›

Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng cây lan vũ nữ (Oncidium sp.) in vitro

pdf 82 trang thiennha21 13/04/2022 3360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng cây lan vũ nữ (Oncidium sp.) in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_anh_huong_cua_mot_so_dieu_kien_nuoi_cay_len.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng cây lan vũ nữ (Oncidium sp.) in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SỰ SINH TRƢỞNG CÂY LAN VŨ NỮ (Oncidium sp.) IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. HUỲNH HỮU ĐỨC KS. VÕ THANH HUY Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ ANH ĐÀO MSSV: 1411100514 Lớp: 14DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2018
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Huỳnh Hữu Đức – Phó trưởng phòng Thực nghiệm Cây trồng và KS. Võ Thanh Huy – cán bộ phòng Thực nghiệm Cây trồng. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng Thực nghiệm Cây trồng Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM. Các số liệu, bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP. HCM, ngày 27, tháng 07, năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Anh Đào
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này em xin đặc biệt chân thành cảm ơn TS. Huỳnh Hữu Đức – Phó trưởng phòng Thực nghiệm Cây trồng, KS. Võ Thanh Huy – cán bộ phòng Thực nghiệm Cây trồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giải đáp thắc mắc trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô hiện đang giảng dạy trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH cùng toàn thể quý thầy cô đang công tác của trường Đại học Công Nghệ TP. HCM đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quãng thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường. Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn, các em trong Phòng Thực nghiệm Cây trồng đã giúp đỡ nhiệt tình, hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình làm đồ án, giúp em có thể thực hiện tốt đề tài. Cuối cùng con xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ những nguời đã sinh thành và nuôi dưỡng dạy dỗ con nên người và gia đình đã luôn động viên, lo lắng, tạo điều kiện cho con được học tập trong suốt thời gian qua. Mặc dù em đã cố gắng để hoàn thiện đồ án này bằng tất cả sự nhiệt huyết và năng lực của mình, tuy nhiên không trách khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn. Xin chân thành cảm ơn! TP. HCM, Ngày 27, tháng 07, năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Anh Đào
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN 0 LỜI CẢM ƠN 1 MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 3 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 7. Kết quả đạt đƣợc 4 8. Kết cấu của đề tài 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Giới thiệu chung về hoa lan 5 1.1.1. Nguồn gồc lịch sử và vị trí phân bố của cây hoa lan 5 1.1.2. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam 7 1.1.3. Giới thiệu về lan Vũ nữ 10 1.2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 18 1.2.1. Khái niệm 18 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro 18 1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro 20 1.2.4. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 22 1.2.5. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro 27 1.2.6. Sự phát sinh hình thái thực vật 29 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Thời gian và địa điểm 31 2.1.1. Thời gian 31 2.1.2. Địa điểm 31 2.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 31 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 31 2.2.3. Điều kiện phòng nuôi cấy 33 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 34 2.3. Nội dung nghiên cứu 34 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam 34 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam 38 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam 47 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 4.1. Kết luận 58 4.2. Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 1 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AC : Than hoạt tính BA : 6-Benzyl Adenine CNSH : Công Nghệ Sinh Học CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật CW : Nước dừa Cs : Cộng sự IBA : Indolebutyric Acid GA3 : Gibberellic acid MS : Murashige - Skoog NAA : Napthalene Acetic Acid NT : Nghiệm thức PLB : Protocorm like body TDZ : 1-phenyl-3-(1,2,3-Thiadiazol-5 yl)-urea TP. HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các trang thiết bị trong thí nghiệm 32 Bảng 2.2. Hóa chất môi trường MS 33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam 35 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam 37 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam 40 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam 49 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến số chồi của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 42 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến chiều cao chồi của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 42 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng chất khô của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 43 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến số lá của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 51 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến chiều cao chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 51 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến số rễ của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 52 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến chiều dài rễ của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 52 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng chất khô của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 53 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng chất khô của rễ lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 53 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến tổng trọng lượng tươi, tổng trọng lượng khô và tổng hàm lượng chất khô của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 54 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lan Vũ nữ 10 Hình 1.2. Lan Vũ nữ cam 12 Hình 1.3. Một số giống lan Vũ vữ 13 Hình 1.4. Rễ của lan Vũ nữ 14 Hình 1.5. Thân của lan Vũ nữ 15 Hình 1.6. Hoa lan Vũ nữ 15 Hình 1.7. Quy trình nhân giống in vitro 20 Hình 1.8. α-naphthaleneacetic acid (NAA) 24 Hình 1.9. 6-benzylaminopurine (BA) 25 Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam 44 Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam 55 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tình hình kinh tế trên thế giới trong những năm gần đây biến động khá phức tạp. Nền kinh tế của Việt Nam cũng chịu nhiều ảnh hưởng. Đến năm 2015, nền kinh tế nước ta mới có sự chuyển biến. Trong đó, ngành nông nghiệp là ngành phát triển mạnh mẽ. Trong đầu năm 2015, ngành nông nghiệp đã tăng đáng kể và chiếm tỷ trọng lớn nhất (71%) trong nền kinh tế Việt Nam. Cùng với những thành tựu đạt được trong nền sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan cũng có những bước tiến đáng kể. Hiện nay lan Vũ nữ nói chung và các loại lan khác nói riêng đang được xem là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan là loại cây mang lại nhiều lợi nhuận cho các trung tâm, doanh nghiệp cũng như nhiều hộ gia đình nhờ việc cung cấp trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài. Nhiều nước trên thế giới kinh doanh xuất khẩu hoa lan như: Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Indonesia, Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya, Ở Việt Nam, các vùng trồng hoa lan phổ biến như Tây Nguyên, Đà Lạt, Yên Bái, Sa Đéc, Tp. Hồ Chí Minh, nhưng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt (Địa Lan), Tp. Hồ Chí Minh (Denrobium, Mokara, Vanda, Oncidium, ) với diện tích khá khiêm tốn khoảng 200 ha chỉ bằng 5,4% so với Thái Lan. Thái Lan xuất khẩu đến 38 nước trên thế giới trong đó có Việt Nam, đạt giá trị 104 triệu USD (2009). Trong khi đó Tp. Hồ Chí Minh với 168 ha Lan, sản lượng hàng năm mới chỉ giải quyết được khoảng 30% nhu cầu tại chỗ. Một vài công ty cũng xuất khẩu đến Mỹ, Nhật với Mokara cắt cành, tuy chất lượng đạt yêu cầu nhưng giá thành khá cao nên khó có thể cạnh tranh với Thái Lan. Nếu phải xuất một lượng lớn trong thời gian dài theo hợp đồng thì nước ta không thể đáp ứng được. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Nhân giống in vitro đã được chứng minh là một công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch và cs, 2001; Martin, 2003; Azad và cs, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan và cs, 2009). Lan Vũ nữ là loại lan có hoa nhỏ mọc thành từng chùm, đẹp, bền với nhiều màu sắc và hoa văn phong phú, nhưng lại là loài sinh trưởng chậm và là loài rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp trong vườn ươm và rất dễ nhiễm bệnh. Để có số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm nhằm đem đến sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ lai. Tuy nhiên, việc nhân giống bằng phương pháp gieo hạt này mang tính ngẫu nhiên, thu được cây có tính trạng không yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng cây ổn định về mặt di truyền. Do đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng cây lan Vũ nữ (Oncidium sp.) in vitro” nhằm tìm ra nồng độ thích hợp của một số chất cho việc nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh và gia tăng chất lượng cây giống. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng cây lan Vũ nữ nhằm thiết lập môi trường thích hợp góp phần nhân nhanh giống lan Vũ nữ (Oncidium sp.) 2
  13. Đồ án tốt nghiệp 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: lan Vũ nữ cam. Phạm vi nghiên cứu: bố trí thí nghiệm với các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng (BA, NAA), chất hữu cơ (nước dừa) và than hoạt tính nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của lan Vũ nữ. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam. - Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ cây Vũ nữ cam. 5. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, hai yếu tố. Các nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS V8 và chương trình Microsoft Excel 2010®. 6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài lên sự tạo chồi từ PLB và tạo rễ của lan Vũ nữ sẽ giúp tạo ra nguồn mẫu lớn trong một thời gian ngắn, đạt hiệu quả nhân giống cao. Từ đó, góp phần phục vụ cho những ứng dụng thực tế quan trọng, giúp nâng cao chất lượng cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế. Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ góp phần rất lớn trong công tác nhân nhanh giống cây trồng đồng thời mở ra triển vọng trong việc tạo được cây hoa lan Vũ nữ có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây giống. 3
  14. Đồ án tốt nghiệp 7. Kết quả đạt đƣợc - Xác định được nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa thích hợp cho sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính thích hợp đến khả năng tạo rễ cây Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy. 8. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về hoa lan Các họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả qua từng năm. Chúng phân bố từ đồng bằng rộng lớn cho đến vùng núi cao, mọc trải dài nhiều nơi, các loài lan rất khác biệt nhau: lan đất, thực vật biểu sinh hoặc thực vật phụ sinh hoặc ngay cả dưới mặt đất (Trần Văn Huân, Văn Tích Lượm (2004)). Mặc dù có khác biệt về địa hình phân bố. Nhưng đa số các loài này đều được xem là thực vật phụ sinh. Chúng thường có nguồn gốc từ các miền nhiệt đới của một số lục địa. 1.1.1. Nguồn gồc lịch sử và vị trí phân bố của cây hoa lan 1.1.1.1. Nguồn gốc lịch sử Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông, nói về hoa lan là phải nói đến người Trung Hoa, họ đã biết về lan vào khoảng 2500 năm vềtrước tức là ở thời đại của Đức Khổng Tử (551 – 479 trước công nguyên). Ở phương Đông lan được chú ý đến vì vẻ đẹp duyên dáng của lá, hương thơm của hoa do đó Khổng Tử đề cao lan là vua của những loài cỏ cây có hương thơm. Theo các tác giả Trần Hợp (1990) [9], Nguyễn Tiến Bân (1997) [2], Võ Văn Chi – Dương Đức Tiến (1978) [2], Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh (1991) [6], cây lan Orchida thuộc họ lan Orchidaceae, bộ lan Orchidales, lớp một lá mầm Monoctyledoneae, họ lan Orchidaceae ở trong lớp đơn tử diệp, thuộc ngành ngọc lan, thực vật hạt kín Magoliophyta, phân lớp hành Lilidae, có thể nói theo Pharastus (376 – 285 trước công nguyên) là cha đẻ ngành học và ông cũng là người đầu tiên dùng từ orchid để chỉ một loại lan có củ tròn. Người đạt nền tảng hiện đại cho môn học về lan là Joanlind (1979 – 1985), năm 1936 ông đã công bố sắp xếp các tông họ lan (A Tabuler view of the tribes of orchidaler) và tên của họ lan do ông đưa ra được dùng cho đến ngày nay (dẫn theo Trần Hợp, 1990) [9]. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.2. Vị trí phân bố Cây hoa lan mọc khắp mọi nơi trên thế giới từ miền gió tuyết đến sa mạc nóng bỏng khô cằn từ miền núi cao rừng thẳm đến đồng cỏ miền Bình Nguyên và ngay cả các vùng sình lầy cũng có lan, qua lịch sử biến đổi, cho đến ngày nay, người ta đã biết họ lan có một số lượng loài rất lớn khoảng 15.000 – 35.000 loài phân bố chủ yếu ở 680 vĩ Bắc đến 560 vĩ Nam (nằm gần cực Bắc như Thụy Điển, Alasksa) xuống đến các đảo cuối cùng của cực Nam ở Australia. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là trên các vĩ độ nhiệt đới đặc biệt là châu Mỹ và Đông Nam Á. Đa số lan mọc tập trung ở các rừng nhiệt đới, ở các nước châu Á như Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam như Phalaenopsis, Vanda, Archinis ở châu Mỹ như Costarica, Colombia, Venezuela có các giống Cattleya, Odontoglosum Theo Briger (1971) [13] vùng trung sinh Bắc bán cầu có 75 chi và 900 loài, Bắc Mỹ có 170 loài. Họ lan (Orchidaceae) thuộc vào một loài hoa đông đảo với khoảng chừng 750 chi và 30.000 loài nguyên thủy và khoảng một triệu loài lai; là loài hoa có số lượng lớn đứng thứ 2 sau họ cúc (Asteraceae). Theo Peresley (1981) thì vùng Châu Á nhiệt đới có 250 chi và 6801 loài trong đó chi Dendrobium có 1400 loài, chi Coelogyne có 200 loài, chi Phalaenopsis có 35 loài. Vùng Châu Mỹ nhiệt đới có 306 chi và 8266 loài. Trên thế giới có một số nước tập trung nhiều loài hoa như Colombia có 1300 loài, New Guinea có 1450 loài (Phan Thúc Huân) [10]. Ở Việt Nam, dấu vết nghiên cứu về lan ban đầu không rõ rệt lắm, người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Giolas Noureio – Nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha, ông đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789 trong cuốn “Flora cochin chinensis”, gọi tên các cây lan trong cuộc hành trình đến nam phần Việt Nam là Aerides, Phaius và Sarcopodium đã được Netham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera Planterum” (1862 – 1883) [12]. 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát sơ bộ ở Việt Nam, chi Dendrobium có khoảng 89 loài, Paphipoedium có 25 loài, Aerdes có 5 loài, chi Cymbidium có 20 loài, chi Phalaenopsis có 7 – 8 loài 1.1.2. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam 1.1.2.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước. Theo international Statistics Flowers and Plants, 2007, thị trường tiêu thụ hoa lan của khối EU rất hấp dẫn. Trong năm 2000, kim ngạch xuất nhập khẩu của hoa lan cắt cành và cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó lan cắt cành đạt 128 triệu USD. Năm 2006, khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan cho thế giới đạt 55 tỷ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỷ EUR. Trong đó, Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có ngành công nghệ trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước trên thế giới. Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% (52,049 ngàn sản phẩm) trên tổng sản lượng hoa lan trong khối EU. Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác nhưng do nhu cầu tiêu thụ hoa lan trong khối EU cao nên cũng trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỷ EUR. Tại Châu Á, Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu các chủng hoa lan nhiệt đới, đặc biệt là Oncidium. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Vanda và Oncidium. Hơn 80% lan trên thị trường thế giới là từ Thái Lan. Chỉ với các loại hoa chủ lực là Dendrobium, Oncidium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. Bên cạnh đó, Đài Loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan bằng quy mô công nghệ cao, giá trị doanh thu từ sản xuất loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với lan cắt cành. Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 7
  18. Đồ án tốt nghiệp 36 triệu cành lan. Trong đó, 12 triệu cành hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu cành đến Nhật Bản; 3 triệu cành đến trung quốc; 2,5 triệu cành đến Hoa Kỳ và 3,5 triệu cành cho các quốc gia khác. Vào tháng 6/2004, Hoa Kỳ đã cấp giấy phép xuất khẩu lan cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kỳ. 1.1.2.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển với nhiều chủng loại. Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2.500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5 – 6 %. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hóa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển rất nhanh. Tại TP. HCM, theo thống kê của sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông thôn TP. HCM trong năm 2003, doanh số kinh doanh hoa lan, cây kiểng chỉ đạt 200 – 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600 – 700 tỷ đồng ngay từ những tháng đầu năm. Đến quý 2, năm 2013, diện tích vườn lan đã đạt 199,9 ha trên tổng số 2010 ha diện tích sản xuất hoa và cây kiểng với sản lượng và chủng loại tăng khá mạnh trong diệp tết. Chủng loại hoa lan sản xuất trong diệp Tết của thành phố chủ yếu là Denrobium và Mokara; một ít Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Vanda. Hoa lan (chậu và cắt cành) có giá trị sản xuất ước 350,0 tỷ đồng, chiếm 23,4% tổng giá trị sản xuất hoa, cây kiểng Tết, đang mang lại thu nhập cao trên nhiều nông hộ. Tuy vậy hiện nay có cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, nên các nhà vườn nhập cây giống từ nước ngoài như: Thái Lan, Đài Loan và Trung Quốc. Tại Đà Lạt nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú và đặc chủng, được tìm trong rừng sâu, dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3% về chi và 76,5% về loài lan rừng của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những Năm 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, nghành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kỹ thuật công nghệ cao vào sản xuất. Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí cây trồng 8
  19. Đồ án tốt nghiệp từ 40.000 – 70.000 đồng/gốc lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 – 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô in vitro và đặt biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng. Năm 2007, Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt (Nay là Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nhân giống thành công Hồng Hài – loài lan Hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chúng chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống và khó sinh sản. Với khí hậu khá lý tưởng, Đà Lạt là cổ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan trong thiên nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước Asean khác. 1.1.2.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ TP. HCM những năm gần đây được xem như là đơn vị đi đầu trong cả nước về sản xuất hoa lan cắt cành theo quy mô tập trung. Chiến lược phát triển nông nghiệp của Thành phố năm 2010 là sản xuất được 300 ha trồng hoa lan phục vụ cho nhu cầu nội địa và xuất khẩu. Hoa lan trồng ở TP. HCM chủ yếu là giống Mokara nhập từ Thái Lan, hiện nay loại hoa này đang bị xuống giá mạnh do sản phẩm của chúng trên thị trường hoa trong nước gần đạt tới mức bão. Vì vậy nhiều nhà vườn, trang trại chuyển sang trồng hoa lan chậu có giá trị kinh tế cao hơn như Oncidium, Catleya, đáp ứng cho thị trường. Lan Vũ nữ (Oncidium) là loài hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao, là sản phẩm được cả thị trường trong nước và thế giới ưa chuyện. Đây là chủng hoa lan nhiệt đới, chu kỳ sinh trưởng ngắn, thời gian từ trồng đến ra hoa khoảng 18 – 20 tháng tùy thuộc vào điều kiện chăm sóc và vùng trồng, dễ áp dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp. Vì vậy từ lâu lan Vũ nữ đã được rất nhiều nhà sản xuất hoa trong nước quan 9
  20. Đồ án tốt nghiệp tâm. Tại TP. HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng lan Vũ nữ với quy mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Tuy nhiên việc sản xuất các loại lan này ở nước ta hiện nay vẫn còn rất hạn chế do nhiều nguyên nhân: không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu hợp lý, không đầu tư nê cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Ngoài ra, hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài Loan, Thái Lan, Thì ngành trồng lan của nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 1.1.3. Giới thiệu về lan Vũ nữ 1.1.3.1. Phân loại khoa học Giới: Plantace (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp: Liliopsida (Hành) Phân lớp: Liliidae (Hành) Bộ: Orchidales (Lan) Họ: Orchidaceae (Lan) Chi: Oncidium (Lan Vũ Nữ) Loài: Oncidium sp. Hình 1.1. Lan Vũ nữ (Nguồn: 10
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.2. Nguồn gốc và sự phân bố Cây lan Vũ nữ (Oncidium sp.), hay Dancing lady là loại hoa lan có khoảng 700 loài phân bố rất rộng ở bắc bán cầu từ Mexico đến Tây Ấn độ và Nam bán cầu tới tận Balivia, Paraguay. Đa số các loài hoa Oncidium đều có giả hành dẹp hay hình trụ hoa, hoa thường nhỏ nhưng đặc biệt có cánh môi rất lớn, hoa thường có nhị màu vàng và có điểm đốm đỏ trên cánh hoa, ngoài ra còn có một số loài hoa mang màu đỏ hoặc trắng, Chúng có thể mọc thành chùm và đôi khi có phân nhánh, nhụy bông hoa rất dài, có thể khoảng 80 – 120 cm. Tùy theo giống có lá dầy và cứng hoặc dài và mềm như nhiều lan khác, lan Vũ nữ có hình dạng gần giống như nhau nhưng khác ở màu sắc và một vài đặc điểm như: Dò hoa có thứ dài gần 2 m như Oncidium falcipetatum, Oncidium carthagenense, Oncidium divarcatum và cũng có những loài cho dò hoa ngắn như Oncidium cherophorum. Mỗi dò, tùy loài, mang từ 30 đến 100 hoa. Có nhiều giống cho hoa to đến 4 – 5 cm. Oncidium thường nở hoa vào mùa xuân hay hạ, nhưng cũng có cây cho hoa vào mùa thu. Theo American Orchid Society thì việc phân loại chi Oncidium lại không đơn giản: Khi được phân loại vào thập niên 1800, chi Oncidium bao gồm hàng trăm loài lan, có hình dạng bên ngoài tương đối giống nhau. Năm 2004, các nghiên cứu và DNA do Mark Chase, tại Jodrell Laboratory của Royal Botanic Garden, Kew, London đã tìm ra nhiều khác biệt giữa các loài lan được nhóm chung này, sau đó so sánh thêm những chi tiết thực vật và cấu trúc của hoa, sự phân biệt càng chính xác hơn. Norris Williams và Mark Whitten tại Florida Museum of Natural History (Gainesville) cũng có những nghiên cứu nhận định tương tự: Chi Oncidium được định danh lại là Oncidium Alliance (liên nhóm), một nhóm lan có 700 loài nguyên giống cộng thêm trên 1000 loài lai tạo. Oncidium Alliance hiện tạm chia thành những chi phụ: Oncidium, Miltonia, Miltionopsis, Odontoglossum, Rossioglossum, Zenlenkoa, Cirtochilum và Tolumnia. Chi chính thống Oncidium chỉ còn khoảng 150 loài. Một đặc điểm quan trọng là có thể lai giống giữa những cây tuy thuộc chi 11
  22. Đồ án tốt nghiệp phụ nhưng chỉ cần thuộc liên nhóm Alliance. Sự lai tạo, qua nhiều thế hệ đã tạo rất nhiều loài mới, đa dạng hơn. Một số chi phụ trong Alliance hiện nay đang được các nhà thực vật tách riêng để tạo thành những chi riêng biệt như Cyrtochilum (120 loài), Psychopsis (5 loài), Tolumnia (35 loài), Zenlenkoa (1 loài duy nhất, được tách riêng từ 2001). Hình 1.2. Lan Vũ nữ cam (Hình chụp thực tế) 12
  23. Đồ án tốt nghiệp ONCIDIUM SWEET SUGAR ONCIDIUM ONCIDIUM JIANT FANLEAVE ONCIDIUM SNOW WHITE ONCIDIUM BIG ONCIDIUM BAIPAI GOLDEN PURPLE ONCIDIUM POP CAT ONCIDIUM ONCIDIUM ORANTO CHALEE BABY WHITE Hình 1.3. Một số giống lan Vũ vữ (Nguồn: 13
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.3. Đặc điểm hình thái sinh học  Rễ Không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh hay lông hút một cách rõ ràng. Chúng thường có dạng hình tròn, vừa, có nhánh hoặc không phân nhánh. Màu sắc: màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu vàng trắng. Rễ thường mọc tràn ra ngoài chậu, bám lên giá thể hoặc là than mục, buông lơ lửng trong không khí, có lợi cho việc hút oxy và nước. Nhiều nghiên cứu cho thấy rễ lan Vũ nữ nói riêng cũng như rễ phong lan nói chung có khả năng quang hợp. Hình 1.4. Rễ của lan Vũ nữ (Nguồn: Rễ của lan Vũ nữ cũng như một số loại lan khác thường có nấm cộng sinh. Do hạt của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không được cung cấp đủ dinh dưỡng khi nảy mầm, trong điều kiện mầm tự nhiên, cần dựa vào các nấm cộng sinh để hút chất dinh dưỡng. trong quá trình sinh trưởng của cây, các loài nấm này sống cộng sinh tại rễ của cây lan để hỗ trợ lẫn nhau, vì thế rễ của cây lan còn được gọi là rễ nấm. Nên việc tưới và bón phân cho cây lan Vũ nữ cần cẩn thận chính là vì trên rễ cây có nấm cộng sinh. Gốc cây lan có rễ khí sinh màu trắng, cây càng mọc khỏe rễ trắng càng nhiều.  Thân Có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây trong hoàn cảnh khô hạn khi sống bám trên cao. Củ giả hình thuôn dài. Kích thước của củ giả cũng rất biến động, tùy vào lúc 14
  25. Đồ án tốt nghiệp sinh trưởng của lan. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Hình 1.5. Thân của lan Vũ nữ (Nguồn:  Lá Cây Lan Vũ Nữ cao 20 – 90 cm, lá hình kiếm, mỏng và có màu xanh nhạt, 2 – 3 lá mọc trên một củ giả hình trứng, lá mọc lệch thành hình quạt.  Hoa Lan Vũ Nữ có 2 loại: hoa to và hoa nhỏ. Cành hoa mọc từ gốc vẩy giả, hoa mọc trên các nhánh ngắn của cành với nhiều màu sắc từ màu đỏ, hung nâu đến hồng, vàng, xanh hoặc trắng. Mỗi cây Lan Vũ Nữ 1 năm mọc 2 lần hoa, sau khi hoa tàn sức sống của cây suy yếu dần. Hình 1.6. Hoa lan Vũ nữ (Nguồn: 15
  26. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ  Nhiệt độ Lan Vũ nữ có thể phát triển ở nhiệt độ tối thiểu 22 – 25oC ban ngày và 18oC vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để cây phát triển tốt là 25oC. Oncidium thích nghi được với biên độ sinh thái khá rộng, chúng có thể trồng được khắp nơi các tỉnh phía Nam, phía Bắc và trên vùng cao. Oncidium là cây cần độ ẩm cao, đặc biệt trong thời kỳ tăng vì trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày vào mùa khô, 2 lần/ngày vào mùa mưa. Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống.  Độ ẩm Lan Vũ Nữ chịu ẩm cao, cần ẩm độ 50 – 80% nhưng không chịu nhiều nước. Giàn che lan cần phải thích hợp che được 70% nắng. Lan Vũ nữ cần nhiều ẩm hơn nước tưới.  Ánh sáng Lan Vũ nữ cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát. Tuy nhiên không trồng lan Vũ nữ ở nơi quá râm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuếch tán vừa phải rất tốt; nếu chiếu sáng được 12 – 16 giờ mỗi ngày, 12 giờ cho cây lớn và 16 giờ cho cây nhỏ thì cây sẽ phát triển tốt hơn. Trồng Vũ nữ trong nhà kính cần có hệ thống làm mát, ánh sáng nhân tạo thích hợp để lan phát triển tốt; còn trồng trong nhà thì cần để lan ở gần cửa sổ có ánh nắng hoặc không cũng được.  Độ thông thoáng So với các loài lan khác, sự thông thoáng rất cần thiết cho lan Vũ nữ. Lan Vũ nữ hay bị bệnh thối nhũn lá (phỏng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa, lan Vũ nữ tăng trưởng mạnh, nhưng những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt cây; do đó để ngăn ngừa tình trạng trên lan cần phải được che chắn cẩn thận. 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Cần cung cấp đủ nước cho cây tránh sự héo rũ, nhăn lá vào mùa gió nhiều và mùa nắng.  Nhu cầu nƣớc tƣới Lan Vũ nữ là cây thân có giả hành để dự trữ dinh dưỡng và nước, hơn nữa nước thường tập trung ở giả hành vì lan Vũ nữ có giả hành tương đối lớn, có lá nhiều nên diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho cây một lượng nước đầy đủ. Tránh để lan quá khô vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: sáng, trưa, chiều. Chú ý khi tưới nước vào buổi trưa phải tưới thật đẫm đễ tránh nắng sẽ làm sốc cây lan. Mùa mưa thì tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp, có thể khoảng 10 ngày tưới 1 lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá cây sẽ khô, tránh nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết.  Dinh dƣỡng Lan Vũ nữ cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ. Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao và đừng tưới lên ngọn cây, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Tùy từng độ tuổi của cây mà ta có lượng phân cần bón với tỷ lệ NPK thích hợp. Ngoài việc dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ loãng có pha thêm thuốc trừ nấm. Lan Vũ nữ cần bón phân với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: Bánh dầu, vitamin B1 kích thích ra rễ, Các chất dinh dưỡng cần thiết nhất là đạm (N), lân (P), potassium (K) và calcium (Ca). Sự thiếu các chất dinh dưỡng này có thể làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển và làm giảm năng suất hoa. 1.1.3.5. Giá trị sử dụng của lan Vũ nữ: Hoa lan Vũ nữ là nguyên liệu cắm hoa cao cấp, những giỏ hoa không thể nào thiếu đi được những cành hoa Vũ nữ tươi tắn này được. Lan Vũ nữ thường được trồng kiểng và bài trí trong nhà, bên cửa sổ, hành lang cũng có thể bài trí trong 17
  28. Đồ án tốt nghiệp phòng làm việc, phòng học và đại sảnh khách sạn. Ngoài ra, những cánh hoa lan vũ nữ còn được dùng trong ngành nước hoa. 1.2. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.2.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ khoa học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 1.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định: - Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp - Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (Cam, Quýt). - Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (Khoai Tây), cây cảnh (Phong Lan), cây lâm nghiệp (Bạch Đàn, ). - Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm. - Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo. - Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen. - Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống. - Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai. - Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào. Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế. Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta là tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995). 19
  30. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro Chuẩn bị cây mẹ Nuôi cấy khởi động Nhân nhanh chồi Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Chuyển cây ra đất trồng Hình 1.7. Quy trình nhân giống in vitro Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ - Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao. - Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non v.v - Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động - Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy. - Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi. Giai đoạn nuôi cấy này gọi là cấy mẫu in vitro. - Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất 20
  31. Đồ án tốt nghiệp định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi - Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích nhân nhanh. - Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1 – 2 tháng tùy loại cây. Những khả năng tạo cây đó là: - Phát triển chồi nách. - Tạo phôi vô tính. - Tạo đỉnh sinh trưởng mới. - Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh - Mỗi chồi khi ra rễ là một cây hoàn chỉnh - Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. - Giai đoạn 4 thông thường cần 2 – 8 tuần. 21
  32. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần sự chăm sóc đặc biệt. Vì cây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu: - Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và làm mát - Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển. - Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 – 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và quan sát kỹ. 1.2.4. Thành phần hóa học của các môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [28]: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng - Các vitamin - Các amino acid - Nguồn Carbon: một số các loại đường - Các chất điều hoà sinh trưởng - Than hoạt tính, nước dừa, chuối - Chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar) Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: - Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường. - Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống ). - Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng ). 22
  33. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.1. Các chất khoáng [28] Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và đa lượng: - Các chất dinh dưỡng đa lượng bao gồm sáu nguyên tố: nitrogen (N), phosphor (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau. - Các nguyên tố vi lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn, Mo, Zn ): Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật. 1.2.4.2. Vitamin [28] Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. 1.2.4.3. Các chất điều hòa sinh trưởng [7] Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học là phytohormon. Đây là những sản phẩm bình thường của quá trình sống ở thực vật, được tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây. Những phytohormon hiện nay được biết nhiều nhất là auxin, gibberrellin, cytokinin, abcisic acid và ethylene. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đã có mặt cùng lúc nhiều chất điều hoà sinh trưởng khác nhau nhưng với tỷ lệ rất khác nhau. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp a) Auxin Auxin là loại phytohormone được xác định đầu tiên, được tổng hợp ở hầu hết các mô thực vật và có hoạt tính mạnh. Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến.  Giới thiệu về NAA Tên khoa học: Naphthaleneacetic acid; Alpha-naphthaleneacetic acid; α-naphthaleneacetic acid; Naphthalene acetic acid; NAA; Naphthalene-1-acetic acid; 1-Naphthalene acetic acid; 1-Naphthylacetic acid. Trọng lượng phân tử: 186,21. Công thức cấu tạo: C12H10O2. Hình 1.8. α-naphthaleneacetic acid (NAA)  Vai trò sinh lý của Auxin - Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào. - IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh. - IAA đóng vai trò kích thích sự phân hóa của các mô dẫn (xylem và phloem). IAA, IBA, NAA thường được sử dụng cho phát sinh rễ. - Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và phát sinh chồi phụ có ảnh hưởng khác nha với sự rụng lá, sự ra hoa đậu quả, sự phát triển và chín của quả. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp - 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp. b) Cytokinin Cytokinin là nhóm phytohormone thứ ba được phát hiện sau auxin và giberelin. Các cytokinin có tác dụng kích thích sự phân bào và phân hóa chồi. Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân chia tế bào, phân hóa chồi từ mô sẹo, tạo phôi vô tính. Cytokinin gồm có kinetin, BA, zeatin, TDZ.  Giới thiệu về BA Tên khoa học: 6-benzylaminopurine, N-benzyl-Adenine, N6-Benzyladenine, benzylaminopurine, N-(phenylmethyl)-1H-purin-6-amine, Benzyladenine, Cytokinin B, Purin-6-amine, N-(phenylmethyl), Verdan senescence inhibitor, 6BA. Trọng lượng phân tử: 225,25. Công thức cấu tạo: C12H11N5. Hình 1.9. 6-benzylaminopurine (BA)  Vai trò sinh lý của Cytokinin - Hoạt hóa sự phân chia tế bào. - Hình thành chồi và kích thích mạnh mẽ sự phân hóa chồi. - Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây. - Phân hóa giới tính cái, tăng tỷ lệ hoa cái. - Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ. 25
  36. Đồ án tốt nghiệp c) Gibberellin Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3. Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật.  Vai trò sinh lý của Gibberellin - Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic acid. - Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân. Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin. - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hoá các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi 1.2.4.4. Nguồn carbon [3] Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả nảng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, D-glucose, D-fructose. Saccharose là nguồn các carbon là nguồn carbon được sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm. 1.2.4.5. Than hoạt tính (AC) Bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Khi bổ sung AC vào môi trường nuôi cấy thì sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hoá phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng làm tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. AC nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng hoặc làm đen môi trường [28]. 26
  37. Đồ án tốt nghiệp Khả năng kích thích sự tăng trưởng của AC là do nó kết hợp với các hợp chất phenol độc tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Bổ sung thêm AC vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do AC có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng và nó có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ trong môi trường nuôi cấy [15]. AC thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 – 3% (v/v) [28]. 1.2.4.6. Nước dừa [28] Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi. 1.2.4.7. Độ pH và agar pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 – 5,8. Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng. Khi pH 7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây. Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường, nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1%. 1.2.5. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro  Ƣu điểm Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp Tiết kiệm không gian: vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. Nâng cao chất lượng cây giống: nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc. Lợi thế về vận chuyển: các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi.  Nhƣợc điểm Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp. Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Sự phát sinh hình thái thực vật Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ những thay đổi của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm sự phát sinh chồi bất định, phát sinh rễ bất định, tạo phôi soma, Trong phát sinh cơ quan, chồi thường được cảm ứng và tăng trưởng trước, rễ được tạo ra sau. Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau đó mới hình thành chồi như trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi được cảm ứng bởi Agrobacterium rhizogenes (James và cs, 1988). Với những cây thân gỗ cứng, chồi thường được cảm ứng trực tiếp từ bộ lá.  Sự phát sinh chồi bất định Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sự tạo chồi nhằm nhân nhanh để tạo một số lượng chồi lớn với những đặc tính đồng nhất và giống với cây mẹ. Sự tạo chồi in vitro có thể từ nuôi cấy cơ quan, mô hay tế bào trên môi trường có hàm lượng cytokinin kết hợp với auxin. Tỷ lệ về hàm lượng của hai loại phytohormone này là rất quan trọng. Nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì mẫu có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại, nếu nồng độ auxin cao hơn cytokinin thì mẫu có khuynh hướng tạo rễ. Trong sự tạo chồi, hoặc là chồi được tạo trực tiếp hoặc thông qua mô sẹo. Các tế bào của mô cấy được cảm ứng bởi môi trường để phản biệt hóa trở về trạng thái sinh mô. Những tế bào sinh mô được cảm ứng để có khả năng biệt hóa trở lại tạo một cơ quan chồi mới được gọi là chồi bất định. Chồi thường được cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi (vùng nhu mô vỏ) nên thường được xem là có nguồn gốc ngoại sinh. 29
  40. Đồ án tốt nghiệp  Sự phát sinh rễ bất định Sự tạo rễ trên nhánh cây hoặc chồi in vitro gọi là sự tạo rễ bất định, gồm ít nhất là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự, 1980): - Giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe – mộc hoặc chu luân, giai đoạn này được khởi phát bởi auxin ở nồng độ cao. Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào thượng tầng, đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn. - Giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp. Điều quan trọng là nồng độ của auxin kích thích giai đoạn tạo sơ khởi rễ nhưng có thể ức chế giai đoạn kéo dài rễ và ngược lại. 30
  41. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian Từ tháng 04/2018 – 07/2018 2.1.2. Địa điểm Phòng Thực nghiệm cây trồng, Trung tâm Công nghệ Sinh học số 2374 Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Các mẫu lan Vũ nữ cam in vitro được cung cấp bởi phòng Thực nghiệm Cây trồng Trung tâm CNSH TP. HCM. 2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.2.1. Dụng cụ - trang thiết bị Dụng cụ: - Chai thủy tinh 500 ml, chai thủy tinh 100 ml - Ống đong 50 ml, ống đong 100 ml, ống đong 500 ml, ống đong 1000 ml - Pipet 2 ml, pipet 5 ml, pipet 10 ml, micropipet 20 – 200 µl, micropipet 100 – 1000 µl. - Cốc thủy tinh. - Bao PE chịu nhiệt, giấy, nút cao su, bông, giấy thấm. Bộ dụng cụ cấy gồm: dao cấy, đĩa cấy, đèn cồn - Đèn huỳnh quang, nhiệt kế, ẩm kế Trang thiết bị: - Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ. - Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trường dự trữ. - Bếp điện: để nấu môi trường và hấp cách thủy hóa chất. - Cân phân tích: để cân đường, agar, các hóa chất. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp - Nồi hấp autoclave: hấp vô trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy. - Máy đo pH. - Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25± 2oC. Bảng 2.1. Các trang thiết bị trong thí nghiệm Tên thiết bị Model & Hãng sản xuất Tủ cấy vô trùng ESCo LHC - A41 - Indonesia Tủ sấy Member t UNE 550 - Đức Mấy cất nước hai lần Bibby Scientific (Stuart) A4000D - Anh Tủ lạnh Hitachi - Nhật Bếp từ Philips - Hà Lan Cân phân tích 2 số lẻ Denver Instrument TP 1502 - Đức Máy đo pH Schott Lab 860 - SI Analytic - Đức Nồi hấp tiệt trùng (Nồi hấp 1 cửa ALP) CL - 40M - Nhật Kính hiển vi (3 mắt kính) Meiji MT4300H - Nhật 2.2.2.2. Hóa chất - Cồn 960, 700 - Saccharose - Agar - Chất hữu cơ: nước dừa. - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật: NAA (MERCK - Đức), BA (BIO BASIC - Canada). - Peptone. - Môi trường MS (Murashiga & Skoog) (1962): 32
  43. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. Hóa chất môi trƣờng MS Nguyên tố đa lượng: NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.H2O 440 mg/l Nguyên tố vi lượng: H3BO5 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,5 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l KI 0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Vitamins: Inositol 100 mg/l Nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Thiamin HCl 0,1 mg/l Fe EDTA: FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2EDTA.2H2O 37,3 mg/l 2.2.3. Điều kiện phòng nuôi cấy Mẫu cấy được chuyển vào phòng nuôi cây với điều kiện ánh sáng 2000 ± 500 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 50%, chiếu sáng 12 giờ/ngày. 33
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu - Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS V8 và Microsoft Excel 2010. - Phân tích thống kê qua phép Duncan’s ở mức ý nghĩa 5%. - Số mẫu tạo chồi = số PLB tạo chồi trong tổng số mẫu PLB. - Chiều cao chồi (mm) = Tổng chiều cao/tổng số chồi theo dõi - Số lá/chồi = Tổng số lá thu được/tổng số chồi - Số rễ/mẫu (rễ) = Tổng số rễ thu được/tổng số mẫu theo dõi. - Chiều dài rễ (mm) được đo từ gốc rễ đến chóp rễ dài nhất. 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam Môi trường thí nghiệm: thực hiện trên môi trường MS có bổ sung đường 30 g/l, 0,5 g/l pepton, 0,1 g/l Myo-inositol, 0,02 g/l glycine, agar 6,5 g/l. Chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa được bổ sung vào môi trường với nồng độ theo bảng 2.3, pH môi trường 5,5. Vật liệu thí nghiệm: mẫu PLB lan Vũ nữ cam. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 12 nghiệm thức, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai, mỗi chai có tổng mẫu cấy (PLB) là 6. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam Nồng độ BA Nghiệm thức Nƣớc dừa (ml/l) (mg/l) A1 (ĐC) 0 A2 50 0 A3 100 A4 150 A5 0 A6 50 1 A7 100 A8 150 A9 0 A10 50 2 A11 100 A12 150 35
  46. Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi: - Thời gian tạo chồi. - Tỷ lệ mẫu tạo chồi/PLB - Số chồi/mẫu - Chiều cao chồi (mm). - Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô - Hình thái, màu sắc, kích thước, Số liệu được ghi nhận sau 8 tuần. 2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam Môi trường thí nghiệm: thực hiện trên môi trường MS có bổ sung đường 30 g/l, 0,5 g/l pepton, 0,1 g/l Myo-inositol, 0,02 g/l glycine, agar 6,5 g/l. Chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính được bổ sung vào môi trường với nồng độ theo bảng 2.4, pH môi trường 5,5. Vật liệu thí nghiệm: chồi đơn lan Vũ nữ cam đã cắt hết rễ. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí gồm 9 nghiệm thức, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 chai, mỗi chai có tổng mẫu cấy là 6. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam Nồng độ NAA Nồng độ than Nghiệm thức (mg/l) hoạt tính (g/l) B1 (ĐC) 0 B2 0 0,5 B3 0,7 B4 0 B5 0,5 0,5 B6 0,7 B7 0 B8 1 0,5 B9 0,7  Chỉ tiêu theo dõi: - Thời gian tạo rễ. - Số lá/mẫu. - Chiều cao cây ( mm). - Số rễ mới. - Chiều dài rễ TB (mm). - Trọng lượng tươi chồi/rễ - Trọng lượng khô chồi/rễ Số liệu được ghi nhận sau 8 tuần. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là thành phần quan trọng của môi trường nuôi cấy. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Trong đó, BA là một loại cytokinin tổng hợp được sử dụng phổ biến trong việc kích thích phân hóa chồi ở nhiều loài thực vật (George và cộng sự, 1996). Ngoài ra, zeatin có trong nước dừa là một loại cytokinin tự nhiên thường được sử dụng. Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi cấy phôi Datura metel L. và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota. Các nghiên cứu sau đó trên hoa lan cho thấy nước dừa rất thích hợp cho đối tượng này. Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty,1955; Niimoto and Sagawa, 1961). Theo kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và cộng sự trong nước dừa có các amino acid, acid hữu cơ, đường sucrose, glucose, fructose , các hợp chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside với thành phần và hàm lượng rất cân đối [1]. Khi bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy, hiệu quả kích thích được nhận thấy chỉ xảy ra khi hàm lượng nước dừa được thêm vào từ 10 – 15 % và hàm lượng 20% là cần thiết cho quá trình tăng trưởng của mô sẹo ở một số loài cây [18], [21]. Năm 2012, Saranjeet và cộng sự nhận thấy bổ sung 10% nước dừa đã thúc đẩy quá trình nhân nhanh protocorm và hình thành chồi có từ 2 – 3 lá và 1 – 2 rễ, đạt 73,75% [25]. Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và nước dừa lên sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam đã được theo dõi trong 8 tuần và kết quả ghi nhận được như sau: Sau 2 tuần nuôi cấy, PLB trở nên xanh hơn nhưng chưa có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy thì có sự khác biệt rõ ràng hơn giữa các nghiệm thức, có sự biệt hóa thành chồi, kích thước PLB cũng như số lượng chồi tăng dần. Đến tuần thứ 6, các mẫu cấy đã bắt đầu có sự khác biệt. Nghiệm thức A1, A2, A3, A4 mẫu cấy có sự tăng trưởng về số lượng chồi chậm lại, tuy nhiên các chồi bắt đầu phát triển rõ rệt về chiều cao. Ở nghiệm thức A5, A6, A7, A8 PLB tăng trưởng chậm lại về kích thước. Các nghiệm thức còn lại phát triển bình thường về kích thước PLB cũng như số lượng chồi. Tuần nuôi cấy thứ 7 và thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.1. 39
  50. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam Tỷ lệ Hàm Số chồi/ Trọng Trọng mẫu tạo Chiều cao lƣợng Đặc điểm NT mẫu lƣợng tƣơi lƣợng chồi chồi (mm) chất khô hình thái (chồi) (mg) khô (mg) (%) (%) Hình thành cụm chồi to, màu A1 100 36,2fg 26,98ab 2916,98 63,23 2,17 xanh, ít chồi, chồi cao Hình thành cụm chồi to, màu A2 100 36,2fg 22,20cdef 4485,12 121,20 2,70 xanh, ít chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi to, màu A3 100 38,5de 28,85a 2525,72 80,25 3,18 xanh, ít chồi, chồi cao Hình thành cụm chồi to, màu A4 100 34,1hi 24,78ab 2727,40 85,17 3,12 xanh, ít chồi ít, chồi cao Hình thành cụm chồi nhỏ, màu A5 100 40,1bc 23,94bcd 1683,67 79,00 4,69 xanh, nhiều chồi, chồi cao Hình thành cụm chồi nhỏ, màu A6 100 33,5ij 20,61defg 1903,68 65,92 3,46 xanh, ít chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi nhỏ, màu A7 100 37,1ef 18,54fg 1375,88 53,58 3,89 xanh, ít chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi nhỏ, màu A8 100 32,0i 22,50cde 1261,07 59,58 4,72 xanh, ít chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi nhỏ, màu A9 100 35,1gh 18,43fg 2588,32 79,05 3,05 xanh, ít chồi, chồi thấp 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Hình thành cụm chồi to, màu A10 100 42,6a 17,82g 2195,83 94,93 4,32 xanh, nhiều chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi to, màu A11 100 41,3ab 18,85efg 2421,23 98,50 4,07 xanh, nhiều chồi, chồi thấp Hình thành cụm chồi to, màu A12 100 39,2cd 20,59defg 2213,22 107,80 4,87 xanh, nhiều chồi, chồi thấp TB 100 37,16 22,02 2358,18 89,35 3,69 CV 4,34 16,5 BA CW * BA*CW * Ghi chú: - Các chữ cái: a, b, c, d, trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's test với độ tin cậy P 0,05. - ns: p > 0,05; : p < 0,01; *: 0,01< p < 0,05. 41
  52. Đồ án tốt nghiệp Số chồi 50 40 30 20 Số chồi 10 0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Nghiệm thức Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến số chồi của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy mm Chiều cao chồi 35 30 25 20 15 10 Chiều cao chồi 5 0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Nghiệm thức Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến chiều cao chồi của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 42
  53. Đồ án tốt nghiệp (mg) fdgh (%) 5000 6 4500 4000 5 3500 4 3000 2500 3 2000 1500 2 1000 1 500 0 0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Nghiệm thức Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Hàm lượng chất khô (%) Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô và hàm lƣợng chất khô của PLB lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 43
  54. Đồ án tốt nghiệp A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam (1cm: ) A1: BA 0 mg/l + CW 0 ml/l; A5: BA 1 mg/l + CW 0 ml/l; A9: BA 2 mg/l + CW 0 ml/l; A2: BA 0 mg/l + CW 50 ml/l; A6: BA 1 mg/l + CW 50 ml/l; A10: BA 2 mg/l + CW 50 ml/l; A3: BA 0 mg/l + CW 100 ml/l; A7: BA 1 mg/l + CW 100 ml/l; A11: BA 2 mg/l + CW 100 ml/l; A4: BA 0 mg/l + CW 150 ml/l; A8: BA 1 mg/l + CW 150 ml/l; A12: BA 2 mg/l + CW 150 ml/l Nhận xét và thảo luận: Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA và nước dừa thì có sự khác biệt rõ rệt ở các nghiệm thức. Từ bảng kết quả 3.1 ta có thể kết luận rằng BA và nước dừa đều có ảnh hưởng đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam. Ở thí nghiệm này, tất cả các nghiệm thức đều đạt tỉ lệ mẫu tạo chồi ở mức cao nhất là 100%. 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Ở môi trường không bổ sung nước dừa, số chồi mới hình thành thấp (37,08 chồi) và tăng dần (37,42 chồi) khi tăng nồng độ nước dừa lên 50 ml/l. Khi môi trường nuôi cấy được bổ sung nước dừa với nồng độ 100 ml/l thì số lượng chồi phát sinh đạt mức cao nhất (38,96 chồi). Tuy nhiên số chồi lại giảm (còn 35,11 chồi) khi tăng nồng độ nước dừa lên 150 ml/l, điều này cho thấy nồng độ nước dừa trong môi trường nuôi cấy cao sẽ ức chế sự gia tăng số lượng chồi. Các nghiệm thức không bổ sung BA thì hình thành cụm chồi to, màu xanh, chồi cao (25,70 mm) tuy nhiên cho số chồi ít (36,35 chồi) và hàm lượng chất khô thấp (2,79%). Khi tăng BA 1 mg/l cho kết quả xấu nhất với cụm chồi nhỏ, màu xanh, số chồi mới hình thành ít (35,68 chồi), chồi thấp (21,40 mm) nhưng hàm lượng chất khô cao (4,19%). Các nghiệm thức còn lại cho cụm chồi to, màu xanh, nhiều chồi (39,55 chồi), hàm lượng chất khô cao (4,08%) tuy nhiên chiều cao chồi thấp (18,92 mm). Trong một số trường hợp, cytokinin đơn độc là đủ để kích thích phôi soma hoặc PLB có hoặc không có giai đoạn hình thành mô sẹo trung gian (Chen và cộng sự 1999, Chen và Chang 2000) [19], [20]. Hơn nữa, sự kết hợp của cytokinin (kinetine và zeatin) cũng có kết quả thích hợp cho sự tái sinh chồi (Wu và cs, 2004) [26]. Nước dừa là nguồn dinh dưỡng dồi dào, cung cấp nguồn đạm (từ nhiều loại acid amin, acid hữu cơ) và carbohydrate (sucrose, glucose, fructose, ). Ngoài ra, nước dừa còn chứa một số chất điều hòa sinh trưởng, được biết đến nhiều nhất là zeatin (Arditti, 1992). Cấu trúc của zeatin gần giống với kinetin nhưng hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần. Zeatin có trong nước dừa là một loại cytokinin, chất này làm tăng hoạt động phân chia tế bào trong điều kiện có auxin, giúp gia tăng kích thước tế bào và tổng hợp protein. Đồng thời trong nước dừa có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng chưa xác định, các thành phần dinh dưỡng bổ sung này sẽ giúp thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào. Theo phân tích thành phần dinh dưỡng của tổ chức y tế thế giới (WHO) thì trong nước dừa có chứa protein, carbohydrate, calcium, sắt và một số vitamine như thiamine, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Mặc dù 45
  56. Đồ án tốt nghiệp protein trong nước dừa đã bị loại bỏ do sự kết tủa trong quá trình lưu giữ lâu dài, nhưng các thành phần đa dạng khác của nước dừa đã cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc kích thích sự tăng trưởng và nhân số lượng tế bào [1]. Theo Vũ Văn Vụ (1993), nước dừa có chứa khá nhiều hợp chất nitrogen dạng khử như các acid amine, ngoài ra trong nước dừa còn chứa các hormone sinh trưởng thuộc nhóm cytokinine. Trong nghiên cứu này, việc bổ sung nước dừa đã làm thay đổi nồng độ và loại cytokinin trong môi trường nuôi cấy [1]. Nhìn chung, các kết quả cho thấy môi trường nuôi cấy bổ sung BA ở nồng độ 2 mg/l kết hợp với 50 ml/l nước dừa cho sự tạo chồi từ PLB tốt nhất với số chồi nhiều nhất là 42,6 chồi/mẫu, hàm lượng chất khô cao (4,32% so với trung bình là 3,69%) tuy nhiên chiều cao chồi thấp (17,82 mm so với trung bình là 22,02 mm). Dựa theo kết quả ghi nhận được trong thí nghiệm này, môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 50 ml/l nước dừa (A10) cho kết quả thích hợp nhất cho sự tạo chồi từ PLB lan Vũ nữ cam. 46
  57. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển của thực vật. Thông thường auxin kích thích kéo dài tế bào, cảm ứng tạo mô sẹo khi chúng dùng riêng lẻ hoặc kết hợp các CĐHSTTV khác. Kích thích sự phát sinh sơ khởi rễ và kìm hãm kéo dài rễ. Một số auxin có tác động riêng biệt lên sự tạo rễ và phát triển của mô cấy hoặc chồi tái sinh. NAA và IAA có tác động sinh lý quan trọng trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái, kích thích phát triển chồi bên và hình thành rễ, kéo dài thân và lá bởi cơ chế kéo dài tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự tăng trưởng của tế bào cũng như hấp phụ các chất ức chế sự tăng trưởng tế bào thực vật, làm giảm quá trình oxy hóa của phenol hay sự tích tụ các chất gây hóa nâu, thay đổi pH trung bình đến mức tối ưu, tạo môi trường tối, có thể mô phỏng điều kiện của đất. Tác động của than như một chất điều hòa tăng trưởng còn chưa rõ ràng, nhưng một số dẫn chứng công nhận khả năng giải phóng dần một số sản phẩm hấp phụ (chất dinh dưỡng, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật), tự bản thân than cũng giải phóng một số chất tự nhiên có thể thúc đẩy sự tăng trưởng. Một số báo cáo cũng cho thấy khả năng kích thích hình thành củ và tăng kích thước củ của than hoạt tính trên Lilium sp., Allium sativum, Nerine sarniensis, Muscari armeniacum, Narcissus tazetta. Ngoài ra, một số thí nghiệm cho thấy hiệu quả tạo chồi và rễ (Gossypium hirsutum, Vitis vinifera, Salix caprea), tăng chiều cao chồi (Acacia mearnsii), tăng khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo (Acacia sinuate), hỗ trợ trong biệt hóa mô sẹo (Triticale sp., Cynodon dactylon), tạo và kéo dài chồi (G. hirsutum, Exacum sp., Eucalyptus sp.) [27]. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam đã được theo dõi trong 8 tuần và kết quả ghi nhận được như sau: Sau 2 tuần nuôi cấy, các chồi tăng trưởng bình thường, chiều cao và số lá tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Theo dõi sau 3 tuần nuôi cấy thì có sự khác biệt rõ ràng hơn giữa các nghiệm thức, bắt dầu có sự hình thành rễ lần lượt ở các nghiệm thức B5, B6, B7, B4, B3, B2, B1, B8, B9. Đến tuần thứ 6, các mẫu cấy đã bắt đầu có sự khác biệt. Nghiệm thức B1, B2, B3 các chồi hình thành rễ rất ít. Ở nghiệm thức B4, B5, B7 mẫu cấy tăng trưởng tốt, thân cao, to, rễ nhiều và dài hơn so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức B9 tăng trưởng chậm về chiều cao. Các nghiệm thức còn lại phát triển bình thường. Tuần nuôi cấy thứ 7 và thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ về hình thái rõ rệt. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.2. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam Số lá Chiều Chiều TLT TLK HLCK TLT TLK Số rễ HLCK TTLT TTLK THLCK NT /mẫu cao cây dài rễ chồi chồi chồi rễ rễ (rễ) rễ (%) (mg) (mg) (%) (lá) (mm) (mm) (mg) (mg) (%) (mg) (mg) B1 6,50ab 42,35abc 1,06e 14,29f 140,43 15,08 10,74 8,20 1,18 14,43 148,63 16,27 10,94 B2 6,09b 39,19cd 1,52e 11,00g 100,95 11,55 11,44 4,90 1,00 20,41 105,85 12,55 11,86 B3 6,59a 39,04cd 1,46e 12,36g 152,48 14,23 9,33 12,40 1,22 9,81 164,88 15,45 9,37 B4 6,57a 44,43ab 4,72a 30,37a 238,97 24,47 10,24 59,70 7,97 13,34 298,67 32,43 10,86 B5 5,56c 41,39abc 3,76c 24,35c 142,25 14,15 9,95 42,98 5,07 11,79 185,23 19,22 10,37 B6 5,57c 40,13bcd 2,78d 22,35d 124,70 12,37 9,92 38,83 3,45 8,88 163,53 15,82 9,67 B7 5,17cd 45,30a 4,30ab 28,33b 197,48 16,32 8,26 68,95 6,92 10,03 266,43 23,23 8,72 B8 5,44c 39,22cd 2,48d 16,37e 147,58 12,62 8,55 41,82 4,18 10,00 189,40 16,80 8,87 B9 5,15c 36,13d 4,09bc 22,63d 121,42 11,08 9,13 40,48 4,27 10,54 161,90 15,35 9,48 TB 5,85 40,8 2,91 20,23 151,81 14,65 9,37 35,36 3,92 12,14 187,17 18,57 10,02 CV 7,55 10,47 18,39 8,49 49
  60. Đồ án tốt nghiệp NAA ns AC * NAA*AC ns Ghi chú: - Các chữ cái: a, b, c, d, trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê theo trắc nghiệm phân hạng Duncan's test với độ tin cậy P 0,05. - ns: p > 0,05; : p < 0,01; *: 0,01< p < 0,05. 50
  61. Đồ án tốt nghiệp Số lá 7 6 5 4 3 Số lá 2 1 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Biểu đồ 3.4. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến số lá của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy Chiều cao 50 40 30 20 Chiều cao (mm) 10 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Biểu đồ 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến chiều cao chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 51
  62. Đồ án tốt nghiệp Số rễ 5 4 3 2 Số rễ 1 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Biểu đồ 3.6. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến số rễ của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy Chiều dài rễ 35 30 25 20 15 Chiều dài rễ (mm) 10 5 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Biểu đồ 3.7. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến chiều dài rễ của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 52
  63. Đồ án tốt nghiệp (mg) gdgf (%) 300 15 200 10 100 5 0 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Trọng lượng tươi chồi (mg) Trọng lượng khô chồi (mg) Hàm lượng chất khô chồi (%) Biểu đồ 3.8. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô và hàm lƣợng chất khô của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy (mg) fdgdf (%) 80 25 70 20 60 50 15 40 30 10 20 5 10 0 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Nghiệm thức Trọng lượng tươi rễ (mg) Trọng lượng khô rễ (mg) Hàm lượng chất khô rễ (%) Biểu đồ 3.9. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô và hàm lƣợng chất khô của rễ lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 53
  64. Đồ án tốt nghiệp (mg) fgftg (%) 400 15 300 10 200 5 100 0 0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Tổng trọng lượng tươi (mg) Tổng trọng lượng khô (mg) Tổng hàm lượng chất khô (%) Biểu đồ 3.10. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến tổng trọng lƣợng tƣơi, tổng trọng lƣợng khô và tổng hàm lƣợng chất khô của chồi lan Vũ nữ cam sau 8 tuần nuôi cấy 54
  65. Đồ án tốt nghiệp B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam (1 cm: ) B1: NAA 0 mg/l + than 0 g/l B4: NAA 0,5 mg/l + than 0 g/l B7: NAA 1 mg/l + than 0 g/l B2: NAA 0 mg/l + than 0,5 g/l B5: NAA 0,5 mg/l + than 0,5 g/l B8: NAA 1 mg/l + than 0,5 g/l B3: NAA 0 mg/l + than 0,7 g/l B6: NAA 0,5 mg/l + than 0,7 g/l B9: NAA 1 mg/l + than 0,7 g/l 55
  66. Đồ án tốt nghiệp Nhận xét và thảo luận: Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA và than hoạt tính thì có sự khác biệt rõ rệt ở các nghiệm thức. Từ bảng kết quả 3.2 ta có thể kết luận rằng NAA và than hoạt tính đều có ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ của lan Vũ nữ cam. Việc bổ sung NAA và than hoạt tính dẫn đến sự tăng trưởng và phát triển khác nhau về chiều cao chồi, số lá, số rễ, chiều dài rễ và hàm lượng chất khô. Ở chỉ tiêu số lá sau 8 tuần nuôi cấy, nhận thấy không có sự khác biệt nhiều về số lá giữa các nghiệm thức về mặt thống kê. Các nghiệm thức không bổ sung than hoạt tính và các nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA cho chiều cao hơn so với mẫu ở các nghiệm thức còn lại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ cao sẽ hạn chế chiều cao chồi, điều này thấy rõ ở nghiệm thức bổ sung 1 mg/l NAA + 0,7 g/l AC cho kết chiều cao xấu nhất (36,13 mm) và nghiệm thức không than hoạt tính bổ sung 1 mg/l NAA đạt chiều cao tốt nhất (45,30 mm). Một số công bố cũng cho thấy than hoạt tính tác động tiêu cực trong quá trình nuôi cấy mô thực vật. Than hoạt tính vừa hấp phụ các chất không mong muốn vừa có thể hấp phụ cả các hormone cần thiết, vitamin và ion kim loại (Cu2+, Zn2+) nên làm giảm sự tăng chồi (Gymnema sylvestre), hạn chế chiều cao chồi (Anacardium occidentale); một số trường hợp không hạn chế được việc mẫu bị hóa nâu (mô sẹo Plumbago zeylanica), giảm quá trình hóa nâu nhưng cản trở quá trình biệt hóa mô sẹo (cánh hoa Crocus sativus) [27]. Tất cả các nghiệm thức đều có số rễ cao hơn mẫu đối chứng (B1) và số rễ giữa các nghiệm thức có sự khác biệt dựa trên kết quả thống kê. Các nghiệm thức không than cho kết quả tốt về cả 2 chỉ tiêu số rễ và chiều dài rễ. Khi tăng nồng độ than lên 0,5 g/l kết quả của cả 2 chỉ tiêu đều giảm nhưng kết quả này lại tăng khi tiếp tục tăng nồng độ than lên 0,7 g/l. Các nghiệm thức không bổ sung NAA cho kết quả thấp nhất về chỉ tiêu số rễ là (1,35 rễ) và chiều dài rễ (12,61 mm). Khi tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l cho kết quả tốt nhất về số rễ (3,75 rễ) và chiều dài rễ (25,69 mm). 56
  67. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên khi tăng nồng độ NAA lên 1 mg/l thì kết quả của cả 2 chỉ tiêu đều giảm (cụ thể số là 3,62 rễ và chiều dài rễ là 22,68 mm). Trong đó nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA đạt kết quả tốt nhất với số rễ 4,72 rễ và chiều dài rễ là 30,37 mm. Riêng ở nghiệm thức 0,5 mg/l NAA + 0,5 g/l than cho kết quả tương đối tốt với số rễ là 3,76 rễ và chiều dài rễ là 24,35 mm. Đây cũng là nghiệm thức có sự hình thành rễ sớm nhất. Hầu hết các nghiệm thức cho thấy mối liên quan giữa số rễ và chiều dài rễ, số rễ càng nhiều thì tổng chiều dài rễ càng tăng. Nghĩa là ở các nghiệm thức có sự phát triển tốt về rễ thì sẽ phát triển đồng thời cả về số lượng lẫn chiều dài. Nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/l NAA cho kết quả tối ưu ở hầu hết các chỉ tiêu theo dõi. Trong nghiệm thức này, trọng lượng tươi và trọng lượng khô đạt kết quả cao nhất (298,67 mg và 32,43 mg), hàm lượng chất khô của chồi cao (11,86% so với trung bình là 10,02%). Nhờ tất cả các yếu tố trên nên nghiệm thức bổ sung NAA nồng độ 0,5 mg/l thích hợp nhất đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam với các kết quả các chỉ tiêu đạt giá trị cao như số lá đạt 6,57 lá/mẫu, chiều cao chồi 44,43 mm, số rễ đạt 4,72 rễ/mẫu, chiều dài rễ 30,37 mm, trọng lượng tươi đạt 298,67 mg, trọng lượng khô đạt 32,43 mg và hàm lượng chất khô đạt 11,86%. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện đề tài và dựa vào các kết quả thí nghiệm thu được thì có thể kết luận như sau: - Sau 8 tuần theo dõi, môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi từ PLB lan Vũ nữ cam là môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 50 ml/l nước dừa (cho kết quả 42,6 chồi) ở nghiệm thức A10. - Sau 8 tuần theo dõi, môi trường thích hợp nhất đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA (cho kết quả 4,72 rễ) ở nghiệm thức B4. 4.2. Kiến nghị Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn, vì vậy tôi có những kiến nghị sau: - Áp dụng kết quả thí nghiệm 1 tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của đèn led lên sự tạo chồi từ PLB lan Vũ nữ cam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và các chất hữu cơ tự nhiên lên sự tạo chồi và phát triển chồi lan Vũ nữ cam. - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số yếu tố khác đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam. - Nghiên cứu các điều kiện ánh sáng, giá thể khác nhau để hoàn thiện quy trình nhân giống lan Vũ nữ cam đưa cây con ra vườn ươm. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt [1]. Trịnh Thị Lan Anh, Dương Tấn Nhựt (2011). Ảnh hưởng của nước dừa già tới quá trình phát sinh hình thái của phôi vô tính lan hồ điệp (phalaenopsis amabilis), Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường và Công nghệ sinh học năm 2011, 138-142. [2]. Nguyễn Tiến Bân (1997). Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Nagnoliphyta emgiuspermae) ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 67-83. [3]. Ngô Xuân Bình ( 2009). Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và kĩ thuật. [4]. Bùi Bá Bông (1995). Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô, Sở Khoa học Công nghệ và môi trường An Giang. [5]. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978). Phân loại thực vật bậc cao, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp. [6]. Nguyễn Văn Chương, Trịnh Văn Thịnh (1991). Từ điển bách khoa nông nghiệp, Trung tâm Quốc gia biên soạn. [7]. Nguyễn Minh Chơn (2004). Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Đại học Cần Thơ. [8]. Hoàng Đức Cự, Vũ Văn Vụ và csv (1993). Sinh lý thực vật, Giáo trình cao học Nông nghiệp Sinh học, Viện KHKTNNMN Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Trần Hợp (1990). Phong lan Việt Nam, tập 1 – 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [10]. Phan Thúc Huân (2005). Hoa lan cây cảnh và vấn đề sản xuất kinh doanh xuất 59
  70. Đồ án tốt nghiệp khẩu, NXB Phương Đông. [11]. Dương Công Kiên (2006). Nuôi cấy mô, NXB Đại học Quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh. [12]. Đồng Văn Khiêm (1995). Tiếp thị sinh vật cảnh, hoa cây cảnh Việt Nam và thị trường thế giới, Việt Nam Hương sắc, số 25. [13]. Nguyễn Xuân Linh (1998). Hoa và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 145-162. [14]. Nguyễn Đức Thành (2000). Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [15]. Bùi Trang Việt (2000). Sinh lý thực vật đại cương, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [16]. Vũ Văn Vụ (1999). Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo Dục. 2. Tài liệu Tiếng Anh [17]. Arditti (1992). Fundamentals of orchid biology, Jonh Wiley and Sons Inc., New York, U.S.A. [18]. Burnet G., Ibrahim R. K. (1973). Tissue culture of Citrus peel and its potential for flavonoid synthesis, Z. Pflanzenphysiol, 69, 152-162. [19]. Chen JT, Chang C, Chang WC (1999). Direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium Gower Ramsey and subsequent plant regeneration. Plant Cell Reports 19, 143-149 [20]. Chen JT, Chang WC (2000). Plant regeneration via embryo and shoot bud formation from flower-stalk explants of Oncidium Sweet sugar, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp [21]. Intuwong O., Sagawa Y. (1973). Clonal propagation of sarcanthine orchids by aseptic culture of inflorescences, Amer. Orc. Soc. Bull,. 42, 264-270. [22]. K. Kalimuthu, R. Senthilkumar and S. Vijayakumar (2007). In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp. (Dancing Dolls), African Journal of Biotechnology, 6 (10), 1171-1174. [23]. Prashant Bagde and Madhuri Sharon (1997). In vitro regeneration of Oncidium gower ramsey by high frequency protocorm like bodies proliferation, IndianJ. Plant Physiol., 2 (1), 10-14. [24]. Ming-T sair Chan, Sanjaya, Jaime A. Teixeira da Silva (2006). Oncidium Tissue Culture, Transgenics and Biotechnology, Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues (Vol. II), Edition: 1, Chapter: 24, Publisher: Global Science Books, Editors: Jaime A. Teixeira da Silva, 193-198. [25]. Saranjeet K., Bhutani K. K. (2012). Organic growth supplement stimulants for in vitro multiplication of Cymbidium pendulum, HortScince, 9 (1), 47-52. [26]. Wu IF, Chen JT, Chang WC (2004). Effect of auxins and cytokinins on embryo formation from root-derived callus of Oncidium 'Gower Ramsey'. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 77, 107-109 3. Tài liệu internet [27]. vat/than-hoat-tinh-la-gi-va-vai-tro-than-hoat-tinh-tro.aspx [28]. [29]. truong-den-qua-trinh-nuoi-cay-in-vitro-cua-hai-giong-lan-dendrobium-va- 10266/ [30]. 61
  72. Đồ án tốt nghiệp [31]. oncidium.html [32]. [33] 62
  73. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục A: Thống kê xử lý số liệu bằng chƣơng trình SAS V8. Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng BA và nƣớc dừa đến sự tạo chồi từ PLB của lan Vũ nữ cam  Số chồi 1
  74. Đồ án tốt nghiệp 2
  75. Đồ án tốt nghiệp  Chiều cao chồi 3
  76. Đồ án tốt nghiệp 4
  77. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục B: Thống kê xử lý số liệu bằng chƣơng trình SAS V8. Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ lan Vũ nữ cam  Số lá 5
  78. Đồ án tốt nghiệp  Chiều cao 6
  79. Đồ án tốt nghiệp  Số rễ 7
  80. Đồ án tốt nghiệp 8
  81. Đồ án tốt nghiệp  Chiều dài rễ 9
  82. Đồ án tốt nghiệp 10