Đồ án Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase

Nội dung text: Đồ án Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN ENZYME CHITINASE Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Trần Đức Vinh MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 7/2014
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học. Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người đã nhiệt tình, tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi những kiến thức chuyên ngành để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Tôi cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi. Và cuối cùng, hơn ai hết, con xin cám ơn ba và mẹ, người đã hết lòng lo lắng, vất vả để tạo điều kiện cho con đi học đến hiện nay và thực hiện ước mơ của mình. Con xin cám ơn ba mẹ rất nhiều.
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Trần Đức Vinh
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về Trichoderma 4 1.1.1. Phân loại 5 1.1.2. Lịch sử phát triển 5 1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma 6 1.1.3.1. Đặc điểm hình thái 6 1.1.3.2. Đặc điểm sinh trƣởng 8 1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma 9 1.1.4. Vai trò sinh thái 10 1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam 10 1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp 12 1.1.6.1. Bảo vệ thực vật 12 1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng 12 1.1.6.3. Trong xử lí môi trƣờng 13 1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm 13 1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi 14 1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. 14 1.2.1. Cạnh tranh 14 1.2.2. Kí sinh 15 1.2.3. Bất hoạt enzyme của nấm bệnh 16 1.2.4. Tăng khả năng kháng của thực vật 16 1.3. Những nghiên cứu về enzyme chitinase 17 1.3.1. Giới thiệu về chitin 17 1.3.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin 17 i
5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.2. Lịch sử phát hiện của chitin 18 1.3.1.3. Sự phân bố của chitin trong tự nhiên 19 1.3.1.4. Điều chế chitin 20 1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase 20 1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố 20 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase 22 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase 23 1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase 25 1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase 26 1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật 28 1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ƣu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới 30 1.4 Sơ lƣợc về bệnh thán thƣ trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp 32 1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt 32 1.4.1.1 Triệu chứng 32 1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 33 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 34 2.1 Thời gian và địa điểm 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu 34 2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Dụng cụ 34 2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 35 2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 35 2.2.3.1 Môi trƣờng PDA 35 2.2.3.2 Môi trƣờng định tính sự sinh tổng hợp chitinase 36 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Môi trƣờng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase 36 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 38 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của Trichoderma 38 2.3.1.1 Phƣơng pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trƣờng thạch PDA 38 2.3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trƣờng thạch 38 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 40 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase 41 2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase 42 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS 42 2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn 45 2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 46 2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 46 2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 48 2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 49 2.3.11 Khảo sát sự ảnh hưởng các nguồn đường và hàm lượng đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 51 2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp 52 2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu 53 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Kết quả khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi trƣờng thạch có cơ chất cảm ứng chitin 1% 53 3.2 Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 55 3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 60 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 3.4 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 62 3.5 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 65 3.6 Ảnh hƣởng của nguồn đƣờng bổ sung đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum 67 3.7 Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ Trichoderma harzianum. 68 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 iv
8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNS Dinitrosalicylic acid GlacNac N-acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton MT Môi trƣờng NSC Ngày sau cấy PDA Potato D-glucose agar v
9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG TRANG khả năng phân giải chitin của Trichoderma 1 3.1 harzianum trên môi trƣờng định tính sinh tổng hợp 56 chitinase. Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh môi 2 3.2 58 trƣờng nuôi cấy. Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng 3 3.3 63 của nguồn cơ chất cảm ứng Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng 4 3.4 65 ngày nuôi cấy Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng 5 3.5 71 của pH môi trƣờng nuôi cấy Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng 6 3.6 74 của nguồn dƣờng và tỷ lệ đƣờng bổ sung. 7 3.7 Đƣờng kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy ở 2 70 mẫu thí nghiệm 8 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua các ngày 80 vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG TRANG Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi 1 1.1 9 trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA). 2 1.2 Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum 10 Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính 3 1.3 11 hiển vi quang học x100 Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của 4 1.4 14 Trichoderma spp. ở Việt Nam và trên thế giới. 5 1.5 Cấu trúc phân tử của chitin 20 6 1.6 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 26 Quả ớt bình thƣờng và quả ớt bị bệnh thán thƣ do 7 1.7 35 Collectotrichum spp. 8 2.1 Buồng đếm hồng cầu Neubauer 43 Vòng phân giải chitin của T. harzianum trên môi 9 3.1 trƣờng dinh dƣỡng chứa chitin 1% sau 2 ngày nuôi 54 cấy. Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase 10 3.2 55 theo môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng A, B trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngàyvới 11 3.3 58 bào tử Trichoderma harzianum. vii
11. Đồ án tốt nghiệp Môi trƣờng C, D trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngày với 12 3.4 59 bào tử Trichoderma harzianum. Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase 13 3.5 60 theo cơ chất cảm ứng. Biều đổ đƣờng thể hiện sự biến đổi của hoạt tính 14 3.6 63 chitinase theo thời gian nuôi cấy Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của chitinase theo pH 15 3.7 65 môi trƣờng ban đầu Mặt sau (a) và mặt trƣớc (b) của tản nấm 16 3.8 77 Collectotrichum sp sau 3 ngày ủ với enzyme chitinase. Mặt sau (c) và mặt trƣớc (d) của tản nấm 17 3.9 77 Collectotrichum sp sau 6 ngày ủ với enzyme chitinase. viii
12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Trichoderma spp. là tác nhân kiếm soát sinh học có hiệu quả, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng đối kháng của chúng với các loài nấm hại thực vật bằng các cơ chế khác nhau. Trong số đó, cơ chế sinh tổng hợp enzyme ngoại bào có một vai trò quan trọng, đặc biệt là hệ enzyme chitinase. Đây là hệ enzyme có khả năng phân hủy chitin- thành phần cấu tạo nên vách tế bào của đa số loài nấm hại cây trồng và kể cả côn trùng, từ đó ức chế sự phát triển của dịch bệnh. Ngoài ra, chitinase còn nhiều ứng dụng có ý nghĩa khác nhƣ là dùng để xúc tác để tạo ra các hợp chất có tác dụng giúp tăng sản xuất dịch nhầy, cải thiện khả năng bôi trơn khớp để giảm triệu chứng của thoái hóa khớp, để tổng hợp các hợp chất chitooligosaccharides Trong các loài Trichoderma spp. thì Trichoderma harzianum đƣợc chứng minh là có khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt hơn cả. (Theo M.H. Et-Katatny, 2000) Hiện nay, dân số ngày càng gia tăng một cách nhanh chóng, đi cùng là nhu cầu về lƣơng thực cũng gia tăng theo. Song đối với khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa nhƣ Việt Nam lại rất đa dạng về các loại nấm bệnh gây hại thực vật và chúng phát triển rất nhanh trong nhiệt độ và độ ẩm thuận lợi thế này, gây rất nhiều khó khăn cho việc trồng trọt và ảnh hƣởng đến bảo quản sau thu hoạch. Để bảo vệ năng suất cây trồng và chất lƣợng nông sản sau thu hoạch, nông dân sử dụng các chất hóa học để ngăn cản sự tấn công của nấm bệnh. Ngay cà khi dùng thuốc diệt nấm chuyên dụng thì hàng năm trên thế giới nấm bệnh thực vật vẫn gây ra thiệt hại 15% sản lƣợng thu hoạch. Hơn nữa, khi sử dụng thuốc hóa học một cách chủ quan lại chính là con dao hai lƣỡi, bởi các chất hóa học là nguy cơ tiềm tàng mà ngày nay các nhà khoa học phát hiện ra chính chúng gây ra các bệnh ung thƣ và một số bệnh lý nguy hiểm khác. Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã nghiên cứu một thời gian dài và đã tìm ra đƣợc một chìa khóa thích hợp nhất. Đó chính là những hợp chất sinh 1
13. Đồ án tốt nghiệp học, thân thiện với môi trƣờng cũng nhƣ không ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. Và hợp chất sinh học có thể ứng dụng đó chính là enzyme chitinase, đƣợc sinh ra từ một số vi sinh vật nhất định. Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài “Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ƣu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase.” 2. Mục đích nghiên cứu Tìm ra đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu để thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum. 3. Nội dung nghiên cứu Định tính khả năng sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma harzianum. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, thời gian nuôi cấy đến sự tổng hợp chitnase từ Trichoderma harzianum . Khảo sát ảnh hƣởng của một số nguồn cơ chất cảm ứng, pH môi trƣờng, nguồn đƣờng bổ sung đến khả năng sinh hoạt tính enzyme chitinase. Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ Trichoderma harzianum. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Phần mềm thống kê, tính toán - Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010. - Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lý số liệu. 4.2 Kết quả đạt được của đề tài - Tìm ra đƣợc các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng Trichoderma harzianum sinh tổng hợp chitinase. 2
14. Đồ án tốt nghiệp 5. Kết cấu đồ án - Chƣơng 1: Tổng quan - Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp - Chƣơng 3: Kết quả và biện luận - Chƣơng 4: Kết luận và đề nghị 3
15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về Trichoderma Trichoderma là một trong số ít những vi nấm có lợi, điều này đã đƣợc chứng minh và chúng đã đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học đối với những nấm gây bệnh (Chet, 1987; Chet et al., 1998). Trichoderma có thể phát triển mạnh trong các thảm thực vật. Trichoderma là một chi nấm hiện diện trong đất, chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (gỗ, các loài nấm khác ), nhiều loài trong chi này có khả năng sống cộng sinh với cây. Có thể nói Trichoderma là một trong số những loài vi nấm đƣợc nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng đƣợc tìm thấy ở khắp nơi trừ những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Nấm Trichoderma phổ biến ở những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, chúng hiện diện trên rễ cây, trong đất hay xác sinh vật đã chết, xác bã hữu cơ hay kí sinh trên các loài nấm khác. Mỗi dòng nấm Trichoderma khác nhau sẽ yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Harman, 2000). Khi cộng sinh với cây, Trichoderma sẽ giúp cây tránh đƣợc khỏi sự xâm hại của các loài nấm gây bệnh khác bằng các cơ chế nhƣ tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dƣỡng từ các loài nấm hại khác. Và yếu tố quan trọng để giúp chúng có thể xâm nhập vào bên trong nấm hại chính là khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme ngoại bào. 4
16. Đồ án tốt nghiệp 1.1.1. Phân loại Giới (Kingdom): Nấm (Fungi) Ngành (Phylum): Nấm túi (Ascomycota) Lớp (Class): Sordariomycetes Phân lớp (Subclass): Hypocreomycetidae Bộ (Order): Hypocreales Họ (Family): Hypocreaceae Chi (Genus): Trichoderma Loài (Species) : Trichoderma spp. 1.1.2. Lịch sử phát triển Chủng nấm Trichoderma đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Persoon vào năm 1794, vào thời điểm đầu tiên này ông đã mô tả đƣợc 3 loài: 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). Cho đến năm 1801, Persoon và Gray đã mô tả chi tiết đƣợc 7 loài nấm Trichoderma đó là: 1- Trichoderma caesium Pers. (1794). 2- Trichoderma nigrescens Pers. (1794). 3- Trichoderma viride var. viride Pers. (1794). 4- Trichoderma aureum Pers. (1796). 5
17. Đồ án tốt nghiệp 5- Trichoderma laeve Pers. (1796). 6- Trichoderma dubium Pers. (1801). 7- Trichoderma fuliginoides Pers. (1801). Trong suốt 2 thế kỷ tiếp theo đến năm 1999 các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện thêm khoảng 90 loài. Từ năm 2000 trở lại đây đã phát hiện thêm khoảng 50 loài mới. Cho đến năm 2013, đã có trên 150 loài nấm Trichoderma đƣợc mô tả. 1.1.3. Đặc điểm chung của Trichoderma 1.1.3.1. Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trƣờng thạch dịch chiết khoai tây (PDA). (Nguồn: Chủng nấm Trichoderma spp. thuộc nhóm nấm bất toàn (là những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử), có khuẩn lạc màu lục khi tăng trƣởng có sự hiện diện của ánh sáng mặt trời. Sợi nấm của Trichoderma phân nhánh mạnh, thƣờng hình thành ở dạng gần nhƣ vòng tròn đồng tâm. Các sợi nấm thƣờng mọc tạo góc với trục chính khoảng 90 độ. 6
18. Đồ án tốt nghiệp Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu và liên kết với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Hình 1.2: Sợi nấm và cuống bào tử của Trichoderma harzianum (Nguồn: Bào tử của nấm Trichoderma mịn, trơn láng có màu xanh lá cây hoặc màu vàng. Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3-5 x 2-4 µm (L/W=1.3), bào tử hình cầu (L/W<1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài. 7
19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3: Bào tử của Trichoderma harzianum quan sát dƣới kính hiển vi quang học x100 1.1.3.2. Đặc điểm sinh trưởng Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng đƣợc là monosaccharide, disaccharide, polysaccharide NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên thƣờng có mặt trong môi trƣờng nuôi cấy loài nấm này, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trƣờng có nhiều dinh dƣỡng. Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hƣởng lớn đến khả năng sinh trƣởng của Trichoderma. Nhƣng muối NaCl sẽ làm giảm sự sinh trƣởng và phát triển của một số loài Trichoderma, do đó trong môi trƣờng nuôi cấy không nên có sự có mặt của NaCl. Nồng độ CO2 cũng ảnh hƣởng phần nào đến sự sinh trƣởng của Trichoderma. Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C [13], có một vài loài Trichoderma tăng trƣởng đƣợc ở 350C. Một số ít phát triển tốt ở 400C (Samuels, 2000). Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5 - 7,0 nhƣng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5, phát triển tốt ở pH trung tính. Các chủng Trichoderma có tốc độ tăng trƣởng nhanh, đƣờng kính khuẩn lạc đạt trung bình 2 cm – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy (Bùi Xuân Đồng, 1982). Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví dụ Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trƣờng có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum 8
20. Đồ án tốt nghiệp thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thƣờng phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Phần lớn các loài Trichoderma có tính cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo dƣới điều kiện tối sáng lẫn lộn hay bào tử xuất hiện trong điều kiện sáng. Bào tử trên môi trƣờng thạch agar dƣới ánh sáng 85 Lux trong 20 - 30 giây sẽ làm tăng hiệu quả nẩy mầm. Đối với thể bào tử phialiconidio cảm ứng với ánh sáng nhất, chúng sẽ xuất hiện nhiều dƣới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút hoặc dƣới tia cực tím ở 10 - 30 giây. Một số tác giả đã công bố Trichoderma hình thành bào tử nhiều nhất ở bƣớc sóng từ 380 nm - 440 nm, và không hình thành bào tử ở bƣớc sóng dƣới 254 nm và trên 1100 nm. Các bào tử cảm quang bị hạn chế phát triển dƣới sự có mặt của các hóa chất nhƣ: azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidum bromide, các hóa chất này sẽ ngăn chặn sự hình thành của các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc rất đặc biệt, có tiềm năng trong phòng trừ sinh học. T. hamatum, T. hazianum, T. viride và T. virens ở trong cả môi trƣờng lỏng và rắn có acide thích hợp cho sự nảy mầm bào tử hơn là môi trƣờng trung tính. 1.1.3.3. Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma Weidling là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma. Weidling và Emerson đã phân lập đƣợc chất độc kết tinh từ sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma, đó là: gliotoxin (C13H14N2S2O4). Chất độc thứ hai do Brian và Mc. Growan công bố là virindin (C9H16O6), đƣợc sản xuất từ T. viride. Dennis và Webstre ghi nhận Trichoderma spp., còn sinh tổng hợp một sản phẩm trao đổi chất khác gliotoxin và virindin, đó là kháng sinh: trichlorofore từ T. viride và T. polysporum, kháng sinh peptide từ T. harzianum. Bên cạnh sản phẩm trao đổi chất là chất độc và kháng sinh, Trichoderma còn sinh tổng hợp đƣợc một số các enzyme có hoạt tính sinh học mạnh nhƣ: exo và endoglucanse, cellobiose và chitinase. 9
21. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Vai trò sinh thái Ngoài tự nhiên Trichoderma thể hiện rất rõ vai trò sinh thái của chúng nhƣ: ức chế sự phát triển của các loài nấm bệnh nhờ cơ chế kí sinh, phân giải các nguồn chất thải hữu cơ nhƣ cellulose từ gỗ, lá, Theo Garret (1956), Trichoderma có đƣợc những khả năng trên là do các đặc tính sau: Sinh trƣởng mạnh và bào tử nảy mầm nhanh. Có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải cao. Có khả năng tạo kháng sinh, chịu đƣợc cả kháng sinh. 1.1.5. Tính ứng dụng của Trichoderma trên thế giới và Việt Nam Nấm Trichoderma đã đƣợc biết đến từ những năm 1920 và đƣợc xem là yếu tố kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh trên cây trồng. Cho đến gần đây, các cơ chế để kiểm soát đã đƣợc biết đến, bao gồm khả năng kí sinh, kháng nấm, cạnh tranh về dinh dƣỡng, khả năng tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh. Nấm Trichoderma xâm chiếm các lớp biểu bì rễ, lớp vỏ bên ngoài và đồng thời giải phóng các phân tử chất có hoạt tính sinh học. Trichoderma spp. bắt đầu đƣợc ứng dụng trong nông nghiêp để kiểm soát dịch bệnh. Các nghiên cứu về tính kí sinh cũng đã chứng minh rằng loài nấm này tạo ra một hỗn hợp đa dạng các enzyme kháng nấm, bao gồm: chitinase và β-1,3-glucanase. Các enzyme này cùng với một số enzyme khác, cùng với hợp chất kháng nấm hỗ trợ nhau trong quá trình chống lại các loài nấm bệnh. Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma đƣợc đƣa vào ứng dụng tính đối kháng nấm bệnh trên một số cây trồng. Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssim Pythium. Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nhiều nấm bệnh. Sản phẩm Ecofit (India) chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium, 10
22. Đồ án tốt nghiệp Rhizoctonia, Macrophomia, Phytophthora trên cây bông vải, thuốc lá, cao su, và nhiều loại rau. Sản phẩm BINAB-T-WP (Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống các bệnh ở rễ cây. Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm khác ở nhiều nƣớc trên thế giới đƣợc ứng dụng rộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI, 2001). Ở Việt Nam, các tỉnh phía nam đang lƣu hành khoảng 30 sản phẩm có chứa Trichoderma của nhiều công ty khác nhau, các sản phẩm này đã và đang góp phần hạn chế các nấm bệnh trên cây trồng nhƣ hồ tiêu, ca cao, cà chua, dua hấu, dƣa leo, cam quýt (Quang Ngọc, 2009). Nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Cần Thơ đã phối hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản phẩm phòng trừ bệnh hiệu quả theo đối tƣợng nhƣ: Tricô-ĐHCT có khả năng phòng trừ bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau màu do Fusarium; Tricô-Lúa Von phòng trừ bệnh lúa Von do Fusarium moniliforme; Tricô- Nấm Hồng trị bệnh do Phytophthora trên sầu riêng, tiêu, cao su, Tricô- Khóm trị bệnh do Phytophthora, Fusarium gây ra (Dƣơng Minh và cộng sự, 2010). Hình 1.4: Một số sản phẩm thƣơng mại ứng dụng của Trichoderma spp. ở Việt Nam và trên thế giới. 11
23. Đồ án tốt nghiệp 1.1.6. Ứng dụng của Trichoderma trong nông nghiệp 1.1.6.1. Bảo vệ thực vật Một số bệnh liên quan đến các bộ phận rễ cây rất khó trị bằng biện pháp hóa học truyền thống, vì không thể tác động lên toàn bộ rễ bằng thuốc diệt nấm. Trichoderma spp. đƣợc biết đến nhƣ là một tác nhân đối kháng lại với các nấm bệnh của cây trồng và đã đƣợc ứng dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học cho cây trồng trong nhà kính và ngoài ruộng, chúng có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh khác nhau nhƣ: Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Pythium spp., Slecrotium rofsii. Một số loài Trichoderma đƣợc sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là T. koningii, T. harzianum, T. viride, T. hamatum, 1.1.6.2. Cải thiện năng suất cây trồng Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa. Đã có những công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningiii kích thích sự nảy mầm và tăng trƣờng của cây. Đối với các loài đƣợc trồng trong nhà kính, T. harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lƣợng hoa. Trichoderma đẩy mạnh tốc độ tăng trƣởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng bắp đƣợc bổ sung T. harzianum T-22 hỗ sinh ở rễ thì cần lƣợng đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22. Trichoderma cải thiện cấu trúc đất và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định Nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất, tăng độ phì nhiêu và dinh dƣỡng cho cây trồng. Tăng sức đề kháng cho cây trồng, một số chủng T. harzianum còn có thể xâm nhập vào mô tế bào cây, làm tăng khả năng chống chịu bệnh của cây. 12
24. Đồ án tốt nghiệp Các chủng nấm Trichoderma spp.trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón xanh, hiệu quả mà còn góp phần kiểm soát các bệnh hại cây trồng và tạo ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. 1.1.6.3. Trong xử lí môi trường [17] T. harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng, đã đƣợc chứng minh có khả năng phân giải hiệu quả ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphonic. T. harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật trƣờng đại học California) có thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol. T. harzianum CCT-4790 có thể phân giải 60% thuốc diệt cỏ Durion trong đất sau 24 giờ, đây đƣợc xem nhƣ là một liệu pháp rất có tiềm năng trong việc xử lí các hóa chất gây độc hại trong đất và trong đầm lầy. 1.1.6.4. Trong công nghiệp thực phẩm Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã đƣợc khảo sát và cho thấy có thể làm tăng hƣơng vị của men rƣợu. Đồng thời, các loại enzyme glucanase và glucosidase đƣợc tiết ra có khả năng thủy phân các liên kết glycoside trong liên kết glycoside-terpen từ đó giải phóng các hợp chất terpen, tạo mùi thơm đặc trƣng cho sản phẩm. Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thƣờng chứa đầy đủ hàm lƣợng β-amylase nhƣng lại thiếu α-amylase, cho nên ngƣời ta phải bổ sung vào bột một lƣợng α- amylase nhất định có thể lấy từ đại mạch nảy mầm, vi khuẩn hay nấm. Trong đó nấm đƣợc xem là nguồn α-amylase phong phú và tốt nhất. Các nhà khoa học đã chuyển thành công gen mã hóa α-amylase từ Trichoderma vào nấm men bánh mì dƣới sự kiểm soát của promoter ACT1. Bánh mì tạo ra có kích thƣớc lớn hơn và ruột bánh mì cũng mềm hơn, chậm cứng hơn làm kéo dài thời gian bảo quản. 13
25. Đồ án tốt nghiệp 1.1.6.5. Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi Hiện nay trên thị trƣờng có chế phẩm EconaseTM với các enzyme có nguồn gốc từ Trichoderma reesei bổ sung vào thức ăn của gia súc, với các ƣu điểm: - Thành phần dinh dƣỡng linh động hơn. - Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền. - Dễ tiêu hóa - Làm tăng giá trị năng lƣợng của ngũ cốc - Giảm lƣơng rác thải cho môi trƣờng Ngoài ra còn có chế phẩm AvizymeTM cũng chứa nhƣng ƣu điểm tƣơng tự EconaseTM thích hợp cho gia cầm trong giai đoạn đẻ trứng. PorzymeTM là thƣơng hiệu của một hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase, protease, amylase bổ sung vào khẩu phần ăn của lợn con vừa thôi bú. Tất cả enzyme này đều bắt nguồn từ Trichoderma. 1.2. Cơ chế kiểm soát sinh học của Trichoderma spp. [17] Trichoderma spp. Phát triển nhiều cơ chế để ngăn chặn sự tấn công của các loài nấm khác và hỗ trợ cho cây và rễ cây phát triển. Các cơ chế này bao gồm cạnh tranh về không gian và dinh dƣỡng (Elad et al., 1999), kí sinh (Haran et al., 1996; Lorito et al., 1996), sản sinh ra những hợp chất mang tính ức chế (Sivasithamparam và Ghisalberi, 1998), bất hoạt các enzyme của tác nhân gây bệnh (Roco và Perez, 2001) và tăng khả năng kháng của thực vật (Kapulnik và Chet, 2000). 1.2.1. Cạnh tranh Các loài Trichoderma thƣờng đƣợc xem là những đối thủ cạnh trạnh mạnh mẽ (Samuels, 1996), chúng phát triển mạnh và nhanh chóng sử dụng các nguồn cơ chất dinh dƣỡng để ức chế khả năng phát triển của nấm bệnh, ví dụ nhƣ Fusarium spp. (Papavizas, 1985). Những loài Trichoderma, có thể bổ sung trực tiếp vào đất, hay xử lí với hạt giống sẽ phát triển theo sự sinh trƣởng của hệ thống rễ của cây đƣợc xử lí (Ahmad và Baker, 1987). Đất đƣợc xử lí với bào tử nấm T. harzianum sẽ 14
26. Đồ án tốt nghiệp lấn áp các nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum và F. oxysporum f. sp. melonis. Cạnh tranh dinh dƣỡng và không gian sống đƣợc xem nhƣ là một cơ chế, mặc dù nó không đƣợc chứng minh là hoạt động riêng rẽ (Silvan và Chet, 1989). Ozbay và Newman (2004) đã chỉ ra rằng Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Chalara elegans bị ức chế mạnh mẽ bởi Trichoderma trong điều kiện in vitro. Cả tác nhân gây bệnh và Trichoderma điều phát triển. Các nhà nghiên cứu quan sát thấy rằng hoạt động ức chế của Trichoderma với nấm bệnh có liên quan đến nồng độ và sự tích lũy CO2. 1.2.2. Kí sinh Cách thức tƣơng tác và kí sinh sợi nấm của các loài Trichoderma với các tác nhân gây bệnh trong đất đã đƣợc biết đến từ lâu (Chet et al., 1981; Denis và Webster, 1971).Trichoderma phát triển hƣớng về sợi nấm của các nấm khác và cuộn tròn lấy chúng, sau đó phân giải thành tế bào của mục tiêu bằng cách tiết ra những enzyme phân giải khác nhau. Quá trình kí sinh này giới hạn sự phát triển và hoạt động của các tác nhân gây bệnh thực vật.Trichoderma tấn công vào hệ sợi nấm của mục tiêu sau khi cuộn lấy chúng và xâm nhập vào bên trong thành tế bào vật chủ nhờ hệ phân giải. Sự tƣơng tác kí sinh này mang tính đặc hiệu, Trichoderma sẽ nhận diện tính hiệu từ vật chủ, rồi bắt đầu cuộn lấy vật chủ và xâm nhập chúng (Denis và Webster, 1971; Sivan và Chet, 1989). Hệ eznyme của Trichoderma giúp phân giải thành tế bào vật chủ nhƣ β-1,3-glucanase và các enzyme phân giải chitin, đƣợc xem là các enzyme chủ chốt trong hoạt động kí sinh này (Elad et al., 1982 Cherif và Benhamou, 1990). Endochitinase (42-kDa), chitobiosidase (40-kDa) và N-acetyl-b-D- glucosamidase (73-kDa) từ T. atroviride chủng P1 và T. virens chủng 41 đƣợc công bố là có khả năng ức chế đáng kể sự nảy mầm của bào tử và sự kéo dài sợi nấm của nhiều nấm bệnh khác nhƣ Botrytis cinerea, Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae, Uncinula necator và hầu nhƣ đối với tất cả các nấm mà thành 15
27. Đồ án tốt nghiệp phần thành tế bào có chứa chitin (Di Pietro et al., 1993, Lorito et al., 1993, 1994, 1996; Schrimbock et al., 1994). Nhiều enzyme đã đƣợc thu nhận và tinh sạch, khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử và kéo dài sợi nấm của nấm bệnh đã đƣợc kiểm nghiệm in vitro (Lorito et al., 1998). Quan sát bởi kính hiển vi điện tử và kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng T. harzianumvà T. hamatum có khả năng kí sinh cà Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani. Nấm đối kháng tấn công tác nhân gây bệnh và tiết ra glucanase và chitinase để thâm nhập vào bên trong thành tế bào vật chủ (Elad et al., 1983). Trichoderma có thể sản sinh cellulase, β-1,3-glucanase và chitinase để mà phân giải lớp glucan trong thành tế bào Pythium spp., chitin và glucan trong thành tế bào của Rhizoctonia solani (Harman et al., 1980). 1.2.3. Bất hoạt enzyme của nấm bệnh Bất hoạt enzyme của nấm bệnh là một cơ chế kiểm soát khác của Trichoderma. Enzyme của Botrytis cinerea nhƣ là pectinase, cutinase, glucanase và chitinase bị bất hoạt thông qua enzyme protease của chủng T39 tiết ra trên bề mặt cây (Elad et al., 1999). Tác nhân gây bệnh thực vật Alternaria alternatacó thể tiết enzyme endo-polygalacturonase và pectate lyase để phân giải các thành phần chứa pectic của thành tế bào thực vật. Sự hiện hiện diện của Trichoderma harzianum làm suy giảm 50% enzyme endo-polygalacturonase do nấm Alternaria alternata tiết ra (Roco và Pertez, 2001). Các loài Trichoderma khác hay các chủng phân lập khác thuộc mỗi loài có thể khác nhau về khả năng kiểm soát sinh học. Do đó, việc phân lập và khảo sát các loài Trichoderma tử các vùng khác nhau là rất quan trọng để tìm ra một loài hay chủng thích hợp. 1.2.4. Tăng khả năng kháng của thực vật Các chủng đặc trƣng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ, sau đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều này đƣợc xem nhƣ là phản ứng phòng vệ của cây. Khi bón T. harzianum vào rễ cây 16
28. Đồ án tốt nghiệp đậu cho thấy rằng giảm đƣợc từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra. Các nhà khoa học đã sử dụng T. harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng T. harzianum T39 ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thƣơng cho cây (Audenaert et al., 1998). Theo Yedidia et al. (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây đƣợc xử lí với T. harzianum T-203. Những rễ đƣợc bổ sung chủng T 203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và perosidase cao hơn so với đối chứng không xử li trong 72 giờ. Còn những cây dƣa leo đƣợc xử lí với 2,6- dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ của thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhƣng không giống với khi xử lí bằng T. harzianum. Theo Khan et al., (2001) thì T. hamatum chủng 382 kích ứng hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra. 1.3. Những nghiên cứu về enzyme chitinase 1.3.1. Giới thiệu về chitin 1.3.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitin Hình 1.5: Cấu trúc phân tử của chitin (Nguồn: 17
29. Đồ án tốt nghiệp Chitin (C8H13O5N)n gồm: 47,29% là C, 6,89% là N., 6,45% là H, 39,37% là O. Chitin vốn đƣợc xem là một polymer sinh học nhiều thứ hai trong tự nhiên sau cellulose, là một homopolysaccharide không hòa tan gồm các đơn phân là β-1,4-N- acetylglucosamine.Chitin có thể đƣợc mô tả là 1 phân tử cellulose với một gốc hydroxyl ở mỗi monomer đƣợc thay thế bởi một gốc acetyl amine, và chính sự khác biệt đó làm tăng số lƣợng liên kết hidro giữa các polymer liền kề, tạo thành một mạng lƣới khá vững chắc. Chitin là một trong những thành phần quan trọng cấu tạo nên vách tế bào của nhiều loài nấm bệnh thực vật cũng nhƣ lớp vỏ và biều bì của động vật chân đốt, động vật giáp xác, côn trùng và động vật thân mềm. Chitin chiếm từ 22% đến 44% thành phần cấu thành vách tế bào của nấm bệnh, và nó rất cần thiết cho cấu trúc của sợi nấm (Peberdy, 1990). [17] Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền nhờ vào các liên kết hidro ở trong và giữa các mạch. Chitin không tan trong nƣớc, cồn, acid hay kiềm loãng và các dung môi thông thƣờng khác. Nó chỉ tan trong các dung dịch nhƣ HCl đậm đặc, HNO3 đậm đặc, Có 3 dạng chitin: α, β và γ. Dạng α, có nhiều trong vỏ cua và tôm, biểu bì của côn trùng, dạng này gồm các chuỗi đơn phân xuôi-ngƣợc xen kẽ nhau, dạng sắp xếp này làm tăng tính bền của liên kết hidro, giúp cấu trúc ổn định hơn. Dạng β, có trong động vật thân mềm nhƣ mực, gồm các chuỗi đơn phân song song. Trong khi đó dạng γ gồm 2 sợi song song và một sợi song song xuôi-ngƣợc. Có thể chuyển đổi từ dạng β sang α, sự chuyền đổi chỉ xảy ra theo một chiều. Dạng γ có thể chuyển đổi thành α bằng cách xử lí với lithium thiocyanate. 1.3.1.2. Lịch sử phát hiện của chitin [11] Năm 1811, một nhà khoa học ngƣời Pháp chuyên nghiên cứu về lịch sử của tự nhiên, Henri Braconnot, đã phát hiện ra một hợp chất hữu cơ trong nấm rơm và đặt tên cho nó là “fungine”. 18
30. Đồ án tốt nghiệp Năm 1823, Odier tìm một chất tƣơng tự thế trong côn trùng, thực vật và đặt tên cho nó là “chitine” Năm 1843, Lassaigne chứng minh có sự hiện diện của Nitơ trong phân tử chitin. 1.3.1.3. Sự phân bố của chitin trong tự nhiên [14] Đối với prokaryote, chitin không hiện diện ở prokaryote mặc dù bản chất hóa học nó cũng tƣơng tự cấu trúc khung polysaccharide của peptidoglycan. Gooday (1995) đã công bố rằng chitin là một thành phần trong bào tử của Streptomyces. Đối với vi nấm, hầu hết thành tế bào của vi nấm đều chứa chitin, chúng chiếm 22%- 40% (Muzzarelli, 1977). Sự có mặt của chitin cùng với một số polysaccharide khác đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu để phân loại nấm. Các sợi polysaccharide có độ dài khác nhau phụ thuộc vào loài và vị trí tế bào (Gow và Gooday, 1983). Đối với nguyên sinh vật, chitin hiện diện trong nang, thành tế bào của một số cilliates, amoebae, chrysophytes, tảo và trong gai của tảo cát, dạng tinh khiết nhất của chitin đƣợc phân lập từ loài tảo Thalassiosira fluvitalis (Bartnicki- Garcia và Lippman, 1982). Đối với động vật, chitin đƣợc tìm thấy trong thành phần cấu trúc của một ít cơ quan, nhƣ trong các lớp da của động vật chân đốt, tuyến trùng và động vật thân mềm, và trong niêm mạc ruột, khung xƣơng ngoài của côn trùng. Phần xƣơng ngoài của côn trùng chứa một lƣợng khá lớn phức hợp chitin- protein, trong khi vỏ của loài giáp xác ngoài phức hợp chitin-protein còn có CaCO3 (Kramer và Muthukrishnan, 1997). Chitin trong tự nhiên tồn tại ở dạng acetyl hóa và deacetyl hóa cực kì ít. Nấm mốc Absida coerulae đƣợc tìm thấy là có chitosan trong thành phần cấu tạo vách tế bào. (Muzzarelli et al., 1994) 19
31. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.4. Điều chế chitin Chitin trong tự nhiên không tồn tại ở dạng tự do mà liên kết với các hợp chất khác nhƣ protein, khoáng chất, lipid và chất màu. Để tách các chất này ra khỏi chitin. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp để tinh chế chitin, thƣờng ngƣời ta tiến hành theo các bƣớc sau: loại protein, loại khoáng chất và tẩy màu. Loại khoáng: trong thành phần vỏ tôm, cua thì loại khoáng chiếm nhiều nhất là CaCO3, và để loại nó đi các nhà nghiên cứu đã sử dụng các tác nhân acid đậm đặc nhƣ: HCl, H2SO4, HNO3, CH3COOH, Nhƣng HCl đƣợc dùng nhiều hơn cả bởi nó có thể loại khoáng gần nhƣ triệt để và không gây các phản ứng phụ đáng kể. Loại protein: các chất hóa học đƣợc dùng để loại protein nhƣ: NaOH, NaHCO3, KOH, K2CO3, Trong đó, NaOH đƣợc sử dụng thƣờng nhất bởi tính phổ biến của nó. Tẩy màu: thƣờng để tẩy màu ngƣời ta xử lí bột vỏ tôm, cua với các hợp chất nhƣ Ethanol, Aceton hoặc dùng các chất có tính oxi hóa mạnh nhƣ H2O2, KMnO4, 1.3.2 Giới thiệu về enzyme chitinase 1.3.2.1 Đặc điểm và sự phân bố Hệ enzyme thủy phân chitin (chitinase) thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase) có khả năng thủy giải liên kết β-1,4-glycoside giữa C1 và C4 của hai monomer N-acetyl glucosamine trong mạch chitin. Trong tự nhiên, sự phân giải chitin chủ yếu đƣợc thực hiện bởi vi sinh vật, mặc dù rằng enzyme phân giải chitin có thể đƣợc tìm thấy trong cả thực vật, động vật có xƣơng sống và động vật không xƣơng sống. Chitinase đƣợc tìm thấy trong đƣờng tiêu hóa của động vật có xƣơng sống (Gooday, 1990), trong khi động vật không xƣơng sống cần chitinase để phân giải lớp biểu bì cũ. Còn chitinase ở thực vật lại là enzyme cảm ứng tiết ra để đáp trả sự tấn công của vi sinh vật, ví dụ nhƣ 20
32. Đồ án tốt nghiệp thành tế bào của nấm bệnh thƣờng cấu tạo bởi một lớp chitin [17]. Hay là ở trong nộc độc của một số loài côn trùng cũng chứa một lƣợng chitinase để tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của chất độc vào cơ thể con mồi. [16], [10] Chitinase là enzyme phân hủy chitin- vốn là một trong những thành phần của vách tế bào nấm, côn trùng trong tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn, nấm có khả năng sinh tổng hợp chitinase ngoại bào, nhƣng đƣợc các nhà khoa học chú ý nhiều nhất là Trichoderma. Chitinase của vi nấm gồm có ba loại đƣợc công nhận dựa trên khả năng phân giải cơ chất chitin (Sahai và Manocha, 1993). Những enzyme phân giải chitin đó là exochitinase, endochitinase và N-acetylglucosaminidase. Sự phối hợp của các enzyme trên có thể thủy phân chitin thành dạng monomer là N-acetylglucosamine. Chitinase của vi nấm có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 27-130 kDa. [17] Thành phần hệ enzyme chitinase của Trichoderma: Các loài Trichoderma sử dụng hệ enzyme phân giải chitin cùng với enzyme β-1,3-glucanase để thủy phân vách tế bào nấm bệnh và do đó làm giảm mức độ bệnh (Haran et al., 1995). Hệ enzyme phân giải chitin của T. harzianum là phức hợp của 6 enzyme (Haran et al., 1995): hai β-1,4 N-acetylglucosaminidase (Chit 102 và Chit 73) và bốn endochitinase (chit 52, chit 42, chit 33 và chit 31). Các enzyme phân giải chitin đƣợc tổng hợp và tiết ra trong suốt quá trình phát triển của Trichoderma trong môi trƣờng có chitin là nguồn cacbon duy nhất. Chỉ có chit 20 đƣợc tiết nội bào với nồng độ thấp khi mà Trichoderma phát triển trên môi trƣờng chứa glucose. Sự phức hợp và đa dạng về hệ enzyme phân giải chitin của T. harzianum liên quan đến sự bổ trợ của 6 enzyme trên, chúng cần thiết giúp cho T. harzianum đối kháng với phổ rộng các nấm bệnh thực vật (Haran et al., 1995). [17] Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm. Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370C trong trƣờng hợp không có mặt cơ chất. Chu kì bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày. [15] 21
33. Đồ án tốt nghiệp Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt cơ chất là chitin. Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là k= 0.145/h 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động của chitinase [15], [12] Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên và tạo ra các đoạn oligosaccharides, trong đó, chiếm đa số là các diacetylchitiobiose (GlcNac)2, đã đƣợc nghiên cứu trên dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum. Chitin 1,4-β- chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm chính là dimer chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosamidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin tử một đầu, cho ra sản phẩm là các monomer N-acetyl-D-glucosamine. Chitobiose là enzyme phân cắt chitobiose thành 2 monomer N-acetyl-D- glucosamine Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylglucosamidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylglucosamidase. 22
34. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6:Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase (Nguồn: 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase a) Chitinase từ vi khuẩn. Vi khuẩn sinh tổng hợp chitinase nhằm mục đích đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng. Chúng thƣờng tổng hợp nhiều loại chitinase để phân cắt các loại chitin đa dạng trong tự nhiên. Chitinase đƣợc tìm thấy trong các vi khuẩn nhƣ: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là Streptomyces. Enzyme chitinase là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ngƣời ta đều cho thêm vào nguồn cơ chất chitin, để làm chất cảm ứng cho khả năng sinh tổng hợp chitinase. 23
35. Đồ án tốt nghiệp b) Chitinase từ vi nấm Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loại nấm sợi. Các chủng nấm sợi cho enzyme chitinase cao nhƣ: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, đặc biệt là ở các loài nấm lớn nhƣ: Lycoperdon, Coprinus, Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dƣỡng nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào. c) Chitinase từ thực vật Các thực vật bậc cao có khả năng tổng hợp chitinase nhu cao su (Hevea brasiliensis), thuốc là (Nicotiana spp.), lúa, lúa mì, lúa mạch (Hordeum vulgare), cà rốt, khoai lang, đậu nành, và một số loài tảo biển cũng có khả năng sinh tổng hợp chitinase. Chitinase ở thực vật tồn tại ở các mô nhất định hoặc cơ quan sinh sản nhƣ: hạt giống, củ, hoa và đƣợc cảm ứng bởi côn trùng và các tác nhân có hại trên thực vật. Bên trong tế bào thực vật, chitinase nằm trong không bào cùng với các enzyme chống bệnh khác. Ví dụ nhƣ: endochitinase mang tính base trong lá đậu tập trung trong không bào. d) Chitinase từ động vật Ở động vật, chitinase tồn tại ở các mô, các tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều động vật không xƣơng nhƣ: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt. Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát, chim, thú ăn sâu bọ. Ngoài ra, enzyme chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase còn giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài trong quá trình tiến hóa hay lột xác. 24
36. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu về chitinase [17] So với các enzyme khác nhƣ protease, cellulase, amylase, thì chitinase lại là một enzyme đƣợc nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn khá hạn chế. Đối tƣợng nghiên cứu sớm nhất và nhiều nhất là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M Renolds, 1958; R.Grupta, R.K. Saxena, P. Chatuvedi và J.S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tƣợng này nhằm thu chitinase để phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A. Carroad và R.A. Tom có công trình nghiên cứu về phƣơng pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I.G. Cosio, R.A. Fisher, P.A (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin. Về sau, những năm 1989, việc thu nhận chitinase đƣợc nghiên cứu trên các đối tƣợng khác nhƣ: Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski) với hoạt tính enzyme chitinase là 15,1 (U/ml), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và M.V. Deshpand) với hoạt tính là 2,0 (U/ml) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào nấm. Trong những năm trở lại đây, nấm sợi Trichoderma dần trở thành đối tƣợng nghiên cứu sản xuất chitinase phổ biến. Năm 1991, C.J. Ulhoa, J.F Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum. Năm 1999, P.A . Felse và T. Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase của Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn. Dƣờng nhƣ Trichoderma là chi nấm đến nay đƣợc phát hiện là có hoạt tình chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt là trong bảo vệ thực vật. Vi khuẩn cũng là một đối tƣợng đƣợc nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp chitinase. Năm 1998, B. Bhushan, G.S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây nhất, năm 2009, S.M. Akir và cộng sự nghiên cứu tối ƣu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận chitinase từ Bacillus licheniformis bằng 25
37. Đồ án tốt nghiệp phƣơng pháp bề mặt đáp ứng ( RSM). Ƣu điểm của chitinase từ vi khuẩn là khả năng bền nhiệt. Trên đối tƣợng thực vật, cũng có một số nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm 2004, Isabela S. Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu nhận trên đối tƣợng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonia L.) và cây họ đậu Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonia L. là loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen (1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang. 1.3.2.5 Ứng dụng của enzyme chitinase [26], [8], [3], [19] a) Sản xuất glucosamine Glucosamine là một hoạt chất quý, đƣợc sản xuất từ chitin trong vỏ tôm hoặc chitonsan, nó chủ yếu đƣợc dùng trong y học để chữa thoái hóa khớp. Do glucosamine làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển. b) Tổng hợp chitooligosaccharides Hiện nay các hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharides ngày càng đƣợc nghiên cứu chuyên sâu. Trong y học, ngƣời ta sử dụng các chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân kháng ung thƣ. Enzyme chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đƣợc dùng để sản xuất chitopentaose và chitotriose từ huyền phù chtiin (Murao và cộng sự, 1992). c) Chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện hầu hết trong vách các loài nấm bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Do đó có thể đánh dấu chitin đặc hiệu cho vi nấm, tạo cơ sở cho một phƣơng pháp 26
38. Đồ án tốt nghiệp chuẩn đoán nhanh bệnh truyền nhiễm bằng chitinase từ Vibrio parahemolyticus, enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin nên có thể dùng nhƣ một đầu dò trong việc chuẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện đặc hiệu các vách tế bào nấm hay các vết chồi của nấm men. d) Kiểm soát muỗi và các côn trùng gây hại Do cấu tạo lớp da của côn trùng phần lớn có chứa chitin, nên enzyme chitinase đƣợc xem nhƣ là chiếc kìm sinh học, phá vỡ sự bền vững của lớp da thông qua phân giải chitin, điều này làm giảm sức sống của côn trùng, từ đó tạo điều kiện cho các tác nhân kiểm soát côn trùng gây hại, qua đó giảm thiểu quy mô dịch bệnh. e) Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần. Phần lớn cấu tạo của tế bào vi nấm có thành tế bào cấu tạo từ chitin. Do đó hệ enzyme chitinase đặc biệt có hiệu quả trong trƣờng hợp này, chúng giúp phá vỡ thành tế bào vi nấm, tạo dạng tế bào trần, tạo thuận lợi cho quá trình nghiên cứu các quá trình sinh học của vi nấm. Dahiya (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận đƣợc từ chủng Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần ở nấm Trichoderma reesei, Aspergillus Niger, Pleutotus florida f) Kiểm soát nấm bệnh trên cây trồng Enzyme chitinase đƣợc dùng để ức chế sự phát triển của nấm, côn trùng và động vật chân đốt gây hại thực vật. Các loài nấm bệnh bị ức chế bởi chitinase nhƣ: Fusarium, Gliocladium, Rhizoctonia, Ustilaigo, Botrytis, Slecrotium, các loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy Leppidoptera (sâu cải, thuốc lá) bộ cánh cứng Coeoptera (bọ cánh cứng khoai tây, bọ vòi voi vỏ tròn, bọ cánh cứng đậu Mexico và ấu trùng sống ở rễ bắp) Bộ cánh đều Homoptera (rệp bông cải, rệp khoai tây, rệp đỏ Califonia) x` [9] Ngƣời ta sử dụng enzyme chitinase nhƣ là một tác nhân kiểm soát sinh học an toàn và dễ phân hủy thay cho thuốc trừ sâu sinh học 27
39. Đồ án tốt nghiệp Theo Hirohi Ihui, thì enzyme chitinase luôn hiện diện trong cơ thể của thực vật, chitinase là β-1,3-glucanase đƣợc tạo ra ở mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm bệnh có chƣa chitin, từ đó phân giải vách tế nào nấm bệnh và ngăn chặn sự phát triển của dịch bệnh. CHIT40, CHIT42 và CHIT72 có tác động lên kéo dài của sợi nấm của nhiều nấm hại thực vật nhƣ: Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae, khi chúng đƣợc ủ với dịch enzyme. [20] g) Các chế phẩm mới: [21] Ngày nay, các nhà khoa học đã kiến nghị sử dụng chitinase kết hợp với các tác nhân kháng nấm (nhƣ: Amphotericin B, 5-flourocytosi, Griseofulvin, Allylamines, ) Enzyme chitinase có thể giúp phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lƣợng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân, do khi có mặt chitinase thì sự xâm nhập của thuốc vào cơ thể nấm bệnh dễ dàng. 1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme chitinase và sự sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật [5], [23] b) Ảnh hưởng của pH: Giá trị tối ƣu của enzyme chitinase thƣờng dao động trong khoảng 4-9 đối với thực vật bậc cao và tảo, 4,8- 7,5 ở thú và 3,5- 8,0 ở vi sinh vật Chúng thƣờng thể hiện hoạt tính ở pH hơi acid, có tính ổn định tốt. pH tối ƣu của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng. Đa số các nghiên cứu về chitinase chỉ ra khoàng pH tối ƣu là 5,0 khi sử dụng các cơ chất là bột chitin, pH thuộc khoảng kiềm yếu khi sử dụng cơ chất là glycol chitin. Hoạt tính của enzyme chitinase bị ức chế ở pH < 4,5, ngoại trừ chitinase trong dạ dày động vật có xƣơng sống thì vẫn có thể hoạt động ở pH= 3,0. Giá trị pH môi trƣờng ban đầu có sự ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase của vi sinh vật. Tùy thuộc vào loài, các chủng vi sinh vật mà pH thích hợp dao động từ pH hơi acid đến pH hơi kiềm. Theo Takashi và cộng sự 28
40. Đồ án tốt nghiệp (2002), chủng Aspergillus sp. tổng hợp chitinase tốt nhất ở pH môi trƣờng ban đầu là 5-6. Còn theo Nguyễn Hồng Thƣơng và cộng sự (2003) thì Trichoderma harzianum có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt ở pH= 4-6. b) Chất cảm ứng của enzyme chitinase Có nhiều loài vi sinh vật prokaryotic và eukaryotic có khả năng sinh sinh ra enzyme phân giải chitin khi mà có sự hiện diện của chitin trong môi trƣờng phát triển của chúng (Jeniaux, 1996; Monreal và Reese, 1969). Sự hình thành chitinase trong vi sinh vật đƣợc cho là đƣợc kiểm soát bởi một hệ thống ức chế-cảm ứng, trong đó chitin hoặc sản phẩm thủy phân của chitin đóng vai trò là chất cảm ứng. Sự cảm ứng hệ enzyme chitinase ngoại bào rất hiệu quả khi trong môi trƣờng nuôi cấy Trichoderma có mặt nguồn carbon là chitin (dạng bột, dạng thô hoặc dạng huyền phù), vách tế bào nầm hay hệ sợi nấm. Không có hoặc hiệu quả cảm ứng kém khi thành phần môi trƣờng có chứa chitosan, cellulose, chitin chƣa tinh sạch hoặc laminarin. Theo Felse và Panda (2000), thì khi nồng độ chitin khoảng 1%-1,5% là vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase. Và chitin huyền phù là có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp chitinase tốt nhất (Bhushan, 2003; Nampoothiri et al., 2003). Quá trình sinh tổng hợp enzyme đƣợc điều chỉnh bởi sự ức chế dị hóa (Neidhardt, 1960; Holzer 1976)., thể hiện qua việc, sự hình thành hệ enyzme chitinase in vitro bị ức chế bởi tỉ lệ gia tăng của hàm lƣợng đƣờng glucose, sucrose và sản phẩm cuối của quá trình phân giải chitin. Điều này đã đƣợc nghiên cứu rõ hơn ở endochitinase 42kDa (CHIT42) và gene mã hóa ThEn-42 của T. harzianum. c) Ảnh hưởng của nhiệt độ: Enzyme chitinase có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 250C đến 800C và bị mất hoạt tính hoàn toàn khi bị đun sôi. Nhìn chung , nhiệt độ tối ƣu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C. Tùy thuộc vào từng loài hay chủng nấm Trichoderma mà sẽ có nhiệt độ tối ƣu khác nhau. 29
41. Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến cả quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật bởi vì khi nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ kìm hãm sự sinh trƣờng của nấm sợi, thậm chí giết chết chúng. Nhiệt độ tối ƣu cho nấm sợi phát triển là 28-320C, cao nhất là 500C. d) Ảnh hưởng của nguồn khoáng Các chất khoáng nhƣ Fe, Zn, Mg, Cu, có vai trò tham gia vào quá trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, trong thành phần cấu tạo của các protein, coenzyme, điều hòa pH môi trƣờng nuôi cấy nên phần nào có sự ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. 1.3.2.7 Những nghiên cứu về tối ưu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum ở Việt Nam và trên thế giới a) Ở Việt Nam Năm 2007, tác giả Tô Duy Khƣơng, chuyên ngành vi sinh, trƣờng Đại học khoa học tự nhiên có một nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của Trichoderma spp, đƣợc công bố trong luận án thạc sĩ “Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật” và thu đƣợc những kết quả tƣơng đối tốt. Tác giả nhận định môi trƣờng chứa các thành phần: Pepton, Cao nấm men, Glucose, MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4, FeSO4.7H2O, ZnSO4, cơ chất chitin huyền phù 1% cho khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt nhất, với thời gian tối ƣu là 7 ngày, hoạt tính enzyme thu đƣợc là 2280,43 x10-3 UI/ml. Năm 2010, tác giả Lê Thị Huệ đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma. Và bƣớc đầu thu chế phẩm enzyme chitinase thô từ Aspergillus để phòng trừ sâu tơ và sản xuất glucosamine. Trong công trình nghiên cứu của mình, tác giả thu nhận enzyme chitinase từ chủng Aspergillus awamori với hoạt độ là 101,61 (UI/gCPE) 30
42. Đồ án tốt nghiệp Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số loài nấm bệnh. Năm 2013, hai tác giả Phạm Thị Lịch và Trần Thanh Thủy hoàn thành công trình “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp.” Hai tác giả kết luận rằng điều kiện thích hợp thu enzyme chitinase hoạt độ cao từ chủng Trichoderma BL2 là : Trấu 50g, Cám 40g, pepton 0,5g, glucose 1g, KH2PO4 0,3g, K2HPO4 0,7g, MgSO4,7H2O 0,5g, FeSO4.7H2O 0,5g, ZnSO4 0,001g, chitin huyền phù 1%, pH= 5, 60% độ ẩm và nuôi cấy trong 60 giờ. Hoạt tính chitinase đạt đƣợc là 37.416 (UI/ml). b) Trên thế giới Năm 2000, M.H. Et-Katatny, W. Somitsch, K.-H. Robra, M.S. Et-Katatny và G.M. Gübitz đã có một công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của Trichoderma harzianum, đƣợc công bố trong bài báo “Production of Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii”. Kết quả của nghiên cứu tác giả nhận định rằng chủng T. harzianumsinh tổng hợp enzyme chitinase tốt nhất ở điều kiện pH=6, nồng độ cơ chất chitin cảm ứng là 1%. Trong bài báo “ Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation (2004)” của các tác giả Sandhya C, Adapa LK, Nampoothiri KM, Binod P, Szakacs G, Pandey A, đã nhận định rằng điều kiện nuôi cấy để thu đƣợc chitinase có hoạt tính tốt nhất là ở 300C, trong 96 giờ, nguồn cơ chất chitin là 1,5%, bổ sung 0,42% pepton (đóng vai trò làm nguồn ni-tơ). Trong bài báo cáo “Regulation of chitinaes synthesis in Trichoderma harzianum” của 2 tác giả Cirano J. Ulhoa và John F. Peberdy, đã nhận định rằng điều kiện nuôi cấy chủng Trichoderma harzianum 39,1 để thu nhận chitinase tốt nhất là ở 280C, pH= 6. 31
43. Đồ án tốt nghiệp 1.4 Sơ lƣợc về bệnh thán thƣ trên cây ớt và tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp 1.4.1 Bệnh thán thư trên ớt 1.4.1.1 Triệu chứng [2] Bệnh gây hại trên thân, lá, quả và hạt, nhƣng chủ yếu là gây hại trên quả vào giai đoạn chín. Biểu hiện ban đầu của bệnh là có đốm nhỏ, hơi lõm, ƣớt trên bề mặt vỏ quả, sau 2-3 ngày kích thƣớc đƣờng kính mô bệnh có thể đạt đến 1cm. Vết bệnh lúc ấy thƣờng có dạng hình thoi, lõm và phân ranh giữa mô bệnh là một đƣờng màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ. Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm cho quả bị thối, vỏ khô và có màu trắng vàng bẩn. Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiên tƣợng thối ngọn ớt. Chồi bị hại có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây bị chết dần hoặc cây có quả nhƣng ít và kém chất lƣợng. Trên những trái ớt đã lớn, khi bị nhiễm bệnh, thƣờng có những vết lõm xuống, hình vòng tròn và hơi ƣớt. Khi gặp thời tiết thuận lợi, bệnh lan rất nhanh, vết bệnh có màu nâu nhạt đến đậm, vết bệnh thƣờng có những hạch bào tử màu vàng. Ngoài ra bệnh còn xuất hiện trên cây con, gây chết rạp lá ớt và gây lốm đốm. (Nguồn: thuocbvtv.com) Hình 1.7 Quả ớt bình thƣờng và quả ớt bị bệnh thán thƣ do Collectotrichum spp. 32
44. Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Bệnh do hai loại nấm Collectotrichum nigum và Collectotrichum capsici gây ra. Hai loại nấm trên thƣờng song song gây bệnh làm cho quả ớt bị thối nhanh chóng. Đĩa cành nấm C.nigum đƣờng kính từ 120-180 µm, có nhiều lông gai đen nhọn ở đỉnh, kích thƣớc 55-190x 6,5- 65 µm, bào tử phân sinh hình bầu dục hoặc hình trụ hai đầu tròn, không màu, đơn bào và kích thƣớc là 18-25x 3 µm. Cành bào tử phân sinh ngắn hình gậy, kích thƣớc 20-50x25 µm. Đĩa cành nấm C.capsici có đƣờng kính 70-100 µm có lông gai đen màu nâu sẫm, đỉnh có màu hơi nhạt có nhiều ngăn ngang và dài tới 150 µm. Bào tử phân sinh không màu, đơn bào, hơi cong nhƣ hình lƣỡi liềm, kích thƣớc 17-28x3-4 µm có giọt dầu bên trong. Collectotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả đƣợc gọi là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong và bào tử trong suốt. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh. 33
45. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm 2.1.1 Thời gian 7/4/2014 đến 29/6/2014 2.1.2 Địa điểm Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Đại học Công nghệ Tp.HCM, cơ sở 1, 475A (số cũ: 144/24) Điện Biên Phủ, P.25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM. 2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu 2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 2.2.1.1 Thiết bị - Máy đo quang phổ UV-Vis 2550 - Máy ly tâm Universal 320 - Nồi hấp khử trùng (Autoclave) - Máy lắc - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích - Tủ lạnh Toshiba - Máy chƣng cất nƣớc 2.2.1.2 Dụng cụ - Erlen 250 ml - Đĩa petri - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh 50ml, 100ml, 600ml, 1000ml. - Ống đong 50ml, 100ml, - Falcon - Eppendorf 34
46. Đồ án tốt nghiệp - Que cấy - Đũa thủy tinh - Bông thấm nƣớc, bông không thấm nƣớc (Bạch tuyến, Bảo thạch) - Bao nhựa, dây thun, giấy báo - Micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp. - Đèn cồn. 2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu Chủng Trichoderma harzianum phân lập đƣợc từ nấm linh chi. 2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 2.2.3.1 Môi trường PDA D-Glucose 4g Agar 4g Dịch chiết khoai tây 200ml Cloramphenicol 0.005g pH: 6-7 Chuẩn bị dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây đƣợc cắt hạt lựu, cho vào cốc 2 lít, đong nƣớc cất tới 1000ml rồi đun sôi hỗn hợp trên bếp từ. Đun sôi khoảng 10 phút rồi đem lọc lấy dịch trong. 35
47. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.2 Môi trường định tính sự sinh tổng hợp chitinase [5] NaNO3 3,5 g/l K2HPO4 1,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l FeSO4.7H2O 0,01 g/l Cloramphenicol 0,005 g/l Đong dịch chitin huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 2.2.3.3 Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase Thành phần môi trƣờng A [18] MgSO4.7H2O 0,2 g K2HPO4 0,9 g KCl 0,2 g FeSO4.7H2O 0,002 g ZnSO4 0,002 g MnSO4 0,002g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 36
48. Đồ án tốt nghiệp Thành phần môi trƣờng B: [16] Pepton 1 g Urea 0,3 g KH2PO4 0,2 g MgSO4.7H2O 0,3 g Tween 80 1,2 g (NH4)2SO4 1,4 g CaCl2 0,3 g Cloramphenicol 0.005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 Thành phần môi trƣờng C: [15] Pepton 0,5 g Cao nấm men 0,5 g Glucose 1g MgSO4.7H2O 0,5 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 0,3 g FeSO4.7H2O 0,01 g ZnSO4 0,001 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 37
49. Đồ án tốt nghiệp Thành phần môi trƣờng D: Glucose 1g NH4NO3 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 0,3 g FeSO4.7H2O 0,01 g ZnSO4 0,001 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6-7 2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của Trichoderma 2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma trên môi trường thạch PDA Chuẩn bị môi trƣờng PDA nhƣ mục 2.2.1 Cho vào bình môi trƣờng Ducan 200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Hấp xong, để môi trƣờng hạ xuống khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Đợi thạch đông lại, ta tiến hành cấy điểm Trichoderma (từ ống giống), rồi lật úp đĩa (tránh tụ nƣớc trên bề mặt thạch) rồi ủ ở 28-320C. 2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch [4] Nguyên tắc: khi nuôi cấy trong môi trƣờng thạch có bổ sung chitin, nấm sợi sẽ sinh ra enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng polymer có cấu trúc mạch ngắn hơn, thậm chí tạo thành monomer N-acetyl-D-glucosamine. Các dạng 38
50. Đồ án tốt nghiệp này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi cho thuốc thử Lugol vào, độ lớn của phần môi trƣờng trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm sợi. Phƣơng pháp này chỉ dùng để định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme chứ không xác định chính xác hoạt độ của enzyme. Thực hiện: Cách pha dịch Lugol (Nguyễn Đức Lƣợng) [7] Iodine 1 g. KI 2 g. Nƣớc cất 300 ml. Hòa tan rồi giữ trong lọ màu. Chuẩn bị môi trƣờng nhƣ mục 2.2.2.2, cho vào bình môi trƣờng Ducan 200ml rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Hấp xong, để môi trƣờng hạ xuống khoảng 500C rồi tiến hành đổ đĩa. Trong khi đợi thạch đông, ta sẽ tiến hành lấy khuẩn lạc Trichoderma đƣợc nuôi cây trong đĩa PDA sau 4 ngày nuôi cấy bằng cách: lấy cây đục lỗ thạch có đƣờng kính 5mm (khử trùng bằng cồn 960, đốt trên ngọn lửa đèn cồn) để đục lỗ, đục trên cùng 1 đƣờng tròn chu vi tâm là điểm đã cấy trƣớc đó. Sau đó, đặt miếng thạch từ đĩa PDA sang đĩa chứa môi trƣờng có chitin, đặt miếng thạch ngay tâm đĩa ủ ở 28-320C. Sau 2 ngày, tiến hành đổ Lugol vào đĩa để quan sát vòng phân giải, lugol đổ ngập bề mặt đĩa 1 ít, để 15p rồi đổ lugol thừa ra, cho ít nƣớc cất vào đĩa, đổ nƣớc cất ra, rồi tiến hành quan sát. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa 39
51. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu (Trần Thạnh Phong, 2004; Nguyễn Đức Lƣợng, 2005) Hình 2.1: Buồng đếm hồng cầu Neubauer (Nguồn: Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm các vi sinh vật có kích thƣớc rất nhỏ (nấm men, bào tử nấm mốc). Nguyên tắc: Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu đó: là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ có kẻ một lƣới đếm, gồm nhiều ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích là 1/25 mm2, lại đƣợc chia thành các ô vuông nhỏ ( thƣờng là 16 ô), mỗi ô có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10. Nhƣ vậy thể tích của mỗi ô nhỏ là 1/400x0.1=1/4000 mm3. Thực hiện: Trichoderma harzianum đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch PDA khoảng 7 ngày thì bào tử sẽ mọc kín đĩa. Ta cho vào đó 20 ml nƣớc muối sinh lý chứa Tween 80 0.1%, rồi dùng đũa thủy tinh cạo sạch lớp bào tử trên đĩa, sau đó dùng micropipet hút từ đĩa ra 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc muối sinh lý có chứa Tween 80 0.1% để pha loãng mẫu, ta dƣợc độ pha loãng 10-1, lặp lại đến khi 40
52. Đồ án tốt nghiệp có đƣợc các độ pha loãng 10-2,10-3,10-4. Sau đó tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. Lắc đều mẫu pha loãng. Đậy lá kính lên lƣới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho một giọt vào mép lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lƣới đếm, chú ý không để tạo bọt khí trong lƣới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3-5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô con và những bào tử nằm trên 2 cạnh bên trài và ở trên. Đếm lần lƣợt từ ô con 1 đến ô con 16. Chú ý: nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm đƣợc trong 5 ô phải lớn hơn 200 mới đảm bảo tính chính xác của phƣơng pháp. Tính số lƣợng bào tử theo công thức sau: N= Với: N : Số lƣợng bào tử trong 1 ml huyền phù. a : Số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con). b : Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô X 5 = 80 ô con). 1000 : Số chuyển mm3 thành ml ( 1000mm3 = 1 ml) n : Số lần pha loãng dịch huyền phù. 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase Bước 1 : Chuẩn bị môi trường: nhƣ mục 2.2.2.3 Phối vào mỗi erlen 50ml môi trƣờng, sau khi chuẩn bị xong, ta sẽ tiến hành hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội khoảng 300C, , rồi tiến hành cấy bào tử nấm Trichoderma vào. Sau đó, tiến hành ủ trên máy lắc với 150 vòng/phút. 41
53. Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Chuẩn bị giống Đĩa PDA nuôi cấy điểm Trichoderma 7 ngày, ta cho 20ml nƣớc muối sinh lý vô trùng vào rồi lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối trên bề mặt thạch. Sau đó dùng Micro pipett hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa môi trƣờng sao cho mật độ bào tử đạt 106/ml. 2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase (Nguyễn Đức Lƣợng) [7] Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong môi trƣờng lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân là các enzyme hòa tan trong nƣớc. Do đó, để thu nhận enzyme trong trƣờng hợp nuôi cấy chìm là phải thu nhận dịch nuôi cấy (sau khi tách sinh khối và các thành phần không hòa tan của môi trƣờng). Thực hiện: Sau khi nuôi cấy trong điều kiện môi trƣờng cụ thể. Ta tiến hành lọc môi trƣờng nuôi cấy qua giấy lọc, thu dịch lọc. 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase bằng phương pháp DNS [6] Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử và thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS). Cƣờng độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bƣớc sóng 540 nm. Dựa vào biểu đồ đƣờng chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử trong mẫu nghiên cứu Phƣơng trình phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử và DNS acid: 42
54. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện: a) Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine: Đối Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 chứng N-acetyl-D- glucosamine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 10 mg/ml (ml) Nƣớc cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 (ml) Nồng độ N- acetyl-D- 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 glucosamine (mg/ml) OD540nm - Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã đƣợc rửa và làm khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS. - Đun sôi các ống test 10 phút (có đậy nắp hay nút bông không thấm nƣớc). - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nƣớc cất vào ống nghiệm. Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng. 43
55. Đồ án tốt nghiệp - Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vễ đƣờng chuẩn glucose với trục hoành là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD). Tìm phƣơng trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y=ax+b và hệ số tƣơng quan R2 nhờ phần mềm Excel. b) Xác định hoạt độ enzyme chitinase: Nguyên tắc: hoạt độ chitinase đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp định lƣợng N-acetyl-D-glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lƣợng N- acetyl-D-glucosamine tạo ra đƣợc xác định theo phƣơng pháp Elson- Morgan. Thực hiện: Chuẩn bị các ống nghiệm đã đƣợc rửa sạch và làm khô - Ống phản ứng:: Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 300C trong 60 phút. Ngƣng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng. Thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều và đo OD ở bƣớc sóng 535 nm. - Ống không phản ứng: Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin vào rồi làm tƣơng tự nhƣ cách bƣớc của ống phản ứng. c) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µg N-acetyl-D-glucosamine từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định. Đơn vị hoạt tính = (U/ml) 44
56. Đồ án tốt nghiệp Với a: hàm lƣợng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đƣờng chuẩn. n: hệ số pha loãng. v: thể tích hỗn hợp phản ứng. t: thời gian phản ứng (phút). V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml) 2.3.6 Phương pháp tủa enzyme bằng cồn (Nguyễn Đức Lƣợng) [7] Nguyên tắc: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những dung môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc) tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch, còn những dụng môi có hằng số điện môi nhỏ (nhƣ aceton, ethanol, ) lại ngăn chặn sự phân tán của phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó, độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự liên kết của các phân tử protein với nhau và tạo thành tủa. Đây là kiểu kết tủa thuận ngịch, nghĩa là protein có thể hòa tan lại trong nƣớc. Dùng cồn 960 làm tác nhân tủa có nhiều thuận lợi: rẻ tiền, không có tác dụng ức chế hay làm mất hoạt tính enzyme và nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ dàng tách cồn ra khỏi tủa bằng phƣơng pháp sấy nhiệt độ thấp hay bằng quạt gió. Thực hiện: Lấy cồn từ tủ lạnh, từ từ cho vào dịch lọc enzyme đã làm lạnh, khuấy nhẹ cho cồn hòa đều với dịch enzyme. Sau đó, để hỗn hợp vào tủ lạnh. Lƣợng cồn dùng để tủa enzyme thƣờng gấp 2- 2,5 lần lƣợng dịch enzyme. Sau 15- 24 giờ, hỗn hợp sẽ phân thành 2 lớp. Đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để protein- enzyme dạng tủa, sau đó hòa tan tủa trong đệm thích hợp. Các bƣớc nên tiến hành ở điều kiện 40C. 45
57. Đồ án tốt nghiệp 2.3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Nguyên tắc: Vi sinh vật cần các yếu tố dinh dƣỡng nhất định để có thể sinh trƣờng, phát triển và dùng để làm nguồn nguyên liệu tổng hợp các hợp chất cần thiết. Thực hiện: Chuẩn bị các môi trƣờng nuôi cấy nhƣ mục 2.2.3.3, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật độ 106bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase. MT A MT B MT C MT D Lọc lấy dịch nuôi cấy Xác định hoạt độ enzyme Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen 2.3.8 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Nguyên tắc: Khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau, chúng sẽ tác động đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của Trichoderma. 46
58. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện: Lần lƣợt thay thế dịch huyền phù vỏ tôm 1% bằng dịch huyền phù chitin 1%, 1% dịch nấm Fusarium 7 ngày nuôi cấy lắc, 1% nấm linh chi và môi trƣờng không bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng. Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 nhƣng thay thế thành phần cơ chất, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật độ 106bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase. Chuẩn bị sinh khối nấm bệnh: Nuôi cấy nấm bệnh Fusarium trên môi trƣờng PDA 4 ngày, sau đó cắt 1cm2 thạch có chứa nấm bệnh cho vào 100ml môi trƣờng PDB trong erlen 250ml để tăng sinh, lắc 150v/p trên máy lắc trong 7 ngày (M. H. El-Katatny, 2000), rồi tiến hành hấp bỏ ở 1210C, 30 phút để diệt nấm bệnh sau đó thu dịch sinh khối làm nguồn cơ chất cảm ứng. Chuẩn bị dịch chitin huyền phù 1%: Lấy 5g bột chitin, cho từ từ vào 50ml HCl đậm đặc, khuấy đều trong 1 giờ, rồi ủ qua đêm, sau đó cho 250 ml Ethanol 960 (lạnh) vào để tạo dịch huyền phù, sau đó ta đem hỗn hợp rửa lại bằng nƣớc cất, có thể bằng phƣơng pháp lọc hay li tâm 4000v/p trong 5 phút, đến khi pH đạt 5 thì cho 500ml nƣớc cất, ta đƣợc dịch chitin huyền phù 1%, rồi để trữ trong tủ lạnh để sử dụng. Chuẩn bị nấm linh chi: Chuẩn bị 10g nấm linh chi, tiến hành trích ly bào tử nấm linh chi trong cốc thủy tinh bằng 100ml cồn 960, cạo sạch bào tử trên tai nấm rồi để cồn bốc hơi hết. Sau đó mang tai nấm (khi này không còn bào tử nấm) đi xay nhỏ ra. Bào tử dính trên cốc thủy tinh cũng sẽ đƣợc hòa trong 10ml nƣớc cất, 47
59. Đồ án tốt nghiệp để lấy dịch bào tử. Cho bã nấm xay nhỏ vào trộn với dịch bào tử ở trên, ta đƣợc mẫu nấm linh chi. Khi sử dụng ta sẽ lấy mẫu nấm linh chi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy với tỉ lệ 1% (w/v). MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.7 Không cơ chất Chitin Vỏ tôm Nấm linh chi Fusarium Lọc lấy dịch nuôi cấy Tiến hành đo hoạt độ enzyme. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen 2.3.9 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Nguyên tắc: Ở mỗi thời điểm khác nhau của quá trình sinh trƣờng, vi sinh vật sƣ dụng các nguồn cơ chất trong môi trƣờng nuôi cấy bằng một hay một số hệ enzyme. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme chitinase theo thời gian nuôi cấy Trichoderma harzianum nhằm xác định đƣợc thời gian tối ƣu để thu đƣợc enzyme chitinase có hoạt tính cao nhất. Thực hiện: Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 cơ chất là dịch vỏ tôm huyền phù 1%,, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật 48
60. Đồ án tốt nghiệp độ 106bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 5 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase. MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.8 Nuôi cấy trong 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ Lọc lấy dịch nuôi cấy Tiến hành đo hoạt độ enzyme Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen 2.3.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Nguyên tắc: Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trƣởng của nấm cũng thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+ có trong môi trƣờng sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hƣởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổitrạng thái điện ly các phân tử của chất dinh dƣỡng, từ đó làm giảm khả năng sử dụng dinh dƣỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đó, pH ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào. Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme chitinase theo pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu nhằm xác định đƣợc thời gian tối ƣu để thu đƣợc enzyme chitinase có hoạt tính cao nhất Thực hiện: Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 với cơ chất là dịch vỏ tôm huyền phù 1%, pH đƣợc thay đổi từ 5-8 bẳng đệm photphate, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy 49
61. Đồ án tốt nghiệp huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật độ 106bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 3 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase. MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.9 Thu nhận enzyme Hòa trong đệm photphate với các pH khác nhau pH= 5 pH= 6 pH= 7 pH= 8 Lọc lấy dịch nuôi cấy Tủa enzyme bằng cồn 960 ( tỷ lệ dịch nuôi cấy: cồn là 1:3), tiến hành ở điều kiện 40C Ly tâm 4000 vòng/p, 15 phút, thu tủa, rồi hòa tan vào đệm photphate (pH=5) Tiến hành đo hoạt độ enzyme. (đơn vị hoạt tính sẽ đƣợc nhân với hệ số pha loãng) Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen 50
62. Đồ án tốt nghiệp 2.3.11 Khảo sát sự ảnh hưởng các nguồn đường và hàm lượng đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Nguyên tắc: Nguồn đƣờng và hàm lƣợng đƣờng có sự ảnh hƣởng sâu sắc đến sự sinh trƣờng và phát triển của vi sinh vật và từ đó sẽ ảnh hƣờng đến quá trình sinh tổng hợp của chúng theo thời gian. Khảo sát sự ảnh hƣởng các nguồn đƣờng và hàm lƣợng nhằm xác định nguồn đƣờng và hàm lƣợng tối ƣu để thu đƣợc enzyme chitinase có hoạt tính cao nhất. Thực hiện: Chuẩn bị môi trƣờng D nhƣ mục 2.2.3.3 cơ chất là dịch vỏ tôm huyền phù 1%, pH ban đầu của môi trƣờng là 6, sau đó cho 50ml môi trƣờng vào mỗi erlen loại 250ml. Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội rồi cấy huyền phù bào tử Trichoderma harzianum với mật độ 106bt/ml. Ủ lắc 150v/p, 3 ngày rồi tiến hành lọc thu dịch cấy để do hoạt tính chitinase. MT đƣợc chọn từ thí nghiệm ở mục 2.3.10 Glucose Sucrose 0,1% 0,2% 0,3% 0,1% 0,2% 0,3% Lọc lấy dịch nuôi cấy Tiến hành đo hoạt độ enzyme. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 erlen 51
63. Đồ án tốt nghiệp 2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp Nguyên tắc: Enzyme chitinase phân giải vách tế bào nấm, ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm, đồng thời làm giảm khả năng gây bệnh của nấm hại. Tiến hành: [9] - Thu nhận enzyme chitinase bằng phƣơng pháp tủa bằng tác nhân cồn 960 (với tỉ lệ cồn:dịch nuôi cấy = 1:3) ở điều kiện 40C, rồi ủ lạnh 2 giờ, sau đó ly tâm 4000 vòng/p, 15 phút, thu tủa, rồi hòa tan vào 1ml đệm photphate (pH=6). - Chủng nấm Collectotrichum sp dùng chuẩn bị cho thí nghiệm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA trong 5 ngày. - Chuẩn bị 2 đĩa chứa môi trƣờng PDA, dùng ống đục đƣờng kính 8mm, đục ở giữa mỗi đĩa tạo thành một giếng. Và đục các tảng nấm Collectotrichum sp đã chuẩn bị sẵn. - Các đĩa đối chứng sẽ đƣợc bơm 25 µl đệm photphate pH=6 và giếng và rồi đặt 1 tảng nấm lên. - Đĩa thí nghiệm thì sẽ đƣơc bơm 25 µl dịch enzyme và giếng và rồi đặt 1 tảng nấm lên. Tiến hành ủ đĩa, quan sát và nhận xét về đặc điểm của 2 mẫu sau 3 ngày. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Cách tính phần trăm tản nấm bị phân giải: a b % tản nấm bị phân giải= a/b 52
64. Đồ án tốt nghiệp 2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu Dùng phần mềm statgaphic và excel 2010 để xử lí số liệu Tiến hành xử lí số liệu thống kế trong statgaphic theo thứ tự - Xử lí số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trƣng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phƣơng sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi trƣờng thạch có cơ chất cảm ứng chitin 1% Bảng 3.1: khả năng phân giải chitin của Trichoderma harzianum trên môi trƣờng định tính sinh tổng hợp chitinase. ĐKKL ĐKVPG D (d) (D) d Lần nhắc 1 1,7 3,5 2,06 Lần nhắc 2 1,8 3,4 1,89 Lần nhắc 3 1,7 3,7 2,18 TB 2,04 ± 0.145 Dựa số liệu ở bảng 3.1, cho thấy có xuất hiện vòng phân giải chitin khi nuôi cấy chủng vi nấm Trichoderma harzianum trên môi trƣờng dinh dƣỡng có chứa 53
65. Đồ án tốt nghiệp nguồn carbon duy nhất là chitin. Điều này chứng tỏ rằng, chủng nấm Trichoderma harzinanum khả năng sinh tổng hợp chitinase. Vì vậy, sinh viên quyết định chọn chủng Trichoderma harzianum sử dụng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh enzyme chitinase. Hình 3.1: Vòng phân giải chitin của T. harzianum trên môi trƣờng dinh dƣỡng chứa chitin 1% sau 2 ngày nuôi cấy. 54
66. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Bảng 3.2: Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng nuôi cấy Hoạt tính (U/ml) A 0,082c ± 0,011 B 0,175bc ± 0,058 C 0,273b ± 0,076 D 0,573a ± 0,116 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong một cùng cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD. Hoạt tính (U/ml) 0.8 a 0.7 0.6 0.5 0.4 b 0.3 bc 0.2 c 0.1 0 môi trƣờng A B C D Hình 3.2: Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase theo môi trƣờng nuôi cấy. 55
67. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.2, cho thấy rằng hoạt tính chitinase của Trichoderma harzianum tăng dần theo thứ tự ở môi trƣờng: A<B<C<D và đạt giá trị tốt nhất khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng D, tốt hơn so với nuôi cấy trong môi trƣờng C mà tác giả Tô Duy Khƣơng nhận định là tốt nhất trong thí nghiệm của tác giả. Lý do là: ở môi trƣờng A, thành phần dinh dƣỡng gồm có khoáng chất và chitin là nguồn carbon duy nhất, là một môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng. Điều này bắt buộc khi tiếp xúc với môi trƣờng vi nấm phải tiết ra hệ enzyme chitinase để phân giải chitin thành các monomer dễ sử dụng phục vụ cho quá trình đồng hóa. Nhƣng hoạt tính của nấm ở môi trƣờng này thấp bởi ban đầu lƣợng sinh khối hình thành ít . Ở môi trƣờng B, hoạt tính cao hơn so với môi trƣờng A bởi vì trong môi trƣờng B có chứa nguồn Carbon bổ sung dƣới dạng Tween 80 và nguồn ni-tơ bổ sung ở dạng urea và pepton. Điều kiện này cho phép vi nấm có thể phát triển đƣợc một lƣợng sinh khối cao hơn so với môi trƣờng A, và do đó lƣợng enzyme chitinase đƣợc tổng hợp mạnh, tăng cao hơn so với môi trƣờng A. Còn ở môi trƣờng C, nguồn carbon bổ sung là đƣờng glucose, cao nấm men và nguồn ni-tơ bổ sung cùng một số yếu tố hỗ trợ tăng trƣờng có trong peptone và cao nấm men, glucose là nguồn carbon ƣa thích nhất của mọi tế bào nên khoảng thời gian đầu, vi nấm phát triển sinh khối dồi dào. Đến khi hết nguồn glucose, chúng bắt đầu sinh tổng hợp enzyme chitnase và với lƣợng sinh khối dồi dào nhƣ thế thì lƣợng enzyme chitinase đƣợc sinh tổng hợp cũng nhiều hơn so với môi trƣờng B. Cuối cùng ở môi trƣờng D, thành phần môi trƣờng giống với môi trƣờng C, duy chỉ khác ở việc bổ sung nguồn ni-tơ là NH4NO3 thay vì peptone và cao nấm men. Hoạt tính chitinase của nấm Trichoderma harzianum khi nuôi cấy trên môi trƣờng D đạt giá trị tốt nhất, cao hơn môi trƣờng A xấp xỉ 7 lần, và hơn môi trƣờng C xấp xỉ 2,1 lần. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: nguồn ni-tơ đƣợc bổ sung NH4NO3 đƣợc vi sinh vật sử dụng dễ dàng hơn so với pepton, bởi peptone là sản 56
68. Đồ án tốt nghiệp phẩm thủy phân chƣa hoàn toàn của các protein có nguồn gốc khác nhau nên cần trải qua một số giai đoạn chuyển hóa trung gian để thành dạng vi sinh có thể sử dụng. Trong khi NH4NO3 lại là dạng khoáng dễ sử dụng. Đồng thời, đây cũng là một nguồn ni-tơ bổ sung có giá thành rẻ hơn so với pepton. Điều này phù hợp với nhận định của các tác giả M.H. Et-Katatny và cộng sự (2000) rằng hoạt tính của enzyme khi nguồn ni-tơ bổ sung là peptone chỉ đạt 32,5%, trong khi sử dụng NH4NO3 thì đạt 75,1%. Do đó môi trƣờng D sẽ đƣợc lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Tóm lại, kết quả của thí nghiệm cho thấy một điều rằng, sự tổng hợp enzyme chitinase của Trichoderma harzianum chịu sự ảnh hƣởng đáng kể của thành phần môi trƣờng: nhƣ nguồn ni-tơ, nguồn carbon. T.harzianum sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt nhất với nguồn ni-tơ bổ sung là NH4NO3. 57
69. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3: Môi trƣờng A, B trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngàyvới bào tử Trichoderma harzianum. 58
70. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Môi trƣờng C, D trƣớc khi ủ và sau khi ủ 5 ngày với bào tử Trichoderma harzianum. 59
71. Đồ án tốt nghiệp 3.3 Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất chitin đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Bảng 3.3: Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng của nguồn cơ chất cảm ứng Nguồn cơ chất cảm ứng Hoạt tính (U/ml) Không cơ chất 0,081b ± 0,008 Vỏ tôm huyền phù 0,099b ± 0,006 Chitin huyền phù 0,156a ± 0,018 Bã nấm linh chi 0,099b ± 0,011 Sinh khối Fusarium 0,087b ± 0,016 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong một cùng cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD. Hoạt tính (U/ml) 0.18 a 0.16 0.14 b 0.12 b b 0.1 b 0.08 0.06 0.04 0.02 0 Cơ chất Không cơ Vỏ tôm Chitin Bã nấm linh Sinh khối chất huyền phù huyền phù chi nấm Fusarium Hình 3.5: Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của hoạt tính chitinase theo cơ chất cảm ứng. 60
72. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.3 và biểu đồ 3.5, có thể thấy rằng dùng chitin huyền phù làm chất cảm ứng thì hoạt tính enzyme chitinase đạt giá trị cao nhất, xấp xỉ gấp 1,8 lần so với môi trƣờng không có chất cảm ứng. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu trƣớc đây khi cho rằng chitin là nguồn cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp chitinase tốt nhất, nhƣ sự khẳng định của tác giả Ulhoa C.J (1991), Lê Thị Huệ (2010), M.H. Et-Katatny và cộng sự (2000), Vỏ tôm huyền phù, bã nấm linh chi và sinh khối Fusarium cho khả năng cảm ứng sinh tổng hợp chitinase đứng thứ hai và cuối cùng thấp nhất là ở môi trƣờng không có chất cảm ứng. Điều này cho thấy, Trichoderma harzianum có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase khá tốt, có thể ở nhiều điều kiện môi trƣờng, kể cả môi trƣờng không có chất cảm ứng. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng có chất cảm ứng là vỏ tôm, hoạt tính chitinase thấp hơn so với chitin là do trong thành phần có: khoáng nhƣ CaCO3, các protein liên kết với chitin trên vỏ tôm, nên hàm lƣợng chitin trong vỏ tôm so với bột chitin thì sẽ thấp hơn (ở cùng một tỷ lệ bổ sung). Khi huyền phù mặc dù vỏ tôm đã loại đƣợc một số các yếu tố tạp, nhƣng mà hàm lƣợng chitin cảm ứng thì thấp hơn bột chitin huyền phù, do đó hàm lƣợng chitinase tiết ra ít hơn, dẫn đến hoạt tính thấp hơn. Đối với việc sử dụng sinh khối nấm bệnh làm chất cảm ứng thì theo nhƣ nghiên cứu của các tác giả trƣớc đây nhƣ: Tô Duy Khƣơng sử dụng vách tế bào một số nấm bệnh bổ sung vào môi trƣờng theo tỷ lệ 1% (w/v) để cảm ứng sinh tổng hợp chitinase và đạt kết quả dao động trong khoảng 1,203- 2,760 (đvht/ml). Còn ở thí nghiệm của sinh viên, sử dụng tỷ lệ thể tích/thể tích để bổ sung dịch nấm bệnh vào môi trƣờng, nhằm tận dụng khả năng cảm ứng của cả sinh khối lẫn bào tử nấm bệnh để cảm ứng sinh tổng hợp chitinase, nhƣng có lẽ bằng cách này mật độ chitin loãng nên làm khả năng cảm ứng thấp, dẫn đến lƣợng enzyme sinh ra không nhiều. Bên cạnh đó theo Elad Y (1982), bản thân Trichoderma harzianum tổng hợp enzyme chitinase còn phụ thuộc vào tính đặc hiệu với từng ký chủ cụ thể. 61
73. Đồ án tốt nghiệp Bên cạnh đó, có thể thấy nếu dùng vỏ tôm huyền phù làm cơ chất cảm ứng thì hoạt tính chitinase đạt xấp xỉ 63,46% so với dùng chitin huyền phù. Mà vỏ tôm thì đang đƣợc xem nhƣ là một phế thải khó xử lý của ngành công nghiệp thủy hải sản của nƣớc ta, nên nếu ứng dụng vỏ tôm làm cơ chất để sinh tổng hợp enzyme chitinase thì sẽ rất kinh tế và góp phần xử lý một phần rác thải lớn cho môi trƣờng. Do đó, sinh viên quyết định chọn vỏ tôm huyền phù làm nguồn cơ chất cảm ứng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.4 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Bảng 3.4: Hoạt tính của enzyme chitinase theo thời gian nuôi cấy Ngày nuôi cấy Hoạt tính (U/ml) 1 0,091f ± 0.011 2 0,554c ± 0.082 3 1,461a± 0,043 4 1,445a ± 0,017 5 0,994b ± 0,082 6 0,428d ± 0,100 7 0,210e ± 0,008 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong một cùng cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD. 62
74. Đồ án tốt nghiệp Hoạt tính (U/ml) 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Ngày 0 2 4 6 8 Hình 3.6: Biều đổ đƣờng thể hiện sự biến đổi của hoạt tính chitinase theo thời gian nuôi cấy Dựa vào kết quả trên bảng 3.4 và biểu đồ 3.6, có thể nhận thấy rằng hoạt tính chitinase của nấm tăng dần trong 4 ngày đầu, đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ 3 sau nuôi cấy, giảm nhẹ vào ngày thứ 4 rồi giảm nhanh ở những thời gian sau đó. Điều này có thể giải thích nhƣ sau khoảng thời gian đầu nuôi cấy, bào tử nấm nảy mầm và sử dụng nguồn đƣờng glucose có sẵn trong môi trƣờng để phát triển sinh khối nấm, lúc này (tức từ lúc cấy đến ngày 1) enzyme chitinase đƣợc sinh ra rất ít (cụ thể là hoạt tính chitinase ngày 1 là 0,091 U/ml). Khi nguồn đƣờng đƣợc sử dụng hết thì các tơ nấm mới bắt đầu tổng hợp enzyme chitinase để phân giải nguồn cơ chất chitin thành các monomer dễ sử dụng. Điều đó đƣợc thể hiện ở việc hoạt tính chitinase tăng lên ở ngày 2 (0,554 U/ml). Lúc này lƣợng glucose trong môi trƣờng vẫn còn, và khi đó chitin trong vỏ tôm phát huy khả năng cảm ứng enzyme, nhƣng vẫn chƣa đạt hiệu quả cảm ứng cao nhất vì chịu sự ức chế một phần của glucose. Sở dĩ hoạt tính đạt giá trị tối đa ở ngày 3 (1,461 U/ml) là vì khi đó đƣờng glucose trong môi trƣờng đã cạn kiệt, khả năng cảm ứng enzyme của chitin đạt tối đa, sinh khối nấm đã phát triển tốt nên chúng tiết ra một lƣợng lớn enzyme để phân giải cơ chất đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng của chúng phục vụ cho quá trình đồng hóa. Sau đó, khi đã quen dần với nguồn cơ chất mới, lƣợng enzyme tiết ra đƣợc điều tiết đến một lƣợng hợp lí, nên hoạt tính giảm dần. Đến ngày thứ 7 thì hoạt tính 63
75. Đồ án tốt nghiệp enzyme rất thấp, điều này xảy ra đƣợc giải thích bởi hiện tƣợng ức chế ngƣợc (feed back inhibition), sản phẩm N-acetyl glucosamine đƣợc sinh ra nhiều nên ức chế ngƣợc quá trình phân giải cơ chất hoặc có thể là do khi ấy môi trƣờng đã cạn dần nguồn chitin và tế bào sợi nấm bắt đầu sinh trƣởng chậm dần. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định trong nghiên cứu trƣớc đây của các tác giả Sandhya C, Adapa LK, Nampoothiri KM, Binod P, Szakacs G, Pandey A (2004) Do đó thời gian nuôi cấy là 3 ngày sẽ đƣợc chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 64
76. Đồ án tốt nghiệp 3.5 Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Bảng 3.5: Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy pH môi trƣờng Hoạt tính (U/ml) 5 1,537ab ± 0.307 6 2,057a ± 0,475 7 1,399ab ± 0,088 8 1,001c ± 0,037 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong một cùng cột giá trị TB theo sau bởi một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD. Hoạt tính U/ml 3 a 2.5 2 ab ab 1.5 c 1 0.5 0 pH 5 6 7 8 Hình 3.7: Biểu đồ cột thể hiện sự thay đổi của chitinase theo pH môi trƣờng ban đầu 65
77. Đồ án tốt nghiệp Dựa vào 3.5 và biểu đồ 3.14, có thể nhận thấy rằng hoạt tính chitinase thấp nhất ở pH= 8, ổn định ở pH= 5 và pH= 7, đạt giá trị cao nhất ở pH= 6. Điều này chứng tỏ Trichoderma harzianum có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase tốt nhất ở môi trƣờng có giá trị pH= 6. Kết quả này cũng giống với các nghiên cứu trƣớc đây của nhiều tác giả khi khẳng định rằng Trichoderma harzianum là loài có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao ở môi trƣờng hơi acid pH=5-6, Ulhoa và Peberdy (1991) đã nhận định rằng pH có sự ảnh hƣởng đáng kể đến sự sinh tổng hợp enzyme chitinase và đạt giá trị tối ƣu ở pH= 6. Bên cạnh đó dựa vào số liệu hoạt tính enzyme ở cả khoảng pH tử 5-8, có thể thấy rằng đây là loài nấm có khả năng thích nghi tốt với môi trƣờng, thích hợp cho việc ứng dụng trong bảo vệ thực vật trên các loại đất trồng ở Việt Nam. Sở dĩ pH ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp của enzyme chitinase là do pH tức nồng độ ion H+ trong môi trƣờng sẽ ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi vật chất trong tế bào, giảm khả năng sử dụng các chất dinh dƣỡng, và có thể làm suy yếu hoạt tính hay bất hoạt enzyme, thông qua việc làm thay đổi trạng thái tích điện của thành tế bào vi sinh vật, thay đổi trạng thái điện ly của các phân tử chất dinh dƣỡng. Sinh viên quyết định chọn pH môi trƣờng ban đầu bằng 6 đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 66
78. Đồ án tốt nghiệp 3.6 Ảnh hƣởng của nguồn đƣờng bổ sung đến sự sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum Bảng 3.6: Hoạt tính của enzyme chitinase dƣới sự ảnh hƣởng của nguồn dƣờng và tỷ lệ đƣờng bổ sung. Nguồn đƣờng Tỷ lệ bổ sung (w/v) 0.1% 0.2% 0.3% Glucose 0,255 ± 0,027 0,803 ± 0,170 0,448 ± 0,039 Sucrose 0,300 ± 0,102 0,235 ± 0,087 0,219 ± 0,044 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Thứ nhất, dựa vào số liệu ở bảng 3.6 và kết quả xử lí thống kê ở phụ lục N, thấy rằng chủng Trichoderma harzianum có khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt nhất khi sử dụng nguồn đƣờng bổ sung là glucose hơn là khi bổ sung sucrose. Đồng thời dựa trên số liệu giá trị OD của ống phản ứng và không phản ứng khi sử dụng sucrose làm nguồn đƣờng bổ sung (ở phụ lục I), cho thấy lƣợng sucrose còn xót lại rất nhiều (phản ánh qua giá trị OD khá cao). Điều này phù hợp với nhận định của Prasun K. Mukherjee, Benjamin A. Horwitz, Uma Shankar Singh, Mala Mukherjee và Monika Schmoll (2013) trong cuốn “Trichoderma biology and Applications” [25], khi cho rắng Trichoderma harzianum sử dụng sucrose rất hạn chế, thậm chí không có khả năng sử dụng sucrose. Thứ nhì, dựa số liệu ở bảng 3.6 và kết quả xử lí thống kê ở phụ lục N, khi bổ sung đƣờng glucose với các tỷ lệ khác nhau thì hoạt tính enzyme tăng lên đáng kể khi tăng tỷ lệ glucose từ 0,1% lên 0,2%, đạt giá trị tối ƣu ở tỷ lệ bố sung là 2%, và giảm xuống khi tăng nguồn đƣờng từ 0,2% lên 0,3%. Điều này có thể giải thích nhƣ sau: glucose trong trƣờng hợp này đóng vai trò vừa là chất dinh dƣỡng cho sự phát triển sinh khối nấm sợi vừa là chất ức chế sự sinh tổng hợp enzyme. Khi tăng hàm lƣợng glucose từ 0,1% lên 0,2% thì hoạt tính chitinase tăng tỷ lệ thuận. Sở dĩ nhƣ 67
79. Đồ án tốt nghiệp vậy, là do khi bổ sung 0,2% glucose vào môi trƣờng cấy, lƣợng đƣờng này đã góp phần là tiền chất cho sự phát triển sinh khối của nấm sợi tốt hơn so với 0,1%, cũng vì thế mà lƣợng enzyme chitinase sinh ra nhiều hơn so với bổ sung 0,1% glucose. Nhƣng khi tăng hàm lƣợng đƣờng lên 0,3% thì hoạt tính enzyme chitinase giảm, và nguyên nhân gây ra điều đó chính là lƣợng glucose đã vƣợt mức nhu cầu của nấm sợi và vô tình lƣợng dƣ glucose đã trở thành chất ức chế- kìm hãm sự sinh tổng hợp enzyme chitinase của Trichoderma harzianum (Hartl và cộng sự, 2012), do nó ảnh hƣởng đến khả năng cảm ứng của chitin và khả năng biểu hiện gene mã hóa cho enzyme chitinase. Cuối cùng, dựa vào kết quả xử lí thống kê ở ở phụ lục N, cho thấy rằng có sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố nguồn đƣờng và tỷ lệ đƣờng bổ sung vào môi trƣờng. Do đó, sinh viên chọn nguồn đƣờng là glucose và tỷ lệ bổ sung là 0.2% cho khả năng sinh tổng hợp chitinase tốt của chủng Trichoderma harzianum. 3.7 Hiệu quả khống chế nấm gây bệnh thán thƣ ớt của chitinase thu từ Trichoderma harzianum. Bảng 3.7 Đƣờng kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy ở 2 mẫu thí nghiệm Đƣờng kính vòng melanin qua các ngày nuôi cấy (cm) Nghiệm thức 3 NSC 4 NSC 5 NSC 6 NSC Thí nghiệm 1,1 1,23 ± 0.058 1,42 ± 0.104 1,42 ± 0.104 Đối chứng 2,68 ± 0,126 3,97 ± 0,577 5,47 ± 0,838 6,47 ± 0,802 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. 68
80. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua các ngày Nghiệm % tản nấm bị phân giải ở các ngày nuôi cấy thức 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC 5 NSC 6 NSC Đối 0 0 0 0 0 0 chứng Thí 0 0 74,6 ± 1,19 64,2 ± 4,31 79,7 ± 1.15 80.9 ± 3.49 nghiệm Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD. 69
81. Đồ án tốt nghiệp a b Hình 3.8 Mặt sau (a) và mặt trƣớc (b) của tản nấm Collectotrichum sp sau 3 ngày ủ với enzyme chitinase. c d Hình 3.9 Mặt sau (c) và mặt trƣớc (d) của tản nấm Collectotrichum sp sau 6 ngày ủ với enzyme chitinase. Dựa vào bảng 3.7 có thể thấy rằng qua các ngày nuôi cấy, sự phát triển của vòng melanin (vòng màu đen mặt dƣới tản nấm) ở mẫu thí nghiệm rất yếu, thậm chí ngừng phát triển ở ngày 6, còn ở mẫu đối chứng thì vòng melanin vẫn tăng lên theo thời gian. Đồng thời, nếu quan sát trong cùng một ngày nuôi cấy thì có thể thấy rằng, sự phát triển vòng melanin ở mẫu đối chứng cao hơn nhiều so với mẫu thí nghiệm. Ở ngày 1 và ngày 2, không xuất hiện sự khác biệt ở mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm. Tuy nhiên, bƣớc sang ngày thứ 3, sinh viên quan sát thấy rằng, đƣờng kính vòng melanin do Collectotrichum sp tạo thành ở mẫu thí nghiệm không phát triển vể quy mô nhƣ mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ đã có sự ảnh hƣởng của enzyme chitianse đến sơi nấm của Collectotrichum sp vì hợp chất melanin này do 70
82. Đồ án tốt nghiệp sợi nấm tiết ra (Miguel J., 2014), có thể quan sát hình (b) để thấy đƣợc sợi nấm có thể đã bị phân giải. điều này đƣợc thể hiện qua số liệu % tản nấm bị phân giải trên bảng 3.7. Theo phỏng đoán của sinh viên, có thể sau 1 khoảng thời gian nhất định enzyme chitinase mới có thể tiếp xúc với vách tế bào nấm bệnh và phân giải từ từ thành phần chitin có trong vách tế bào của Collectotrichum sp làm cho hệ sợi nấm phân rã, mất đi tính xốp của nó, đặc điểm này có phần giống nhƣ nghiên cứu của Mandana Zarei et al. (2011) [22]. Bên cạnh đó, những diện tích tản nấm chƣa chịu sự tác động của chitinase thì vẫn vƣơng ra, trong khí phần trong thì bị phân giải từ từ, điều này thể hiện quả số liệu ở ngày 4,5,6. 71
83. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Chủng nấm Trichoderma harzianum sinh tổng hợp chitnase mạnh nhất trên môi trƣờng có các thành phần sau: glucose 2%, NH4NO3 0,5g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l, FeSO4.7H2O 0,01g, ZnSO4 0,001g/l, chitin huyền phù 1% và K2HPO4, KH2PO4 (đƣợc pha theo tỷ lệ đạt pH=6) - Chủng nấm Trichoderma harzianum có thể hoạt động và sinh tổng hợp enzyme chitinase trong điều kiện pH= 5-8. Trong đó, khả năng sinh tổng hợp chitinase mạnh nhất ở pH=6. Thời gian nuôi cấy tốt nhất là 3 ngày. - Enzyme chitinase thu nhận từ chủng Trichoderma harzianum theo các điều kiện nuôi cấy tối ƣu có khả năng ảnh hƣởng đến khuẩn lạc của Collectotrichum sp trong điều kiện in vitro. Cụ thể là sau 6 ngày nuôi cấy, phần trăm tản nấm bị phân giải đạt xấp xỉ 80,9%. 4.2 Kiến nghị - Cần phân lập các chủng Trichoderma khác để chọn ra chủng có hoạt tính tốt hơn. - Cần khảo sát thêm các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase nhƣ: nhiệt độ phòng, số vòng lắc/phút, tỷ lệ cơ chất bổ sung, mật độ bào tử bổ sung. - Khảo sát ảnh hƣởng của chitinase đến bệnh thán thƣ trên cây ớt ở các nồng độ pha loãng enzyme khác nhau. - Thu nhận enzyme chitinase làm chế phẩm, rồi thử nghiệm để ức chế một số nấm bệnh hại thực vật. 72