun ca chitosan. Kt qu cho thy: xét v tính tan, αchitosan phù hp vi chun b chitosan hồ tan trong nưc hơn là βchitosan. pH ti là 3,3 vi nhit đ phn ng là 65 oC. Hiu sut ti ưu trong các kt qu ca dn sut chitosan đt đưc vào các ngày (t 2 đn 6 ngày) và ph thuc vào vic s dng saccharide. Căn c vào các kt qu đi vi hiu sut, tính tan, mc đ deacetyl và pH n đnh, nhiu kh năng chitosan hồ tan trong nưc là dn sut chitosan glucosamin. Dn sut này cho thy kh năng to chelat vi các ion kim loi cao hơn và cĩ hot tính kháng khun cao hơn so vi chitosan hồ tan trong acid. Các kt qu này cho thy rng dn sut chitosan glucosamin sn xut bng phn ng Maillard là mt trin vng thương mi thay th cho chitosan hồ tan trong acid. Sweetie R. Kanatt, Ramesh Chander, Arun Sharma (2007) cho thy phc hp chitosan glucose là cht đ bo qun tt hơn là ch cĩ chitosan, cho thy đĩ là cht chng ơxi hĩa mnh hơn so vi ch cĩ chitosan/glucose. Hot tính kháng khun ca phc hp chitosan/glucose thì ging vi chitosan đi vi các thc phm b hng ph bin và các mm bnh như: E.coli, Pseudomonas spp, S. aureus và B. cereus.
32. 20 Avadi (2004) nghiên cu ci bin chitosan bng cách to dn sut dimethyl ethyl chitosan. Dn sut này cĩ tng đin tích dương tăng đáng k và tăng kh năng kháng khun cũng như hn ch kh năng phân hu do enzyme ngoi bào ca vi khun. Hot tính kháng khun ca dimethyl ethyl chitosan đưc th nghim vi E. coli . Kt qu cho thy, tr s MIC ca dimethyl ethyl chitosan nh hơn gp 2 ln so vi chitosan. Huang (2004) nghiên cu ci bin to dn sut chitosan sulfate đ nâng cao hot tính kháng khun ca chitosan. Kt qu th nghim hot tính kháng khun ca chitosan sulfate cho thy chitosan sulfate c ch mnh vi khun S. aureus, nhưng li khơng c ch E. coli. Kh năng c ch nng đ < 100 microgam/lít đi vi S. aureus cao hơn axít phenic và mt s cht kháng sinh thơng dng. 1.1.6. Các dn sut ci bin ca chitosan Như đã đ cp phn trên, chitosan cĩ phm vi ng dng rt đa dng. Tuy nhiên, kh năng tan hn ch ca chitosan (khơng tan trong nưc, ch tan trong dung dch cĩ pH axít nh ) đã làm gii hn các ng dng trong nhiu trưng hp. Ngưi ta đã c gng tìm ra các phương pháp khc phc nhưc đim này, to ra các loi chitosan tan tt nhm phc v cho mc đích phát huy hiu qu ca chitosan trong các điu kin pH mơi trưng địi hi khác nhau. Các ng dng này chia làm hai hưng cơ bn: Phân ct chitosan to các chitooligosaccharide cĩ kh năng hịa tan pH trung tính và kim. To các dn xut cĩ kh năng hồ tan pH trung tính và kim t chitosan. 1.1.6.1. Chitooligosaccharide Chitooligosaccharide thu đưc t quá trình phân ct ca chitosan và gm mt chui các phân t glucosamine và Nacetyl glycosamine. Xét v tính cht lý hố, chitoolidosaccharide là dng bt màu vàng nht, cĩ v va ngt
33. 21 va đng, tan hồn tồn trong nưc, pH khong 57, tuỳ theo tng mc đích ng dng c th mà chitooligosaccharide đưc sn xut cĩ khi lưng phân t dưi 3 kDa, dưi 6 kDa hay t 6 kDa đn 10 kDa. Các chitoologosaccharide đã lơi cun rt nhiu chú ý ca các nhà khoa hc do kh năng phn ng, thuc tính vt lý và các hot tính sinh hc ca chúng. Chúng cĩ nhiu chc năng sinh lý quan trng như cm ng phytoalexin, kháng khun, kháng ung thư và kh năng kích thích h min dch Galed (2004)[41]. Ngồi ra, chitooligosaccharide cịn đưc chng minh cĩ kh năng ngăn nga tin trin ca bnh tiu đưng và cĩ ái lc vi lipopolysaccharide cao hơn chitosan, Fujii (1978)[40]. Các nghiên cu cũng đã ghi nhn tính kháng khun rt tt và kh năng ng dng làm cht bo qun thc phm ca chitooligosaccharide cĩ s mc đ trùng hp hố (degree of polimerization) khong 816, Dumitriu [33] và cng s (1994), Lê Văn Hip (2008). Trong mt s tài liu, các nhà nghiên cu gi chúng là chitosan cĩ khi lưng phân t thp (LMWC) hoc phân đon B. Tuy nhiên, đ cho thng nht, chúng tơi s dng thut ng chitooligosaccharide đ ch chitosan cĩ mc đ trùng hp hố là 816. + Đ an tồn Mt th nghim v đ gây đc bán cp ca chitooligosaccharide đưc SpragueDawley tin hành trên chut đc và cái. Các nhĩm 36 con chut c đc và cái thí nghim đưc cho ăn các liu 500, 1000 và 2000 mg/kg/ngày trong 4 tun. Các xét nghim v du hiu bnh lý, cân nng, ch tiêu huyt hc, sinh hố và mơ bnh hc đã đưc tin hành. Kt qu cho thy chut trong nhĩm đi chng và các nhĩm thí nghim khơng khác bit v các ch tiêu hình thái ln hành vi. Thêm vào đĩ, cũng khơng cĩ khác bit đáng k trong phân tích nưc tiu, huyt hc, sinh hố máu, khi lưng các cơ quan và mơ bnh hc gia các nhĩm nĩi trên. Vì vy, cĩ th kt lun rng tính đc bán cp ca chitooligosaccharide thp dưi mc phát hin vi mc đ an tồn
34. 22 đưc ghi nhn là 2.000 mg/kg khi xem xét các ch s tác đng bt li đn sc kho chut, Fisk (1996). 1.1.6.2. Các dn sut ca chitosan Như đã đ cp, chitosan cĩ nhiu tính năng ng dng trong rt nhiu lĩnh vc. Tuy nhiên, kh năng tan hn ch đã gây khá nhiu tr ngi cho cht này trong các ng dng thc t. Chitosan ch tan trong dung dch axít yu do cĩ hiu ng proton hố nhĩm amino v trí carbon C2 ca gc glucosamine. Các nhà khoa hc đã và đang nghiên cu các phương thc làm tăng kh năng tan ca chitosan, đng thi vn duy trì và khai thác thêm đưc các tính năng quý giá ca cht này. Ngồi phân ct to các chitooligosaccharide, ngưi ta cũng đã tin hành các bin đi to dn xut t chitosan. • To dn xut ti v trí nhĩm –NH 2 ca C2 S hin din ca nhĩm amino trên phân t chitosan rt hu ích do nĩ mang đn các thuc tính sinh hố quan trng. Các nghiên cu đưc cơng b v kh năng kháng khun ca chitosan nhn mnh đn đ deacetyl hố, hay nĩi các khác là s lưng nhĩm NH 2 cĩ mt trong phân t. S lưng này càng cao thì kh năng kháng khun càng tt, nhĩm NH 2 đã đưc chng minh đĩng vai trị quan trng trong chc năng dit khun ca chitosan (Harish 1996; Harida và cng s 1984)[53] [54]. Ngồi ra, nhĩm amino cũng là mt v trí to thun li cho vic gn thêm các gc hố hc trong phn ng to dn xut. + Gn đưng kh Trong phn ng kh alkyl hố chitosan cĩ s hin din ca tác nhân kh, các đưng đơi kh như glucose, lactose, galactose, glucosamine s đưc gn vào v trí carbon C2 ca chitosan. Phn ng này m mch vịng ca phân t đưng (Chihara 1993; Lee HW và cng s 2003)[28].
35. 23 Bên cnh đĩ, khi thc hin phn ng gia chitosan và các dn xut formylmethyl ca các đưng kh nĩi trên thì s xy ra phn ng gn khơng cĩ s m vịng, Cui (2001)[30] như sơ đ sau: + Gn polyethylene glycol (PEG) PEG là mt polyme ái nưc, nên vic gn PEG lên chitosan cĩ kh năng ci thin tính tan ca chitosan, đng thi vn gi nguyên cu trúc cơ bn ca nĩ, Nguyn Anh Dũng (2004)[9]. Harris (1984) cũng nghiên cu thc hin phn ng kh alkyl hố vi gc aldehyde ca dn xut PEG đưc trình bày như sau, Chihara (1993)[29]:
36. 24 + Gn nhĩm carboxy Các nhĩm carboxy đưc gn vào phân t chitosan to nên thuc tính anion và lưng tính cho dn xut to thành. Carboxymethyl chitosan đưc to thành do phn ng kh ca chitosan và nhĩm aldehyde ca glyoxylic axít vi xúc tác NaCNBH 3, gn nhĩm carboxymethyl vào carbon C2 Harris và các cng s (1984)[56]. • To dn xut ti v trí nhĩm –OH ca C6 Vic to dn xut bng cách gn thêm gc ti v trí carbon C3 và C6 tương đi khĩ hơn gn vào nhĩm amino C2. Chính vì vy, các phn ng vi các điu kin riêng bit phc v cho mc đích này đưc nghiên cu rt k lưng. + Gn đưng αmannose
37. 25 Khi s dng 3Oacetyl2Nphthaloyl chitosan là nguyên liu đ tin hành gn đưng, αmannose đưc gn vào v trí C6. Tương t, βgalactose, glucosamine và Nacetylglucosamine cũng cĩ th đưc gn vào v trí C6 như αmannose, Garnett (1985)[42]. + Gn carboxy Trong mơi trưng phn ng kim mnh gia acid monochloroacetic và chitosan, nhĩm carboxy đưc ưu tiên gn vào carbon C6, Harish (2004). Morimoto và cng s (2002) đã tin hành chc lc gn gc vào v trí carbon C6 bng quy trình: Bo v v trí NH 2 carbon C2 và OH carbon C3. Oxi hố v trí C6[55]. G b cht bo v, tr li gc NH 2 và OH t do. 1.1.7. Kh năng kháng khun ca chitosan và dn sut Chitosan và rt nhiu dn xut ca nĩ th hin kh năng kháng khun rt tt. Tác đng kháng khun thưng din ra rt nhanh (trong vài gi), Borges và cng s (2007). Thêm vào đĩ, chúng đu là các cht cĩ kh năng phân gii sinh hc và khơng gây đc đi vi t bào đng vt hu nhũ. Ph kháng khun ca chúng rng, bao gm c vi khun gram âm và gram dương. Tuy nhiên, cn nhc li là kh năng tuyt vi này b hn ch do tính tan hn ch ca chitosan (khơng tan trong mơi trưng pH >7). Bên cnh đĩ, đ nht cao ca dung dch chitosan cũng là mt tr ngi, gây kt t protein điu kin pH sinh lý. Vì th, chitooligomer và các dn xut đã đưc nghiên cu nhm khc phc nhng vn đ trên.
38. 26 Cơ ch tác đng chính xác ca chitosan và các dn xut lên t bào vi sinh vt thc t vn chưa đưc tìm ra. Nhiu cơ ch khác nhau đã đưc đ ngh đ gii thích kh năng này. Ví d như tính cht đa đin tích dương ca chitosan và các dn xut đã khi đu cho quá trình gn kt lên màng t bào vi sinh vt cĩ đin tích âm. Khi Hwang và các cng s (1998) quan sát t bào vi khun E. coli sau khi x lý bng dung dch chitosan và các dn xut qua kính hin vi đin t truyn qua (TEM), kt qu cho thy màng sinh cht ca t bào b tách ra khi màng trong. Sau khi gn vào t bào, chitosan và dn xut gây nh hưng đn tính thm ca t bào, làm rị r các thành phn sinh cht và t bào cht đi do thiu ht các thành phn này David (1994)[31]. Hay theo mt gi thit khác là chitosan và các dn xut hot đng như tác nhân kp (chelating agent) ly các kim loi dng vt trong t bào cht ca t bào trong khi các kim loi này đĩng vai trị ti quan trng trong chc năng sinh hố ca vi khun. S thiu ht các kim loi này c ch s to thành đc t, enzyme và s tăng trưng ca t bào, Kondo và cng s (2000). Bên cnh đĩ, chitosan và các dn xut cũng đưc cho là c ch quá trình phiên mã to thành mRNA và quá trình dch mã to protein khi đi đưc vào trong nhân t bào (chitooligosaccharide), Klein (1981)[81]. Tĩm li, trên th gii trong nhng năm gn đây đã cĩ nhiu nghiên cu ng dng ca chitosan và các dn xut chitosan trong cơng nghip thc phm như là mt cht bo qun thc phm t nhiên. Tuy nhiên phn ln các nghiên cu cịn qui mơ phịng thí nghim, ít cĩ các nghiên cu thc t trên các thc phm dùng hàng ngày như các loi tht, cá. 1.2. Tình hình bo qun thc phm hin nay Tác dng kháng khun là đc tính quan trng ca chitosan đã đưc rt nhiu nhà khoa hc trên th gii chng minh. Do đĩ vic ng dng chitosan đ bo qun thc phm là rt cn thit và cũng là mi quan tâm ca nhiu nhà khoa hc. Đã cĩ rt nhiu nghiên cu v màng chitosan đ bo qun thc phm:
39. 27 Nghiên cu v c ch vi khun gây hư hng trên các sn phm tht ch bin bng màng chitosan ca tác gi Blaise ouattara, Andrebegin, Gabriel piette, Trung tâm nghiên cu và phát trin thc phm Canada Đi hc Quebec, Canada. Nghiên cu kh năng kháng khun ca màng chitosan bng vic kt hp vi du ti ca tác gi Y.Pranoto, S.K Rakskit và V.M.Salokhe thuc vin cơng ngh Châu Á, Thái Lan. S hp tác nghiên cu gia các nhà khoa hc K.Soontarapa và N.Suwan thuc Trưng Đi hc Chulalongkorn – Thái Lan và K.Tota, S.Mistushita, Kamiya thuc Trưng Đi hc Quc gia Yokohama – Nht đã nghiên cu làm tăng hiu qu trao đi ion, tăng đ kín màng chitosan bng mt s hĩa cht hay cht kích thích . Nghiên cu ch to màng chitosan kt hp vi tinh bt ca Y.X.Xu, K.M.Hana, D.Nag thuc nghành cơng ngh thc phm, Đi hc Nebraska, USA. Màng đưc phi trn bng cách trn chitosan và tinh bt theo t l 1:1 và nng đ tinh bt đưc thay đi, nghiên cu tính cht cơ lý ca màng. + Nghiên cu trong nưc: Hai nhà khoa hc Nguyn Anh Trinh và Bùi Văn Miên, khoa hc cơng ngh thc phm, Đi hc Nơng Lâm thành ph H Chí Minh đã nghiên cu ch to màng chitosan ng dng đ bo qun thc phm giàu đm, d hư hng như tht, cá Đây đưc xem là bao bì cĩ tính năng bo v và cĩ th s dng như thc phm mà khơng hi ti mơi trưng. Màng đưc s dng đ bao bc xúc xích giúp sn phm cĩ hình dáng đp và nĩ cịn cĩ tác dng khơng làm mt màu, mùi v đc trưng ca sn phm. Đng Th Anh Đào và Châu Trn Dim Ái thuc khoa cơng ngh hĩa hc và du khí, Đi hc Bách khoa thành ph H Chí Minh đã ng dng màng chitosan đ bo qun nhãn mơi trưng cĩ nng đ CO 2 cao hơn trong mơi trưng khí quyn. Kt qu là nhãn đưc bao gĩi bng màng chitosan vn gi đưc giá tr thương phm sau 45 ngày bo qun.
40. 28 PGS.TS Trn Th Luyn, Trưng Đi hc Thy sn Nha Trang đã nghiên cu kh năng chu lc và đ giãn ca màng chitosan vi ph liu đng to màng. Nghiên cu màng chitosan cĩ b sung tinh bt ethylen glycol đ bao gĩi tht bị bo qun lnh ca Phm Th Hoa, chuyên ngành Cơng ngh sinh hc trưng Đi hc Thy sn Nha Trang. Đ tài nghiên cu nh hưng ca nng đ chitosan đn thi gian bo qun và cht lưng trái bơ ca Nguyn Th Trâm (2004). 1.3. Mt s đc đim ca đi tưng nghiên cu 1.3.1. Vi khun Escherichia coli 1.3.1.1. Đc đim chung Trc khun rut già Escherichia coli cịn cĩ tên là Bacterium colicommun, Bacillus colicommunis đưc Escherichia phân lp năm 1885 t phân tr em. E. coli thưng cĩ phn sau ca rut, ít khi cĩ d dày và rut non. Bình thưng E. coli cĩ trong rut vi s lưng ln so vi các loi vi khun khác, khi sc đ kháng ca cơ th yu hay gia súc mc bnh nào đĩ thì E. coli phát trin mnh tăng đc lc và gây bnh. 1.3.1.2. Đc đim sinh vt Hình thái E. coli là trc khun hình que, kích thưc dài ngn khác nhau, trung bình t 23 µm, rng 0,5µm, đơi khi trong mơi trưng nuơi cy trc khun dài 68µm. Trong cơ th cĩ hình cu trc khun, đng riêng l loi đơi khi xp thành chui ngn. Phn ln E. coli di đng do cĩ lơng xung quanh thân, nhưng mt s khơng thy di đng. 1.3.1.3. Phịng và tr Do E. coli cĩ rt nhiu typ khác nhau, nên vic ch vaccin và huyt thanh phịng bnh là ht sc phc tp, ngưi ta thưng ch vaccin và kháng huyt thanh đa giá, cũng cĩ th ch vaccin ti ch.
41. 29 Kháng sinh và các hp cht nitrofuran dùng điu tr đi vi Colibasillosis là rt cĩ hiu qu. Các kháng sinh thưng đưc s dng là: biomyxin, teramyxin và xitomyxin. Cn chú ý vic điu tr phi tin hành sm mi cĩ hiu qu cao. 1.3.2. Vi khun Staphylococcus aureus 1.3.2.1. Đc đim chung Staphylococcus aureus là nhng vi khun hình cu, t li thành tng đám thành hình chùm nho. Là loi gây bnh thưng gp nht, nĩ cĩ vai trị và ý nghĩa đi vi y hc và thú y hc, khong 30% ngưi khe mnh mang vi khun này trên da và trên niêm mc, khi cĩ nhng tn thương da và niêm mc hoc nhng ri lon v chc năng thì các nhim trùng do S. aureus d dàng sut hin. S. aureus cũng gây nên các nhim trùng các gia súc nht là trong nhưng cơ s chăn nuơi tp trung cĩ mt đ đàn gia súc ln gây thit hi đáng k v kinh t. Nhng nhim trùng do S. aureus cĩ th gây nên nhiu biu hin khác nhau, nhu các nhim trùng ca da hoc trong các cơ quan ni tng, gây mưng m đin hình, mt s trưng hp chuyn sang chng huyt nhim trùng, chng bi huyt. S. aureus cịn cĩ kh năng hình thành đc t trong thc phm, do đĩ nĩ cĩ th gây nên chúng nhim đc S. aureus là mt trong ba loi thuc ging t cu khun, đưng kính khong 0,7 1m, khơng di đng, khơng sinh nha bào và thưng khơng cĩ v, khơng cĩ lơng, khơng di đng. Trong bnh phm, t cu trưng xp thành tng đơi, tng đám nh hình chùm nho. Khi nhum phương pháp gram, vi khun bt màu gram dương. 1.3.2.2. Phịng bnh và cha bnh + Phịng bnh Phịng bnh bng v sinh: ch yu là gi v sinh chung, trong các thao tác sn khoa, ngoi khoa phi vơ trùng, nhng vt thương phi điu tr đ tránh tr thành ch xâm nhp ca vi khun gây nên nhim khun nng.
42. 30 Phịng bnh bng vaccine: cĩ th dùng vaccine t cu cht hoc vaccine gii đc t ch to t các chng phân lp ti đa phương nơi cĩ dch gi là vaccine chung. Vic dùng vaccine phịng bnh vn chưa đt hiu qu cao nên ít đưc dùng. + Điu tr Cha bnh bng thuc kháng sinh: do đc đim ca t cu rt d kháng thuc, hoc gp phi chng kháng kháng sinh, nên khi dùng thuc kháng sinh ta phi dùng kháng sinh đ. Nhng loi kháng sinh thưng dùng là: nhĩm beta lactamin (penicillin, methicillin, oxacillin), nhĩm aminoside trong đĩ thưng dùng là kanamycin và gentamycin. Cha bnh bng vaccine: trong nhng trưng hp vi khun kháng thuc kháng sinh, ngưi ta cĩ th dùng vaccine đ điu tr, thưng dùng là vaccine t liu hoc vaccine tr liu. Chương 2: NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Ni dung nghiên cu Đ đt đưc nhng mc tiêu đ ra tơi s nghiên cu nhng ni dung sau đây: + Nghiên cu ch to dn sut Chitosan ci bin nhm nâng cao hot tính kháng khun ca chitosan. + Nghiên cu kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin trong invitro. + Nghiên cu th nghim kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin trên thc phm. 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.1. Đa đim nghiên cu Phịng thí nghim B mơn Sinh hc Thc vt trưng Đi hc Tây Nguyên. 2.2.2. Vt liu hố cht
43. 31 Các chng vi sinh vt: Thu thp t B mơn Vi sinh, Đi hc Y Dưc Tp. HCM, bao gm: Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus ATCC 25923 (MSSA). Chitosan mc đ deacetyl hĩa 90%, khi lưng phân t 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa, sn phm ca Kitto life (Hàn Quc). Các hố cht khác như glucose, glucosamine, N acetyl glucosamine, galactose, acid acetic là hĩa cht tinh khit. 2.2.3. Thit k thí nghim 2.2.3.1. Phương pháp nuơi cy vi khun * Vi khun Escherichia coli và Staphilococcus aureus + Mơi trưng nuơi cy Vi khun ( Escherichia coli và Staphilococcus aureus ) đưc nuơi cy trong mơi trưng Nutrient Broth. + Phương pháp gi ging và bo qun Vi khun E. coli và S. aureus đưc nuơi cy thưng xuyên (1 tháng/1 ln) trong ng thch nghiêng cĩ cha mơi trưng Nutrient Broth – agar. Ging đưc cy vào các ng nghim sau 2 ngày s đưa vào t lnh đ bo qun nhit đ 4 0C. + Phương pháp chun b ging đ tin hành thí nghim Chun b 2 ng nghim cha 10ml dung dch mơi trưng Nutrient Broth, đem hp kh trùng. Sau đĩ cy vi khun E. coli và S. aureus vào ng nghim, lc đu, đem trong t m nhit đ 37 0C. Sau 24h dùng ng ging này đ thc hin thí nghim. 2.2.4. Các bưc tin hành Trong phịng thí nghim, tin hành ln lưt như sau: + Chun b ging vi sinh vt Mt ng E. coli + 10ml Nutrient Broth Mt ng S. aureus + 10ml Nutrient Broth
44. 32 Đưc cy t ng ging, đem nuơi t gi nhit vi nhit đ 37 0C trong vịng 24 gi. + Chun b mơi trưng 10ml mơi trưng Nutrient Broth/1 ng nghim. Hp kh trùng 121 0C trong 10 phút. +Thit k thí nghim Trong mt ng nghim cha 10ml mơi trưng Nutrient Broth đã hp kh trùng, cho vào 0,1ml th vn vi khun ( E. coli, S. aureus). Sau đĩ b sung chitosan ci bin cĩ khi lưng phân t khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa, đi chng) vi nng đ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm. Mi thí nghim thc hin 3 ng nghim vi 3 ln lp li, mu đưc nuơi cy 37 0C trong 24h. + Các ch tiêu theo dõi Sinh trưng ca vi khun trong mơi trưng cĩ b sung chitosan đưc xác đnh bng phương pháp đo đ đc trên máy quang ph bưc sĩng 620 nm sau thi gian nuơi cy 24h. 2.2.5. Phương pháp nghiên cu ci bin chitosan 2.2.5.1. Phương pháp ci bin chitosanglucose * Chun b thí nghim Chitosan 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa Pha chitosan 1%: Cân 1g chitosan pha trong 100ml axít acetic 1% Glucose 1%: Cân 1g glucose pha trong 100ml nưc ct Chitosan gn glucose đưc thc hin bng phn ng Maillard theo phương pháp ca Kanatt (2007). Qui trình đưc tĩm tt như sau 1% chitosan đưc chun b trong 1% acid acetic băng. Phc hp chitosanglucose(CGC) đưc chun b bng cách hp kh trùng chitosan 1% và glucose 1% trong 15 phút. Phn ng Maillard: Thí nghim gm 3 cơng thc:
45. 33 Cơng thc 1(CT1): Chitosan/glucose theo t l nng đ 1 :1 ; Cơng thc 2(CT2): Chitosan/glucose theo t l nng đ 2 :1 ; Cơng thc 3(CT3): Chitosan/glucose theo t l nng đ 5 :1 ; Phn ng đưc thc hin nhit đ 121 0C trong vịng 15 phút ; mi cơng thc làm 3 ng và 3 ln lp li. Thí nghim cũng đưc thc hin 3 loi chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa. Các ch tiêu theo dõi: Mc đ gn ca glucose lên mch chitosan đưc xác đnh bng phương pháp quang ph Spectrophotometer theo phương pháp ca Ajandouz (2001). Pha lỗng thích hp vi nưc ct và đo đ hp ph các bưc sĩng 420nm. 2.2.5.2. Phương pháp ci bin chitosanglucosamine Phương pháp ci bin tương t như phương pháp chitosanglucose đưc tng hp bng phn ng Maillard theo phương pháp ca Kanatt (2005). Cơng thc 1(CT1): Chitosan/glucosamine theo t l nng đ 1 : 1; Cơng thc 2(CT2): Chitosan/glucosamine theo t l nng đ 2 : 1; Cơng thc 3(CT3): Chitosan/glucosamine theo t l nng đ 5 : 1; Phn ng đưc thc hin nhit đ 121 0C trong vịng 15 phút; mi cơng thc làm 3 ng và 3 ln lp li. Thí nghim cũng đưc thc hin 3 loi chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau là 30 kDa, 300 kDa và 700 kDa. Các ch tiêu theo dõi: Mc đ gn ca glucose lên mch chitosan đưc xác đnh bng phương pháp quang ph Spectrophotometer theo phương pháp ca Ajandouz (2001). Pha lỗng thích hp vi nưc ct và đo đ hp ph các bưc sĩng 420nm. 2.2.6. Phương pháp nghiên cu kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin
46. 34 Hot tính kháng khun ca chitosan ci bin đưc thc hin bng phương pháp đo đ đc và phương pháp khuch tán trên đĩa. 2.2.6.1. Xác đnh kh năng kháng khun bng phương pháp đo đ đc Các vi khun chng gây bnh E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC 25923 (MSSA), đưc nuơi cy trong 10ml mơi trưng Nutrient Broth, các ng nghim đưc b sung các sn phm chitosan ci bin cĩ khi lưng phân t khác nhau (chitosanglucose; chitosanglucosamine) vi nng đ t 0 (đi chng cĩ b sung 0,015ml axít acetic), 50, 100, 150, 200 và 300 ppm. Vi khun đưc nuơi cy nhit đ 37 0C trong 24h. Sinh trưng ca vi khun đưc xác đnh bng phương pháp đo đ đc bưc sĩng 625 nm. Thí nghim gm 6 cơng thc, lp li 3 ln. 2.2.6.2. Xác đnh kh năng kháng khun bng phương pháp khuych tán trên đĩa Các chng vi khun đưc cy trên mơi trưng thch đĩa. Các dn sut chitosan ci bin đưc tm trên giy thm vơ trùng cĩ đưng kính 6mm vi nng đ bng ch s MIC, đt nh trên b mt đĩa. Vi khun đưc nhit đ 37 0C trong 48h, đo kích thưc vịng vơ khun. Thí nghim gm 4 cơng thc: Cơng thc 1: B sung chitosan cĩ khi lưng phân t 30 kDa Cơng thc 2: B sung chitosan cĩ khi lưng phân t 300 kDa Cơng thc 3: B sung chitosan cĩ khi lưng phân t 700 kDa Cơng thc 4: Đi chng Thí nghim gm 4 cơng thc, lp li 3 ln. 2.2.7. Phương pháp th nghim các dn sut chitosan ci bin trong bo qun thc phm Các dn sut chitosan ci bin cĩ hot tính kháng khun cao s đưc th nghim đ bo qun thc phm trên đi tưng là tht bị. Nng đ các dn sut s dng theo ch s MIC ni dung 2.
47. 35 Tht bị đưc mua ch v cĩ màu hng đ tươi, mùi v đc trưng ca tht tươi, cĩ đ đàn hi tt. Sau đĩ đưc ct thành tng ming nh khong t 15 30g/ ming ri đem bo qun bng cách phun trc tip dung dch ch phm lên ming tht và đưc bo qun nhit đ phịng 2025 0C và 5 0C. Ch tiêu theo dõi: Ch tiêu cm quan: màu sc, đ nht b mt, mùi sn phm sau các khong thi gian bo qun 24, 48, 72, 96, 120, 144 h. Theo phương pháp cho đim TCVN 7096:2002 . Tht gi tươi nhit đ phịng thì c 6h ly mu kim tra mt ln và nhit đ 5 0C thì c 24h ly mu kim tra mt ln. Sơ đ b trí thí nghim như sau: Đi vi chitosanglucose cĩ khi lưng phân t là 30 kDa: Tht tươi Ct ming Khơng chitosan Chitosan 1% Chitosanglucose (ĐC1) (ĐC2) CT1 CT2 CT3 Thí nghim thc hin tương t vi chitosanglucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa và 700 kDa.
48. 36 Đi vi chitosanglucosamine cĩ khi lưng phân t là 30 kDa: Tht tươi Ct ming Khơng chitosan Chitosan 1% Chitosanglucosamine (ĐC1) (ĐC2) CT1 CT2 CT3 Tương t vi chitosanglucosamine cĩ khi lưng phân t 300 kDa và 700 kDa. Cơ s cho đim tht bị theo tiêu chun Vit Nam 321579 (TCVN 321579):Sn phm thc phm – Phân tích cm quan – Phương pháp cho đim. Phương pháp này s dng h thng thang đim 20 gm 6 bc t 0 đn 5, đim cao nht cho mt ch tiêu là 5 và thp nht là 0. Sáu bc đánh giá tương ng vi ni dung mơ t c th như sau:
49. 37 Bng 2.1: Cơ s cho đim tht bị theo TCVN 321579 Bc Đim chưa đánh cĩ trng Màu sc Mùi Trng thái giá lưng Màu đ hng tươi đc Mùi thơm đc trưng Cơ tht săn chc, trưng ca tht, mt ct ca tht tươi, khơng n lõm phc hi 1 5 cĩ màu đ tươi và m cĩ mùi l ln vào ngay ưt Mùi thơm ca tht Cơ tht săn chc, Màu hng nht, mt tươi, khơng cĩ mùi n lõm phc hi 2 4 ct cĩ màu đ hng l ln vào nhanh và m ưt Mùi thơm ca tht Cơ tht cịn săn Màu hng nht, mt khơng h hin rõ chc, n lõm phc 3 3 ct cĩ màu hng và ràng hi hơi chm m ưt Mùi thơm ca tht Cơ tht mm, n Màu hng rt nht, khơng cịn, các mùi lõm phc hi 4 2 cho phép mt s ch l đã xut hin, chm màu xanh lơ hoc nhưng mc đ xám. nh Màu hng tái xen ln Mùi ơi thiu th hin Cơ tht mm, n 5 1 vi màu tái, b mt rt rõ lõm hu như hơi nht khơng phc hi 6 0 Tht cĩ màu xanh Mùi ơi thiu rt khĩ Cơ tht mm xám, b mt rt nht chu, cĩ th gây sc nhũn, n lõm khơng phc hi
50. 38 Bng 2.2: H s quan trng ca các ch tiêu cm quan ca tht Ch tiêu cm quan H s quan trng (K) Màu sc 1,7 Mùi 1,3 Trng thái 1,0 Tích gia đim trung bình ca ch tiêu vi h s quan trng ca ch tiêu đưc gi là đim cĩ trng lưng ca ch tiêu đĩ. Tng đim cĩ trng lưng ca tt c các ch tiêu gi là đim chung ca sn phm. Đim chung ca sn phm dùng đ phân loi hay xp hng cht lưng cm quan ca sn phm. Đ phân cp cht lưng ngưi ta s dng đim cĩ trng lưng. Tiêu chun TCVN 321579 qui đnh các cp cht lưng đi vi sn phm thc phm cĩ đim chung và các đim trung bình chưa cĩ trng lưng đi vi mt ch tiêu, đưc th hin bng sau: Bng 2.3: Bng phân cp cht lưng tht Yêu cu v đim trung bình chưa Cp cht lưng Đim chung cĩ trng lưng đi vi các ch tiêu Loi tt 18,6 ÷ 20,0 Các ch tiêu quan trng nht≥4,7 Loi khá 15,2 ÷ 18,2 Các ch tiêu quan trng nht≥3,8 Loi trung bình 11,2 ÷ 15,1 Các ch tiêu quan trng nht≥2,8 Loi kém (khơng đt cht lưng trong tiêu chun 7,2 ÷ 11,2 Các ch tiêu quan trng nht≥1,8 nhưng vn bán đưc) Loi rt kém (khơng cĩ kh năng bán đưc nhưng khi tái ch cịn cĩ th dùng 4,0 ÷ 7,1 Các ch tiêu quan trng nht≥1,0 đưc) Loi hng (khơng s dng đưc) 0,0 ÷ 3,9 Các ch tiêu quan trng nht≥0,0 2.2.8. Phương pháp x lý s liu Tt c các thí nghim đưc thc hin vi 3 ln lp li và x lý thng kê bng phn mm MSSTAT.
51. 39 Chương 3: KT QU VÀ THO LUN 3.1. Nghiên cu ch to dn sut chitosan ci bin Chitosan cĩ hot tính kháng khun khá mnh nh tính cht polycation ca các nhĩm NH 2. Tính cht polycation ca chitosan giúp cho chitosan gn cht vi màng polyanion ca t bào vi khun làm ri lon quá trình trao đi cht qua màng và dn đn t tào vi khun b cht. Tuy nhiên mt s vi khun cĩ hot tính enzyme chitosanase, cellulase ngoi bào cĩ kh năng phân hy mch chitosan làm mt hot tính ca ch phm này. Mc tiêu ca ni dung này là gn các gc đưng như glucosamine, glucose vào mch nhánh ca chitosan (chitosan ci bin) đ làm thay đi cu trúc ca chitosan giúp hn ch kh năng phân hy ca h enzyme vi khun. 3.1.1. nh hưng khi lưng phân t ca chitosan và t l nng đ chitosan/glucose đn phn ng Maillard Phn ng Maillard là phn ng gia nhĩm amin (NH 2) ca chitosan vi nhĩm (CHO) ca đưng glucose. Dn sut to thành cĩ màu vàng hp thu bưc sĩng 420nm, mc đ gn t l thun vi đ hp th (OD) 420nm. Chitosan s dng trong thí nghim cĩ khi lưng phân t khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa) phn ng vi đưng glucose nhit đ 121 0C trong vịng 15 phút, sau đĩ đ ngui ri đem đo OD bưc sĩng 420nm đ xác đnh mc đ gn.
52. 40 Bng 3.1: nh hưng ca khi lưng phân t và nng đ đưng glucose đn mc đ phn ng Maillard Nghim thc Khi lưng T l chitosan/glucose OD420 phân t 1 1:1 0,299 b 30 kDa 2 2:1 0,360 ab 3 5:1 0,357 ab 4 1:1 0,404 ab 300 kDa 5 2:1 0,450 a 6 5:1 0,384 ab 7 1:1 0,404 ab 700 kDa 8 2:1 0,480 a 9 5:1 0,440 a ANOVA z Khi lưng Cơng thc Khi lưng x cơng thc CV (%) 4,21 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01 Kt qu bng 3.1 cho thy chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau thì kh năng gn đưng khác nhau. Khi lưng phân t ca chitosan càng ln thì kh năng gn đưng glucose càng ln. Chitosan khi lưng phân t 30kDa, t l chitosan/glucose 2:1 cĩ OD420 là 0,360 tăng lên 0,450 chitosan 300kDa và 0.480 chitosan 700 kDa. Điu này chng t mch chitosan càng dài, s lưng nhĩm NH 2 trong mch càng ln thì kh năng gn vi nhĩm –CHO ca đưng glucose càng ln. S khác bit kh năng gn glucose gia các chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau là cĩ ý nghĩa thng kê vi mc P ≤ 0,01. So sánh v nh hưng ca t l nng đ chitosan/ glucose đn mc đ phn ng Maillard cho thy c ba khi lưng phân t t l chitosan/glucose thích hp là 2:1. T l đưng cao chitosan/glucose 1:1 hoc nng đ đưng quá thp chitosan/glucose 5:1 thì phn ng Maillard din ra mc đ thp
53. 41 hơn (bng 3.1). nh hưng ca t l chitosan/glucose là cĩ ý nghĩa thng kê vi xác sut P≤0,01. Tương quan giũa khi lưng phân t chitosan và t l nng đ chitosan/glucose là cĩ ý nghĩa thng kê. 3.1.2. nh hưng khi lưng phân t ca chitosan và nng đ đưng glucose đn phn ng Maillard gn glucosamine vào mch chitosan Ci bin dn sut chitosan – glucosamine đưc thc hin bng phn ng ca Maillard. Chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau (30 kDa, 300 kDa, 700 kDa) hn hp vi glucosamine các nng đ khác nhau tương t như thí nghim vi glucose và thc hin phn ng Maillard nhit đ 121 0C trong vịng 20 phút, sau đĩ đ ngui ri đem đo OD bưc sĩng 420nm. Bng 3.2: nh hưng ca khi lưng phân t và nng đ đưng glucosamine đn mc đ phn ng Maillard Nghim Khi lưng Cơng thc(CT) OD420 thc phân t 1 1:1 0,210 ab 2 30 kDa 2:1 0,277 ab 3 5:1 0,294 ab 4 1:1 0,168 b 5 300 kDa 2:1 0,181 ab 6 5:1 0,192 ab 7 1:1 0,221 ab 8 700 kDa 2:1 0,309 ab 9 5:1 0,350 a ANOVA z Khi lưng Cơng thc Khi lưng x cơng thc CV (%) 7,05 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01.
54. 42 T kt qu bng 3.2 cho thy cũng tương t như phn ng Maillard gia chitosan và glucose. Tuy nhiên mc đ phn ng thp hơn so vi phn ng vi glucose, OD420 ch bin thiên t 0,210 đn 0,350 so vi 0,299 0,480. 3.2. Nghiên cu kh năng kháng khun ca các dn sut chitosan ci bin trong invitro 3.2.1. Nghiên cu kh năng kháng khun ca chitosan glucose * Chitosan–glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa Vi khun E.coli đưc nuơi cy trong mơi trưng lng Nutrient Broth cĩ b sung chitosanglucose vi nng đ t 50300 ppm. Mi nng đ cĩ 3 cơng thc chitosan ci bin cĩ t l chitosan/glucose khác nhau 1:1; 2:1; và 5:1 vi 2 cơng thc đi chng ĐC 1 (b sung chitosan chưa ci bin cùng nng đ), ĐC 2 (Vi khun nuơi cy trong mơi trưng Nutrient Broth cĩ b sung axít acetic vi lưng tương t các cơng thc khác). Sau thi gian nuơi cy 24h nhit đ 30 0C, xác đnh sinh trưng ca vi khun bng phương pháp đo đ đc bưc sĩng 625 nm. Thí nghim thc hin vi các sn phm chitosanglucose ci bin khác nhau. Kt qu ghi nhn trong bng 3.3.
55. 43 Bng 3.3: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0, 643 a 2 2:1 0, 710 a 50ppm 3 5:1 0, 662 a 4 ĐC1 0, 67 4a 5 ĐC2 0, 673 a 6 1:1 0, 655 a 7 2:1 0, 739 a 100ppm 8 5:1 0,044 ab 9 ĐC1 0,535 ab 10 ĐC2 0,646 a 11 1:1 0,643 a 12 2:1 0,391 ab 150ppm 13 5:1 0, 025 c 14 ĐC1 0, 044 b 15 ĐC2 0, 677 a 16 1:1 0, 260 a 17 2:1 0, 052 b 200ppm 18 5:1 0, 017 c 19 ĐC1 0, 029 b 20 ĐC2 0, 702 a 21 1:1 0, 031 b 22 2:1 0, 026 b 23 300ppm 5:1 0, 00 7c 24 ĐC1 0, 017 b 25 ĐC2 0, 698 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 8,9
56. 44 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01 + ĐC1: Chitosan + Vi khun + Nutrient Broth + ĐC2: Acid acetic + Vi khun + Nutrient Broth Kt qu bng 3.3 cho thy chitosan – glucose khi lưng phân t 30 kDa cĩ mc đ c ch sinh trưng ca vi khun E. coli khác nhau. Khi lưng phân t càng ln thì kh năng kháng khun ca chitosanglucose ci bin càng ln. Nguyên nhân là do khi lưng phân t ln thì mc đ polycation càng ln. Kt qu này cũng tương t nghiên cu ca Hong Kyoon No (2004) nghiên cu nh hưng ca sáu loi khi lưng phân t khác nhau ca chitosan, chitosan oligomer đn kh năng kháng khun trên 7 loi vi khun gram dương và 4 vi khun gram âm. Kt qu thy rng chitosan cĩ khi lưng phân t cao cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan oligomer cĩ khi lưng phân t thp hơn. Nghiên cu v các mc đ gn khác nhau, kt qu bng 3.3 cho thy nng đ 50ppm gn như khơng cĩ kh năng kháng vi khun E. coli so vi đi chng. Tuy nhiên, đn nng đ 100 ppm kh năng kháng khun mu chitosan/glucose 5:1 cao hơn so vi chitosan khơng ci bin (ĐC 1). Khi tăng lên nng đ lên 150200ppm, kh năng kháng khun ca chitosanglucose 5:1 tăng lên đáng k so vi các cơng thc khác và đi chng chitosan khơng ci biên. nng đ 150ppm, mu 5:1 gn như c ch hồn tồn vi khun E.coli (OD625: 0,025) so vi ĐC1 là 0,44. nng đ 200ppm, mu 5:1 cĩ OD625 là 0,017 thp hơn nhiu so vi chitosan khơng ci bin ĐC 1 là 0,029. S khác bit này qua x lý thng kê là cĩ ý nghĩa vi xác sut P≤0.01. Điu đĩ chng t chitosanglucose ci bin cĩ hiu qu kháng khun cao hơn so vi chitosan chưa ci bin. So sánh mc đ gn glucose và kh năng kháng khun, kt qu cũng cho thy, mc đ gn cao cơng thc 1:1 và 2:1 cĩ kh năng kháng khun thp hơn 5:1, thm chí thp hơn c chitosan chưa ci bin. Nguyên nhân, là do
57. 45 khi mc đ gn qua ln làm gim mc đ polycation ca chitosan dn đn kh năng kháng khun gim. Bng 3.4: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa đi vi vi khun S. aureus Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,451 ab 2 2:1 0,517 ab 3 50ppm 5:1 0,299 ab 4 ĐC1 0,403 ab 5 ĐC2 0,592 ab 6 1:1 0,220 ab 7 2:1 0,326 ab 8 100ppm 5:1 0,227 ab 9 ĐC1 0,259 ab 10 ĐC2 0,687 a 11 1:1 0,446 ab 12 2:1 0,243 ab 13 150ppm 5:1 0,037 b 14 ĐC1 0,040 b 15 ĐC2 0,681 a 16 1:1 0,395 ab 17 2:1 0,257 ab 18 200ppm 5:1 0,027 c 19 ĐC1 0,043 b 20 ĐC2 0,763 a 21 1:1 0,040 b 22 2:1 0,043 b 23 300ppm 5:1 0,017 c 24 ĐC1 0,033 b 25 ĐC2 0,552 ab ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 10,3
58. 46 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 Kt qu bng 3.4 cho thy kh năng kháng khun trên vi khun S. aureus ca chitosanglucose ci bin tương t như vi vi khun E.coli . nng đ 50ppm. nng đ 100ppm cĩ kh năng c ch nh đn s sinh trưng ca vi khun S. aureus , CT 5:1 là 0,227 nh hơn CT ĐC 1 là chitosan chưa ci bin 0,259 và ĐC 2 là 0,687. Nng đ 150ppm, cơng thc 5:1 cĩ kh năng c ch sinh trưng ca vi khun S. aureus mnh hơn so vi ĐC 1 là chitosan chưa ci bin. Nng đ 200ppm, cơng thc chitosan ci bin 5:1 cĩ kh năng c ch sinh trưng ca vi khun S. aureus mnh hơn so vi chitosan chưa ci bin. Điu đĩ chng t, chitosan ci bin vi mc đ gn thích hp cĩ kh năng kháng khun mnh hơn chitosan chưa ci bin. S khác bit này là cĩ ý nghĩa thng kê. * Chitosan –glucose ci bin cĩ khi lưng phân t 300 kDa Bng 3.5: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,530 a 2 2:1 0,408 ab 3 50ppm 5:1 0,352 ab 4 ĐC1 0,312 ab 5 ĐC2 0,673 a 6 1:1 0,131 b 7 2:1 0,055 b 8 100ppm 5:1 0,027 b 9 ĐC1 0,086 b 10 ĐC2 0,646 a 11 1:1 0,050 b 12 2:1 0,067 b
59. 47 13 150ppm 5:1 0,041 b 14 ĐC1 0,079 b 15 ĐC2 0,677 a 16 1:1 0,045 b 17 2:1 0,029 b 18 200ppm 5:1 0,022 b 19 ĐC1 0,038 b 20 ĐC2 0,702 a 21 1:1 0,025 b 22 2:1 0,034 b 23 300ppm 5:1 0,022 b 24 ĐC1 0,084 b 25 ĐC2 0,698 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 2,1 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 T kt qu bng 3.5 cho thy chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa, th hin các giá tr đo OD trong sut quá trình nuơi cy, kt qu này đúng vi gi thit Avadi (2004). Nng đ 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm thì đu cĩ kh năng kháng khun đi vi vi khun E. coli cao hơn so vi đi chng chitosan chưa ci bin (ĐC 1). Tr s đ đc OD ca các cơng thc ci bin đu thp hơn so vi đi chng chitosan. C th nng đ 100ppm, cơng thc 2:1 là 0,055 và cơng thc 5:1 là 0,027 so vi đi chng chitosan chưa ci bin là 0,086 và đi chng khơng chitosan (ĐC 2) là 0,646. Theo kt qu phân hng, nhim thc 18 và 23 cĩ kh năng kháng khun vi vi khun E. coli tt nht, s khác bit cĩ ý nghĩa mc 1% vi các
60. 48 nghim thc 1, 5, 10, 15, 20, 25 và khơng cĩ s khác bit vi các nghim thc cịn li. Bng 3.6: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa đi vi vi khun S. aureus Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0, 309 def 2 2:1 0, 233 def 3 50ppm 5:1 0,335 bcdef 4 ĐC1 0,307 cdef 5 ĐC2 0,592 abcd 6 1:1 0,175 ef 7 2:1 0, 09 1f 8 100ppm 5:1 0, 042 f 9 ĐC1 0, 087 f 10 ĐC2 0, 687 ab 11 1:1 0,032 f 12 2:1 0,045 f 13 150ppm 5:1 0,006 f 14 ĐC1 0,052 f 15 ĐC2 0,681 abc 16 1:1 0, 003 f 17 2:1 0, 004 f 18 200ppm 5:1 0, 009 f 19 ĐC1 0,026 f 20 ĐC2 0,763 a 21 1:1 0,001 f 22 2:1 0,002 f 23 300ppm 5:1 0,019 f 24 ĐC1 0, 034 f 25 ĐC2 0, 552 abcde ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 16,8 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01
61. 49 Kt qu th hin bng 3.6 cho thy kh năng kháng khun ca chitosan glucose khi lưng phân t 300.000 Da cĩ kh năng kháng khun S. areus mnh so vi đi chng chitosan chưa ci bin. Nng đ 100ppm, 150ppm, 200ppm, 300ppm đu cĩ kh năng kháng khun cao đi vi vi khun S. aureus so vi đi chng. nng đ 100ppm và 150 ppm chitosanglucose ci bin vi t l 5:1 đã gn như c ch hồn tồn vi khun. Trong khi đĩ chitosan chưa ci bin cn nng đ 200300 ppm. Kt qu này th hin rõ rt hiu qu ca ci bin chitosan trong kháng khun. Tuy nhiên nng đ 200ppm vi CT 1 và 300ppm vi CT 1 là c ch mnh nht. Kt qu này cùng tương đương vi kt qu nghiên cu ca Hong Kyoon No (2002). Tĩm li, t kt qu thng kê bng trên cho thy nng đ chitosan – glucose nh hưng ln đn kh năng kháng khun S. aureus . Nhưng ch tiêu v cơng thc thì nh hưng đn kh năng kháng khun tùy thuc vào lưng đưng đưc gn vào chitosan. nghim thc 21 cho kt qu tt nht và cĩ s khác bit cĩ ý nghĩa mc xác sut P≤0.01 vi các nghim thc 5, 10, 15, 20, 25 và khơng cĩ s khác bit vi các nghim thc cịn li. Kt qu t chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa vi nng đ t 100150ppm đã c ch hồn tồn s sinh trưng ca vi khun S. aureus và vi khun E. coli trong quá trình nuơi cy. Theo S.R.Kanatt (2008) , chitosan 100ppm chưa cĩ kh năng c ch sinh trưng ca vi khun, và t 200ppm đã th hin rõ kh năng này Ana (2004).
62. 50 * Chitosan –glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa Bng 3.7: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,560 abcd 2 2:1 0,569 abcd 3 50ppm 5:1 0,627 abc 4 ĐC1 0,655 ab 5 ĐC2 0,673 ab 6 1:1 0,250 abcd 7 2:1 0,161 abcd 8 100ppm 5:1 0,191 abcd 9 ĐC1 0,224 abcd 10 ĐC2 0,646 ab 11 1:1 0,158 abcd 12 2:1 0,058 cd 13 150ppm 5:1 0,058 cd 14 ĐC1 0,069 cd 15 ĐC2 0,677 a 16 1:1 0,301 abcd 17 2:1 0,037 d 18 200ppm 5:1 0,037 d 19 ĐC1 0,038 d 20 ĐC2 0,702 a 21 1:1 0,029 d 22 2:1 0,033 d 23 300ppm 5:1 0,033 d 24 ĐC1 0,096 bcd 25 ĐC2 0,698 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 13,6 z : khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01
63. 51 Kt qu bng 3.7 cho thy kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa, nng đ 150ppm, 200ppm, 300ppm cĩ kh năng c ch đi vi vi khun E. coli . nng đ 200300ppm vi cơng thc 1:1; 2:1 và 5:1 cĩ kh năng c ch hồn tồn s sinh trưng vi khun E. coli . Theo kt qu phân hng, ch tiêu v nng đ nh hưng rt ln đn kh năng kháng khun ca vi khun E. coli . Nng đ càng cao thì kh năng kháng khun càng cao, cịn ch tiêu cơng thc khơng nh hưng đn kh năng kháng khun. Kh năng kháng khun tt nht là nghim thc 21, cĩ s khác bit cĩ ý nghĩa mc 1% vi các nghim thc 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 và khơng cĩ s khác bit vi các nghim thc cịn li. Bng 3.8: Kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700 k Da đi vi vi khun S. aureus Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,608 abc 2 2:1 0,528 abcd 3 50ppm 5:1 0,517 abcd 4 ĐC1 0,263 abcd 5 ĐC2 0,592 abcd 6 1:1 0,297 abcd 7 2:1 0,163 bcd 8 100ppm 5:1 0,164 bcd 9 ĐC1 0,071 cd 10 ĐC2 0,687 ab 11 1:1 0,127 bcd 12 2:1 0, 067 cd 13 150ppm 5:1 0,061 cd 14 ĐC1 0,050 cd
64. 52 15 ĐC2 0,681 ab 16 1:1 0,035 cd 17 2:1 0,065 cd 18 200ppm 5:1 0,035 cd 19 ĐC1 0,063 cd 20 ĐC2 0,763 a 21 1:1 0,056 cd 22 2:1 0,077 cd 23 300ppm 5:1 0,029 d 24 ĐC1 0,047 cd 25 ĐC2 0,552 abcd ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 13,5 z : khác bi trt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 Bng 3.8, kh năng kháng khun ca chitosan glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa, nng đ 50ppm và 100ppm kh năng c ch vi khun S. aureus khơng kh quan so vi đi chng chitosan chưa ci bin. Nng đ 150ppm, 200ppm, 300ppm cho thy cĩ kh năng c ch đi vi vi khun S. aureus , nhưng tt nht vi nng đ 300ppm cơng thc 5:1 so vi đi chng. T kt qu thng kê, hai ch tiêu v nng đ và cơng thc đu nh hưng đn kh năng kháng khun S. aureus . Nng đ cao thì kh năng kháng khun tt, nghim thc 23 cho thy chitosan – glucose cĩ kh năng kháng khun hồn tồn và cĩ s khác bit cĩ ý nghĩa mc 1% vi các nghim thc
65. 53 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 và khơng cĩ s khác bit vi các nghiêm thc cịn li. Nhìn chung, xét v nh hưng ca khi lưng phân t chitosan ci bin thì 300 kDa là ti ưu cho kh năng kháng khun hơn là 30 kDa và 700 kDa. Xét v t l chitosan/glucose khi ci bin thì cơng thc 5:1 là ti ưu hơn c và nng đ c ch hồn tồn (MIC) đi vi E.coli và S. areus là 150ppm so vi chitosan khơng ci bin là 200300 ppm. 3.2.2. Kt qu nghiên cu kh năng kháng khun chitosan – glucosamine ci bin Gn đưng glucose lên chitosan cĩ th làm gim kh năng kháng khun nu mc đ gn ln. Nguyên nhân là do khi mc đ gn cao làm gim đ tích đin dương polycation ca chitosan. Vì vy, đ tăng kh năng kháng khun và hn ch kh năng đ kháng ca vi khun chúng tơi tin hành gn glucosamine lên chitosan. Glucosamine cũng ging như glucose nhưng cĩ thêm nhĩm NH 2, vì vy tính cht polcation ca chitosan khơng b nh hưng khi t l gn thay đi cao thp. Bng 3.9: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 30 kDa đi vi vi khun S. aureus Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,194 b 2 2:1 0,137 bcd 3 50ppm 5:1 0,173 bc 4 ĐC1 0,189 b 5 ĐC2 0,355 a 6 1:1 0,088 cde 7 2:1 0,083 de 8 100ppm 5:1 0,068 de 9 ĐC1 0,066 de 10 ĐC2 0.,308 a 11 1:1 0,078 de
66. 54 12 2:1 0,075 de 13 150ppm 5:1 0,056 de 14 ĐC1 0,069 de 15 ĐC2 0,307 a 16 1:1 0,063 de 17 2:1 0,054 e 18 200ppm 5:1 0,039 e 19 ĐC1 0,062 de 20 ĐC2 0,343 a 21 1:1 0,093 cde 22 2:1 0,144 bcd 23 300ppm 5:1 0.,070 de 24 ĐC1 0,090 cde 25 ĐC2 0,317 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 2,62 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 Khi gn glucosamine vi chitosan cĩ khi lưng phân t 30kDa đem th nghim kh năng kháng khun kt qu cho thy kh năng kháng vi khun S. aureus ca chitosan – glucosamine tt hơn chitosan – glucose. Điu này chng t chitosan –glucosamine ci bin khơng làm gim mc đ polycation, tính cht liên quan trc tip đn tính kháng khun. Kt qu bng 3.9 cho thy chitosanglucosamine ci bin th hin tính kháng khun ngay nng đ thp 50100 ppm. cơng thc 1:1 và 5:1 OD là 0,137 so thp hơn so vi ĐC 1 chitosan chưa ci bin là 0,189 và đi chng khơng chitosan là 0,355.
67. 55 So sánh nh hưng ca mc đ gn glucosamine, kt qu cho thy ttat c các nng đ khơng cĩ s khác bit gia các cơng thc 1:1; 2:1 và 5:1. Kt qu này là bng chng thc tin chng minh lý thuyt trên. Bng 3.10: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 30 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0, 172 c 2 2:1 0, 170 c 3 50ppm 5:1 0, 100 c 4 ĐC1 0,114 c 5 ĐC2 0,365 ab 6 1:1 0,134 c 7 2:1 0,087 c 8 100ppm 5:1 0, 091 c 9 ĐC1 0, 081 c 10 ĐC2 0, 429 a 11 1:1 0, 092 c 12 2:1 0,087 c 13 150ppm 5:1 0,071 c 14 ĐC1 0,080 c 15 ĐC2 0,297 b 16 1:1 0, 026 c 17 2:1 0, 022 c 18 200ppm 5:1 0, 015 c 19 ĐC1 0,016 c 20 ĐC2 0,096 ab 21 1:1 0,094 c 22 2:1 0,088 c 23 300ppm 5:1 0,077 c 24 ĐC1 0, 082 c 25 ĐC2 0, 339 ab ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 17,6 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01
68. 56 Vi chitosan cĩ khi lưng phân t 30 kDa khi gn glucosamine vào thì kh năng c ch quá trình sinh trưng vi khun E. coli đã cho kt qu khá tt. Ch tiêu v nng đ nh hưng ln đn kh năng kháng khun, vi nng đ 200ppm thì đã cĩ th c ch hồn tồn vi khun E. coli so vi cơng thc đi chng. kt qu tt nht là nghim thc 18, và cĩ s khác bit mc 1% vi các nghim thc ĐC2 là 5, 10, 15, 20, 25 và khơng cĩ s khác bit vi các nghim thc cịn li. Bng 3.11: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 300 kDa đi vi vi khun S. aureus Nghim th c Nng đ Cơng th c(CT) OD 1 1:1 0.173 b 2 2:1 0.146 bc 3 50ppm 5:1 0.147 bc 4 ĐC1 0.143 bcd 5 ĐC2 0.395 a 6 1:1 0.141 bcd 7 2:1 0.125 bcde 8 100ppm 5:1 0.090 bcde 9 ĐC1 0.105 bcde 10 ĐC2 0.351 a 11 1:1 0.096 bcde 12 2:1 0.051 cde 13 150ppm 5:1 0.054 e 14 ĐC1 0.073 cde 15 ĐC2 0.396 cde 16 1:1 0.092 bcde 17 2:1 0.071 cde 18 200ppm 5:1 0.056 de 19 ĐC1 0.051 e 20 ĐC2 0.371 a 21 1:1 0.089 bcde 22 2:1 0.101 bcde 23 300ppm 5:1 0.066 cde
69. 57 24 ĐC1 0.093 bcde 25 ĐC2 0.386 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 2,7 z : khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 Qua kt qu thng kê bng 3.11 chitosan(300 kDa) ci bin, cĩ nng đ 100ppm, 200ppm, 300ppm đu cĩ kh năng kháng vi khun S. aureus mnh so vi đi chng. Kt qu này tương ng vi nghiên cu ca Hong Kyoon No (2002) . Kt qu này cũng cho thy chitosan –glucosamine (300 kDa) ch cĩ th kháng vi khun S. aureus nng đ cao hơn so vi vi khun E. coli . T kt qu phân hng cho thy nghim thc 12 cĩ kh năng kháng vi khun S. aureus hồn tồn, vi s khác bit cĩ ý nghĩa mc 1% so vi các nghim thc 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 7, 9, 22 các nghim thc cịn li khơng cĩ s khác bit. Bng 3.12: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 300 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc OD625 thc 1 1:1 0,094 cde 2 2:1 0,093 cde 3 50ppm 5:1 0,092 cde 4 ĐC1 0,098 bcde 5 ĐC2 0,365 a 6 1:1 0,113 bcde 7 100ppm 2:1 0,097 de 8 5:1 0,085 bcde 9 ĐC1 0,087 cde
70. 58 10 ĐC2 0,314 abcd 11 1:1 0,053 de 12 2:1 0,043 e 13 150ppm 5:1 0,047 de 14 ĐC1 0,087 bcde 15 ĐC2 0,347 ab 16 1:1 0,063 de 17 2:1 0,057 de 18 200ppm 5:1 0,019 e 19 ĐC1 0,029 e 20 ĐC2 0,219 ab cde 21 1:1 0,093 bcde 22 2:1 0,092 cde 23 300ppm 5:1 0,086 bcde 24 ĐC1 0,084 cde 25 ĐC2 0,369 a ANOVA z Nng đ NS Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 7,1 z , NS: khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01, hoc khơng cĩ s khác bit. Kt qu thng kê bng 3.12 cho thy, kh năng c ch s sinh trưng vi khun E. coli ca chitosan – glucosamine rt hiu qu mi nng đ so vi đi chng. Ngay nng đ 50ppm, chitosanglucosamine đã cho hiu qu kháng khun cao, và khơng cĩ s khác bit khi tăng nng đ lên 100ppm, 200ppm, thm chí 300 ppm. Kt qu x lý thng kê cũng cho thy khơng cĩ s khác bit v kh năng kháng khun trong khong t 50300ppm (NS). nng đ 200300ppm cĩ kh năng c ch hồn tồn vi khun E. coli trong sut quá trình nuơi cy. Kt qu này tương đng vi kt qu ca Nguyn Anh Dũng (2003) đã s dng oligoglucosamine vi nng đ 250
71. 59 300ppm đ ngăn chn s tăng trưng ca vi khun E. coli . Theo nghiên cu ca Hirano (1998) liu c ch vi khun E.coli ca chitosan là 200240ppm. Bng 3.13: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 700 kDa đi vi vi khun S. aureus Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,181 abc 2 2:1 0,205 abc 3 50ppm 5:1 0,185 abc 4 ĐC1 0,151 abc 5 ĐC2 0,239 abc 6 1:1 0,152 abc 7 2:1 0,328 a 8 100ppm 5:1 0,018 c 9 ĐC1 0,025 bc 10 ĐC2 0,275 ab 11 1:1 0,047 bc 12 2:1 0,009 c 13 150ppm 5:1 0,003 c 14 ĐC1 0,007 c 15 ĐC2 0,276 ab 16 1:1 0,013 c 17 2:1 0,005 c 18 200ppm 5:1 0,001 c 19 ĐC1 0,002 c 20 ĐC2 0,340 a 21 1:1 0,017 bc 22 2:1 0,000 c 23 300ppm 5:1 0,000 c 24 ĐC1 0,000 c 25 ĐC2 0,314 a ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc * CV (%) 7,6
72. 60 z , *: khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01, 0,05. Bng 3.13 kt qu cho thy chitosan – glucosamine cĩ khi lưng phân t 700 kDa cĩ kh năng kháng khun S. aureus hồn tồn nng đ ti thiu là 100150 ppm. nng đ 50ppm, chitosan – glucosamine (700 kDa) cũng đã th hin kh năng kháng khun, kt qu đi chng là 0,239 gim mt na xung cịn 0,151 cơng thc 5:1. T nng đ 100ppm đn 300pm thì kh năng c ch vi khun S. aureus hồn tồn. Nht là nng đ 300ppm thì kh năng kháng khun hồn tồn và vi khun khơng cĩ kh năng phc hi so vi đi chng. Bng 3.14: Kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine cĩ khi lưng phân t 700 kDa đi vi vi khun E. coli Nghim Nng đ Cơng thc(CT) OD625 thc 1 1:1 0,328 abcd 2 2:1 0,242 abcde 3 50ppm 5:1 0,214 abcde 4 ĐC1 0,183 abcde 5 ĐC2 0,333 abcd 6 1:1 0,226 abcde 7 2:1 0,114 cde 8 100ppm 5:1 0,087 de 9 ĐC1 0,086 de 10 ĐC2 0,389 ab 11 1:1 0,143 bcde 12 2:1 0,031 e 13 150ppm 5:1 0,000 e 14 ĐC1 0,000 e 15 ĐC2 0,422 a
73. 61 16 1:1 0,083 de 17 2:1 0,004 e 18 200ppm 5:1 0,000 e 19 ĐC1 0,000 e 20 ĐC2 0,324 abcd 21 1:1 0,007 e 22 2:1 0,000 e 23 300ppm 5:1 0,000 e 24 ĐC1 0,000 e 25 ĐC2 0,365 abc ANOVA z Nng đ Cơng thc Nng đ x cơng thc CV (%) 3,49 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 bng 3.14, t kt qu thng kê cho thy chitosan – glucosamine (700 kDa) cĩ kh năng c ch hồn tồn quá trình sinh trưng và phát trin ca vi khun E. coli t nng đ 100pp đn 300ppm. Tĩm li, Chitosan cĩ khi lưng phân t khác nhau thì cĩ kh năng kháng khun khác nhau, chitosan khi lưng phân t càng ln kh năng kháng khun càng cao, khi s dng chitosan ci bin bng phương pháp to nhánh vi các phân t đưng thì hiu qu kháng khun càng tăng cao. Đi vi chitosan – glucosamine kh năng kháng khun vi khun E. coli, S. aureus tt hơn chitosan – glucose.
74. 62 3.3. Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan ci bin bng phương pháp khuych tán trên đĩa Các chng vi khun E. coli và S. aureus đưc nuơi trong mơi trưng đĩa thch. Các dn sut chitosan ci bin đưc tm trên giy thm vơ trùng cĩ đưng kính 6mm, đt nh trên b mt đĩa. Vi khun đưc nhit đ 37 0C trong vịng 48h, sau đĩ đưc đem đo kích thưc vịng vơ khun. 3.3.1. Đi vi chitosan – glucose Bng 3.15: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucose bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun S. aureus Nghim Khi lưng phân Cơng thc Kích thưc vịng thc t vơ khun (mm) 1 1:1 0,333 d 2 2:1 0,667 cd 30.000Da 3 5:1 1,000 bcd 4 ĐC 0,500 cd 5 1:1 0, 500 cd 6 2:1 1,333 bc 300.000Da 7 5:1 1,833 ab 8 ĐC 0,833 cd 9 1:1 1,333 bc 10 2:1 1, 833 ab 700.000Da 11 5:1 2,333 a 12 ĐC 1333 bc ANOVA z Khi lưng Cơng thc Khi lưng x cơng thc CV (%) 3,67 z : khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01 + ĐC(Chitosan + Vi khun + Nutrient Broth) Bng 3.15 cho thy kích thưc vịng kháng khun ca mu chitosan – glucose ci bin là 1,833 và 2,333 cao gp đơi so vi chitosan chưa ci bin là 0,833 và 1,333.
75. 63 T kt qu thng kê bng 3.15 nhn thy khi thc hin phương pháp khuych tán trên đĩa cũng cho kt qu ging vi phương pháp ca Kanatt (2008). Vi chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t khác nhau(300 kDa, 700 kDa) sau 2 ngày quan sát ta nhn nhn thy xung quanh mnh giy cĩ tm chitosan ci bin vi khun S. aureus khơng phát trin to thành 1 vịng cĩ màu sc sáng hơn xung quanh, đĩ là vịng kháng khun S. aureus . Chitosan cĩ khi lưng phân t ln (300 kDa, 700 kDa) thì cĩ vịng kháng khun ln, c th là nghim thc 11 vịng kháng khun đt kích thưc ln nht so vi đi chng. T kt qu đĩ cho ta thy chitosan khi gn thêm đưng vi liu lưng thích hp 5:1 và cng thêm chitosan cĩ khi lưng phân t ln thì kh năng kháng khun càng cao. Kt qu này mt ln na minh chng kh năng kháng khun cha chitosan gia tăng khi ci bin gn vi glucose. Bng 3.16: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucose bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun E. coli Nghim Khi lưng Cơng thc Kích thưc vịng vơ thc phân t khun (mm) 1 1:1 0, 333 b 2 2:1 0,667 b 30 kDa 3 5:1 1,167 ab 4 ĐC 1, 333 ab 5 1:1 0, 333 b 6 2:1 0,833 b 300kDa 7 5:1 1,833 ab 8 ĐC 1,167 ab 9 1:1 0, 667 b 10 2:1 1,833 ab 700kDa 11 5:1 2, 667 a 12 ĐC 1,000 b ANOVA z Khi lưng Cơng thc Khi lưng x cơng thc * CV (%) 3,49
76. 64 z , *: khác bit rt cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01; 0,05. ĐC: (Chitosan + Vk+mt Nutrient Broth) T kt qu thng kê cho thy, nghim thc 11 cĩ vịng kháng khun E. coli ln nht, điu này ta cĩ th khng đnh đưc rng vi chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t là 700 kDa cĩ kh năng kháng khun tt nht CT 3, vi s khác bit cĩ ý nghĩa mc 1% vi các nghim thc 1, 2, 5, 6, 9, 12 và khơng cĩ s khác bit vi các nhim thc cịn li. 3.3.2. Đi vi chitosan – glucosamine Bng 3.17: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun S. aureus Nghim Khi lưng Cơng thc Kích thưc vịng thc phân t vơ khun (mm) 1 1:1 0,500 ab 2 2:1 0,500 ab 30kDa 3 5:1 0,500 ab 4 ĐC 0,667 ab 5 1:1 0,167 b 6 2:1 0,667 ab 300 kDa 7 5:1 1,667 ab 8 ĐC 0,667 ab 9 1:1 0,167 b 10 2:1 0,500 ab 700 kDa 11 5:1 2,333 a 12 ĐC 0,167 b ANOVA z Khi lưng NS Cơng thc Khi lưng x cơng thc CV (%) 5,2
77. 65 z khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0,01; NS: khơng cĩ s khác bit. Đi vi chitosan đưc ci bin vi glucosamine thì nhn thy vịng kháng khun S. aureus thu đưc rng hơn đi vi chitosan – glucose. Theo kt qu thng kê bng 3.17, nghim thc 11 cĩ kích thưc vịng kháng khun ln, và cĩ s khác bit mc 1% so vi các nghim thc 5, 9, 12 và khơng cĩ s khác bit vi các nghiêm thc cịn li. Bng 3.18: Kt qu xác đnh kh năng kháng khun ca chitosan glucosamine bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun E. coli Nghim Khi lưng Cơng thc Kích thưc vịng thc phân t vơ khun (mm) 1 1:1 0,500 ab 2 2:1 2,833 ab 30 kDa 3 5:1 3,667 a 4 ĐC 0,500 ab 5 1:1 0,500 ab 6 2:1 0,667 ab 300 kDa 7 5:1 0,833 ab 8 ĐC 0,667 ab 9 1:1 0,167 b 10 2:1 0,500 ab 700 kDa 11 5:1 0,667 ab 12 ĐC 0,167 ab ANOVA z Khi lưng * Cơng thc * Khi lưng x cơng thc * CV (%) 8,7 z *: khác bit cĩ ý nghĩa mc p ≤ 0.05. Kt qu thng kê bng 3.18 xác đnh kh năng kháng khun ca chitosanglucosamine cĩ khi lưng phân t khác nhau(30 kDa, 300 kDa,
78. 66 700kDa) bng phương pháp khuych tán trên đĩa đi vi vi khun E. coli nhn thy nghim thc 3 cho vịng kháng khun ln nht và cĩ s khác bit cĩ ý nghĩa mc 5% so vi các nghim thc 9 và khơng cĩ s khác bit vi các nghim thc cịn li. 3.4. Nghiên cu th nghim các dn sut chitosan ci bin trong bo qun thc phm 3.4.1. Đi vi chitosan – glucose 3.4.1.1. nh hưng ca nng đ chitosan – glucose đn trng thái cm quan ca tht trong quá trình bo qun Tht sau khi đưc phun chitosan – glucose các cơng thc ca Maille: CT1, CT2, CT3; cĩ khi lưng phân t khác nhau: 30 kDa, 300 kDa, 700 kDa. Đem đi bo qun nhit đ phịng (khong t 20 0C – 25 0C) và nhit đ lnh 5 0C. Sau mi khong thi gian như đã nĩi trên ta tin hành ly mu tht đưc bo qun đi kim tra, đánh giá và cho đim cm quan. Kt qu đánh giá đưc th hin đ th 3.1 cho thy nhit đ bo qun 25 0C, sau thi gian bo qun 36 gi, tht b xám, nhy đi vi mu đi chng. Đim cm quan gim t 20 xung cịn 8,9, chitosan cịn 10 và chitosanglucose 5:1 cịn gi đưc 13,1 đim. Rõ ràng là t kt qu kháng khun trong invitro đn trc nghim khuych tán trên đĩa và thí nghim bo qun cho thy chitosanglucose ci bin cĩ kh năng kháng khun tt hơn chitosan.
79. 67 25 20 ĐC1 15 ĐC2 M QUAN M CT1 CT2 10 M C M CT3 I Đ 5 0 0 6 12 18 24 30 36 TH I GIAN(GI ) Hình 3.1: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht 25 20 ĐC1 15 ĐC2 M QUAN M CT1 10 CT2 M C M CT3 I Đ 5 0 0 6 12 18 24 30 36 TH I GIAN(GI ) Hình 3.2: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300kDa nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht.
80. 68 25 20 ĐC1 15 ĐC2 M QUAN M CT1 CT2 M C M 10 I CT3 Đ 5 0 0 6 12 18 24 30 36 TH I GIAN(GI ) Hình 3.3: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa nhit đ phịng (20 – 25 0C) đn trng thái cm quan ca tht. So sánh kt qu bo qun ca các mu chitosanglucose cĩ khi lưng phân t khác nhau 30 kDa, 300 kDa và 700kDa nhit đ 25 0C kt qu đim cm quan khơng cĩ s khác bit. Kt qu này so vi kt qu kháng khun trong invitro cĩ s khác bit. Nguyên nhân cĩ th là do kt qu kháng khun ch thc hin trên các vi khun gây ng đc thc phm, cịn các vi khun gây thi khác làm gim đim cm quan thì khơng nghiên cu. Ngồi ra, đim cm quan cịn chu nh hưng ca nhiu yu t khác như nhit đ, ánh sáng, m đ khơng khí. Như vy nhit đ 25 0C s dng chitosanglucose cĩ th bo qun tht đưc 36 gi.
81. 69 25 20 ĐC1 15 ĐC2 NG QUAN NG CT1 10 CT2 M T M I CT3 Đ 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TH I GIAN(NGAY) Hình 3.4: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 30 kDa nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht. 25 20 ĐC1 15 ĐC2 NG QUAN NG CT1 10 CT2 M T M I CT3 Đ 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 TH I GIAN(NGAY) Hình 3.5: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 300 kDa nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht.
82. 70 25 20 ĐC1 15 ĐC2 M QUAN M CT1 CT2 M C M 10 I CT3 Đ 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 TH I GIAN(NGAY) Hình 3.6: Đ th biu din nh hưng ca nng đ chitosan – glucose cĩ khi lưng phân t 700 kDa nhit đ lnh (5 0C) đn trng thái cm quan ca tht. nhit đ bo qun lnh 5 0C, đim cm quan ca tht cĩ tt hơn. Tht cĩ th bo qun đưc 8 ngày khi x lý vi chitosanglucose vi đim cm quan là 16,517,4/20 so vi đi chng là 14 và chitosan khơng ci bin là 16. 3.4.1.2. nh hưng ca nng đ chitosan – glucosamine đn trng thái cm quan ca tht trong quá trình bo qun Thí nghim đưc làm tương t như đi vi chitosan – glucose. Thu đưc kt qu như sau: