›

Đồ án Xác định thời gian thu hoạch sâu chết để thu nhận virus NPV trên sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura

pdf 63 trang thiennha21 12/04/2022 7250
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xác định thời gian thu hoạch sâu chết để thu nhận virus NPV trên sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_xac_dinh_thoi_gian_thu_hoach_sau_chet_de_thu_nhan_viru.pdf

Nội dung text: Đồ án Xác định thời gian thu hoạch sâu chết để thu nhận virus NPV trên sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH THỜI GIAN THU HOẠCH SÂU CHẾT ĐỂ THU NHẬN VIRUS NPV TRÊN SÂU KHOANG ĂN TẠP SPODOPTERA LITURA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ DIỄM CHI Lớp: 11HSH02 MSSV: 1191111006 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận tiện cho cây trồng phát triển. Đồng thời với cây trồng phát triển là sâu bệnh hại cũng phát sinh, chúng gây hại đáng kể đến năng suất. Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, hàng năm các loại dịch hại, bệnh hại đã làm giảm 35 – 40 % tổng sản lượng, mặt khác làm giảm phẩm chất của nông sản. Để bảo vệ cây trồng thì mức chi phí cho công tác bảo vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi toàn quốc. Trong đó, đáng đề cập đến là loài sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura), theo ước tính loài sâu này có thể gây hại trên 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật. Ở nước ta chúng là loài gây hại quan trọng trên các loại rau họ thập tự, cà chua, đậu đũa, bầu bí, rau muống, khoai lang, thuốc lá, bông, thầu dầu, điền thanh, (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Để phòng trừ và làm giảm thiệt hại gây ra do sâu, bệnh hại nói chung và loài sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) nói riêng người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp phòng trừ như canh tác thủ công, luân canh, chuyên canh, chọn tạo giống mới, dùng thuốc hóa học. Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học được xem là phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà giá thành lại rẻ. Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, để lại dư chất hóa học trong nông sản, giảm số lượng sinh vật có ích, làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh, đã làm cho việc phòng trừ sâu hại trở nên kém hiệu quả: Riêng đối với loài thiên địch, El zen, G.W.et al (1987) cho thấy thuốc hoá học trừ sâu có gốc lân hữu cơ và caramat rất độc, gây chết 100% ong Microphilitis Croleipes (một loài ký sinh của sâu xanh). Ở việt nam, các tác giả Vũ Quang Côn và ctv (1993), Nguyễn Thị Hai (1996), Phạm Hữu Nhược (1996) đều cho rằng phun thuốc hoá học làm giảm mật độ của các loài ăn thịt, ong mắt đỏ và các loài ong ký sinh khác. Trang 1
  3. Đồ án tốt nghiệp Việc phân tích các thí nghiệm ở California đã chỉ ra rằng sử dụng thuốc hoá học một cách không thận trọng đã kìm hãm sự phát triển tự nhiên của sâu hại, là nguyên nhân làm cho sâu hại tái phát, mật độ sâu sau khi xử lý thuốc cao hơn trước khi xử lý (Mariechel, J. Navarro, (1985). Tình hình sâu xanh tái phát cũng đã phát hiện ở trung quốc: Theo tổng kết của Sheng, C.F (1993), sau một năm sử dụng thuốc học đơn độc để trừ sâu, mật độ sâu xanh năm 1992 mật độ sâu xanh lên cao hơn 40 lần so với năm 1982. Ở Việt Nam, Nguyễn Thơ (1993), cũng có nhận xét nếu phun thuốc không đúng quy định sẽ tiêu diệt ong mắt đỏ cũng như các loài thiên địch khác ngoài tự nhiên và lập tức sâu xanh bùng phát thành dịch. Một tác hại lớn của thuốc hoá học trừ sâu hiện nay mà toàn thế giới đang quan tâm đó là: việc sử dụng thuốc hoá học liên tục đã làm tăng sự sự chọn lọc gen của quần thể sâu hại và làm cho sâu ngày càng chịu đựng với thuốc. Tính đến năm 1986 cả thế giới đã có 447 loài sâu kháng thuốc, trong đó có 264 loài phá hoại trong nông nghiệp (Nguyễn Thiện Thuật, 1996). Ở Việt Nam, Sâu tơ hại bắp cải (Plutella xylostella St.) đã kháng hầu hết các loài thuốc trừ sâu thông dụng (Lê Trường,1981). Tồn dư của thuốc hoá học trừ sâu đã gây ô nhiễm lớn cho nguồn nước, nhiễm độc cho thức ăn. Frisbie, R. et al (1991) cho biết sự phun thuốc hoá học trừ sâu ở Mỹ đã làm nhiễm độc nặng cho nguồn nước và thức ăn. Ở Việt Nam, Bùi Sĩ Oanh và ctv (1995) đã cho biết dư lượng thuốc Cypermerthin trên các loài đậu đỗ đã lên tới 0,4 -0,7 mg/kg, vượt xa so với mức tồn dư cho phép. Do vậy, việc sử dụng thuốc hóa học chỉ là biện pháp tình thế. Đứng trước thực trạng đó thì biện pháp sinh học là một giải pháp được đánh giá là có hiệu quả cao, vì nó không những không gây hại cho người, an toàn cho gia súc, không ảnh hưởng đến các loài sinh vật có ích mà còn góp phần cải thiện môi trường, Trong số này, đáng kể nhất là virus đa diện nhân (NPV). Virus đa diện nhân Nucleopolyhedrovirus (NPV) là một tác nhân gây bệnh rất phổ biến trên sâu ăn tạp, được công nhận là một tiềm năng cho việc quản lý côn trùng, có hiệu quả tiêu diệt cao do tính chất lây lan virus NPV trong quần thể sâu, đồng thời virus sẽ Trang 2
  4. Đồ án tốt nghiệp nhân nhanh sinh khối trong cơ thể sâu khoang làm tăng tính chất tiêu diệt sâu, nó đặc biệt hấp dẫn bởi tính an toàn đối với môi trường và các sinh vật khác. Ưu điểm quý giá của NPV là không ảnh hưởng xấu đến các loài thiên địch, ở Mỹ, các nghiên cứu trong phòng cũng cho thấy chuồn chuồn cỏ và các loài ong không bị nhiễm NPV (Heins, K.M. et al, 1995., Nitt. L. et al, 1995). Ngoài tác động diệt sâu tức thời, NPV còn có khả năng truyền sang các thế hệ sau (Khaire, V.M. et al, 1986). Do có nhiều ưu điểm, NPV đã được nghiên cứu để trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng. Bertucci, B.M (1985) đã sử dụng NPV trừ ruồi đục thân (Neodiprion sertifer) trên cây tùng tại Ý. Rabindra, R.J. et al (1985) nghiên cứu sử dụng HaNPV trừ sâu xanh hại hướng dương ở Ấn Độ. Virus được nghiên cứu trừ sâu hại trên các vườn cây ở Nhật và nhiều nước khác (Sato t.,1989). Trần Quang Tấn và ctv (1995) nghiên cứu sử dụng NPV trừ sâu dóm hại thông ở Việt Nam. Tất cả các công trình nghiên cứu của các tác giả trên đều cho kết quả: NPV có tác dụng trừ sâu hại trên các loại hoa màu tương đương hoặc cao hơn thuốc hoá học. Một trong những bước đầu tiên và quan trọng nhất là phải nhân nuôi và thu nhận sinh khối lớn NPV nhằm phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm virus NPV. Nhưng thời gian thu nhận sâu chết đã nhiễm virus đóng vài trò quan trọng trong quy trình sản xuất NPV nói chung và NPV sâu khoang nói riêng (Senthil và cộng sự, 2010). Bởi vì, nếu ta thu nhận quá sớm, lượng virus sẽ không cao, ngược lại nếu thu nhận quá trễ, xác sâu vỡ ra lượng virus thất thoát ra môi trường cũng đáng kể. Vì vậy, việc xác định thời điểm thu nhận cho sản lượng virus cao nhất, hiệu quả kinh tế nhất là rất cần thiết để giảm chi phí, hạ giá thành sản xuất chế phẩm. Xuất phát từ nhu cầu trên, sinh viên tiến hành đề tài: “xác định thời gian thu hoạch sâu chết để thu nhận virus NPV trên sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura”. 2. Mục đích của đề tài Xác định thời điểm thu nhận để có lượng PIBs cao nhất 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài cung cấp những dữ liệu khoa học là cơ sở cho việc xác định thời gian thu nhận sâu chết để thu nhận NPV trên sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura thích Trang 3
  5. Đồ án tốt nghiệp hợp trong quy trình sản xuất sinh khối lớn NPV nhằm cung cấp cho quá trình sản xuất chế phẩm NPV trên quy mô lớn. 4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi đề tài  Đối tượng nghiên cứu Nuclear polyhedrosis virus – NPVgây chết sâu khoang thu được từ tự nhiên và nhân lên trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nguồn sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura dùng để nhân nhiễm virus NPV được bắt từ tự nhiên đem về nhân nuôi để thu được F1.  Địa điểm Các thí nghiệm được tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Khoa môi trường và công nghệ sinh học, trường đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 5. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nhân nhiễm virus NPV trên bề mặt thức ăn nhân tạo của McKInley (1985) Số liệu thí nghiệm được đưa vào xử lý thống kê, bằng chương trình Microsoft Excel, Statgraphic centurion. Trang 4
  6. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius) 1.1.1. Phân loại khoa học - Tên khoa học: Spodoptera litura Fabricius - Họ: Noctuidate (ngài đêm) - Bộ: Lepidoptera (cánh vảy) Hình 1.1: Sâu khoang (Spodoptera litura) 1.1.2. Phân bố và ký chủ Sâu ăn tạp (SAT) là loài có phổ ký chủ rộng, phân bố hầu hết các nơi trên thế giới và được ghi nhận lần đầu tiên ở huyện Nelson gây hại cho cây thuốc lá (Cottier và Gourlay,1955). Sâu ăn tạp còn có tên gọi là sâu khoang, sâu đàn, sâu keo là loài phân bố rộng khắp thế giới, ở các nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á, Bắc Phi. Ở nước ta SAT có ở khắp nơi. Đây là loài đa thực, theo ước tính có thể gây hại trên 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật. Ở nước ta chúng là loài gây hại quan trọng trên các loại rau họ thập tự, cà chua, đậu đũa, bầu bí, rau muống, khoai lang, thuốc lá, bông, thầu dầu, (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004) thì sâu có thể gây hại khoảng 200 loại cây trồng. Loài này phân bố khắp nơi ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, kể cả một số nước ôn đới, châu Úc, châu Á và đảo Thái Bình Dương (Feaking và Franz, 1977 được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thuỳ Dung, 2008). 1.1.3. Đặc điểm gây hại Trang 5
  7. Đồ án tốt nghiệp Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006), sâu non tuổi nhỏ tập trung thành từng ổ gặm nhắm ăn lá, chừa lại biểu bì trên và gân lá nên người ta còn gọi là sâu ổ hay sâu đàn. Sau khi sâu lớn thì phân tán, ăn thủng lá chỉ để lại gân lá, có thể cắn trụi hết lá, cắn trụi cành hoa, chui và đục khoét trong quả, nụ hoa. Khi SAT phát sinh thành dịch, chúng gây thiệt hại khá nặng cho cây trồng. Đối với rau ăn lá thì bị giảm sản lượng và giá trị thương phẩm, đối với cây lấy quả như cà chua, đậu đũa thì hoa nụ sẽ bị rụng và quả bị hại cũng sẽ rụng sớm hoặc trở nên thối khi gặp trời mưa. Hình 1.2: Hoa màu bị phá hủy bởi sâu khoang 1.1.4. Đặc điểm hình thái và sinh thái Sâu khoang có nhiều loại, bướm trưởng thành có chiều dài thân từ 20 - 25 mm, sải cánh rộng từ 35 - 45 mm, cánh trước màu nâu vàng. Phần giữa từ mép trước cánh tới mép sau cánh có một vân ngang rộng màu trắng. Trong đường vân này có 2 đường vân màu nâu (ở con đực không rõ). Cánh sau màu trắng loáng phản quang màu tím. Bướm có đời sống trung bình từ 1 - 2 tuần tuỳ thuộc vào điều kiện thức ăn. Trung bình một bướm cái có thể đẻ 300 trứng, nhưng khi gặp điều kiện thích hợp bướm có thể đẻ từ 900 - 2.000 trứng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Theo Phạm Thị Nhất (2000) ở điều kiện Việt Nam thì tổng số trứng trung bình của sâu ăn tạp là 1000 trứng/ổ. Thời gian đẻ trứng trung bình kéo dài từ 5 - 7 ngày nhưng cũng có khi lên đến 10 hoặc 12 ngày. Trang 6
  8. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3: Trứng sâu khoang Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006) trứng hình bán cầu, đường kính 0,5 mm. Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đáy trứng (36 - 39 đường) và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ. Trứng mới đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu tro đậm. Trứng xếp với nhau thành từng ổ có lông từ bụng bướm mẹ phủ bên ngoài. Thời gian ủ trứng từ 4 - 7 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Sâu có 5 - 6 tuổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường và phát triển trong khoảng thời gian từ 20 - 25 ngày. Sâu lớn đủ sức dài khoảng 35 - 53 mm, hình ống tròn. Sâu tuổi nhỏ có màu xanh lục, càng lớn chuyển dần sang màu nâu đen hoặc nâu đậm. Sâu tuổi nhỏ toàn thân có màu xanh và chuyển dần sang màu nâu khi tuổi lớn với 1 sọc màu vàng sáng ở hai bên hông chạy từ đốt thứ nhất của bụng đến đốt cuối, dọc theo những đường ấy có những điểm hình bán nguyệt. Từ đốt thứ nhất đến đốt thứ tám của bụng mỗi đốt có một chấm đen rõ, đây là điểm đặc biệt của loài sâu này để phân biệt với các loài sâu khác cùng giống. Trong đó có 2 chấm đen ở đốt thứ nhất là to nhất và gần như giao nhau khi sâu tuổi lớn tạo thành một khoang đen trên lưng nên người ta còn gọi sâu này là "Sâu Khoang" (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Nhộng dài 18 - 20 mm màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh các đốt bụng thứ 5, 6, 7 có nhiều chấm lõm. Cuối bụng có một đôi gai ngắn (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004) thì thời gian nhộng từ 7 - 10 ngày. Trang 7
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4: Nhộng sâu khoang Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố và phát triển của sâu ăn tạp, ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho tất cả các giai đoạn phát triển của sâu ăn tạp là 370C, sâu ngừng hoạt động và sẽ chết khi nhiệt độ >400C, trứng sâu ăn tạp sẽ nở khoảng 4 ngày trong điều kiện nhiệt độ ẩm và có thể lên 11 - 12 ngày ở nhiệt độ thấp hơn (Rang Rao et al., 1989 được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thuỳ Dung, 2008). Ẩm độ cùng với nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt động bắt cặp của thành trùng. Khi ẩm độ thấp và nhiệt độ cao sẽ làm tăng khả năng hoạt động của thành trùng và ngược lại. Tuy nhiên nếu nhiệt độ cao, kết hợp với ẩm độ thấp sẽ làm giảm số lượng cũng như tỷ lệ trứng nở. Ẩm độ thích hợp cho sự sinh trưởng của ấu trùng sâu ăn tạp dao động từ 85% - 100%. Hình 1.5 Thành trùng, trứng và ấu trùng sâu ăn tạp trong đất (Nguồn: Trần Văn Hai, ĐHCT Trang 8
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6: Sơ đồ vòng đời của sâu khoang 1.1.5. Tập quán sinh sống và quy luật phát sinh gây hại Theo Lê Thị Sen (1999) bướm thường vũ hoá vào buổi chiều và bay ra ngoài hoạt động vào lúc vừa tối, ban ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong các bụi cỏ. Thời gian hoạt động từ tối đến nửa đêm. Bướm bay rất khoẻ, có khi bay xa đến vài chục mét và có thể cao đến 6 - 7 m. Sau khi bắt cặp vài giờ bướm có thể bắt cặp và 1 ngày sau là có thể đẻ trứng. Bướm có xu tính mạnh với mùi vị chua ngọt và với ánh sáng đèn, đặc biệt là đối với đèn có bước sóng ngắn (3,650 A0). Thành trùng đẻ trứng vào đêm thứ 2 sau khi vũ hóa. Một đời con cái giao phối 3 - 4 lần, trong khi đó con đực có thể giao phối 10 lần (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Trang 9
  11. Đồ án tốt nghiệp Bướm có tính chọn lọc ký chủ để đẻ trứng, bướm đẻ trứng thành từng ổ khoảng vài trăm trứng, thường đẻ ở mặt dưới lá, ổ trứng có phủ lông màu vàng. Thời gian đẻ trứng kéo dài 6 - 8 ngày. Thời gian sống của bướm ở nhiệt độ cao (hè - thu) ngắn hơn ở nhiệt độ thấp (đông - xuân), bướm được cho ăn thêm sống lâu hơn là không ăn. Sâu non vừa nở ăn gặm vỏ trứng và sống quần tụ với nhau quanh ổ trứng. Lúc này nếu bị khua động nhẹ chúng có thể bò phân tán ra chung quanh hoặc nhả tơ buông mình xuống đất, ở giai đoạn này sâu chỉ ăn gặm ở mặt dưới lá, chừa lại lớp biểu bì trên và gân lá. Sang tuổi 2 sâu bắt đầu phân tán và ăn gặm lá nhiều hơn. Từ tuổi 4 sâu có phản ứng rõ rệt đối với ánh sáng, nghĩa là sâu thường trốn ánh sáng nên ban ngày sâu thường ẩn vào những nơi tối hoặc chui xuống kẻ đất nứt, ban đêm mới chui lên cây. Vào những ngày râm mát hoặc có mưa nhẹ thì ban ngày sâu có thể bò lên hoạt động trên cây (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). Sâu có thể di chuyển từ cánh đồng này sang cánh đồng khác, ở đất cát pha hoặc đất thịt nhẹ sâu có thể ăn cả bộ phận dưới mặt đất của cây trong thời gian ẩn nấp ban ngày (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Sâu có 6 tuổi, sâu tuổi cuối có thể nặng tới 800 mg, trung bình giai đoạn sâu non có thể ăn hết 4g lá, trong đó 80% bị tiêu thụ bởi sâu tuổi cuối. Sâu tuổi lớn có tập quán ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành và trái non. Khi sắp hoá nhộng sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đó để hoá nhộng bên trong. Đất có hàm lượng nước 20% là thích hợp cho sâu hoá nhộng, đất quá khô hoặc quá ẩm đều không thuận lợi (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Sâu ăn tạp là loài ưa điều kiện nóng ẩm. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sâu sinh trưởng và phát dục là 29 - 300C và độ ẩm không khí thích hợp là trên 90%. Ở Việt Nam điều kiện thời tiết khí hậu và cây trồng thuận lợi cho sâu phát sinh và phát triển và thường gây hại cho cây trồng vào các tháng mùa hè và mùa thu (từ tháng 4 - 10). Dịch sâu thường phát sinh vào tháng 5 - 6, còn các tháng khác có thể gây hại nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào điều kiện địa điểm và cây trồng. Trang 10
  12. Đồ án tốt nghiệp Sâu ăn tạp phát sinh quanh năm trên rau. Mỗi năm có 7 đỉnh cao mật độ sâu trên đồng ruộng, thời gian giữa 2 đỉnh cao là 20 - 26 ngày. Trong thời gian từ tháng 5 đến tháng 11 thì các đợt mưa lớn kết hợp với sự phát sinh bệnh thối nhũn do virus NPV là nguyên nhân làm giảm mật số sâu ăn tạp trên đồng ruộng ở đồng bằng sông Hồng (Nguyễn Đức Khiêm, 2006). Hình 1.7: Thiệt hại do sâu ăn tạp trên lá đậu nành, ớt, cải xà lách và dưa hấu (Nguồn: Trần Thị Ba, ĐHCT) 1.1.6. Biện pháp phòng trị Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006) thì trong những năm gần đây để phòng trừ sâu ăn tạp trên thế giới cũng như ở nước ta đã và đang áp dụng các biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (JA Wightman, ICRISAT, DNAhra Pradesh, India, 1996) vì sâu này kháng thuốc rất mạnh nên áp dụng các biện pháp ngăn ngừa sâu trước khi phát sinh thành dịch, bao gồm các biện pháp sau: + Dùng bẫy đèn và bẫy chua ngọt để bắt và tiêu diệt. Vừa có ý nghĩa trong dự báo vừa làm giảm số lượng thành trùng trước khi đẻ trứng. + Bắt sâu tuổi nhỏ lúc chưa phân tán và ngắt bỏ ổ trứng là biện pháp có hiệu quả. Khi dự tính được thời gian trưởng thành ra rộ thì định kỳ 2 - 3 ngày 1 lần đi thu bắt sâu tuổi nhỏ và ngắt ổ trứng chưa nở. + Tiến hành cày bừa, phơi ải kỹ đất trước khi trồng rau, kết hợp với làm cỏ xung quanh bờ ruộng để tiêu diệt chỗ ẩn náu của thành trùng. Có thể cho ruộng ngập nước từ 2 - 3 ngày để diệt nhộng. + Sử dụng bẫy pheromone. + Bảo vệ và thả các loài ong ký sinh sâu non, có thể sử dụng loài bắt nồi ăn thịt Conocephalus sp. Trang 11
  13. Đồ án tốt nghiệp + Sử dụng ong ký sinh trứng để hạn chế số lượng sâu: ở giai đoạn trứng của SAT có khoảng 4 loài ong mắt đỏ (Trichogramma), một loài ong thuộc họ Selionidae và một loài ong họ Braconidae; ngoài ra còn có thêm loài Chelonus sp. và Telenomus spp Ở giai đoạn ấu trùng, ngay từ giai đoạn nhỏ đến khi trưởng thành và hoá nhộng có khoảng 8 loài ký sinh đã được ghi nhận trong đó có ong Ichneumon sp. và loài Chelonus sp. Kí sinh chủ yếu ở giai đoạn nhộng non (Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thuỳ Minh, 2001). + Sử dụng các loài nấm ký sinh trên côn trùng: theo Trịnh Thị Xuân (2006), thì có 4 loại nấm ký sinh trên sâu ăn tạp: Paecilomyces sp, Nomurae rileyi, Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae. Theo Nguyễn Thị Thu Cúc et al (2002) được trích dẫn bởi Nguyễn Thị Kiều Khuyên (2002) thì sâu ăn tạp ở Đồng bằng Sông Cửu Long bị ký sinh bởi loài Nosema bombycis. Theo một số tác giả sâu ăn tạp còn bị chết bởi N. carpocapsae tại nhiều nơi trên thế giới. Sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis hoặc sử dụng NPV (sử dụng 500 sâu non nhiễm virus/ ha). Ở nước ta hiện nay, các chủng virus nhân đa diện (NPV) đã được nghiên cứu và sử dụng có kết quả trên sâu xanh hại bông, sâu tơ bắp cải, sâu ăn tạp, sâu keo da láng Đây là những triển vọng rất lớn để sử dụng trong chương trình phòng trừ sinh học trên cây trồng ở Việt Nam (Nguyễn Công Thuật, 1996). Khi cần có thể phun thuốc theo liều khuyến cáo, tránh sử dụng một loại thuốc quá hiều lần có thể gây ra tính kháng thuốc ở sâu. Có thể sử dụng các loại thuốc trừ sâu thông dụng để trị khi sâu còn nhỏ. Các loại thuốc thường dùng như Cyperan 10EC, Karate 2,5EC, Regent 800WG, nên phun thuốc vào chiều mát và phun lúc sâu còn tuổi nhỏ để chúng ít kháng thuốc. 1.2. Biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật 1.2.1. Giới thiệu về biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật Theo Chi cục Bảo vệ Thực vật TP. Hồ Chí Minh, biện pháp sinh học là biện pháp: Trang 12
  14. Đồ án tốt nghiệp - Tạo môi trường thuận lợi cho các loài sinh vật có ích là kẻ thù tự nhiên của dịch hại, phát triển nhằm góp phần tiêu diệt dịch hại, bảo vệ thiên địch tránh khỏi độc hại do dùng thuốc hoá học, tạo nơi cư trú cho thiên địch sau vụ gieo trồng bằng cách trồng xen, làm bờ rạ cho thiên địch ẩn nấp Áp dụng các kỹ thuật canh tác hợp lí tạo điều kiện cho thiên địch phát triển. - Sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật sinh học, các loại thuốc sinh học chỉ có tác dụng trừ dịch hại, không độc hại với các loại sinh vật có ích an toàn với sức khỏe con người và môi trường - Tập trung nhân nuôi, sử dụng thiên địch nhóm bắt mồi, ký sinh và vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng. Trong tự nhiên, phòng trừ tự nhiên (Natural control) hay đấu tranh sinh học luôn có mặt một cách tích cực tại mọi hệ sinh thái trên khắp hành tinh, khống chế trực tiếp đến 95% các loài chân khớp hại (100 000 loài được phòng trừ tự nhiên), trong khi các biện pháp mà con người thực hiện bây giờ chủ yếu tập trung vào 5000 loài mục tiêu. Chi phí hàng năm về thuốc trừ dịch hại là khoảng 8,5 tỷ USD, trong khi tổng số chi phí ước tính cho phòng trừ tự nhiên hàng năm vào khoảng 400 tỷ USD (dẫn theo Van Lenteren, 2005). Biện pháp sinh học cổ điển áp dụng cho 350 triệu ha tức bằng 10% diện tích canh tác có tỷ lệ thuận trên gia thành là 20-500 lần, cao hơn nhiều so với biện pháp sinh học nuôi nhân và phóng thích thiên địch (BPSH tăng cường). Biện pháp sinh học tăng cường được áp dụng cho 16 triệu ha tức bằng 0,046% diện tích canh tác có tỷ lệ lợi nhuận/giá thành là 2-5 lần. Tổng hợp trong 120 năm qua, trên 196 nước và vùng lãnh thổ đã có 5000 lần giới thiệu 2000 loài chân khớp ngoại lai để phòng chống chân khớp hại và hiện có trên 150 loài thiên địch (ký sinh, bắt mồi và vi sinh vật) đang được nhân nuôi và thương mại trên thế giới (Vũ Văn Đĩnh và ctv, 2004). Các nhà sản xuất và nông dân nêu lên 9 ưu điểm của biện pháp sinh học (Van Lenteren, 2005): Trang 13
  15. Đồ án tốt nghiệp - Giảm một cách rõ rệt sự phơi nhiễm của nông dân đối với thuốc hóa học BVTV. - Không có dư lượng thuốc BVTV trên nông sản. - Không có ảnh hưởng sinh lý xấu đến sinh trưởng của cây non, phần non của cây. - Phóng thích thiên địch tốn ít thời gian hơn phun thuốc và dễ chịu hơn nhiều, nhất là trong nhà kính nóng ẩm. - Việc phóng thích thiên địch được tiến hành ngay sau khi gieo trồng, người nông dân có thể kiểm tra sự thành công của biện pháp này và chỉ cần một vài lần kiểm tra sau đó nhưng đối vơi biện pháp hóa học cần sự kiểm tra thường xuyên trong suốt vụ. - Đối với một số loài đã hình thành tính kháng thuốc thì biện pháp hóa học là rất khó khăn . - Đối với ruộng phòng trừ sinh học, có thể thu hoạch sản phẩm vào bất kỳ thời gian nào nếu thấy giá có lợi nhất, trong khi biện pháp hóa học cần phải chờ đợi cho hết thời gian cách ly. - Khi có được thiên địch tốt sẽ đảm bảo sự thành công của biện pháp sinh học. - Biện pháp sinh học được nhân dân thừa nhận, sản phẩm sẽ dễ bán hơn và giá bán cao hơn. Ngoài ra, các nhà quản lý và ứng dụng còn đưa thêm 4 ưu thế nữa của BPSH (Vũ Văn Đĩnh và ctv, 2004): - Ít gây nguy hại đến thực phẩm, nước và môi trường. - Đóng góp cho sản xuất thực phẩm bền vững. - Đóng góp cho bảo vệ và phát triển đa dạng sinh học. - Không có dư lượng trên nông sản. 1.2.2. Một số thành tựu của biện pháp sinh học trong phòng trừ sâu hại 1.2.2.1. Châu Âu Trang 14
  16. Đồ án tốt nghiệp Theo kinh nghiệm của người nông dân Trung Quốc, người trồng cây có múi ở vùng Địa Trung Hải đã biết sử dụng loài kiến bắt mồi Oecophylla smaragdia Fabricius phòng chống sâu ăn lá cam (Mc Cook 1882, Clausen 1966). Ngay từ thời xa xưa người trồng chà là ở Ả rập đã nhân nuôi kiến bắt mồi để phòng chống kiến ăn cây chà là. Đây cũng được coi là những trường hợp đầu tiên con người biết sử dụng kẻ thù tự nhiên (thiên địch) với mục đích của biện pháp sinh học. Họ biết phân biệt các loài kiến dựa trên tập tính ăn của chúng. Vallisnieri (1661-1730) là người Italia đầu tiên đề nghị sử dụng ong ký sinh Apanteles glomeratus Linneaus phòng chống bướm trắng hại cải Pieris rapae Linneaus (Doutt 1964). Tiếp theo đó, vào những năm đầu của thế kỷ 18 nhiều báo cáo đã đề cập đến tập tính ký sinh của một số loài côn trùng. Các tác giả cho rằng nhiều loài thiên địch có thể được sử dụng như một tác nhân quan trọng phòng chống sâu hại cây trồng. Có thể khẳng định, ngay từ thế kỷ 18 những kết quả ứng dụng đầu tiên biện pháp sinh học ở châu Âu chủ yếu tập trung sử dụng côn trùng ký sinh hoặc bắt mồi để phòng chống sâu hại cây trồng mà chưa có đề nghị nào về việc nhập nội thiên địch để phòng chống sâu hại cây trồng ở địa phương. Năm 1991, ở một số nước châu Âu đã nghiên cứu nhân nuôi và sử dung ong mắt đỏ Trichogramma sp. phòng chống nhiều loài sâu thuộc bộ cánh vẩy hại táo, bắp cải, củ cải đường, (Meyer, 1991). Cho tới nay nhiều nước châu Âu đã có nhà máy sinh học sản xuất hàng loạt ong mắt đỏ bằng dây chuyền cơ khí hóa, tự động hóa, góp phần đáng kể nâng diện tích cây trồng được sử dụng ong mắt đỏ phòng chống sâu hại. Từ năm 1973 đến 1987, Liên xô cũ đã nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma sp. và ong vàng Habrobracon để phòng chống sâu xám Agrotis và sâu xanh Helicoverpa armigera đạt hiệu quả. Theo Petov (1964) các loài bọ mắt vàng (chuồn chuồn cỏ) thuộc họ Chrysopidae là những loài thiên địch có ý nghĩa trong điều hòa số lượng sâu hại chính trên cây trồng ở Bungari. Cũng theo Zeleuny 1965 ở Tiệp Khắc cũ người ta đã sử dụng loại bọ mắt vàng Chrysopa carnea Steph để phòng chống sâu hại trên cây công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả tốt. Trang 15
  17. Đồ án tốt nghiệp Kể từ khi nhà khoa học Louis Pasteur phát hiện ra loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis gây bệnh trên sâu non tằm vào những năm đầu thế kỷ 19. Tiếp đến 1915, E. Bertiner (người Đức) cũng đã phân lập và xác định vi khuẩn Bacillus thuringiensis gây bệnh cho sâu non ngài Địa Trung Hải Anagasta kuchniella. Từ đó nhiều nước ở châu Âu đã tập trung nghiên cứu sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt để phòng chống trên 525 loài sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp có kết quả tốt. Ngay từ năm 1720 Phillips đã phát hiện virus gây bệnh côn trùng. Từ đó nhiều nhà khoa học ở các nước phát triển của châu Âu đã đi sâu nghiên cứu và sử dụng virus, một nhóm vi sinh vật gây bệnh có nhiều triển vọng để phòng chống sâu hại cây trồng. Balisneri (1709) đã phát hiện nấm gây bệnh trên côn trùng đã tạo điều kiện cho nhiều nhà khoa học ở các nước châu Âu nghiên cứu và sử dụng nấm gây bệnh côn trùng để phòng chống các loài sâu hại cây trồng. Năm 1878, Metschnhikov đã phát hiện và phân lập được nấm xanh Metashizium aurisophiae trừ sâu non bọ cánh cứng hại lúa mì Anisophiae austrinia có hiệu quả phòng chống sâu non, trưởng thành bọ đầu dài hại củ cải đường Bothinoderes pauctiventris. V.I. Bilai (1961), G. Seiketov (1962), Domsch (1980) đã lần lượt phát hiện nấm Trichoderma là những thành viên phổ biến trong hệ vi sinh vật đất, có khả năng đối kháng với các vi sinh vật khác thông qua việc tiết ra các chất kháng sinh, men rượu các chất có hoạt tính sinh học cao tạo khả năng ức chế các nấm dịch hại cây trồng như Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium. Đến nay nhiều nước châu Âu đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma để phòng chống hơn 150 loài vi sinh vật gây hại trên 40 loại cây trồng khác nhau. Ngay từ giữa thế kỷ 19 đã hình thành hướng nghiên cứu sử dụng tuyến trùng phòng chống côn trùng. Trước hết phải kể đến những công trình khoa học của các nhà tuyến trùng học như P. Bovien, J. R. Christie, N. A. Cobb, I. N. Filipjev, G. Fuchs, G. Steiner, G. Thorne (Nickle và Welch 1984). Theo Hara (1991) tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) có phổ sâu chủ rộng, khả năng tìm kiếm sâu chủ và Trang 16
  18. Đồ án tốt nghiệp sinh trưởng rất mạnh. Khoảng đầu những năm 1980, người ta đã có thể nhân nuôi hàng loạt tuyến trùng ký sinh côn trùng bằng in vi tro với các loài vi khuẩn cộng sinh của chúng (Beđing 1981, 1984) gắn liền với việc sử dụng những loài EPN nay phòng chống có hiệu quả sâu đục thân (Lindegren 1981), bọ cánh cứng hại nho đen (Ređing và Miller 1981, Simons 1981) tạo khả năng thương mại hóa sản phẩm sinh học tuyến trùng EPN diệt côn trùng gây hại cây trồng. Brooks (1986) chỉ rõ hầu hết các loài Nosema thuộc nguyên sinh động vật Pzotozoa đã được nghiên cứu sử dụng trong biện pháp sinh học phòng chống sâu non bộ cánh vẩy và sâu non thuộc bộ cánh thẳng như châu chấu, cào cào (Maddix vàctv, 1981). Lewis (1997) cho rằng từ năm 1980 một số nước châu Âu đã phát hiện và sử dụng nhện bắt mồi Amblyseius cucumeris để phòng chống bọ trĩ hại hành Thrips tabaci, bọ trĩ Frankliniella occidentalis, F. tritici và T. Obscuratus hại dưa chuột có hiệu quả rõ rệt. Môt số hiệu quả sử dụng biện pháp ĐTSH phòng chống sâu hại cây trồng ở các nước châu Âu: - Sử dụng ong ký sinh Allotropa burelli và Pseudaphicus malimus nhập nội từ Nhật Bản vào năm 1934-1941 phòng chống có hiệu quả Rệp Pseudococcus coustocki hại táo ở Liên xô cũ. - Vào những năm 60 của thế kỷ 20, viện BVTV của Liên xô cũ đã sản xuất thành công chế phẩm Virus phòng ngừa có hiệu quả sâu non ngài Portheroa dispar, sâu non bướm cải Barathra brassicae. - Từ năm 1972 ở Bungari đã sử dụng chế phẩm Beauveria để phòng trừ bọ lá khoai tây, sâu hại lúa, sâu hại mận có hiệu quả tốt. Cũng từ năm 1930 thế kỷ 20 ở Pháp đã sử dụng nấm Arthrobotrys oligospora, Dactylella ellipsospora để phòng chống tuyến trùng hại cây cải đường, khoai tây, cà chua, 1.2.2.2 Châu Mỹ Ngay từ năm 1883 ở các bang Colombia, Mitsuri, của Mỹ đã sử dụng thành công ong kén nhỏ Apanteles glomeratus nhập nội từ Anh phòng chống sâu bướm Trang 17
  19. Đồ án tốt nghiệp trắng hại cải và đã trở thành một tác nhân sinh vật có ích tồn tại trong hệ sinh thái đồng rau cho tới nay ở các bang đó. Năm 1887 người ta lại thành công trong việc nhập nội bọ rùa châu Úc Rodilia cardinalis vào Mỹ để phòng chống có hiệu quả Rệp sáp Icerya purchasi hại cam, chanh ở bang Califonia. Kết quả kỳ diệu này gắn liền với tên tuổi của nhà khoa học A. Koebele. Ông là người đầu tiên nghiên cứu biện pháp ĐTSH chống cỏ dại. Vào những năm 70 của thế kỷ 20 ở Mỹ đã nhân nuôi và sử dụng có hiệu quả ong mắt đỏ Trichogramma sp. và ong vàng Habrobracon sp. để phòng chống sâu xanh hại ngô, rau, đậu. Từ năm 1980 ở Mỹ đã phát hiện 86 giống với 1380 loài bọ mắt vàng, trong đó một số loài đã được nhân nuôi và sử dụng phòng chống có hiệu quả sâu hại bông, đay, Năm 1947 ở Haoai, Mỹ đã nhập nội ong ký sinh Opius oophibis từ Ấn Độ, Malasia để phòng chống ruồi đục quả Dacus dorsalis đạt kết quả tốt. Năm 1938 ở Haoai, Mỹ đã nhập nội và sử dụng thành công côn trùng bắt mồi Telsimia nitida từ Guama và Chilocorus nigritus từ Ấn Độ để phòng chống Rệp sáp Pinnapis buxi hại dừa, cọ. Năm 1993 ở Mỹ đã sản xuất chế phẩm virus NPV của sâu Spodoptera exigua cũng như một số chế phẩm virus khác được sử dụng có hiệu quả phòng chống sâu keo da láng hại bông, sâu cắn lá rau, đậu, cây lâm nghiệp, ngay ở những nơi mà biện pháp hóa học bị cấm. 1.2.2.3. Châu Á Hirashima (1990) cho rằng ở Nhật Bản ngay từ 1986 đã sử dụng ong Cotesia phitellae, Tetrastichus sokolowski và Diadromus subtilicornis phòng chống sâu tơ hại bắp cải trên diện rộng có kết quả tốt. Wauchrea (1988) chỉ rõ ở Trung Quốc ngay từ những năm 70 của thế kỷ 20 người nông dân ở các tỉnh An Huy, Vũ Hán, Hồ Bắc, đã sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma japonicum, Trichogramma dendrolimi để phòng chống sâu cuốn lá lúa, sâu róm hại thông, sâu cuốn lá hoa lan có hiệu quả rõ rệt, tỷ lệ ong ký sinh đạt trên 70% so với ruộng không thả ong. Trang 18
  20. Đồ án tốt nghiệp Từ những năm 1985-1990 ở Nhật người ta đã tạo ra quy trình sản xuất bọ mắt vàng Chrysopa theo quy mô công nghiệp và sử dụng chúng phòng chống sâu ăn lá khoai tây, sâu hại bắp cải đạt hiệu quả cao. Rachappa và Naik (2000) cho rằng ngay từ năm 1930 của thế kỷ 20 ở Ấn Độ đã sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma chilonis, Trichogramma japonicum phòng chống sâu đục thân mía trên diện rộng, đặc biệt trên ruộng mía trồng xen với rau mùi cho hiệu quả hơn hẳn những khu ruộng mía không thả ong. Chen (1963) cũng khẳng định ở Đài Loan đã sử dụng khá thành công ong mắt đỏ Trichogramma chilonis phòng chống sâu đục thân mía từ những năm 60. UbDNAi và Sunaryo 1986 chỉ rõ ở Malasia và Indonesia đã sử dụng thành công ong kén trắng C. Flavipes phòng chống sâu đục thân mía D. Saccharalis. Ngay từ những năm 80 của thế kỷ 20 ở Trung Quốc người đã sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisophiae (gọi là nấm xanh) và Beauvernia bassiana (gọi là nấm trắng) và phòng chống bọ cánh cứng hại khoai tây, sâu đục thân ngô, loài sâu hại khác thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera hại rau, đậu, có hiệu quả hẳn so với đối chứng không sử dụng biện pháp ĐTSH. Zen và ctv (1991) cho rằng từ năm 1990 đến nay Trung Quốc đã sản xuất hàng loạt chế phẩm tuyến trùng ký sinh côn trùng Steinernema carprocapsae và phòng chống có hiệu quả nhóm sâu đục thân Holcocerus insularis hại cây gỗ và Zeuzera muthitrigata hại cây bóng mát. 1.3. Khái quát về virus gây bệnh côn trùng 1.3.1. Lịch sử nghiên cứu virus gây bệnh côn trùng Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh tằm dâu và ong khi con người bắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này. Năm 384-322 Trước công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, nhưng người Trung quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm trước công nguyên. Trang 19
  21. Đồ án tốt nghiệp Năm 1856 Cornalia và Maestri đã mô tả bệnh tằm nghệ - bệnh virus. Các tác giả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm. Bolle (1898) mô tả sự sự hoà tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các hạt. Năm 1919 Akkva, Komarek và Breidl (1923) đã phát hiện dịch qua lọc có bản chất virus và gây bệnh, tạo nên những thể đa diện ở côn trùng. Người đầu tiên nhìn thấy virus gây bệnh côn trùng là Bergold trong những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện tử. 1.3.1.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng virus côn trùng trên thế giới Virus gây bệnh côn trùng là một nhóm tác nhân sinh học có nhiều triển vọng trong phòng chống côn trùng gây hại cây trồng. Bệnh virut hại côn trùng dược mô tả sớm hơn bệnh virus hại thực vật. Bệnh virus hại côn trùng đầu tiên do Cornalia và Maestri mô tả vào năm 1856 chính là bệnh tằm nghệ (mặc dù bệnh này được biết từ trước đó rất lâu). Các tác giả này là những người đầu tiên phát hiện thấy khi hòa tan thể vùi trong ruột tằm sẽ giải phóng ra các thể nhỏ. Komarek và Breindl vào năm 1923 đã khẳng định bản chất virus của bệnh tằm nghệ và bệnh thối nhũn ở sâu róm Lymantria monacha. Tuy nhiên, người đầu tiên tìm thấy các virus gây bệnh côm trùng lại là Bergold với các nghiên cứu công bố từ năm 1943 đến năm 1947. Sau đó trên thế giới xuất hiện hàng loạt các công trình nghiên cứu về virus gây bệnh cho côn trùng, đặc biệt sau khi có kính hiển vi điện tử (dẫn theo P.V.Lầm, 1995). Đến năm 1975, Martignoni và Iwai đã đưa ra danh sách 647 loài côn trùng thuộc các họ khác nhau bị virus tấn công. Đến những năm giữa thập niên 80, các nhà khoa học đã mô tả hơn 700 virus gây bệnh cho 800 loài côn trùng khác nhau (Jayaraj, 1985). Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng hơn 1.450 loài virus gây bệnh khác nhau thuộc 13 họ siêu vi khuẩn thiên địch được phân lập từ côn trùng và ve bét, trong đó khoảng 90% là thể vùi (Georghe và Gerard, 1984). Virus gây bệnh cho côn trùng (hay virus côn trùng) chỉ có khả năng sống, sinh sản ở trong các mô, tế bào sống, không thể nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Virus côn trùng có đặc điểm nổi bật là tính chuyên hóa hẹp, chỉ gây bệnh Trang 20
  22. Đồ án tốt nghiệp cho côn trùng và chỉ xâm nhiễm ở những mô nhất định của vật chủ. Virus côn trùng có thể tạo thành thể vùi như NPV, CPV, GV, EPV hoặc không tạo thành thể vùi như Iridovirus, Densovirus, Baculovirus trần (Jayaraj, 1985; Ramakrishnan, 1985). 1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng virus côn trùng để trừ sâu hại ở Việt Nam Ở nước ta, các nghiên cứu sử dụng virus côn trùng để trừ sâu hại mới được bắt đầu từ những năm cuối thập niên 1980. Các nghiên cứu này cũng chỉ tập trung vào nhóm NPV. Nghiên cứu sử dụng virus côn trùng trong phòng chống sâu hại gồm 2 mảng công việc riêng biệt là: nghiên cứu nhân nuôi hàng loạt sâu vật chủ bằng môi trường thức ăn và nghiên cứu phát triển, sử dụng chế phẩm sinh học từ NPV. Từ năm 1988 Viện Bảo vệ thực vật bắt đầu nghiên cứu môi trường thức ăn tổng hợp để nuôi sâu non các loài côn trùng cánh vẩy, như sâu cắn gié M. Separata, sâu xanh H. Armigera, sâu khoang S. Litura, sâu keo da láng S. Exigua, sâu đục thân ngô O. Furnacalis, sâu tơ P. Xylostella và sâu xanh bướm trắng P. rapae. Viện BVTV đã chế được 10 môi trường thức ăn từ nguyên liệu phế thải có sẵn ở trong nước để nuôi sâu xanh, sâu khoang và sâu keo da láng. Các môi trường này được Cục sở hữu công nghiệp Nhà nước cấp bằng sáng chế. Từ 1989 - 1990, Trung tâm nghiên cứu cây bông Nha Hố đã nuôi sâu xanh thành công bằng môi trường thức ăn nhập nội từ Ấn Độ, Thái Lan. Sau đó, Trung tâm nghiên cứu cây bông đã cải tiến những môi trường này cho phù hợp với Việt Nam. Cho đến nay, việc nghiên cứu môi trường thức ăn thành công nhất chỉ là đối với sâu khoang, sâu xanh. Có thể nuôi hai loài sâu này trong điều kiện thủ công ở phòng thí nghiệm với lượng lớn để phục vụ sản xuất chế phẩm NPV. Viện BVTV và Trung tâm nghiên cứu cây bông Nha Hố đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm NPV của sâu xanh, sâu khoang, sâu keo da láng, sâu đo xanh hại đay, sâu róm thông. Các chế phẩm HaNPV, SeNPV, S1NPV được sản xuất ở cả dạng lỏng và dạng bột thấm nước (1,5x107 PIB/mg). Trang 21
  23. Đồ án tốt nghiệp Trong phòng thí nghiệm, hiệu lực các chế phẩm AfNPV, HaNPV và S1NPV đối với sâu đo xanh hại đay, sâu xanh và sâu khoang tương ứng là 72,2-100; 78,7- 100 và 52,6-100%. Ở điều kiện đồng ruộng, hiệu quả chế phẩm NPV đối với sâu xanh, sâu keo da láng, sâu khoang, sâu đo xanh hại đay và sâu róm thông dùng trong liều lượng 250- 1000 sâu chết/ha rất biến động phụ thuộc vào cây trồng, địa điểm và thời gian sử dụng. Hiệu lực của chế phẩm HaNPV đối với sâu xanh trên thuốc lá tại Đồng Nai đạt 57,8-78,6%, còn tại Hà Nội chỉ đạt 31,6-51,1%. HaNPV để trừ sâu xanh trên bông ở Nha Hố và Sơn La cho hiệu lực tương ứng là 34,0-65,0 và 43,4-89,8%, (P. H. Nhượng và nnk, 1996, 1997; H. T. Việt và nnk, 1999, 2000). Đến nay chỉ mới có chế phẩm HaNPV được sử dụng nhiều hơn cả. Hàng năm chế phẩm được sử dụng trên diện tích vài trăm ha bông ở phía Nam. Sau đó là chế phẩm NPV sâu keo da láng được sử dụng trên hàng trăm ha hành tây, nho, đậu xanh ở Nam Trung Bộ. 1.3.2. Cơ sở khoa học sử dụng virus diệt côn trùng trong đấu tranh sinh học Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn virus tồn đọng trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp đấu tranh sinh học phòng chống sâu hại cây trồng trong tương lai. Năm 1923, Tanaka và Kaya đã miêu tả hơn 20 nhóm (họ) virus gây bệnh cho côn trùng. Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và Reoviridae. Đại diện của họ Baculoviridae là virus đa diện nhân (NPV- Nuclear polyhedrosis viruses) và đại diện của họ Reoviridae là virus đa diện tế bào chất (CPV - Cytoplasmic polyhedrosis viruses). Trang 22
  24. Đồ án tốt nghiệp Theo các tác giả Granados và Federici (1986); Possee (1993), Tanada và Kaya (1993), có hơn 600 loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera, Diptera là vật chủ của Baculovirut. Do đó có rất nhiều nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu virus tập trung vào nhóm virus này. Hầu hết Baculo virus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong một loài sâu, thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào đó của sâu (Groner, 1986). Baculovirut của Autographa californica (AcMNPV) và Baculovirut của Autographa falcifera có vật chủ của hơn 30 loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy - Lepidoptera. Những tác động có hại của Baculovirut đối với thiên địch và các ong kí sinh trưởng thành chưa được phát hiện trong tự nhiên (Groner, 1990). 1.3.3. Hình thái và cấu trúc của virus - Virus có cấu tạo vỏ gọi là Capsid có bản chất protein. - Trong vỏ capsid là nhân (Nucleoid) chứa ADN hoặc ARN. + Hình thái: Virus có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi. + Cấu trúc: - Vỏ và nhân: ADN virrus ARN virus Sợi đơn Sợi đôi Sợi đơn Sợi đôi Khi có bộ gen trong vỏ capsid thì gọi là virion hoặc là hạt virus. Vậy virion là hạt virus đầy đủ về hình thái, nó có thể là một nucleocapsid có vỏ bọc gọi là virus có vỏ, hoặc là một nucleocapsid trần gọi là virus không vỏ (Hình 1.8): Trang 23
  25. Đồ án tốt nghiệp Axit Nucleic Nucleocapsid Capsid Virion Capsomer Virus không vỏ Axit Nucleic Nucleocapsid Capsid Virion Capsomer Virus có vỏ Hình 1.8: Cấu tạo virus - Nucleocapsid là cấu trúc bao gồm capsid và axit nucleic. - Capsid là một vỏ protein của hạt virus bao gồm nhiều capsomer. 1.3.4. Phân loại nhóm virus diệt côn trùng Phân loại virus hại côn trùng gắn liền với lịch sử phát minh và những cấu trúc đặc trưng của chúng. Virus ký sinh trên vật chủ riêng biệt cho nên tên của virus được gắn với tên của ký chủ. Ví dụ virus đa diện nhân tằm có tên virus đa diện nhân Bombyx mori viết tắt là BmNPV, virus đa diện nhân của sâu xanh đục quả có tên virus đa diện nhân Helicoverpa armigera, viết tắt là HaNPV Virus côn trùng được phân thành 14 nhóm. Mỗi nhóm được miêu tả như một “họ” mặc dù phân loại virus côn trùng vẫn đang phát triển, đặc biệt là các đặc điểm hóa sinh, cho nên việc phân nhóm này không nên coi như là một quyết định cuối cùng. Khi nghiên cứu để xác định loại virus, các nhà khoa học thường dựa vào sự xuất hiện của các thể protein khác nhau, bởi virus côn trùng thường có vỏ protein Trang 24
  26. Đồ án tốt nghiệp bao bọc để tạo nên các thể vùi (virion) với hình khối đa diện hoặc hình dạng hạt, không phải các loại virus gây bệnh trên côn trùng đều tạo thành những thể vùi (Phạm Thị Thùy, 2004). Căn cứ vào cấu trúc của các virion, các nhà khoa học đã phân loại và chia virus côn trùng thành 7 nhóm chính như sau: Nhóm Baculovirus thuộc họ Baculoviridae Virus thuộc nhóm này có dạng hình que, hình gậy. Kích thước từ 40-70 nm x 250-400nm, nhóm virus này gồm có một vỏ lipoprotein bao quanh một protein nằm trong lõi DNA (nucleocapsid) trong đó có các virion, các virion bao gồm 11-25 polypeptid, trong đó có 4-11 polypeptid được kết hợp với nucleocapsid, số còn lại kết hợp với capsid, DNA của Baculovirus có cấu trúc 2 sợi vòng với trọng lượng phân tử từ 50-100 x 106, các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein lưới mắt cáo, các nhà khoa học gọi đó là thể vùi (Polyhedrosis Inclusion Body-PIB). Theo Tinsley và Kelly (1985), Baculovirus bao gồm một số loại sau:  Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus) viết tắt là NPV, đây là virus có hình đa giác, bên trong có chứa nhiều hạt virion hay còn gọi là thể vùi PIB. Loại virus này có thể lây bệnh rất cao với 7 bộ côn trùng như bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ hai cánh Diptera, bộ cánh màng Hymenoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthoptera, bộ cánh mạch Neuroptera và bộ cánh nửa Hemiptera trong đó có khoảng 300 loài côn trùng có bộ cánh vẩy và hai cánh là nhiều nhất, tập trung chủ yếu ở họ ngài đêm Noctuidae và họ ngài sáng Piralidae.  Virs hạt Granulosis virus (GV), đây là virus dạng hạt có hình oval, hình que Bên trong chỉ chứa một virion ít khi chứa 2 virion, loại virus này chỉ xâm nhập chủ yếu vào tế bào lớp hạ bì của mô mỡ và huyết tương, khả năng diệt sâu cao, DNA này thường có trọng lượng phân tử là 80 x 106, tỷ lệ guanin + xitozin trong DNA thường vào khoảng 35-39% (P. Wildy, 1971). Chúng là những virus chứa DNA (axit dezoxiribonucleic). Trang 25
  27. Đồ án tốt nghiệp  Virus có thể protein (thể vùi) khác nhau, bên trong có chứa các virion khác nhau cũng có khả năng diệt trừ sâu hại nhưng tỷ lệ thấp hơn NPV và GV.  Virus không tạo thể vùi hoặc tạo thành nhưng rất mỏng cho nên loại virus này ít có khả năng tiêu diệt sâu hại cây trồng. Triệu chứng sâu bị nhiễm bệnh do NPV: sâu bị bệnh do NPV trở nên ít hoạt động, ngừng ăn. Cơ thể chúng có màu sắc trắng hơn hoặc vàng hơn ở vùng ruột. Cơ thể căng phồng, trương phù, chứa nhiều nước. Sau khi chết thân sâu chuyển từ màu nâu sang màu đen, da dễ bị nứt vỡ khi có tác động cơ học, dịch virus giải phóng ra ngoài có mùi rất thối. Sâu chết do NPV thường treo ngược trên cây, nhưng nếu bị chết do NPV ở tế bào thành ruột thì phần đầu lại bám chặt vào các bộ phận của cây. Bình thường từ khi nhiễm đến khi sâu chết là từ 1 - 3 ngày, có khi lên đến 4 - 5 ngày nếu sâu đã trưởng thành. Nhóm cytoplasmic polyhedrosis virus - CPV (Reoviridae) Nhóm virus đa diện tế bào chất (CPV) gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng, chủ yếu đối với bộ Lepidoptera và Diptera. Virus trong họ Reoviridae có đặc điểm hình thái giống virus của NPV, nhưng chúng khác ở chỗ chúng chứa sợi đôi RNA trong bộ gen. CPV tạo thành các thể protein chứa các virion hình cầu có đường kính 50 - 65 nm (hoặc 68 - 69 nm). Các virion có một số gai ở đỉnh với chiều dài 20 nm. Trong thể vùi có thể bao gồm một hau nhiều virion. Mạng lưới protein của thể vùi phần lớn chỉ có một polypeptide, trọng lượng phân tử là 25.000 - 31.000 kDa. Trong bộ gen của virus CPV có sợi đôi RNA gồm 10 đoạn có trọng lượng phân tử 0,34 - 2,59 x 106. Người ta cho rằng mỗi đoạn có một gen. Dựa trên cơ sở phân đoạn của bộ gen, có ít nhất 12 loại (tip) của CPV được phân loại. Triệu chứng sâu chết do CPV: biểu hiện kém ăn, còi cọc, đôi khi phần đầu quá to so với cơ thể, ở giai đoạn cuối cùng của bệnh, màu sắc cơ thể sâu bị biến đổi, thường trở nên trắng hoặc vàng. Những triệu chứng khác bao gồm sự phát triển kéo dài và giảm ăn dẫn đến chết. Nhóm Entomopox virus (EV) thuộc họ Poxviridae Trang 26
  28. Đồ án tốt nghiệp Nhóm virus này gây bệnh chủ yếu trên côn trùng ở bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ hai cánh Diptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthoptera. Về hình thái nhóm EV có thể protein, DNA gồm 2 sợi có trọng lượng phân tử 110-200 x 108 và có ít nhất là 4 enzyme kết hợp, bên trong các thể vùi cò chứa các virion hình bầu dục, chúng xâm nhiễm vào các mô mỡ của côn trùng nên khả năng diệt sâu không lớn. Nhóm Irido virus (IV) thuộc họ Iridoviridae Đây là nhóm virus trần, chúng không tạo thành các thể vùi, các virion có hình cầu chứa DNA thẳng với hai loại kích thước, kích thước nhỏ khoảng 130 nm với trọng lượng phân tử 114-150 x 106 và kích thước lớn khoảng 240-288 x 108, trong virion có nhiều enzym DNA, ARN polymeraza, nucleotid phosphohydrolaza và protein kinaza. Nhóm virus này thường xuyên xâm nhiễm trong các mô tế bào chất của sâu nên cũng có khả năng diệt sâu nhưng không cao. Nhóm Denso virus (DV) thuộc họ Parvoviridae Nhóm virus này chỉ gây bệnh trên 3 loài sâu hại: Galleria mellonella, Junonia coenia, Agraulis vanillae. Virion chứa sợi DNA có trọng lượng phân tử 1,6-2,2 x 106. Nhóm này có kích thước nhỏ đường kính 20-22 nm. . Dựa trên cơ sở hình thái các virion và triệu chứng nhiễm bệnh, nhóm này chia thành type 1 (nhiễm bệnh và chết nhanh) và type 2 (chỉ nhiễm trong ruột và chết tương đối chậm). Nhóm virus ARN thuộc họ Picornaviridae Nhóm virus có sợi đơn RNA này có hạt virus kích thước 20 - 30 nm. Phần lớn các virus RNA được tách chiết từ nhiều loại côn trùng, chúng ký sinh trong tế bào chất và biểu mô tế bào ruột không tạo thể vùi. Người ta nhận thấy sự giống nhau của virus này với picornavirus, đặc biệt giống Enterovirut ký sinh ở động vật có xương sống. Nhóm Sigma virus thuộc họ Rhabdoviridae Nhóm này có tác nhân lây nhiễm di truyền, kích thước 140 x 1180 x 7 nm. Virus sigma là một tác nhân gây nhiễm di truyền có mặt thường xuyên trong quần thể sâu Drosophila melanogaster. Các hạt virut hình gậy với kích thước 75 x 200 Trang 27
  29. Đồ án tốt nghiệp nm với các gai trên bề mặt có chiều dài 8nm. Triệu chứng duy nhất đối với virut này là sự mẫn cảm của các ruồi dấm trưởng thành với CO2. Trong 7 nhóm virus trên thì nhóm Baculovirus và nhóm CPV là hai nhóm có tác dụng diệt sâu tốt nhất với hiệu quả phòng trừ cao nhất. Vì vậy, nhiều nước trên thế giới cũng như ở nước ta nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu. Đây là những virus đã ký sinh trên các loại sâu hại, được các nhà khoa học nhân nuôi để tạo ra chế phẩm virus và sử dụng chúng trong việc phòng trừ các loài sâu hại đó. Chúng gồm ba loại chính là virus đa diện dạng nhân (Nuclear polyhedrosis), loại virus thể hạt (Granulosis virus) và loại virus đa diện dạng tế bào chất (Cytoplasmis polyhedrosis virus). 1.3.5. Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus NPV (nuclear polyhedrosis virus) gây bệnh côn trùng SpltNPV thuộc nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae, nên nó mang những đặc điểm cấu tạo đặc trưng của họ này. SpltNPV tạo thể vùi có hình khối đa diện (NPV) (Chu Thị Thơm et al., 2006). NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nuclecocapsit), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nuleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside. DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi. SpltNPV có dạng hình que, đường kính 0,15 - 15 µm, chứa hàng trăm tiểu thể virus, mỗi tiểu thể gồm một hoặc nhiều nucleocapsid. Mỗi nucleocapsid có cấu tạo bên trong là DNA và bên ngoài được bao bọc bằng một capsid protein. Các virion dính lại với nhau để tào thành thể vùi là nhờ vào một chất nền cũng được cấu tạo bằng protein (Frances et al., 1998). Trang 28
  30. Đồ án tốt nghiệp GP64 Vỏ ngoài Thể vùi từ màng tế DNA virus bào vật chủ Vỏ bọc Nuleocapside ngoài virionVỏ bọ c calyx của polyhedra Virus nảy chồi Virus nằm trong cấu trúc polyhedra Hình 1.9 Cấu trúc của thể vùi Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsdi (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV - SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid - Multiple Nucleocapsid (NPV - MNPV). Khi pha loãng thấy chúng tạo huyền phù màu trắng đục, để quan sát thể vùi thì thường quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 15.280 - 20.000 lần ở độ phóng đại này thì có thể thấy thể vùi đa diện là những khối kết tinh có nhiều cạnh, có dạng gần giống như hình cầu. Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40µm (Burgess, S., 1977). Trang 29
  31. Đồ án tốt nghiệp Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp 2 - 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977). Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP): theo kết quả nghiên cứu của Bud, H.M et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa DNA và protein, sự kết hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo được 32 nm. DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng. Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985). Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al , 1966). Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng có lớp vỏ này chưa được xác định. 1.3.6. Đặc tính của NPV Kích thước nhỏ, dưới 1,4 chiều dài của sóng ánh sáng, nên các dụng cụ quang học cổ điển không nhìn thấy được. - Ký sinh trong tế bào, chỉ sinh sản, phát triển trong tế bào vật chủ, làm thay đổi đặc tính của tế bào vật chủ, hủy hoại chúng làm cho vật chủ chết. Trang 30
  32. Đồ án tốt nghiệp - Chúng có thành phần hóa học có khả năng gây ra phản ứng miễn dịch xác định được trên các cơ thể vật chủ. - Chúng có khả năng biến đổi khi có thể chuyển đổi. Hình 1.10 : Ảnh kính hiển vi điện tử đại diện các nhóm virus côn trùng. 1. MNPV của Lymantra dispar x 2940 lần 2. MNPV của Autographa californica x 2940 lần 3. SNPV của Helicoverpa zea x 5000 lần 4. MNPV của Lymantra dispar x 5000 lần 5. SNPV của Helicoverpa zea x 27150 lần 6. MNPV của Lymantra dispar x 19820 lần 7. GV của Plutella xylostella x 12500 lần 8. GV của Cnaphalocrocis x 29675 lần 9. Hạt virus Oryctes rhinoceros x 200000 lần 10. Lát cắt của hạt virus Oryctes rhinoceros x 135000 lần 1.3.7. Cơ chế xâm nhiễm của virus NPV Trang 31
  33. Đồ án tốt nghiệp Theo Vũ Mai Nam (2001) khi giải thích về cơ chế xâm nhiễm của NPVs như sau: virus SpltNPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua thức ăn, vào đến ruột giữa do tác động của dịch ruột, vỏ protein vỡ ra. Sâu bị nhiễm có màu trắng bệch, lờ đờ. Hai hoặc ba ngày sai khi bị nhiễm, sâu không ăn, nằm bất động cho đến khi cơ thể sưng lên, vỡ dịch chảy ra ngoài và sâu chết hẳn. Thời gian từ lúc virus xâm nhập vào cơ thể cho đến khi sâu chết thay đổi tùy theo tuổi và loài sâu thường kéo dài từ 3-12 ngày. Cơ chế giết sâu là ký sinh trên ký chủ và bắt đầu quá trình ký sinh khác làm bệnh lây nhiễm nhanh chóng và lan rộng không ngừng. Mặt khác, xác sâu chết trở thành thức ăn cho sâu sống vì thế sự lây nhiễm càng nhanh hơn (Vũ Mai Nam, 2001). Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non, cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá trình hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau: khi vào ruột các thể vùi PIB của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình này trải qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể vùi polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu. - Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần. - Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt và đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi. Giai đoạn này kéo dài 2-5 ngày. Trang 32
  34. Đồ án tốt nghiệp Sâu tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus. Nhưng sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn, vì quá trình ủ bệnh còn phụ thuộc vào tuổi sâu, điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và lượng thức ăn khi lây nhiễm Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể khác.  Sâu ăn lá cây bị nhiễm virus  Các thể vùi virus hiện diện trong lá  Hệ tiêu hóa trong ruột giữa của sâu  Các phân tử virus được phóng thích ra khỏi thể vùi và đến gắn vào mao mạch của vách ruột  Sự nhân một số virus trong tế bào sâu Virus Thể vùi Khoang máu Nhân tế bào Tế bào Dịch ruột Lá cây Hình 1.11 Sơ đồ lây nhiễm, xâm nhập và phát triển của NPV trong cơ thể sâu chủ 1.3.8. Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus Trang 33
  35. Đồ án tốt nghiệp Phần lớn các thể vùi của NPV, GV, CPV được giải phóng từ cơ thể sâu bị bệnh đã rã xuống đất hoặc bám trên các bộ phận của thực vật tạo thành những nguồn virus lan truyền bệnh. Những thể vùi của virus cùng thức ăn xâm nhập vào ruột côn trùng. Tại ruột côn trùng dưới tác động của các men tiêu hóa, thể vùi bị hòa tan và giải phóng các virion. Qua biểu mô ruột giữa virion xâm nhập vào dịch máu, tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong các tế bào để sinh sản và gây bệnh cho vật chủ. Theo Chu Thị Thơm el al. (2006), việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng xảy ra theo 2 hướng: - Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế hệ trong điều kiện bệnh phát thành dịch, nguồn virus có thể bám bên ngoài vỏ trứng của vât chủ. Khi trứng nở, ấu trùng gậm vỏ trứng chui ra và nhiễm nguồn bệnh. - Lây truyền dọc: là truyền nguồn bệnh qua trứng (qua phôi). Ngoài ra trong một số trường hợp virus có thể xâm nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua các vết thương trên cơ thể (qua vết chọc đẻ trứng của ong kí sinh, lỗ xâm nhiễm của một số ấu trùng kí sinh vào bên trong cơ thể). 1.3.9. Triệu chứng của bệnh virus trên sâu ăn tạp Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi nhận các triệu chứng như sau: - Dạng 1: sâu có màu trắng sang đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên, da dễ vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi. - Dạng 2: sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi hoặc có mùi hôi. - Dạng 3: sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ rách ở các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi. Sâu non sau khi bị nhiễm bệnh thì sức ăn giảm, động tác chậm, thường bò lên trên cao, cơ thể trước lúc chết bị mềm, các mô trong cơ thể chứa nhiều nước, da dễ Trang 34
  36. Đồ án tốt nghiệp bị nứt, chảy ra dịch màu trắng hoặc nâu, chưa có mùi hôi, cho đến khi có nấm mốc mọc mới có mùi. Sâu non bị chết thường có đuôi bám chặt vào cành cây, thân rũ xuống, dịch chảy xuống dưới làm cho phần cơ thể phía trước phình to lên. Dịch trong thân chứa nhiều NPV. Sau khi nhiễm bệnh thường trải qua 4 ngày mới chết, một số kéo dài đến 24 ngày (Trần Văn Mão, 2002). Nhộng sâu ăn khoang tạp bị nhiễm NPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng, rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng sinh sản giảm và truyền virus sang trứng. Trên đồng ruộng, dịch chứa virus có thể lan qua cây trồng và bị ăn bởi các con sâu khác. Sâu sẽ chết trong vòng 4-7 ngày sau khi nhiễm virus (Shepard B. M., 2009). Theo mô tả của Jayarasjs (1985): - Trong thời gian 2-3 ngày đầu của thời kỳ ủ bệnh, sâu non bị nhiễm bệnh không có biểu hiện triệu chứng bệnh rõ rệt và không có sự thay đổi về sức ăn. - Các ngày sau, các đốt thân của sâu non căng phồng và mọng nước dần, sâu chuyên động nhiều. - Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ. - Trước khi chết sâu thường trèo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây chúc đầu xuống phía dưới. - Dịch trắng chảy ra ngoài và sâu chết. - Dịch trắng không có mùi hôi. - Thời gian từ khi cơ thể mọng nước đến khi sâu chết không quá 1 ngày. Theo nghiên cứu của Abbas, M.S. et al (1988), thời gian ủ bệnh NPV của sâu khoang thường là 4 - 10 ngày. Đối với nhộng, trong thời kỳ ủ bệnh,triệu chứng bệnh không rõ, nhưng vào giai đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thân nhộng xuất hiện màu đục, da dễ vỡ, dịch trắng không có mùi hôi chảy ra và nhộng chết. Sâu trưởng thành bị bệnh vào giai đoạn cuối da cũng bở, dễ vỡ và có dịch trắng chảy ra. Trang 35
  37. Đồ án tốt nghiệp 1.3.10. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại 1.3.10.1. Ưu điểm của chế phẩm NPV Theo Szewczyk et al. (2009), Baculovirus chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác và sẽ bị bất hoạt khi chúng xâm nhập vào tế bào động vật. Điều này có nghĩa là Baculovirus không làm ô nhiễm môi trường sống, không gây ngộ độc thuốc hay lưu tồn, như khi sử dụng thuốc hóa học. Baculovirus là chủng có tính chọn lọc ký chủ rất cao so với các nhóm virus thiên địch khác (Frances et al., 1998) do đó mà không làm hại đến các loài côn trùng có ích khác như thuốc hóa học. Baculovirus có cấu trúc với thể bọc bảo vệ, tránh các yếu tố bất lợi của môi trường nên có thể duy trì khả năng sống trong tự nhiên ngoài cơ thể vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007). Cũng theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) thì Baculovirus rất thuận lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng (1010 virus/ấu trùng). Chế phẩm có thể giữ hoạt tính trong thời gian rất dài (10 - 15 năm) ngoài cơ thể côn trùng. 1.3.10.2. Nhược điểm của chế phẩm NPV Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây thối. So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Ngoài ra chế phẩm virus còn gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Do Baculovirus rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm virus cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên. Trang 36
  38. Đồ án tốt nghiệp Vì là tác nhân sinh học nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, ) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học. Một khuyết điểm khác nữa là trong điều kiện tự nhiên, các loài sinh vật có thể tiêu diệt lẫn nhau làm giảm tác động của thuốc trong việc phòng trừ dịch hại (Quang Chân Chân, 2002). 1.3.11. Hiệu quả diệt sâu của virus NPV Việc nghiên cứu, xác định LC50 được thực hiện với nhiều chủng virus NPV. Sử dụng baculovirus Spilarctic obliqua nucleopolyhedrosis virus trong việc phòng trừ Porthesia xanthorrhoea gây hại dâu R.Varatharajan, M.Ingobi Singh & Lreeta (2006) cho biết. Spilarctic obliqua nucleopolyhedrosis virus (SoNPV) được sử dụng có hiệu quả trong việc phòng trừ S. obliqua cũng như Porthesia xanthorrhoea. Các tác giả cũng đã xác định được LC50 của SoNPV đối với sâu S. obliqua ở nồng độ là 2,5 x 4 4 10 PIB/ml và của P. xanthorrhoea ở nồng độ là 3,7 x 10 PIB/ml. LT50 của SoNPV dùng để phòng trừ S. oblique là 5,73 ngày và P. xanthorrhoea 6,89 ngày. Bằng cách lây nhiễm SoNPV trong việc phòng trừ P.xanthorrhoea có thể dễ dàng dùng để sản xuất một lượng sinh khối lớn cho việc sản xuất thuốc trừ sâu. Hiệu lực của SpltNPV dùng để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau được thực hiện bởi B.S.Ravishankar và M.G.Venkatesha (2010). Các tác giả thực hiện 3 thí nghiệm để xác định mức độ ảnh hưởng của NPV đến các loài cây ký chủ. Cụ thể như sau: Thí nghiệm đầu tiên nuôi sâu non Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau và khi tới tuổi 2 thì thay bằng thức ăn nhân tạo được lây nhiễm ở các nồng độ khác nhau. Giá trị LC50 của NPV đối với sâu Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau như sau: bắp cải 0,42; bông 0,61; khoai tây 0,75; lạc 0,93 và hoa hồng 1,28 PIB/mm2. Trong thí nghiệm 2, Spodoptera litura được nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo cho đến tuổi 2 và sau đó được cho ăn trên các cây ký chủ khác nhau khi đã nhiễm SpltNPV. Giá trị LC50 trên hoa hồng là cao nhất 1,81; tiếp theo là lạc; khoai tây; bông và bắp cải (0,40 PIB/ml). Trong thí nghiệm 3 Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau cho đến tuổi 2 và sử dụng phương pháp nhúng lá để đánh giá LC50. Giá trị LC50 Trang 37
  39. Đồ án tốt nghiệp tăng theo thứ tự là lạc, khoai tây, bông và bắp cải (1,02 PIB/ml). Trong cả 3 thí nghiệm trên thì LC50 của bắp cải là thấp nhất và của hoa hồng là cao nhất. Xác định LC50 của NPV trong trường hợp có trộn thêm acid boric để tăng cường khả năng diệt sâu Lauro Morales và cộng sự (1997). Nồng độ boric acid (0,02; 0,03; 0,045; 0,067 và 0,101 g/ml) được kết hợp với AgNPV làm tăng hiệu lực diệt sâu. Bảy ngày sau khi nhiễm nồng độ gây chết trung bình 50% (LC50) là 1,52 x 105 chỉ có AgNPV và 7,95 x 102 khi phối trộn AgNPV với 0,045 g/100ml boric acid. Quan sát các ngày sau khi nhiễm (9,11 đến 14 ngày) thì LC50 của hổn hợp NPV + boric acid thấp hơn 4 lần khi chỉ có NPV. Thời gian gây chết trung bình 50% (LT50) là 13,6 ngày khi chỉ có NPV, trong khi đó hổn hợp NPV + boric acid thì giá trị LT50 giao động từ 13,7 ngày (boric acid 0,02 g/100ml) đến 7,4 ngày (boric acid 0,101 g/ml). Do đó có thể bổ sung boric acid vào AgNPV để tăng hiệu lực diệt sâu A. gemmatalis và rút ngắn thời gian tử vong bởi các tác nhân gây bệnh. Kết quả nghiên cứu NPV và hiệu quả của sự kết hợp NPV với thuốc hóa học để phòng trừ sâu ăn tạp Spodoptera litura Trần Thị Kiều Trang và S. Chaudhari (2002). Sử dụng NPV để phòng trừ sâu hại là một trong những biện pháp tối hảo trong chường trình IPM, NPV là một trong những nhóm phụ của họ Baculovirus được xem như một loại thuốc sinh học với tính chuyên biệt cao đối với nhiều loài sâu hại thuộc họ Lepidoptera. Nồng độ sử dụng tùy thuộc nhiều vào độ tuổi của sâu. Sâu 2 ngày tuổi sẽ bị nhiễm nhanh gấp 1500000 lần so với sâu ở 8 ngày tuổi, thời gian yêu cầu để 50% sâu chết gia tăng với tuổi sâu. LT50 tăng từ 4,4 ngày đối với sâu 2 ngày tuổi đến 9,4 ngày ở sâu 8 ngày tuổi. LT50 có sự phụ vào liều lượng, LT50 tăng khi tuổi sâu tăng, giảm khi liều lượng tăng. Sự kết hợp NPV với một số thuốc hóa học ở liều lượng cực nhỏ cho thấy có kết quả tốt như trong trường hợp NPV kết hợp với Actara và Difubenzuron cho tác dụng bỗ trợ tăng phần trăm tỷ lệ chết của sâu và thời gian gây chết được rút ngắn hơn so với sử dụng NPV đơn độc. Từ các kết quả nhận được cho thấy tiềm năng sử dụng NPV để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài rau màu là có triển vọng tốt phù hợp với chương trình an toàn lương thực thực phẩm. Trang 38
  40. Đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu của Baskaran et al., (1999) khi chỉ có NPV (108 PIB/ml) và kết hợp giữa NPV ở nồng độ (2 x 104 PIB/ml) với dầu neem (1%), chiết suất từ nhân hạt neem (5%) và chiết suất từ bánh neem 5%. Kết quả cho thấy sự tăng hiệu lực NPV và tỷ lệ tử vong tăng từ 31,1% đến 81,5% và 57,6% tương ứng. Sự kết hợp giữa NPV với Vitex negundo 10% không làm tăng hiệu lực của NPV, trong khi đó Prosopis juliflora và Ipomoea carnea gây ra sự đối kháng với virus NPV. Kết hợp của virus NPV với các sản phẩm từ Neem làm giảm sự thiệt hại của sâu non gây ra và làm giảm LT50 của virus NPV. Sử dụng kết hợp của NPV với dầu neem ở các nồng độ khác nhau (0,1 - 1%) và chiết suất từ nhân hạt neem làm giảm LC50 của virus NPV tương ứng từ 1,06 - 1,43 (lần) và 1,03 - 1,33 lần.  QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỬ DỤNG NPVsl : Dựa vào các kết quả nghiên cứu về các đặc tính và hiệu lực trừ sâu khoang của NPVsl, đồng thời dựa vào kết quả nhân nuôi thực tế, tạo sinh khối lớn tại một số phòng thí nghiệm, cho phép xây dựng quy trình sản xuất và sử dụng NPVsl (Hình 1.12). Trang 39
  41. Đồ án tốt nghiệp Nhân ký chủ Nhân ký sinh NPVsl ĐT phòng trừ Thu nuôi sâu giống Nhiễm NPVsl cho sâu khoẻ Giữ nhộng Thu sâu chết NPVsl Điều tra mật độ Ghép, nuôi bướm Nghiền, lọc sâu chết Sâu khoang Trộn phụ gia Thu trứng Ly tâm 500, 3000 v/ph thu thể vùi (PIB) Phun NPVsl Trừ sâu khoang Nuôi sâu non tuổi Tiêu chuẩn hoá lượng 1-2 PIB Đóng chai Nuôi sâu non tuổi Đánh giá hiệu 3-4 quả sử dụng NPVsl Thu, chọn sâu tuổi Bảo quản lạnh (- 18 4 đến – 200C) Hình 1.12: Sơ đồ sản xuất và sử dụng NPVsl Trang 40
  42. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ ngày 25/06/2013 đến ngày 15/09/2013, tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học của trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM. 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu Hộp nhựa lớn đựng nuôi sâu (nắp đục lỗ và lắp lưới chống côn trùng cho thông thoáng), hộp nhựa nuôi nhân nhiễm NPV, hộp nhỏ thu nhận mẫu, cọ bắt sâu, cân, đũa thủy tinh, pipep, cốc thủy tinh, bút lông ghi mẫu, bông gòn. Các trang thiết bị khác: máy ly tâm, buồng đếm hồng cầu, tủ lạnh, kính hiển vi, bếp từ, máy xay sinh tố. Các hóa chất: Ethanol 70%, formaldehyl 5%.  Thức ăn nhân tạo được làm theo công thức: - Đậu xanh hạt ngâm 150 g - Men mì 15 g - Methyl - paraben 2,5 g - Sorbic acid 1,5 g - Ascorbic acid 3 g - Vitamin tổng hợp 10 ml - Casein 3 g - Agar 10 g - Nước cất 700 ml 2.1.3. Nội dung nghiên cứu Xác định thời gian thu nhận sâu chết để thu được lượng PIBs cao nhất. 2.1.4. Quy trình nhân nuôi sâu khoang Để sản xuất được SpltNPV, trước hết phải nuôi được sâu khoang với số lượng lớn, sâu khỏe. Trang 41
  43. Đồ án tốt nghiệp Để sản xuất sâu khoang thì bắt sâu khoang giống ở ngoài đồng ruộng (thường thì ổ trứng). Trứng sâu sau khi nở được nuôi trong hộp nhựa và được cho ăn bằng thức ăn nhân tạo. Hằng ngày kiểm tra, bổ sung thức ăn cho sâu. Khi sâu đến 6 - 7 ngày tuổi thì có thể tách bớt sâu sang các hộp nhựa có kích thước (19,5 cm x 12 cm x 7 cm) với mật độ sâu là từ 10 đến 20 sâu. Khi sâu vào nhộng, cho nhộng vào hộp nhựa. Mỗi hộp chưa 20 - 30 nhộng, giữ đủ ẩm cho nhộng vũ hóa. Hình 2.1: Nhộng cho vào hộp nhựa để vũ hóa Khi bướm vũ hóa, tiến hành ghép, mỗi cặp 1 bướm cái và 1 bướm đực thả vào lồng nuôi bướm. Dung dịch nước mật 20% và nước cất thấm vào bông được cho vào đáy lồng để bướm ăn thêm. Sau khi ghép bướm 1 - 2 ngày thì bướm đẻ tiến hành thu trứng xử lý bằng formaldehyl 5%. Sau 2 - 3 ngày thì trứng nở. Hình 2.2: Ghép bướm sâu khoang Trang 42
  44. Đồ án tốt nghiệp Sâu non được nuôi trên lá thầu dầu hoặc thức ăn nhân tạo cho đến tuổi cần thí nghiệm. Hình 2.3: Nhân nuôi sâu bằng lá thầu dầu. Hình 2.4: Nuôi bằng thức ăn nhân tạo 2.1.5. Phương pháp đếm virus Thu sâu chết giữ trong lọ (định mức đến 1 sâu/ml nước) và để ở nhiệt độ phòng cho tới khi xác sâu rữa ra. Hình 2.5: Thu sâu nhiễm NPV Lọc qua 2 lớp vải mỏng để loại bỏ xác sâu và tiến hành ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút, trong thời gian 5 phút. Loại bỏ phần cặn lắng phía dưới đáy ống, lấy phần nước ở trên. Ly tâm tiếp với tốc độ 6000 vòng/phút, trong thời gian 30 phút, lấy phần tinh thể trắng lắng đọng ở dưới, đó là các thể vùi PIB của NPV. Trang 43
  45. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.6: Lọc, loại bỏ xác sâu. Hình 2.7: Ly tâm thu NPV Cho 1 gọt dịch virus vào buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng PIB/sâu. Đếm số lượng PIB trên 5 ô lớn (mỗi ô lớn bao gồm 16 ô nhỏ) trên buồng đếm, đếm 3 lần ở mỗi nồng độ pha loãng và ở 5 ô lớn khác nhau lấy giá trị trung bình. Hình 2.8: Hình dáng virus trên buồng đếm hồng cầu  Công thức xác định PIB: Số PIB trong 1 ml mẫu = A x (4000/80) x F x 1000 Trong đó: - 4000 = 400 x 10 (Error! mm2: diện tích một ô nhỏ; Error! mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamelle). - A là tổng số PIB đếm được trong 80 ô nhỏ. - F là hệ số pha loãng mẫu. 2.2. Tiến hành thí nghiệm 2.2.1 Mục đích : Xác định thời gian thu nhận sâu chết để thu được lượng PIBs cao nhất. Trang 44
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với nồng độ dịch nhiễm 1,8 x 105 ; 1,8 x 106 ; 1,8 x 107 đối với sâu tuổi 4 thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần là 20 sâu. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm Tuổi sâu Nồng độ dịch nhiễm ( PIB/ml ) nhiễm 4 1,8 x 105 1,8 x 106 1,8 x 107 2.2.3 Phương pháp tiến hành Thí nghiệm được tiến hành dựa theo phương pháp của McKInley (1985) và có cải tiến một số thao tác cho phù hợp, cụ thể như sau: - Nguồn sâu: được lấy từ trứng của các cặp bướm nuôi được. Chọn sâu tuổi 4 để đói 2 tiếng trước khi đem nhiễm virus. Hình 2.9: Chuẩn bị sâu thí nghiệm. Hình 2.10: Thức ăn nhân tạo để nhân nhiễm - Thức ăn nuôi sâu: Sử dụng thức ăn nhân tạo. Đổ cẩn thận thức ăn vào trong các hộp nhựa, sao cho bề mặt thức ăn không bị rỗ để tránh sự phân bố không đều của dịch nhiễm. Thức ăn được để nguội ở nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ lạnh đến khi sử dụng mới lấy ra để tránh bị hư. - Chuẩn bị dịch nhiễm: Nguồn virus NPV sử dụng là nguồn virus gây chết thu được từ tự nhiên và đem về nhân lên trong điều kiện thí nghiệm. Dịch virus thu Trang 45
  47. Đồ án tốt nghiệp được sau khi lọc thô, chuẩn nồng độ cần để nhiễm 1,8 x 105 ; 1,8 x 106 ; 1,8 x 107 (nồng độ giảm dần theo số lần pha loãng 10-1). - Nhiễm dịch: Cho vào mỗi hộp thức ăn dịch NPV và dùng chổi lông để quét đều dịch virus lên bề mặt thức ăn. Lưu ý để cho bề mặt thức ăn khô trước khi cho sâu vào. Hình 2.11: Quét dịch virus NPV lên mặt thức ăn nhân tạo - Mỗi nghiệm thức sử dụng 20 sâu, lặp lại 3 lần. Sâu được nhiễm với số lượng 20 con/hộp. Hình 2.12: Sâu tuổi 4 trong môi trường thức ăn nhân tạo có nhiễm virus NPV - Hộp nuôi sâu được để ở điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ 26 ± 10C), thay thức ăn nhân tạo và theo dõi hàng ngày để đếm số sâu chết. 2.2.4 Chỉ tiêu theo dõi - Khối lượng sâu chết bệnh NPV trong khoảng 3 ngày sau khi nhân nhiễm.( Ngày 5, 6, 7) Trang 46
  48. Đồ án tốt nghiệp - Số lượng PIB/sâu của các công thức. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm được đưa vào xử lý thống kê, bằng chương trình Microsoft Excel, Statgraphic centurion. Trang 47
  49. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khối lượng trung bình của sâu khoang qua 3 ngày tại các nồng độ nhân nhiễm Bảng 3.1: Khối lượng sâu tuổi 4 chết ở các ngày sau khi nhân nhiễm virus Tình trạng Ngày Khối lượng/sâu (g/sâu) thu Nồng độ 1,8 x 105 1,8 x 106 1,8 x 107 Sống 5 0,3514 ab 0,3575 ab 0,3542ab 6 0,3897 ab 0,4882 a 0,4705 a 7 0,4557 a 0,5342 a 0,4725 a Chết 0,4475 a 0,4582 a 0,4351a nguyên Chết rã 0,3216 ab 0,3552 ab 0,2781b  Nhận xét: Sau khi lây nhiễm virus 5 ngày sâu vẫn tiếp tục tăng sinh khối cho đến khi sâu chết. Khối lượng sâu ở ngày 5 nhỏ hơn hẳn thứ 6 và thứ 7. Cụ thể, khối lượng sâu khi nhiễm ở nồng độ 1,8 x 106 ở ngày 5 là 0,3575g, ngày 6 là 0,4882g và ngày 7 là 0,5342g. Trọng lượng sâu ngày 6 và 7 không có sai khác. Điều này cho thấy, từ ngày 6 trở đi sâu có tăng khối lượng nhưng không đáng kể. Khối lượng sâu sau khi nhiễm 7 ngày không khác biệt với sâu chết nguyên, khối lượng lúc này cũng không tăng đáng kể. Mặc khác, so sánh giữa các nồng độ lây nhiễm khác nhau, khối lượng sâu đạt cao nhất ở nồng độ 1,8 x 106 tương đương với 7,83 x 103 PIB/cm2 và thấp nhất ở nồng độ 1,8 x 105 tương đương với 7,83 x 102. Nhận xét này tương tự với kết quả của Kumar và cs (2005), với 3 nồng độ lây nhiễm là: 3932; 1966; 983 thì khối lượng sâu đạt cao nhất ở 1966 PIB/mm2, thấp nhất là 3932 PIB/mm2. Tương tự như vậy, khối lượng của sâu chết thấp nhất ở công thức 1,8 x 107 có khối lượng là 0,4351g, cao nhất là ở công thức 1,8 x 106 có khối lượng là 0,4582g. Tuy nhiên sự sai khác về khối lượng của sâu chết giữa các công thức không có ý nghĩa thống kê. Trang 48
  50. Đồ án tốt nghiệp Smith and Vlak đề nghị rằng nên thu sâu Spodoptera Exigua trong giai đoạn từ 4 đến 6 ngày sau khi nhiễm. Các tác giả cho rằng các thể vùi polyhydra không sinh sản sau 7 ngày lây nhiễm trên sâu. Biểu đồ 1: Khối lượng sâu ở nồng độ 1,8 x 105PIB/ml Biểu đồ 2: Khối lượng sâu ở nồng độ 1,8 x 106PIB/ml Trang 49
  51. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 3: Khối lượng sâu ở nồng độ 1,8 x 107PIB/ml Kết luận: Khối lượng thu sâu khi thu ngày 6 và ngày 7 khá cao nhưng không có sự sai khác. Đối với dạng thu (sống, chết nguyên), được thu ở cùng nồng độ, cùng ngày, khi xét cụ thể thì khối lượng sâu cao nhất khi thu ở dạng sống, sau đó là chết nguyên, nhưng khối lượng ở hai dạng này không có sự sai khác. Xét về nồng độ thì ở nồng độ 1,8 x 106 cho khối lượng cao nhất. Nhưng lượng virus (số PIB/sâu) như thế nào thì chưa thể xác định được. Vì vậy, cần phải xác định lượng virus có trong sâu đã nhiễm virus NPV mà sinh viên đã thu. 3.2. Sản lượng virus nhân lên trong sâu tuổi 4 ở các nồng độ Bảng 3.2.Số lượng virus đếm được sau khi nhiễm đối với sâu tuổi 4 Tình trạng Ngày Lượng virus/sâu (PIB/sâu) thu Nồng độ 1,8 x 10̀̀5 1,8 x 106 1,8 x 107 Sống 5 4,17 x 108 b 7,17 x 108 ab 5,50 x 108 b 6 6,33 x 108 ab 8,00 x 108 ab 7,67 x 108 ab 7 1,28 x 109 a 1,45 x 109 a 9,17 x 108 ab Chết 1,17 x 109 a 1,71 x 109 a 9,89 x 108 ab Trang 50
  52. Đồ án tốt nghiệp nguyên Chết rã 8,33 x 108 ab 1,02 x 109 a 8,44 x 108 ab  Nhận xét: Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy trong cùng 1 nống độ nhiễm, sản lượng virus tăng dần theo thời gian gây nhiễm trên sâu. Ở nồng độ nhiễm 1,8 x 105 lượng virus tăng khá nhanh qua từng ngày. Cụ thể, ở 5 ngày sau nhiễm lượng virus chỉ đạt 4,7 x 108 tăng lên đến 6,33 x 108 ở ngày thứ 6 và đến ngày thứ 7 lượng virus đạt 1,28 x 109 . Tương tự như vậy, đối với nồng độ gây nhiễm là 1,8 x 106 lượng virus đạt 7,17 x 108 vào ngày 5 sau khi nhiễm tăng lên 8 x 108 sau 6 ngày nhiễm và đạt đến 1,45 x 109 sau 7 ngày nhiễm. Ở nồng độ lây nhiễm 1,8 x 107 sản lượng virus tăng từ 5,5 x 108 đến 7,67 x 108 và 9,17 x 108 tương ứng với sâu sau khi nhiễm 5, 6, 7 ngày. So sánh với sản lượng virus thu được trên sâu chết ở bảng 3.2 cho thấy không có sự sai khác về sản lượng virus giữa sâu sống sau khi nhiễm 7 ngày và sâu chết. Tuy nhiên, so với sâu chết rã thì lượng virus này giảm hơn hẳn. Điều này cho thấy, đối với sâu tuổi 4 sau khi nhiễm 7 ngày có thể tiến hành thu sâu ngay cả khi sâu còn sống để tránh thất thoát virus ra môi trường. Vì sâu chết rất dễ bị vỡ ra vừa khó thu vừa mất sản lượng virus. Tuy nhiên, Kumar và cs (2005) thì cho rằng lượng virus trong sâu chết cao hơn so với lượng virus khi thu sâu còn sống ở các ngày 5, 6, 7 sau khi nhiễm. Mặc dù vậy các tác giả này lại khuyến cáo rằng nên thu sâu sau khi nhiễm còn sống để giảm sự lây nhiễm của các vi khuẩn, vi sinh vật khác sẽ làm giảm sản lượng virus đến 20%. Shapuro and Bell khi nghiên cứu trên Lymantria dispar NPV. So sánh sản lượng virus giữa 3 nồng độ lây nhiễm thì nồng độ 1,8 x 106 cho sản lượng virus cao hơn. Vì vậy, nên sử dụng nồng độ này để nhiễm cho sâu tuổi 4. Kumar và cs (2005) cho rằng có một mối tương quan nghịch giữa nồng độ và sản lượng virus thu được vì các tác giả cho rằng với nồng độ lây nhiễm cao thì sâu sẽ bị giết chết trước khi đạt khối lượng cao nhất và dẫn đến giảm lượng virus. Trang 51
  53. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 4: Lượng virus trên sâu sau khi nhiễm ở nồng độ 1,8 x 105PIB/ml Biểu đồ 5: Lượng virus trên sâu sau khi nhiễm ở nồng độ 1,8 x 106PIB/ml Trang 52
  54. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 6: Lượng virus trên sâu sau khi nhiễm ở nồng độ 1,8 x 107PIB/ml Kết luận: Từ những nhận xét trên cho thấy, lượng virus thu được nhiều nhất khi thu ở dạng chết nguyên, nhưng lượng virus thu được giữa sâu sống và sâu chết nguyên lại không có sự khác biệt. Mà các tác giả nghiên cứu trước cũng khuyến cáo nên thu sâu ở dạng sống. Lượng virus ngày càng tăng theo ngày thu, và nồng độ thích hợp cho việc nhân nhiễm là 1,8 x 106. 3.3. Mối tương quan giữa khối lượng và sản lượng virus nhân lên trong một sâu ở các nồng độ Bảng 3.3: Tương quan giữa khối lượng và sản lượng virus Nồng độ Ngày thu Khối lượng Sản lượng trên sâu 1,8 x 105 5 0,3514 4,17 x 108 8 6 0,3897 6,33 x 10 7 0,4557 1,28 x 109 1,8 x 106 5 0,3575 7,17 x 108 8 6 0,4882 8,00 x 10 7 0,5342 1,45 x 109 8 1,8 x 107 5 0,3542 5,50 x 10 6 0,4705 7,67 x 108 Trang 53
  55. Đồ án tốt nghiệp 7 0,4974 9,17 x 108  Nhận xét: Kết quả cho thấy, trong cùng một nồng độ, khi khối lượng sâu càng tăng thì sản lượng virus càng tăng, ở nồng độ 1,8 x 105 khối lượng sâu sau khi nhiễm 5 ngày đạt trung bình là 0,3514g có sản lượng virus là 4,17 x 108. Sau 6 ngày khối lượng trung bình là 0,3897g cho sản lượng virus là 6,33 x 108. Đến ngày 7 khối lượng đạt 0,4557g cho sản lượng virus là 1,28 x 109. Tương tự ở 2 nồng độ còn lại cũng cho thấy sự tương quan này. Biểu đồ 7: Tương quan giữa trọng lượng và sản lượng virus ở nồng độ 1,8 x 105PIB/ml Trang 54
  56. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 8: Tương quan giữa trọng lượng và sản lượng virus ở nồng độ 1,8 x 106PIB/ml Biểu đồ 9: Tương quan giữa trọng lượng và sản lượng virus ở nồng độ 1,8 x 107PIB/ml Kết luận: Khi khối lượng sâu càng tăng thì lượng virus có trong sâu cũng tăng Trang 55
  57. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận: - Sau khi nhiễm 5 ngày khối lượng sâu vẫn có chiều hướng tăng cho đến khi chết. Khối lượng sâu sau nhiễm 5 ngày sai khác rõ với 6, 7 ngày sau nhiễm và khối lượng sâu không tăng sau khi nhiễm virus 7 ngày . - Lượng virus tăng dần trong cơ thể sâu sau các ngày phơi nhiễm và đạt cao nhất khi sâu chết. Tuy nhiên, không có sự sai khác về số virus trong cơ thể sâu sống sau khi nhiễm 7 ngày so với sâu chết. - Trong 3 nồng độ nhân nhiễm (1,8 x 105; 1,8 x 106; 1,8 x 107 ), sản lượng virus đạt cao nhất ở nồng 1,8 x 106PIB/ ml (7,83 x 103/cm2). 4.2. Kiến nghị: - Trong sản xuất virus nên tiến hành thu sâu sống sau khi lây nhiễm 7 ngày thay vì đợi đến khi sâu chết. - Tiếp tục đánh giá hiệu lực diệt sâu của virus thu được từ nguồn sâu qua các ngày phơi nhiễm. Trang 56
  58. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài và Nguyễn Văn Tó (2006). Tìm hiểu về chế phẩm vi sinh vật dùng trong nông nghiệp, Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động, Nhà xuất bản lao động, Hà Nội. [2] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006). Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống, Nhà xuất bản Lao động, Hà Nội. [3] Ngô Trung Sơn (1999). Nghiên cứu sử dụng HaNPV trong phòng trừ tổng hợp sâu xanh hại bông tại Ninh Thuận. Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. [4] Nguyễn Công Thuật (1996). Phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại cây trồng. Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp. [5] Nguyễn Đức Khiêm (2006). Giáo trình Côn trùng nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội. [6] Nguyễn Thị Hai (1996). Sâu hại và thiên địch của chúng trên cây bông. Sách: Kết quả nghiên cứu khoa học (1976-1996). Nxb Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, tr.108-120. [7] Nguyễn Thị Kiều Khuyên (2002). Tình hình thiên địch trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab.), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Hubner.) và một số đặc điểm hình thái, sinh học của sâu xếp lá (Lamprosenma indica Fab.), tại Cần Thơ, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [8] Nguyễn Văn Huỳnh (1999). Côn trùng nông nghiệp, Đại học Cần Thơ. [9] Nguyễn Văn Huỳnh & Lê Thị Sen (2004). Côn trùng gây hại cây trồng chính ở đồng bằng sông Cửu Long, Giáo trình côn trùng nông nghiệp, phần B, Đại học Cần Thơ, 34 – 39. [10] Phạm Hữu Nhượng (1996). Nghiên cứu sử dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ sâu hại bông. Sách: Kết quả nghiên cứu khoa học (1976-1996), Nxb Nông nghiệp, TPHCM, tr.88-107. Trang 57
  59. Đồ án tốt nghiệp [11] Phạm Huỳnh Thanh Vân & Lê Thị Thùy Minh (2001). Sâu ăn tạp Spodoptera litura: Một số đặc điểm sinh học, sinh thái và thành phần, tác động của thiên địch trong điều kiện vùng đồng bằng sông Cửu Long, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [12] Phạm Thị Thùy (2004). Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. [13] Phạm Văn Lầm (1995). Biện Pháp sinh học phòng chống dịch hại Nông nghiệ, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [14] Quang Chân Chân (2002). Siêu vi khuẩn thiên địch Baculovirus và hiệu quả sử dụng trong nông nghiệp, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [15] Nguyễn Thị Thùy Dung (2008). Quy trình chế biến thức ăn nhân tạo và khảo sát ảnh hưởng của Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius) trong phòng thí nghiệm, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [16] Trần Văn Hai (2005). Giáo trình hóa bảo vệ thực vật. Đại học Cần Thơ. [17] Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích, Tập II: Sử dụng vi sinh vật có ích, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. [18] Vũ Mai Nam (2001). Những nhà khoa học trẻ miệt mài với loài sâu, Tạp chí Khoa học và Đời sống, Số 35. [19] Vũ Văn Đĩnh và ctv (2004). Giáo trình biện pháp sinh học trong bảo vệ thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội. Tiếng nước ngoài: [20] Adam, J. R. DNA Mc Clintock, J. T, (1991). Baculoviridae Nuclear polyherosis viruses. Part 1. Nuclear polyherosis viruse of insects, in atlas of invertebrate virus. CRC. BoCa Raton, FL, p. 87-204. [21] Albert, H. U. DNA N. E. Alger (2003). Nosema bombycis algerae: Infection of the white mouse by a mosquito parasite, Journal of Invertebrate Pathology, Volume 83, Issue 1, May, Pages 51-59. Trang 58
  60. Đồ án tốt nghiệp [22] B. S. Ravishankar DNA M. G . Venkatesha (2010). Effectiveness of SlNPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera: Noctuidae) on different host plants, Journal of Biopesticides 3 (1 Special Issue) 167 - 171. [23] Bergold, G. H. (1963a). Fine structure of some insect viruses, Journal Insect Pathology, 5, 111 - 128. [24] Bergold, G. H. (1963b). The molecular structure of some insect virus inclusion bodies, Journal Ultrastructs. Res., 8, 360 - 378. [25] Cook, R.J. & K.F. Baker (1983). The nature and practice of biological control of plant pathogens, American Phytopathological Society, St.Paul: 539 pp [26] Cook R.J (1991). Biological control of plant diseases: broad concepts and Applications, In: The Biological Control of Plant Diseases. FFTC Book Series. No.42. Taipei. 1-29. [27] Crook, N. E. DNA Jarrett P. (1991). Viral DNA bacterial pathogens of insect, Socirty for Applied Bacteriology 20: 91-96. [28] Doutt R (1964). The Historical development of biological control, In: Biological control of insect pests DNA weeds, New York Reinhold, p.21- 42. [29] El Salamouny S., Shapiro M., Ling K. S. DNA Shepard B. M. (2009a). Black tea DNA lignin as Ultraviolet protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus, Journal of Entomological Science. 44(1): 50-58. [30] El Salamouny S., Ranwala D., Shapiro M., Shepard M. DNA Farrar R. (2009b). Tea, coffee, DNA cocoa as ultraviolet radiation protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus, Journal of Economic Entomology. 102(5): (In Press). [31] Fries, I. (2010), Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera), Journal of Invertebrate Pathology, Volume 103, Supplement 1, January, Pages S73-S79. Trang 59
  61. Đồ án tốt nghiệp [32] Hatakeyama, Y., H. Oda, R. Tsunoda, Y. Imura, T. Maeda, T. T. Xuan, T. V. Hai, DNA H. Iwano (2009). Infection DNA phylogenetic analyses of microsporidia isolated from the common cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) in Vietnam Journal of Jananese Society of applied Entomology & Zoogly. [33] Hidetoshi Iwano DNA Ren Ishihara (1991). Dimorphism of Spores of Nosema bombycis spp. In Cultured Cell. Journal of Invertebrate Pathology 57, 211 - 219. [34] Hidetoshi Iwano, Nobuaki Shimizu, Fuji Kawahami DNA Ren Ishihara (1993). Spore Dimorphism DNA some other biological features of a Nosema bombycis sp. isolated from the lawn grass cutworm Spodoptera depravata Butle, Journal of appl. Entomology. Zoo. 29, 219- 227. [35] Hugh Evan & Martin Shapiro (1997). Viruses, Manual of Techniques in Insect Pathology, Biological Techniques, p 17-53. [36] Huter - Fujita F. R., P. F. Entwiste, H. F. Evans DNA N. E. Cook (1998). Insect virus DNA Pest Management, Wiley, New York. [37] Ignoffo C.M. Manipulating enzootic-epizootic diseases of arthropods (1985). In: Biological control in Agricultural IPM Systems, Academic Press, Inc. New York, p.243-262 [38] Ignoffo C. M., M. Shapiro, W.F. Hink (1971). Replication DNA serial passage of infectious Heliothis nucleopolyhedrosisvirus in an established line of Heliothis zea cells, J. Invertebr. Pathol, 18, p 131– 134. [39] Jayaraj (1985). Symptoms and pathologies of insect diseases inMicrobial control and integrated pest management, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatorem, India, p 30 - 33. [40] KDNAybin N.V (1989). Bacterial’nye sregstva bor’by s gryzunymii vregnymi nasekomye: teoria i practiki, Agropromizgat, Moscva. Trang 60
  62. Đồ án tốt nghiệp [41] Kelly, D. C. (1985). Insect iridescent viruses, Current Topics in Microbiology DNA Immunology, 116, 23 - 35. [42] Knittel M. D. and A. Fairbrother (1987). Effects of Temperature and pH on Survival of Free Nuclear Polyhedrosis Virus of Autographa californica, Applied and Environmental Microbiology, pp. 2771 - 2773. [43] Klee, J. (2007). Widespread dispersal of the microsporidian Nosema bombycis ceranae, an emergent pathogen of the western honey bee, Apis mellifera J, Invertebr, Pathol, doi:10,1016, 2007, 02, 014. [44] Lauro Morales, Flávio Moscardi, Daniel R. Sosa-Gómez, Fábio E. Paro and Ivanilda L. Soldorio2 (1997). Enhanced Activity of Anticarsia gemmatalis Hüb. (Lepidoptera: Noctuidae) Nuclear Polyhedrosis Vírus by Boric Acid in the Laboratory, Neotropical Entomology 34 (1): 067 – 075. [45] Lenteren J.C. Van (2005). IOBC Internet Book of Biological Control. [46] Madoka Nakai, Nguyen Thi Thu Cuc, Yasuhisa Kunimi, DNA ctv. 2002. Field application of an insect virus in Can Tho: Effects of nucleopolyhedrovirus on 131 Spodoptera litura DNA its parasitic natural enemies. Journal of Biocontrol Science DNA Technology. 15 (5), p 443-453. [47] Mariano, H. (2007). Experimental infection of Apis mellifera honeybees with Nosema bombycis ceranae (Microsporidia), Journal of Invertebrate Pathology,Volume 94, Issue 3, Pages 211-217. [48] McCarthy, W. J. DNA Gettig, R. R., (1986). Current development in baculovirus serology, The biology baculovirus, vol I. CRC press, Boca, Raton, Florida, p. 147-158. [49] Ravensberg W. J. (1992). The use of beneficial organisms for pest control under practical condition. In: Biological crop protection. Bayer 45(63), p49-69. Trang 61
  63. Đồ án tốt nghiệp [50] R Varatharajan*, M Ingobi Singh & Lreeta (2006). Cross infectivity of baculovirus, Spilarctia obliqua nuclear polyhedrosis virus against mulberry pest, Porthesia xanthorrhoea Kollar, Indian Journal of Experimental Biology Vol, 44, pp. 419 - 421. [51] Summers, M. D., R. Engler, L. A. Falcon DNA P. V. Vail (Eds) (1975). Baculoviruses for Insect Pest Control: Safety Considerration. Amerrican Society of Microbiology, Washington. [52] Tran Thi Kieu Trang DNA S. Chaudhari (2002). Bioassay of nuclear polyhedrosis virus (NPV) DNA in combination with insecticide on Spodoptera litura (Fab), Omonrice 10: 45 – 53. [53] Tran Van Hai, Trinh Thi Xuan DNA Hidetoshi Iwano., (2009). Potential of Nosema bombycis sp. (Protozoa; Microsporida) for controlling Spodoptera litura Fab. (Lepidoptera; Noctuidae) in the Mekong Delta of Vietnam Workshop on collaboration in advanced sciences DNA technology. Trang 62