Khóa luận Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Phlorotannin từ rong mơ cho chế biến thực phẩm

Nội dung text: Khóa luận Nghiên cứu quy trình trích ly hoạt chất sinh học Phlorotannin từ rong mơ cho chế biến thực phẩm

1. §¹I HäC TH¸I NGUY£N TR¦êNG §¹I HäC N¤NG L¢M trÇn thiªn kh¸ Tên đề tài : T Nghiªn cøu quy tr×nh trÝch ly ho¹t chÊt sinh häc Phlorotannin tõ rong m¬ cho chÕ biÕn th−c phÈm khãa luËn TèT NGHIÖP ®¹i häc Hệ đào t ạo : Chính quy Chuyên ngành : Công ngh ệ Th ực ph ẩm Khoa : CNSH - CNTP Khoá h ọc : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014
2. §¹I HäC TH¸I NGUY£N TR¦êNG §¹I HäC N¤NG L¢M trÇn thiªn kh¸ Tên đề tài : T Nghiªn cøu quy tr×nh trÝch ly ho¹t chÊt sinh häc Phlorotannin tõ rong m¬ cho chÕ biÕn th−c phÈm khãa luËn TèT NGHIÖP ®¹i häc Hệ đào t ạo : Chính quy Chuyên ngành : Công ngh ệ Th ực ph ẩm Khoa : CNSH - CNTP Lớp : 42 - CNTP Khoá h ọc : 2010 - 2014 Gi ảng viên h ướng d ẫn : 1. ThS. Nguy ễn Đức Ti ến 2.ThS. Tr ần Th ị Lý Thái Nguyên, 2014
3. LỜI CẢM ƠN Để có được k ết qu ả nghiên c ứu này, tôi xin g ửi l ời c ảm ơn sâu s ắc đến ThS. Nguy ễn Đức Ti ến - Tr ưởng B ộ môn Nghiên c ứu ph ụ ph ẩm và Môi tr ường nông nghi ệp thu ộc Vi ện C ơ điện nông nghi ệp và Công ngh ệ sau thu ho ạch, ng ười đã tr ực ti ếp h ướng d ẫn giúp đỡ tận tình và truy ền đạt cho tôi nh ững ki ến th ức quý báu trong quá trình thôi th ực hi ện lu ận v ăn. ThS.Tr ần Th ị Lý – cô giáo trong B ộ môn Công ngh ệ th ực ph ẩm, khoa Công ngh ệ sinh h ọc và Công ngh ệ th ực ph ẩm – trường Ðại h ọc Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ , h ỗ tr ợ về ph ươ ng di ện nghiên c ứu, ki ến th ức và có nh ững góp ý sâu s ắc trong th ời gian tôi th ực hi ện ð ề tài. Tôi xin g ửi l ời yêu th ươ ng chân thành đến b ố mẹ, anh ch ị đã luôn ở bên động viên trong su ốt th ời gian h ọc t ập. Cu ối cùng, Tôi xin chân thành c ảm ơn b ạn bè đã động viên, giúp đỡ, chia s ẻ và t ạo điều ki ện thu ận l ợi cho tôi trong su ốt quá trình h ọc t ập và hoàn thành lu ận v ăn t ốt nghi ệp. Xin chân thành c ảm ơn! Hà N ội, ngày tháng nãm 2014. Sinh viên Trần Thiên Khá
4. DANH M ỤC CÁC B ẢNG Trang Bảng 2.1. Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh. 4 Bảng4.1. Ảnh h ưởng c ủa kích th ước nguyên li ệu đến khả năng trích ly phlorotannin 31 Bảng 4.2 . Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin 32 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin 34 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích l y phlorotannin 36 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin 38 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin 39 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến hàm lượng phlorotannin 40 Bảng 4.8. Kết quả đánh giá cảm quan dịch trích ly 42
5. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Phloroglucinol (i) và phlorotannin [tetrafucol A (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] và ho ạt tính c ủa chúng 12 Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin 31 Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin 32 Hình 4.3. Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin 34 Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin 36 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin 38 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin 39 Hình 4.7. Sơ đồ quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum polycystom 44
6. MỤC L ỤC Trang PH ẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt v ấn đề 1 1.2. M ục đích và yêu c ầu c ủa đề tài 2 1.2.1. M ục đích 2 1.2.2. Yêu c ầu 2 PH ẦN 2 T ỔNG QUAN TÀI LI ỆU 3 2.1. Gi ới thi ệu chung v ề rong m ơ 3 2.1.1. Đặc điểm 3 2.1.2. Phân b ố 4 2.1.3. Thành ph ần hóa h ọc có trong rong mơ 4 2.1.4. Vai trò c ủa rong m ơ đối v ới con ng ười 9 2.2. Giới thiệu về các hợp ch ất ch ống oxy hóa hi ện nay 10 2.3. Giới thiệu về hợp ch ất Phlorotannin 12 2.3.1. Đặc điểm 12 2.3.2. C ơ ch ế oxi hóa c ủa phlorotannin 13 2.3.3. Ho ạt tính sinh h ọc c ủa phlorotannin 14 2.3.4. Tình hình nghiên c ứu phlorotannin trên th ế gi ới 15 2.3.5. Tình hình nghiên c ứu phlorotannin ở Việt Nam 17 2.4. Gi ới thi ệu v ề quá trình trích ly 18 2.4.1. Cơ sở của quá trình trích ly 18 2.4.2. Ph ạm vi s ử dụng c ủa quá trình 19 2.4.3. Các y ếu t ố ảnh h ưởng đến quá trình trích ly 19 2.5. Giới thiệu về phương pháp thu nhận 21 2.5.1. Phương pháp cô đặc 21 2.5.2. Phương pháp sấy 21 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1. Đối t ượng, v ật li ệu, địa điểm và th ời gian nghiên c ứu 23 3.1.1. Đối t ượng nghiên c ứu 23
7. 3.1.2. Hóa ch ất và thi ết b ị 23 3.1.3. Địa điểm và th ời gian nghiên c ứu 23 3.2. Nội dung nghiên cứu 23 3.3. Phương pháp nghiên cứu 24 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiêm 24 3.3.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 28 3.3.3 . Phương pháp xử lý số liệu 30 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 4.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin 31 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin 32 4.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin 34 4.4. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin 36 4.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin 39 4.7. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình cô đặc 40 4.8. Kết quả xác định thông số thông số thích hợp của quá trình ly tâm 42 4.9. Đề xuất quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum Polycystom . 44 PH ẦN 5 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1. Kết luận 47 5.2. Kiến nghị 47 TÀI LI ỆU THAM KHẢO 48
8. 1 PH ẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt v ấn đề Xã h ội ngày càng phát tri ển, đời s ống con ng ười ngày càng được nâng cao. Con ng ười không ch ỉ quan tâm đến nh ững v ấn đề ăn, m ặc, ở đơ n gi ản nh ư tr ước đây mà còn có nh ững yêu c ầu cao h ơn. Khi đời s ống được nâng cao, con ng ười ngày càng quan tâm h ơn đến s ức kh ỏe c ủa mình. Do đó, nh ững th ực ph ẩm, v ật d ụng có th ể gây h ại cho s ức kh ỏe d ần b ị lo ại b ỏ và được thay th ế bằng các s ản ph ẩm được s ản xu ất t ừ các thành ph ần chi ết xu ất từ thiên nhiên. Nhu c ầu c ủa con ng ười là m ột trong nh ững y ếu t ố quan tr ọng thúc đẩy xã h ội phát tri ển và c ũng là động l ực thúc đẩy các nhà khoa h ọc, nhà sản xu ất tìm tòi, sáng t ạo ra nhi ều s ản ph ẩm m ới. Với s ự phát tri ển c ủa khoa h ọc, con ng ười đã bi ết cách chi ết xu ất ra nhi ều h ợp ch ất có ngu ồn g ốc t ự nhiên có l ợi cho s ức kh ỏe con ng ười. Trong đó, vi ệc ứng d ụng các thành t ựu khoa h ọc vào ngành công nghi ệp th ực ph ẩm đóng vai trò quan trọng vì nó ảnh h ưởng tr ực ti ếp đến s ức kh ỏe con ng ười. Hi ện nay, có r ất nhi ều h ợp ch ất được chi ết xu ất t ừ thiên nhiên đã được ứng dụng r ộng rãi vào đời s ống. Trong s ố đó không th ể không nói đến h ợp ch ất phlorotannin (polyphenol). Thành ph ần này được s ử dụng trong th ực ph ẩm nh ư m ột lo ại th ực ph ẩm ch ức n ăng nh ằm m ục đích phòng ng ừa b ệnh do có tính ch ất kháng oxi hóa m ạnh. Vi ệt Nam có h ệ động v ật, th ực v ật vô cùng phong phú đặc tr ưng cho khí h ậu nhi ệt đới nóng ẩm. Điều ki ện t ạo nên s ự phong phú và giàu có, ấy chính là vùng bi ển nhi ệt đới r ộng v ới b ờ dài h ơn 3200km bao b ọc h ết phía đông và nam đất n ước. M ột trong nh ững ngu ồn tài nguyên phong phú và có giá tr ị mà vùng bi ển ban t ặng cho chúng ta là rong bi ển. Rong bi ển là lo ại th ực v ật bi ển quý giá được dùng làm nguyên li ệu ch ế bi ến thành các s ản ph ẩm có giá tr ị trong công nghi ệp và th ực ph ẩm. T ừ lâu, rong bi ển đã được coi là đối t ượng nghiên c ứu c ủa nhi ều n ước trên th ế gi ới. Ở nước ta tr ữ lượng rong bi ển r ất l ớn, là ngu ồn tài nguyên bi ển vô cùng phong phú, rong bi ển chi ếm v ị trí quan tr ọng trong l ĩnh v ực kinh t ế bi ển Vi ệt Nam. Hệ rong biển có nhi ều
9. 2 loài, m ột trong nh ững loài có nhi ều tính n ăng ưu vi ệt được nhi ều nhà nghiên cứu ở nước ta quan tâm t ới là loài rong mơ. Ng ười ta đã phát hi ện ra nhi ều thành ph ần quý có trong rong m ơ nh ư: Iod, Alginate, Fuccoidin, h ợp ch ất ch ống oxi hóa (phlorotannin), các axit béo R ất có giá tr ị trong y h ọc, th ực ph ẩm, d ược ph ẩm Xu ất phát t ừ nhu c ầu c ủa xã h ội hi ện đại, đồng th ời t ận dụng được ngu ồn nguyên li ệu d ồi dào, cần có những tìm hiểu, nghiên cứu , tách chi ết ra các ho ạt tính sinh h ọc đặc biệt là phlorotannin để gia t ăng giá tr ị rong m ơ Vi ệt Nam. Vì v ậy chúng tôi ti ến hành nghiên c ứu đề tài “ Nghiên c ứu quy trình trích ly ho ạt ch ất sinh h ọc Phlorotannin t ừ rong m ơ cho ch ế bi ến thực ph ẩm”. 1.2. M ục đích và yêu c ầu c ủa đề tài 1.2.1. M ục đích Nghiên c ứu quy trình trích ly ho ạt ch ất sinh h ọc Phlorotannin t ừ rong mơ cho ch ế bi ến th ực ph ẩm. 1.2.2. Yêu c ầu Ảnh h ưởng c ủa các điều ki ện x ử lý nguyên li ệu đến khả năng trích ly Phlorotannin từ ro ng m ơ. Xác định các thông s ố của quá trình trích ly Phlorotannin t ừ rong m ơ. Lọc, cô d ịch trích ly và thu nh ận ch ế ph ẩm Phlorotannin trích ly. Đư a ra quy trình s ản xu ất ch ế ph ẩm Phlorotannin.
10. 3 PH ẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Gi ới thi ệu chung v ề rong mơ 2.1.1. Đặc điểm Theo h ệ th ống phân lo ại c ủa Agardh, J.G. (1889) , h ọ rong m ơ Sargassaceae gồm 3chi: Chi Hormophysa Kuetzing 1843 (rong kh ế), chi Turbinarina Lamouroux 1828 (rong cùi b ắp) và chi Sargassum C.AG. 1821 (rong m ơ). Chi Sargassum C.AG. 1821 (rong m ơ) g ồm có 5 phân chi: Phyllottricha J.Ag, Schizophycus J.Ag, Bactrophycus J.Ag, Arthrophycus J.Ag, SargassumJ.Ag. Sargassum C.Ag (rong m ơ) là t ảo l ớn thu ộc h ọ rong m ơ Sargassaceae của ngành rong nâu, rong có kích th ước l ớn, dài đến 4m hay có khi trên 6 – 8m, rong dài hay ng ắn tùy loài và tùy điều ki ện môi tr ường. Chúng bám vào v ật bám nh ờ đĩa bám hay h ệ th ống r ễ bò phân nhánh. Đĩa bám th ường ch ắc h ơn r ễ và sóng bi ển th ường đánh đứt rong h ơn là nh ổ được đĩa bám. Thân rong g ồm m ột tr ục chính r ất ng ắn, đa s ố th ường dài trên d ưới 1cm, hình tr ụ, s ần sùi. Đỉnh c ủa tr ục chính s ẽ phân ra t ừ 2 cho đến 4 – 5 nhánh chính. Hai bên nhánh chính m ọc ra nhi ều nhánh bên. Các nhánh chính và nhánh bên s ẽ tạo ra chi ều dài c ủa rong. Chi ều dài này khác nhau tùy các chi, loài và trong cùng m ột loài kích th ước này c ũng thay đổi tùy điều ki ện sống, tùy n ơi phân b ố. Trên các nhánh có các c ơ quan dinh d ưỡng g ần gi ống nh ư lá và các túi ch ứa đầy không khí g ọi là phao. Khi rong tr ưởng thành, trên các nhánh bên s ẽ mọc ra các nhánh th ụ, ng ắn (th ường t ừ tháng 3 đến tháng 6), có mang nhi ều c ơ quan sinh s ản đực và cái g ọi là đế. Nh ờ có h ệ th ống phao luôn gi ữ vị trí th ẳng đứng trong môi tr ường bi ển. N ếu n ước c ạn và rong khá dài thì ph ần trên c ủa rong n ằm trên m ặt n ước [5]. Sinh s ản h ữu tính là cách sinh s ản ch ủ yếu c ủa t ất c ả các loài rong m ơ để tạo thành các bãi rong. Đa s ố các loài có đế đực và cái trên hai cây khác nhau (cây khác g ốc), m ột s ố khác có đế đực và cái cùng cây (cùng g ốc). Khi rong đạt kích th ước và chi ều dài t ối đa chúng s ẽ mọc ra các nhánh ng ắn g ọi là nhánh th ụ, trên đó ch ủ yếu m ọc ra các c ơ quan sinh s ản. Giao t ử đực còn g ọi là tinh trùng s ẽ được phóng thích kh ỏi giao t ử phòng đực, b ơi l ội được. Giao
11. 4 tử cái g ọi là tr ứng hay noãn c ầu s ẽ được phóng thích kh ỏi giao t ử phòng cái. Sự th ụ tinh ch ỉ xảy ra v ới các giao t ử đã được phóng thích. Noãn c ầu sau khi thoát ra th ường có m ột l ớp nh ầy dính chung quanh đế cái. Quan sát các noãn cầu này d ưới kính hi ển vi chúng ta th ấy h ầu h ết chúng đã th ụ tinh và b ắt đầu phân c ắt [5]. 2.1.2. Phân b ố Rong m ơ phân b ố ch ủ yếu ở Trung Qu ốc, Nh ật B ản, Philippin, Úc, Ở Vi ệt Nam lo ại th ực v ật này phân b ố rộng, kéo dài t ừ vùng bi ển Qu ảng Ninh đến Kiên Giang và các h ải đảo, t ập trung nhi ều nh ất ở vùng b ờ bi ển c ủa thành ph ố Đà N ẵng và các t ỉnh Qu ảng Nam, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thu ận, Qu ảng Ninh. N ăng su ất ở các vùng t ập trung đó có khi lên đến 7kg/m 2 mặt nước, bình quân trên d ưới 5,5kg/m 2, t ạo nên ngu ồn nguyên li ệu b ền v ững cho vi ệc khai thác ch ế bi ến và c ũng điểm ch ỉ nh ững môi tr ường nuôi tr ồng thu ận lợi [20]. Rong m ơ là loài chi ếm ưu th ế nh ất ở các khu v ực v ới tr ữ lượng chi ếm 98% t ổng tr ữ lượng c ủa các bãi rong, m ật độ cây trung bình 43,8 ± 20,2cây/m 2 và sinh l ượng trung bình đạt 456 ± 64,2g khô/m 2 [7]. Bảng 2.1. Diện tích rong mơ theo vùng biển các tỉnh. Năng suất sản Diện tích Mùa vụ Các địa danh lượng (m 2) (tháng ) (kg/m 2) Quảng Nam – Đà Nẵng 190.000 2 – 7 3 – 4 – 5 Bình Định 42.750 2,5 3 – 4 – 5 Khánh Hòa 2.000.000 5,5 3 – 4 – 5 Ninh Thuận 1.500.000 7 3 – 4 – 5 2.1.3. Thành ph ần hóa h ọc có trong rong mơ Màu nâu c ủa rong m ơ là k ết qu ả của s ắc t ố hoàng th ể tố fucoxanthin, thành ph ần chính c ủa rong m ơ là các polysaccharide (cellulose, alginate, laminaran, fucoidan ), ngoài ra còn có mannitol, gibberellin, cytokinin và nhi ều lo ại vitamin. Hàm l ượng alginic acid trung bình t ừ 20 – 30% tr ọng l ượng khô. M ột lo ại đường khác có giá tr ị trong rong m ơ là mannitol v ới hàm l ượng
12. 5 từ 7 – 10% tr ọng l ượng khô. Hàm l ượng protein có t ừ 5 – 15%. T ổng l ượng khoáng có t ừ 20 – 40% trong đó có đầy đủ các nguyên t ố khoáng c ần thi ết cho cơ th ể sinh v ật, đặc bi ệt là iod v ới hàm l ượng t ừ 0,08 – 0,34% là ngu ồn d ược li ệu để ch ữa b ệnh b ướu c ổ. Ngoài ra rong m ơ còn ch ứa các phospho lipid dùng trong y d ược và các h ợp ch ất có ho ạt tính sinh h ọc khác [5]. Theo k ết qu ả nghiên c ứu v ề thành ph ần dinh d ưỡng và hóa h ọc c ủa loài Sargassum naozhouense (tính theo tr ọng l ượng khô) thì có hàm l ượng protein 11,20%; ch ất khoáng 35,18%; lipid 1,06%; carbohydrate t ổng s ố 47,73%; tổng carbohydrate tan trong n ước 29,74%; polysaccharide tan trong n ước 21,01%; và ch ất x ơ t ổng s ố 4,83% [17]. Kotake – Nara và c ộng s ự nghiên cứu cho thấy rong nâu chi Sargassum và Turbinaria ở vùng nhi ệt đới th ường có hàm l ượng phenol và tannin t ươ ng đối th ấp h ơn nhi ều so v ới ở vùng ôn đới, do đó 2 chi rong nâu ở vùng nhi ệt đới th ường là th ức ăn cho cá, động v ật ăn c ỏ ( ở vụng nhi ệt đới dao động gi ữa 0 và 1,6% tr ọng l ượng khô, vùng ôn đới dao động t ừ 3 đến 12% trọng l ượng khô) [15]. Rong m ơ có kh ả năng tích l ũy hàng lo ạt các nguyên t ố hóa h ọc v ới h ệ số tập trung cao, n ồng độ các nguyên t ố này trong tro c ủa chúng có th ể gấp hàng v ạn hay hàng tri ệu l ần so v ới trong n ước bi ển. Đã tìm th ấy khá nhi ều nguyên t ố hóa h ọc trong rong m ơ: Al, Si, Mg, Ca, Sr, Ba, fe, V, Mn, Ti, Co, Ni, Cr, Sn, Ag, Bi, Cu, Pb, Zn, Ga, Be, Na, K [5]. 2.1.3.1. S ắc t ố Sắc t ố trong rong mơ là di ệp l ục t ố (Chlorophyl), di ệp hoàng t ố (Xantophyl), s ắc t ố màu nâu (Fucoxanthin), s ắc t ố đỏ (Caroten). Tùy theo t ỷ lệ các lo ại s ắc t ố mà rong có màu t ừ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng l ục. Nhìn chung s ắc t ố của rong m ơ khá b ền [8]. 2.1.3.2. Gluxit * Monosacaride [8] Monosacaride quan tr ọng trong rong m ơ là đường Mannitol được Stenhouds phát hi ện ra n ăm 1884 và được Kylin ch ứng minh thêm. Mannitol có công th ức t ổng quát: HOCH 2 – (CHOH) 4 – CH 2OH. Mannitol tan được
13. 6 trong Alcol, d ễ tan trong n ước có v ị ng ọt. Hàm l ượng t ừ 14% – 25% tr ọng lượng rong khô tùy thu ộc vào hoàn c ảnh địa lý n ơi sinh s ống. Hàm l ượng Mannitol bi ến động theo th ời gian sinh tr ưởng trong n ăm c ủa rong khá rõ r ệt, t ăng d ần t ừ tháng 1, t ập trung cao vào mùa hè (tháng 4) r ồi sau đó gi ảm đi: Theo Kylin và Vedrinski cho th ấy hàm l ượng Mannitol đạt 25% v ề mùa hè r ồi b ị phân h ủy d ần trong các tháng mùa đông ch ỉ còn 4% – 6%. Ở Vi ệt Nam, theo k ết qu ả nghiên c ứu c ủa các nhà khoa h ọc vi ện H ải D ươ ng h ọc và Đại h ọc Th ủy s ản, hàm l ượng Mannitol c ũng theo quy lu ật này. Hàm l ượng Mannitol c ủa các loài rong ở các vùng bi ển Qu ảng Nam – Đà N ẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thu ận dao động t ừ 7% – 15,95% (vào tháng 4 hàng năm). Trong quá trình b ảo qu ản rong khô có hi ện t ượng xu ất hi ện các điểm đốm tr ắng trên thân cây rong, đó là h ỗn h ợp đường Mannitol theo t ỷ lệ : Muối 60% – 80%, mannitol 20% – 40%. Rong b ảo qu ản không t ốt, độ ẩm cao làm cho mannitol b ị phá h ủy. Công d ụng c ủa mannitol: Dùng trong y h ọc ch ữa bệnh cho ng ười già y ếu; trong qu ốc phòng dùng điều ch ế thu ốc n ổ theo t ỷ lệ hỗn h ợp mannitol v ới hydrogen và nito. Ngoài ra mannitol còn dùng điều ch ế thu ốc sát trùng (mannit v ới kim lo ại có tác d ụng sát trùng cao). Do có kh ả năng này mà ngày nay m ột s ố tác gi ả cho th ấy có kh ả năng s ản xu ất thu ốc tr ừ sâu có b ản ch ất sinh h ọc (b ảo v ệ th ực v ật) t ừ rong bi ển. * Polysaccharide - Alginic: Alginic là m ột polysaccharide t ập trung ở gi ữa vách t ế bào, là thành ph ần ch ủ yếu t ạo thành t ầng bên ngoài c ủa màng t ế bào rong m ơ. Alginic và các mu ối c ủa nó có nhi ều công d ụng trong ngành công nghi ệp, y học, nông h ọc và th ực ph ẩm. Hàm l ượng Alginic trong các lo ại rong m ơ kho ảng 2% – 4% so v ới rong t ươ i và 13% – 15% so v ới rong khô. Hàm l ượng này ph ụ thu ộc vào loài rong và v ị trí địa lý môi tr ường mà rong sinh s ống. Theo các tài li ệu t ổng k ết c ủa Miyake cho th ấy hàm l ượng Alginic trong các loài rong m ơ có ở các vùng bi ển Liên Xô c ũ là 13% – 40%. Theo tài li ệu phân tích các chuyên gia B ộ Th ủy s ản cho th ấy hàm l ượng Alginic trong các loài rong m ơ ở Hải Phòng là 22% – 40%, trong khi đó, rong m ơ ở vùng bi ển Phú Yên – Khánh Hòa có hàm l ượng Alginic cao h ơn h ẳn.
14. 7 - Acid Fucxinic: có tính ch ất g ần gi ống v ới acid Alginic. Acid Fucxinic tác d ụng v ới acid Sunfuric t ạo h ợp ch ất có màu ph ụ thu ộc vào n ồng độ acid Sunfuric. Ch ẳng h ạn: Acid Fucxinic + H 2SO 4 0,1%: Cho s ản ph ẩm màu xanh. Acid Fucxinic + H 2SO 4 10%: Cho s ản ph ẩm màu xanh tím. Acid Fucxinic + H 2SO 4 25%: Cho s ản ph ẩm màu tím. Acid Fucxinic + H 2SO 4 25%: Cho s ản ph ẩm màu đỏ. Acid Fucxinic + H 2SO 4 > 50%: Cho s ản ph ẩm m ất màu. Nh ờ có tính ch ất này mà Fucxinic được ứng d ụng vào s ản xu ất t ơ s ợi màu, phim ảnh màu. Mu ối của Fucxinic v ới kim lo ại g ọi là Fucxin. Fucxinic tác d ụng v ới Iod cho s ản ph ẩm màu xanh [8]. - Fuccoidin: Là lo ại mu ối gi ữa acid Fuccoidinic v ới các kim lo ại hóa tr ị khác nhau nh ư: Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính ch ất g ần gi ống v ới Alginic, nh ưng hàm l ượng th ấp h ơn Alginic. Fuccoidin hay Fucoidan là m ột polysaccharide sulfate hóa d ị hợp, trong đó fucose chi ếm t ừ 18,6% – 60% [22]; sulfate chi ếm t ừ 17,7% – 39,2%; ngoài ra còn có m ặt các thành ph ần đường khác nh ư: galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose, và acid uronic. - Laminarin: Laminarin là tinh b ột c ủa rong m ơ. Laminarin th ường ở dạng b ột không màu, không mùi và có hai lo ại: Loại hòa tan và lo ại không hòa tan trong n ước. Laminarin có hàm l ượng t ừ 10% – 15% tr ọng l ượng rong khô tùy thu ộc vào lo ại rong, v ị trí địa lý và môi tr ường sinh s ống c ủa rong m ơ. Th ường thì vào mùa hè hàm l ượng Laminarin gi ảm vì ph ải tiêu hao cho quá trình sinh tr ưởng và phát tri ển c ủa cây rong. Công d ụng c ủa Laminarin là dùng cho th ực ph ẩm và ch ăn nuôi [6]. Laminarin được hình thành t ừ các g ốc D – glucans k ết h ợp v ới nhau b ằng các liên k ết β – 1,3 và m ột ít liên k ết β – 1,6, g ốc đường cu ối m ạch c ủa m ột s ố phân tử có th ể có các g ốc manitol (M – series) ho ặc v ẫn là glucose (G – series) [23].
15. 8 - Cellulose: Là thành ph ần t ạo nên v ỏ cây rong. Hàm l ượng Cellulose trong rong Nâu nhi ều h ơn rong Đỏ. Công d ụng: Dùng cho công nghi ệp gi ấy, trong công nghi ệp xây d ựng (là ph ụ gia k ết c ấu xi m ăng) [8]. 2.1.3.3. Protein Protein c ủa rong m ơ không cao l ắm nh ưng khá hoàn h ảo. Do v ậy rong mơ có th ể sử dụng làm th ực ph ẩm. Protein c ủa rong m ơ th ường ở dạng k ết hợp v ới Iod t ạo Iod h ữu c ơ nh ư: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Iod h ữu cơ r ất có giá tr ị trong y h ọc. Do v ậy rong m ơ còn được dùng làm thu ốc phòng ch ống và ch ữa b ệnh b ướu c ổ (Basedow). 2.1.3.4. H ợp ch ất ch ống oxy hóa Polyphenol trong rong m ơ, được phân lo ại thành các nhóm khác nhau theo c ấu trúc c ủa chúng, b ởi s ự hi ện di ện c ủa m ột s ố nhóm hydroxyl vòng th ơm, ch ẳng h ạn nh ư các flavonoid, acid phenolic và lignans [25]. Chúng được tìm th ấy r ộng rãi trong gi ới th ực v ật nh ư các ch ất chuy ển hóa ch ịu trách nhi ệm v ề sắc t ố, sinh s ản, t ăng tr ưởng và có c ơ ch ế bảo v ệ ch ống l ại tác nhân gây b ệnh [27]. Polyphenol đã được ch ứng minh ho ạt động ch ống oxy hóa đa ch ức n ăng, do vòng phenol c ủa nó ho ạt động nh ư b ẫy điện t ử nh ặt rác peroxy, anion và các g ốc hydroxyl. Phlorotannins là nhóm duy nh ất c ủa tannin c ủa rong m ơ ở bi ển, chúng g ồm polyme phloroglucinols (1,3,5 – trihydroxybenze), có hàm l ượng đạt lên đến 1 – 15% tr ọng l ượng khô c ủa rong m ơ [11]. Màu nâu v ới màu đen c ủa Phaephyceae là t ừ phlorotannins và các s ản ph ẩm quá trình oxy hóa c ủa chúng. Phlorotannins là h ợp ch ất r ất ưa nước [28] và nó c ũng được cho là h ợp ch ất có kh ả năng ch ống oxy hóa c ủa rong m ơ [9]. Các ch ất trích ly t ừ tảo nâu đã cho th ấy tác d ụng b ảo v ệ ch ống lại t ổn th ươ ng t ế bào hydro peroxide gây ra b ằng cách kh ử gốc t ự do [25]. Phlorotannins có ti ềm n ăng ứng d ụng trong thành ph ần c ủa th ực ph ẩm ch ức năng [24] đã nghiên c ứu các ho ạt động ch ống oxy hóa c ủa phlorotannins phân lập t ừ Laminarian ở Nh ật B ản, cho th ấy ho ạt động g ấp hai l ần hi ệu qu ả ch ống oxy hóa nh ư catechin, acid ascorbic và α – tocopherol.
16. 9 2.1.4. Vai trò c ủa rong m ơ đối v ới con ng ười Ngu ồn l ợi mà rong m ơ đem l ại cho th ế gi ới r ất l ớn. Các s ản ph ẩm truy ền th ống c ủa nó là mannitol (35000 tấn/n ăm), alginate (hàng tri ệu tấn/n ăm) [5]. Trong kho ảng ch ục n ăm g ần đây, các nghiên c ứu phát hi ện rong mơ có ch ứa m ột s ố thành ph ần quan tr ọng, đó chính là fucoxanthin, phlorotannins, fucoidan, v ới nh ững ho ạt tính sinh h ọc quý như : Ch ống ung th ư, gi ảm mỡ nội t ạng, ch ống c ục máu đông, kháng khu ẩn, kháng virut (k ể cả virut HIV), ch ống ngh ẽn t ĩnh m ạch [10]. Rong m ơ được s ử dụng đầu tiên ở Nh ật B ản và Trung Qu ốc trong vai trò là ngu ồn th ực ph ẩm quan trọng. Hàm l ượng iod trong rong m ơ (0,25 – 0,35% kh ối l ượng khô) cao h ơn hàm l ượng iod c ủa th ực v ật ở đất li ền vài tr ăm l ần. Rong m ơ được s ử dụng nh ư m ột lo ại d ược th ảo ch ữa b ệnh b ướu c ổ, nó không ch ỉ cung c ấp iod và các nguyên t ố vi l ượng cho con ng ười mà còn cung c ấp m ột s ố vitamin nh ư A, B, C, D, E, K và h ầu h ết các acid amin không thay th ế. Thành phần hóa học có trong vách tế bào c ủa rong mơ có ý nghĩa rất lớn . Alginic acid là m ột lo ại polysaccharide có giá tr ị sử dụng. Đây là lo ại nguyên li ệu quan tr ọng dùng để trích ly keo alginate, dùng trong nhi ều ngành công nghi ệp, nh ư: công nghi ệp gi ấy, s ơn, cao su, phim ảnh, m ỹ ph ẩm, công nghi ệp th ực ph ẩm, ho ặc thay th ế carbon metyl cellulose (CMC) làm ph ụ gia cho xi m ăng dùng cho gi ếng khoan d ầu ở bi ển, có tác d ụng làm t ăng th ời gian quánh c ủa xi m ăng, gi ải quy ết s ự cố xi m ăng đông k ết s ớm gây khó kh ăn cho quá trình xây d ựng các công trình, có độ bền u ốn cao h ơn đảm b ảo độ bền cho công trình Keo alginate còn được ứng dụng sản xuất một số dụng cụ trong ngành y (băng gạc, chân tay giả , ). Mannitol là m ột lo ại polyol, đồng phân của sorbitol, lo ại đường r ượu này được s ử dụng r ộng rãi trong công nghi ệp th ực ph ẩm và d ược ph ẩm. Mannitol có tác d ụng ng ăn ng ừa ho ặc điều tr ị nước trong c ơ th ể dư th ừa. Mannitol là gi ải pháp hi ệu qu ả làm gi ảm áp su ất trong mắt, gi ảm s ưng não sau ch ấn th ươ ng đầu, điều tr ị bệnh giãn m ạch vành, tr ị ung th ư, r ất có l ợi cho ng ười b ị bệnh ti ểu đường
17. 10 2.2. Giới thiệu về cá c h ợp ch ất ch ống oxy hóa hi ện nay Polyphenol phân b ố rộng rãi ở th ực v ật, có ho ạt tính ch ống oxy hóa và được nghiên c ứu r ất nhi ều. Polyphenol được chia thành các nhóm chính là: Flavonoids, acid phenolic, tannin, vitamin C, Vitamin E, beta – caroten. - Flavonoid [32]: Flavonoid là m ột trong nh ững nhóm h ợp ch ất phong phú và đa d ạng vào b ậc nh ất trong thiên nhiên, có m ặt không nh ững ch ỉ trong nh ững th ực v ật b ậc cao, mà còn trong m ột s ố th ực v ật b ậc th ấp, th ậm chí còn có c ả trong các loài t ảo. H ơn m ột n ửa rau qu ả thông th ường có ch ứa flavonoid. Chúng c ũng là thành ph ần hay g ặp trong d ược li ệu có ngu ồn g ốc th ực vật. Đến nay, flavonoid v ẫn là l ớp ch ất được các nhà hoá h ọc các h ợp ch ất t ự nhiên quan tâm nghiên c ứu, có kho ảng trên 11.000 h ợp ch ất flavonoid đã được bi ết v ề cấu trúc. Flavonoid không nh ững có giá tr ị về mặt c ảm quan mà được khai thác, sử dụng trong nhi ều l ĩnh v ực: Th ực ph ẩm, m ỹ ph ẩm và có ý ngh ĩa đặc bi ệt quan tr ọng trong y d ược. Flavonoid có ứng d ụng trong y h ọc để điều tr ị một s ố bệnh nh ư: Viêm nhi ễm, d ị ứng, loét d ạ dày và hành tá tràng, giúp c ơ th ể điều hoà các quá trình chuy ển hoá, ch ống lão hoá, làm b ền thành mạch máu, và gi ảm l ượng cholesterol trong máu. Các nhà hoá sinh cho r ằng flavonoid là m ột ch ất ch ống oxi hoá lý t ưởng. Hi ện nay nhi ều flavonoit được phân l ập t ừ th ực v ật đã được ứng d ụng thành các ch ế ph ẩm đặc tr ị bệnh và s ử dụng trong b ảo qu ản th ực ph ẩm, được th ế gi ới công nh ận là m ột trong nh ững lớp ch ất thiên nhiên có tác d ụng làm ch ậm quá trình lão hoá và đột bi ến c ủa các t ế bào trong c ơ th ể. - Acid phenolic [12]: Được chia thành hai lo ại là d ẫn xu ất c ủa acid benzoic, ch ẳng h ạn nh ư acid gallic, và các d ẫn xu ất c ủa acidcinnamic, acid caffeic và các acid ferulic. Các acid cinnamiac ph ổ bi ến h ơn. Th ực ph ẩm giàu acid phenolic có l ợi cho s ức kh ỏe, chúng có kh ả năng ch ống oxy hóa, ng ăn ng ừa t ổn th ươ ng t ế bào do ph ản ứng oxy hóa các g ốc t ự do. Acid phenolic chi ếm kho ảng m ột ph ần ba c ủa h ợp ch ất phenol trong ch ế độ ăn u ống, có th ể có m ặt ở th ực v ật trong các hình th ức t ự do và liên k ết v ới các thành ph ần khác. Phenol có th ể được liên k ết v ới các thành ph ần th ực v ật khác nhau thông qua các liên k ết este, ether. Các acid hydroxybenzoic gallic, p - hydroxy benzoic, protocatechuic, vanillic syringic acid, ph ổ bi ến c ấu trúc C6 – C1.
18. 11 Hydroxycinnamic acid là nh ững h ợp ch ất th ơm v ới m ột chu ỗi bên ba – carbon (C6 – C3), caffeic, ferulic, p – coumaric vàcác acid sinapic là ph ổ bi ến nh ất. - Tannin [12]: Nhóm quan tr ọng th ứ ba c ủa phenolics, có th ể được chia thành hydrolysable và tannin cô đặc. Nghiên c ứu r ộng rãi nh ất là catechin. Các tannin hydrolysable là các d ẫn xu ất c ủa acid gallic (3, 4, 5 – trihydroxyl acid benzoic). Acid gallic este hóa polyol lõi, và các nhóm alloyl có th ể được ti ếp t ục este hóa ho ặc oxidativelycrosslinked để tạo các tannin hydrolysable ph ức t ạp h ơn. Tannin có tác d ụng đa d ạng trên các h ệ th ống sinh h ọc vì chúng là ch ất ion hóa kim lo ại, t ạo k ết t ủa v ới protein và ch ất ch ống oxy hóa sinh học. - Vitamin C: Là ch ất kh ử trong c ơ th ể, đóng vai trò r ất quan tr ọng trong vi ệc ng ăn ch ặn quá trình s ản xu ất các g ốc t ự do, b ảo v ệ acid béo không no c ủa màng tế bào, đồng th ời b ảo v ệ vitamin E là ch ất ch ống oxy hóa chính c ủa màng t ế bào, ng ăn không cho g ốc này xâm nh ập các phân t ử cholesterol. Chúng t ăng c ường s ự bền b ỉ của mao m ạch, đẩy m ạnh mau lành v ết th ươ ng, kích thích s ản xu ất kháng th ể, acetylcholine, ng ăn ch ặn tác d ụng có h ại c ủa oxygen. - Vitamin E: Được tìm th ấy đầu tiên vào n ăm 1929 b ởi Evans và Bishop, là lo ại vitamin tan trong d ầu có m ặt trong nhi ều lo ại th ực ph ẩm đặc bi ệt trong các lo ại h ạt và d ầu m ỡ. Vitamin E được bi ết đến là ch ất ch ống oxy hoá mạnh, có th ể ng ăn c ản nh ững tác động có h ại c ủa các ch ất oxy hoá sinh ra bởi quá trình chuy ển hoá trong c ơ th ể ho ặc khi c ơ th ể bị nhi ểm khu ẩn. Quá trình tích lu ỹ của các ch ất chuy ển hoá này lâu d ần s ẽ dẫn đến quá trình lão hoá trong c ơ th ể ho ặc s ẽ tr ở thành y ếu t ố nguy c ơ c ủa các b ệnh lý nh ư tim mạch, ung th ư. Vì th ế vi ệc b ổ sung ch ất ch ống oxy hoá ngo ại sinh nh ư vitamin E s ẽ góp ph ần ch ống lão hoá trong đó có lão hoá da và đẩy lùi nguy cơ b ệnh lý mãn tính. - Beta – caroten: Được khám phá ra cách đây h ơn 150 n ăm t ừ lớp màu cam ở củ cà r ốt, beta – caroten hi ện gi ờ là lo ại ch ống oxy hóa được tiêu th ụ rất nhi ều trên th ị tr ường. Ch ất này c ần cho s ự tăng tr ưởng và cho ch ức n ăng
19. 12 của các mô, c ủa x ươ ng; t ăng c ường tính mi ễn d ịch, gi ảm nguy c ơ gây ung th ư, giúp th ị lực t ốt h ơn, nó có th ể bi ến đổi thành vitamin A. Các ch ất ch ống oxy hóa khác g ồm có: Selenium, bioflavonoid và ubiquinon c ũng được biết đến với khả năng chống lão hóa, nh ưng không ph ổ bi ến nh ư vitamine C, E và beta – Caroten. 2.3. Giới thiệu về hợp ch ất Phlorotannin 2.3.1. Đặc điểm Theo Ragan M. A [23] thì phlorotannin được định ngh ĩa nh ư sau: Chúng là polyme sinh h ọc được hình thành t ừ gốc phloroglucinol (1,3,5 – trihydroxybenzen) và các g ốc này liên k ết v ới nhau b ằng nhi ều cách khác nhau. Chính vì v ậy mà chúng t ạo nên nhi ều c ấu trúc khác nhau và đôi lúc có tr ọng l ượng phân t ử lên đến 650KDA. Cho đến nay, trên th ế gi ới có m ột s ố cấu trúc c ủa các h ợp ch ất thu ộc nhóm phlorotannin t ừ rong M ơ đã được xác định và nhi ều d ịch chi ết thô c ủa chúng đã được kh ảo sát ho ạt tính sinh h ọc. Tuy nhiên, r ất ít công trình công b ố một cách đầy đủ các c ấu trúc c ủa t ất c ả các d ẫn xu ất c ủa phloroglucinol trong d ịch chi ết phlorotannin thô được chi ết từ một loài rong c ụ th ể và ho ạt tính c ủa chúng và các công trình này ch ỉ được công b ố trong 10 tr ở lại đây. Các nhà khoa h ọc Hàn Qu ốc c ũng đư a ra c ấu trúc đầy đủ của các d ẫn xu ất c ủa phloroglucinol chi ết t ừ loài rong Ecklonia cava bao g ồm: Hình 2.1. Phloroglucinol (i) và phlorotannin [tetrafucol A (ii), fucodiphloroethol B (iii), fucodiphlorethol A (iv), tetrafuhalol A (v), tetraisofuhalol (vi), phlorofucofuroeckol (vii)] và ho ạt tính c ủa chúng
20. 13 2.3.2. C ơ ch ế oxi hóa c ủa phlorotannin Trong c ơ th ể con người th ường xuyên di ễn ra nhi ều ho ạt động ho ặc xây dựng ho ặc phá h ủy. Có nh ững ch ất t ưởng nh ư là th ực ph ẩm chính c ủa t ế bào nh ưng đồng th ời c ũng làm h ại t ế bào. Có nh ững phân t ử gây ra t ổn th ươ ng thì cũng có nh ững ch ất đề kháng l ại ho ạt động phá phách này. Gốc t ự do, oxygen và ch ất ch ống oxi hóa là m ột ví d ụ. Theo các nhà khoa h ọc thì g ốc t ự do có th ể là th ủ ph ạm gây ra t ới h ơn 60 b ệnh, chúng t ấn công lên các phân t ử protein, lipid, ADN, dẫn đến các bệnh nan y nh ư thoái hóa th ần kinh, ung th ư, tim m ạch, ti ểu đường, Vì v ậy ch ế độ ăn nhi ều hoa qu ả và ít cholesterol s ẽ làm gi ảm ung th ư, kìm hãm và gi ảm các g ốc t ự do. Các ch ất ch ống oxi hóa t ừ trái cây ho ặc s ản ph ẩm chi ết xu ất giúp b ảo v ệ, ng ăn c ản quá trình oxi hóa. Để ch ống l ại tác h ại l ớn do các gốc t ự do gây ra, c ơ th ể con ng ười được trang b ị một h ệ th ống các ch ất ch ống oxi hóa. Ch ất ch ống oxi hóa là các ch ất có kh ả năng ng ăn ng ừa, ch ống l ại và lo ại b ỏ tác d ụng độc h ại c ủa các g ốc t ự do tr ực ti ếp ho ặc gián ti ếp. Ch ất ch ống oxi hóa có th ể ph ản ứng tr ực ti ếp với g ốc t ự do ho ạt động, t ạo ra nh ững g ốc mới kém ho ạt động h ơn, ng ăn c ản các chu ỗi ph ản ứng dây chuy ền do các g ốc tự do kh ơi mào. Ch ất ch ống oxi hóa c ũng có th ể tạo ph ức gián ti ếp v ới ion kim lo ại chuy ển ti ếp ức ch ế enzyme xúc tác trong ph ản ứng sinh gốc t ự do nh ằm ng ăn s ự hình thành g ốc t ự do trong c ơ th ể. Polyphenol được coi là ch ất ch ống oxi hóa h ữu hi ệu nh ất hi ện nay (h ữu hi ệu g ấp 100 l ần vitamin C và g ấp 25 l ần vitamin E) [6]. Sự oxi hóa c ủa các h ợp ch ất polyphenol có ý ngh ĩa r ất l ớn trong s ự sinh tổng h ợp nhi ều ch ất t ự nhiên nh ư lecithin, alkaloid và melanin. S ự tạo thành các h ợp ch ất này có th ể gi ải thích b ằng c ơ ch ế gốc t ự do, trong đó ở giai đoạn đầu c ủa h ợp ch ất monomerphenol xu ất hi ện các g ốc phenol. Ở giai đoạn sau, xảy ra s ự ghép đôi các g ốc t ự do v ới s ự tạo thành m ối liên k ết C – C ho ặc C – O – C ph ụ thu ộc vào ki ểu ghép đôi [6]. Kh ả năng kháng oxi hóa m ạnh c ủa polyphenol được gi ải thích d ựa trên số lượng l ớn các nhóm hydroxyl trong công th ức chúng, nó cho ghép ti ếp nh ận electron m ột cách d ễ dàng (polyphenol là ch ất nh ận các g ốc t ự do), t ức là chúng có kh ả năng d ập t ắt các quá trình t ạo ra g ốc t ự do.
21. 14 2.3.3. Ho ạt tính sinh h ọc c ủa phlorotannin Ho ạt tính sinh h ọc c ủa phlorotannin được công b ố nhi ều nh ất là ho ạt tính ch ống oxi hóa. Ho ạt tính này được nghiên c ứu thông qua kh ảo sát kh ả năng quét các g ốc DPPH (2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrasyl), g ốc hydroxyl - (OH), các anion nh ư superoxide anion (O 2 ), kh ử sắt (III), t ạo ph ức chelat v ới các ion hóa tr ị (II) và oxi hóa lipid c ủa chúng. Các nhà khoa h ọc Mexico đã xác định kh ả năng quét các g ốc DPPH, - anion O 2 và ho ạt tính kh ử của h ỗn h ợp các ch ất thu ộc nhóm phlorotannin được chi ết t ừ một s ố loài rong Nâu sinh tr ưởng t ại vùng bi ển nhi ệt đới t ại Mexico. H ọ đã thu các phlorotannin b ằng chi ết l ạnh, s ử dụng dung môi là dichloromethanol: Methanol (2:1) trong 20 gi ờ. K ết qu ả thu được cho th ấy t ất cả tổng phlorotannin được chi ết t ừ các loài rong ( Lobophora variegate,Padina gymnospora, Dictyota cervicornis và m ột s ố loài rong thu ộc chi Sargassum , chi Turbinaria ) đều có ho ạt tính ch ống oxi hóa v ới giá tr ị EC50 của g ốc DPPH t ươ ng ứng là nh ư sau: Lobophora variegate : 0,32 ± 0,01mg/ml; Padina gymnospora : 3,45mg/ml; chi Sargassum : Từ 6,64 – 7,14mg/ml; chi Turbinaria : 8,85mg/ml và chi Dictyota : 6,42mg/ml. Ngoài ra tổng phlorotannin chi ết t ừ loài Lopophora variegate còn th ể hi ện kh ả năng - quét g ốc anion O 2 và tính kh ử mạnh [18]. Ho ạt tính kháng vi sinh v ật c ủa phlorotannin chi ết t ừ loài rong Ecklonia kurome tại Nh ật B ản đã được Koki Nagayama và cộng sự kiểm định [13]. Để th ử ho ạt tính kháng vi sinh v ật c ủa phlorotannin, nhóm tác gi ả đã s ử dụng ph ươ ng pháp chi ết phlorotannin b ằng c ồn methanol. H ỗn h ợp thu được sau khi chi ết b ằng c ồn được chi ết l ại v ới ethyl acetate và cu ối cùng được tách trên sắc ký b ản m ỏng. T ất c ả các phân đoạn thu được đều th ử ho ạt tính trên 25 ch ủng vi sinh v ật ki ểm định thu ộc 02 nhóm Gr(+) và Gr(-). K ết qu ả là t ất c ả các phân đoạn đều th ể hi ện ho ạt tính kháng 25 ch ủng vi sinh v ật đem th ử. Trên c ơ s ở phlorotannin thô chi ết t ừ loài rong Ecklonia cava các nhà khoa h ọc Hàn Qu ốc đã xác định được nhi ều ho ạt tính sinh h ọc khác c ủa chúng. T ất c ả các d ẫn xu ất c ủa phloroglucinol phân l ập được (tetrafucol A, fucodiphloroethol B, fucodiphlorethol A, tetrafuhalol A, tetraisofuhalol,
22. 15 phlorofucofuroeckol) đều th ể hi ện ho ạt tính ức ch ế các enzyme matrix metalloproteinase (MMP), Alphaglucosidase, α – amylase và ức ch ế quá trình gi ải phóng histamine [26,19, 21]. K ết qu ả này định h ướng cho vi ệc s ử dụng chúng để hỗ tr ợ điều tr ị các b ệnh ti ểu đường, th ấp kh ớp, viêm nhi ễm kinh niên, ch ống d ị ứng. 2.3.4. Tình hình nghiên c ứu phlorotannin trên th ế gi ới Rong bi ển là ngu ồn nguyên li ệu quý có kh ả năng giúp cho c ơ th ể phòng ch ống được m ột s ố lo ại b ệnh. Do v ậy nhi ều n ước trên th ế gi ới giành kho ản ngân sách khá l ớn cho vi ệc nghiên c ứu ứng d ụng s ản xu ất th ực ph ẩm t ừ rong bi ển. Trên th ế gi ới có nhi ều nghiên c ứu v ề phlorotannin do có ho ạt tính sinh học cao. N ăm 2003, Toshiyuki Shibata, Kohki Nagayama, Ryusuke Tanaka, KunikoYamaguchi và Takashi Nakamura đại h ọc Kyushu Nh ật B ản đã đánh giá ho ạt tính ch ống oxy hóa c ủa phlorotannin t ừ loài Laminariaceae bằng cách sử dụng ức ch ế sự peoxy phospholipid trong h ệ th ống liposome và xác định các ho ạt động kh ử gốc t ự do b ằng DPPH. K ết qu ả: Các oligomers c ủa phloroglucinol là eckol; phlorofucofuroeckol A; dieckol and 8,8-bieckol; phân l ập t ừ tảo Eisenia bicyclis có ho ạt tính ch ống oxy hóa cao và hi ệu qu ả hơn so v ới ascorbic và α – tocophenol [13]. Năm 2005, Masaaki Nakai , Norihiko Kageyama , Koichi Nakahara và Wataru Miki đã sàng l ọc phlorotannin t ừ 25 loài rong nâu ở vùng bi ển Nh ật Bản b ằng cách s ử dụng ethanol làm dung môi chi ết. K ết qu ả cho th ấy loài Sargassum ringgoldianum cho ho ạt tính ch ống oxy hóa là cao nh ất, m ạnh gấp 5 ho ạt tính c ủa catechin [30]. Năm 2006, Gin Nae Ahn, Kil Nam Kim, Seon Heui Cha, Choon Bok Song, Jehee Lee, Moon Soo Heo, In Kyu Yeo, Nam Ho Lee, Young Heun Jee và Jin Soo Kim , đánh giá ho ạt động ch ống oxy hóa c ủa phlorotannin (g ồm ba nhóm phloroglucinol, eckol and diecko) t ừ loài Ecklonia cava bằng ph ươ ng pháp quang ph ổ ESR và kh ảo nghi ệm hi ệu qu ả ức ch ế H2O2 thông qua m ức độ tổn th ươ ng DNA. K ết qu ả cho th ấy hi ệu qu ả ức ch ế H2O2 rất tốt . Năm 2007, các tác gi ả Mayalen Zubia, Daniel Robledo, Yolanda FreilePelegrin đã chi ết xu ất phlorotannin và đánh giá ho ạt tính ch ống oxy hóa
23. 16 của 48 loài t ảo bi ển (17 Chlorophyta, 8 Phaeophyta, 23 Rhodophyta) ở bờ bi ển Yucantan và Quintana Roo (Mecico). Nhóm tác gi ả đã s ử dụng dichloromethanol: Methanol (2/1) trong 20 gi ờ. Ho ạt tính ch ống oxy hóa được đo b ằng DPPH và xác định hàm l ượng theo ph ươ ng pháp Folin – Ciocalteu. Các k ết qu ả: Tất c ả các loài đều bi ểu hiện ho ạt tính ch ống oxy hóa, đặc bi ệt ba loài ( Avrainvillea longicaulis, Chondria baileyana và Lobophora variegate ) bi ểu hi ện ti ềm n ăng ch ống oxy hóa tuy ệt v ời v ới quá trình oxy hóa rất th ấp. Ch ỉ số EC50 t ươ ng ứng 1,44 ± 0,01; 2,84 ± 0,07 và 0,32 ± 0,01mg/ml t ươ ng đươ ng v ới m ột s ố ch ất ch ống oxy hóa th ươ ng m ại nh ư α – tocopherol, ascorbic acid, BHA and BHT [18]. Năm 2008, Riitta Koivikko đã chi ết tách hàm l ượng phlorotannin t ừ các lo ại t ảo nâu. Dung môi được s ử dụng là n ước k ết h ợp v ới methanol, ethanol, aceton. K ết qu ả thu được v ới t ỷ lệ nước và aceton là 3:7 thì thu được hàm lượng phlorotannin cao nh ất [29]. Cũng trong n ăm 2008, Jay Robert Rowen đã nghiên c ứu v ề hợp ch ất polyphenol chi ết xu ất t ừ rong bi ển Ecklonia cava gọi chung là ECE. Hai h ợp ch ất quan tr ọng là dieckol và phlorofurofucoeckol (PFF) và được g ọi là siêu ch ất ch ống oxy hóa. K ết qu ả cho th ấy kh ả năng b ắt g ốc t ự do m ạnh h ơn t ừ 10 đến 100 l ần so v ới các polyphenol t ừ th ực v ật trên c ạn, v ượt xa resveratrol và tannin chè. Ngoài ra ECE có tác d ụng gi ảm đau dây th ần kinh, đau kh ớp ng ăn ch ặn ho ặc đảo ng ược s ự ti ến tri ển c ủa b ệnh hen suy ễn mãn tính và b ệnh ph ổi, bảo v ệ bức x ạ, ch ống ung th ư [31]. Năm 2009, Reum Kim, Min Sup, Ji Young Park,Tai Sun Shin, Kyoung Eun Park, Na Young Yoon, Jong Soon Kim, Choi Jae Sue đã xác định được thành ph ần các h ợp ch ất có ho ạt tính ch ống oxy hóa cao t ừ loài Ecklonia solonifera . Các c ấu trúc c ủa phlorotannin được xác định trên c ơ s ở phân tích quang ph ổ, bao g ồm c ả NMR và phân tích kh ối ph ổ. K ết qu ả ch ỉ ra r ằng phlorofucofuroeckol A, dieckol và dioxinodehydroeckol cho th ấy ho ạt tính ch ống oxy hóa cao. Trong đó phlorofucofuroeckol A có ti ềm n ăng làm th ực ph ẩm ch ức n ăng ch ống oxy hóa và ch ống viêm [20]. Năm 2010, Hyun Ryul Goo, Jae Sue, Choi Dong Hee Na đại h ọc Kyungsung, Busan, Hàn Qu ốc đã định l ượng phlorotannin trong t ảo Ecklonia
24. 17 stolonifera . S ử dụng ph ươ ng pháp s ắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao để xác định đồng th ời ba phlorotannin l ớn eckol, dieckol, and phlorofucofuroeckol – A. Các điều ki ện s ắc ký t ối ưu: Cột – C18 (250 × 4,6mm) b ằng cách s ử dụng tách r ửa gradient tuy ến tính c ủa acetonitrile và n ước có ch ứa axit formic 0,1% UV 254nm. Phlorotannins tách được xác định b ởi ph ổ sắc ký lỏng kh ối l ượng. Ph ươ ng pháp s ắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao cho th ấy độ tuy ến tính t ốt (R2> 0,998), độ chính xác (1,4 – 9,5%), và độ chính xác (93,9 – 108,7%). Các gi ới hạn phát hi ện dao động 0,06 – 0,30mg/ml và các gi ới h ạn th ấp h ơn định l ượng dao động 0,2 – 1,0mg/ml. Trong s ố phlorotannins, dieckol là phong phú nh ất trong c ả ethanol và các ch ất chi ết xu ất t ừ acetate ethyl Ecklonia stolonifera [15]. Năm 2012, Wang T, Jónsdóttir R, Liu H, Gu L, Kristinsson HG, Raghavan S, Olafsdóttir G đã đánh giá ho ạt tính ch ống oxy hóa c ủa phlorotannin t ừ loài Fucus vesiculosu bằng DPPH. S ử dụng ph ươ ng pháp s ắc ký c ột ho ặc siêu l ọc để tinh ch ế. K ết qu ả cho th ấy ho ạt tính c ủa phlorotannin cao h ơn r ất nhi ều so v ới acid ascorbic [24]. Hàm l ượng phlorotannins t ập trung trong rong bi ển màu nâu có th ể khác nhau gi ữa các loài, b ị ảnh h ưởng b ởi kích th ước, độ tu ổi, lo ại mô, độ mặn, mùa, m ức độ dinh d ưỡng, c ường độ ăn th ực v ật, c ường độ ánh sáng và nhi ệt độ nước. 2.3.5. Tình hình nghiên c ứu phlorotannin ở Việt Nam Hi ện nay vi ệc nghiên c ứu tách chi ết và ứng d ụng phlorotannin vào trong th ực ph ẩm t ại Vi ệt Nam đã và đang được Vi ện Nghiên C ứu và ứng dụng Nha Trang ti ến hành nghiên c ứu: Năm 2009 , Đặng Xuân C ường đã nghiên c ứu thành công vi ệc thu nh ận dịch chi ết kháng khu ẩn ch ứa polyphenol (phlorotannin) t ừ rong nâu Dictyota dichotoma . Tác gi ả đã xác định các thông s ố tối ưu để thu nh ận phlorotannin tổng s ố từ Dictyota dichotoma có hàm l ượng t ối đa b ằng cách s ử dụng ph ươ ng pháp Folin – Ciocalteu. Đồng th ời t ử ho ạt tính kháng khu ẩn trên m ột số lo ại vi khu ẩn và đã thu được k ết qu ả cao [1].
25. 18 Năm 2010 đến nay, nghiên c ứu xây d ựng quy trình chi ết tách và sàng lọc các ch ất phlorotannin có ho ạt tính sinh h ọc t ừ rong Nâu t ại vùng bi ển Nam Trung B ộ đang được th ực hi ện b ởi Tr ần Th ị Thanh Vân và c ộng s ự [2]. Năm 2010 đến nay, thu nh ận phlorotannin t ừ rong mơ ( Sargassum ) t ại Nha Trang – Khánh Hòa và th ử nghi ệm s ử dụng phlorotannin làm th ực ph ẩm ch ức năng ch ống oxy hóa đang được th ực hi ện b ởi Đặng Xuân C ường dưới s ự hướng d ẫn chính c ủa TS. V ũ Ng ọc B ội và TS. Tr ần Th ị Thanh Vân [3]. Ngoài ra có một s ố công b ố về chi ết tách và nghiên c ứu bi ến động phlorotannin t ừ rong nâu đã được công b ố bởi Vi ện Nghiên c ứu và Ứng d ụng Công ngh ệ Nha Trang. S ự tích l ũy và phân b ố phlorotannin ch ống oxy hóa trong m ột s ố loài rong nâu sargassum Khánh Hòa theo th ời gian sinh tr ưởng đã được công b ố năm 2011 [2]. Năm 2011, Đặng Xuân C ường, Tr ần Th ị Thanh Vân, V ũ Ng ọc B ội đã ứng d ụng mô hình đáp ứng b ề mặt Box – Behnken trong t ối ưu hóa công đọan chi ết phlorotannin t ừ rong nâu ( Sargassum aemulumSonder ) Khánh Hòa [2]. Tối ưu hóa quá trình chi ết phlorotannin t ừ rong nâu Sargassum baccularia ở Khánh Hòa, Vi ệt Nam b ằng ph ươ ng pháp đáp ứng b ề mặt được công b ố bởi tài li ệu [3, 5] đã công b ố các y ếu t ố ảnh h ưởng đến quá trình chi ết polyphenol t ừ loài rong Sargassum macculurei . 2.4. Gi ới thi ệu v ề quá trình trích ly 2.4.1. Cơ sở của quá trình trích ly Phương pháp trích ly là phương pháp thu lấy m ột hay nhi ều ch ất t ừ hỗn hợp đã tách bi ệt, cô l ập và tinh ch ế các c ấu t ử có trong h ỗn h ợp thành nh ững cấu t ử riêng. Quá trình trích ly gồm hai giai đoạn nh ư sau: Giai đoạn 1: Dung môi th ấm ướt lên b ề mặt nguyên li ệu, sau đó th ấm sâu vào bên trong do quá trình th ẩm th ấu t ạo ra dung d ịch ch ứa các ho ạt ch ất. Sau đó dung môi ti ếp t ục hòa tan các ch ất trên b ề mặt b ằng cách đẩy các b ọt khí chi ếm đầy trong các khe vách tr ống c ủa t ế bào. Giai đoạn 2: Giai đoạn ti ếp t ục hòa tan các ho ạt ch ất trong các ống mao dẫn c ủa nguyên li ệu nh ờ vào dung môi đã th ấm sâu vào các l ớp bên trong
26. 19 * Phương pháp trích ly Soxhlet : Soxhlet d ựa trên nguyên t ắc hóa h ơi (dung môi, th ường là dung môi phân cực => d ễ hóa h ơi), theo ống d ẫn lên g ặp h ệ th ống làm l ạnh r ồi ng ưng t ụ xu ống tr ụ trích ly , hòa tan ch ất (tan được trong dung môi phân c ực) nh ư s ắc tố; vitamin nhóm A, D, E, K, Q; lipid; polyphenol Sau đó có ống d ẫn bên thành tr ụ chi ết hình ch ữ U ng ược ho ạt động theo nguyên t ắc trên l ệch áp su ất để về bình c ầu khi m ức trong tr ụ vượt m ức này. V ậy nên đây ch ỉ là cách chi ết ch ất thô, ch ưa được tinh khi ết. H ạn ch ế: tốn th ời gian, qua nhi ều công đoạn dẫn đến sai s ố do cân, đo, đong, đếm. Hi ện có m ột s ố test, ph ươ ng pháp định lượng nhanh, m ức độ chính xác gia t ăng. 2.4.2. Ph ạm vi s ử dụng c ủa quá trình Trong công ngh ệ th ực ph ẩm nh ằm m ục đích sau: Khai thác là m ục đích ch ủ yếu. Ph ổ bi ến là trích ly các nguyên li ệu dạng r ắn nh ư: h ạt d ầu, các nguyên li ệu tinh d ầu nh ư lá, r ễ, cây, hoa ho ặc qu ả; trích ly các lo ại c ủ nh ư c ủ cải đường, trích ly mía. C ũng v ới m ục đích này có th ể ph ối h ợp v ới quá trình khác để nâng cao hi ệu suất thu s ản ph ẩm. Ví d ụ nh ư ph ối h ợp v ới quá trình ép trong s ản xu ất mía đường [4]. Trích ly còn nh ằm m ục đích chu ẩn b ị cho các quá trình ti ếp theo, ví d ụ nh ư ngâm các lo ại h ạt (các lo ại đậu, ngô, thóc, ) tr ước khi ch ế bi ến; ngâm các lo ại c ủ (s ắn, khoai, ) làm y ếu các liên k ết trong v ật li ệu, đồng th ời trích ly một s ố phân t ử vào dung môi ngâm (ví d ụ: Hòa tan HCN khi ngâm c ủ sắn) [4]. Với m ục đích thu nh ận s ản ph ẩm nh ư tách penicillin t ừ dung d ịch lên men s ản xu ất n ước ch ấm b ằng ph ươ ng pháp ủ ẩm trích ly, ho ặc trích ly trong quá trình s ản xu ất cà phê hòa tan, trích ly khi ngâm qu ả, ngâm t ẩm các lo ại thu ốc b ổ và thu ốc ch ữa b ệnh, [4]. 2.4.3. Các y ếu t ố ảnh h ưởng đến quá trình trích ly Th ực ch ất quá trình trích ly là quá trình khu ếch tán. Vì v ậy s ự chênh lệch n ồng độ gi ữa hai pha (gradient n ồng độ) chính là động l ực c ủa quá trình. Khi chênh l ệch n ồng độ lớn, l ượng ch ất trích ly t ăng; th ời gian trích ly gi ảm ta th ực hi ện b ằng cách t ăng t ỷ lệ dung môi so v ới nguyên li ệu.
27. 20 Quá trình trích ly polyphenol (phlorotannin) hi ện nay được th ực hi ện bằng các lo ại dung môi. Nguyên t ắc c ủa trích ly b ằng dung môi d ựa trên s ự th ẩm th ấu dung môi vào t ế bào, ch ất c ần trích ly hòa tan vào dung môi và khu ếch tán ra ngoài t ế bào. Quá trình trích ly b ằng dung môi có ưu điểm là thi ết b ị đơ n gi ản, có th ể xử lý m ột l ượng l ớn nguyên li ệu và có th ể sử dụng ở quy trình liên t ục. Các y ếu t ố ảnh hưởng đến quá trình trích ly b ằng dung môi: Lựa ch ọn dung môi trích ly: Dung môi trích ly là dung môi hòa tan được h ợp ch ất c ần trích ly. Các polyphenol (phlorotannin) là các h ợp ch ất phân c ực nên ch ủ yếu s ử dụng các dung môi phân c ực nh ư: Nước, ethanol, acetone, ethyl acetate Di ện tích ti ếp xúc gi ữa nguyên li ệu và dung môi. C ần t ăng di ện tích này để làm t ăng hi ệu qu ả của quá trình. V ới các nguyên li ệu r ắn c ần t ăng di ện tích ti ếp xúc gi ữa chúng và dung môi. Điều này th ực hi ện b ằng cách nghi ền nh ỏ, thái nh ỏ, b ăm nh ỏ vật li ệu. Nó còn làm phá v ỡ cấu trúc t ế bào, thúc đẩy quá trình ti ếp xúc tri ệt để gi ữa dung môi và v ật li ệu. Tuy nhiên kích th ước và hình d ạng c ủa v ật li ệu khi làm nh ỏ cũng có gi ới h ạn vì n ếu chúng quá m ịn s ẽ bị lắng đọng lên lớp nguyên li ệu, làm t ắc các ống mao d ẫn ho ặc b ị dòng dung môi cu ốn vào mixen (h ỗn h ợp) làm cho dung d ịch có nhi ều c ặn gây ph ức t ạp cho quá trình x ử lý ti ếp theo [2]. Khu ấy tr ộn: Khu ấy tr ộn giúp t ăng c ường hi ệu qu ả trích ly, do t ăng cường quá trình truy ền kh ối. Tính ch ất c ủa vật li ệu c ũng ảnh h ưởng l ớn đến hi ệu su ất trích ly. V ật li ệu là h ỗn h ợp l ỏng – lỏng ho ặc h ỗn h ợp r ắn – lỏng c ộng v ới m ột dung môi ho ặc t ập h ợp m ột s ố lo ại dung môi. Chúng có độ hòa tan khác nhau, n ồng độ các ch ất khác nhau và có tác d ụng t ươ ng h ỗ, khu ếch tán vào nhau. Nh ư khi trích ly đầu n ếu độ ẩm nguyên li ệu gi ảm, t ốc độ trích t ăng lên, vì độ ẩm tác dụng v ới protein và các ch ất háo n ước khác ng ăn c ản s ự dịch chuy ển c ủa dung môi th ấm sâu vào trong nguyên li ệu, làm ch ậm quá trình khu ếch tán [4]. Nhi ệt độ có tác d ụng t ăng t ốc độ khu ếch tán và gi ảm độ nh ớt, ph ần t ử ch ất hòa tan chuy ển động d ễ dàng khi khu ếch tán gi ữa các ph ần t ử dung môi. Tuy nhiên nhi ệt độ là m ột y ếu t ố có gi ới h ạn. Vì khi nhi ệt độ quá cao có th ể
28. 21 xảy ra các ph ản ứng khác không c ần thi ết (làm oxi hóa polyphenol c ần trích ly), gây khó kh ăn cho quá trình công ngh ệ [4]. Do đó trong toàn b ộ quá trình nhi ệt độ không nên v ượt quá 70 0C. Yếu t ố th ời gian c ũng ảnh h ưởng đến quá trình trích ly. Khi th ời gian tăng lên, l ượng ch ất khu ếch tán t ăng, nh ưng th ời gian ph ải có gi ới h ạn. Vì khi đã đạt được m ức độ trích ly cao nh ất, n ếu kéo dài th ời gian s ẽ không mang l ại hi ệu qu ả kinh t ế. 2.5. Giới thiệu về phương pháp thu nhận 2.5.1. Phương pháp cô đặc Cô đặc là phương pháp thường dùng để làm tăng nồng độ hàm lượng các chất có trong dịch trích ly. Tùy theo tính chất của chất cần cô đặc khó bay hơi (hay không bay hơi trong quá trình đó) ta có thể tách phần dung môi dễ bay hơi bằng phương pháp nhiệt hay phương pháp làm lạnh kết tinh . Cô đặc là quá trình làm tăng nồng độ chất rắn hòa tan trong dung dịch bằng cách tách bớt một phần dung môi qua dạng bay hơi . Phương pháp nhiệt (đun nón g): Dung môi chuyển từ dạng lỏng sang trạng thái dạng hơi dưới tác dụng của nhiệt khi áp suất riêng của nó bằng áp suất tác dụng lên bề mặt thoáng chất lỏng . Phương pháp lạnh : Khi hạ tháp nhiệt độ đến một mức nào đó thì một cấu tử sẽ tách ra dạng tinh thể đơn chất tinh khiết, thường là kết tinh dung môi để tăng nồng độ chất tan. Tùy tính chất của chất tan và áp suất bên ngoài tác dụng lên mặt thoáng mà quá trình kết tinh đó xảy ra ở nhiệt độ cao hay thấp và đôi khi phải dùng đến máy lạnh . 2.5.2. Phương pháp sấy Ph ươ ng pháp s ấy nóng: Trong ph ươ ng pháp s ấy nóng, tác nhân s ấy và vật li ệu s ấy được đốt nóng. Do tác nhân s ấy được đốt nóng nên độ ẩm t ươ ng đối φ gi ảm d ẫn đến phân áp su ất h ơi n ước trong tác nhân s ấy gi ảm. M ặt khác do nhi ệt độ của v ật li ệu s ấy t ăng lên nên m ật độ hơi trong các mao qu ản t ăng và phân áp su ất h ơi n ước trên b ề mặt vật c ũng t ăng.
29. 22 Ph ươ ng pháp s ấy l ạnh: Khác v ới ph ươ ng pháp s ấy nóng, để tạo ra s ự chênh l ệch áp su ất gi ữa h ơi n ước c ủa v ật li ệu s ấy v ới tác nhân s ấy, ng ười ta làm gi ảm áp su ất h ơi n ước trong tác nhân s ấy (b ằng cách gi ảm ẩm trong tác nhân s ấy và độ ẩm t ươ ng đối ( φ)). Áp su ất c ủa môi tr ường không khí bên ngoài gi ảm xu ống, độ chênh áp su ất c ủa ẩm trong v ật s ấy vào môi tr ường xung quanh t ăng lên. Ẩm chuy ển d ịch t ừ trong v ật ra môi tr ường. Nhi ệt độ môi tr ường c ủa s ấy l ạnh th ường th ấp (có th ể th ấp h ơn nhi ệt độ của môi tr ường bên ngoài, có khi nh ỏ hơn 00C). Ph ươ ng pháp s ấy th ăng hoa: Ph ươ ng pháp s ấy th ăng hoa được th ực hi ện ở điều ki ện nhi ệt độ và áp su ất th ấp. Ch ế độ làm vi ệc th ấp h ơn điểm ba th ể của n ước (t = 0,0098 0C, p = 4,58mmHg). Quá trình s ấy được th ực hi ện trong m ột bu ồng s ấy kín. Ph ươ ng pháp s ấy phun: S ấy phun được s ử dụng để sấy khô các ch ất cô của dung d ịch canh tr ường, các ch ất kháng sinh động v ật, các acid amin, các enzyme, các ch ất trích ly thu nh ận được trên các môi tr ường dinh d ưỡng r ắn, các dung d ịch ch ất l ắng thu nh ận được khi làm l ắng enzyme b ằng các dung môi vô cơ hay b ằng các mu ối trung hoà, c ũng nh ư các ph ần cô ch ất l ỏng canh tr ường. Ph ươ ng pháp s ấy chân không: Ph ươ ng pháp s ấy chân không được áp dụng để sấy các lo ại v ật li ệu có ch ứa nhi ều hàm lượng tinh d ầu, h ươ ng hoa, dược ph ẩm, các nông s ản th ực ph ẩm có yêu c ầu nhi ệt độ sấy th ấp nh ằm gi ữ nguyên ch ất l ượng và màu s ắc, không gây phá h ủy, bi ến tính các ch ất. Nguyên lý c ơ b ản c ủa ph ươ ng pháp s ấy chân không đó là s ự ph ụ thu ộc vào áp su ất điểm sôi của n ước. N ếu làm gi ảm (h ạ th ấp) áp su ất trong m ột thi ết bị chân không xu ống đến áp su ất mà ở đấy n ước trong v ật b ắt đầu sôi và b ốc hơi s ẽ tạo nên m ột dòng chênh l ệch áp su ất đáng k ể dọc theo b ề mặt v ật, làm hình thành nên m ột dòng ẩm chuy ển động trong v ật li ệu theo h ướng t ừ trong ra b ề mặt v ật.
30. 23 PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối t ượng, v ật li ệu, địa điểm và th ời gian nghiên c ứu 3.1.1. Đối t ượng nghiên c ứu Đối t ượng nghiên c ứu c ủa đề tài là trích ly phlorotannin từ loài Sargassum Polycystum có độ ẩm 16% được thu mua ở Nha Trang – Khánh Hòa 3.1.2. Hóa ch ất và thi ết b ị 3.1.2.1. Hóa ch ất Các hóa ch ất: Ethanol, acetone và nước cất (Vi ệt Nam) đều là hóa ch ất tinh khi ết. Thu ốc th ử Folin – Ciocalteu (Đức ) g ồm: Sodium phosphate và amonium molybdate (Merck); Na 2CO 3 10% 3.1 .2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị : Cân k ỹ thu ật (Cent – 0 – Gram Balance, OHAUS, M ỹ) Cân phân tích (Precisa XT 320M, Th ụy S ỹ) Tủ lạnh (Samsung SR – 15NFBA, Nh ật B ản) Máy s ấy (Grot DZ 47 – 63, Trung Qu ốc) Thi ết b ị Soxhlet (TC 15, Trung Qu ốc) Dụng cụ : Gi ấy l ọc, ph ễu l ọc, c ốc đong, bình tam giác các lo ại, bình định m ức, đũa th ủy tinh, pipet các lo ại, nhi ệt k ế hi ện có t ại các phòng thí nghi ệm c ủa Viện cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch . 3.1.3. Địa điểm và th ời gian nghiên c ứu Địa điểm: Phòng thí nghi ệm B ộ môn Nghiên c ứu ph ụ ph ẩm và Môi tr ường nông nghi ệp – Vi ện C ơ điện nông nghi ệp và Công ngh ệ sau thu ho ạch, 126 ph ố Trung Kính – Trung Hòa – Cầu Gi ấy – Hà N ội. Th ời gian : T ừ tháng 07/12/ 2013 đến tháng 27/05/2014. 3.2. Nội dung nghiên cứu Nghiên c ứu ảnh h ưởng c ủa điều ki ện x ử lý nguyên li ệu đến khả năng trích ly ho ạt ch ất sinh h ọc phlorotannin từ rong mơ . Nghiên c ứu ảnh h ưởng c ủa lo ại dung môi, t ỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly ho ạt ch ất sinh h ọc phlorotannin từ rong mơ .
31. 24 Nghiên c ứu xác định các thông s ố ảnh h ưởng đến khả năng trích ly hoạt ch ất sinh h ọc phlorotannin từ rong mơ . Lọc, cô d ịch trích ly và thu được ch ế ph ẩm phlorotannin từ rong mơ . Xây d ựng quy trình trích ly ho ạt ch ất sinh h ọc phlorotannin từ rong mơ . 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiêm Trong quá trình ti ến hành thí nghi ệm c ần chú ý: Rong tránh ti ếp xúc v ới ánh sáng m ặt tr ời do phlorotannin d ễ bị phân h ủy. Th ường xuyên ki ểm tra nhi ệt độ trong quá trình trích ly . Khi th ời gian thí nghi ệm kéo dài c ần th ường xuyên kiểm tra các điều ki ện còn l ại để đảm b ảo độ chính xác. 3.3.1.1. Thí nghi ệm ảnh h ưởng c ủa kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly Phlorotannin. Rong mơ được nghiền nhỏ với các kích thước khác nhau để lựa chọn ra kích thước tối ưu nhất. Ở đây tôi khảo sát ở các kích thước như sau : CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 Kích thước (mm) d ≤ 0,5 0,5 < d ≤ 1 1 < d ≤ 1,5 Rong mơ với các kích thước khác nhau được đem đi trích ly ở cùng điều kiện. Cố định các điều kiện sau : Khối lượng mẫu : 10g Dung môi trích ly: Nước cất Tỷ lệ dung môi : 35/1 Thời gian trích ly : 2 gi ờ Nhiệt độ trích ly : 40 0C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bằng giấy lọ c tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định kích thước tối ưu . Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần . 3.3.1.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin Trong thí nghiệm này tôi khảo sát với 3 loại dung môi với nồng độ dung môi gần như tinh khiết .
32. 25 CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 Loại dung môi Nước cất Ethanol Aceton Cố định các điều kiện trích ly sau : Khối lượng mẫu : 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Tỷ lệ dung môi : 35/1 Thời gian trích ly : 2 gi ờ Nhiệt độ trích ly : 40 0C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bàng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định dung môi tối ưu . Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần . 3.3.1.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin Khi xác định được loại dung môi tôi khảo sát tỷ lệ dung môi để lựa chọn tỷ lệ tối ưu nhất. Thí nghiệm này tôi khảo sát với các tỷ lệ sau : CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 Tỷ lệ DM /NL (ml/g) 30/1 35/1 40/1 45/1 Cố định các điều kiện trích ly sau : Khối lượng mẫu : 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.2 Thời gian trích ly : 2 gi ờ Nhiệt độ trích ly : 40 0C Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc tách bã bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định tỷ lệ tối ưu . Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần . 3.3.1.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin Nhi ệt độ có ảnh h ưởng đến kh ả năng hòa tan các ch ất trong rong nguyên li ệu vào môi tr ường chi ết. Khi nhi ệt độ tăng các phân t ử khu ếch tán càng mạnh, độ nh ớt gi ảm, l ượng ch ất tan vào môi tr ường trích ly càng nhiều. Tuy nhiên n ếu nhi ệt độ quá cao có th ể làm bi ến tính m ột s ố hợp ch ất có ho ạt tính
33. 26 sinh h ọc ho ặc làm hao h ụt m ột l ượng ch ất tan d ễ bay h ơi khác. N ếu nhi ệt độ quá th ấp, l ượng ch ất tan khu ếch tán ra môi tr ường b ị hạn ch ế. Vì v ậy t ôi tiến hành thí nghiệm ở các nhiệt độ sau : CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 Nhiệt độ (0C) 40 50 60 70 Cố định các điều kiện trích ly sau : Khối lượng mẫu : 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Thời gian : 2 gi ờ Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định nhiệt độ trích ly tối ưu . Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần . 3.3.1.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin Thí nghi ệm nh ằm xác định th ời gian trích ly tối ưu để thu được hàm lượng phlorotannin cao nh ất. Th ời gian trích ly phải h ợp lý , n ếu kéo dài th ời gian trích ly lượng ch ất hòa tan dung môi đã h ết, đồng th ời s ẽ ảnh h ưởng đến th ời gian th ực hi ện và chi phí cho toàn b ộ quá trình. Vì vậy tôi tiến hành thí nghiệm ở các thời gian sau : CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 Thời gian (gi ờ) 1 2 3 4 Cố định các điều kiện trích ly sau : Khối lượng mẫu : 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Nhiệt độ trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.4 Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định thời gian trích ly tối ưu . Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần .
34. 27 3.3.1.6. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotanni n Tiến hành trích ly mẫu ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở các thì nghiệm trên. Sau khi trích ly 1 lần xong thì tiến hành lấy dịch lọc. Phần bã tiếp tục sử dụng để trích ly lại lần 2, lần 3 tương tự . CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 Số lần trích ly 1 2 3 Cố định các thông số : Khối lượng mẫu : 10g Kích thước nguyên liệu: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.1 Dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.2 Tỷ lệ dung môi: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.3 Nhiệt độ trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.4 Thời gian trích ly: Dựa vào kết quả thí nghiệm mục 3.3.2.5 Sau khi trích ly đem dịch trích ly đi lọc bằng giấy lọc tinh 1 lần rồi xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định số lần trích ly . 3.3.1.7. Thí nghiệm xác định nhiệt độ cô đặc Quá trình cô đặc là để tách b ớt l ượng dung môi có trong d ịch trích ly tạo điều ki ện thu ận l ợi cho các công đoạn sau. Ta c ần xác định nhi ệt độ cô đặc thích h ợp nh ằm h ạn ch ế ảnh h ưởng c ủa y ếu t ố nhi ệt độ đến ch ất tan c ần trích ly. Vì vậy tôi tiến hành thì nghiệm ở các nhiệt độ sau : CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 Nhiệt độ (0C) 40 50 60 70 Sau khi d ịch rong được l ọc, ta chia d ịch rong thành 4 th ể tích b ằng nhau r ồi ti ến hành cô đặc b ằng thi ết b ị cô đặc chân không trong 30 phút . Làm thí nghi ệm này khi đã l ựa ch ọn được các y ếu t ố ảnh h ưởng đến quá trình chi ết nh ư: Kích thước nguyên liệu , t ỷ lệ nguyên li ệu, dung môi, nhi ệt độ trích ly và th ời gian trích ly. Sau đó xác định hàm lượng Phlorotannin, từ đó xác định nhiệt độ cô đặc . 3.3.1.8. Thí nghiệm xác định thời gian ly tâm Quá trình ly tâm là để tách h ết c ặn (bã rong) còn sót l ại trong d ịch trích ly trong quá trình cô đặc. D ịch trích ly thu được s ẽ trong h ơn, sáng màu h ơn. Ta c ần xác định th ời gian ly tâm thích h ợp để tách tri ệt để cặn trong d ịch rong, đồng th ời ti ết ki ệm được th ời gian và chi phí th ực hi ện quá trình.
35. 28 Dịch rong sau khi cô đặc tách b ớt dung môi được chia thành 5 m ẫu và ti ến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút t ại các m ức th ời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút . CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Thời gian (Phút ) 5 10 15 20 25 Sau khi ly tâm ki ểm tra độ trong b ằng c ảm quan và l ựa ch ọn th ời gian ly tâm thích h ợp. 3.3.2. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý 3.3.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm Xác định độ ẩm của chế phẩm sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi . Tiến hành : S ấy c ốc đến kh ối l ượng không đổi. C ốc được r ửa s ạch, úp khô, s ấy ở nhi ệt độ 100 – 105 0C trong kho ảng 1 gi ờ, sau đó l ấy ra làm ngu ội trong bình hút ẩm r ồi mang đi cân và s ấy ti ếp ở nhi ệt độ trên, làm ngu ội trong bình hút ẩm và cân đến khi nào gi ữa hai l ần liên ti ếp sai khác kh ối l ượng không quá 5.10 -4g là được (s ấy đến kh ối l ượng không đổi). Cân chính xác m ột l ượng rong đã c ắt nh ỏ (kho ảng 10g) vào c ốc đã s ấy khô đến kh ối l ượng không đổi. Dùng đũa th ủy tinh đánh t ơi m ẫu r ồi dàn đều mẫu trên đáy c ốc. Chuy ển c ốc vào t ủ sấy, s ấy ở 60 – 80 0C trong 2 gi ờ. Sau đó nâng nhi ệt độ lên 100 – 105 0C, s ấy liên t ục trong 3 gi ờ. Chú ý, trong quá trình sấy c ứ sau m ột gi ờ đảo m ẫu m ột l ần. L ấy m ẫu ra để ngu ội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích r ồi s ấy ti ếp ở nhi ệt độ 100 – 105 0C đến kh ối l ượng không đổi nh ư trên. Tính kết quả : Độ ẩm rong được tính theo công thức : G1 - G2 X= * 100% G1 - G Trong đó : X: Độ ẩm (hàm l ượng n ước) c ủa rong (%). G1: Kh ối l ượng c ốc s ấy và m ẫu th ử tr ước khi s ấy (g).
36. 29 G2: Kh ối l ượng c ốc s ấy và m ẫu th ử sau s ấy (g). G: Kh ối l ượng c ốc s ấy (g). 3.3.2.2. Xác định hàm l ượng phlorotannin trong d ịch trích ly [13] Hàm l ượng phlorotannin trong d ịch chi ết được xác định b ằng ph ươ ng pháp so màu, dùng thu ốc th ử Folin – Ciocalteu ở bước sóng 750nm. Tiến hành : L ấy 1ml d ịch trích ly dung môi + 1ml Folin – Ciocalteu 10% + 2ml Na 2CO 3 10%. Sau đó đặt các ống nghi ệm trong bóng t ối ở nhi ệt độ phòng kho ảng 1 gi ờ. Sau kho ảng th ời gian trên quan sát th ấy màu xanh đen xu ất hi ện và ti ến hành so màu b ằng máy quang ph ổ UV – Vis ở bước sóng 750nm, ghi độ hấp th ụ và tính toán xác định được hàm l ượng phlorotannin có trong m ẫu th ử. * Xây dựng đường chuẩn : Cân 1g phlorotannin tinh khi ết (ch ất chu ẩn), hòa tan trong bình định m ức 1lít b ằng n ước c ất sau khi glucose tan h ết ta thêm n ước c ất đến v ạch định mức. Ta có dung d ịch chu ẩn v ới n ồng độ 1mg/ml (1000ppm). Từ dung d ịch chu ẩn ta pha thành dãy chu ẩn v ới các n ồng độ: 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; 0,001mg/ml; t ươ ng ứng v ới các n ồng độ 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm; 1ppm. Lấy 5ml m ỗi n ồng độ ch ất chu ẩn đưa vào các ống nghiệm 1ml. Thêm lần lượt vào tất cả các ống nghiệm chuẩn 1ml Folin – Ciocalteu 10% lắc đều trong 5 phút, rồi bổ sung thêm lần lượt vào các ống nghiệm 2ml Na 2CO 3 lắc đều và để trong bóng tối khoảng 1 giờ . Chuy ển dãy chu ẩn ra các cuvet và đo độ hấp th ụ quang h ọc ở bước sóng là 750nm. Kết qu ả xây d ựng đường chu ẩn: y = 6,4843x + 0,0441 với R 2 = 0,9996 (phụ lục 1) * Tính toán xác định hàm l ượng phlorotannin trong sinh kh ối rong m ơ. Từ đường chu ẩn xác định được n ồng độ mẫu phân tích. Hàm l ượng phlorotannin được tính theo công th ức sau: x * n * V Hàm l ượng phlorotannin (%) = m
37. 30 Trong đó: x: Là s ố gam xác định t ừ đường chu ẩn n: Là h ệ số pha loãng m: Là kh ối l ượng m ẫu ban đầu đem phân tích (g) V: Là th ể tích dung môi (ml) 3.3.3 . Phương pháp xử lý số liệu Xử lý các s ố li ệu th ực nghi ệm theo ph ươ ng pháp th ống kê s ử dụng Iristat 5.0 và MS . Excell
38. 31 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin Tính ch ất c ủa nguyên li ệu có ảnh h ưởng đến hi ệu su ất trích ly phlorotannin. N ếu hàm ẩm c ủa nguyên li ệu gi ảm thì t ốc độ trích ly t ăng lên, vì l ượng n ước trong nguyên li ệu tác d ụng v ới protein và các ch ất háo n ước khác làm ng ăn c ản s ự chuy ển d ịch c ủa dung môi th ấm sâu vào trong nguyên li ệu, làm ch ậm quá trình khu ếch tán. Chúng tôi sử dụng nguyên liệu rong mơ có độ ẩm là 16% để sử dụng cho quá trình trích ly phlorotannin. Kích th ước c ủa nguyên li ệu có ảnh h ưởng l ớn đến kh ả năng trích ly phlorotannin, n ếu kích th ước nguyên li ệu mà l ớn thì dung môi khó ti ếp xúc v ới nguyên li ệu do đó khả năng trích ly thấp. K ết qu ả kh ảo sát ảnh h ưởng c ủa kích th ước nguyên li ệu đến hi ệu su ất trích ly phlorotannin được trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1. Ảnh h ưởng c ủa kích th ước nguyên li ệu đến khả năng trích ly phlorotannin Kích thước (mm) Hàm lượng phlorotannin ( mg/g chất khô ) d ≤ 0,5 9,372 a 0,5 < d ≤ 1 8,150 b 1 < d ≤ 1,5 7,077 c (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến khả năng trích ly phlorotannin
39. 32 Từ bảng 4.1 chúng tôi nh ận th ấy, khi nguyên li ệu có kích th ước d ≤ 0,5mm thì hàm lượng phlorotannin cao nhất đạt 9,372mg/g. Sau đó là hàm lượng phlorotannin ở kích th ước 0,5 < d ≤ 1mm là 8,150mg/g. Nguyên li ệu có kích th ước 1 < d ≤ 1,5mm có hi ệu su ất th ấp nhất là 7,077mg/g. K ết qu ả xử lý th ống kê cho th ấy giá tr ị hàm l ượng phlorotannin ở các kích th ước khác nhau là khác nhau ở mức ý ngh ĩa α = 0,05. Qua thí nghi ệm này chúng tôi ch ọn kích th ước d ≤ 0,5mm là phù h ợp nh ất cho quá trình trích ly phlorotannin và s ử dụng k ết qu ả này cho các nghiên c ứu sau. 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin Tiến hành 3 thí nghiệm, mỗi mẫu lấy 10g nguyên liệu để trích ly phlorotannin bằng cách sử dụng cá c dun g môi khác nhau. Mẫu 1: Nước cất; Mẫu 2: Ethanol; Mẫu 3: A ceton. Sau khi trích ly thu nhận phlorotannin để đánh giá kết quả. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2: Bảng 4.2 . Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin Dung môi Hàm lượng phlorotannin (mg/g chất khô ) Nước cất 9,376 a Ethanol 8,970 b Aceton 7,624 c (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin
40. 33 Qua k ết qu ả nghiên c ứu bảng 4.2 và hình 4.2 thể hiện: Khi trích ly bằng 3 dung môi nói trên thì hàm lượng phlorotannin thu được giảm dần theo thứ tự sau : N ước cất, ethanol, aceton. Điều này cho thấy những dung môi có độ phân cực mạnh hơn thì hàm lượng phlorotannin thu được cao hơn . Kết quả nghiên cứu hình 4.2 cho thấy : K hi trích ly bằng dung môi nước cất hàm lượng phlorotannin là cao nhất 9,376mg/g nguyên liệu. Trong khi đó hàm lượng phlorotannin thu được thấp nhất khi sử dụng aceton 7,624mg/g nguyên liệu. Ethanol cũng là dung môi trích ly được phlorotannin với hàm lượng khá cao 8,970mg/g nguyên liệu. Có thể giải thích những điều trên như sau: Độ phân cực của dung môi và hợp chất tự nhiên là rất quan trọng trong trích ly. Dung môi phân cực thì sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực. Theo tài liệu [29 ] cho thấy các hợp chất phenol thường dễ dàng hòa tan trong các dung môi phân cực bằng hoặc nhỏ hơn so với nước. Phlorotannin là hợp chất có độ phân cực do đó hiệu quả trích ly của dung môi tăng khi độ phân cực tăng . Phân tử nước được cấu tạo một phân tử oxy và hai phân tử hydro, mà đôi electron trong môi trường liên kết này bị kéo về phía oxy nên phân tử nước có tính phân cực, do đó nước dễ liên kết với các nguyên tử, phân tử và các chất khác. Mặt khác các phân tử nước liên kết với nhau bằng liên kết hydro (liên kết kém bền) nên các phân tử , nguyên tử hoặc các chất khác dễ bẻ gãy liên kết đó để tạo nên chất mới. Vì vậy trong dịch trích ly thu được hàm lượng cao nhất so với các dung môi còn lại . Khi trích ly bằng ethanol 96 0, etahnol được sử dụng có độ nhớt cao 1,20cp sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu, nhưng do sức căng bề mặt khá nhỏ 22,03dyn/cm và quan trọng hơn là ethanol có tính phân cực khá mạnh nên khả năng hòa tan phlorotannin vẫn dễ dàng. Vì vậy trong dịch trích ly hàm lượng phlorotannin thu được cũng khá cao 8,970mg/g nhưng vẫn thấp hơn dung môi là nước cất 9,376mg/g. Khi trích ly bằng aceton, aceton được sử dụng có độ nhớt 0,32cp thấp hơn so với ethanol rất nhiều do đó dễ thấm vào nguyên liệu hơn. Nhưng sức căng bề mặt của aceton là 23,7dyn/cm lớn hơn sức căng bề mặt của ethanol nên hàm lượng phlorotannin thu được trong dịch trích ly thấp hơn so với trích
41. 34 ly bằng ethanol. Vì vậy hàm lượng phlorotannin thu được bằng dung môi là aceton là thấp nhất trong 3 loại dung môi khảo sát . Theo Riitta Koivikko đã chi ết tách hàm l ượng phlorotannin t ừ các lo ại tảo nâu. Dung môi được s ử dụng là n ước k ết h ợp v ới methanol, ethanol, aceton. K ết qu ả thu được v ới t ỷ lệ nước và acetone là 3:7 thì thu được hàm lượng phlorotannin cao nh ất [29 ]. Nhưng dựa trên giá trị kinh tế và kết quả khảo sát của mình tôi nên tôi lựa chọn dung môi để trích ly cho các thì nghiệm về sau là nước cất . 4.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly Phlorotannin Sau khi xác định kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến khá năng trích ly phlorotannin từ rong mơ. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 và hình 4.4 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin Tỷ lệ dung môi / nguyên liệu Hàm lượng phlorotannin (mg/g chất (ml/g) khô) 30/1 8,554 c 35/1 9,375 b 40/1 10,280 a 45/1 10,276 ab (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.3. Đồ thì biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến khả năng trích ly phlorotannin
42. 35 Qua kết quả nghiên cứu hình 4.3 và bảng 4.3 cho thấy khi tăng thể tích dung môi thì hàm lượng phlorotannin thu được tăng , cao nhất ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu = 40/1 đạt 10,280mg/g nguyên liệu. Khi vượt quá tỷ lệ 40/1 thì hàm lượng phlorotannin không tăng nữa. Ở tỷ lệ 45/1 hàm lượng phlorotannin đạt 10,276mg/g nguyên liệu thấp hơn 0,004mg/g so với khi trích ly ở tỷ lệ 40/1. Có thể giải thích như sau : Trong quá trình trích ly bằng dung môi thì nhận th ấy r ằng khi l ượng dung môi càng l ớn thì hi ệu qu ả trích ly càng t ăng do chúng luôn t ạo ra được một s ự chênh l ệch n ồng độ cần thi ết bên trong và bên ngoài môi tr ường t ức là luôn có động l ực cho quá trình. Khi tỷ lệ tăng, phlorotannin và các chất tan có điều kiện hòa tan tốt vào dung môi bởi lượng dung môi lớn sẽ làm tăng khả năng tiếp xúc, từ đó làm tăng sự chênh lệch áp nồng độ phlorotannin giữa môi trường bên trong và bên ngoài nguyên liệu. Sự chênh lệch này càng lớn thì tốc độ trích ly càng nhanh. Khi chưa đạt cân bằng thì quá trình khuếch tán vẫn tiếp tục diễn ra . Lúc đầu nồng độ chất phlorotannin và các chất tan có trong nguyên liệu nhiều, sự khuếch tán chúng ra khỏi tế bào cũng nhanh và mạnh. Nhưng dần dần khi lượng dung môi đã ngấm kiệt vào trong các thành phần của nguyên liệu (sự thẩm thấu gần đạt trạng thái bão hòa) và nồng độ chất tan cũng như phlorotannin đã giảm so với ban đầu, thì sự khuếch tán các chất này ra khỏi tế bào nguyên liệu cũng giảm và chậm hơn. Do đó khả năng hòa tan của chúng vào môi trường trích ly sẽ bị giảm và dần ổn định (lúc này chênh lệch nồng độ chất tan trong tế bào n guyên liệu và trong dịch trích ly rất nhỏ ). Tỷ lệ dung môi /nguyên liệu = 30/1 là tỷ lệ thấp nhất và hàm lượng phlorotanin thấp nhất do dung môi thấp chưa đủ tách hết lượng phlorotanin trong nguyên liệu ra ngoài môi trường trích ly hoàn toàn . Ở tỷ lệ dung môi /nguyên liệu = 35/1 là 9,375mg/g chưa đạt được hàm lượng phlorotannin cao nhất do lượng dung môi chưa đủ để tách hết lượng phlorotannin trong nguyên liệu . Tại tỷ lệ 40/1 tạo ra sự chênh lệch nồng độ lớn nhất, lượng phlorotannin dịch chuyển qua màng tế bào và thoát ra ngoài môi trường nhiều 10,280mg/g. Vì vậy cho hàm lượng phlorotannin cao nhất .
43. 36 Nhưng khi tỷ lệ 45/1 lại thu được hàm lượng phlorotannin là 10,276mg/g xấp xỉ với hàm lượng thu được với tỷ lệ 40/1, có thể giải thích như sau : K hi tỷ lệ quá cao sẽ dẫn đến sự cân bằng pha, trong dịch trích ly phlorotannin còn có nhiều chất tan khác do đó lượng phlorotannin thu được không tăng . Do đó tôi chọn tỷ lệ dung môi /nguyên lệu là 40/1 là tỷ lệ thích hợp cho quá trình trích ly và là thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp theo . 4.4. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin Sau khi xác định được kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất và tỷ lệ dung môi /nguyên liệu = 40/1 thích hợp, tôi tiến hành ngiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin trong các điều kiện này. Kết quả được thể hiện tại bảng 4.4 và hình 4.4. Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin Hàm lượng phlorotannin Nhiệt độ (0C) ( mg/g chất khô ) 40 10,286 c 50 10,868 a 60 9,851 b 70 8,214 d (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly phlorotannin
44. 37 Từ kết quả nghiên cứu bảng 4.4 và đồ thị (hình 4.4), ta thấy hàm lượng phorotannin t rong dịch trích ly tăng lên khi ta tăng nhiệt độ từ 40 0C đến 50 0C từ 10,286mg/g lên 10,868mg/g và bắt đầu giảm xuống khi tăng nhiệt độ từ 50 0C đến 70 0C và hàm lượng phlorotannin là 8,214mg/g. Có thể giải thích nh ư sau: Khi tăng nhiệt độ trích ly sẽ làm giảm độ nhớt của dịch, làm tăng tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học [4] trong nguyên liệu với nhau cũng như các thành phần đó với hỗn hợp dung môi trích ly. Và tăng hiệu quả của quá trình trích ly. Tuy nhiên nhiệt độ quá cao làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt đồng thời quá trình oxy hóa phlorotannin tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly . Khi tăng nhiệt độ trích ly làm cho chuyển động nhiệt tăng lên, tốc độ khếch tán các chất tan cũng như phlorotannin từ bên trong nguyên liệu ra ngoài môi trường trích ly sẽ tăng, làm tăng sự thẩm thấu giữa dung môi và tế bào nguyên liệu [4]. Vì vậy hàm lượng phlorotannin trong dịch tăng lên. Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn, vì nhiệt độ quá cao làm cho hiện tượng chuyển pha của dung môi diễn ra mãnh liệt, đồng thời quá trình oxy hóa phlorotannin tăng cao nên làm giảm hiệu quả trích ly. Ngoài ra, nhiệt độ có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một số thành phần chất tan cần thiết. Còn nếu nhiệt độ quá thấp thì lại kéo dài thời gian trích ly ảnh hưởng đến cả quá trình . Nhìn chung có thể nhìn thấy rõ yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất rõ đến quá trình trích ly. Vì vậy tôi chọn nhiệt độ 50 0C là nhiệt độ trích ly thích hợp cho quá trình trích ly và là thông số cố định cho các thí nghiệm tiếp theo . 4.5 . Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin Kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm, dung môi là nước cất, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu = 40/1, nhiệt độ trích ly là 50 0C, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly trong những điều kiện cố định này. Kết quả được thể hiện tại bảng 4.5 và hình 4.5.
45. 38 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin Hàm lượng phlorotannin Thời gian (giờ ) (mg/g c hất khô ) 1 7,613 d 2 10,868 c 3 10,928 b 4 11,074 a (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly phlorotannin Từ kết quả nghiên cứu , ta thấy được rằng khi thay đổi thời gian từ 1 giờ đến 4 giờ thì hàm lượng phlorotannin tăng dần; từ 1 giờ đến 2 giờ thì hàm lượng phlorotannin tăng nhanh từ 7,613mg/g lên đến 10,868 mg/g nguyên liệu, nhưng từ 2 giờ đến 3 giờ lại tăng chậm 10,928mg/g và 4 giờ là 11.074mg/g. Có thể giải thích điều này như sau : Khi thời gian kéo dài, giúp dung môi thẩm thấu vào trong từng tế bào nguyên liệu qua các mao quản, tạo điều kiện thuận lợi cho sự khuếch tán chất tan và phlorotannin ra khỏi nguyên liệu vào môi trường trích ly . Lúc đầu lượng chất tan và phlorotannin có trong nguyên liệu nhiều nên khả năng hòa tan của nó trong môi trường trích ly sẽ lớn. Nhưng lượng phlorotannin trong nguy ên liệu chỉ có ở mức độ giới hạn nhất định. Vì vậy hàm lượng phlorotannin chỉ tăng mạnh ở thời gian đầu, đến một thời điểm
46. 39 nào đó khi sự khếch tán các chất tan và phlorotannin xảy ra hạn chế thì hàm lượng phlorotannin sẽ giảm vì khả năng oxy hóa của phlorotannin . Ta thấy thời gian trích ly dài thì hàm lượng phlorotannin trong dịch tăng, nhưng việc kéo dài thời gian lại bất lợi về mặt năng lượng và ảnh hưởng đến thời gian thực hiện quy trìn h. Qua quá trình thực hiện nghiên cứu và kết quả thu được sau quá trình nghiên cứu nên tôi chọn thời gian trích ly là 2 giờ thích hợp nhất . 4.6. Kết quả xác định ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin Sau 3 lần trích ly thì hàm lượng phlorotannin trong nguyên liệu còn lại không đáng kể, kết quả được thể hiện ở bảng 4.6 và hình 4.6. Bảng 4.6. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin Số lần trích ly Hàm lượng phlorotannin (mg/g) 1 10,867 a 2 2,784 b 3 0,893 c (Ghi chú: Trên cùng m ột c ột các giá tr ị mang cùng ch ữ số mũ thì khác nhau không có ý ngh ĩa ở mức ý ngh ĩa α = 0,05 theo tiêu chu ẩn LSD) Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của số lần trích ly đến khả năng trích ly phlorotannin
47. 40 Qua kết quả hình 4.6 cho thấy khi trích ly lần 1 hàm lượng phlorotannin là cao nhất 10,867mg/g nguyên liệu. Trích ly lần thứ 2, thì hàm lượng phlorotannin giảm xuống đáng kể chỉ còn 2,784mg/g nguyên liệu. Tiếp tục trích ly đến lần thứ 3 thì hàm lượng phlorotannin thu được rất ít 0, 893mg/g nguyên liệu. Có thể giải thích như sau : Ban đầu nồng độ chất tan trong nguyên liệu lớn nên dịch trích ly thu được nhiều. Hàm lượng phlorotannin trong rong có mức giới hạn nhất định, nên đến một thời điểm nào đó thì sự khuếch tán sẽ cân bằng. Ở những lần trích ly sau, lượng phlorotannin trong rong rất ít. Khi đó sẽ không thu thêm được lượng phlorotannin được nữa, mà còn lẫn nhiều tạp chất khác . Như vậy lượng phlorotannin thu được qua 3 lần trích ly tăng lên không đáng kể so với trích ly 1 lần. Trong khi dung môi sử dụng nhiều, gây khó kh ăn cho quá trình cô đặc đồng thời gây lãng phí dung môi, nên không cần thiết trích ly nhiều lần. Vì vậy tôi lựa chọn trí ch ly 2 lần . 4.7. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình cô đặc Vì tôi chọ tỷ lệ dung môi /nguyên liệu là 40/1 nên thể tích dịch trích ly lớn và nồng độ chất trích ly nhỏ. Vì vậy cần thiết phải tăng nồng độ chất chiết bằng phương pháp khác nhau. Trong luận văn này, tôi chọn phương pháp cô đặc chân không với áp suất chân không. Đây là phương pháp sử dụng phổ biến với các chất có hoạt tính sinh học. Để xác định nhiệt độ cô đặc, mỗi một mẫu tôi lấy 500ml dịch trích ly đem cô tại các nhiệt độ 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C tại áp suất thường cho đến khi thể tích dung dịch còn 1/10 thể tích ban đầu (50ml) và đem các mẫu đi phân tích và đánh giá cảm quan. Kết quả thể hiện ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến hàm lượng phlorotannin Nhiệt độ Thời gian Hàm lượng STT Chất lượng cảm quan (0C) (ph út ) phlorotannin (mg/g) Màu nâu, dạng lỏng có 1 40 50 10,868 a cặn màu trắng Màu nâu, dạng lỏng có 2 50 40 10,868 a cặn màu trắng Màu nâu đen, dạng lỏng 3 60 30 10,321 b có cặn màu trắng Màu nâu đen, dạng lỏng 4 70 20 9,894 c có cặn màu vàng
48. 41 Số liệu bảng 4.7 cho thấy rằng, hàm lượng phorotannin ít thay đổi theo nhiệt độ cô đặc. Tuy nhiên các chỉ tiêu cảm quan thay đổi đổi rõ rệt từ màu nâu sang nâu đen khi nhiệt độ cô đặc từ 40 0C đến 70 0C. Nguyên nhân là do quá trình cô đặc là quá trình làm bay hơi chất lỏng khỏi dung dịch trích ly, nhờ sự chênh lệch nhiệt độ và áp suất. Tốc độ chuyển động nhiệt của các phân tử chất lỏng nằm gần mặt thoáng có một giới hạn nhất định, ở một thời điểm nào đó các phân tử sẽ thoát ra khỏi bề mặt trở thành trạng thái tự do (dạng hơi ). Không những phân tử ở trên bề mặt thoáng bay hơi mà chủ yếu là các bọt hơi tạo thành trong chất lỏng. Chúng là những tâm tạo thành hơi nhờ lực đẩy Acsimet được đẩy lên bề mặt thoáng và chúng chuyển động liên tục bên trong lớp chất lỏng lên bề mặt thoáng. Điều kiện tạo thành hơi là áp suất bọt bằng áp suất chất lỏng [4]. Khi đó dung môi sẽ bay hơi, làm giảm thể tích của dịch trích ly. Từ đó tăng nồng độ dung dịch và màu của dịch sau khi cô đặc sẽ làm đậm lại . Trong quá trình cô đặc, nhiệt độ sôi của dịch phụ thuộc vào áp suất hơi ở trên bề mặt, nồng độ chất khô và tính chất vật lý, hóa học của hỗn hợp. Khi áp suất hơi trên bề mặt của sản phẩm càng thấp thì nhiệt độ sôi sẽ giảm. Hay nói cách khác chúng ta điều chỉnh nhiệt độ sôi bằng cách thay đổi độ chân không [1]. Đồng thời, khi nhiệt độ sôi thấp tính chất của sản phẩm ít bị biến đổi và màu sắc cũng ít biến đổi. Nhiệt độ sôi thấp còn là giảm tốc độ ăn mòn của vật liệu lên thiết bị, kéo dài thời gian bền của thiết bị [1]. Khi nhiệt độ tăng lên từ 40 0C đến 50 0C hàm lượng phlorotannin và màu sắc của dịch trích ly ít bị thay đổi nhưng khi nâng nhiệt độ đế n 60 0C thì hàm lượng phlorotannin bắt đầu giảm dần và màu sắc cũng chuyển dần sang màu nâu đen, có thể giải thích như sau : Nhiệt độ cao có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một số thành phần chất tan cần thiết. Vì vậy hàm lượng phlorotanin cũng sẽ biến tính và mất dần khi nhiệt độ tăng cao. Do vậy tôi lựa chọn phương pháp cô chân không để dễ điều chỉnh được nhiệt độ sôi bằng cách giảm áp suất mà không cần tăng nhiệt độ, hạn chế được
49. 42 quá trình oxy hóa chất tan cũng như ảnh hưởng xấu của nhiệt độ cao đến cô dịch. Bên cạnh đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí năng lượng cho quá trình thực hiện, tôi tiến hành cô dịch trích ly ở nhiệt độ 50 0C trong khoảng 40 phút . 4.8. Kết quả xác định thông số thích hợp của quá trình ly tâm Dung dich sau khi cô đặc ch ứa các mu ối khoáng và m ột s ố tạp ch ất khác ít tan trong n ước t ạo d ạng c ặn màu tr ắng đục. Vì v ậy, tôi ti ến hành lo ại bỏ cặn b ằng ph ươ ng pháp ly tâm. Để xác định th ời gian ly tâm thích h ợp, tôi ti ến hành thí nghi ệm nh ư sau: Mỗi m ột thí nghi ệm l ấy 300ml đem ly tâm t ại các th ời gian khác nhau là 5 phút; 10 phút; 15 phút; 20 phút và 25 phút v ới tốc độ 5000 vòng/phút. Các m ẫu đem đi đánh giá c ảm quan và k ết qu ả thu được th ể hi ện ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả đánh giá cảm quan dịch trích ly Mẫu 1 2 3 4 5 Thời gian 5 10 15 20 25 (phút ) Màu vàng Màu vàng Màu vàng Màu sắc Màu vàng nâu Màu vàng nâu nâu nâu nâu Còn cặn lơ Dịch trong Còn cặn Dịch Dich lửng trong dịch không còn Độ lơ lửng trong, trong, trích ly nhưng cặn lơ lửng trong trong dịch lượng cặn lượng căn đã giảm đáng trong dịch trích ly không đổi không đổi kể trích ly Từ kết quả nghiên cứu ta thấy trong quá trình ly tâm , l ượng t ạp ch ất trong d ịch trích ly ph ụ thu ộc vào th ời gian ly tâm. Th ời gian càng dài, l ực ly tâm càng có điều ki ện tác động lên toàn b ộ các ph ần t ử trong d ịch rong, kh ả năng phân tách các t ạp ch ất cao nên l ượng t ạp ch ất tách ra càng nhi ều, d ịch càng trong và sáng h ơn. Nh ưng n ếu càng kéo dài th ời gian ly tâm, s ự tác động của l ực ly tâm đến các thành ph ần trong d ịch đã đạt đến tr ạng thái ổn định và lượng t ạp ch ất trong d ịch rong lúc này không còn nhi ều nh ư lúc đầu nên chúng s ẽ thay đổi ít ho ặc không thay đổi. C ụ th ể nh ư sau:
50. 43 Dịch chi ết sau khi ly tâm trong 5 phút v ẫn còn nhi ều c ặn l ơ l ửng, l ượng tạp ch ất tách ra ít và màu v ẫn kém sáng. Khi ly tâm trong 10 phút, d ịch chi ết trong h ơn, l ượng t ạp ch ất tách ra nhi ều h ơn nh ưng v ẫn còn m ột l ượng c ặn nh ất định l ơ l ửng trong d ịch trích ly . Khi ti ến hành ly tâm trong thời gian 15 phút ta th ấy d ịch trích ly trong, l ượng tạp ch ất đã l ắng h ết, màu d ịch sáng rõ r ệt. Tuy nhiên khi kéo dài th ời gian ly tâm trong kho ảng 20 − 25 phút quan sát k ĩ ta th ấy d ịch trong và sáng nh ưng l ượng t ạp ch ất t ồn t ại trong d ịch v ẫn không thay đổi. Do v ậy, để dịch trích ly thu được trong h ơn và sáng màu h ơn, đồng th ời tránh lãng phí th ời gian và n ăng l ượng ta ch ọn th ời gian thích h ợp nh ất là 15 phút với tốc độ ly tâm là 5000 vòng/phút để làm thông s ố cố định cho quá trình ly tâm.
51. 44 4.9. Đề xuất quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum Polycystum. *Sơ đồ quy trình : Rong m ơ ( 1,6 – 1,8%) Xử lý nguyên liệu (sấy đến độ ẩm 16%, kích thước d ≤ 0,5mm) Trích ly (tỷ lệ dung môi 40/1, nhiệt độ 50 0C, thời gian 2 giờ, dung môi nước cất ) Lọc Cô đặc chân không Bã (50 0C, 40 phút ) Ly tâm (15 phút ) Chế phẩm phlorotannin Hình 4.7 . Sơ đồ quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum polycystum
52. 45 * Thuyết minh quy trình : Nguyên liệu : Lựa chọn rong mơ ít tạp chất, có nguồn gốc và được thu mua đúng cách . Rong khô cần được bảo quản trong điều kiện thích hợp, tránh hút ẩm, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời. Vì khi đó một số thành phần nhạy cảm của rong với m ôi trường sẽ bị phân hủy gây hao hụt hoặc làm biến tính giá trị của chúng. Do đó rong được bảo quản trong bao bì nilon và để trong bóng tối . Xử lý nguyên liệu : Mục đích : Loại bỏ tạp chất dính trên rong mơ. Tiến hành cắt nhỏ nguy ên liệu d ≤ 0,5mm Trích ly : Rong đã được cắt nhỏ cho vào các lọ thủy tinh có nắp đậy kín, tránh hiện tượng dung môi bay hơi trong quá trình ngâm rong. Ta tiến hành trích ly trong các điều kiện : Dung môi là nước cất; tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 40/1; kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm; nhiệt độ trích ly là 50 0C; thời gian trích ly là 2 giờ . Thực hiện công đoạn trích ly theo ph ươ ng pháp ngâm. Khi gia nhiệt cho quá trình trích ly, sử dụng tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ, đồng thời phải thường xuyên lắc mẫu trong suốt thời gian trích ly . Lọc : Lọc nhằm mục đích loại bỏ các chất không tan, bã ra khỏi hỗn hợp trích ly và thu hồi dịch trích ly. Tiến hành lọc ở điều kiện phòng và sử dụng giấy lọc Whatman 01. Cô đặc : Tiến hành cô đặc ở nhiệt độ 50 0C trong khoảng thời gian 40 phút thì đạt được nồng độ chất khô hoặc thể tích dịch trích ly như mong muốn. Sau khi cô đặc hầu như dung môi nước bay hơi hết . Sử dụng thiết bị cô quay điều chỉnh được nhiệt độ và áp suất một cách dễ dàng, tạo môi trường chân không và khấy đảo cho quá trình cô đặc. Từ đó
53. 46 hạn chế được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, nhiệt độ cao đến hàm lượng và hoạt tính chất ta cần thiết . Ly tâm: Một lượng tạp chất còn lại sau quá trình lọc và cô đặc sẽ được tách hết ra kh ỏi dịch trích ly như vào lực ly tâm của quá trình ly tâm. Vì thế sau khi ly tâm, dịch lọc trong hơn và sáng màu hơn .
54. 47 PH ẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5. 1. Kết luận Qua th ời gian th ực hi ện đề tài, tôi rút ra m ột s ố kết lu ận nh ư sau: Đã xây dựng được quy trình trích ly phlorotannin từ rong Sargassum Polycystom của bờ biển Nha Trang – Khánh Hòa . Phlorotannin tồn tại chủ yếu trong tế bào của cây rong và là thành phần có nhiều giá trị trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm, Nếu quá trình thu hái, bảo quản làm cây rong bị dập nát sẽ rất dễ gây tổn thất một lượng phlorotannin nhất định. Do đó, tôi lựa chọn nguyên liệu có nguồn gốc khô và đươc bảo quản trong túi nilon và để trong bống tối . Xác định được các thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly, đó là : Dung mô i nước cất; tỷ lệ dung môi /nguyên liệu là 40/1; kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5mm; nhiệt độ trích ly là 50 0C; thời gian trích ly là 2 giờ . Xác định được chế độ cô đặc phù hợp, cô đặc trong điều kiện chân không với nhiệt độ cô 50 0C trong khoảng 40 phút . Xác định được thời gian ly tâm là 15 phút với tốc độ ly tâm là 5000 vòng/phút . 5.2. Kiến nghị Mặc dù đã cố gắng trong quá trình làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài vẫn có giới hạn nên đề tài vẫn còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Vì vậy tôi xin đề xuất một số kiến nghị sau : Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu hái và bảo quản rong từ lúc còn tươi để hạn chế tổn thất các thành phần quý t rong rong. Áp dụng phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài đối với những loại rong có điều kiện sống khác nhau. Tìm hiểu những yếu tố ban đầu ảnh hưởng đến hàm lượn g phlorotannin trong rong nh ư: Tính chất thủy hóa, thòi gian thu hái, độ tuổi của rong, môi trường sinh sống Sử dụng những phương pháp trích ly phlorotannin khác . Nghiên cứu khả năng ứng dụng của hợp chất phlorotannin vào trong các lĩnh vực : Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm ,
55. 48 TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Tài li ệu trong n ước 1. Đặng Xuân C ường (2009), Nghiên c ứu thu nh ận d ịch chi ết có ho ạt tính kháng khu ẩn t ừ rong Nâu Dictyota Dichotoma Vi ệt Nam , Lu ận v ăn Th ạc sỹ, Đại h ọc Nha Trang. 2. Đặng Xuân C ường, Tr ần Th ị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, V ũ Ng ọc Bội(2011), Sự tích l ũy và phân b ố phlorotannin ch ống oxy hóa trong m ột s ố loài rong Sargassum Khánh Hòa theo th ời gian sinh tr ưởng . Quy ển 4 – sinh học và ngu ồn l ợi, H ội ngh ị Khoa h ọc và công ngh ệ bi ển t oàn qu ốc l ần th ứ V, Tuy ển t ập báo cáo, nxb. Khoa h ọc t ự nhiên và công ngh ệ. 3. Đặng Xuân C ường, Tr ần Th ị Thanh Vân, V ũ Ng ọc Bội (2011), Ứng dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box – Behnken trong t ối ưu hóa công đoạn chi ết Phlorotannin t ừ rong nâu (Sargassum aemulum Sonder ) Khánh Hòa, K ỷ yếu H ội ngh ị Công ngh ệ Sinh h ọc toàn qu ốc – Khu v ực phía Nam l ần th ứ II – năm 2011, TP. HCM. 4. Khoa hóa th ực ph ẩm và công ngh ệ sinh h ọc, Các quá trình công ngh ệ cơ bản trong sản xu ất th ực ph ẩm, Tr ường Đại h ọc Bách Khoa Hà N ội. 5. Ngô Đă ng Ngh ĩa, Lu ận án ti ến s ỹ (1999) , Tối ưu hóa quy trình công ngh ệ sản xu ất alginate natri t ừ rong m ơ Vi ệt Nam và ứng d ụng c ủa nó trong m ột s ố lĩnh v ực s ản xu ất. 6. Nguy ễn H ải Hà (2004), Nghiên c ứu trích ly polyphenol t ừ trà Camellia sinensis (L), Lu ận v ăn Th ạc s ĩ, Đại h ọc Bách Khoa TP H ồ Chí Minh. 7. Ph ạm Đức Th ịnh (2007), Tách chi ết và phân tích thành ph ần các polysacchrid tan trong n ước t ừ một s ố loài rong nâu Vi ệt Nam , lu ận v ăn th ạc sĩ, Vi ện Nghiên C ứu và Ứng D ụng Công Ngh ệ Nha Trang, Khánh Hòa. 8. Tr ần Th ị Luy ến, Đỗ Minh Ph ụng, Nguy ễn Anh Tu ấn, Ngô Đă ng Ngh ĩa (2004 ), Ch ế bi ến rong bi ển, NXB Nông Nghi ệp TP H ồ Chí Minh.
56. 49 Tài li ệu n ước ngoài 9. Airanthi, Hosokawa, M., & Miyashita, K. (2011). Comparative Antioxidant Activity of Edible Japanese Brown Seaweeds . Journal of Food Science, 76(1), C104 – C111. 10. B. Tangorone, J.C.Royer, J.P. Nakas (1989), Purification and characterization of an endo – (1,3) – β – D – glucanase from Trichoderma longibrachiatum , Applied and environmental. Microbiology, Vol 55, No 1, pp 177 – 184). 11. Burtin, P. (2003). Nutritonal value of seaweeds . Electronic Journal Of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 24, 498 – 503. 12. Ioana Ignat, Irina Volf, Valentin I. Popa (2011), A critical review of methods for characterisation of polyphenolic compounds in fruit and vegetables , Food Chemistry, 126, 1821–1835. 13. Franciska S, Steinhoff, Martin Graeve, Krzysztof Bartoszek, KaiBischof,Christian Wiencke (2012), Phlorotannin Production and Lipid Oxidation as a Potential Protective Function Against High Photosynthetically Active and UV Radiation in Gametophytes of Alaria esculenta (Alariales, Phaeophyceae) Photochemistry and Photobiology, 88, 1, 46–57. 14. Koki Nagayama, Yoshitoshi Iwamura, Toshiyuki Shibata, Izumi Hirayamal and Takashi Nakamura (2002) , Bactericidal activity of phlorotannins from the brown algal, Ecklonia kurome, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 50, 889 – 893. 15. Kotake – Nara E, Asai A, Nagao A (2005), Neoxanthin and fucoxanthin Induceapoptosis in PC-3 human prostate cancer cells . Cancer Lett. 2005;220:75 – 84. 16. MariaE. R. Duarte, aMarcA. Cardoso, aMiguelD. Noseda, a, lAlberto S. Cerezo(2001), Structural studieson fucoidans from the brown seaweed Sargassum Stenophyllum , Carbohydrate Research 333, pp 281 – 293. 17. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E, Nifantiev and Anatolii I. Usov (2006), Structure of a Fucoidan
57. 50 from the brown seaweed Fucus serratus L , Carbohydrate Research 341, pp 238 – 245. 18. Mayalen Zubia, Daniel Robledo, Yolanda Freile – Pelegrin (2007), Antioxidant activities in tropical marine macrroalgae from the Yucatan Peninsula , Mexico, J Appl PHYCOL 19:449 – 458. 19. Moon Moo Kim, Quang Van Ta, Eresha Mendis, Niranjan Rajapakse, Won Kyo Jung, Hee Guk Byun, You Jin Jeon, Se Kwon Kim (2006), Phlorotannins in Ecklonia cava extract inhibit matrix metalloproteinase activity , LifeSciences79 1436 – 1443. 20. Mülheim an der Ruhr (2009), Isolation, Characterisation, Modification an Application of Fucoidan from Fucus vesiculosu. 21. Murat Artan, Yong Li, Fatih Karadeniz, Sang Hoo Lee, Moon Moo Kim, Se Kwon Kim (2008), Anti – HIV – 1 activity of phloroglucinol derivative ; 6,6’ – bieckol, from Echlonia cava, Bioorganic & Medicinal Chemistry 167921 – 7926. 22. Nelson T.E., Lewis B. A (1974), Separation and characterization of thesoluble and insoluble components of insoluble laminaran // Carbohydr. Res. Vol.33. P. 63 – 74. 23. Rangan M. A. and Glombitza K. W. 1986, Phlorotannin, Brown Algal polyphenols , Prog. Phycol. Res, 4, 1290241. 24. Shibata T, Ishimaru K, Kawaguchi S, Yoshikawa H, & HamaY (2008), Antioxidant activities of phlorotannins isolated from Japanese Laminariaceae . Journal of Applied Phycology, 20 (5), 705 – 711. 25. Tierney, M. S., Croft, A. K., & Hayes, M. (2010 ). A review of antihypertensive and antioxidant activities in macroalgae . Botanica Marina, 53(5), 387 – 408. 26. Sang Hoon Lee, Li Yong , Fatih Karadeniz, Moon Moo Kim, Se Kwon Kim (2008), α – glucosidaseand α – amylase inhibitory activities of phlorotannin derivatives from Ecklonia cava , Journal of Biotechnology 136S S577 – S588.
58. 51 27. Yuan. (2007). Antioxidants from Edible Seaweeds . In F. Shahidi & C. T.Ho (Eds.), Antioxidant Measurement and Applications (Vol. 956, pp. 268 – 301): American Chemical Society. 28. Yvonne, Y. (2007). Marine Algal Constituents Marine Nutraceuticals and Functional Foods (pp. 259 – 296): CRC Press. 29. Riitta Koivikko (2008), Brown algal phlorotannins improving and Applying chemical methods , Ph. D. Thesis, University of Turku, Turku, Finland. 30. Masaaki Nakai, Norihiko Kageyama, Koichi Nakahara and WataruMiki (2006), Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of Sargassum ringgoldianum , Marine biotechnology, 409 – 414. 31. Jay Robert Rowen (2008), Super Antioxidant from the Sea , From the Townsend Letter. Tài liệu internet 32. – Các – ph ươ ng – pháp – chi ết – su ất – và tổng – hợp – flavonoid#ixzz1vA2z0xeZ.
59. 52 PHỤ LỤC Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ phlorotannin để xác định hàm lượng phlorotannin . Đồ thị đường chuẩ n phlorotannin
60. 53 Một số hình ảnh trong đề tài Nguyên liệu rau mơ Kích thước nguyên liệu d ≤ 0,5 mm Dịch trích ly 60 0C Dịch trích ly tỷ lệ 35/1
61. 54 Xử lý Irristat Kích thước nguyên liệu trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQFILE SL1 1/ 6/14 15: 3 :PAGE 1 anh huong cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === === 1 KT$ 2 7.91164 3.95582 0.000 2 * RESIDUAL 6 .474180E-02 .790299E-03 * TOTAL (CORRECTED) 8 7.91638 .989547 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL1 1/ 6/14 15: 3 :PAGE 2 anh huong cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT KT$ KT$ NOS KQ 0.5 3 9.37200 1 3 8.15000 1.5 3 7.07700 SE(N= 3) 0.162306E-01 5%LSD 6DF 0.561443E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL1 1/ 6/14 15: 3 :PAGE 3 anh huon g cua kich thuoc den kha nang trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |KT$ | (N= 9) SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 9 8.1997 0.99476 0.28112E-01 0.3 0.0000
62. 55 Dung môi trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL2 1/ 6/14 15:41 :PAGE 1 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === === 1 DM$ 2 5.04956 2.52478 0.000 2 * RESIDUAL 6 .185966E-03 .309943E-04 * TOTAL (CORRECTED) 8 5.04975 .631218 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL2 1/ 6/14 15:41 :PAGE 2 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT DM$ DM$ NOS KQ NUOC 3 9.37667 ETHANOL 3 8.97033 ACETON 3 7.62400 SE(N= 3) 0.321425E-02 5%LSD 6DF 0.111186E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL2 1/ 6/14 15:41 :PAGE 3 anh huong cua dung moi den kha nang trich ly phlo rotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |DM$ | (N= 9) SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 9 8.6570 0.79449 0.55672E-02 0.1 0.0000
63. 56 Tỷ lệ dung môi trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL1 4/ 6/14 1:46 :PAGE 1 anh huong cua ty le dung moi den kha nang trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === === 1 TLDM$ 3 6.18348 2.06116 0.000 2 * RESIDUAL 8 .200025E-02 .250031E-03 * TOTAL (CORRECTED) 11 6.18548 .562317 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL1 4/ 6/14 1:46 :PAGE 2 anh huong cua ty le dung moi den kha nang trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT TLDM$ TLDM$ NOS KQ 30/1 3 8.55467 35/1 3 9.37533 40/1 3 10.2800 45/1 3 10.2763 SE(N= 3) 0.912927E-02 5%LSD 8DF 0.297696E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL1 4/ 6/14 1:46 :PAGE 3 anh huong cua ty le dung moi den kha nang tri ch ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |TLDM$ | (N= 12) SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 9.6216 0.74988 0.15812E-01 0.2 0.0000
64. 57 Nhiệt độ trích ly BALANCED ANOVA FOR VARIATE KQ FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 :PAGE 1 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin VARIATE V002 KQ LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN === === 1 ND$ 3 11.6285 3.87615 0.000 2 * RESIDUAL 8 .150546E-04 .188182E-05 * TOTAL (CORRECTED) 11 11.6285 1.05713 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 :PAGE 2 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin MEANS FOR EFFECT ND$ ND$ NOS KQ 40 3 10.2683 50 3 10.8677 60 3 9.85067 70 3 8.21433 SE(N= 3) 0.792007E-03 5%LSD 8DF 0.258265E-02 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SL5 20/ 5/14 23: 6 :PAGE 3 anh huong cua nhiet do den hieu suat trich ly phlorotannin F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |ND$ | (N= 12) SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | KQ 12 9.8003 1.0282 0.13718E-02 0.0 0.0000