›

Đồ án Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34S-FMV

pdf 68 trang thiennha21 13/04/2022 3840
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34S-FMV", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_xay_dung_phuong_phap_phat_hien_thuc_pham_bien_doi_gen.pdf

Nội dung text: Đồ án Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34S-FMV

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CÓ NGUỒN GỐC THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER 34S-FMV Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Vũ Việt Dũng Sinh viên thực hiện : Trần Quang Phát MSSV: 1311100065 Lớp: 13DSH01
  2. Đồ án tốt nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do bản thân thực hiện và không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trong đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc. Kết quả trình bày trong đề tài được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trước đây. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài nghiên cứu này. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên, Trần Quang Phát
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM nói chung, quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường nói riêng đã tận tình dạy dỗ, giúp em hoàn thiện kiến thức, các kỹ năng chuyên môn và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập. Xin gửi đến TS. Nguyễn Tiến Dũng, ThS. Phạm Vũ Việt Dũng cùng với các anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 lời cảm ơn sâu sắc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em trong suốt thời gian qua. Xin ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của toàn thể các bạn trong lớp 13DSH01 đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ đã nuôi dạy con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để kiến thức của chúng em ngày càng hoàn thiện hơn, rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập, làm việc sau này. Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô của trường Đại học Công nghệ TP.HCM dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý của mình. Đồng kính chúc quý thầy cô, anh chị của phòng kiểm nghiệm Sinh học tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 luôn dồi dào sức khỏe và đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017 Sinh viên, Trần Quang Phát
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO) 3 1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO) 3 1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen 4 1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay 5 1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới 5 1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen 7 1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam 11 1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam 12 1.3. Các phương pháp xác định cây trồng biến đổi gen 14 1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích 14 1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích 14 1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc 15 1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR 16 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 18 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 18 2.2. Vật liệu nghiên cứu 18 2.2.1. Nguồn mẫu 18 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 21 2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu 21 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA 21 2.3.4. Phản ứng PCR 24 2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel 28 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR 31 2.5. Bố trí thí nghiệm 32 2.5.1. Tách chiết DNA 32 2.5.2. Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR 32 2.5.3. Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp 34 2.6. Cải tiến phương pháp 36 2.7. Khảo sát mẫu thị trường 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1. Sản phẩm tách chiết DNA 38 3.2. Tối ưu hóa phản ứng PCR 39 3.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi 39 3.2.2. Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR 40 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong phản ứng PCR 42 3.3. Đánh giá hiệu lực phương pháp 44 3.4. Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR 46 3.5. Cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR 47 3.6. Kết quả khảo sát mẫu thực tế 49 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1. Kết luận 51 4.2. Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 1 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT g : microgam M : micromole/lít BĐG : Biến đổi gen Bp : base pair DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid Elisa : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU : European Union FMV : Virus dạng mosaic GM : Genetically Modified GMC : Genetically Modified Crop GMO : Genetically Modified Organism ISAAA : Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp IRRI : Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế LOD : Limit of detection mA : miliampe mM : milimol/lít PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) TBE : Tris-borate-EDTA Tm : Temperature melting U : Đơn vị tính hoạt tính của Taq polymerase UV : Ultra Violet V : Volt iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG SỬ DỤNG Bảng 2.1. Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13] 18 Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật 19 Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 22 Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR 27 Bảng 2.5. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 28 Bảng 2.6. Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 2.7. Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng 33 Bảng 2.8. So sánh kết quả thử khẳng định 35 Bảng 2.9. Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR 36 Bảng 2.10.Chương trình phản ứng Realtime - PCR 37 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát 42 Bảng 3.2. Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu 43 Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa 44 Bảng 3.4.Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn MON89788 5% 44 Bảng 3.5. Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp 45 Bảng 3.6. Diễn giải kết quả điện di 46 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm 4 Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo ISAAA 9 Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm 10 Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18] 11 Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus 19 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052 23 Hình 2.3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1] 27 Hình 2.4. Các bước trong kỹ thuật điện di [1] 29 Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường 39 Hình 3.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện dương tính GMO với các chủng vi sinh vật khác. 40 Hình 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO 41 Hình 3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO 41 Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA 43 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất 46 Hình 3.7. Kết quả khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn 48 Hình 3.8. Đường xác định nhiệt độ nóng chảy của kết quả real-time PCR khoảng 80ºC 48 Hình 3.9. Kết quả chạy điện di của sản phẩm Realtime – PCR 49 Hình 3.10. Kết quả mẫu xét nghiệm GMO thị trường. 50 v
  9. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học phát triển mở ra nhiều triển vọng cho cây trồng biến đổi gen. Với những lợi ích mà cây trồng biến đổi gen mang lại (kháng sâu bệnh, tăng năng suất, tăng giá trị dinh dưỡng ), cùng với những yêu cầu của con người ngày càng tăng về vấn đề an ninh lương thực, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng và đặc biệt là đối phó với sự biến đổi của khí hậu Cây trồng biến đổi gen được dự báo sẽ tiếp tục tăng trong những năm tới [7]. Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển cây trồng biến đổi gen, nhiều cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã có những nghiên cứu cơ bản ban đầu như: sàng lọc các gen hữu ích, thiết kế vector chuyển gen. Tới nay, đã có báo cáo kết quả ban đầu trong nghiên cứu cây chuyển gen đối với cây ngô, đậu tương, lúa, bông ở Việt Nam nhưng còn rất hạn chế. Công tác nghiên cứu, phát triển cây trồng biến đổi gen ngày càng mạnh mẽ hơn, đặc biệt khi việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đối với đa dạng sinh học và môi trường của các cây chuyển gen: ngô, bông vải và đậu tương với mục đích làm giống đã được Chính phủ cho phép. Tại thị trường Việt Nam, một số hạt giống ngô chuyển gen đã được cấp phép có nguồn gốc từ các công ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred đối với tính trạng kháng sâu và thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, bt11xGA21, MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507[28]. Các giống ngô này được phép trồng khảo nghiệm trên diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc. Mặc dù vẫn chưa có một khẳng định hợp pháp nào chứng minh thực phẩm biến đổi gen có hại cho sức khỏe. Người tiêu dùng chúng ta có quyền lựa chọn việc sử dụng hoặc không sử dụng thực phẩm biến đổi gen. Trước những tranh cãi như vậy, có thể chọn mua các thực phẩm được chứng nhận là không chứa biến đổi gen (Non- GMO) hoặc các thực phẩm hữu cơ - một loại thực phẩm hoàn toàn không chứa biến đổi gen GMO có chứng nhận hữu cơ, hoặc tìm hiểu các cách nhận biết, hay phòng tránh thực phẩm biến đổi gen trước khi có khẳng định chính thức từ loại thực phẩm này. Sản phẩm GMO đã có mặt trên thị trường Việt Nam nhưng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay GMO đã được quy định dán nhãn trên thị trường và được 1
  10. Đồ án tốt nghiệp phân tích phát hiện, định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau trong đó có phương pháp khuếch đại DNA (PCR). Hiện nay, đa số các phương pháp sàng lọc GMO dựa trên trình tự promoter 35S- CaMV và terminator NOS. Để mở rộng thêm các trình tự sàng lọc GMO, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện Genetically Modified Organism - (GMO) dựa trên trình tự promoter 34S-FMV”. Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4.  Mục đích nghiên cứu: Xây dựng hoàn chỉnh quy trình phát hiện GMO dựa trên trình tự promoter 34S- FMV với các thông số về giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu đạt yêu cầu sử dụng tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4.  Mục tiêu nghiên cứu: Để hoàn thiện phương pháp đáp ứng yêu cầu đưa vào áp dụng thực tế, đề tài bao gồm hai mục tiêu lớn: - Tối ưu các thông số để thực hiện phản ứng PCR như nồng độ MgCl2, nồng độ primer, nhiệt độ bắt cặp. - Xác định các thông số của phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác của phương pháp.  Nội dung nghiên cứu: - Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen và kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm tách chiết. - Khảo sát và tối ưu nồng độ primer, nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp của mồi nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR. - Đánh giá hiệu lực sử dụng của phương pháp thông qua các thông số: LOD, độ nhạy, độ đặc hiệu. - Áp dụng quy trình để phân tích một số mẫu ngoài thị trường. - Một số đề xuất cải tiến phương pháp. 2
  11. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu cây trồng biến đổi gen (GMO) 1.1.1. Khái niệm về cây trồng biến đổi gen (GMO) GMO (Genetically Modified Organism): sinh vật biến đổi gen, là một sinh vật mà vật liệu di truyền của nó đã bị biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người. Công nghệ này thường được gọi là “công nghệ sinh học hiện đại” hoặc “công nghệ gen”, đôi khi còn “công nghệ tái tổ hợp DNA” hoặc “kỹ thuật di truyền”. Nó cho phép chuyển các gen riêng lẻ từ một loài này sang một loài khác, cũng như giữa các loài không liên quan [16]. Ngoài ra cũng có thể có những sinh vật được tạo ra do quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên. Ví dụ quá trình lai xa giữa cỏ dại với cây trồng biến đổi gen có cùng họ hàng có thể tạo ra loài cỏ dại mang gen biến đổi. Sinh vật biến đổi gen có nhiều loại khác nhau. Nó có thể là các dòng lúa mỳ thương mại có gen bị biến đổi do tia điện từ hoặc tia phóng xạ từ những năm 1950. Nó cũng có thể là các động vật thí nghiệm chuyển gen như chuột bạch hoặc là các loại vi sinh vật bị biến đổi cho mục đích nghiên cứu di truyền. Tuy nhiên hiện nay, thông thường khi nói đến GMO người ta thường đề cập đến các cơ thể sinh vật mang các gen của một loài khác để tạo ra một dạng chưa hề tồn tại trong tự nhiên. GMC (Genetically Modified Crop) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số gene chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn [16]. Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền. Điểm khác biệt duy nhất giữa giống lai truyền thống và giống chuyển gen là vật liệu di truyền (DNA) được chọn lọc một cách chính xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại và chuyển vào giống cây trồng để đem lại một tính trạng mong muốn một cách có kiểm soát. Công nghệ gen có thể được sử dụng theo nhiều cách, ví dụ như kỹ thuật chống chịu stress(căng thẳng) phi sinh học như hạn hán, nhiệt độ cực đại hoặc độ mặn, và các stress sinh học, như côn trùng và mầm bệnh, thường có thể gây hại cho sự phát triển và tồn tại 3
  12. Đồ án tốt nghiệp của cây trồng. Công nghệ này cũng có thể được sử dụng để cải thiện hàm lượng dinh dưỡng của cây, một ứng dụng có thể được sử dụng đặc biệt ở các nước đang phát triển. 1.1.2. Lịch sử hình thành cây trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen được tạo ra lần đầu tiên vào năm 1982 bằng việc sử dụng loại cây thuốc lá chống kháng sinh. Những khu vực trồng thử nghiệm cây thuốc lá có khả năng chống thuốc diệt cỏ đầu tiên là ở Pháp và Hoa Kỳ vào năm 1986. Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ) là công ty đầu tiên phát triển cây trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả năng chống chịu côn trùng bằng cách biểu hiện các gen mã hóa protein diệt côn trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), được thành lập bởi Marc Van Montagu và Jeff Schell. Trung Quốc là quốc gia đầu tiên chấp nhận cây công nghiệp chuyển đổi gen với cây thuốc lá kháng virus được giới thiệu lần đầu vào năm 1992, nhưng rút khỏi thị trường Trung Quốc vào năm 1997 [25]. Hình 1.1. Gạo vàng, một loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được phê chuẩn bán ở Mỹ vào năm 1994 là cà chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu hơn các loại cà chua thông thường. Năm 1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn cây thuốc lá có khả năng chống thuốc diệt cỏ bromoxynil. Năm 1995, khoai tây Bt đã được phê duyệt an toàn bởi Cơ quan Bảo vệ Môi trường, trở thành cây nông sản kháng sâu đầu tiên được phê duyệt tại Hoa Kỳ. 4
  13. Đồ án tốt nghiệp Các loại cây trồng chuyển đổi gen sau đó cũng được chấp thuận giao dịch ở Mỹ vào năm 1995: cải dầu với thành phần chuyển đổi (Calgene), ngô bắp có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil (Calgene), bông kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Monsanto), bí kháng virus (Asgrow) và cà chua chín chậm (DNAP, Zeneca/Peto và Monsanto). Tính đến giữa năm 1996 đã có tổng cộng 35 phê chuẩn được cấp cho 8 loại cây công nghiệp chuyển đổi gen và 1 loại hoa cẩm chướng, với 8 điểm khác nhau tại 6 quốc gia cộng thêm EU. Năm 2000, lần đầu tiên các nhà khoa học đã biến đổi gen thực phẩm để gia tăng giá trị dinh dưỡng bằng việc sản xuất ra hạt gạo vàng. Đây là giống lúa chứa hàm lượng vitamin A cao hơn bình thường do Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) tạo ra. Đặc điểm của loại lúa này chứa hàm lượng beta-caroten rất lớn. Mục đích của các nhà khoa học khi tạo ra giống lúa siêu vitamin A chống bệnh về mắt hay thiếu hụt vitamin A [12]. 1.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam hiện nay 1.2.1. Xu hướng nghiên cứu cây trồng biến đổi gen trên thế giới 1.2.1.1. Cây trồng chống chịu thuốc diệt cỏ Nhiều loại cây trồng đã được biến đổi gen nhằm kháng lại thuốc diệt cỏ phổ rộng. Các cây trồng chuyển gen này chứa các gen giúp chúng phân hủy các thành phần hoạt động trong thuốc diệt cỏ, khiến chúng trở thành vô hại. Nông dân có thể dễ dàng loại bỏ cỏ dại trong suốt vụ mùa và thoải mái chọn lựa thời điểm phun thuốc. cây trồng kháng thuốc diệt cỏ không cần hoặc cần rất ít việc làm đất. Những người phản đối cho rằng việc sử dụng cây trồng kháng thuốc diệt cỏ có thể dẫn đến tăng sử dụng thuốc diệt cỏ, kích thích sự kháng thuốc diệt cỏ ở cỏ dại và hủy hoại đa dạng sinh học nông nghiệp. Gần đây, hai hệ thống cây trồng kháng thuốc diệt cỏ được phát triển đối với đậu nành, ngô, củ cải dầu và bông là: RoundupReady và Liberty Link. Một số sản phẩm thương mại của nhóm này là: 5
  14. Đồ án tốt nghiệp - GA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang gen kháng thuốc trừ cỏ). - Bt11xGA21 (Giống khảo nghiệm: giống ngô lai NK66 mang tổ hợp 2 gen: kháng sâu bộ cánh vảy và kháng thuốc trừ cỏ được tạo ra bằng phương pháp lai truyền thống) [28]. 1.2.1.2. Cây trồng kháng bệnh Các cây trồng có thể bị bệnh gây ta bởi các loài nấm, vi khuẩn, virus, giun tròn và các tác nhân khác. Nhiều các phương pháp công nghệ cao được đề xuất nhằm bảo vệ thực vật khỏi các tác hại này. Đến nay, hầu hết các mối quan tâm tập trung vào các thực vật chuyển gen kháng virus, nhưng việc sử dụng công nghệ sinh học để kháng nấm, vi khuẩn hay giun tròn cũng được quan tâm. Hai ví dụ về tăng trưởng cây GM thương mại trong lĩnh vực này là các cây kháng côn trùng thể hiện gen Bt (từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis) và đu đủ GM kháng virus [9]. 1.2.1.3. Thực vật với thành phần thay đổi Ngày càng nhiều giống cây trồng chuyển gen mới được khảo nghiệm với đặc tính tăng giá trị và chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu công nghiệp và của người tiêu dùng. Các thực vật chuyển gen mới với thành phần biến đổi đem lại nhiều lợi ích cho công nghiệp và người tiêu dùng. Chẳng hạn khoai tây với thành phần tinh bột biến đổi và các hạt dầu được dùng để thay thế các sản phẩm dầu mỏ là mối quan tâm của công nghiệp. Người tiêu dùng có nhiều lợi ích từ thế hệ cây trồng biến đổi gen tiếp theo, thế hệ của gạo với mức độ tăng cường cao của sắt, vitamin A hay dầu thực vật có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim 1.2.1.4. Cây trồng chống chịu áp lực Các nhà sinh học thực vật sử dụng công nghệ sinh học để hoàn thiện cách thức khiến các thực vật có thể thích nghi hơn với các thách thức môi trường như hạn hán, mặn hay nhiệt độ thích hợp. 6
  15. Đồ án tốt nghiệp - Chịu hạn: Một cách tạo ra thực vật chịu hạn là lấy gen từ thực vật có khả năng chịu hạn và chuyển vào cây trồng. Các thực vật hồi sinh (Xerophyta viscosa), nguồn gốc từ vùng khô hạn phía nam châu Phi, chứa gen mã hóa duy nhất một protein trong thành tế bào. Thực nghiệm chỉ ra rằng các thực vật nhận gen này có khả năng chịu áp lực của hạn hán và độ mặn cao [21]. - Chịu mặn: Các nhà nghiên cứu nhận ra rằng các thực vật có khả năng chịu mặn cao chứa nồng độ cao chất glycinebetaine. Hơn nữa, thực vật có khả năng chịu mặn trung bình có nồng độ trung bình và thực vật với khả năng chịu mặn thấp có ít hay không chứa chất glycinebetaine. Khoai tây chuyển gen với khả năng sản sinh nhiều glycinebetaine tăng khả năng chịu mặn. 1.2.1.5. Loại bỏ chất ô nhiễm Thực vật và vi sinh vật có thể được cải biến để tăng khả năng hấp thu kim loại nặng và phân hủy các sản phẩm dầu. Các biện pháp công nghệ sinh học được áp dụng để loại bỏ các chất ô nhiễm. Thực vật biến đổi gen được biến đổi để tích lũy nồng độ cao các kim loại độc. Một ví dụ của biện pháp này là sử dụng cây dương liễu với khả năng hút cadimi từ đất ô nhiễm. Kim loại độc này được rễ cây hút nhanh chóng và sau đó được dự trữ trong gỗ và lá để loại đi. Nhiều thực vật có khả năng hấp thu lượng nhỏ kim loại nặng. 1.2.2. Tình hình thương mại hóa cây trồng chuyển gen 1.2.2.1. Tình hình thương mại hóa trên thế giới Tỷ lệ canh tác cây trồng BĐG trong năm 2016 hồi phục lại mức cao với tổng diện tích 185,1 triệu ha trên toàn cầu. Năm 2016, sau hai thập kỷ thương mại hóa, 26 quốc gia đã trồng được 185,1 triệu ha cây trồng BĐG – tăng 5,4 triệu ha tương đương với 3% so với năm 2015. Ngoại trừ sự sụt giảm trong năm 2015, đây là lần tăng thứ 20 liên tiếp về tỷ lệ canh tác, trong đó đáng chú ý có 12 năm đạt mức tăng trưởng hai con số [11]. Cây trồng BĐG cung cấp lựa chọn đa dạng hơn cho người tiêu dùng. 7
  16. Đồ án tốt nghiệp Các cây trồng BĐG đã được mở rộng ngoài 4 loại cây chính (ngô, đậu nành, bông và cải dầu) nhằm mang tới nhiều lựa chọn hơn cho người tiêu dùng trên thế giới. Những loại cây BĐG mới này gồm củ cải đường, đu đủ, bí, cà tím và khoai tây cùng với sự xuất hiện của táo vào năm 2017. Khoai tây là giống cây trồng quan trọng và chủ lực thứ tư trên thế giới; còn cà tím là loại rau được tiêu dùng số một tại châu Á. Giống táo và khoai tây không thâm nâu có thể góp phần giảm lãng phí thực phẩm. Thêm vào đó, nghiên cứu thực hiện bởi các tổ chức công cộng đã đưa các cây trồng như gạo, chuối, khoai tây, lúa mì, đậu hồi, đậu triều, mù tạt và mía đường vào các giai đoạn đánh giá nâng cao, có khả năng cung cấp nhiều lựa chọn cho người tiêu dùng, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Các tính trạng và cây trồng BĐG mới đang được nghiên cứu và giới thiệu nhằm mang thêm lợi ích cho nông dân và người tiêu dùng. Đáng chú ý là các tính trạng và giống cây BĐG mới đang được thử nghiệm thực địa để cung cấp tới nông dân và người tiêu dùng. Các loại cây này bao gồm các giống trọng yếu như giống gạo vàng giàu beta-carotene đang được thử nghiệm tại Philippines và Bangladesh; giống chuối BĐG kháng virus đầu buồng trồng tại Uganda; giống chuối BĐG chống rầy nâu và giống lúa mì BĐG kháng bệnh, chịu hạn, biến đổi lượng dầu và cấu thành hạt đang được thử nghiệm tại Úc; giống lúa mỳ có sinh khối và sản lượng cao tại Anh; các giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Desiree và Victoria tại Uganda, cùng giống khoai tây kháng giun tròn và bệnh mốc sương Maris Piper, giống khoai tây ít thâm và ít acrylamide canh tác tại châu Âu; đậu triều và đậu hồi kháng sâu bệnh cùng mù tạt BĐG, vốn là các loại rau và nguồn dầu chủ lực, được thử nghiệm tại Ấn Độ; giống mía đường chịu hạn trồng tại Ấn Độ và Indonesia và cải camelina giàu omega-3 tại châu Âu [11]. Diện tích canh tác cây trồng BĐG toàn cầu tăng gần 110 lần, từ 1,7 triệu ha năm 1996 tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 – khiến cây trồng BĐG trở thành công nghệ cây trồng được ứng dụng nhanh nhất tại thời điểm hiện tại. Diện tích cộng dồn đạt 2,1 tỷ ha có được sau 21 năm (1996 – 2016) thương mại hóa cây trồng BĐG. Diện tích canh tác cây BĐG tại các quốc gia đang phát triển chiếm 54% diện tích canh 8
  17. Đồ án tốt nghiệp tác toàn cầu (99,6 triệu ha); trong khi diện tích này tại các nước công nghiệp chiếm 46% (85,5 triệu ha) [11]. Hình 1.2. Bản đồ diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới 2016 theo ISAAA Bốn loại cây trồng BĐG chủ lực gồm: đậu nành, ngô, bông và cải dầu là các giống BĐG được ứng dụng nhiều nhất tại 26 quốc gia. Diện tích canh tác đậu nành BĐG đạt mức cao nhất 91,4 triệu ha, tương đương 50% diện tích canh tác của tất cả các giống cây BĐG trên toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặc dù có sự sụt giảm nhẹ tương đương mức biên 1% so với năm 2015 (92,7 triệu ha), khu vực canh tác đậu nành vẫn giữ mức bền vững 91,4 triệu ha. Xét trên diện tích canh tác toàn cầu của từng 9
  18. Đồ án tốt nghiệp loại cây trồng riêng lẻ, trong năm 2016 có 78% đậu nành, 64% bông, 26% ngô và 24% cải dầu là giống cây BĐG [11]. Tính trạng biến đổi gen đơn chống chịu thuốc trừ cỏ trên cây đậu nành, cải dầu, ngô, cỏ linh lăng và bông hiện vẫn giữ ngôi vị thống trị với 47% diện tích canh tác toàn cầu. Tuy vậy, tỷ lệ này có xu hướng giảm đi, cùng với sự tăng lên của cây BĐG đa tính trạng (kết hợp tính trạng kháng sâu bệnh, chống cỏ dại và các tính trạng khác). Diện tích canh tác cây trồng với tính trạng kháng cỏ dại là 86,5 triệu ha năm 2016, chiếm 47% tổng diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Mặt khác, diện tích canh tác cây trồng đa tính trạng đã tăng 29% trong năm 2016, đạt 75,4 triệu ha từ 58,4 triệu ha năm 2015. Theo đó, cây trồng đa tính trạng hiện chiếm 41% diện tích canh tác toàn cầu (185,1 triệu ha). Ví dụ ở Hoa Kỳ, ngô GM kháng côn trùng được trồng trên diện tích 10,6 triệu ha và bao gồm 35% ngô (GM và không GM) trồng ở cả nước [6]. Hình 1.3. Diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế giới sau 20 năm 1.2.2.2. Tình hình cây trồng biến đổi gen tại Việt Nam Ở Việt Nam, các sản phẩm từ cây trồng biến đổi gen được nhập khẩu về có kiểm soát nhằm sử dụng chủ yếu trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Theo thống kê của Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong 9 tháng đầu năm 2015 nước ta nhập khẩu 2,59 tỷ USD thức ăn gia súc và nguyên liệu, trong đó thị trường nhập khẩu chính là Argentina (42% thị phần), Mỹ (14% thị phần), Brazil (7,8% thị phần) [22]. 10
  19. Đồ án tốt nghiệp Hiện tại Việt Nam cho phép nhập khẩu những loại thực phẩm biến đổi gen và được kiểm soát chặt chẽ đó là NK66 Bt; NK66 GT và NK66 Bt/Gt và Bt11, các event MON89788, MON87705, 40-3-2, MON87705, MON87701, MON87708 của đậu nành (Tham khảo tại phụ lục B, Danh mục cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen). Hình 1.4. Tình hình nhập khẩu đậu tương quý I năm 2017 [18] Đối với đậu tương, trong quý I năm 2017 đã nhập khẩu 137,1 nghìn tấn, trị giá 61,9 triệu USD, giảm 57,4% về lượng và giảm 52,1% về trị giá so với quý I năm 2016, tính riêng tháng 3/2017, nhập khẩu đậu tương tăng 27,8% về lượng và 28% về trị giá so với tháng 2/2017, đây cũng là tháng tăng đầu tiên sau hai tháng suy giảm liên tiếp đạt tương ứng 60,5 nghìn tấn, trị giá 27,3 triệu USD. 1.2.3. Các yêu cầu về dán nhãn sản phẩm GMO trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới có nhiều quốc gia cho phép nhập khẩu và sử dụng thực phẩm biến đổi gen. Mỗi quốc gia đều đặt ra những quy định dán nhãn riêng. Mỹ là một trong những quốc gia có yêu cầu cao về việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen GMO. Cụ thể, từ ngày 01/07/2016 tất cả các sản phẩm GMO bày bán tại bang Vermont (Mỹ) đều phải dán nhãn. Brazil hiện là nước sản xuất cây trồng GMO lớn thứ hai trên thế giới cũng yêu cầu dãn nhãn cho cả hai loại thực phẩm làm thức ăn cho người hoặc động vật nếu có chứa hoặc được sản xuất từ GMO. 11
  20. Đồ án tốt nghiệp Trong khi đó tại một số nước, việc quy định dán nhãn dựa trên tỷ lệ GMO trong một sản phẩm thực phẩm. Cụ thể, những nơi như Liên minh châu Âu, Ả-rập Saudi, Thổ Nhĩ Kỳ và Úc tỷ lệ GMO ở ngưỡng 0,9%. Các nước khác cho phép đưa GMO vào mức độ cao hơn như Hàn Quốc là 3% và Nhật Bản là 5% [27]. Theo thông tư liên tịch số 45 giữa Bộ Khoa học Công nghệ và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban hành cuối tháng 11/2015 thì từ 08/01/2016, thực phẩm GMO được đóng gói sẵn bắt buộc phải dán nhãn bằng tiếng Việt có ghi rõ “biến đổi gen”. Bên cạnh đó, với sản phẩm đóng gói sẵn có ít nhất một thành phần nguyên liệu GMO lớn hơn 5% tổng nguyên liệu được sử dụng đều phải ghi nhãn khi lưu thông tại thị trường Việt Nam. Đối với những sản phẩm có diện tích để ghi nhãn nhỏ hơn 10cm2 thì trên nhãn bắt buộc phải có tên hàng hóa và cụm từ “biến đổi gen”; những nội dung bắt buộc còn lại không thể hiện trên nhãn thì phải được ghi trong tài liệu kèm theo hàng hóa. Theo thông tư 45, một số trường hợp được miễn ghi nhãn GMO bao gồm: - Thực phẩm mang theo người nhập khẩu để tiêu dùng cá nhân trong định mức được miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi lãnh sự; thực phẩm tạm nhập tái xuất, thực phẩm quá cảnh, chuyển khẩu; thực phẩm gửi kho ngoại quan; thực phẩm là mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; thực phẩm là mẫu trưng bày hội chợ, triển lãm; - Nguyên liệu, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, bao bì chứa đựng thực phẩm, nhập khẩu về để sản xuất nội bộ không bán ra thị trường, chỉ vận chuyển nội bộ giữa các kho từ tỉnh này qua tỉnh khác thuộc cùng một hệ thống trong doanh nghiệp [5]. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen tại Việt Nam Công nghệ sinh học là một lĩnh vực còn mới ở Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng GMO mới đang bước những bước đầu tiên trong quá trình phát triển. Một vài nghiên cứu về GMO mới chỉ diễn ra trong quy mô phòng thí nghiệm và tập trung ở một số viện nghiên cứu đầu ngành trong cả nước thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Trong đó, 12
  21. Đồ án tốt nghiệp tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các nghiên cứu tạo GMO chủ yếu trên đối tượng vi sinh vật, thực vật, động vật và được tiến hành ở các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới. Tại Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các nghiên cứu thường được tiến hành trên đối tượng thực vật tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng song Cửu Long. Nhìn chung, trong quy trình nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng. Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng; gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ; gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại Các gen có giá trị y dược phải kể đến các gen mã hóa cho một số kháng nguyên của virus và vi khuẩn như gen mã hóa kháng nguyên E của virus Dengue typ I và typ II sử dụng trong chuẩn đoán sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue [23]. Song song với những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước. Trên đối tượng thực vật, hướng nghiên cứu hoàn thiện các phương pháp chuyển gen và các quy trình tái sinh cây khởi đầu cho những nghiên cứu chuyển gen có giá trị vào các đối tượng cây trồng cũng nhận được sự quan tâm của nhiều nhóm tác giả. Gần đây, hướng nghiên cứu nuôi cấy tế bào động vật nhằm hoàn thiện quy trình tiến tới sử dụng để biểu hiện gen trên tế bào động vật nuôi cấy cũng bắt đầu được tiếp cận nghiên cứu. 13
  22. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Các phƣơng pháp xác định cây trồng biến đổi gen 1.3.1. Phương pháp sử dụng protein như là đích phân tích Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù. Trong trường hợp này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein. Mức độ ái lực của các kháng thể đối với protein sẽ phụ thuộc vào cấu hình protein sau khi tách chiết. Tính đặc trưng của kháng thể được sử dụng cần được chứng minh (ví dụ: không có khả năng phản ứng chéo). Việc phát hiện sinh vật biến đổi gen qua phân tích dòng đặc hiệu bằng định lượng protein không thể thực hiện được chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện cùng một protein. Các phương pháp sàng lọc có thể có lợi cho việc đánh giá sản phẩm có chứa hay không chứa các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen dựa trên sự có mặt các protein biểu hiện. Các ví dụ về phương pháp sàng lọc là dạng mẫu que thử và ELISA định tính. Việc định lượng sinh vật biến đổi gen trong một loại chất nền nhất định có thể được thực hiện bằng các phương pháp dựa vào protein, chẳng hạn như phương pháp dùng ELISA. Phương pháp này có thể phù hợp với chất nền cần phân tích và các chất chuẩn có thể được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn để từ đó tính được hàm lượng protein trong mẫu thử nghiệm. 1.3.2. Phương pháp sử dụng DNA đích Đặc trưng của các phương pháp phân tích sử dụng DNA đích là để xác định sự có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào các tính chất cụ thể của trình tự DNA đích. Ứng dụng và phân loại khác của tính đặc hiệu như sau: Phương pháp dựa vào taxon đích: Tìm thấy các trình tự DNA trong một taxon đích, thường là một loài nhưng có thể là cấp phân loại nhỏ hơn hoặc cao hơn. Các phương pháp dựa vào taxon đích có thể dùng để đánh giá sự có mặt, chất lượng và số lượng DNA có nguồn gốc từ taxon và đôi khi được sử dụng như là một điểm chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Tính đặc hiệu cần được xây dựng bằng các số liệu thực nghiệm. 14
  23. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp sàng lọc tìm thấy: Các trình tự DNA đích trong một vài loài nhưng không nhất thiết trong toàn bộ các dòng biến nạp. Các trình tự này cũng được tìm thấy trong nguyên liệu không biến đổi gen, chẳng hạn do sự có mặt của virus và vi khuẩn tự nhiên. Các phương pháp sàng lọc giúp cho việc đánh giá sự có mặt hay không có mặt sản phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Ví dụ, phương pháp sàng lọc là định tính PCR để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV [3]. 1.3.3. Một số trình tự DNA đích được áp dụng phương pháp sàng lọc Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S của virus khảm súp lơ (CaMV): Do promoter 35S-CaMV có mặt trong một số thực vật biến đổi gen. Đoạn DNA 195bp trong promoter 35S-CaMV được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza sau khi tách (Phụ lục B, TCVN 7605:2005). Phát hiện trình tự kết thúc (terminator) trên gen nopalin synthaza (NOS) có nguồn gốc từ Agrobacterium tumefaciens: Do nhiều thực vật biến đổi gen có chứa trình tự NOS-terminator nên phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc sự có mặt của thành phần từ thực vật biến đổi gen. Đoạn DNA có kích thước 118bp nằm trong trình tự kết thúc (terminator) của NOS được khuếch đại bằng PCR và được phát hiện bằng điện di trên gel agaroza (Phụ lục B, TCVN 7605:2005). Phát hiện trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) FMV 34S ở cây cải dầu GM RT73. Do promoter 34S-FMV có mặt trong một số thực vật biến đổi gen. Virus dạng mosaic (FMV) là một phân đoạn, virus RNA sợi đơn (mạch âm) được xác định là tác nhân gây bệnh rêu mồi (Ficus carica) trên cây cải dầu. FMV có thể gây ra một loạt các triệu chứng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng, trong đó có lá úa biến dạng và khảm hoặc đổi màu hoa văn, cũng như khảm trên hoa quả non. Promoter FMV có chiều dài 196bp thường được chuyển các gen ở cây cải dầu, đậu nành. Sự hiện diện của promoter 34S-FMV có trong nhiều cây biến đổi gen, đặc biệt là trong hạt cải dầu, khoai tây, đậu nành, bông, cà chua, củ cải. Một số event được phát hiện bởi promoter 34S-FMV RT73 cải dầu, MON1445, MON1698 15
  24. Đồ án tốt nghiệp và MON88913 của vải, MON89788 ở đậu nành, H7-1 ở củ cải đường. Một số event không phát hiện được như đậu nành 40-3-3 và MON810, MON863, TC1507, giống ngô Bt11, GA21, NK603, Bt176 (Phụ lục B, ISO 21569:2005/2013). 1.3.4. Giới thiệu chung về phương pháp PCR Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.  Nguyên tắc: Đây là phương pháp invitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, đó là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:  Giai đoạn biến tính: tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành dạng mạch đơn.  Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.  Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang. Phương pháp này có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm thế giới. Hiện nay có nhiều phương pháp PCR cải tiến như nested PCR, PCR đẳng nhiệt, Realtime PCR. 16
  25. Đồ án tốt nghiệp Định nghĩa kỹ thuật Realtime PCR là một phương pháp khuếch đại gene và đọc kết quả được thực hiện đồng thời trong cùng một ống hay một giếng mẫu. Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xác định sự biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại. Nguyên tắc thực chất hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong suốt tiến trình phản ứng Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo ra bản sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự DNA khác nhau. Với nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần chạy mà không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện. Nhiệt độ gắn mồi phải được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để chúng có thể thực hiện chính xác trong một cặp bazo phải khác nhau để tạo ra các băng có thể phân biệt bằng mắt thường khi điện di [24]. Nested PCR làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để tạo ra các sản phẩm DNA, bên cạnh đoạn DNA đích mà phản ứng hướng đến vẫn có thể bao gồm các đoạn DNA khuếch đại không đặc hiệu. Các sản phẩm sau đó được sử dụng tiếp phản ứng PCR thứ hại với cặp mồi mà vị trí gắn khác hoàn toàn hoặc khác một phần từ vị trí 3 của mỗi mồi ở phản ứng đầu tiên. PCR lồng thường thành công hơn phản ứng PCR thông thường, đặc biệt trong trường hợp khuếch đại các đoạn DNA dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các trình tự đích [24]. 17
  26. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại phòng Kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4. Địa chỉ: 30 Hàm Nghi, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 03/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu 2.2.1.1. Nguồn mẫu xét nghiệm Mẫu đối chứng dương do phòng Kiểm nghiệm Sinh học cung cấp được thực hiện để đánh giá phương pháp. Mẫu được thu bên ngoài với 10 nguồn mẫu ngẫu nhiên để phân tích thực nghiệm bằng phương pháp. 2.2.1.2. Mồi phản ứng PCR Kích thước sản phẩm khuếch đại là 196bp Mồi xuôi FMV-F: 5 -AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3 Mồi ngược FMV-R: 5 -CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3 Bảng 2.1. Trình tự mồi có sẵn sử dụng trong nghiên cứu [13] Kích Tên Mã số Tm thước cặp Trình tự oligonucleotide Gen Bank khuếch mồi cặp mồi đại (bp) 5 -AAG CCT CAA CAA GGT CAG-3 FMV AR016589 52 - 65 196bp 5 -CTG CTC GAT GTT GAC AAG-3 2.2.1.3. Thang DNA Để ước lượng kích thước các đoạn DNA được khuếch đại, trong nghiên cứu này sử dụng loại thang 100bp Ladder Plus (Promega) bao gồm 11 vạch với kích thước như: 18
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus 2.2.1.4. Mẫu chuẩn GMO, chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu Mẫu sử dụng chính cho nghiên cứu và dùng làm đối chứng dương là các mẫu chuẩn dương GMO. Các vi sinh vật gây bệnh lan truyền qua đường thực phẩm khác cũng được sử dụng trong phần đánh giá hiệu lực sơ cấp của phương pháp và khẳng định độ đặc hiệu, tính chọn lọc của cặp mồi đã chọn. Bảng 2.2. Các chủng vi sinh vật Số STT Tính thuần Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu của chủng lượng 1 Chứng dương GMO MON89788 01 GMO Microbiologics 2 Norovirus GI 01 NoV-GII HE0013S Microbiologics 3 ng Norovirus GII 01 NoV-GI ủ HE0013S 4 ch n ầ Virus gây bệnh đốm trắng Kit IQ2000 01 WSSV 5 Thu Virus gây bệnh đầu vàng Kit IQ2000 01 YHV 6 Mengovirus ATCCVR-2310 01 MeV 7 Vibrio parahaemotilycus ATCC 17802 01 V.para 19
  28. Đồ án tốt nghiệp 8 Eschechiria coli ATCC 25922 01 E.coli 9 Salmonella Typhymurium ATCC 14028 01 S.typhi 10 Staphylococcus aureus ATCC 6538 01 S.aureus *ATCC là chủng vi sinh vật chuẩn. *Kit IQ2000 là bộ kit dùng để phát hiện các virus gây bệnh trên tôm, cá và đƣợc cung cấp bởi hãng GeneReach Biotecnology Corp (Đài Loan) bao gồm: virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV); virus gây bệnh đầu vàng (Yellow head virus-YHV). 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1. Hóa chất - Lysis Buffer - Protein K nồng độ ≥ 30U/mg - Binding Buffer - Pre - Wash Buffer - Wash Buffer - Ethanol - Elution - Nuclease - Free Water - Buffer phản ứng (5X Colorless GoTaq Flexi Buffer) - MgCl2 25mM - dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix) - Mồi xuôi (Upstream primer) - Mồi ngược (Downstream primer) - Gotaq G2 Hot Start Polymerase - Đệm TAE 1X (4,48g Tris; 2ml Na2EDTA 0,5M pH 8; 1,14ml glacial acetic acid; nước cất đủ 1000ml) - Agarose phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR - Dung dịch nạp mẫu Blue/Orange Loading Dye 6X, thuốc nhuộm Dynamid Nucleotid Dye 6X 20
  29. Đồ án tốt nghiệp - Bộ Kit TaKaRa EX Taq 2.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị - Cân kỹ thuật (d = 0,01gram) - Cân phân tích (d = 0,0001gram) - Tủ ấm 37ºC - Bể ổn nhiệt - Nồi hấp - Tủ sấy - Tủ bảo quản hóa chất 2 - 8ºC - Tủ bảo quản chủng -30ºC - Tủ an toàn sinh học Nuve MN120 - Máy vortex - Máy PCR (Applied Biosystems ABI 2720 Thermal Cycler) - Bộ điện di DNA liền nguồn Mupid-eXU - Bộ chụp ảnh điện di (ATTO) và Video Graphic Printer - Pipet, transferpipet các mức 1-10l; 10-100l; 100-1000l - Máy đo OD 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu mẫu Mẫu được thu và cắt đủ lượng tách chiết và đựng trong các ống falcon, lưu trữ trong tủ lạnh -30ºC. 2.3.2. Phương pháp bảo quản mẫu Mẫu dư sau khi phân tích được bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4ºC hoặc bảo quản trong cồn. 2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA 2.3.3.1. Hóa chất tách chiết Tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052 tách chiết DNA: Proteinase K, đệm ly giải (Lysis buffer), đệm gắn kết (Binding buffer), đệm 21
  30. Đồ án tốt nghiệp rửa 1 (Pre-Wash buffer), đệm rửa 2 (Wash buffer), đệm ly giải DNA (Elution buffer). Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA Hóa chất Tác dụng Đệm ly giải Dung dịch đệm phá vỡ cấu trúc tế bào (Lysis buffer) Proteinase K Thủy phân protein, đặc biệt là protein liên kết với DNA. Đệm gắn kết Thu acid nucleic (Binding buffer) Đệm rửa 1 Rửa sản phẩm không mong muốn (Pre-Wash buffer) Đệm rửa 2 Rửa sạch sản phẩm tạp còn lại (Wash buffer) Đệm ly giải DNA Tủa protein, đẩy lipit lên bề mặt dung dịch, tạo thuận lợi (Elution buffer) cho việc thu nhận DNA 2.3.3.2. Cách thực hiện tách chiết Bước 1: Chuẩn bị 50mg mẫu sau đó thêm vào 400l đệm ly giải và 20l Proteinase K Bước 2: Đem mẫu đi ủ ở nhiệt độ 65ºC trong thời gian 30 phút, ly tâm 12000 vòng/phút. Bước 3: Bỏ cặn thu dịch DNA, sử dụng cột lọc Receiver Tube tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút Bước 4: Bổ sung 200l đệm gắn kết ly tâm 12000 vòng/phút bỏ dịch thu lại cột lọc Bước 5: Thêm 550µl đệm rửa 1 rửa lần một, ly tâm 12000 vòng/phút Bước 6: Thêm 550l đệm rửa 2 rửa lần hai, ly tâm 12000 vòng/phút loại bỏ nước 22
  31. Đồ án tốt nghiệp Bước 7: Ủ 100l đệm ly giải DNA ở 65ºC, giữ ở nhiệt độ này. Cho vào cột lọc ly tâm 10000 vòng/phút thu dịch DNA. 2.3.3.3. Quy trình chung tách và tinh sạch DNA bằng Kit SureFood PREP Basic Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052  Lưu ý: - Cần ủ 100µl đệm ly giải DNA ở nhiệt độ 65ºC trước khi tách chiết DNA. - Bật máy heat nhiệt (gia nhiệt) trước khi tách chiết. - Lấy Proteinase K trong tủ đông khi sử dụng, tránh để môi trường ngoài. 23
  32. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.4. Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích Mẫu DNA ly trích được điện di trên gel Agarose 1% trong dung dịch đệm TBE1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV, Diamond Dye đã liên kết với sợi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch trên gel. Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích, có thể tiến hành tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 thì mẫu ly trích được xem là sạch. Nếu tỷ lệ 2,0 thì cần tiến hành pha loãng mẫu và thực hiện đo lại giá trị OD. 2.3.4. Phản ứng PCR 2.3.4.1. Khái niệm Kỹ thuật PCR được phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự. Phát minh này đã đem đến cho Millis giải Nobel Hóa học năm 1993. PCR là phương pháp khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu invitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lượng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ được thu nhận từ DNA mẫu. 2.3.4.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR  Mẫu DNA: Mẫu DNA sẽ được ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thường được ly trích từ mô lá, DNA động vật thường được ly trích từ máu, lông, mô Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao, tuy nhiên để thu được kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 - 10ng. Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ đo OD (mật độ quang) ở bước sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức: - 1 OD260nm = 50 ng/µl (đối với DNA sợi kép). 24
  33. Đồ án tốt nghiệp - 1 OD280nm = 40 ng/µl (đối với DNA sợi đơn).  Primer (mồi): Là một đoạn nucleotide có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngược). Cặp primer sẽ quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR, nếu primer được thiết kế đúng thì đoạn DNA đích mới được khuếch đại chính xác.  dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP): Nồng độ dNTPs thường được sử dụng là 20 - 200µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự ức chế phản ứng. Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Thông thường thì nồng độ của các dNTPs sẽ là như nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTPs thích hợp cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ưu cho từng phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.  Dung dịch buffer: Tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động.  Taq polymerase: Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 90ºC ở giai đoạn biến tính tách hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được. Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,1 - 0,5 đơn vị/100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong muốn có 25
  34. Đồ án tốt nghiệp thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3 của sản phẩm PCR, điều này rất quan trọng trong việc tạo dòng (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu  Ion kim loại Mg2+: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.3.4.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR Phản ứng PCR thường được thực hiện qua 35 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bước: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài). Giai đoạn denature (biến tính DNA): thường được tiến hành ở nhiệt độ từ 94 - 98ºC, trong 40 - 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài của DNA mẫu). Đây là bước làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ bằng cách phá vỡ các liên kết hydro. Giai đoạn annealing (gắn mồi): 50 - 60ºC trong 30 giây. Đây là bước primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (lúc này ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào độ dài của từng cặp primer. Giai đoạn extension (kéo dài): 72ºC, 30 - 90 giây tùy thuộc độ dài DNA đích. Đây là bước kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ở nhiệt độ 72ºC, hoạt động của Taq polymerase sẽ đạt hiệu quả tối ưu. Sau 25 - 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72ºC trong 5 - 20 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 26
  35. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [1] 2.3.4.4. Chương trình phản ứng PCR Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR Nhiệt độ Bƣớc Số chu kỳ Thời gian (giây) (ºC) 1 1 95 300 2 95 30 3 40 55 - 65 30 4 72 60 5 1 72 420 6 1 4 (giữ lạnh cho tới chạy điện di) 27
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.5. Thực hiện phản ứng PCR Các thí nghiệm phân tích FMV bằng phản ứng PCR đều được thực hiện với thể tích phản ứng là 25µl trong ống eppendorf 0,2ml của bộ Kit TaKARa EX Taq với thành phần hỗn hợp phản ứng chưa tối ưu hóa như trong bảng: Bảng 2.5. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR STT Hóa chất Nồng độ một phản ứng Thể tích hút (µl) 1 Bufer 10X 1X 2,5 2 MgCl2 25mM 1 – 4 mM 1 – 4 3 dNTP 0,2mM mỗi dNTP 2,0 4 Mồi Xuôi 0,1 - 1µM 0,2 – 2,5 5 Mồi Ngược 0,1 - 1µM 0,2 – 2,5 6 Tag Polymerase 5U/µl 0,1 7 Nuclease-Free Water / Vừa đủ 25µl Tiến hành nạp 3µl dịch DNA vào ống mastermix PCR. Nhẹ nhàng vortex bằng pipet, tránh tạo bọt, ly tâm nhẹ (spin) để toàn bộ hỗn hợp này di chuyển vào đáy ống eppendorf và tiến hành chương trình nhiệt cho phản ứng PCR. 2.3.4.6. Ưu nhiệt điểm của phản ứng PCR  Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA để thực hiện.  Nhược điểm: Do quá nhạy nên có thể cho kết quả dương tính giả: trong một số trường hợp cây bị nhiễm bệnh hoặc ngoại nhiễm DNA từ môi trường thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính. Do đó, nếu cần thiết nên sử dụng thêm các phương pháp nhận dạng sản phẩm PCR như: giải trình tự, dùng enzyme cắt hạn chế 2.3.5. Kỹ thuật điện di trên gel Nguyên tắc chung của kỹ thuật điện di: trong cùng một điện trường, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào kích thước và điện tích của chúng. 28
  37. Đồ án tốt nghiệp Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực trái dấu nhanh hơn. Hình 2.4. Các bước trong kỹ thuật điện di [1] Đối với DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleotide đi qua. Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel thường được sử dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử nucleotide: gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agarose: Lỗ có đường kính trung bình, cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước 100 - 1000bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.  Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thước dưới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt đến 1 nucleotide. Lưu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên cần phải cẩn thận khi sử dụng. 29
  38. Đồ án tốt nghiệp Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta sử dụng một số phương pháp phát hiện sau:  Đối với gel agarose: Nhuộm bằng Diamond Dye, chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại (UV). Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.  Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Ngoài ra, các phân tử DNA còn có thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Trong nghiên cứu chỉ sử dụng phương pháp điện di trên agarose nhằm kiểm tra kết quả tách chiết DNA và phân tích sơ bộ sản phẩm PCR. Chuẩn bị gel agarose 2% bằng cách cân 2g agarose vào chai thủy tinh 250ml, thêm vào 100ml đệm TAE 1X, đun bằng lò vi sóng (microware) trong 3 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều. Để nguội đến khoảng 60ºC. Nhẹ nhàng cho hỗn hợp gel này vào trong khay đổ gel đã chuẩn bị sẵn cùng với các lược tạo giếng. Để yên trong khoảng 60 phút để cho gel được đông đặc hoàn toàn. Bề dày của gel sau khi đông đặc đạt khoảng 0,7 - 0,8cm. Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, đặt khuôn gel vào bồn điện di. Cho dung dịch đệm điện di TAE 1X vào bồn cho đến khi ngập gel. Dùng pipet nhẹ nhàng trộn đều 3µl dung dịch nạp mẫu (Loading Buffer 6X) và 10µl sản phẩm PCR, nạp mẫu vào mỗi giếng trên gel điện di. Gel agarose 2% chứa sản phẩm khuếch đại sau khi được điện di sẽ tiến hành nhuộm với dung dịch TAE 1X chứa thuốc nhuộm DNA (Orange Loading Dye 6X) với tỷ lệ 10:1. Thời gian nhuộm từ 15 - 25 phút. Trong quá trình phân tích luôn dành một giếng cho thang DNA chuẩn (DNA marker) hay mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Thực hiện điện di ở 100V trong 40 phút. Sản phẩm khuếch đại được xem và chụp ảnh bằng bộ thiết bị ATTO và Video graphic Printer (Sony). 30
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.4. Xác nhận hiệu lực phƣơng pháp phân tích GMO bằng kỹ thuật PCR Mục tiêu khảo sát nhằm đánh giá, xác định đầy đủ các thông số kỹ thuật của phương pháp định tính đã được xây dựng trong nghiên cứu này, bao gồm: Giới hạn phát hiện (LOD50) Độ chính xác Độ nhạy Tỷ lệ âm tính giả Tỷ lệ dương tính giả Các thông số kỹ thuật này được xác định theo hướng dẫn xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh vật tại ISO/TS 16140:2003 và sổ tay hướng dẫn tính toán các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp sinh học phân tử do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm Thủy sản - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam ban hành [2]. Một số khái niệm: LOD: lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không cần thiết phải định lượng, như đã được chứng minh bằng thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác. LOD50 là lượng tối thiểu của chất cần phân tích mà phương pháp có khả năng phát hiện 50%. Độ chính xác: mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm và giá trị quy chiếu được chấp nhận. Độ nhạy (sensitivity): sự thay đổi kết quả do sự thay đổi tương ứng của nồng độ trong đồ thị chuẩn. Độ đặc hiệu (specificity) hay tỷ lệ âm tính thật là thương số của d với (b+d): số trường hợp âm tính và kết quả test âm tính trên tổng số trường hợp âm tính. Giá trị tiên đoán dương (positive predictive value, PPV) là thương số của d với (b + d): số trường hợp dương tính và có kết quả test dương tính trên tổng số trường hợp có kết quả test dương tính. 31
  40. Đồ án tốt nghiệp Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value, NPV) là thương số của a với (a+c): số trường hợp âm tính và có kết quả test âm tính trên tổng số trường hợp có kết quả âm tính. 2.5. Bố trí thí nghiệm 2.5.1. Tách chiết DNA Sử dụng mẫu bột thô làm đối chứng dương cho event FMV. Tiến hành tách chiết theo quy trình tách chiết của hang SureFood PREP Basic, DNA sau khi tách chiết được bảo quản trong tủ âm 30ºC. Mẫu DNA ly trích được điện di bằng bộ điện di BIO-RAD trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 400mA trong 35 phút. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA để kiểm tra sản phẩm. Các mẫu có nồng độ DNA quá cao sẽ được pha loãng bằng TE và kiểm tra lại bằng điện di. 2.5.2. Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR 2.5.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi Khảo sát nhằm mục đích khẳng định thêm tính chuyên biệt của cặp mồi bằng cách chạy phản ứng với 9 mẫu tách chiết DNA của các chủng vi sinh vật khác và 1 mẫu dương GMO của FMV và 1 mẫu đối chứng trắng (không có khuôn DNA). 2.5.2.2. Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi Với thí nghiệm này, sử dụng bộ Kit thành phần của TaKaRa EX Taq cho phép khảo sát nồng độ MgCl2 tại các mức 1,0 - 1,2 - 1,5 - 1,8 - 2,0. Bố trí thí nghiệm: - Tiến hành pha mastermix phản ứng PCR khảo sát đồng thời MgCl2 và mồi. Mỗi 1 ống phản ứng PCR chứa 1 nồng độ MgCl2 và 1 nồng độ mồi. Do đó, tổng số phản ứng PCR cần cho việc tối ưu đồng thời MgCl2 và mồi là 20 phản ứng. - Kết quả thí nghiệm được diễn giải dựa trên ảnh bảng gel điện di. Dựa vào sự có mặt hay không, độ sáng rõ và vạch đặc trưng của sản phẩm tương đương kích thước 196bp xuất hiện trên bảng điện di. Từ đó, tìm ra được thông số MgCl2 và mồi 32
  41. Đồ án tốt nghiệp tối ưu cho phản ứng PCR. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ mồi, nồng độ MgCl2 được tổng hợp vào Bảng 2.6. Bảng 2.6. Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành phần phản ứng PCR Nồng độ MgCl2 (mM) Khảo sát tối ưu 2 mục tiêu 1,0 1,2 1,5 1,8 2,0 0,4 Nồng độ mồi 0,2 (M) 0,1 0,05 Chương trình phản ứng Bảng 2.4 và thành phần cho một phản ứng PCR 25µl ở bảng 2.4 Nhiệt độ bắt cặp được sử dụng là 55ºC. Đây là nhiệt độ đảm bảo có sự bắt cặp dễ dàng giữa primer và mạch khuôn DNA; nhưng hạn chế là có độ chuyên biệt giữa primer và khuôn DNA thấp, dễ xuất hiện vạch không mong muốn. Thang điểm đánh giá trong bảng khảo sát tối ưu cho nồng độ mồi và nồng độ MgCl2 lên phản ứng PCR như sau: - Không có vạch sản phẩm mục tiêu: (-) - Độ sáng rõ của vạch sản phẩm mục tiêu: Mờ (+) Sáng (++) Rất sáng (+++) - Có vạch sản phẩm mục tiêu và có vạch tạp: (*) 2.5.2.3. Tối ưu hóa nhiệt độ phản ứng Với thí nghiệm này thì chúng tôi sẽ thử nghiệm nhiều mức nhiệt độ khác nhau trên cùng một cặp mồi với nồng độ MgCl2 đã tối ưu . Tiến hành pha Master mix để khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Thực hiện khảo sát các mức nhiệt độ 55ºC, 58ºC, 60ºC, 62ºC, 65ºC. Bảng 2.7. Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng 33
  42. Đồ án tốt nghiệp Bƣớc Số chu kì Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây) 1 1 95 300 95 30 2 40 55 - 58 - 60 - 62 - 65 30 72 60 3 1 72 420 4 1 4 ∞ Ở thí nghiệm này nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi sẽ được cố định dựa trên kết quả của thí nghiệm trước. Mỗi nhiệt độ sẽ khảo sát lặp lại 3 lần. 2.5.3. Đánh giá các thông số kĩ thuật phương pháp 2.5.3.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD50) Dịch chuẩn mẫu trong ống chứa ban đầu khoảng 5% GMO (về khối lượng). Tiến hành chuẩn bị dãy nồng độ pha loãng nhị phân từ ống chứa dịch chuẩn ban đầu. Chuẩn bị nền mẫu cho thí nghiệm: nền mẫu sử dụng cho phân tích là mẫu âm tính với GMO. Thực hiện 10 lần lặp lại cho một độ pha loãng, nhằm xác định tỷ lệ phát hiện mật độ mà tại đó cho kết quả dương tính của phương pháp đã được xây dựng. Kết quả sẽ được tính theo công thức Spearman-Karber như sau: log(LOD50) = L - d(∑Pi – 0,5) = m LOD50 = 10m Với độ tin cậy 95%, LOD50 nằm trong khoảng: (10m - 2SQRT (Um); 10m + 2SQRT(Um)) Trong đó: LOD50: Giới hạn phát hiện của phương pháp L: Log của nồng độ GMO thấp nhất mà tại đó 100% số lần lặp lại cho kết quả dương tính d: Hệ số của nồng độ pha loãng (d = 2) Pi: Tỉ lệ mẫu cho kết quả phát hiện dương tính trong khoảng (50% ≤ Pi ≤ 100%) tương ứng với nồng độ pha loãng thứ i 34
  43. Đồ án tốt nghiệp Um : ước lượng sai số của m, với Um = d2∑(Pi(1- Pi)/(n-1)) n: Số lần lặp lại đối với nồng độ pha loãng thứ i (n = 10) 2.5.3.2. Độ chính xác Độ chính xác là mức độ tương đồng giữa 2 kết quả thử nghiệm thu được bằng phương pháp cần thẩm duyệt và phương pháp tham chiếu trên cùng một mẫu đã được đồng nhất. Số mẫu sử dụng cho phân tích thường là 60 mẫu và phải có ít nhất 20 kết quả dương tính và 20 kết quả âm tính được phân tích bằng phương pháp tham chiếu. Mỗi mẫu đều phải được phân tích bởi cả 2 phương pháp: phương pháp tham chiếu và phương pháp cần thẩm duyệt. Nguyên tắc chung là sử dụng 2 dòng vi sinh vật (dòng mục tiêu và dòng không phải mục tiêu) ở 3 nồng độ cấy: L0 = mẫu chứng âm, L1 = mẫu chứa dòng mục tiêu và L2 = mẫu chứa dòng không phải mục tiêu có nồng độ gấp 10 - 100 lần dòng mục tiêu. Độ chính xác (%)= a d 100 a b c d 2.5.3.3. Độ nhạy Độ nhạy là khả năng phát hiện ra vi sinh vật đích của phương pháp cần thẩm duyệt so với phương pháp tiêu chuẩn hoặc so mẫu dương tính biết trước. Việc tính toán được thực hiện bằng cách dùng các dữ liệu thu được khi đo độ chính xác sau khi khẳng định. a 100 Độ nhạy (%) SE = a c Giá trị chấp nhận được là > 95% Bảng 2.8. So sánh kết quả thử khẳng định Kết quả chuẩn bị mẫu Phƣơng pháp Kết quả dương tính Kết quả âm tính cần (+/ ) (-/ ) 35
  44. Đồ án tốt nghiệp thẩm duyệt Kết quả dương tính ( /+) +/+ (a) -/+ (b) Kết quả âm tính ( /-) +/- (c) -/- (d) (a): +/+ : Dương tính thật (b): -/+ : Dương tính giả (c): +/- : Âm tính giả (d): -/- : Âm tính thật 2.5.3.4. Độ đặc hiệu Là khả năng không phát hiện được vi sinh vật đích bằng phương pháp cần thẩm duyệt khi chúng không bị phát hiện bằng phương pháp tham chiếu hoặc so với mẫu âm tính biết trước. Giá trị chấp nhận được là > 95%. (b 100) Độ đặc hiệu (%) = (b d) 2.5.3.5. Tỷ lệ Âm tính giả (False negative) và Dương tính giả (False positive) Âm tính giả (FN) là kết quả khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa vi sinh vật mục tiêu của phương pháp nhưng kết quả của phương pháp đó cho âm tính. Dương tính giả (FP) là kết quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa vi sinh vật mục tiêu nhưng kết quả của phương pháp đó cho dương tính. Tỷ lệ dương tính giả: FP = (1 – Độ đặc hiệu) x 100% Tỷ lệ âm tính giả: FN = (1- Độ nhạy) x 100% 2.6. Cải tiến phƣơng pháp Sau khi hoàn thành các bước khảo sát và tối ưu cho phản ứng ứng PCR. Chúng tôi thử nghiệm cải tiến phương pháp bằng phản ứng Realtime – PCR. Chúng tôi sử dụng bộ kit GoTaq® qPCR Master Mix, mỗi phản ứng có 25µl và thành phần phản ứng như bảng 2.8 Bảng 2.9. Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR 36
  45. Đồ án tốt nghiệp Tên hóa chất Thể tích hút (µ) MasterMix 2x 12.5 Nuclease-Free Water 8.5 Primer R 0.5 Primer F 0.5 Mẫu dương 3 Bảng 2.10. Chương trình phản ứng Realtime - PCR Bƣớc Nhiệt độ Thời gian 1 95 5 phút 2 95 30 giây 3 60 1 phút Đo phát quang sau mỗi lần kéo dài (bước 3), chạy với 45 chu kì ở bước 2, 3 2.7. Khảo sát mẫu thị trƣờng Sau khi hoàn thiện và đánh giá phương pháp, tiến hành kiểm tra 10 mẫu thị trường. Những mẫu thực phẩm này có nguồn gốc là các cây trồng đã được biến đổi gen trên thế giới. Các mẫu được sử dụng như sau : cà chua, khoai tây, cám gia cầm, ngô, gạo, đậu nành, bột bắp, bột khô Các nguồn mẫu được lấy từ mẫu xét nghiệm tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 và ở các chợ địa bàn thành phố Hồ Chí Minh. 37
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Sản phẩm tách chiết DNA Tách chiết DNA là bước khởi đầu rất quan trọng, quyết định sự thành công của phản ứng PCR sau này. Bước đầu trong quy trình tách chiết sử dụng Lysis Buffer là chất tẩy rửa mạnh giúp phá vỡ thành tế bào và màng nhân, giải phóng nhiễm sắc thể có chứa DNA. Kết hợp với Proteinase K giúp thủy phân protein liên kết với DNA của nhiễm sắc thể, giải phóng DNA vào dung dịch. Tiếp theo sử dụng Binding Buffer kết hợp với ly tâm nhẹ sẽ giúp tủa protein, đẩy lipid lên bề mặt dung dịch, tạo thuận lợi cho việc thu nhận DNA ở khoảng giữa eppendoft. Bước sử dụng đệm rửa Pre-Wash có pha cồn, kết hợp ly tâm và ủ ở nhiệt độ thấp sẽ giúp tủa DNA, rửa lại với Wash Buffer kết hợp ly tâm sẽ giúp rửa sạch protein, polysaccharide và lipid còn sót lại. Cuối cùng bảo quản DNA đã tinh khiết bằng dung dịch Elution ổn định và tan đều trong dung dịch. Với nồng độ OD đo được của mẫu chứng dương GMO được tách từ bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052 như sau:  Độ tinh sạch - Mẫu chứng dương (5% GMO): OD260/280 = 1,875 - Mẫu thị trường: OD 260/280= 2,032  Giá trị OD 260 1mm: + Mẫu chứng dương (5% GMO):OD260= 0,5534 + Mẫu thị trường: OD 260= 2,2344  Giá trị OD 280 1 mm + Mẫu chứng dương (5% GMO): OD280= 0,295 + Mẫu thị trường: OD 280= 1,0992 Với các mẫu thị trường là những mẫu thu thập nghi ngờ thực phẩm biến đổi gen.  Nồng độ DNA đo được - Mẫu chứng dương (5% GMO): 276,7ng/µl - Mẫu thị trường: 1117,2ng/µl 38
  47. Đồ án tốt nghiệp Với kết quả đo được kiểm tra đại diện mẫu DNA tách chiết bằng phương pháp điện di trên gel agarose, kết quả thể hiện ở hình 3.1 Hình 3.1. Kết quả điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường L thang chuẩn 100bp, giếng 1 nồng độ DNA gốc, giếng 2 nồng độ DNA pha loãng 10 lần Từ hình 3.1 cho thấy quy trình tách chiết theo mục 2.3.3.3 các giá trị thu được đều nằm trong ngưỡng chấp nhận 1,8 - 2,0 và không tạp nhiễm protein. Trường hợp mẫu ngoài thị trường có giá trị OD cao do nồng độ DNA sau tách chiết, được thể hiện ở bảng điện di (giếng 1), do đó khi thực hiện phản ứng PCR cần thực hiện với mẫu pha loãng và mẫu không pha loãng. 3.2. Tối ƣu hóa phản ứng PCR 3.2.1. Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi Khảo sát nhằm mục đích khẳng định thêm tính chuyên biệt của cặp mồi đã chọn sau khảo sát in silico bằng các công cụ sinh tin học trên NCBI. Khảo sát được thực hiện bằng thực nghiệm với 10 chủng vi sinh vật, bao gồm: - 5 chủng virus là: hepatitis A virus, Norovirus GI, Norovirus GII, virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (YHV), Mengovirus. 39
  48. Đồ án tốt nghiệp - 4 chủng vi sinh khuẩn là: Salmonella Typhymurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus. Thông tin chi tiết về các chủng vi sinh vật này được trình bày trong Bảng 2.2. - 1 mẫu GMO dương tính và 1 mẫu đối chứng không khuôn. Tiến hành phản ứng PCR với mẫu là 10 chủng như Bảng 2.2. Các thông số về điều kiện phản ứng PCR được trình bày tại bảng 2.3, 2.4, cụ thể như sau: nồng độ các mồi trong phản ứng PCR tương ứng là 1,5mM và 0,4μM; nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn là 60ºC. Kết quả quả khảo sát thể hiện ở hình sau: Hình 3.2. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện dương tính GMO với các chủng vi sinh vật khác. L: Thang chuẩn 100bp; 1: Dương GMO; 2: E.coli; 3: S.aureus; 4: V.para; 5: S.typhi; 6: NoV-GI; 7: NoV-GII; 8: WSSV; 9: YHV;10: HAV; (-): mẫu chứng trắng. Kết quả Hình 3.2 thấy được cặp mồi sự dụng khuếch đại gen mục tiêu mẫu chứng dương GMO và không có bất kì sản phẩm khuếch đại nào với các chủng vi sinh vật khác. Cặp mồi có tính chuyên biệt phát hiện thực phẩm biến đổi gen có chứa trình tự promoter 34S- FMV. 3.2.2. Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR Khảo sát nhằm mục đích xác định đồng thời 2 thành phần của phản ứng PCR là MgCl2 và mồi. Hai thành phần này được khảo sát theo bộ Kit thành phần TaKaRa Ex Taq. Nồng độ MgCl2 khảo sát tại các mức: 1,5 - 2 – 2,5 – 3 – 3,5mM. Nồng độ mồi khảo sát tại các mức: 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4μM. 40
  49. Đồ án tốt nghiệp Khảo sát được thực hiện trên dịch chiết DNA từ mẫu dương chuẩn có nồng độ 5%. DNA đã được tinh sạch và tiến hành bước phản ứng PCR với thành phần phản ứng, chương trình phản ứng và nồng độ MgCl2 đã tối ưu ở mục 3.2.2 Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.6. Chương trình phản ứng PCR như Bảng 2.4 với nhiệt độ bắt cặp mồi được chọn mặc định là 55ºC. Hình 3.3. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO Với 1 MgCl2: 1,0mM; primer: 0,05μM, 2 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,05μM, 3 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,05μM, 4 MgCl2:1,8mM; primer: 0,05μM, 5 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,05μM, 6 MgCl2: 1,0mM; primer: 0,4μM,7 MgCl2:1,2mM; primer: 0,4μM, 8 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,4μM, 9 MgCl2: 1,8mM; primer: 0,4μM, 10 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,4μM, đối chứng âm (-). Hình 3.4. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 và nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát hiện GMO Với 1 MgCl2: 1,0mM; primer: 0,1μM, 2 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,1μM, 3 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,1μM, 4 MgCl2: 1,8mM; primer: 0,1μM, 5 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,1μM, 6 MgCl2: 41
  50. Đồ án tốt nghiệp 1,0mM; primer: 0,2μM, 7 MgCl2: 1,2mM; primer: 0,2μM, 8 MgCl2: 1,5mM; primer: 0,2μM, 9 MgCl2: 1,8mM; primer: 0,2μM, 10 MgCl2: 2,0mM; primer: 0,2μM, đối chứng âm (-). Bảng 3.1. Kết quả khảo sát Khảo sát tối ưu 2 Nồng độ MgCl2 (mM) mục tiêu 1,0 1,2 1,5 1,8 2,0 0,05 - + + + + Nồng độ mồi 0,1 +* +* ++* ++* +++* (M) 0,2 ++ ++ +++ +++* +++* 0,4 ++ ++* ++* - - Sau kết quả thí nghiệm ở nồng độ mồi 0,05μM, 0,1μM và nồng độ MgCl2 1,0mM, 1,2mM cho kết quả không ổn định, vạch dương mờ và có nhiều vạch tạp. Kết quả Bảng 3.3 và Bảng 3.4 cho thấy nồng độ mồi 0,2μM và nồng độ MgCl2 1,5 – 2,0mM cho tín hiệu khuếch đại tốt nhất, tuy nhiên tín hiệu trong các lần có xuất hiện vạch tạp (tại 1,5mM vạch tạp là mờ nhất). Ở nồng độ MgCl2 1,8 – 2,0mM và nồng độ mồi 0,2µM cho kết quả âm tính vì ở nồng độ cao gây ức chế phản ứng. Tương tự ở nồng độ mồi 0,05µM và nồng độ MgCl2 1,0mM cho kết quả âm tính vì ở nồng độ thấp bị ức chế phản ứng. Nồng độ MgCl2 1,5mM và nồng độ 0,2µM cho tín hiệu khuếch dại rõ và sáng nhất không chứa vạch tạp. Từ kết quả của việc khảo sát đồng thời 2 thành phần của phản ứng PCR, chúng tôi chọn nồng độ mồi 0,2μM và nồng độ MgCl2 1,5mM là nồng độ tối ưu trong thành phần phản ứng PCR. 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong phản ứng PCR Khảo sát này nhằm xác định nhiệt độ tối ưu cho bước bắt cặp trong chương trình phản ứng PCR phát hiện gen mục tiêu. Khảo sát được thực hiện trên dịch chiết mẫu dương GMO có nồng độ DNA là 5%. Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.4. Chương trình phản ứng PCR như 42
  51. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3 với nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA thay đổi ở các mức 55 ºC - 58ºC - 60ºC - 62 ºC - 65ºC. Kết quả khảo sát được thể hiện tại Hình 3.5. Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA L: Thang chuẩn 100bp; 1: Tm= 55ºC; 2: Tm= 58ºC; 3: Tm= 60ºC; 4: Tm= 62ºC; 5: Tm= 65ºC; 6:Tm= 55ºC; 7: Tm= 58ºC; 8: Tm= 60ºC; 9: Tm= 62ºC; 10: Tm= 65ºC; (-): Chứng âm không chứa DNA. Kết quả từ hình cho thấy ở các mức nhiệt độ đều cho thấy tín hiệu khuếch đại từ gen mục tiêu. Ở các mức nhiệt độ 55, 58 và 65ºC xuất hiện vạch tạp. Nhiệt độ 60ºC và 62ºC cho vạch mục tiêu rõ. Nhưng ở vạch 62ºC không có độ ổn định, vẫn có vạch tập sau nhiều lần lặp lại. Nên chọn 60ºC là nhiệt độ tối ưu nhất cho cặp mồi sử dụng. Sau khi tối ưu hóa phản ứng PCR thành phần hóa chất trong phản ứng và chương trình phản ứng được đề xuất như sau: Bảng 3.2. Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu Bƣớc Số chu kì Nhiệt độ (ºC) Thời gian (giây) 1 1 95 300 95 30 2 40 60 30 72 60 3 1 72 420 43
  52. Đồ án tốt nghiệp 4 1 4 ∞ Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau khi tối ưu hóa STT Hóa chất Nồng độ một phản ứng 1 Bufer 10X 1X 2 MgCl2 25mM 1,5mM 3 dNTP 0,2mM mỗi dNTP 4 Mồi Xuôi 0,2µM 5 Mồi Ngược 0,2µM 6 Tag Polymerase 5U/µl 7 Nuclease-Free Water Vừa đủ 25µl 3.3. Đánh giá hiệu lực phƣơng pháp  Giới hạn phát hiện LOD50 của promoter FMV Bảng 3.4. Kết quả phân tích phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn MON89788 5% Độ pha Số lần % GMO trong mẫu thử Số mẫu dƣơng tính Tỷ lệ dƣơng tính loãng lặp lại 5% 10 1 2,5% 9 0,9 1,25% 2 10 9 0,9 0,625% 8 0,8 0,3125% 4 0,4 LOD50 = 0,625% Cận dưới: 0,815% Cận trên: 0,479% 44
  53. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Kết quả giá trị đánh giá các thông số của phương pháp Kết quả chuẩn bị mẫu Phƣơng Dương Âm Tổng pháp cần Kết quả dương tính a =tính 38 btính = 0 a + b = 38 thẩm duyệt Kết quả âm tính c = 2 d = 20 c + d = 22 Tổng a + c = 40 b + d = 20 a + b + c + d = 60 Căn cứ kết quả từ bảng tổng hợp, thông số kĩ thuật của phương pháp được tính như sau:  Độ chính xác a d 100 38 20 AC 100 96,67% a b c d 60  Độ nhạy a 100 38 100 SE = 95% a c 40  Độ đặc hiệu d 100 20 100 SP = 100% b d 20  Tỷ lệ dƣơng tính giả, âm tính giả Tỷ lệ dương tính giả - False possitive (FP) FP = (1 – SP) x 100% = (1 –1) x 100% = 0% Tỷ lệ âm tính giả - False Negative (FN) FN = (1- SE) x 100% = (1 – 0,95) x 100% = 5% Kết quả LOD50 đạt yêu cầu của các nước. Với các thông số đánh giá về độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả đáp ứng yêu cầu phân tích. 45
  54. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế bằng kĩ thuật PCR Hình 3.6. Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế được đề xuất Bảng 3.6. Diễn giải kết quả điện di Mẫu Mẫu âm Mẫu âm Chứng 100 10-1 Kết quả tách chiết PCR dương Trường hợp 1 + + - - + Dương tính 46
  55. Đồ án tốt nghiệp 2 + - - - + Dương tính 3 + + + - + Không kết luận 4 + + + - - Không kết luận 5 - - + - + Có thể Âm tính. 6 - - + + - Không kết luận 7 - - - - + Âm Tính 8 - + - - + Dương Tính Trong tất cả các trường hợp, các mẫu kiểm soát âm phải cho kết quả âm tính, các mẫu kiểm soát dương cho kết quả dương tính. Khi đó:  Mẫu phân tích (pha loãng hoặc không pha loãng) cho kết quả dương tính thì trả lời là “Phát hiện sản phẩm biến đổi gen (GMO) với sự hiện diện của trình tự promoter 34S-FMV”.  Mẫu phân tích cho kết quả âm tính thì trả lời là “Không phát hiện sản phẩm biến đổi gen (GMO) với sự hiện diện của trình tự promoter 34S-FMV”. Ngoài ra, với các trường hợp đặc biệt (trường hợp 3 – 4 – 5 – 6), đều cần thực hiện phân tích lại, do có sự ngoại nhiễm ở mẫu chứng âm hoặc mẫu chứng dương bị ức chế trong quá trình PCR (trường hợp 4 – 6). Với trường hợp 5, mặc dù có sự ngoại nhiễm, nhưng mẫu phân tích cho kết quả âm tính và mẫu chứng dương không bị ức chế trong quá trình PCR nên có thể nghi ngờ là sản phẩm âm tính. Tuy nhiên, vẫn cần thực hiện lại quá trình phân tích để xác định rõ hơn. 3.5. Cải tiến phƣơng pháp bằng phản ứng Realtime – PCR Khảo sát nhằm mục đích thử nghiệm việc phát hiện gen mục tiêu trên mẫu dương GMO từ đậu nành bằng kỹ thuật RT-PCR. Nằm trong hướng phát triển của đề tài, kỹ thuật này giúp giảm thời gian thực hiện để cho ra kết quả phân tích sớm 47
  56. Đồ án tốt nghiệp hơn, kết hợp với việc đánh giá nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm thiểu được các mẫu dương tính giả. Khảo sát được thực hiện trên mẫu là dịch chiết DNA mẫu dương có nồng độ 5% đã được tinh sạch. Tiến hành phản ứng PCR, thành phần phản ứng như Bảng 2.9. Chương trình phản ứng như Bảng 2.9 Hình 3.7. Kết quả khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn Kết quả real-time PCR, chứng âm cũng có tín hiệu, tuy nhiên tín hiệu trễ, nghi ngờ do nhiễm hoặc do dimer, cần đánh giá điểm nóng chảy để biết thêm có phải dương tính giả hay không. Hình 3.8. Đường xác định nhiệt độ nóng chảy của kết quả real-time PCR khoảng 80ºC 48
  57. Đồ án tốt nghiệp Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích chính là ở chiều dài, nếu từ dimer primer thì chiều dài sẽ không bao giờ vượt quá 50 – 55bps, còn nếu từ DNA đích thì chiều dài thường quá 100bps. Như vậy, để có thể phân biệt được được đường biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer, phải dựa vào một tính chất đặc trưng giúp phân biệt được chiều dài của hai loại sản phẩm khuếch đại này, và tính chất đặc trưng đó chính là nhiệt độ chảy (melting To, Tm), là nhiệt độ làm cho sợi đôi DNA bị biến tính 50% tức là có 50% số sợi đôi bị biến tính hoàn toàn. Theo kết quả thì nhiệt độ chảy trung bình là 80,5ºC. Mẫu âm có tín hiệu thấp do primer hấp thụ sóng huỳnh quang. Hình 3.9. Kết quả chạy điện di của sản phẩm Realtime – PCR Với mẫu 1; 2; 3 là các mẫu chứng dương được tách bằng bộ Kit SureFood PREP Basic Art. No. S1052 cho ra vạch mục tiêu rõ và sáng. Có thể thấy chu kỳ nhiệt và cặp mồi ổn định khi chạy Realtime-PCR. Từ kết quả điện di có thể thấy được chứng âm dương tính giả. 3.6. Kết quả khảo sát mẫu thực tế Sau khi hoàn thiện quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR và đề xuất quy trình cải tiến phương pháp, tiến hành khảo sát 10 mẫu thị trường. Các mẫu được lấy từ các mẫu xét nghiệm GMO tại Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4. Có kết quả như Hình 3.9 49
  58. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Kết quả mẫu xét nghiệm GMO thị trường. L Thang chuẩn 100bp, 1 mẫu Cà chua, 2 mẫu Gạo, 3 mẫu Nếp, 4 mẫu Khoai tây nghiền, 5 Cám cá, 6 Bắp mỹ, 7 Bột Sắn, 8 Bột Khoai, 9 Đậu nành, 10 Bắp nếp Kết quả phân tích cho thấy các mẫu phân tích đều âm tính với GMO sau 3 lần lặp lại, trong đó có Bắp mỹ hiển thị kết quả dương tính. Bắp mỹ là thực phẩm biến đổi gen. 50
  59. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận  Kết luận: Trong khuôn khổ đề tài thực hiện, chúng tôi đã thu được các kết quả như sau: - Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR  Khẳng định được cặp mồi FMV đã sử dụng là chuyên biệt phát hiện thực phẩm biến đổi gen.  Nồng độ MgCl2 tối ưu cho phản ứng PCR là 1,5mM  Nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR là 0,2μM;  Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu cho phản ứng PCR là 60ºC. - Kết quả đánh giá hiệu lực sơ cấp của quy trình đề xuất theo tiêu chuẩn ISO 16140-2003 đã xác định được các thông số kỹ thuật của phương pháp như sau:  Giới hạn phát hiện (LOD50) là 0,625%;  Độ chính xác là 96,67%;  Độ nhạy là 95%;  Độ đặc hiệu là 100%;  Tỷ lệ dương tính giả là 0%; tỷ lệ âm tính giả là 5%. Các thông số nhận được cho thấy phương pháp phù hợp để áp dụng tại phòng kiểm nghiệm. - Bước đầu thử nghiệm quy trình phân tích bằng Realtime-PCR. - Bước đầu phân tích sự hiện diện của một số thực phẩm biến đổi gen trên thị trường hiện nay. 4.2. Kiến nghị Do giới hạn của đề tài nên còn một số điểm chưa được nghiên cứu. Mặt khác, để kết quả nghiên cứu được áp dụng nhiều hơn vào thực tế, chúng tôi xin có một số ý kiến như sau: - Khảo sát sự ổn định của phương pháp trên một số nền mẫu chưa được khảo sát trong đề tài. - Khảo sát và đánh giá qui trình cải tiến để áp dụng vào thực tế. 51
  60. Đồ án tốt nghiệp - Đánh giá quy trình phản ứng Mutiplex Realtime-PCR để phát hiện cùng lúc 3 event (35S-CaMV, t-NOS và 34S-FMV). 52
  61. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt [1] Lê Tấn Thành “Đánh giá đa dạng di truyền cá Tra chọn giống bằng chỉ thị phân tử microsatellite”, Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, (2015). [2] Sổ tay hướng dẫn tính toán các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp sinh học phân tử. Cục Quản Lý Chất Lượng Nông Lâm Sản và Thủy Sản. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam. [3] TCVN 7605: 2007. Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen. [4] TCVN 7608: 2007. Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Yêu cầu chung và định nghĩa. [5] Thông tư liên tịch 45/2015 Hướng dẫn ghi nhãn đối với thực phẩm biến đổi gen bao gói sẵn quy định cách thức ghi nhãn thực phẩm, TTLT-BNNPTNT- BKHCN.  Tài liệu tiếng anh [6] ISAAA briefs. Brookes G, Barfoot P, 2006. [7] The potential of genetically enhanced plants to address food insecurity. Nut Research Rev; 17:23–42, Christou P, Twyman RM, 2004 [8] Food and Agriculture Organisation. The State of Food Insecurity in the World. Rome: FAO; 2001. [9] Engineering plants with increased disease resistance: what are we going to express? Trends Biotech;23:275–82, Gurr SJ, Rushton PJ, 2005. [10] ISO 21569 -2005 / amd1:2013 ( E ) Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods [11] ISAAA Brief is an extension of the 20 Volumes of Annual Briefs (1996 to 2015) on global status of biotech/GM crops authored by Clive James, 2016. 53
  62. Đồ án tốt nghiệp [12] In A Grain Of Golden Rice, A World Of Controversy Over GMO Foods, Dr. Gerard Barry,2013 [13] Interlaboratory trial validation of an event-specific qualitative polymerase chain reaction-based detection method for genetically modified RT73 rapeseed, Liangwen Pan, Huya Zhang, Tao Yang,2007. [14] The geography and causes of food insecurity in developing countries. Agriculture Economics; 22:199–215, Smith LC, El Obeid AE, Jensen HH, 2000. [15] The Soybean Plant: Botany, Nomenclature, Taxonomy, Domestication, and Dissemination by William Shurtleff and Akiko Aoyagi, 2004. [16] WHO, Food safety,2014. [17] World Bank. World Development report 2000/2001. Attacking poverty. Washington DC: World Bank; 2000  Tài liệu website [18] [19] %E2%80%93-gmo/29453.html [20] analysis/gmo/screen/item/surefood-gmo-35s-nos-fmv [21] the-gioi [22] thuc-an-chan-nuoi-quy-I2017-9698.html [23] nam/ [24] [25] su-cay-trong-bien-doi-gen [26] 54
  63. Đồ án tốt nghiệp [27] the-gioi-ve-viet-nam [28] 55
  64. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. Một số hình ảnh chạy điện di cặp mồi event promoter 34S- FMV. Hình ảnh điện di kiểm tra LOD50 phát hiện promoter FMV trên mẫu chuẩn MON89788 5% Hình A1 - Kết quả 10 mẫu dương tính mẫu chuẩn 5% Hình A2 - Kết quả 9 mẫu dương tính mẫu chuẩn 2,5% Hình A3 - Kết quả 9 mẫu dương tính mẫu chuẩn 1,25% 1
  65. Đồ án tốt nghiệp Hình A4 - Kết quả 8 mẫu dương tính mẫu chuẩn 0,625% Hình A5 - Kết quả 4 mẫu dương tính mẫu chuẩn 0,3125% Hình ảnh điện di kết quả đánh giá các thông số của phương pháp trên mẫu chuẩn MON89788 5% với 40 mẫu dương tính GMO, 10 mẫu âm tính (Nuclease-Free Water), 10 mẫu dương virus HAV với mật độ 100PFU/µl. Hình A6 - Kết quả 10 mẫu âm tính (Nuclease-Free Water) 2
  66. Đồ án tốt nghiệp Hình A7 - Kết quả 10 mẫu âm tính với chủng Virus HAV Hình A8 - Kết quả 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Hình A9 - Kết quả 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% 3
  67. Đồ án tốt nghiệp Hình A10 - Kết quả 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Hình A11 - Kết quả 8 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% 4
  68. Đồ án tốt nghiệp B. Danh mục Cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen.[28] 5