›

Đồ án Xác định thành phần bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan

pdf 56 trang thiennha21 12/04/2022 5620
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xác định thành phần bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_xac_dinh_thanh_phan_benh_va_giam_dinh_vi_khuan_pantoea.pdf

Nội dung text: Đồ án Xác định thành phần bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN NẤM BỆNH VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII GÂY BỆNH HÉO RŨ CÂY NGÔ TRÊN HẠT GIỐNG NGÔ NHẬP KHẨU TỪ THÁI LAN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Dương Thị Thủy Tiên MSSV: 1191111043 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv 1. Đặt vấn đề 2 2. Mục đích và yêu cầu 2 2.1. Mục đích 2 2.2. Yêu cầu 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ NGÔ VÀ BỆNH CÂY NGÔ 5 1.1. Giới thiệu về cây ngô 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 5 1.1.3. Kỹ thuật canh tác 8 1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 11 1.3. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam 14 1.4. Sơ lược về các bệnh thường gặp trên cây ngô 16 1.4.1.Một số sâu hại ngô 17 1.4.2. Một số bệnh do nấm gây ra 19 1.4.3. Bệnh héo rũ do vi khuẩn 26 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30 2.2. Vật liệu 30 2.2.1. Mẫu nghiên cứu 30 2.2.2. Môi trường và hóa chất 31 i
  3. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 33 2.3. Nội dung nghiên cứu 34 2.3.1. Giám dịnh nấm 34 2.3.2. Giám định vi khuẩn bằng phương pháp PCR 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 42 3.1. Kết quả giám định nấm trên hạt giống bắp 42 3.2. Kết quả giám định vi khuẩn Pantoea stewartii 46 3.3. Kết luận và kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 ii
  4. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1. Diện tích trồng ngô tại các nước trên thế giới qua các năm 13 1.2. Năng suất ngô của các nước trên thế giới 13 2.1. Bảng ký hiệu các mẫu hạt giống bắp dùng trong nghiên cứu 30 2.2. Tên, trình tự và kích thước khuếch đại của primer 40 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR 40 3.1. Tỉ lệ hạt xuất hiện nấm trên các mẫu hạt giống 42 3.2. Kết quả giám định nấm trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan 46 3.3. Kết quả kiểm tra sự hiện diện DNA của vi khuẩn được ly trích từ các mẫu 47 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1. Các vùng trồng ngô chính tại Việt Nam 14 1.2. Vết bệnh khô vằn trên thân và trên lá ngô 20 1.3. Vết bệnh rỉ sắt trên thân và trên lá ngô 21 1.4. Triệu chứng bệnh phấn đen gây hại ngô 22 1.5. Triệu chứng bệnh thối thân do nấm Fusarium trên bắp 23 1.6. Triệu chứng bệnh trên ngô do Aspergillus spp. gây ra 25 1.7. Bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria 27 1.8. Trệu chứng bệnh héo rũ ngô trên cây con và cây trưởng thành 28 1.9. Trệu chứng bệnh héo rũ ngô trên lá và ở thân cây 29 2.1. Cách ủ hạt trong đĩa petri 35 2.2. Quy trình chuẩn bị mẫu vi khuẩn 38 3.1. Các loại nấm xuất hiện trên các mẫu hạt giống 42 3.2. Các loại nấm phân lập được trên môi trường CMA 3 ngày sau khi cấy 43 3.3. Sợi nấm Aspergillu spp. xem trên kính hiển vi 44 3.4. Bào tử nấm Aspergillus spp. 44 3.5. Sợi bào tử nấm Aspergillus spp. 45 3.6. Sợi nấm Rhizopus sp. xem trên kình hiền vi 45 3.7. Nấm Fusarium sp. xem trên kính hiển vi 46 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường KB 2 ngày sau khi cấy 46 3.9. Kết quả ly trích DNA sau khi điện di 48 3.10. Kết quả thực hiện PCR sau khi điện di 48 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1
  7. Đồ án tốt nghiệp 1. Đặt vấn đề Xã hội ngày càng phát triển nảy sinh các yêu cầu về vấn đề an sinh xã hội ngày càng được quan tâm. Trong đó, vấn đề an ninh lương thực là một vấn đề không chỉ giới hạn trong phạm vi lãnh thổ của riêng một quốc gia mà nó cần sự chung tay của tất cả các nước trên toàn cầu. Hiện nay, trên thế giới vẫn còn rất nhiều nước ở trong tình trạng nghèo đói lương thực. Vì vậy, các nước này luôn cần sự giúp đỡ của các quốc gia phát triển để thoát khỏi tình trạng nghèo đói này. Chính điều này đã đặt ra một thách thức cho ngành sản xuất nông nghiệp thế giới. Ngành nông nghiệp của thế giới phát triển với nền sản xuất nông nghiệp ngày càng hiện đại, cơ giới hóa ngày càng cao. Sản lượng các cây lương thực như lúa mì, lúa mạch, gạo, ngô, các loại hạt đậu đỗ ngày càng được tăng cao. Đặc biệt là cây ngô đã trở thành cây trồng chính giúp cho nông dân các nước Châu Phi, Mỹ Latin thoát khỏi tình trạng nghèo đói. Các nhà khoa học luôn tìm cách để sản lượng cây ngô ngày một tăng cao. Tuy nhiên, song song với việc tăng sản lượng là vấn đề dịch bệnh trong việc sản xuất lương thực. Vì có những bệnh hại cho cây trồng nếu xảy ra không chỉ gây thiệt hại cho một vùng hay một quốc gia mà có thể ảnh hưởng đến tình trạng an ninh lương thực khắp toàn cầu. Làm thế nào để tăng năng suất cây trồng đồng thời hạn chế dịch bệnh là vấn đề luôn mới đối với các nhà khoa học về nông nghiệp. Một trong những biện pháp ngăn chặn dịch bệnh là phát hiện ngay khi chúng còn trong môi trường truyền bệnh mà chưa biểu hiện ra ngoài như trong hạt, trong đất hay trong tàn dư thực vật. Xuất phát từ vấn đề trên, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm “Xác định thành phần bệnh và giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan”. 2. Mục đích và yêu cầu 2.1. Mục đích - Xác định thành phần bệnh hại trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan. - Nghiên cứu phương pháp giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ cây ngô bằng phương pháp PCR. 2
  8. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Yêu cầu - Phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của các tác nhân gây bệnh trên hạt giống ngô nhập khẩu. - Định danh đến chi của các tác nhân gây bệnh đã phân lập được trên hạt giống. - Tìm hiểu quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh héo rũ ngô. 3
  9. Đồ án tốt nghiệp NỘI DUNG 4
  10. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ NGÔ VÀ BỆNH CÂY NGÔ 1.1. Giới thiệu về cây ngô 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.1.1. Nguồn gốc Ngô có nguồn gốc đầu tiên từ cỏ ngô và được thuần dưỡng tại Trung Mỹ, sau đó lan ra toàn Châu Mỹ và khắp thế giới. Quá trình thuần dưỡng ngô được một số người cho là đã bắt đầu vào khoảng năm 5.500 tới 10.000 TCN. Chứng cứ di truyền học gần đây cho rằng quá trình thuần dưỡng ngô diễn ra vào khoảng năm 7000 TCN tại miền trung Mexico. Có rất ít thay đổi diễn ra đối với hình dạng bắp ngô cho tới khoảng 1100 TCN khi các thay đổi lớn diễn ra trên các bắp ngô trong các hang động tại Mexico: sự đa dạng của ngô tăng lên nhanh chóng. Có lẽ sớm nhất là vào khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng và nhanh. Khi nó được du nhập vào các nền văn hóa mới. Các nền văn minh Trung Mỹ đã được tăng cường sức mạnh nhờ vào ngô. Trong thiên niên kỷ I, việc gieo trồng ngô đã lan rộng từ Mexico vào Tây Nam Hoa Kỳ và khoảng một thiên niên kỷ sau vào Đông Bắc nước này cũng như Đông Nam Canada. Ngày nay, nhờ sự phát triển khoa học kỹ thuật nên ngày càng có nhiều giống ngô lai mới được sản xuất và đưa vào sử dụng khắp nơi trên thế giới. 1.1.1.2. Vị trí Phân loại Tên khoa học: Zea mays L. Giới: Plantea (thực vật) Ngành: Angiospermae (thực vật có hoa) Lớp: Monocots (một lá mầm) Bộ: Poales (hòa thảo) Họ: Poaceae (hòa thảo) Chi: Zea (cỏ ngô) Loài: mays (ngô) 5
  11. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật Cũng như các cây họ hòa thảo, cây ngô có các bộ phận: rễ, thân, lá, hoa (cờ ngô), quả (bắp ngô) và hạt.  Rễ ngô: Rễ ngô chia làm 3 loại: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. - Rễ mầm phát triển từ rễ sơ sinh của phôi, tồn tại từ khi nảy mầm đến khi cây ngô có 4 - 5 lá. . Rễ mầm có 2 loại: rễ chính (xuất hiện sau khi hạt ngô nảy mầm) và rễ phụ (xuất hiện sau rễ chính). - Rễ đốt phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng quanh các đốt dưới mặt đất, bắt đầu lúc ngô được 3 - 4 lá. Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng suốt thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây ngô. - Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt sát mặt đất. Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt đất. Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nước và thức ăn.  Thân ngô Thân ngô đặc, đường kính khoảng 2 - 4 cm tùy thuộc vào giống, thân có thể cao từ 1,5 - 4 m. Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm, từ các đốt của thân chính có thể phát sinh ra 1-10 nhánh có hình dáng tương tự như thân chính (thân phụ). Thân ngô trưởng thành gồm nhiều lóng được ngăn cách bởi các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Số lượng và chiều dài của các lóng được xem như một đặc điểm có giá trị trong việc phân loại các giống ngô. Thường các giống ngắn ngày có 14 - 15 lóng, các giống trung ngày có 18 - 20 lóng, còn các giống dài ngày có khoảng 20 - 22 lóng.  Lá ngô Căn cứ vào hình thái và vị trí trên thân có thể chia làm 4 loại lá: - Lá mầm: là lá đầu tiên khi cây còn nhỏ, chưa phân biệt được phiến lá với vỏ bọc lá. - Lá thân: là những lá có mầm nách ở kẽ chân lá hay những lá mọc trên những đốt thân. - Lá ngọn: là những lá ở phần trên của bắp trên cùng hay những lá mọc ở trên các đốt ngọn, không có mầm nách ở kẽ lá. 6
  12. Đồ án tốt nghiệp - Lá bi: là những lá bao bắp. Số lượng lá, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo từng giống khác nhau. Số lá là đặc điểm khá ổn định ở ngô, có quan hệ chặt với số đốt và thời gian sinh trưởng. Những giống ngô ngắn ngày thường có 15 - 16 lá, giống ngô trung bình: 18 - 20 lá, giống ngô dài ngày thường có trên 20 lá.  Bông cờ Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh. Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié. Các gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh. Mỗi bông nhỏ có cuống ngắn và hai vỏ nâu hình bầu dục, trên vỏ trấu (mày ngoài và mày trong) có gân và lông tơ. Trong mỗi bông nhỏ có hai hoa: một hoa cuống dài và một hoa cuống ngắn. Một bông nhỏ có thể có một hoặc ba hoa. Ở mỗi hoa có thể thấy dấu vết thoái hoá và vết tích của nhụy hoa cái, quanh đó có ba chỉ đực mang ba nhị đực và hai mày cực nhỏ gọi là vẩy tương ứng với tràng hoa. Bao quanh các bộ phận của một hoa có hai mày nhỏ, mày ngoài ứng với lá bắc hoa và mày trong ứng với lá đài hoa.  Bắp ngô Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp. Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn, mỗi đốt trên cuống có một lá bi bao bọc. Trên trục đính hoa cái (cùi, lõi ngô), hoa mọc từng đôi bông nhỏ. Mỗi bông có hai hoa, nhưng chỉ có một hoa tạo thành hạt, còn một hoa thoái hóa. Phía ngoài hoa có hai mày (mày ngoài và mày trong). Ngay sau mày ngoài là dấu vết của nhị đực và hoa cái thứ hai thoái hoá, chính giữa là bầu hoa, trên bầu hoa có núm và vòi nhụy vươn dài thành râu. Râu ngô thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Trên râu có nhiều lông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nảy mầm.  Hạt ngô Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dưới vỏ 7
  13. Đồ án tốt nghiệp hạt và bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng. Nội nhũ có 2 phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Các hạt ngô có kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25 cm, chứa khoảng 200 - 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. 1.1.3. Kỹ thuật canh tác Để có được một vụ ngô đạt năng suất và chất lượng thì cần rất nhiều yếu tố kết hợp: giống, thời vụ gieo trồng, điều kiện đất đai, khí hậu kết hợp với các kỹ thuật canh tác, quản lý dịch bệnh đúng phương pháp và đúng lúc.  Giống Trong thực tế sản xuất, sử dụng hạt giống có chất lượng tốt có thể làm tăng năng suất ngô từ 10% - 15%. Giống tốt lại mang thêm các đặc tính khác như có khả năng chống chịu sâu bệnh thì sẽ giảm được chi phí đầu tư về bảo vệ thực vật, sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao. Do vậy, để có vụ sản xuất ngô bội thu thì việc chuẩn bị hạt giống là yếu tố rất quan trọng trong quy trình kỹ thuật trồng ngô. Ở Việt Nam, cây ngô lai mới được đưa vào cơ cấu sản xuất trong thời gian gần đây nhưng do khả năng vượt trội của các giống này về năng suất nên hiện nay, diện tích trồng ngô lai của cả nước chiếm trên 90%. Các giống ngô lai có mặt tích cực về khả năng cho năng suất cao hơn các giống ngô thuần nhưng người trồng ngô phải mua hạt giống từ các nhà cung cấp. Hiện nay, hạt giống ngô đều được các nhà cung cấp xử lý thuốc phòng trừ sâu bệnh trước khi đóng gói, khi mua về phải quan sát màu hạt giống xem đã xử lý hay chưa xử lý. Với các giống ngô thuần tự để giống có thể dùng các loại thuốc xử lý hạt như Rovral, lượng 2g/ 10kg hạt, Thiram 85 WP, lượng 2-3 g/kg hạt giống hoặc TMD85 BTN, lượng 2-3 g/kg hạt giống. Xử lý bằng cách trộn thuốc với hạt giống trước khi gieo. 8
  14. Đồ án tốt nghiệp  Thời vụ Nước ta có diện tích trải dài, đặc điểm khí hậu và đất đai rất khác nhau giữa các vùng. Do đó, thời vụ gieo trồng tại mỗi vùng cũng không giống nhau. - Miền Bắc: vụ xuân, vụ hè, vụ thu đông, vụ đông xuân. - Miền Trung: vụ xuân, vụ đông, vụ hè thu, vụ đông xuân - Miền Nam và Tây Nguyên: vụ hè thu, vụ thu đông, vụ đông xuân.  Đất Cây ngô có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất phù sa được bồi đắp hàng năm, đất đỏ, đất bạc màu Nhưng thích hợp nhất là đất phù sa được bồi đắp hàng năm, kế đến là đất đỏ. Không nên trồng ngô lai trên vùng đất nhiễm phèn nặng, vùng quá khô hạn hay vùng thường bị ngập úng. Đất trồng ngô cần đựợc cầy sâu, bừa kĩ, sạch cỏ dại. Ở những bãi dốc có thể không cần làm đất, chỉ làm sạch cỏ dại, chờ có mưa, ẩm đất tiến hành chọc lỗ gieo hạt.  Khoảng cách và mật độ trồng Mật độ trồng ngô phụ thuộc vào vùng sinh thái, mùa vụ, thời gian sinh trưởng của giống và điều kiện thâm canh. Nguyên tắc chung là càng đi xa theo hướng từ Bắc vào Nam thì mật độ trồng tăng dần. Có điều kiện thâm canh tốt thì tăng mật độ để đảm bảo năng suất ngô cao và ổn định. Theo Viện nghiên cứu ngô khuyến cáo nên áp dụng những công thức mật độ trồng ngô sau: - Đối với giống dài ngày trồng với khoảng cách 75 cm x 25 cm (1 cây/1 hốc), tương ứng với mật độ 53.300 cây/ha. - Đối với giống ngắn ngày, thấp cây nên trồng dày với khoảng cách 70 cm x 25 cm (1cây/1hốc) ứng với mật độ 57.000 cây/ha. Chú ý: Vụ đông xuân và thu đông nên trồng dày hơn vụ hè thu. Theo TS. Phan Xuân Hào khuyến cáo tăng mật độ để nâng cao năng suất ngô như sau: "Để thuận lợi cho canh tác, nên trồng theo khoảng cách hàng không đều nhau. Tức là trồng theo hàng kép với khoảng cách hàng hẹp khoảng 40 cm và khoảng cách hàng rộng không quá 70 cm, khoảng cách giữa các cây trong hàng nên ở mức khoảng 25 cm để đạt mật độ từ 7 vạn - 7,5 vạn cây/ha." 9
  15. Đồ án tốt nghiệp  Chăm sóc ngô Làm cỏ vào thời điểm hai ngày sau khi gieo hạt, (tức là một ngày sau khi tưới nước lần đầu) phun thuốc trừ cỏ. Sau khi ngô mọc đều đến 2-3 lá, đất có thể đóng váng và cỏ non cũng đã mọc, nên tiến hành xới xáo mỏng nhằm phá váng, hạn chế sự mất nước kết hợp với trừ cỏ. Sau đợt phá váng này, tiến hành bón thúc lần 1. Từ bón thúc lần 1 đến lần 2, đất ít được canh tác nên cỏ mọc nhiều. Do vậy, cần tiến hành xới cỏ, đá chân và gạt đất vào gốc ngô. Trong khi tiến hành bón thúc đợt 2 cần kết hợp xới xáo diệt cỏ và lấy đất vun cao, vừa để lấp phân vừa giúp cây chống đổ và tạo thành rãnh thoát nước đến cuối vụ. Nhu cầu phân bón cho cây ngô cao nhưng phải bón cân đối đúng lúc, đúng kỹ thuật để phát huy hết tiềm năng về năng suất, và cũng tùy theo từng loại giống mà bón với liều lượng khác nhau. Lượng phân bón cho 1 ha như sau: Urê 300 kg, DAP 150-200 kg, KCl 100-150 kg. Ngoài lượng phân vô cơ trên, tốt nhất nên bón thêm phân chuồng với lượng từ 8- 10 tấn/ha hoặc phân hữu cơ vi sinh với lượng 2 tấn/ha. Về cách bón phân là bón lót và bón thúc, bón lót trước khi gieo hạt hoặc đặt bầu. Có 2 cách bón thúc: bón thúc bằng cách rãi phân hoặc bằng cách tưới. Bón thúc lần 1 khi ngô có 3 - 4 lá thật (10 - 15 ngày sau gieo) với 1/2 lượng đạm và 1/2 lượng kali. Bón thúc lần 2 khi ngô có 9 - 10 lá (sau gieo 35 - 40 ngày), bón nốt 1/2 lượng đạm và 1/2 lượng kali.  Tưới nước Độ ẩm đất thích hợp cho ngô là 70 - 80% sức chứa ẩm tối đa đồng ruộng. Khi đất khô, trời không mưa thì phải tưới nước cho ngô. Cách tưới hiệu quả nhất là tưới theo rãnh, để qua đêm cho nước ngấm vào thân luống rồi rút cạn nước. Những giai đoạn ngô rất cần nước: giai đoạn 3 - 4 lá khi cây chuyển sang lấy chất dinh dưỡng từ đất, giai đoạn 6 - 9 lá khi ngô tạo lập các cơ quan sinh thực (bông cờ, chồi ngô), trước và sau khi ngô ra hoa 7 ngày (giai đoạn tung phấn, phun râu) là giai đoạn xác định số hạt, kích thước hạt. 10
  16. Đồ án tốt nghiệp  Phòng trừ sâu bệnh Để phòng trừ sâu bệnh có hiệu quả cần áp dụng các biện pháp tổng hợp gồm: - Chọn hạt giống khỏe, giống chống chịu sâu bệnh, phù hợp với vụ gieo trồng và vùng sinh thái. - Làm đất kỹ, phơi ải, vệ sinh thu dọn sạch tàn dư sâu bệnh. - Gieo trồng đúng thời vụ, luân canh với lúa hoặc các cây trồng họ đậu để hạn chế nguồn dịch bệnh từ vụ này sang vụ khác. - Chăm sóc tốt làm cho cây khỏe, tăng cường khả năng chống chịu sâu bệnh. - Thường xuyên kiểm tra đồng ruộng, kiểm tra kho tàng cất trữ, bảo quản, phát hiện và phòng trừ sâu bệnh kịp thời. 1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới Cây ngô là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới: ngô, lúa nước, lúa mì, sắn và khoai tây. Trong những năm gần đây, ngô được sản xuất với gần 100 triệu ha trên 125 nước đang phát triển. Ngoài ra, ngô còn là một trong ba loại lương thực phát triển mạnh nhất ở 75 quốc gia khác [1]. Trong đó, ba loại cây gồm ngô, lúa gạo và lúa mì chiếm khoảng 87% sản lượng lương thực toàn cầu. Trong ba loại cây này, ngô là cây trồng có sự tăng trưởng mạnh cả về diện tích, suất, sản lượng và là cây có năng suất cao nhất. Khoảng 67% sản lượng ngô trên thế giới được trồng ở các nước đang phát triển. Tại các nước này, ngô trở thành nguồn thu nhập chính của nông dân [2]. So với lúa mì và lúa nước, ngô là cây trội hơn về ưu thế lai trong chọn tạo giống. Những thành tựu mới trong chọn tạo giống lai cùng với việc ứng dụng công nghệ sinh học đã tạo ra các giống ngô chuyển gen có năng suất cao, chống chịu sâu bệnh. Bên cạnh đó, việc không ngừng cải thiện các biện pháp canh tác kỹ thuật đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên trên lúa mì và lúa nước. Đến năm 2008, đã có 16 nước chấp nhận trồng cây ngô chuyển gen, nước trồng ngô chuyển gen nhiều nhất là Mỹ [3]. [1] (FAOSTAT, 2010) [2] (theo CYMMIT) [3] (Ngân hàng kiến thức trồng ngô – Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam) 11
  17. Đồ án tốt nghiệp Sản lượng ngô xuất khẩu trên thế giới trung bình hàng năm khoảng trên 80 triệu tấn. Trong sản xuất ngô của thế giới, Mỹ là nước chiếm tỷ lệ sản xuất cao nhất, gần 50% tổng sản lượng, còn lại là các nước khác như Brazil, Argentina, Ấn Độ, Mexico Nhu cầu về ngô trên thế giới tăng cùng với sự thay đổi của thời tiết đã làm ảnh hưởng đến sản lượng ngô ở một số quốc gia trồng ngô lớn trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc. Trong vài năm qua, Brazil đã vượt qua Argentina và vươn lên trở thành nước xuất khẩu ngô đứng thứ 2 trên thế giới. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA), năm 2012 thế giới có khoảng 174,64 triệu ha trồng ngô với sản lượng thế giới đạt khoảng 850 triệu tấn, trong đó Mỹ, Trung Quốc, Brazil có lần lượt diện tích là 35,36 triệu ha, 34,95 triệu ha và 15,80 triệu ha. Sự thay đổi khí hậu toàn cầu cũng đã tác động đến sản xuất nông nghiệp của các nước, ảnh hưởng đến sản xuất và sản lượng ngô thế giới. Năm 2012, sản xuất ngô tại các nước Trung Quốc và Nga đều tăng. Tại Trung Quốc, nhờ vào sự quản lý tốt và hỗ trợ từ chính phủ cùng với sự phát triển các dòng bắp lai, sản xuất ngô năm 2012 đạt 208 triệu tấn, tăng 8% so với năm 2011. Diện tích trồng ngô đạt 34,95 triệu ha, tăng 1,4% so với năm 2011, sản lượng đạt được là 5,96 tấn/ha, tăng 20% so với các năm 2003 - 2004. Với Nga, sản xuất ngô đạt 8,5 triệu tấn, tăng 27% vo với năm trước, sản lượng đạt 4,47 triệu tấn/ha, tăng 4% với năm trước. Riêng với Canada, diện tích cây trồng là 1,42 triệu ha, tăng 16% so với năm 2011 nhưng sản lượng đạt được là 9,2 triệu tấn/ha, giảm 2,7% so với năm 2011 [4]. Ngô có thể thích nghi được với các điều kiện sinh thái, khí hậu khác nhau. Vì vậy, cây ngô được trồng ở khắp nơi trên thế giới. Diện tích trồng ngô trung bình của thế giới tính đến năm 2012 là 169,63 ha, với năng suất bình quân là 4,2 triệu tấn/ha. [4] (WAP-USDA, 2012) 12
  18. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Diện tích trồng ngô tại các nước trên thế giới qua các năm (triệu ha) [5] 2012/2013 2013/ 2014 Quốc gia 2010/2011 2011/2012 (Ước tính) (Dự báo) Mỹ 32,96 33,99 35,36 36,07 Trung Quốc 33,50 32,54 34,95 35,60 Brazil 13,80 15,20 15,80 15,50 Argentina 3,75 3,60 4,00 3,50 EU-28 8,02 8,81 9,69 9,52 Ấn độ 8,60 8,80 8,71 8,90 Mexico 7,02 6,07 6,83 6,90 Russia 1,02 1,60 1,94 2,15 Canada 1,24 1,27 1,42 1,50 Toàn cầu 163,86 169,63 174,79 176,51 174.79 176.51 Bảng 1.2.Năng suất ngô của các nước trên thế giới (triệu tấn/ha) [6] 2012/2013 2013/ 2014 Quốc gia 2010/2011 2011/2012 (Ước tính) (Dự báo) Mỹ 9,59 9,24 7,74 9,82 Trung Quốc 5,45 5,75 5,88 5,93 Brazil 4,16 4,80 5,06 4,65 Argentina 6,72 5,83 6,63 7,71 EU-28 7,00 5,83 6,63 7,71 Ấn độ 2,53 2,47 2,55 2,42 Mexico 3,00 3,09 3,15 3,33 Russia 3,01 4,34 4,24 4,42 Canada 9,75 8,93 9,20 9,20 Toàn cầu 3,94 4,20 4,20 4,31 [5], [6] (WAP-USDA, 2012) 13
  19. Đồ án tốt nghiệp Trên thế giới, ngô được sử dụng làm lương thực, đặc biệt tại một số nước Mỹ Latin và Châu Phi ngô được sử dụng làm lương thực chính. Tại Hoa Kỳ và Canada, sử dụng chủ yếu của ngô là nuôi gia cầm và gia súc, cỏ khô, cỏ ủ chua hay lấy hạt làm lương thực. Cỏ ủ chua được sản xuất bằng cách lên men các đoạn thân cây ngô non. Hạt ngô có thể chế biến thành rất nhiều loại thức ăn khác tùy theo phong tục, tập quán của từng dân tộc. Ngoài ra, hạt ngô còn có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, như tạo chất dẻo làm vải sợi, một số đồ gia dụng, thậm chí còn chế tạo cả điện thoại, máy vi tính, làm nguyên liệu sản xuất xi rô ngô, rượu wisky, dầu ngô và đặc biệt là sản xuất ethanol làm nhiên liệu sinh học. Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ, lượng ngô dùng để sản xuất ethanol của nước này niên vụ 2009/2010 lên đến 107 triệu tấn, cao hơn niên vụ 2008/2009 khoảng 11 triệu tấn [7]. 1.3. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam Ở Việt Nam, ngô là loại cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Ngô được trồng khắp nơi, từ đồng bằng đến trung du và khá nhiều ở miền núi. Có nhiều loại ngô, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và công dụng như ngô nếp, ngô tẻ, ngô đường, ngô rau. Miền Nam và Miền Bắc Miền Trung Tây Nguyên Bắc Trung Tây Bắc Tây Nguyên Bộ Duyên hải Đông Nam Đông Bắc Miền Trung Bộ Đồng bằng Đồng bằng sông Cửu sông Hồng Long Hình 1.1. Các vùng trồng ngô chính tại Việt Nam [7] (Ngân hàng kiến thức trồng ngô – Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam) 14
  20. Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, nước ta có truyền thống sản xuất lúa gạo nên trong một thời gian dài ngô ít được chú ý mà chỉ những năm gần đây mới phát triển. Vào những năm 1960, diện tích ngô chỉ hơn 200 nghìn ha, năng suất chỉ đạt trên 1 tấn/ha, đến đầu những năm 1980 cũng không cao hơn nhiều, chỉ ở mức 1,1 tấn/ha, sản lượng đạt khoảng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô địa phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu. Từ giữa những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm Cải tạo Ngô và Lúa mì Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng góp phần nâng năng suất ngô lên gần 1,5 tấn/ha. Ngành sản xuất ngô nước ta thực sự có những bước tiến nhảy vọt từ đầu những năm 1990 đến nay, do việc tạo được các giống ngô lai và mở rộng diện tích trồng ngô lai trong sản xuất, kết hợp áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác theo nhu cầu của giống mới [8]. Cuộc cách mạng về giống ngô lai đã góp phần phần tăng nhanh diện tích, năng suất và sản lượng ngô toàn quốc. Trong đó, giống ngô lai do Viện nghiên cứu ngô (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) tạo ra chiếm tới 90% lượng giống lai của Việt Nam. Một số giống khá nổi bật như: LVN10, LVN99, LVN4, LVN9, VN8960, LVN885, LVN66 Các giống ngô này có năng suất và chất lượng tương đương các giống ngô của các công ty liên doanh với nước ngoài nhưng giá bán chỉ bằng 65 - 70%, góp phần tiết kiệm chi phí cho người trồng 80 - 90 tỷ đồng/năm [9]. Từ năm 2006, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam đã có những bước tiến nhảy vọt cao nhất từ trước đến nay. Năm 2008, diện tích trồng ngô của cả nước (trong đó 90% diện tích là ngô lai) đạt 1.126.000 ha, tổng sản lượng trên 4.531.200 tấn. Năm 2009, diện tích đạt 1.170.900 ha, tổng sản lượng lên tới trên 5.031000 tấn, cao nhất từ trước tới nay. Các giống ngô lai của Việt Nam bước đầu cũng đã xuất bán sang các nước Bangladesh, Cam-pu-chia, Lào, Quảng Tây -Trung Quốc, Pakistan, Indonesia, Ấn Độ [10] [8] Phan Xuân Hào [9] Ngân hàng kiến thức trồng ngô – Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam [10] Viện nghiên cứu ngô 15
  21. Đồ án tốt nghiệp Theo thống kê của Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), năm 2011 diện tích cây ngô ở nước ta là 1,08 triệu ha với sản lượng 4,30 triệu tấn/ha. Năm 2012, ước tính diện tích trồng ngô là 1,12 ha nhưng sản lượng ngô vẫn không tăng so với năm trước. Xét về diện tích thì cao hơn Thái Lan (1,08 triệu ha) nhưng tấp hơn Indonesia (3,00 triệu ha) và Philippines (2,56 triệu ha). Về sản lượng ngô, nước ta có sản lượng cao hơn cả Thái Lan (4,26 triệu tấn/ha), Indonesia (2,67 triệu tấn/ha) và Philippines (2,84 triệu tấn/ha). Tuy nhiên, thực trạng hiện nay ở nước ta là vẫn còn phải nhập khẩu một lượng hạt giống ngô từ các nước trong khu vực. Theo Tổng Cục Hải quan Việt Nam, ba tháng đầu năm 2013, Việt Nam đã nhập khẩu 410,2 nghìn tấn ngô, trị giá 142,1 triệu USD, tăng 0,15% về lượng và tăng 13,65% về trị giá so với cùng kỳ năm 2012. Việt Nam nhập khẩu ngô từ 6 thị trường trên thế giới, trong đó Ấn Độ là thị trường có lượng ngô nhập khẩu nhiều nhất 367,4 nghìn tấn, chiếm 89,5% tổng lượng ngô nhập khẩu của cả nước, tăng 0,43% về lượng và tăng 9,16% về trị giá so với 3 tháng năm 2012. Tuy đứng thứ ba về lượng nhập trong 3 tháng đầu năm, nhưng Thái Lan là thị trường sự tăng trưởng vượt lên hơn cả so với các thị trường khác, tăng 128,24% tương đương với 12,2 nghìn tấn, trị giá 11,5 triệu USD, tăng 79,83%. Tại sao lại có tình trạng nghịch lý này? Đó là do sản xuất ngô ở nước ta vẫn còn nhiều vấn đề đặt ra: tuy năng suất ngô có tăng nhưng vẫn còn rất khiêm tốn so với thế giới, chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, công nghệ sau thu hoạch còn chưa được chú ý nhiều. Thêm vào đó, sự biến đổi phức tạp của khí hậu toàn cầu, nhiều sâu bệnh hại mới xuất hiện cũng đã làm ảnh hưởng đến năng suất ngô. 1.4. Sơ lược về các bệnh thường gặp trên cây ngô Ngô thường bị nhiều loại sâu bệnh gây hại trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển, chín đến thu hoạch và ngay cả trong kho bảo quản, cất trữ. Bệnh trên cây ngô do rất nhiều nguyên nhân gây nên: do sâu hại, do nấm hay do vi khuẩn, virus. Các loại sâu bệnh chủ yếu trên cây ngô bao gồm: Các loại sâu chính như sâu xám (Agrotis ypsilon), sâu xanh (Heliothis armigera), sâu đục thân (Ostrinia furnacalis), rệp (Rhopalosiphum maydis). Các loại bệnh như bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh đốm lá lớn (Helminthosporium turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthosporium 16
  22. Đồ án tốt nghiệp maydis), bệnh bạch tạng (Sclerospora maydis), bệnh gỉ sắt (Puccinia maydis), bệnh phấn đen (Ustilago maydis ), bệnh mốc hồng (Fusarium moniliforme), bệnh thối thân (Pantoea stewartii), bệnh virus khảm lá ngô, bệnh virus sọc lá 1.4.1.Một số sâu hại ngô 1.4.1.1. Sâu xám Tên khoa học: Agrotis ipsilon Rott  Triệu chứng gây hại Sâu xám là loại sâu đa thực, chúng không chỉ hại nặng trên ngô mà còn hại cả đậu tương. Bướm trưởng thành đẻ trứng trên lá cây, thân cây, hoặc trên cây cỏ trên mặt đất. Sâu non tuổi nhỏ sống ở trên lá, tuổi lớn ban ngày ẩn nấp dưới mặt đất, ban đêm chui lên phá hại. Sâu non hoá nhộng trong đất. Sâu xám thường hại ngô ở tất cả các vùng vào giai đoạn cây con. Sâu thường gây hại vào ban đêm, sâu tuổi 1- 3 ăn lá ngô non hoặc gặm xung quanh thân ngô. Tuổi 4 trở đi sâu phá mạnh, cắn đứt ngang thân ngô non kéo xuống đất. Sâu tuổi 6 mỗi đêm có thể cắn đứt 3 - 4 cây ngô non. Khi cây ngô có 7 - 8 lá, thân cây đã cứng, sâu thường đục vào thân gần sát gốc ăn phần non mềm ở giữa làm thân cây ngô bị héo và chết. Ruộng ngô bị sâu xám gây hại trông mất khoảng lỗ chỗ, mật độ cây giảm, thiệt hại về năng suất. Sâu xám thường hại nặng trên ngô trồng trên đất cát pha và đất thịt nhẹ. Quy luật phát sinh gây hại của sâu xám trên đồng ruộng có liên quan chặt chẽ với các yếu tố sinh thái: phát triển mạnh khi thời tiết mát mẻ, đất quá ẩm ướt hoặc quá khô đều không có lợi cho sâu sinh trưởng. Sau những trận mưa lớn cuối tháng 3 - đầu tháng 4, trên đồng ruộng bị đọng nước, mật độ sâu xám giảm đi nhiều. Ngô đông xuân gieo sớm (đầu tháng 10 - giữa tháng 10) nói chung bị hại nhẹ hơn so với ngô gieo muộn vào cuối tháng 12 hoặc trong tháng 1.  Biện pháp phòng trừ - Cày đất phơi ải để tiêu diệt trứng và nhộng. - Làm đất kỹ, sạch cỏ trước khi trồng, làm sạch cỏ quanh bờ để hạn chế nguồn ký chủ phụ của sâu. 17
  23. Đồ án tốt nghiệp - Bắt sâu bằng tay vào buổi sáng sớm hay chiều tối bằng cách bới đất quanh gốc cây bị sâu cắn để bắt sâu. - Bẫy bướm trưởng thành bằng bả chua ngọt. Mỗi ha đặt 3 bẫy, mỗi bẫy cách nhau 400 – 500m. Cách làm bẫy bả chua ngọt: 4 phần đường + 4 phần dấm + 1 phần rượu + 1 phần nước. Cho vào trong bình đậy kín sau 3 – 4 ngày khi thấy mùi chua ngọt thì thêm vào 1% thuốc trừ sâu. Quấn giẻ hay bùi nhùi rơm rạ vào đầu gậy nhúng vào bả cắm trên bờ ruộng. Sau 2 – 3 ngày nhúng lại 1 lần. Bướm trưởng thành sẽ bay vào ăn bả chua ngọt và bị chết. 1.4.2.2. Sâu đục thân Tên khoa học: Ostrinia nubilalis Hubner  Triệu chứng gây hại Bướm trưởng thành sống ẩn nấp trong bẹ lá, đẻ trứng trên lá, sâu non nở ra ăn thủng lá nõn, hay ăn vào bao cờ, cuống cờ làm cờ gãy gục, hoa phấn khô héo, không tung phấn được. Sâu từ tuổi 3 trở lên đục phá vào thân làm cây chậm phát triển, thậm chí ngừng phát triển. Khi cây lớn, sâu đục trong thân để lại phân ở đường đục. Thân ngô bị đục ít khi chết. Nếu gặp gió to có thể bị gãy ngang. Bắp bị sâu đục lúc còn nhỏ bị gãy non, không lớn lên được. Bắp ngô non có thể bị đục từ cuống bắp vào thân bắp, nếu bắp đã cứng thì sâu đục từ đầu bắp đến giữa bắp. Sâu xuất hiện quanh năm nhưng phá hại mạnh nhất ở giai đoạn trổ cờ phun râu, đóng bắp.  Biện pháp phòng trừ - Chọn và trồng giống ngô chống chịu sâu đục thân. - Luân canh cây trồng để tránh sâu tồn tại từ vụ này sang vụ khác. - Vệ sinh đồng ruộng, diệt sạch cỏ sau khi thu hoạch, cày ải sau khi thu hoạch ngô vụ thu để giết sâu non và nhộng. - Gieo trồng đúng thời vụ. Không trồng rải rác tạo nguồn thức ăn cho sâu tồn tại từ vụ này sang vụ khác. - Bắt sâu bằng tay, ngắt ổ trứng. - Bảo vệ và lợi dụng ong ký sinh, quan trọng nhất là ong mắt đỏ ký sinh trứng Trichogramma. 18
  24. Đồ án tốt nghiệp - Dùng các loại thuốc Padan 95SP, Regent 800WG hoặc thuốc Basudin để phun hoặc rắc vào gốc cây ngô khi cần thiết. 1.4.1.3. Rệp hại ngô Tên khoa học: Rhopalosiphum maydis Fitch  Triệu chứng gây hại Rệp ngô là một trong những loại sâu hại quan trọng. Chúng thường gây hại từ khi cây ngô 8, 9 lá đến khi thu hoạch. Rệp bám trên lá, trong nõn, bẹ lá, lá bi, hoa cờ v.v chích hút nhựa các bộ phận làm cho cây còi cọc, bắp nhỏ, năng suất và chất lượng ngô giảm. Rệp phát triển nhanh và gây hại mạnh khi nguồn thức ăn đầy đủ, nhất là những ruộng ngô gieo dày, ẩm độ không khí trong ruộng cao hoặc ruộng ngô bị hạn. Rệp ngô còn là môi giới truyền virus gây bệnh khảm lá, đốm lá ngô.  Biện pháp phòng trừ - Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng, làm sạch cỏ trong ruộng và xung quanh bờ để không bị rệp bay sang phá hại từ các ký chủ phụ. Không nên trồng ngô mật độ quá dầy, khi cây ngô cao 25 – 30 cm thì tiến hành tỉa định cây, loại bỏ những cây gầy yếu cho ruộng thông thoáng hạn chế rệp phát triển. - Biện pháp sinh học: bảo vệ các loài thiên địch trên ruộng ngô. - Biện pháp hóa học: khi mật độ rệp cao dùng các loại thuốc vị độc, tiếp xúc, thuốc lưu dẫn như Sherpa 25EC, Trebon 10EC, Sherzol 50EC, Reasgant 1.8EC, 2WG, 3.6EC, 5EC, 5WG, Confitin 18 EC, 36EC, Emalusa 10.2EC, 20.5EC, 50.5WSG Phun theo hướng dẫn ghi trên nhãn thuốc. Chú ý thời gian cách ly đối với ngô ngọt, ngô rau bao tử và ngô thu bắp non trước khi thu hoạch 15 - 20 ngày để tránh ngộ độc thực phẩm cho người và gia súc. 1.4.2. Một số bệnh do nấm gây ra 1.4.2.1. Bệnh khô vằn  Nguyên nhân Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây nên. Nấm này là loài nấm đa thực có phổ ký chủ rất rộng (lúa, ngô, khoai tây, thuốc lá, lạc, cà chua, bông, cải bắp, đậu đỗ, bèo 19
  25. Đồ án tốt nghiệp tây, ) [11]. Hạch nấm tồn tại trong đất và tàn dư cây bệnh, hạt giống là nguồn lan truyền bệnh trên đồng ruộng. Nấm bệnh có thể gây hại cho ngô từ khi mới nảy mầm đến khi thu hoạch.  Triệu chứng Mầm bị nhiễm bệnh, trên rễ mầm và thân mầm thường có những vết bệnh màu nâu. Ngô bị nhiễm bệnh trong giai đoạn mầm thường còi cọc và vàng. Song biểu hiện rõ và nặng của bệnh là ở giai đoạn cây ngô trổ cờ đến làm hạt. Trên lá, lá bao bị bệnh, ban đầu thường xuất hiện những đốm nhỏ dạng dội nước sôi, vết bệnh lớn dần không có hình dạng nhất định, xung quanh có viền xanh sẫm hay mầu nâu. Các vết bệnh có thể liên kết với nhau thành đám lớn dạng vằn da hổ. Vết bệnh trên phiến lá và lá bao cũng giống như vết bệnh trên bẹ lá. Khi trời ẩm ướt trên mặt vết bệnh phủ lớp sợi nấm màu trắng và nhữnh hạch nấm xốp khi còn non có màu trắng, khi già chuyển màu nâu. Hạch nấm là nguồn lây nhiễm của nấm bệnh. Bệnh làm giảm năng suất và cây bị bệnh nặng hạt ngô sẽ bị lép. Hình 1.2. Vết bệnh khô vằn trên thân và trên lá ngô  Biện pháp phòng trừ - Lựa chọn các giống có khả năng kháng bệnh để trồng. - Vệ sinh đồng ruộng, thu dọn sạch tàn dư cây bệnh. - Cày ải hoặc ngâm dầm để diệt hạch nấm. - Xử lý hạt giống bằng Rovrral (2g/10kg hạt). Khi ngô đã lớn làm sạch cỏ, bóc sạch bẹ và lá bị bệnh đem tiêu hủy để hạn chế bệnh và ruộng ngô thông thoáng. [11] Kỹ thuật trồng ngô. (2012) 20
  26. Đồ án tốt nghiệp - Dùng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma ủ với phân chuồng bón cho ngô, lượng dùng 80 – 100 kg/. - Phun trừ bệnh bằng thuốc Validamicin 3 SC, pha nồng độ 0,2 - 0,25%. 1.4.2.2. Bệnh rỉ sắt Hình 1.3. Vết bệnh rỉ sắt trên thân và trên lá ngô [12]  Nguyên nhân Do nấm Puccinia sorghi Schw gây ra. Trên cây ngô nấm bệnh chỉ thực hiện hai giai đoạn sinh trưởng là bào tử hạ và bào tử đông. Tuy nhiên sự truyền lan gây bệnh cho ngô chủ yếu là bào tử hạ. Chúng tồn tại trên tàn dư cây bệnh, trên hạt tiếp tục lây nhiễm cho vụ sau. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện thời tiết mát mẻ, ẩm độ cao hoặc có mưa. Các giống ngô địa phương và các giống ngô lai đều bị bệnh. Các giống ngô đường, ngô nếp mẫn cảm với bệnh.  Triệu chứng gây hại Bệnh hại trong suốt quá trình sinh trưởng phát triển của cây, chủ yếu trên lá. Vết bệnh ban đầu là những chấm nhỏ màu vàng nhạt, sau đó lớn dần và liên kết với nhau tạo thành ổ chứa các bào tử màu vàng nâu (bào tử hạ), dần có màu nâu đen như gỉ sắt [12] Nguồn: Ngân hàng kiến thức trồng ngô – Viện Khoa học nông nghệp Việt Nam 21
  27. Đồ án tốt nghiệp (bào tử đông). Bệnh nặng vết bệnh dày đặc làm lá bị khô cháy, bệnh lan sang cả thân, bẹ lá và áo bắp.  Biện pháp phòng trừ - Sử dụng giống ngô có khả năng chống chịu bệnh, dùng hạt giống sạch bệnh. - Xử lý hạt giống bằng thuốc Rovral (2g/10kg hạt). - Luân canh trồng ngô với lúa và cây họ đậu. - Chăm sóc tốt làm cho cây khỏe tăng cường khả năng chống bệnh. - Vệ sinh đồng ruộng, thu dọn sạch tàn dư cây bệnh đưa ra khỏi ruộng tiêu huỷ. - Thường xuyên ngắt tỉa lá già, lá bệnh, tạo độ thông thoáng cho ruộng ngô. - Phun các loại thuốc Tilt 250ND và Anvil 5SC nồng độ 0,1% để trừ bệnh. 1.4.2.3. Bệnh phấn đen Hình 1.4. Triệu chứng bệnh phấn đen gây hại ngô [13]  Nguyên nhân Bệnh do nấm Ustilago maydis gây ra. Nấm bệnh xâm nhập qua vết thương cơ giới do chăm sóc, vun xới hoặc mưa gió, do sâu bệnh cắn phá. Bệnh phát triển mạnh ở ruộng trồng dày và bón nhiều đạm vô cơ. Bào tử nấm bệnh tồn tại trên hạt giống và tàn dư cây bệnh là nguồn lây nhiễm cho vụ sau. Các giống ngô địa phương thường bị bệnh nặng. [13] Nguồn: Ngân hàng kiến thức trồng ngô – Viện Khoa học nông nghệp Việt Nam 22
  28. Đồ án tốt nghiệp  Triệu chứng gây hại Bệnh xuất hiện và gây hại ở hầu hết các vùng trồng ngô. Bệnh có thể hại trên lá, thân, bông cờ và chủ yếu là trên bắp ngô. Đặc trưng điển hình của bệnh là tạo thành các u sưng. Lúc đầu vết bệnh chỉ sùi lên như một cái bọc nhỏ, sau đó phình to được bọc bởi một lớp bọc trắng, phớt hồng, dần chuyển sang màu tro. Bên trong là một khối rắn vàng trắng sau biến thành bột đen, đó là khối bào tử hậu. Bộ phận bị bệnh tạo thành những u sưng dị hình, thối hỏng làm giảm năng suất ngô đáng kể.  Biện pháp phòng trừ - Không dùng ngô bị bệnh để làm giống, chỉ sử dụng hạt giống sạch bệnh. - Xử lý hạt giống trước khi gieo bằng thuốc Thiram 85WP, lượng 2 - 3 kg/tấn giống. - Dùng các giống ngô chống chịu bệnh. - Luân canh với lúa hoặc các cây đậu đỗ. - Vệ sinh đồng ruộng, thu dọn sạch tàn dư cây bệnh đem tiêu hủy. - Phun các loại thuốc trừ bệnh như Thiram 85WP, Tiptop 250 EC. Phun khi bắt đầu xuất hiện bệnh từ 1 – 5%. 1.4.2.4. Bệnh thối thân Hình 1.5. Triệu chứng bệnh thối thân do nấm Fusarium trên bắp [14]  Nguyên nhân Bệnh do nấm Fusarium moniliforme gây ra. Nấm xâm nhập vào cây qua lỗ hở các tế bào, qua các vết thương cơ giới do xây xát. Nấm gây bệnh lan truyền từ cây này [14] Nguồn: CIMMYT 23
  29. Đồ án tốt nghiệp sang cây khác hoặc vùng này qua vùng khác nhờ gió, nước, động vật hoặc côn trùng. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện ấm và ẩm. Ruộng ngô trồng dày, không được chăm sóc bóc tỉa, ẩm độ cao là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển. Bệnh gây hại nặng trên các vụ ngô thu đông và xuân hè, nhưng hại nặng hơn ở vụ thu đông. Nấm bệnh tồn tại trong đất, tàn dư cây bệnh và hạt giống trở thành nguồn bệnh cho vụ sau. Nấm Fusarium moniliforme có tản nấm phát triển, sinh ra hai loại bào tử: một là loại bào tử nhỏ (microconidi) rất nhiều, có hình trứng, kích thước 4 - 30 x 1,5 - 2µm không màu, đơn bào (đôi khi có một ngăn ngang) tạo thành chuỗi hoặc trong bọc giả trên cành bào tử phân sinh ngắn. Loại bào tử thứ hai là bào tử lớn (macroconidi) hình cong lưỡi liềm, đa bào có nhiều ngăn ngang (3 - 5 ngăn ngang), kích thước 20 - 90 x 2 - 25µm không màu. Nguồn bệnh chủ yếu bảo tồn ở dạng sợi nấm sống tiềm sinh trên tàn dư cây ngô, áo bắp và hạt ngô. Một dạng bệnh tương tự là bệnh mốc đỏ do nấm Fusarium graminearum Schw. gây ra vào thời kỳ ngô có bắp đến thu hoạch. Thường thì bệnh phát sinh từ đầu chóp bắp lan vào trong toàn bắp bao phủ một lớp nấm màu hồng đậm - đỏ nhạt, áo bắp và hạt bị bệnh có màu đỏ gạch non. Hạt dễ vỡ, bên trong hạt có thể rỗng chứa một đám sợi nấm. Nếu bắp bị bệnh sớm thì không hình thành hạt, lõi bị phân huỷ [15]. F.graminearum thường không sinh ra loại bào tử nhỏ mà chỉ có bào tử lớn hình bầu dục cong, hình lưỡi liềm cong, nhiều vách ngăn ngang (3 - 6 ngăn), kích thước 25 - 75 x 3 – 6µm.  Triệu chứng Bệnh xuất hiện và gây tác hại ở hầu hết các vùng trồng ngô, thường thể hiện rõ vào giai đoạn cây ngô tung phấn, trổ cờ. Lá ngô bị bệnh chuyển màu vàng khô và chết. Thân cây bổ đôi quan sát thấy ruột có màu phớt hồng hay tím hồng. Lóng cây xốp, dễ bị đổ gẫy, hạt thường bị chín ép. Trên bộ phận bị bệnh có phủ một lớp nấm màu phớt hồng. [15] Kỹ thuật trồng ngô (2012) 24
  30. Đồ án tốt nghiệp  Biện pháp phòng trừ - Lựa chọn các giống có khả năng chống chịu bệnh. - Vệ sinh đồng ruộng, thu dọn sạch tàn dư cây bệnh. - Không gieo ngô quá sâu, tạo độ thoát nước cho ruộng ngô. - Xử lý hạt giống trước bằng thuốc Rovral (2 g/10 kg hạt). Dùng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma ủ với phân chuồng bón cho ruộng ngô. 1.4.2.5. Bệnh mốc vàng Hình 1.6. Triệu chứng bệnh trên ngô do Aspergillus spp. gây ra [16]  Nguyên nhân Bệnh do nấm Aspergillus spp gây ra, trên cây ngô thường có các loài Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus. Đặc biệt, Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus là hai loài sinh ra aflatoxin là độc tố có hại cho người và động vật [17]. Nấm lưu tồn trong đất, trong tàn dư thực vật hay trong hạt và lây nhiễm cho vụ sau. Bào tử nấm lan truyền nhờ gió, côn trùng. Aspergillus niger: sợi nấm trong suốt và có vách ngăn, cuống bào tử không màu xuất phát từ sợi nấm và kết thúc bằng bọng bào tử. Bọng bào tử có dạng hình cầu, bọng bào tử là đặc điểm để phân biệt các loài Aspergillus. Khuẩn lạc có màu đen, sợi nấm màu trắng hoặc vàng, thể bình có hai tầng. Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus: cuống bào tử trong suốt, thể bình có một tầng tỏa tròn bao quanh bọng bào tử hình cầu hoặc đôi khi chỉ nằm phía trên bọng, [16] Nguồn: CIMMYT [17], [18] Theo Biswanath Das, Cimmyt 25
  31. Đồ án tốt nghiệp thể bình trong suốt [18]. Bào tử hình cầu, màu hơi xanh vàng nhạt, đầu bào tử dạng tia. Khuẩn lạc có màu xanh lá cây hay màu nâu vàng.  Triệu chứng Trên hạt có lớp mốc bao phủ, nấm có thể xâm nhập vào phôi hạt và làm chết mầm. Mầm mọc từ hạt ngô bị nhiễm nấm thường xuất hiện những sọc trắng hẹp trên lá mầm. Nấm xâm nhiễm vào các hạt bị tổn thương và gần đầu bắp ngô. Nấm phát triển ở giai đoạn thời kỳ đầu và cuối giai đoạn đông sữa. Sự nhiễm aflatoxin đạt cao nhất khi bắp ngô bị nhiễm nấm ở ngày thứ 21 – 42, khi đó độ ẩm của hạt ngô là 27 – 35% [19]. Trên bắp ngô, A.niger tạo lớp mốc màu đen trên hạt, còn A.flavus, A.paraticus làm mốc có màu xanh non đến xanh rêu, hoặc màu nâu olive.  Biện pháp phòng trừ - Do nguồn bệnh xuất phát từ đồng ruộng nên ngay từ khi gieo trồng đã phải chú ý, gieo trồng đúng thời vụ, chăm sóc tốt để ngô sinh trưởng đều, chín tập trung. - Cần thu hoạch nhanh gọn kịp thời không để ngô chín tồn tại lâu trên đồng ruộng. Thu hoạch vào ngày nắng ráo, loại bỏ những bắp bị bệnh ngay trong khi thu hoạch. Sau khi thu hoạch về thực hiện tốt các biện pháp bảo quản cất trữ. - Khi bảo quản trong kho hạt bắp phải được phơi thật khô, đảm bảo độ ẩm dưới 14%, loại bỏ tạp chất và những hạt sâu mọt. - Vệ sinh sạch sẽ kho cất trữ, phun thuốc khử trùng. - Thường xuyên kiểm tra kho, nếu phát hiện thấy hạt chớm phát sinh nấm bệnh thì cần đem phơi nắng ngay. 1.4.3. Bệnh héo rũ do vi khuẩn Pantoea stewartii Bệnh héo rũ ngô (Stewart's wilt ) do vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith (1898), Mergaert et al. (1993)) gây ra. Bệnh hiện diện ở nhiều nơi trên thế giới, từ Bắc và Trung Mỹ, Peru, châu Âu, đến Liên Xô và Trung Quốc. Vào những năm của thập niên 1930, bệnh đã gây thất thu lớn ở Bắc Mỹ, bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Ontario [19] Lê Lương Tề (2007) 26
  32. Đồ án tốt nghiệp vào năm 1986, nhưng hiện nay, thỉnh thoảng bệnh chỉ bộc phát nhẹ, không gây hại đáng kể. Bệnh phát triển mạnh khi có mưa nhiều, nhiệt độ và ẩm độ cao. 1.2.3.1. Tổng quan về tác nhân gây bệnh Tên khoa học: Pantoea stewartii Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteria Họ: Enterobacteriaceae Chi: Pantoea Loài: Pantoea stewartii Vi khuẩn có dạng hình que, là loài kỵ khí tùy ý, gram âm, không di động, không sinh bào tử. Năm 1898, sau nhiều năm khảo sát bệnh héo rũ ở bắp ngọt, F.C. Stewart đã kết luận rằng gây bệnh là vi khuẩn nằm trong hạt. Đến năm 1923, bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria mới được xác định là vector truyền bệnh này. Hình 1.7. Bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria Pantoea stewartii thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, chúng có thể sống trong ruột của loài côn trùng là bọ cánh cứng Chaetocnema pulicaria, thuộc họ Chrysomelidae (ánh kim). Charlotte Elliot và F.W. Poos đã kiểm tra hơn 28,500 mẫu côn trùng của 94 loài và 76 chi và đưa ra kết luận rằng chỉ có loài C. pulicaria là 27
  33. Đồ án tốt nghiệp vector truyền bệnh quan trọng của loài vi khuẩn này [20]. Khi côn trùng tấn công cây trồng, vi khuẩn sẽ truyền vào cây thông qua vết cắn của côn trùng. Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể tồn tại sẵn trong hạt từ vụ trước (hiện diện trong phôi nội nhũ, không có ở lớp vỏ hạt), rồi xâm nhập vào cây con, theo mạch nhựa lên thân và lá, làm nghẹt mạch dẫn truyền. 1.2.3.2. Triệu chứng Triệu chứng của bệnh gồm có 2 giai đoạn: giai đoạn héo cây con và giai đoạn tàn rụi lá khi cây trưởng thành [21]. Đầu tiên, ở cây con, trên lá có những sọc dài màu xanh nhạt đến vàng rồi nâu, sọc có dạng bất thường chạy dọc theo phiến và gân lá rồi lan dần vào trong thân, cây héo và chết sớm, cả lá có thể bị khô rồi chết, những cây còn sống sót thì thường bị lùn. Với cây trưởng thành, khi bị vi khuẩn tấn công cũng có những triệu chứng tương tự như ở cây con, phát hoa đực phát triển sớm, tàn úa và có màu trắng. Khi cắt ngang thân, thấy mô dẫn truyền có màu nâu và tiết ra từng giọt dịch vi khuẩn màu vàng và nhớt, thân mục làm cây gãy dẫn đến giảm sản lượng ngô. (a) (b) Hình 1.8. Trệu chứng bệnh héo rũ ngô trên cây con (a) và cây trưởng thành (b) [20],[21] Jerald K.Pataky (2004) 28
  34. Đồ án tốt nghiệp (a) (b) Hình 1.9. Trệu chứng bệnh héo rũ ngô trên lá (a) và ở thân cây (b) 1.2.3.3. Biện pháp phòng trị bệnh - Chọn giống từ ruộng không bệnh. - Dùng giống bắp lai có đặc tính kháng bệnh. Tính di tuyền và cơ nguyên của tính kháng bệnh đã được nghiên cứu rộng rãi. Tính kháng bệnh mang tính trội và do một vài gene điều khiển. Trồng giống muộn sẽ ít bị nhiễm bệnh hơn giống sớm. Các nhóm bắp ngọt, bắp đá, bắp răng ngựa, đều dễ bị nhiễm bệnh. - Khử hạt bằng các cách: Trộn hạt khô với thuốc khử hạt, như Arasan 0,2%, vào 7 - 10 ngày trước khi gieo. Ngâm hạt qua đêm trong dung dịch thuốc kháng sinh Streptomycin 100 ppm hoặc Tetracycline. Ngâm hạt ngay trước khi gieo trong HgCl2 0,1% trong 20 phút hoặc ngâm với nước nóng 45°C trong 15 phút. - Phòng trị côn trùng lan truyền bệnh. Tránh gây vết thương cho cây. - Dự báo bệnh bằng cách theo dõi sự lưu tồn của bọ cánh cứng. 29
  35. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ 24/06/2013 đến 15/09/2013 Địa điểm nghiên cứu: Phòng Điều Tra Giám Sát – Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Mẫu nghiên cứu - Mẫu được thu nhận từ các lô hạt giống bắp nhập khẩu từ Thái Lan trong năm 6 tháng đầu năm 2013 của các doanh nghiệp công ty hoặc cá nhân. - Dòng vi khuẩn Pantoea stewartii chuẩn (Landcare Research Manaaki Whenua, New Zealand) Bảng 2.1. Bảng ký hiệu các mẫu hạt giống bắp dùng trong nghiên cứu Stt Ký hiệu mẫu Tên giống Công ty nhập khẩu 1 M1 AT 0970 Việt Thái 2 M2 NK 67 Syngenta 3 M3 DK 8868 Dekalb 4 M4 WAX 44 Syngenta 5 M5 Mẹ 3Q CP 6 M6 Mẹ 888 CP 7 M7 NK 7328 Syngenta 8 M8 Mẹ 3Q Super CP 9 M9 CP 999 CP 10 M10 099 East-West Seed 11 119 WXW6TH2672 Dekalb 12 122 a SG 22 Syngenta 13 122 b WAX 48 Syngenta 14 129 d PAC 293 Vương Nông 15 129 j PAC 1290022 Vương Nông 16 129 g PAC 1290043 Vương Nông 17 129 h PAC 1290393 Vương Nông 18 129 k PAC 1290033 Vương Nông 19 129 l PAC 1290004 Vương Nông 20 129m PAC 1290032 Vương Nông 30
  36. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Môi trường và hóa chất 2.2.2.1. Môi trường Các môi trường được sử dụng là môi trường WA, CMA, KB, LB lỏng  Môi trường WA (môi trường thạch nước) Agar 15 g Nước cất 1000 ml Đun sôi 500 ml nước cất, thêm vào 15 g agar, nấu tan agar và thêm nước cất vào cho đủ 1000 ml, cho vào bình tam giác đem hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. Sau khi hấp đỗ đĩa petri (15 ml/đĩa).  Môi trường CMA (môi trường thạch bột bắp) Bột bắp 30 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Đun 30 g bột bắp với 500 ml nước cất trong 1 giờ, thêm vào 15 g agar, nấu tan agar và thêm nước cất đủ 1000ml. Sau đó, môi trường được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. Sau khi hấp đỗ đĩa petri (15 ml/đĩa)  Môi trường King’s B Proteose peptose 20 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 15 g Glycerol 15 ml Nước cất 1000 ml Nấu tan đều proteose peptose, K2HPO4, MgSO4.7H2O và agar trong 500 ml nước cất, sau đó thêm nước cất cho đủ 1000 ml, tiếp tục thêm vào 15 ml glycerol, chỉnh pH = 7,2 – 7,4. Sau đó hấp vô trùng trong 20 phút ở 1210C, 1 atm rồi đổ đĩa petri (15 ml/đĩa). 31
  37. Đồ án tốt nghiệp  Môi trường LB lỏng Bacto-trypton 10 g Bacto-yeast extract 5 g NaCl 10 g Nước cất 1000 ml Đun trypton, dịch chiết nấm men và NaCl trong 500ml nước cất đến khi tan đều thì dịnh mức cho dủ 1000 ml, sau đó hấp khử trùng trong 20 phút ở 1210C, 1 atm rồi đổ ra ống nghiệm (9 ml/ống). 2.2.2.2. Hóa chất  Hóa chất dùng trong phân lập nấm - Dung dịch KOH 3% - Ethanol 70% - Nước cất vô trùng  Hóa chất ly trích DNA - TE (Tris-EDTA) 1X - SDS ( sodium dodecyl sulfate ) 10% - NaCl 5M, CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) - Phenol/ Chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) - Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), Isopropanol (NSX:Sigma) - Ethanol 70%, Rnase - 3M sodium acetate.  Hóa chất dùng trong PCR và điện di - TAE 0.5X - Gel agarose (Sigma) - Thang DNA (leader) - Loading dye - Ethium bromide - Nước cất dùng cho phản ứng PCR (Sigma) - dNTP’s 10mM 32
  38. Đồ án tốt nghiệp - 10X PCR Buffer - MgCl2 - 10mM Primer ES16, 10mM Primer ESIIG2C - Platium tag DNA. 2.2.3. Dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ - Que cấy - Đèn cồn - Kính hiển vi - Panh kẹp - Giấy lọc - Lam kính, lamelle - Bình tam giác - Cốc thủy tinh, ống nghiệm, đĩa petri, - Micropipet các loại 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl. - Đầu típ các loại 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl. - Ống eppendorf 1,5 ml và 2 ml - Bồn chứa Ethidium bromide. - Khay đổ gel điện di. - Dụng cụ rửa gel. - Hộp giữ lạnh 0oC và -20oC. 2.2.3.2. Thiết bị - Cân phân tích - Nồi hấp vô trùng - Lò vi sóng - Đèn UV - Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC - Tủ sấy - Tủ cấy 33
  39. Đồ án tốt nghiệp - Tủ lạnh bảo quản mẫu và hóa chất - Tủ hút khí độc - Máy cất nước 2 lần - Máy vortex - Máy PCR - Máy điện di - Máy ly tâm - Máy ảnh 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Giám dịnh nấm 2.3.1.1. Thí nhiệm 1: Ủ ẩm hạt giống  Mục đích Khảo sát và kiểm tra sự xuất hiện của các loài nấm có trên hạt giống.  Phương pháp - Dùng phương pháp Blotter là phương pháp ủ hạt giống trên đĩa petri có giấy thấm trong vòng 7 ngày ở 220C – 250C. - Sau khi ủ, kiểm tra sự phát triển của nấm trên mỗi đĩa. - Sử dụng 5 mẫu (M1, M2, M3, M4, M5), các mẫu được nghiên cứu trên 10 đĩa với số hạt là 10 hạt/1 đĩa.  Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mẫu Nghiệm thức 1: giữ nguyên mẫu. Nghiệm thức 2: mẫu được rửa 3 lần với nước cất vô trùng. Thực hiện - Dùng panh kẹp lấy 1 miếng giấy lọc và nhúng vào nước cất vô trùng rồi đặt vào trong đĩa petri. - Quay đĩa theo chiều kim đồng hồ và dùng panh đặt từng hạt vào trong đĩa, đặt 9 hạt xung quanh đĩa và 1 hạt giữa đĩa, các hạt phải có khoảng cách đều nhau. Chú ý không để hạt quá gần thành đĩa và quá gần nhau. 34
  40. Đồ án tốt nghiệp - Ghi ngày ủ mẫu và tên mẫu lên đĩa. - Ủ các đĩa ở 220C – 250C trong 7 ngày, theo dõi sự xuất hiện nấm trên các đĩa. Hình 2.1. Cách ủ hạt trong đĩa petri 2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Phân lập nấm  Mục đích: phân lập thuần các loài nấm xuất hiện trên hạt giống  Phương pháp: dùng phương pháp cấy chuyền  Chuẩn bị thí nghiệm: pha và hấp khử trùng các môi trường WA, CMA.  Thực hiện - Dùng que cấy móc khều một ít sợi nấm xuất hiện trên hạt giống và cấy vào giữa đĩa thạch WA, úp ngược đĩa, để ở nhiệt độ 250C – 270C. - Sau 2 - 3 ngày, cấy chuyền nấm từ đĩa thạch WA sang môi trường CMA để có được nấm thuần, úp ngược đĩa, để ở nhiệt độ 250C – 270C. 2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Quan sát và xác định các loại nấm xuất hiện trên hạt giống bằng phương pháp khóa định loại  Mục đích - Quan sát hình thái, kích thước, đặc điểm và màu sắc các loại nấm đã xuất hiện trên hạt giống đã được ủ ẩm. - Định danh đến chi các loại nấm đã phân lập được.  Phương pháp - Quan sát tiêu bản các nấm trên kính hiển vi điện tử. - Dựa vào các khóa định loại của P.H.B. Talbot (1971), Barry B. Hunter (1998) và Tsuneo Wabatabe (2002) để dịnh danh. 35
  41. Đồ án tốt nghiệp  Chuẩn bị thí nghiệm - Chuẩn bị các dụng cụ: lam kính, lamelle, kính hiển vi điện tử. - Chuẩn bị hóa chất KOH, Ethanol 70% và mẫu nấm.  Tiến hành thí nghiệm - Rửa sạch lam kính với Ethanol 70%, lau khô. - Nhỏ 1 giọt dung dịch KOH 3% lên lam kính. - Dùng que cấy thẳng khều sợi nấm mọc từ đĩa môi trường CMA chuyển qua dung dịch KOH vừa nhỏ trên lam kính, hòa tan. - Dùng lamelle đậy lại nhẹ nhàng sao cho không xuất hiện bọt khí trên lam. - Quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 10x và 40x. 2.3.2. Giám định vi khuẩn bằng phương pháp PCR 2.3.2.1. Quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii (EPPO, 2006) 36
  42. Đồ án tốt nghiệp Mẫu hạt Lắc 200 vòng/phút, 10 Chuẩn phút bị Cấy chang trên môi trường KB mẫu vi Cấy ria trên môi trường KB khuẩn Không Không có Khuẩn lạc nghi ngờ P.stewartii Có G+ Không có Kiểm tra Gram P.stewartii G- Ly Nhân sinh khối Trích DNA Ly trích DNA Thực hiện PCR Thực hiện Điện di PCR Kết quả 37
  43. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2. Thí nghiệm 1: Chuẩn bị mẫu vi khuẩn  Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Cho vào 50 Dịch Bảo Nghiền ml Lắng Lọc chứa vi quản ở 100 hạt nước dịch khuẩn 4oC cất vô trùng Hình 2.2. Quy trình chuẩn bị mẫu vi khuẩn  Phân lập vi khuẩn - Nên phân lập vi khuẩn ngay sau khi thu dịch ủ. - Lấy 100 µl dịch mẫu, dùng que thủy tinh dạng L chang trên môi trường KB. - Các đĩa phân lập được đặt úp ngược và ủ ở 25 - 28oC. - Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn sau 2 - 3 ngày. - Nếu có ít khuẩn lạc đặc trưng ta có thể lấy các khuẩn lạc nghi ngờ và cấy ria trên môi trường KB, ủ ở 25 - 28oC trong 1 - 2 ngày. Sau đó, lấy được khuẩn lạc đặc trưng để nhân sinh khối vi khuẩn.  Nhân sinh khối vi khuẩn - Chọn khuẩn lạc đơn dòng từ kết quả phân lập trên (các khuẩn lạc được chọn có màu vàng chanh tới vàng cam hoặc vàng nhạt, phẳng hoặc lồi, có gờ rõ ràng, mọc chậm tới trung bình, vi khuẩn Gram âm). - Dùng micropipet có gắn đầu típ lấy khuẩn lạc được chọn cho vào ống nghiệm chứa môi trường LB lỏng, lắc ở 150 vòng/phút trong 48 giờ.  Tồn trữ mẫu Cho 850 µl mẫu đã được nhân sinh khối vào eppendorf 1,5 ml, sau đó cho tiếp 150 µl glycerol đã tiệt trùng, trộn đều và cất giữ mẫu ở -80oC. 2.3.2.3. Thí nghiệm 2: Ly trích DNA vi khuẩn 1. Tăng sinh khối vi khuẩn trong môi trường LB lỏng trong 48 giờ. 2. Chuyển mẫu vừa tăng sinh vào eppendorf 1,5 ml. 38
  44. Đồ án tốt nghiệp 3. Ly tâm 12000 vòng/5 phút ở 4oC để thu sinh khối vi khuẩn, bỏ phần dịch phía trên, rửa vi khuẩn bằng nước cất vô trùng. 4. Hòa vi khuẩn thu được trong 567 µl trong dung dịch TE, 30 µl dung dịch SDS 10%, 3 µl proteinase K (20mg/ml), trộn đều bằng máy votex, sau đó ủ ở 37oC trong 1 giờ. 5. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, lắc đều. 6. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (khoảng 1/10 thể tích), vortex kỹ, ủ ở 65oC trong 10 phút. 7. Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), lắc đều bằng tay (không vortex), ly tâm 10 phút 13000 vòng/1 phút ở 4oC. Chú ý: lắc đều dung dịch trước khi cho hóa chất 8. Thu lấy dịch bên trên (chứa DNA) của dung dịch có nhiều phân lớp cho vào eppendorf mới. 9. Thêm 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcocol (25:24:1), trộn đều nhẹ bằng tay, sau đó ly tâm 10 phút với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC. 10. Thu lấy dung dịch bên trên (khoảng 80 - 90 µl) cho vào eppendorf mới. Kết tủa DNA với Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (0,6 x 90) µl, ủ ở - 200C trong 30 phút. Sau đó ly tâm 20 phút với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC, thu kết tủa. 11. Rửa kết tủa với ethanol 70% lạnh, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 10 phút với tốc độ 13000 vòng/phút ở 4oC. Bỏ phần dịch bên trên, thu kết tủa. 12. Làm khô kết tủa. 13. Hòa tan DNA trong 30 µl dung dịch TE. Cất ở 40C hoặc -200C. 39
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.4. Thí nghiệm 3:Thực hiện PCR Bảng 2.2.Tên, trình tự và kích thước khuếch đại của primer (Coplin & Majerezak) Kích thước đoạn DNA Primer Trình tự (5’- 3’) khuếch đại (bp) ES16 GCG AAC TTG GCA GAG AT 920 ESIIG2C GCG CTT GCG TGT TAT GAG 920 - Lấy 3 µl DNA sau khi ly trích cho vào eppendorf 100 µl. - Lần lượt cho vào eppendorf các hóa chất với liều lượng như trong bảng 2.3. - Cho eppendorf vào máy, cài đặt các thông số cho phản ứng PCR. - Sau 90 phút, tắt máy và lấy eppendorf ra tiến hành điện di. Bảng 2.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu Lượng (µl)/mẫu Nồng độ cuối Nước cất PCR (Sigma) 17.25 dNTP’s (Invitrogen) 10mM 0.5 200 µM PCR buffer 10 X 2.5 1 X MgCl(Invitrogen)2 (Invitrogen) 50mM 0.75 1.5 nM Primer ES16 (Sigma) 10 µM 0.4 0.16 µM Primer ESIIG2c 10 µM 0.4 0.16 µM Platinum(Sigma) Taq DNA 5u/ µl 0.2 0.04u DNApolymerase Sample 20ng/µl 3 20 ng (Invitrogen)Tổng thể tích 25  Chu kỳ phản ứng PCR Bước 1 : 94oC - 4 phút Bước 2 : 94oC - 45 giây 55oC - 45 giây 29 chu kỳ 72oC - 1 phút Bước 3 : 72oC - 10 phút Sản phẩm PCR bảo quản ở -200C 40
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.5. Thí nghiệm 4: Điện di sản phẩm PCR  Mục đích: Kiểm tra sản phẩm DNA và sản phẩm PCR.  Phương pháp: Điện di gel agarose.  Chuẩn bị: Chuẩn bị gel agarose 1% và 2%, dung dịch leader.  Tiến hành thí nghiệm Bước 1: Đổ gel vào thiết bị điện di, chờ cho gel nguội. Bước 2: Thực hiện điện di Kiểm tra kết quả DNA - Dùng gel 1% (0,25 g agarose + 25 ml TAE 0.5 X) - Hút 4 µl dung dịch DNA + 2 µl dung dịch nhuộm (loading dye 6X), trộn đều, sau đó bơm vào giếng. - Điện di :100 v – 250 mA – 35 phút Kiểm tra sản phẩm PCR - Dùng gel 2% (0,5 g agarose + 50 ml TAE 0.5 X) - Hút 4 µl sản phẩm PCR + 2 µl leader, trộn đều và bơm vào giếng. - Điện di : 70 v – 250 mA – 50 phút. Bước 3: Sau khi điện di nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (10mg/ml) trong 20 phút. Xem kết quả điện di dưới tia UV 302nm. 41
  47. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 3.1. Kết quả giám định nấm trên hạt giống bắp Bảng 3.1. Tỉ lệ hạt xuất hiện nấm trên các mẫu hạt giống [22] Số hạt xuất hiện Số hạt không xuất Mẫu (100 hạt) nấm hiện nấm NT1 30 70 M1 NT2 72 28 NT1 21 79 M2 NT2 19 81 NT1 71 29 M3 NT2 85 15 NT1 15 85 M4 NT2 67 33 NT1 0 100 M5 NT2 0 100 Hình 3.1. Các loại nấm xuất hiện trên các mẫu hạt giống [22] NT1: Mẫu không rửa thuốc NT2: Mẫu đã rửa thuốc 42
  48. Đồ án tốt nghiệp  Nhận xét Qua bảng 3.1 cho thấy: - Ở các mẫu 1, 3 và 4: số hạt xuất hiện nấm trong nghiệm thức 1 đều ít hơn số hạt xuất hiện nấm trong nghiệm thức 2. - Ở mẫu 2: số hạt xuất hiện nấm trong nghiệm thức 1 và số hạt xuất hiện nấm trong nghiệm thức 2 gần như tương đương nhau. - Ở mẫu 5: không có nấm xuất hiện trong cả hai nghiệm thức. Qua đó có thể thấy rằng ở các mẫu 1, 3, 4 và 5 thuốc BVTV bên ngoài hạt có tác dụng tốt trong việc hạn chế sự xuất hiện của các loại nấm. Còn ở mẫu 2 thuốc không ảnh hưởng đến sự xuất hiện của nấm. b Hình 3.2. Các loại nấm phân lập được trên môi trường CMA 3 ngày sau khi cấy 43
  49. Đồ án tốt nghiệp Qua quan sát trên kính hiển vi điện tử và dựa vào các khóa định loại, kết quả cho thấy có 3 chi nấm xuất hiện trên các mẫu hạt giống, gồm có Fusarium sp., Aspergillus spp., Rhizopus sp. a b Hình 3.3. Sợi nấm Aspergillu spp. xem trên kính hiển vi a. Vật kính 10x; b. Vật kính 40x Hình 3.4. Bào tử nấm Aspergillus spp. 44
  50. Đồ án tốt nghiệp d d c c b b a a Hình 3.5. Sợi bào tử nấm Aspergillus spp. a. Cuống bào tử; b. Bọng bào tử; c. Thể bình; d. Bào tử d a b c d Hình 3.6. Sợi nấm Rhizopus sp. xem trên kình hiền vi a. Khuẩn ty; b. Túi bào tử; c. Cuống bào tử; d. Bào tử 45
  51. Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.7. Nấm Fusarium sp. xem trên kính hiển vi a. Sợi nấm; b. Bào tử Bảng 3.2. Kết quả giám định nấm trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan Đặc điểm hình thái Đặc điểm cấu trúc STT Tên nấm bào tử của nấm Bào tử dài, hơi cong, có 2 Tản nấm có màu hồng đến 1 Fusarium sp. đầu tròn, có vách ngăn. phớt hồng. Cụm bào tử phân sinh hình tròn, màu trắng khi còn non, Bào tử phân sinh có dạng Aspergillus khi già có màu đen, hoặc 2 hình cầu hoặc gần giống spp. xanh, hoặc nâu vàng. Cành hình cầu, sần sùi. bào tử có thể mọc đơn lẻ hoặc theo nhóm. Nấm thường phát triển và Bào tử bọc hình cầu, hình trải ra xung quanh bề mặt 3 Rhizopus sp. ovan hoặc elip. hạt. Hạt bị nhiễm có thể lay lan ra các hạt khác bên cạnh. 3.2. Kết quả giám định vi khuẩn Pantoea stewartii Hình 3.8. Khuẩn lạc trên môi trường KB 2 ngày sau khi cấy 46
  52. Đồ án tốt nghiệp Các khuẩn lạc được chọn có màu vàng chanh tới vàng cam hoặc vàng nhạt, phẳng hoặc lồi, có gờ rõ ràng, mọc chậm tới trung bình, vi khuẩn Gram âm. Kết quả có 12 mẫu có khuẩn lạc nghi ngờ là Pantoea stewartii. Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra sự hiện diện DNA của vi khuẩn được ly trích từ các mẫu Sự hiện diện của DNA Stt Mẫu Hiện diện Không hiện diện 1 M1  2 M9  3 119  4 129 d1  5 129 d2  6 129 j  7 129 j1  8 129 j2  9 129 g  10 129 h  11 129 k  12 129 l   Nhận xét Dựa vào kết quả nuôi cấy dịch vi khuẩn trên môi trường KB, trong 20 mẫu thí nghiệm, có 12 mẫu có các khuẩn lạc nghi ngờ. Sau khi ly trích DNA, kết quả có 9 mẫu ly trích được dịch DNA vi khuẩn. Các mẫu không ly trích được DNA sẽ tiến hành ly trích lại. 47
  53. Đồ án tốt nghiệp (1) (3) (4) (6) (7) (9) (10) (11) Hình 3.9. Kết quả ly trích DNA sau khi điện di Hình 3.10. Kết quả thực hiện PCR sau khi điện di (1) M1 (2) 119 (3) 129 d1 (4) 129 j (5) Thang leader (6) 129 j1 (7) 129 g (8) 129 h (9) Đối chứng (+) (10) 129 k 48
  54. Đồ án tốt nghiệp  Nhận xét Tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 20 mẫu, trong đó 9 mẫu vi khuẩn được ly trích từ các lô hạt giống bắp nhập khẩu đều cho kết quả âm tính với cặp primer ES16 và ESIG3c so với mẫu chuẩn G3. Điều này cho thấy quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ ngô rất ổn định trên cơ sở hóa chất và trang thiết bị hiện có tại Trung tâm Kiểm dịch thực vật sau nhập khẩu II. Vậy đã kiểm tra được 20 mẫu bắp tương đương với 20 lô hạt giống bắp nhập khẩu từ Thái Lan. Tất cả đều không nhiễm vi khuẩn Pantoea stewartii. 3.3. Kết luận và kiến nghị - Thành phần bệnh hại do nấm trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan có tất cả 3 chi với 4 loài nấm. - Với các mẫu tiến hành thí nghiệm, chưa phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii gây bệnh héo rũ ngô trên hạt giống ngô nhập khẩu từ Thái Lan. - Đề nghị nên sử dụng các giống kháng hoặc các giống đã được xử lý thuốc để hạn chế các bệnh hại do nấm gây ra. 49
  55. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005). Sinh học phân tử. NXB Giáo dục. TP.HCM. 2. Kỹ thuật trồng ngô. (2012). Trường TH Nông Nghiệp và PTNT Quảng Trị 3. Lê Lương Tề. Nấm mốc và phòng chống nấm mốc trên đồng ruộng và trong bảo quản. BVTV. Số 5-2007 4. Trần Văn Dư và ctv (2011). Giáo trình modun quản lý dịch hại trên cây ngô. Bộ NN & PTNT. 5. Vũ Triệu Mân (2007). Bệnh cây chuyên khoa. Đại học Nông Nghiệp I. Hà Nội 6. Barry B. Hunter, H.L. Barnett (1998). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. The American Phytopathological Society 7. Carlos De Leon, Den Jeffers, A.J. Ullstrup (1974). Maize disease: A Guide For Field Indentification. 4th Edition (2004). CIMMYT Maize Program. 8. David L.Coplin et al (2002). Indentification of Pantoea stewartii subsp.stewartii by PCR and Strain Differentiation by PFGE, Plant disease, Vol 86, Pages 304-311. 9. E.J.Warham, L.D.Butler, B.C.Sutton. Seed testing of maize and wheat. CIMMYT 10. EPPO Bulletin (2006). Pantoea stewartii subsp. Stewartii, Volume 36, Issue 1, Pages 111-115. 11. Carlos De Leon, Den Jeffers, A.J. Ullstrup (1974). Maize disease: A Guide For Field Indentification. 4th Edition (2004). CIMMYT Maize Program. 12. P.H.B. Talbot (1971). Principles of fungal taxomony. University of Adelaide, South Australia 13. Pataky J.K (2004). Stewart’s wilt of corn., The Plant Health Instructor, DOI: 14.1094/PHI-I-2004-0113-01. 15. Tsuneo Wanatabe (2002). Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi. Morphologics of Cultured Fungi and Key to Species. CRC Press. 16. Lester W. Bergess et al (2009). Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR). 17. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến và Nguyễn Văn Bắc, 2006. Nấm sợi. & 50
  56. Đồ án tốt nghiệp 18. Nguyễn Văn Thành, Cao Ngọc Ðiệp và Nguyễn Văn Bá, 2005. Giáo trình môn nấm học. 19. Biswanath Das . Aspergillus ear rot. 6/2013. 20. Biswanath Das. Fusarium and gibberella stalk rot. 6/2013 21. 22. 23. 24. 25. 26. 51