Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus Plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt

Nội dung text: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus Plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỊT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Phạm Khánh Hưng MSSV: 105111082 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
2. LỜI CẢM ƠN Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việc làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cách làm việc một mình cũng như trong tập thể. Tuy có những thành công và cũng không tránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths. Phạm Minh Nhựt. Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đã giúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học. Những lời khuyên, kinh nghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống. Em cảm ơn thầy! Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang. Chính lòng nhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của một người làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đồ án. Em cảm ơn chị rất nhiều! Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths. Huỳnh Văn Thành đã tạo điều kiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thí nghiệm. Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thời gian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn. Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quá trình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua. Xin gửi lời cảm ơn đến hai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viên trong suốt quá trình làm đồ án. Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánh bên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian qua. Con xin chân thành cảm ơn mọi người!
3. Tp, Hồ Chí Minh, ngày , tháng , năm 2014 Sinh viên Phạm Khánh Hưng
4. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Tp, Hồ Chí Minh, ngày , tháng , năm 2014 Sinh viên, Phạm Khánh Hưng
5. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhu cầu ăn uống của con người cũng được nâng cao. Cũng từ đó, công tác bảo quản thực phẩm luôn là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâm nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người. Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học trong đó, việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, do sự thiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng các hóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định. Trong khi đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu, đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian. Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằng phương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môi trường. Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảo quản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thì hướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thực phẩm ngày được quan tâm phát triển. Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm. Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng không xa lạ với chúng ta, đó là vi khuẩn lactic, những vi khuẩn này được con người chúng ta sử 1
6. Đồ án tốt nghiệp dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay. Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Ngoài bacteriocin, các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môi trường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, acid propionic, ethanol, CO2, H2O2 Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thực phẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừng khẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao. Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống. Kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định được thành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01. Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L. plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao. Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa được xác định. Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể làm tiền đề cho các ứng dụng sau này. Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt”. Nghiên cứu này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực 2
7. Đồ án tốt nghiệp phẩm. Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. 3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. - Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01. 4. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của L. plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang (2013). - Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 đối với thịt heo. 3
8. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 1.1.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thích được quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic. Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên tách được acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng của quá trình lên men. Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu. Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn. Do đó, các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao. Trong đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus. Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat. Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm. Đặc biệt, trong sản các sản phẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua có rất nhiều vi 4
9. Đồ án tốt nghiệp khuẩn lactic. Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998). Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau: - Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L. bulgarius, L. helviticus, L. casei, L. ferment, L. brevis. Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose. - Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau quả, trái cây: L. plantarum, L. delnikii, L. ferment, L. brevis. - Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L. acidophilus, S. faecalis, S. bovis, S. salivanius, S. pyogenes. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra hình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi. - Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài. Hình 1.1. Tế bào Streptococcus - Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu khuẩn. 5
10. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Tế bào Pediococcus - Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình que, có lúc lại có hình ovan. Hình 1.3. Tế bào Bifidobacterium - Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 – 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung. Hình 1.4. Tế bào Leuconostoc 6
11. Đồ án tốt nghiệp - Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm). Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Hình 1.5. Tế bào Lactobacillus 1.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thống nhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau: Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae. Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử. Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose và một số khác không lên men được maltose. Một số vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột). Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase. Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thành phần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP. Các LAB chỉ có thể tạo ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn 7
12. Đồ án tốt nghiệp cacbon. Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí. Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là con đường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate. Con đường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó con đường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol, acetate (Khalid, 2011). 1.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển được + trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4 . Vi khuẩn lactic cần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển. Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn (glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau. Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic (Tortora và Funke, 1992). Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợp được các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp. Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ. Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm (Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994): - Nhóm cần phức hợp các acid amin. - Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon. - Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy nhất. 8
13. Đồ án tốt nghiệp Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton, peptit, cazein Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng. Các vi khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin. Vitamin thường được bổ sung vào môi trường bằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin Các acid nicotinic và acid pantotenic đặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998). Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ, độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy. Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng có ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩn này. Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng: - Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin - Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin - Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic. Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic. Chúng vừa có vai trò cung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các acid amin tự do. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người ta thường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vai trò là chất đệm. Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạt tính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch. Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt là magiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic. Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom. Mangan và magiê còn là 9
14. Đồ án tốt nghiệp yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme. Magiê còn có tác dụng làm tăng khả năng hấp thu đường của vi khuẩn lactic. Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụng làm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần Thanh Thủy, 2003). 1.1.3. Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic. Tùy theo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lên men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình. Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men lactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phương thức trên. 1.1.3.1. Lên men lactic đồng hình Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acid lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB (Embden – Meyerhof – Parnas). Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớn trong công nghiệp thực phẩm. Phương trình tóm tắt: Vi khu ẩn lactic C H O + 2ADP + 2P 2CH -CHOH-COOH + 2ATP 6 6 6 v Lên men đồng hình 3 10
15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L. acidophilus, L. plantarum, L. bulgaricus, L .casei, Streptococus, S. cremoris, S. thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002). 1.1.3.2. Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid lactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid xucxinic, CO2 Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành các sản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997). Phương trình tóm tắt: 2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + Q Trong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol 20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%. Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat). Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và trizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo con đường PP. Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra tương tự như lên men đồng hình. Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999). 11
16. Đồ án tốt nghiệp Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides, L. oenos, L. cremoris, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Bifidobacterium bifidum. Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2 như sự lên men lactic dị hình thông thường. Hình 1.7. Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình 1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 1.2.1. Phân loại Theo Orla – Jensen (1919) và Bergey (1923) vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Chi: Lactobacillus Loài: Lactobacillus plantarum 12
17. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum L. plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 – 1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm. Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic và đã được giải mã hoàn toàn. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 %. Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng lên men. - Nhóm I chỉ lên men hexose duy nhất thành axid lactic và không thể lên men gluconate hay pentoses. - Nhóm II vừa có thể lên men hexose thành axid lactic, vừa có thể lên men gluconate hay pentose. - Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2. Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa của con người. L. plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải L. plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến. L. plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid. Chúng không có khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine. Có đến 6 con đường khác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E. coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011). L. plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy. Khi có oxy, L. plantarum có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide. Khi không có oxy, L. plantarum sẽ lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình). L. plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng. Mangan giúp cho L. plantarum chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2. H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganese cofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983). 13
18. Đồ án tốt nghiệp L. plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non. Kí sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng tích cực đến tế bào vật chủ. L. plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn (Molin, 2010). 1.2.3. Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum Cũng như các chủng LAB khác, L. plantarum đều trải qua quá trình lên men lactic. Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo ra chiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic, ethanol, CO2 Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic, acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm. Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí và diacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate. Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L. plantarum, plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh tổng hợp protein nhờ ribosome. Trong tế bào L. plantarum có mang các gene mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins. Qua quá trình phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo ra plantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn. 1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L. plantarum sản sinh ra 1.3.1. Plantaricin Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L. plantarum sản xuất ra ít nhất 6 bacteriocins khác biệt. Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền chất có chứa glycine. L. plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen PlnE và PlnF. Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và 14
19. Đồ án tốt nghiệp PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt (PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai vùng điều hòa PlnC và PlnD. Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L. plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với L. plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và Propionobacteria. Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau. Chúng gồm 30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau. Các bacteriocins hoạt động với tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ. Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻ hoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả. Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide phân lập từ L. plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh. Các gen cấu trúc chỉ ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motif đôi. Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino. Plantaricin S được coi là kiểm soát quá trình lên men và bảo quản ô liu. Một bacteriocin gồm hai peptide khác là plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Các thành phần lantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự (Zacharof và Lovitt, 2012). 1.3.2. Các hợp chất kháng khuẩn khác Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L. plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E. coli, Salmonella, S. aureus Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm. Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho vi khuẩn bị mất năng lượng. Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đường phân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt. Ngoài ra, các 15
20. Đồ án tốt nghiệp anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ức chế sinh trưởng hoặc có thể chết. Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ con đường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí của L. plantarum. Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát triển. Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị tiêu diệt. 1.4. Bacteriocin và quá trình thu nhận, tách chiết, tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic 1.4.1. Hợp chất bacteriocin Bacteriocin được Gratia tìm thấy đầu tiên vào năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả của công trình này đã thúc đẩy sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin vì nó có khả năng tiêu diệt vi khuẩn E. coli. Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ở riboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương. Bacteriocin có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật. Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp. Đặc tính diệt khuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ. Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷ phân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính. Do có bản chất protein nên 16
21. Đồ án tốt nghiệp bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể người và các vấn đề sức khoẻ khác. Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên, việc phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và trì nh tự chuỗi amino acid. Bacteriocin được chia thà nh 3 lớp: - Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (< 5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào. Lantibiotic bacteriocin lớp I được chia thành 2 lớp phụ: + Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất. Nisin thuộc nhóm này. + Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện. Đại điện: Meracidin. Hình 1.8. Bacteriocin lớp I - Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên, ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường. Nhóm này được chia thà nh 3 lớ p nhỏ: 17
22. Đồ án tốt nghiệp + Lớ p IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P. Các bacteriocin nhóm này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. + Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, những peptid này ít hoặc không hoạt động. Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là: Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK. + Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin không đồng nhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau. Đại diện: Divergicin A và Acidocin B. - Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, không bền nhiệt. Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khả năng bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Đại diện gồm có Acidofilicin A và Lactacins A, B. - Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và cacbohydrate. Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch. 1.4.2. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus, Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium. Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram âm kém vì màng ngoài của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin. Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàm lượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm. Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng. Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn: - Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngoài tế bào. Không gây nguy hiểm sinh lý tế bào. - Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn. 18
23. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của Bacteriocin Trong đó: - Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotic gồm những phân tử lưỡng tính dài có thể tiêu diệt các tế bào bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất. - Lớp II (Sakasin): mang điện dương trong môi trường trung tính và chứa một vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực. Dẫn đến làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. - Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào. 1.4.3. Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm. Đặc biệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiện sản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp. Lợi thế của việc sản xuất invitro là do không có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế, bất hoạt bởi protease. Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm soát các quy trình lên men thì sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến 19
24. Đồ án tốt nghiệp các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon và Phumkhachorn, 2010). Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tử bacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học. Ngoài ra, nhiệt độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làm giảm khả năng sản xuất. Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đến sản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối. Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và quá trình chuyển hóa của LAB. Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thể được phân biệt: - Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammonium sulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao áp. - Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủa ammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược pha lỏng cao áp. - Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cô lập thông qua một quy trình duy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độ hấp thụ bacteriocin có sẵn thông qua điều chỉnh pH của môi trường lên men thô. Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phương pháp đầu tiên. Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007). 20
25. Đồ án tốt nghiệp 1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn a. pH Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0. Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin vẫn hoạt động trong môi trường có tính acid hoặc trung tính. Sự ổn định của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thực phẩm. Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốt trong pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong môi trường có pH 8,0 - 12,0. b. Nhiệt độ Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phòng, hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ được hoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạt động yếu ở nhiệt độ thấp. c. Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin. Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin và trypsin không gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ các chủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001). d. Các chất hoạt động bề mặt Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khả năng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau. Đối với hợp chất kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS, Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5 mM vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv, 2011). Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lại làm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013). 21
26. Đồ án tốt nghiệp 1.5. Một số phƣơng pháp bảo quản thực phẩm và tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật 1.5.1. Một số phương pháp bảo quản thực phẩm Thực phẩm không được bảo quản thường bị biến đổi dẫn đến mất giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan. Những biến đổi đó do những nguyên nhân sau: - Do vi sinh vật: vi sinh vật có sẵn trong thực phẩm hoặc nhiễm từ bên ngoài vào. - Do enzyme: enzyme có sẵn trong tế bào vi khuẩn có trong nguyên liệu thực phẩm. - Do phản ứng giữa các chất bên trong thực phẩm với nhau và chất bên trong thực phẩm với bao bì. - Do độc tố: độc tố vi khuẩn có sẵn trong thực phẩm. - Do kí sinh trùng và côn trùng. Có nhiều phương pháp để bảo quản thực phẩm gồm: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. 1.5.1.1. Phương pháp vật lý a. Phương pháp làm khô Phương pháp sấy tự nhiên (phơi nắng) - Là phương pháp sử dụng nhiệt của ánh sáng mặt trời để làm khô sản phẩm - Thích hợp cho các loại hạt ngũ cốc, các loại thủy sản ướp muối (cá, tôm, mực ) - Hong khô rau quả mà không cần nắng. Phương pháp sấy nhân tạo - Sấy khô: dùng lò sấy than, củi để làm bay hơi nước trong thực phẩm. Chất lượng sản phẩm không cao (chất dinh dưỡng, vitamin bị ảnh hưởng). - Sấy phun: đặc thù của phương pháp này là cô đặc sản phẩm bằng cách dùng vòi phun cao áp dạng sương mù trong buồng sấy có nhiệt 950C để diệt các vi sinh vật đồng thời tạo ra sản phẩm khô. 22
27. Đồ án tốt nghiệp - Sấy thăng hoa: nước trong thực phẩm (thể lỏng) chuyển sang dạng hơi nước và tạo thành thể rắn. - Sấy bằng bức xạ: làm sản phẩm nóng bằng cách dùng các đèn hồng ngoại có công suất 250-500W, chiếu tia hồng ngoại (0,75 - 4µm) vào sản phẩm. - Sấy bằng điện cao tần: là phương pháp đặt sản phẩm sấy vào điện trường xoay chiều có tần số dao động cao (500kHz) giúp cho sản phẩm khô đều và nhanh. Để giữ sản phẩm được trong thời gian dài thì các sản phẩm sau khi làm khô phải được làm nguội ngay, bao gói tốt, tránh hút ẩm trở lại, giữ nơi khô mát. b. Phương pháp sử dụng nhiệt Phương pháp nhiệt độ thấp - Làm lạnh: chủ yếu được áp dụng để bảo quản rau quả tươi. Nhiệt độ hạ xuống gần 00C, tinh thể nước đá chưa xuất hiện, hệ thống men (trong nguyên liệu và trong VSV) hoạt động yếu đi dẫn đến kìm hãm những biến đổi về lý, hóa, sinh; hoạt động vi sinh vật. - Làm lạnh đông (đông lạnh): là phương pháp giúp giữ thực phẩm vài tháng đến vài năm. Nhiệt độ của thực phẩm được hạ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của các dung dịch nước trong thực phẩm giúp phần lớn nước trong thực phẩm bị đóng băng, màng tế bào của vi sinh vật bị nén mạnh. Các quá trình sống của vi sinh vật và hoạt động của các hệ thống men bị kiềm chế. Phương pháp nhiệt độ cao: là phương pháp diệt vi sinh vật và cả bào tử của chúng - Thanh trùng Pasteur (gián đoạn và liên tục) Thanh trùng gián đoạn: phương pháp này dùng một lò hấp Pasteur, bên trong có một thùng chứa được bao quanh bởi hơi nước lưu thông. Trong thùng chứa này, sữa được làm nóng và được khuấy đều trong suốt thời gian khử trùng. Sau đó sữa có thể được làm nguội trong thùng chứa. Ngoài ra, người ta có thể làm nóng sữa một phần trong một lò hình ống trước khi đưa vào thùng chứa. Phương pháp này ít dùng để thanh trùng sữa, thường dùng để thanh trùng những sản phẩm từ sữa hơn. 23
28. Đồ án tốt nghiệp Thanh trùng liên tục: trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp Pasteur tiệt khuẩn nhanh ở nhiệt độ cao. Môi trường làm nóng sản phẩm có thể chứa hơi nước hoặc nước nóng ở chân không. Sữa thô ở 40C được cho chảy qua các thíết bị của lò hấp Pasteur này, nó dược làm nóng đến nhiệt độ khử trùng khoảng 720C/16 giây. Sau khi khử trùng, sữa được chảy vào một thiết bị làm nguội đến 40C hoặc thấp hơn. Sau cùng, sữa được chuyển vào một hệ thống đóng gói sản phẩm. - Phương pháp UHT (Ultra-high temperature) Phương pháp UHT thanh trùng thực phẩm ở nhiệt độ lớn hơn 100oC, thực phẩm được thanh trùng trước khi đóng gói, rồi được cho vào các đồ chứa đã được khử thanh trong điều kiện vô trùng. Phương pháp UHT tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và bào tử, kể cả vi sinh vật chịu nhiệt có bào tử. Thực phẩm dược xử lí bằng phương pháp UHT có thể để được đến 6 tháng mà không cần làm lạnh. c. Phương pháp sử dụng tia bức xạ Trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp Pasteur tiệt khuẩn nhanh ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên việc chiếu xạ lại gây nguy hiểm cho con người khi ăn các loại thực phẩm này. d. Phương pháp hút chân không Ở phương pháp này, người ta đặt các sản phẩm thực phẩm trong những bao bì không thấm khí và hút không khí ở trong ra, tạo ra một môi trường chân không. Trong trường hợp này những quá trình oxi hoá thường xảy ra dưới tác dụng của không khí bị kìm hãm mạnh, lớp bề mặt của sản phẩm không bị khô, giữ được màu sắc và tính chất ban đầu của sản phẩm. e. Phương pháp dùng dòng điện cao tần Sản phẩm được đặt trong điện trường của dòng điện xoay chiều có tần số cao để thanh trùng. Các phân tử tích điện trong sản phẩm (ion, điện tử) sẽ dao động do tác dụng của điện năng, chuyển điện năng được hấp thụ thành nhiệt năng để làm chết vi sinh vật. 24
29. Đồ án tốt nghiệp f. Phương pháp siêu âm Siêu âm là sóng âm có tần số dao động cao mà con người không cảm thụ được. Dưới tác dụng của siêu âm, môi trường lỏng (sản phẩm) truyền âm bị xô đi đẩy lại, bị ép và tạo chân không liên tiếp sinh ra nhiều khoảng trống. Lúc đó, các chất hòa tan và hơi của chất lỏng lập tức dồn vào các khoảng trống ấy, gây ra tác dụng cơ học làm chết vi sinh vật ở trong môi trường. g. Phương pháp lọc thanh trùng Kỹ thuật màng lọc góp phần bảo quản thực phẩm bằng cách giữ lại vi sinh vật trên màng và do đó dịch lỏng thấm qua sẽ vô khuẩn. h. Phương pháp đóng gói bằng thay đổi khí quyển Tính năng của công nghệ bảo quản bằng cách bao gói sản phẩm trong khí quyển thay đổi (MAP) nhằm kéo dài tuổi thọ của thực phẩm đã được nhận biết cách đây nhiều năm. Ngày nay thực phẩm đóng gói trong MA bao gồm thịt tươi và nấu chín, thịt gia cầm và cá, rau quả, mì sợi, phomat, các loại bánh nướng từ bột mì, khoai tây chiên, cà phê và trà. i. Bảo quản bằng áp lực thủy tĩnh cao Dựa trên nguyên tắc thủy tĩnh, áp lực thủy tĩnh tại một điểm cho trước bằng nhau ở mọi hướng và áp lực được truyền đi lập tức và giống nhau qua môi trường truyền áp lực. Sử dụng phương pháp vật lí có thể bảo quản thực phẩm tốt nhưng gây tốn kém, quá trình phức tạp và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng khi sử sụng các tia chiếu xạ. 1.5.1.2. Phương pháp hóa học Sử dụng các chất hóa học để ức chế tác nhân làm biến đổi các thành phần hóa học trong thực phẩm. - SO2 (sulfurous dioxide): Khí SO2 ảnh hưởng đến các quá trình oxy hóa trong tế bào vi sinh vật, đồng thời cũng có tác dụng tương hỗ với các nhóm cacboxyl của các hợp chất đặc biệt có trong thành phần của chất nguyên sinh, làm 25
30. Đồ án tốt nghiệp thay đổi trạng thái lý, hóa học của chất nguyên sinh. Khí SO2 dùng trong bảo quản rau quả. Không dùng các hợp chất SO2 để bảo quản thịt, ngũ cốc, đậu đỗ, sữa. - NO3 (nitrate): NaNO3, KNO3. Nitrit được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thịt với mục đích giữ màu đỏ cho thịt muối mặn, làm thuốc sát khuẩn trong bảo quản cá, thịt và các chế phẩm từ cá, thịt (cá, thịt muối hoặc ướp lạnh). Sử dụng làm chất sát khuẩn và giữ màu cho thịt, các sản phẩm thịt, cá và phomat. Khi ăn phải thức ăn chứa nhiều nitrit có thể gây ngộ độc. - Acid benzoic, muối benzoat: ức chế mạnh nấm men và nấm mốc, có tác dụng yếu đối với vi khuẩn. Tác động lên màng tế bào nấm, ức chế quá trình hô hấp của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, ức chế quá trình biến dưỡng các hợp chất đa lượng (N, P, ) của sinh vật. Acid benzoic được sử dụng nhiều trong bảo quản trái cây và rau quả. Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm thay đổi mùi vị sản phẩm, ảnh hưởng tới thận của người sử dụng. Dùng benzoic hoặc benzoat trong bảo quản sản phẩm có thể làm cho sản phẩm bị thâm đen, và dễ nhận biết dư vị, làm giảm chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm. Acid benzoic có thể tác động hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây kích ứng mắt. - Ester diethyl của acid pyrocarbonic : ethylpyrocarbonat hoàn toàn không độc đối với người, khi tiếp xúc với nước sẽ phân hủy dần dần thành ethanol và CO2.Dùng trong bảo quản nước quả, quả tươi. Sử dụng ethylpyrocarbonat để thay thế phương pháp sulfite hoá trong bảo quản rượu nho và nước quả. - Carbonic (CO2): Khí carbonic tác động tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, ức chế một vài quá trình biến dưỡng của vi sinh vật. Nấm mốc nhạy cảm hơn đối với khí carbonic, còn vi khuẩn thí ít nhạy cảm hơn. Nồng độ khí carbonic cao ức chế sự phát triển của những vi khuẩn hiếu khí và cả vi khuẩn yếm khí. - Ozon (O3): Ozon có tính oxi hóa rất mạnh, tác động trực tiếp tới các chất sống gây biến đổi và bất hoạt các đại phân tử sinh học, gây rối loạn các hoạt động sống của vi sinh vật. 26
31. Đồ án tốt nghiệp - Chất gia tăng áp suất thẩm thấu : Sử dụng đường hay muối trong bảo quản thực phẩm làm gia tăng áp xuất thẩm thấu của môi trường, tạo áp suất thẩm thấu cao nên nước trong tế bào thấm ra khỏi màng tế bào chất và gây ra hiện tượng co nguyên sinh, đồng thời tế bào vi sinh vật không thể hấp thu được các chất dinh dưỡng, làm ức chế hoạt động và sự phát triển của vi sinh vật. - Acid acetic (ngâm dấm): acid acetic làm giảm pH của sản phẩm, làm cho quá trình trao đổi ion của vi sinh vật không thực hiện được. Sự thay đổi quá lớn của nồng độ ion trong và ngoài màng tế bào làm rối loạn các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm. - Kháng sinh được sản xuất theo phương pháp hóa học: các chất kháng sinh có tác dụng chủ yếu với vi khuẩn, tác động yếu đối với nấm mốc, nấm men. Tác dụng là là làm ngưng tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; phá vỡ tính thẩm thấu của màng tế bào, ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, ảnh hưởng đối với acid nucleic. Các chất kháng sinh được phép dùng: biomixin (clotetraxyclin), teramixin, oreomixin, - Chất chống oxy hóa: các chất chống oxy hóa có đặc tính dễ bị oxi hóa hơn so với các chất béo có trong thực phẩm. Sự oxi hóa các hợp chất chống oxi hóa sẽ làm giảm sự oxi hóa của các chất béo trong thực phẩm. Các chất chống oxy hóa có hai dạng như sau: Acid (hoặc muối hay ester của chúng) như acid citric, acid ascorbic, Hợp chất phenol làm chậm khả năng oxy hóa chất béo và dầu có trong thực phẩm. Phương pháp hóa học làm thực phẩm dễ bị nhiễm và tích lũy các chất hóc học gây độc trong thực phẩm, gây tác dụng xấu cho con người 1.5.1.3. Phương pháp sinh học Phương pháp sinh học là phương pháp bảo quản thực phẩm nhờ vi sinh vật, nó đem lại hiệu quả cao và không gây độc cho con người, ví dụ: - Phương pháp lên men 27
32. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng các vi sinh vật lên men tạo ra acid làm thay đổi pH môi trường ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hại thực phẩm và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. Điển hình là vi khuẩn lactic. Trong quá trình lên men, các vi khuẩn này tiết ra acid lactic và acid acetic làm acid hóa môi trường, kiềm hãm và tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm. Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tiết ra bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao. - Phương pháp sử dụng bacteriocin Bacteriocin là các protein có tính kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm, nó được các vi sinh vật chủ yếu là nhóm vi khuẩn sinh lactic tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Nisin là một bacteriocin được sinh ra bởi Lactococcus lactis và Streptococcus lactis. Nisin liên kết với anion phospholipid sau đó chúng di chuyển vào tế bào gây rối loạn quá trình trao đổi ion và làm chết vi sinh vật. Bacteriocin dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biến phomat, bảo quản đồ hộp, nước ép quả đóng hộp - Phương pháp sử dụng enzyme Lyzozyme có trong sữa động vật, xúc tác quá trình cắt đứt nối peptidoglycan trên vách tế bào vi khuẩn. Lactose peroxidase và Glucose peroxidase từ sữa bò A.niger, xúc tác quá trình oxy hóa, giải phóng chất độc hay các sản phẩm làm bất hoạt vi khuẩn. Glucose oxidase từ Penicillium, A.niger, xúc tác quá trình oxy hóa loại bỏ cơ chất hay chất dinh dưỡng. Hydrolase từ các nguồn khác nhau, xúc tác quá trình thủy phân polysaccharide ngoại bào. 1.5.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới và tại Việt Nam 1.5.2.1. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới Sản phẩm công nghệ sinh học nói chung và sản phẩm từ vi sinh vật nói riêng đã được ứng dụng vào nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược, môi trường, trong chế biến và bảo quản thực phẩm. 28
33. Đồ án tốt nghiệp a. Trong công nghiệp sản xuất acid lactic Từ năm 1881, con người đã bắt đầu ứng dụng lên men lactic để sản xuất acid lactic ở quy mô công nghiệp. Từ các nguyên liệu như rỉ đường, tinh bột, dịch thải công nghiệp sản xuất đường và bánh kẹo, dịch thủy phân từ cám gạo, cám ngô, người ta sản xuất một lượng lớn acid lactic đáp ứng cho nhu cầu của nhiều ngành công nghiệp: dược, dệt, da, nhuộm, chất dẻo, mỹ phẩm, sơn và vật liệu cao cấp Vi khuẩn lactic được sử dụng cho mục đích này thuộc loại lên men đồng hình, có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 45 – 480C, có lợi thế để ngăn ngừa sự gây nhiễm, như: Lactobacillus delbruckii, L. bulgaricus, L. leichmanii. Nguồn đạm cần cho sự lên men tạo acid lactic thường là dịch chiết ngô hay sunphat amon. Gần đây, người ta sử dụng vi khuẩn lactic cố định trong alginate natri để lên men liên tục ở 430C, pH = 5,7 với hiệu suất lên men đạt 97% (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Acid lactic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, trong in ấn, chế tạo chất dẻo, sơn, dược phẩm và mỹ phẩm. Lactate natri, lactate canxi và một số muối lactic khác được dùng làm chất giữ ẩm, chất nhủ hóa, chất làm đông trong ngành mỹ phẩm Lactate sắt được dùng để bổ sung sắt cho sữa mẹ và bệnh nhân thiếu máu. Acid lactic còn được dùng làm nguyên liệu để chế các sản phẩm dưỡng tóc và làm giảm sự lão hóa của tóc. Lactate canxi cũng được dùng làm nguyên liệu trong sản xuất kem đánh răng. b. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm Việc sử dụng quá trình lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, thịt, cá, trứng, sữa không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà con nhằm đưa ra thị trường có tính chất và hương vị mong muốn. Đây là một trong những phương pháp bảo quản thực phẩm phổ biến hiện nay. Có thể thực hiện quá trình lên men thực phẩm theo 2 cách: 29
34. Đồ án tốt nghiệp - Sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu hoặc có sẵn trong không khí. Theo cách này, người ta thường áp dụng để chế biến các thực phẩm lên men ở quy mô nhỏ, thủ công, trang thiết bị đơn giản. - Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuẩn chủng bổ sung vào nguyên liệu để điều khiển quá trình lên men. Phương pháp này được áp dụng ở quy mô công nghiệp như sản xuất sữa chua, phomat, váng sữa, bơ. - Ngoài việc sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản thực phẩm, người ta còn dùng chúng để sản xuất một lượng acid lactic và muối lactate dùng làm phụ gia thực phẩm. Các vi khuẩn lactic cũng đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất bánh mì đen (Tortora và Funke, 1992). Gần đây người ta phát hiện ra vài trò to lớn của vi khuẩn lactic với sức khỏe của người và động vật. Khu hệ vi khuẩn lactic trong đường ruột người và động vật có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh, tăng cường tiêu hóa, bảo vệ đường ruột. Các nghiên cứu về vấn đề này làm cơ sở tạo ra các chế phẩm sống (probiotic) giúp cân bằng hệ VSV đường ruột, giảm cholesteron trong máu, bệnh không dung nạp lactoza, viêm dạ dày cấp. Các chế phẩm này còn tạo ra các thức ăn có bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, người ăn kiêng và gia súc, gia cầm (Vũ Hồng Thắng, 1998). Nhờ giá trị đặc biệt của các thực phẩm lên men lactic đối với sức khỏe con người mà đến nay các sản phẩm lên men ngày càng được sử dụng rộng rãi và được tiêu thụ với khối lượng rất lớn. c. Trong nông nghiệp Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic có sẵn trong đất đã phân giải dường và cacbon hydrat tạo thành acid lactic. Acid này có tác dụng như: - Kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi, đặc biệt là hệ vi sinh vật phân giải đường, tạo điều kiện phân giải nhanh các đại phân tử hữu cơ trong đó có các chất khó phân gải như lignin, cenlulose, tinh bột mà không gây hại cho đất. - Ức chế sự phát triển của các vi nấm có hại như Fusarium, giun tròn và các đối tượng chuyên phá hại mùa màng. 30
35. Đồ án tốt nghiệp Trong chăn nuôi, vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình ủ chua thức ăn gia súc. Nhờ ủ chua, thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi, phần lớn các chất dinh dưỡng như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh được bảo đảm góp phần tăng năng suất trong chăn nuôi, đồng thời góp phần hạ giá thành sản phẩm. Nhiều loại thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus, nấm đã được sản xuất, ứng dụng đại trà. Chỉ riêng chế phẩm thuốc trừ sâu Bt, hàng năm đã mang lại lợi nhận hàng trăm triệu đô la Mỹ. Sản xuất thuốc BVTV sinh học không chỉ phát triển mạnh ở các nước phương Tây, mà còn phát triển ở cả Trung Quốc, Thái Lan. Phân bón sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn (Rhizobium, Azotobacter, Bacillus ), xạ khuẩn (Frankia), nấm (Mycorhiza), tảo lam đã được các nước trên thế giới nghiên cứu, sản xuất và áp dụng rộng rãi. Phân vi sinh làm tăng năng suất cây trồng 7-15% và tiết kiệm 20% phân khoáng. Riêng phân vi khuẩn nốt sần, doanh số thế giới hàng năm đạt 25 triệu USD, trong đó riêng Mỹ chiếm 19 triệu USD. d. Trong y học Acid lactic được sử dụng rộng rãi để điều chế một số loại thuốc sát trùng, một số loại thuốc dưới dạng muối canxi. Các vi khuẩn lactic sinh kháng sinh được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” dùng để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ VSV đường ruột. Trong đó nỗi bật là L. acilophilus khi bổ sung vào đường tiêu hóa, tại ruột già chúng phát triển ức chế một số bệnh đường ruột khác. Chúng tiết ra các chất diệt khuẩn, kháng sinh, chất kháng độc tố kháng hệ miễn dịch kích thích sự tạo thành interferon làm giảm quá trình hình thành các khối u. Đặc biệt trong quá trình sinh trưởng các vi khuẩn này thường sử dụng cholesterol nên có vai trò làm giảm lượng cholesterol được hấp thu vào cơ thể (Salmien và Deighton, 1998). e. Ứng dụng trong bảo vệ và xử lý môi trường Xử lý các chất thải, phế liệu trong nông nghiệp - nông thôn bằng công nghệ vi sinh để bảo vệ môi trường và sản xuất ra khí sinh học (biogas), phân bón hữu 31
36. Đồ án tốt nghiệp cơ phục vụ dân sinh và nông nghiệp. Những nước có công nghệ phát triển trong lĩnh vực này là Nhật Bản, Mỹ, EU và Canada. 1.5.2.2. Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên men truyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản phẩm men tiêu hoá đông khô. Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước đầu phân lập và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nguồn sản phẩm lên men và các sản phẩm men tiêu hoá đông khô có sẵn trên thị trường. Qua đó có thể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để có thể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên. Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các sản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm nem chua. Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo hương vị cho nem chua. Việt Nam đã nghiên cứu hoàn thiện một số công nghệ sản xuất phân vi sinh vật, thức ăn bổ sung cho gia cầm, chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật và bả diệt chuột sinh học; ứng dụng thành công công nghệ biogas để xử lý chất thải hữu cơ Sử dụng vi sinh vật để làm phân bón (phân VSV cố định Nitơ tự do hoặc hội sinh; phân VSV phân giải phot phat khó tan từ vi khuẩn hoặc nấm mốc; phân VSV có nguồn gốc từ nấm Mycorhiza, vi khuẩn Rhizobium, xạ khuẩn Frankia cho cây lâm nghiệp: Thông, Keo, Phi lao, Sao đen), chế phẩm VSV bổ sung thức ăn gia cầm Chế phẩm thuốc BVTV sinh học được ứng dụng rộng rãi như NPV, V-Bt để trừ sâu khoang, sâu xanh hại rau, màu, bông, đay, thuốc lá; chế phẩm vi khuẩn 32
37. Đồ án tốt nghiệp huỳnh quang (Pseudomonas fluorescens) phòng trừ bệnh hại rễ cà phê, vải thiều, lạc. Nhiều kết quả nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt côn trùng đã đạt được kết quả tốt như: Metarhizium flovoviridae trừ mối, châu chấu hại mía (hiệu quả phòng trừ đạt 76%), Beauveria bassiana trừ sâu róm hại thông (hiệu quả phòng trừ đạt 93,6%), hay Beauveria bassiana và Metarhizium aníopliae phòng trừ sâu hại dừa đạt hiệu quả từ 56-97%; nấm đối kháng Trichoderma trừ bệnh khô vằn trên ngô đạt hiệu quả 45-50%, hạn chế bệnh lở cổ rễ đậu tương 51-58%. Hiện nay, các nhà khoa học đang hoàn thiện qui trình sử dụng nấm Exserohilum monoceras để trừ cỏ lồng vực. Trong lĩnh vực xử lý môi trường: đã ứng dụng thành công công nghệ Biogas để chuyển các chất thải hữu cơ thành khí đốt. Đã xử lý rác thải, than bùn làm phân bón. Những nghiên cứu trong ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải, chuyển đổi sinh học các nguồn phụ, phế thải nông, lâm nghiệp cũng đang được tiến hành. 1.6. Yêu cầu đối với việc sử dụng chất bảo quản sinh học trong thực phẩm - Chất bảo quản sinh học được sử dụng không có tính độc và kích thích sự kháng thuốc của vi sinh vật khác. - Được cơ quan thẩm quyền công nhận và cho phép sử dụng. - Phải được sử dụng một cách hợp kinh tế trong công nghiệp. - Sản phẩm có bổ sung chất bảo quản sinh học phải không bị ảnh hưởng. Ví dụ: chất bảo quản sinh học không gây tác động xấu đối với đánh giá cảm quan của sản phẩm. - Vẫn tỏ ra hiệu quả khi được dùng ở nồng độ tương đối thấp. - Chất bảo quản sinh học phải đủ bền khi được cất trữ. - Không được sử dụng trong chữa bệnh hoặc dùng làm phụ gia thực phẩm cho động vật hay bổ sung vào thức ăn giúp tăng sự phát triển của động vật. 33
38. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2014 đến tháng 06/2014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Lê Ngọc Thùy Trang (2013). 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella, Listeria monocytogenes được cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp. HCM. 2.2.3. Nguồn mẫu khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm của hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L. plantarum Nguồn mẫu là thịt nạc đùi tươi được mua từ cửa hàng Vissan Quận Bình Thạnh. 2.2.4. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.4.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS OPTSC01 (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013) Môi trường Tryptone Soya Borth (HiMedia - Ấn Độ) Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) Môi trường Saline Pepton Water (SPW) Môi trường Plate Count Agar (PCA) Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB) 34
39. Đồ án tốt nghiệp Môi trường Briliant Green Bile Lactose borth (BGBL) Môi trường Eosine Methylene Blue Agar (EMB) Môi trường Tryptone Môi trường MR-VP Môi trường Simon Citrate Agar (SCA) Thuốc thử Kovac’s Thuốc thử Methyl Red Thuốc thử α-naphtol 5% Dung dịch KOH 40% Dung dịch NaOH 2M Môi trường Baird Parker (BP) Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya (RV) Môi trường Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar) Môi trường TSI Môi trường Mannitol Phenol Red both Môi trường Urea broth Môi trường LDC 2.2.4.2. Dụng cụ và thiết bị a. Dụng cụ Đĩa petri Đũa thủy tinh Ống nghiệm Giấy đo pH Ống đong 50ml, 100ml Ống Falcon Becher 100ml, 250ml, 500ml Các loại đầu típ Pipette 1ml, 10ml, 25ml Đèn cồn Ống ly tâm Eppendorf Micropipette 100µl, 1000µl Bình môi trường 250ml, 500ml, 1l Dao cắt mẫu Dây cấy ria, dây cấy thẳng, que cấy trang Kẹp gắp mẫu Bông y tế và bông không thấm nước 35
40. Đồ án tốt nghiệp b. Thiết bị Tủ cấy vi sinh Máy đo UV - VIS Tủ ấm 300C, 370C Máy ly tâm Bể điều nhiệt Tủ hút Cân phân tích Máy lắc Tủ lạnh Bếp từ Autoclave Máy nước cất Máy đo pH 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng (Phạm Minh Nhựt, 2014). 36
41. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu 2.3.2. Phương pháp tăng sinh Nguyên tắc: nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với giống vi khuẩn lactic được giữ trên môi trường MRS agar hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường MRS broth. Sau đó tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 48 giờ. Đối với giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển đến tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. 37
42. Đồ án tốt nghiệp Quá trình này được lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển giống một lần. Đối với chủng LAB: cấy chuyển định kỳ 2 tuần/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar. Bảo quản trong trong tủ mát. Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: cấy chuyển định kỳ 1 tháng/1 lần trên ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA. Bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, ta có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi sinh vật được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch, thu cặn có chứa sinh khối. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.3. Phương pháp vi gói L. plantarum trong hỗn hợp gelatine và aginate Nguyên tắc: vi gói là phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có nguồn gốc tự nhiên hoặc nhân tạo như gelatine và aginate để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào, cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ. Giúp tế bào cách ly được với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự thất thoát của số lượng tế bào. Vi gói giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào, các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường không thuận lợi như độ acid cao, muối mật, sốc nhiệt hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường lên men và sản sinh hợp chất kháng khuẩn tại những nơi ta mong muốn. Từ đó có thể 38
43. Đồ án tốt nghiệp làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại, giúp việc bảo quản chủng, giống tế bào được lâu dài hơn. Chủng L. plantarum sau khi tăng sinh cấp 1 trong môi trường MRS đi ly tâm thu cặn và pha loãng với nước muồi sinh lý với thể tích bằng với lượng dịch trong bỏ đi. Trôn đều hỗn hợp gelatine (6%) và aginate (2,5%) với nhau theo tỷ lệ 4 : 1 thành một hỗn hợp gel. Tiếp tục trộn đều hỗn hợp gel với sinh khối L. plantarum theo tỷ lệ 2 : 1, theo nghiên cứu của Lê Trần Hồng Xuân. Sử dụng ống bơm tiêm hút hỗn hợp gel và sinh khối L. plantarum và nhỏ thành từng giọt trong dung dịch hổ trợ tạo gel là dung dịch CaCl2 (2%), ngay lập tức các polymer gelatine và alginate bao quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+ tạo thành các hạt gel tròn chứa chủng L. plantarum. Các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng (Đỗ Quốc Cường, 2009). Sau đó có thể bảo quản chúng trong dung dịch đường lactose 10% trong tủ mát 40C hoặc có thể tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS. 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp: đối với dịch sau ly tâm của LAB sau khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp được xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp đồng nuôi cấy (Vaseeharan và Ramasamy, 2003). Vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trong các erlen chứa 10ml TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 150 vòng/ phút trong 24 giờ. Sau khi tăng sinh dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị được đo OD ở bước sóng 600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt mật độ 106 cfu/ml. Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 2 µl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 106 cfu/ml cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm và môi trường TSB ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ rồi tiến hành xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp đo độ đục đã trình bày ở trên. Từ đó, đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn của 39
44. Đồ án tốt nghiệp dịch tế bào L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 % sau ly tâm thông qua tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị. Phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau (Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012): 푶푫 % Tỷ lệ ức chế = ( − 푻푵) 풙 % 푶푫Đ푪 2.3.5. Phương pháp định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý đến độ pha loãng cần sử dụng Hút 1ml ở mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri vô trùng Đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C vào các đĩa trên Lắc đều, chờ đĩa thạch nguội ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ Đọc kết quả, chọn các kết quả từ 25 - 250 khuẩn lạc Tính toán kết quả Hình 2.2. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) 40
45. Đồ án tốt nghiệp Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều kiện vô trùng. Thời gian đồng nhất mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch pha loãng sẽ được pha loãng bằng cách dùng micropipette với đầu tip vô trùng hút 1 ml vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, lắc đều được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật. Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng hút 1ml dịch pha loãng vào đĩa petri vô trùng tương ứng với mỗi độ pha loãng. Tiến hành đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ 45 – 500C. Xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3 – 5 lần để mẫu và môi trường được trộn đều chờ đĩa nguội đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ. Tiến hành đọc kết quả bằng cách đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 tế bào vi sinh vật để tính. Mật độ tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau: A (CFU/g) = 푛1 1+ + 푛푖 푖 Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng (Phạm Minh Nhựt, 2014). 41
46. Đồ án tốt nghiệp 2.3.6. Phương pháp định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa Cho 25g mẫu vào 225 ml SPW và đồng nhất mẫu Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng hợp lý Hút 1 ml ở mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri vộ trùng. Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và đợi trong 30 phút Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Chọn và đếm khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0,5mm Ở mỗi đĩa chọn 3 - 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL Ủ 370C trong 24 giờ Tính tỷ lệ xác nhận R Tính tổng số Coliform (cfu/g) Hình 2.3. Sơ đồ quy trình định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đổ đĩa 42
47. Đồ án tốt nghiệp Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1. Hút 1 ml dịch pha loãng mẫu vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Tùy vào mẫu cần kiểm định mà chọn độ pha loãng thích hợp. Đổ vào mỗi đĩa 5ml môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ. Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB. Chờ môi trường đông đặc ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chọn các đĩa từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật. Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy sang môi trường canh BGBL và ủ ở 370C trong 24 giờ. Phản ứng dương tính khi có bọt khí xuất hiện trong ống Durnham. Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ xác định, tính mật độ của Coliforms theo công thức sau: A (CFU/g hay CFU/ml) = x R 푛1 1+ + 푛푖 푖 Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận Số ống BGBL dương tính Với R = Tổng số ống BGBL thử nghi ệm Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014). 43
48. Đồ án tốt nghiệp 2.3.7. Phương pháp định lượng Staphylocuccus aureus bằng phương pháp cấy trang Cho 25 g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất Pha loãng mẫu đến độ pha loãng 10-2 Hút 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-2 cho vào đĩa môi trường BP có bổ sung egg yolk rồi tiến hành cấy trang Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen và có quầng sáng bao quanh Cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ Ủ 370C trong 24 giờ Xác định tỷ lệ ngưng kết và tính tổng số S. aureus (cfu/g) Hình 2.4. Sơ đồ quy trình định lượng S. aureus bằng phương pháp cấy trang Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong điều kiện vô trùng. Khi đó được dung dịch pha loãng 10-1, tương tự tùy vào mẫu cần kiểm định, tiến hành pha loãng mẫu đến độ pha loãng cần sử dụng. 44
49. Đồ án tốt nghiệp Dùng micropipette hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP và cấy trang đều cho đến khi khô. Thực hiện lặp lại 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng. Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ đối với môi trường BP. Sau 48 giờ, trên môi trường BP khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh. Quy trình khẳng định được thực hiện bằng cách: cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ. Tiến hành ủ ở 370C và theo dõi sau 24 giờ từ đó xác định tỷ lệ ngưng kết R. Tỷ lệ xác nhận (tỷ lệ ngưng kết) là tỷ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định. Đếm số lượng các khuẩn lạc và dựa vào tỷ lệ ngưng kết R để tính mật độ S. aureus theo công thức: A (CFU/g hay CFU/ml) = x R 푛1 1+ + 푛푖 푖 Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận Số ống huy ết thanh dương tính Với R = Tổng số ống huy ết tương th ử nghi ệm Kết quả S. aureus được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ số thập phân (Phạm Minh Nhựt, 2014). 45
50. Đồ án tốt nghiệp 2.3.8. Phương pháp định tính E. coli trong thực phẩm Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu Hút 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BGBL Ủ ở nhiệt độ 440C trong 24 giờ Chọn các ống BGBL đục và có sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của E. coli trên EMB: tròn, dẹt, đường kính <0,5mm, có ánh kim tím Cấy vào các môi trường: 1 Trypton, 2 MR - VP, 1 Simmons Citrate Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Thử nghiệm IMViC Hình 2.5. Sơ đồ quy trình định tính E. coli Chuẩn bị mẫu và tiến hành pha loãng mẫu. Hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1 vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường BGBL, ủ ở nhiệt độ 440C trong 46
51. Đồ án tốt nghiệp 24 giờ. Sau đó, chọn các ống nghiệm cho phản ứng dương tính (môi trường đục và có sinh hơi) và cấy chuyển sang môi trường phân lập EMB rồi mang đi ủ ở 370C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc E. coli: khuẩn lạc tròn, dẹt, có tâm đen, có bờ đều, đường kính >0,5mm và có ánh kim tím. Những khuẩn lạc nghi ngờ được cấy vào các ống thử nghiệm sinh hóa sau đây: 1 ống canh trypton, 2 ống MR – VP, 1 ống Simmon citrate để thực hiện nghiệm thức IMViC (Indol, Methyl Red, VP, Citrate): - Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi trường canh trypton. Phản ứng Indol là dương tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt, phản ứng là âm tính khi không có sự xuất hiện của vòng đỏ ở trên. - Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn trong môi trường MR – VP, lắc đều. Phản ứng MR là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính là khi canh khuẩn không chuyển màu. - Thử nghiệm Voges – Proskauer: cho 3 giọt thuốc thử α – napthol 5 % vào canh khuẩn MR – VP, lắc đều. Sau đó, bổ sung 1 giọt KOH 40%, lắc đều rồi quan sát sau 10 phút. Phản ứng VP là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu. - Thử nghiệm Citrate: trong môi trường Simmon Citrate, phản ứng là dương tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang xanh lam, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển màu. Khẳng định phát hiện E. coli khi các nghiệm thức cho kết quả như sau: Thử nghiệm Indol (+) Thử nghiệm Voges – Proskauer (-) Thử nghiệm Methyl Red (+) Thử nghiệm Citrate (-) (Phạm Minh Nhựt, 2014) 47
52. Đồ án tốt nghiệp 2.3.9. Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm Cho 25g mẫu vào 225ml SPW và đồng nhất mẫu Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Hút 0,1 ml canh trường cho vào ống nghiệm chứa10 ml môi trường RV Ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ Cấy vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Indole, VP, Urea, Manitol, LDC Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Sử dụng các loại thuốc thử để kiểm tra Hình 2.6. Sơ đồ quy trình định tính Salmonella trong mẫu thịt Mẫu thịt 25g được cho vào bao nylon vô trùng, sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu SPW. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 5 phút trong điều kiện vô trùng. Tiến hành quá trình tiền tăng sinh bằng cách ủ các bao nylon chứa mẫu đã 48
53. Đồ án tốt nghiệp được pha loãng và đồng nhất ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Trộn môi trường canh sau khi đã ủ 24 giờ trước cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV. Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24 giờ. Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh chọn lọc RV cấy ria trên môi trường chọn lọc cho Salmonella là XLD. Trên môi trường XLD khuẩn lạc đặc trưng Salmonella có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường XLD chuyển sang màu hồng. Tất cả các đĩa sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 370C trong 22 – 26 giờ. Sau khi ủ, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa. Các thử nghiệm sinh hóa chính được sử dụng cho Salmonella lên men glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, LDC và mannitol. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau: - Thử nghiệm trên môi trường TSI: Salmonella chỉ lên men được glucose trong các môi trường TSI nên phần nghiêng có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện màu đen trên môi trường. Có thể có hiện tượng sinh hơi làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới ống nghiệm. - Thử nghiệm Urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi cấy môi trường vẫn giữ nguyên được màu tím nhạt. - Thử nghiệm lên men mannitol (+): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng. - Thử nghiệm LDC: sau khi nuôi cấy, môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển sang màu ban đầu. - Thử nghiệm Indole và VP đều (+). (Phạm Minh Nhựt, 2014). 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Statgraphics centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 49
54. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Vi khuẩn L. plantarum SC01 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn Khảo sát hiệu quả ức chế của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum đối với vi khuẩn chỉ thị theo thời gian khảo sát Đánh giá khả năng bảo quản thịt của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 đối với vi khuẩn chỉ thị Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 50
55. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 L. plantarum SC01 Tăng sinh cấp 1 Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate Nuôi cấy Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ cặn thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về pH 6 Khảo sát ở các nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 600C, 800C, 1000C trong 30 phút Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị Xác định % tỷ lệ ức chế Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Qua thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hình thức nuôi cấy đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 của Lê Trần Hồng Xuân (2014), tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % 51
56. Đồ án tốt nghiệp - alginate 2,5 % cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn có hoạt tính mạnh nhất được tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng, 600C, 800C, 1000C trong 30 phút để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các hợp chất kháng khuẩn. L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01, ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate. Cân 1,5 g tế bào L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate cho vào erlen chứa 50ml MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin và alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01, ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng để loại bỏ hoạt động ức chế của acid hữu cơ và ủ lần lượt ở các nghiệm thức nhiệt độ: nhiệt độ phòng, 600C, 800C và 1000C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau đó tiền hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. 52
57. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 L. plantarum SC01 Tăng sinh cấp 1 Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate Nuôi cấy Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ tủa, thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về các nghiệm thức pH: pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 Ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ Chỉnh pH các nghiệm thức về pH 6 Thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị Xác định % tỷ lệ ức chế Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 Vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về các giá trị pH: pH 2, 53
58. Đồ án tốt nghiệp pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 bằng NaOH 2N và HCl 2N vô trùng ủ ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ. Sau đó chỉnh pH các nghiệm thức về giá trị pH 6,0 để loại bỏ hoạt động ức chế của acid hữu cơ cũng như pH kiềm đối với vi sinh vật. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 L. plantarum SC01 Tăng sinh cấp 1 Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate Nuôi cấy Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ tủa, thu dịch trong. Ở các nghiệm thức bổ sung các chất hoạt động bề mặt: Sodium dodecyl sulfate (SDS), Tween 20, Tween 80, Urea, EDTA với tỷ lệ 1% (w/v) Ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ Chỉnh pH các nghiệm thức về pH 6 Thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị Xác định % tỷ lệ ức chế Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 54
59. Đồ án tốt nghiệp L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate được nuôi cấy trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng. Sau đó lần lượt xử lý dịch trong bằng các chất hoạt động bề mặt được bổ sung với tỷ lệ 1% (w/v): Sodium dodecyl sulfate (SDS), Tween 20, Tween 80, Urea, EDTA rồi ủ các nghiệm thức ở nhiệt độ 370C trong 5 giờ. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Sau đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu quả ức chế của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L. plantarum SC01 theo thời gian khảo sát 55
60. Đồ án tốt nghiệp L. plantarum SC01 Tăng sinh cấp 1 Cố định tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 trong hỗn hợp gel gelatine và aginate Nuôi cấy Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Loại bỏ cặn, thu dịch trong và chỉnh dịch sau ly tâm về pH 6 Thanh trùng các nghiệm thức ở nhiệt độ 800C trong 30 phút Đánh giá khả năng ức chế của hợp chất kháng khuẩn đối với vi khuẩn chỉ thị trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ Đo OD các nghiệm thức ở bước sóng 600nm và tính % tỷ lệ ức chế Hình 2.11. Sơ đồ thí nghiệm 4 L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6% - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate được tăng sinh cấp 2 trong erlen chứa 50ml môi trường MRS 56
61. Đồ án tốt nghiệp OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng. Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Sau đó tiến hành đánh giá mật độ ức chế đối với vi khuẩn chỉ thị theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.3.4. trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.5. Thí nghiệm 5: Đánh giả khả năng bảo quản thịt của hợp chất kháng khuẩn từ L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị Thịt heo tươi Cắt thịt thành các khối 25 g Ngâm thịt vào dịch tế bào L. plantarum SC01 sau ly tâm trong 2 giờ Định tính Đánh giá cảm quan Salmonella của mẫu Mẫu thịt đã được xử lý Định lượng tổng số Định tính E. coli vi sinh vật hiếu khí (TPC) Định lượng Định lượng tổng số Staphylococcus coliform aureus Hình 2.12. Sơ đồ thí nghiệm bảo quản thịt 57
62. Đồ án tốt nghiệp L. plantarum SC01 được tăng sinh cấp 1 trong erlen chứa 10ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ dịch trong, thu tủa rồi hòa tan trong nước muối sinh lý và cố định trong hỗn hợp gelatin 6% - alginate 2,5 %. Cân 1,5g L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate cho vào erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 sau khi được cố định trong hỗn hợp gelatin - alginate được tăng sinh cấp 2 trong erlen chứa 50ml môi trường MRS OPTSC01 ủ ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ rồi ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch trong. Chỉnh pH dịch sau ly tâm lần lượt về pH 6,0 bằng NaOH 2N vô trùng. Thịt nạc heo tươi sau khi mua về được cắt thành từng khối lập phương, mỗi khối 25 g. Các mẫu được chia làm 2 phần: một phần làm mẫu đối chứng, một phần làm mẫu thí nghiệm. Dùng kẹp gắp các mẫu đối chứng vào các lọ thủy tinh vô trùng. Tiến hành ngâm mẫu thí nghiệm vào dịch L. plantarum SC01 sau ly tâm đã chỉnh về pH 6,0 trong 2 giờ rồi lấy ra để ráo và cho vào các lọ thủy tinh vô trùng. Tiến hành khảo sát ở các mốc thời gian: 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Ứng với các mốc thời gian, tiến hành kiểm tra cảm quan và các chỉ tiêu vi sinh của các mẫu thịt. Mỗi nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần và trong điều kiện vô trùng. 2.4.5.1. Đánh giá cảm quan mẫu Đánh giá cảm quan của sản phẩm thịt heo theo các tiêu chí: - Màu sắc - Mùi - Trạng thái cấu trúc của thịt heo (độ đàn hồi, độ nhớt, ) Các chỉ tiêu được đánh giá mẫu được thực hiện trước và sau khi làm thí nghiệm. 2.4.5.2. Đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh Tại mỗi thời điểm khảo sát tiến hành thu mẫu và đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh vật trong mẫu bao gồm TPC, Coliform tổng số, S. aureus, E. Coli và Salmonella. 58
63. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 Từ nghiên cứu của Zambou và ctv (2013) cho thấy rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn Lactobacillus plantarum sản sinh. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 % sau ly tâm. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Hình 3.1. 70% a a a 60% b a b b b 50% b c c c E. coli c c c 40% Salmonella S. aureus 30% B. subtilis L. monocytogenes Tỷ lệ ức chế (%) chế lệức Tỷ d 20% d d d d 10% 0% 3737^C0C 6060^C0C 80^C800C 100^C1000C Hình 3.1. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các nhiệt độ khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 thông qua mức độ ức chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị được thể hiện trên Hình 3.1. Kết quả này cho thấy rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Dịch ly tâm 59
64. Đồ án tốt nghiệp sau trung hòa khi xử lý ở 4 chế độ nhiệt độ đều thể hiện tính đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và tỷ lệ ức chế đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong 4 nghiệm, nghiệm thức xử lý dịch kháng khuẩn ở nhiệt độ 800C cho tỷ lệ ức chế cao nhất với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị so với 3 nghiệm thức còn lại (tỷ lệ ức chế gần 60 % trong đó tỷ lệ ức chế đối với Salmonella là trên 60 %). Nghiệm thức ủ dịch kháng khuẩn ở nhiệt độ 1000C cho tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn chỉ thị thấp nhất (tỷ lệ ức chế từ 10 % đến 20 %). Xét về tỷ lệ ức chế của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa được ủ ở nhiệt độ 800C cho tỷ lệ ức chế mạnh đối với cả 5 chủng vi khuẩn chỉ thị là E. coli, Salmonella, S. aureus, B. subtilis, L. monocytogenes và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 3 nghiệm thức còn lại (P < 0,05). Từ kết quả trên cho thấy hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được ủ ở nhiệt độ 800C cho hoạt tính mạnh nhất và ủ ở nhiệt độ càng cao thì hoạt tính càng giảm. Điều này có thể do khi xử lý ở nhiệt độ 800C sẽ bất hoạt một số thành phần ức chế hoạt tính của các hợp chất vi khuẩn đặc biệt là bacteriocin trong hỗn hợp. Đồng thời, khi xử lý ở 800C cũng giúp hạn chế sự lây nhiễm của các vi sinh vật khác trong quá trình thao tác, từ đó đánh giá chính xác hơn hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Tuy nhiên khi xử lý dịch ở nhiệt độ 1000C tỷ lệ ức chế vi khuẩn giảm, điều này do khi nhiệt độ cao sẽ làm bất hoạt một số thành phần trong hợp chất kháng khuẩn dẫn đến hạn chế hoạt tính của chúng. Theo nghiên cứa của Ogunbanwo và ctv (2003), khi khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum F1 thì kết quả cho thấy bacteriocin sản xuất từ chủng này cũng giảm dần khi nhiệt độ xử lý ở nhiệt độ 1000C. Theo kết quả nghiên cứu của Zambou và ctv (2013), khi khảo sát khả năng bền nhiệt của bacteriocin do chủng Lactobacillus plantcuarum 29V sản sinh ra bằng cách thu dịch bacteriocin ủ ở nhiệt độ 600C, 800C, 1000C, 1210C lần lượt trong 10 phút, 30 phút và 60 phút đã cho thấy rằng bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic 60
65. Đồ án tốt nghiệp khảo sát có sự thay đổi về hoạt tính khi được ủ trong các khoảng nhiệt độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 600C và 800C hoạt tính đo được là 800 (AU/ml), trong khi ở nhiệt độ 1000C hoạt tính bacteriocin giảm 50 % chỉ còn 400 (AU/ml) và tiếp tục giảm khi ủ ở nhiệt độ 1210C chỉ còn 200 (AU/ml). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu đã tiến hành. Đối với nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 được cố định trong hỗn hợp gelatin 6 % - alginate 2,5 %, chủng này cho tỷ lệ ức chế mạnh nhất khi dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ly tâm sau trung hòa khi được xử lý ở nhiệt độ 800C trong 30 phút. Điều này cho thấy rằng các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic có khả năng chịu nhiệt độ tốt (khoảng 800C), điều này rất có ích cho những nghiên cứu liên quan đến việc bảo quản các loại thực phẩm xử lý nhiệt độ cũng như các nghiên cứu liên quan đến ủ chua. Do đó, kết quả của thí nghiệm này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị Ở thí nghiệm 1 đã xác định hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn L. plantarum SC01 khi được thanh trùng ở nhiệt độ 800C cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Tiếp đến, tiến hành khảo sát khả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01. Kết quả đối kháng được trình bày ở Hình 3.2. 61
66. Đồ án tốt nghiệp 70% a a 60% a bc b b a a bc bcd a ab a ab ab a a bcbcd bc a a bcd bcd cd cd bcd a cd bc b d d 50% b c cd c bc cd c d c de d 40% e E. coli 30% Salmonella 20% S. aureus 10% B. subtilis L. monocytogenes 0% pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 Hình 3.2. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 ở các giá trị pH khác nhau. Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào vi khuẩn L. plantarum SC01 thông qua mức độ ức chế sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị được thể hiện trên Hình 3.2 cho thấy pH có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn L. plantarum SC01. Dịch ly tâm sau trung hòa sau khi được xử lý ở 9 nghiệm thức pH đều thể hiện tính đối kháng với 5 chủng vi khuẩn chỉ thị nhưng tỷ lệ ức chế khác nhau và đối với từng chủng vi khuẩn chỉ thị đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Xét về tỷ lệ ức chế của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 đối với từng vi khuẩn chỉ thị, dịch L. plantarum SC01 khi được xử lý ở pH acid (từ pH 2 – pH 5) cho kết quả kháng khuẩn trung bình cao nhất (tỷ lệ kháng khuẩn luôn duy trì ở mức 50%), đặc biệt dịch vi khuẩn khi xử lý ở pH 4 cho tỷ lệ ức chế mạnh nhất đối với cả 5 chủng vi khuẩn chỉ thị (tỷ lệ ức chế trên 50% trong đó tỷ lệ ức chế đối với E. coli và S. aureus gần 60%) (P < 0,05). Ở các nghiệm thức xử lý dịch vi khuẩn ở pH trung tính (pH 6 và pH 7) có sự khác biệt về giá trị tỷ lệ ức chế. Ở nghiệm thức pH 6, tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn 62
67. Đồ án tốt nghiệp luôn đạt giá trị cao và ổn định trên 50%, trong khi đó ở nghiệm thức xử lý pH 7 cho kết quả tỷ lệ ức chế 5 chủng vi khuẩn không ổn định và đạt tỷ lệ ức chế thấp đối với một số chủng vi khuẩn chỉ thị (tỷ lệ ức chế đối với chủng B. subtilis và L. monocytogenes trên 40%, trong khi đó tỷ lệ ức chế đối với Salmonella chỉ dưới 40%). Các nghiệm thức xử lý dịch vi khuẩn ở giá trị pH bazơ (pH 8 đến pH 10) cho kết quả tỷ lệ ức chế thấp và không ổn định (tỷ lệ ức chế các nghiệm thức trung bình đều dưới 50% và tỷ lệ ức chế đối với chủng Salmonella ở các nghiệm thức này đều duy trì ở mức 40%) (P < 0,05). Xét về tổng thể kết quả tỷ lệ ức chế các nghiệm thức ở các giá trị pH trên cho thấy tỷ lệ ức chế đạt giá trị cao nhất ở pH 4 và pH 6, trong khi ở giá trị pH 4 đạt tỷ lệ ức chế cao nhưng không ổn định giữa các chủng vi khuẩn chỉ thị còn ở giá trị pH 6 cho tỷ lệ ức chế ổn định hơn. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy pH tuy có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 nhưng mức độ ảnh hưởng không lớn giữa các khoảng pH acid, trung tính và base. Zambou và ctv (2013) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH6, pH 7, pH 8, pH 9 và pH 10 đến hoạt tính của bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum 29V ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ sau đó chỉnh pH của tất cả các nghiệm thức về pH 6,5 bằng HCl 6M và NaOH 6M. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tất cả các giá trị pH khác nhau hoạt tính của bacteriocin vẫn duy trì ở mức 800 (AU/ml). Theo nghiên cứu của Ogunbanwo và ctv (2003) khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của L. brevis OG1, kết quả cho thấy hoạt tính hợp chất kháng khuẩn vẫn ỗn định ở các giá trị pH 2, pH 4, pH 6, pH 8 và giảm dần khi ở pH 10. Theo kết quả của Moshood và TengkuHaziyamin (2012), khi khảo ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Enterococcus faecium B3L3. Kết quả cho thấy, khi điều chỉnh pH ở các giá trị pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10 sau đó khảo nghiệm sự khuếch tán trên đĩa petri sau khi ủ 24 giờ với các khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa thì hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn Enterococcus faecium B3L3 không thay đổi (dao động từ 12 mm đến 63
68. Đồ án tốt nghiệp 14 mm). Từ kết quả của những nghiên cứu trên cho thấy hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn khi được xử lý ở các giá trị pH không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của các hợp chất khảo sát. So với các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch từ vi khuẩn L. plantarum SC01, kết quả nghiên cứu này cũng ghi nhận sự ảnh hưởng không lớn của pH đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn thu được từ vi khuẩn L. plantarum SC01. Điều này chứng tỏ rằng ở pH kiềm hay acid cũng đều có thể ứng dụng các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn latic. 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01 đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị Kaur và ctv (2013) đã nghiên cứu và cho thấy rằng bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic có sự thay đổi về hoạt tính khi có sự hiện diện của của chất hoạt động bề mặt khác nhau. Do đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của dịch tế bào L. plantarum SC01 thông qua mức độ ức chế vi khuẩn chỉ thị. Kết quả ức chế được trình bày ở Hình 3.3. a a a 100% a a 90% b 80% b b b 70% b c c E. coli 60% c 50% Salmonella c 40% d c S. aureus Tỷ lệ Tỷức chế (%) d d 30% d d B. subtilis 20% e e e e e L. monocytogenes 10% .000% 0% Đối Chứng Tween 80 Tween 20 EDTA Urea SDS Hình 3.3. Tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị của dịch vi khuẩn L. plantarum SC01 khi bổ sung các chất hoạt động bề mặt với tỷ lệ 1% (w/v). Các nghiệm thức mang các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 64