Đồ án Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Nội dung text: Đồ án Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ YẾN NHI MSSV: 1151110242 Lớp: 11DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2015
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân em. Những kết quả và số liệu trong báo cáo tốt nghiệp được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới và phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, không sao chép bất kỳ nguồn nào khác. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Đó là những hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp một phần sức lực nhỏ bé của mình vào công cuộc xây dựng đất nước. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. HCM và các anh chị phụ trách phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học đã tạo điều kiện và hướng dẫn em hoàn thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại đây. Chân thành cảm ơn các thầy phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong lúc thực hiện đề tài này. Con xin gửi tình thương yêu và lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, mọi người trong gia đình và những người luôn bên cạnh luôn sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong mọi bước đường đi. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ x CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Tình hình nghiên cứu 2 1.3. Mục đích nghiên cứu 3 1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu 3 1.5. Phương pháp nghiên cứu 3 1.6. Các kết quả đạt được của đề tài 3 1.7. Kết cấu của đồ án 4 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Khái quát chung về enzyme 5 2.1.1. Sơ lược về enzyme 5 2.1.2. Tính chất của enzyme 6 2.1.2.1. Bản chất sinh học 6 2.1.2.2. Bản chất hóa học 7 2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose. 7 2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase 9 2.3.1. Định nghĩa 9 2.3.2. Phân loại 10 2.3.3. Tính chất 10 i
5. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.1. Tính đặc hiệu 10 2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học 10 2.3.3.3. Các chất ức chế 10 2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme 11 2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 11 2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) 11 2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) 12 2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase . 12 2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy 12 2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy 13 2.3.5.3. pH môi trường 14 2.3.5.4. Độ ẩm 14 2.3.5.5. Môi trường không khí 14 2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase 14 2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc 14 2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật 15 2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose 15 2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1. Nấm sợi 15 2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii 16 2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 17 2.5.1. Bã mía 17 2.5.2. Cám gạo 17 2.6. Phương pháp lên men bề mặt 19 ii
6. Đồ án tốt nghiệp 2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme 20 2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase 23 2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase 23 2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel 24 2.9.1. Bản chất của phương pháp 24 2.9.2. Đặc tính của gel 25 2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide 26 CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 3.2. Vật liệu 28 3.2.1. Nguồn vi sinh vật 28 3.2.2. Cơ chất 28 3.2.3. Hóa chất 28 3.3. Thiết bị và dụng cụ 29 3.3.1. Thiết bị 29 3.3.2. Dụng cụ 30 3.4. Môi trường 31 3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 31 3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất 31 3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy 32 3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii 32 3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA 32 3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa 33 iii
7. Đồ án tốt nghiệp 3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase 34 3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii 35 3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu 36 3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô 36 3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose 36 3.5.8. Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford 37 3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 40 3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase 42 3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất 43 3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu 43 3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu 44 3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng 45 3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 45 3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống 45 3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 46 3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme . 47 3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa 47 3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme 48 3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase 48 3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase 48 3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô 48 iv
8. Đồ án tốt nghiệp 3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel 49 3.5.14.1. Nguyên tắc 49 3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ 49 3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm 49 3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide 51 3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu 55 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii 56 4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch 57 4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu 57 4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất 58 4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase trên môi trường lên men bán rắn 59 4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 59 4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 60 4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase 61 4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 62 4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 64 4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 65 4.6. Quy hoạch thực nghiệm 66 4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất 71 v
9. Đồ án tốt nghiệp 4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol 71 4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone 73 4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu 74 4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase 75 4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase 75 4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 76 4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc lọc gel 77 4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE 79 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 5.1. Kết luận 82 5.2. Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC vi
10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BM:CG : Bã mía và cám gạo CBB : Coomasie brilliant blue CMC : Carboxymethyl cellulose CMCase : Carboxymethyl cellulase DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid DTT : Dithiothreitol EC : Enzyme commission number (tiểu ban về enzyme) FPA : Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc) HEC : Hydroxyethyl cellulose HL : Hàm lượng protein (mg) HT : Hoạt tính enzyme (U) HTR : Hoạt tính riêng (U/mg) MT : Môi trường MW : Molecular weight (trọng lượng phân tử) NĐC : Nồng độ chuẩn OD : Optical density (trị số mật độ quang) PGA : Potato glucose agar SDS – PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis T. koningii : Trichoderma koningii TEMED : N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine U : Đơn vị hoạt tính enzyme VSV : Vi sinh vật vii
11. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo 18 Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek 31 Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật 37 Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine 39 Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose 41 Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase 42 Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất 43 Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường 44 Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme 47 Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách 53 Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom 54 Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG 59 Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm 66 Bảng 4.3. Mã hóa các biến số 66 Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa 67 Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 68 Bảng 4.6. Kết quả 푗 và 푖푗 69 Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm 69 Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase khi tủa bằng dung môi ethanol 960 và dung môi acetone 74 Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 78 Bảng 4.10. Giá trị 푅 và log của các protein trong thang chuẩn 79 Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2 81 Bảng 4.12. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 3 81 Bảng 4.13. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 4 81 viii
12. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose 7 Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase 9 Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase 11 Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase 11 Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase 12 Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii 16 Hình 2.7. Bã mía 17 Hình 2.8. Cám gạo 17 Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel 24 Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi nuôi cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình b) 56 Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và kính hiển vi điện tử (hình d) 56 Hình 4.3. Vòng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g) 57 Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi 58 Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase 78 Hình 4.6. Kết quả điện di 79 ix
13. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau 59 Đồ thị 4.2. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau 61 Đồ thị 4.3. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có pH ban đầu khác nhau 62 Đồ thị 4.4. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau 63 Đồ thị 4.5. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có thời gian nuôi cấy khác nhau 64 Đồ thị 4.6. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T. koningii có tỷ lệ giống khác nhau 65 Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol 72 Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme cellulase với dung môi acetone 73 Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone 74 Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau 75 Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau 76 Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong thang chuẩn với 푅 80 x
14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, cuộc sống hiện đại với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được áp dụng nhiều hơn vào thực tế góp phần giúp cho đời sống con người ngày càng được nâng cao và hoàn thiện. Trong đó, ngành công nghệ sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu triển vọng, đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme. Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chóng, do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do vi sinh vật tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy vi sinh vật cho phép chúng ta có thể tận dụng được các phế thải của các ngành khác. Nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, agar, Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị phân hủy bằng phương pháp vật lý và hóa học nhưng việc này rất phức tạp. Trong khi đó, nếu sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật bằng công nghệ sinh học để xử lý các chất thải hữu cơ sẽ có nhiều điểm ưu việt hơn kể cả về mặt kỹ thuật, môi trường cũng như về kinh tế. Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Mặt khác, số lượng loài vi sinh vật tham gia tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú như nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn, Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác với mật độ cao. Các nhà khoa học phân lập thành công chủng nấm mốc Trichoderma koningii để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả và giá thành lại rẻ. Bên cạnh đó, celluase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, Vì vậy, việc sản xuất được một lượng lớn enzyme cellulase với chi phí thấp là một điều rất cần thiết. Và để thu nhận được enzyme cellulase một cách hiệu quả nhất thì ta cần khảo sát các điều kiện, yếu tố ảnh hưởng 1
15. Đồ án tốt nghiệp đến môi trường sinh tổng hợp tối ưu của enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm sinh học có giá trị cao trong ứng dụng. 1.2. Tình hình nghiên cứu Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma koningii (T. koningii), nhưng trên thế giới đã có nhiều đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme của T. koningii. Theo Cui Fumian và cộng sự (1995), thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cenllulase đã được thực hiện bằng cách phát triển các giống đột biến trên môi trường bán rắn bao gồm 3 g bột rơm, 2 g cám lúa mì và 10 ml ammonium sulfate 1% trong 250 ml bình ở 280C, 72 giờ tại pH ban đầu là 6,0. Với hiệu suất tổng hợp enzyme cellulase là 4880 U/g carboxymethyl cellulose – Na và 480 U/g trên sợi bông. Hoạt tính enzyme cellulase từ chủng đột biến là gấp 3 lần so với chủng mẹ. Các điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme trên bông là pH 4,5 – 5,0 và 45 – 500C. Enzyme ổn định ở mức pH 3,5 – 6,5 ở 450C trong 4 giờ. Sau khi ủ men ở 600C trong 1 giờ, vẫn còn 20% hoạt tính của enzyme cellulase. Theo Liu Xiao-jie và cộng sự (2003), khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của T. koningii trên môi trường bột rơm đã có tác động tốt, trong khi môi trường (NH4)2SO4 có tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp enzyme cellulase. Hoạt tính mạnh nhất của enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase), hoạt tính giấy lọc (FPA) và β – glucosidase lần lượt là 765,8 U/ml, 155,3 U/ml và 39,54 U/ml, tương ứng với môi trường nuôi cấy tối ưu hóa sau 6 ngày. Theo Zou Shui – yang và cộng sự (2011), điều kiện nuôi cấy được tối ưu cho nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T. koningii đã được thiết lập như sau: tỷ lệ rơm : cám là 3 : 2 (w/w), tỷ lệ dinh dưỡng môi trường là 1:1,5 (w/v), pH ban đầu là 5,5 và nuôi cấy trong 120 giờ ở 28,50C. Với điều kiện tối ưu trên, hoạt tính giấy lọc, β – glucosidase và xylanase lần lượt là 13,1 U/g chất khô, 12,2 U/g chất khô và 994,7 U/g chất khô. Theo Wang S và cộng sự (2013), các gen sản sinh enzyme cellulase và xylanase của nấm Trichoderma tồn tại dưới dạng sợi carbon catabolite áp trung gian 2
16. Đồ án tốt nghiệp bởi các hoạt hóa dị hóa carbon (CRE1). Việc sản xuất enzyme có thể được cải thiện hơn nữa bằng cách bất hoạt gen CRE1. Việc bất hoạt gene CRE1, dẫn đến thay đổi biểu hiện gen sinh enzyme cellulase trong nuôi cấy cơ bản trên đường. Kết quả là hoạt tính giấy lọc, hoạt tính β – 1,4 – exoglucanase, hoạt tính β – 1,4 – edoglucanase và hoạt tính xylanase đã thay đổi trên lần lượt là 2,1, 1,4, 0,8 và 0,8 lần. Việc can thiệp vào RNA là một phương pháp khả thi để phân tích các cơ chế quản lý biểu hiện gen và cải thiện năng suất sinh enzyme xylanase và enzyme cellulase trong T. koningii. 1.3. Mục đích nghiên cứu Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma koningii một cách tối ưu nhất. 1.4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Quan sát đại thể và vi thể hình thái của nấm mốc Trichoderma koningii. - Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii trên môi trường bán rắn. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của Trichoderma koningii. - Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase. - Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel. - Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE. 1.5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm. - Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và stagraphic plus. 1.6. Các kết quả đạt được của đề tài - Thu được enzyme cellulase. - Có được các thông số tối ưu quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của Trichoderma koningii. 3
17. Đồ án tốt nghiệp - Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa. - Tinh sạch được enzyme cellulase. 1.7. Kết cấu của đồ án Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương: Chương 1: Mở đầu. Chương 2: Tổng quan tài liệu. Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 4: Kết quả và thảo luận. Chương 5: Kết luận và kiến nghị. 4
18. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát chung về enzyme 2.1.1. Sơ lược về enzyme (Lê Minh Trí, 2011) Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh, ) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh, ). Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể vi sinh vật. Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa nhiều enzyme thì hoàn toàn khác nhau. Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: - Động vật (hạn chế) - Thực vật (hạn chế) - Vi sinh vật (phổ biến) Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế. 5
19. Đồ án tốt nghiệp Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau: - Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn. - Hệ enzyme có vi sinh vật vô cùng phong phú. - Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao. - Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh. - Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất. - Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp. 2.1.2. Tính chất của enzyme (Nguyễn Văn Mùi, 2011) 2.1.2.1. Bản chất sinh học Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen. Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng cả trong và ngoài tế bào. Một gen một enzyme một phản ứng. Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính chất gây độc. Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện nhiệt độ 20 – 450C, 1 atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính. Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học, vì vậy enzyme cần dùng với lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, 6
20. Đồ án tốt nghiệp 2.1.2.2. Bản chất hóa học Gồm hai nhóm: - Nhóm enzyme đơn cấu tử: enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy nhất là protein. - Nhóm enzyme đa cấu tử: là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành gồm: một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải protein. Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. 2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose. Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp ra nhờ quá trình quang hợp. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982). Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose ( Ligno – cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose và lignin (Hamelinck và cộng sự, 2003). Cellulose (40 – 60% trọng lượng khô) là polymer thẳng của các đơn vị β-D-1,4- 7
21. Đồ án tốt nghiệp glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen cho thấy, cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu trúc không đồng nhất, có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định) (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003). Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở nhiệt độ 40 – 500C nhờ các ezyme thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982). Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20 – 40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose mananose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất không kết tinh nên hemicellullose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003). Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose. Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme của vi sinh vật (VSV). Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn – cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Các chủng VSV như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase. Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy (Hamelinck và cộng sự, 2003). 8
22. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase 2.3.1. Định nghĩa (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013) Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase ( Cellulase là hệ enzyme xúc tác phản ứng cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt, cellulase tương tự enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng chặt chẽ), mặt khác chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế dị hóa. Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Cấu trúc không gian cellulose bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian. Cấu trúc không gian khoảng 280 – 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300 – 450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin. Cellulase là một loại homopolymer của β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan. Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3 enzyme khác nhau: endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, 9
23. Đồ án tốt nghiệp EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và β- glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4- β-D glucoside trong phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose. 2.3.2. Phân loại Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB – International Union pf Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống các enzyme thủy phân cellulose gồm có endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21 (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013). 2.3.3. Tính chất (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013) 2.3.3.1. Tính đặc hiệu Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và các β- D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động trên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellulobiose, β-glucosidase thủy phân các gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose. 2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Bên cạnh hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác của enzyme và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm. Cenllulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu trong khoảng 4 – 5. Nhiệt độ tối ưu từ 40 – 500C. Hoạt tính cellulase bị phá huỷ hoàn toàn ở 800C trong 10 đến 15 phút. 2.3.3.3. Các chất ức chế Cellulase bị ức chế bởi chính các sản phẩm phản ứng được tạo ra như glucose, cellobiose. Thủy phân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác nhau như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ. 10
24. Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme 2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (Nguyễn Hoàng Phúc và những cộng sự, 2012) Enzyme này còn có tên gọi khác như: exoglucanase, cellobiohydrolase, exo- cellobiohydrolase, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase. Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ( 2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) (Nguyễn Hoàng Phúc và những cộng sự, 2012) Enzyme này còn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4-β-D- glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase A3, 9.5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS. Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ( 11
25. Đồ án tốt nghiệp Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. 2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) (Nguyễn Hoàng Phúc và những cộng sự, 2012) Enzyme này có tên gọi khác như là: β-glucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6- glucosidase, β-glucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl β-glucosidase, aryl-β- glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase, primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase. Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng thích ra β-D-glucose. Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase ( 2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy  Nguồn carbon (Lương Đức Phẩm, 1998) Theo lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn carbon. Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, mạt cưa, bã củ cải, rơm, than bùn. T. lignorum và T. koningii được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải. Chất cảm ứng enzyme cellulase còn là cellobiose octaacetate, cám mì, lactose, salixyl. 12
26. Đồ án tốt nghiệp Đối với Stachy botrys atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh bột. Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetate, citrat, oxalate, succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulase. Nhưng trong môi trường có nồng độ glucose thấp có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme.  Nguồn Nitơ (Lương Đức Phẩm, 1998) Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là muối nitrate. Đối với các giống của bộ nấm bông (hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nó chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt tính enzyme này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy, các muối này làm acid hóa môi trường. Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme và thậm chí có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành. Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase. Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt tính cellulase của vi sinh vật; nhưng với cao ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn cao nấm men.  Các nguyên tố khoáng (Lương Đức Phẩm, 1998) Các nguyên tố khoáng như: Fe, Mn, Zn, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Trong đó Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 1,11 – 2,2 mg/l, Fe 2 – 10 mg/l, Mn 3,4 – 27,2 mg/l. 2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp đối với việc sinh trưởng và tích lũy cellulase của nhiều loại nấm khác nhau thường ở nhiệt độ 28 – 300C. 13
27. Đồ án tốt nghiệp 2.3.5.3. pH môi trường (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009) pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật, đối với những loài vi sinh vật. 2.3.5.4. Độ ẩm (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009) Độ ẩm không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hóa của cơ chất. Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau. Do đó, quá trình lên men bán rắn được thực hiện với hàm lượng nước trong cơ chất khác nhau từ 30 – 80%. 2.3.5.5. Môi trường không khí (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009) Vi sinh vật hiếu khí thì môi trường nuôi cấy cần đảm bảo cung cấp đủ oxy để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thường để trên máy lắc, môi trường bán rắn thì cơ chất phải có độ xốp tạo sự thông thoáng giữa các tiểu phần cơ chất. Ngược lại vi sinh vật kỵ khí chỉ phát triển trên môi trường không có sự hiện diện của oxy. Ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được cả hai điều kiện trên. 2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase 2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc Sử dụng phối hợp enzyme cellulase với các enzyme thủy phân khác như pectinase, hemicellulase, trong quá trình ủ cỏ xanh có tác dụng phân giải thành tế bào thực vật, do đó tăng nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi khuẩn lactobacillus lên men sinh acid lactic, ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh có hại khác. Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nấu thức ăn có trộn thêm cellulase sẽ tăng sự tiêu hóa, hấp thụ thức ăn cho động vật, đặc biệt động vật ăn còn non có hệ tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, do đó sẽ làm giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn. 14
28. Đồ án tốt nghiệp 2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật Cellulase phá vỡ thành tế bào thực vật giúp cho việc trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc được dễ dàng. Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào thực vật, tế bào thực vật mất vách cellulose trở thành tế bào trần. Sử dụng tế bào trần để nghiên cứu lai tế bào nhằm tạo ra các tế bào lai có những tính trạng mới theo hướng mong muốn, tế bào trần còn được sử dụng để tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gene. 2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose Cellulase được ứng dụng trong sản xuất glucose, mật đường từ nguyên liệu giàu cellulose như rơm rạ, mạt cưa, gỗ vụn (thay dần cho phương pháp thủy phân bằng acid) dùng làm thức ăn cho người và động vật. Dịch đường sau khi đã thủy phân làm nguồn nuôi cấy nấm men rất tốt. Sử dụng cellulase của T. viride để chuyển hóa nguyên liệu có cellulose thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Theo biện pháp này, nếu tận dụng được ba triệu tấn cellulose trong phế liệu hằng năm ở Mỹ thì có thể thỏa mãn tới 20% nhu cầu nhiên liệu của nước này. Người ta thấy rằng nếu trộn xăng với ethanol sẽ làm giảm đáng kể chi phí nhiên liệu cho các loại xe máy, ô tô và bớt khói bụi. 2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase 2.4.1. Nấm sợi Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất ở môi trường khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rộng rãi và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải các chất hữu cơ và hình thành chất mùn (Võ Thị Bích Viên, 2009). Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum. Trong đó hai giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase. 15
29. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii (Clipson, 2001) Trichoderma koningii được phân loại như sau: Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreacea Giống: Trichoderma Loài: T. koningii  Đặc điểm: Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii T. koningii hiện diện nhiều ở lớp đất mặt nhưng ở độ sâu 120 cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này. Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 260C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài. pH cho sự phát triển của nấm là 3,7 – 6,0 (Domsch và Gams, 1980). Khuẩn lạc có đường kính 3 – 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử đính có dạng hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8 µm) x (1,3 – 2,8 µm).  Khả năng phân hủy chất hữu cơ của nấm Trichoderma spp. Nấm Trichoderma spp. đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy dư thừa thực vật có trong đất (Kredics và cộng sự, 2003). Theo Klein và Eveleigh (1998), nấm Trichoderma spp. hiện diện khắp nơi, sống hoại sinh và có khả năng phân hủy nhanh các chất hữu cơ trong tự nhiên. Khả năng phân hủy cellulose của nấm Trichoderma spp. bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: ẩm độ, độ thoáng khí, pH, hàm lượng nitrogen (Alexander, 1962). Chế phẩm nấm Trichoderma spp. được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ. Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng. Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% 16
30. Đồ án tốt nghiệp phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46%. Khi bón 100% phân hữu cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ (Lưu Hồng Mẫn và cộng sự, 2001). 2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 2.5.1. Bã mía Bã mía chiếm 25 – 30% trọng lượng mía đem ép.Thành phần trung bình của bã mía: - Nước: khoảng 40 – 50%. - Xơ: khoảng 45 – 48% (trong đó 45–55% là cellulose). - Chất hoà tan (đường): 2,5%. Tùy theo loại mía và đặc điểm nơi trồng mía mà thành phần hoá học các chất Hình 2.7. Bã mía có trong bã mía khô (xơ) có thể biến đổi. Thành phần của bã mía sau khi rửa sạch và sấy khô gồm: cenlulose khoảng 45 – 55%, hemicellulose khoảng 20 – 25%, lignin khoảng 18 – 24 %, tro 1 – 4%, sáp: <1%, 2.5.2. Cám gạo (Nguyễn Bá Phương Thảo, 2009) Cám gạo là sản phẩm phụ của quá trình xay xát và chế biến gạo. Cám gạo có giá trị khá cao. Cám được thu hồi dưới 2 dạng là cám khô và cám ướt. Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm khoảng 10 – 12% khối lượng lúa chưa xay xát. Cám gạo thường được cho các loại gia súc và thủy sản ăn chứ Hình 2.8. Cám gạo không cho người. Nguyên nhân là do 17
31. Đồ án tốt nghiệp cám gạo có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh mẽ sẽ oxy hóa các nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó chịu. Thêm vào đó công nghệ xay xát gạo chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá). Vì lý do này mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng làm thức ăn cho các loại gia súc, gia cầm. Hằng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu tấn cám được sản xuất và 90% là nằm ở châu Á. Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo Thành phần Khối lượng/100g Calori 316 KJ Tổng số lipid 21 g Chất béo bão hòa 4 g Chất xơ tiêu hóa được 21 g Carbohydrat 28 g Đường 0,9 g Protein 13,3 g Vitamin E 4,9 g Vitamin B6 4,1 mg Canxi 47 mg ( Theo bảng 2.1, cám có lượng dinh dưỡng rất cao và lượng chất béo chưa bão hòa cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, canxi đều rất cao, ngoài ra trong cám còn chứa chất béo omega 3 khá cao; 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám, thành phần của cám có nhiều loại vitamin và chất béo tốt, lại cân đối với nhiều chất xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho cả con người. 18
32. Đồ án tốt nghiệp 2.6. Phương pháp lên men bề mặt (Trần Anh Đào, 2012) Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện theo phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp này phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống.  Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt (Trần Anh Đào, 2012) Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy này là: - Nuôi cấy dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme tạo ra từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng để giải thích tại sao nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. - Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa ít tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ vẫn rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy, những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Phương pháp nuôi cấy bề mặt có những nhược điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất là khá tốn nhiều diện tích nuôi cấy, phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt của môi trường (môi trường lỏng hoặc bán rắn) nên cần nhiều diện tích. 19
33. Đồ án tốt nghiệp  Phương pháp lên men bề mặt và thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma koningii Đây là quá trình vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (bã mía, cám gạo) được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng nước từ 30 – 70% phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cơ chất và thế nước tối thiểu cần cho sự phát triển của vi sinh vật) (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013). T. koningii phát triển trên môi trường chất dinh dưỡng dạng rắn (môi trường rắn trước khi nuôi cấy nấm mốc cần làm ẩm trước). Để môi trường không bị bết dính trong khi hấp chín cần bổ sung một số chất dinh dưỡng khác. Sau khi hấp môi trường được làm nguội 30 – 400C, sau đó cấy vi sinh vật vào, trộn đều và nuôi ở nhiệt độ 28 – 300C trong 35 – 48 giờ, trong phòng thí nghiệm vô trùng có độ ẩm không khí 80 – 90% (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013). Nấm khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxy của không khí để hô hấp. Để đảm bảo nấm mốc mọc đều trên bề mặt của môi trường và sử dụng nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh enzyme, lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày khoảng từ 2 – 5 cm (Lương Đức Phẩm, 1998). Sau khi nuôi đủ thời gian để T. koningii tổng hợp enzyme, thu lấy môi trường và sấy nhẹ ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8 – 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ, thủy tinh hay túi PE. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzyme thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế (Đông Thị Thanh Thu, 1995). 2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013) Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào. Do đó để có thể chiết rút enzyme nội bào trước hết cần phải phá vỡ cấu trúc của tế bào. Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoặc đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) bằng tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butanol, acetone, glycerin) của sóng siêu âm. 20
34. Đồ án tốt nghiệp Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách phải hết sức lưu ý: Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài. Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là việc rất khó khăn. Enzyme là chất hữu cơ không bền, rất dễ bị biến tính khi chịu các tác động bên ngoài. Enzyme là protein mà protein enzyme luôn luôn đi cùng với những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống nhau. Do đó việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định. Đa số ngành sản xuất thực phẩm cũng như công nghiệp nhẹ thì lại đòi hỏi phải dùng enzyme sạch. Để tách chiết enzyme từ môi trường rắn, thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó nước được sử dụng rộng rãi và cho kết quả tốt nhất. Các enzyme được chuyển từ tế bào vào nước do sự chênh lệch nồng độ. Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzyme được cô đặc dưới áp suất thấp sao cho hàm lượng chất khô không nhỏ hơn 50 – 55%. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước, có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong dịch chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 280C. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống còn 10 – 120C. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ những thành phần tạp cần thực hiện nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường sử dụng biện pháp thẩm tích đối với nước hay các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau. Phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi 21
35. Đồ án tốt nghiệp hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. 2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase (Uhlig Helmut, 1998) Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase Đo hoạt tính Cơ chất Phương pháp xác định Giấy lọc Tổng hoạt tính cellulase (C1) Avicel Glucose Solkafloc Giấy lọc Giảm trọng lượng Hoạt tính hòa tan Avicel Đo mật độ quang Cellulose azur Đo mật độ quang CMC, HEC, Cellulase Đường khử Endoglucanase được tẩm H3PO4 Giảm độ nhớt Exoglucanase Avicel, giấy lọc Đường khử Β-glucosidase Cellobiose Glucose Wood và McCrae (1972) đã chứng minh rằng hoạt tính exoglucanase (được tinh chế) có khả năng phân cắt mạnh cellulose (được xử lý với acid phosphoric) nhưng hoạt động trên CMC rất chậm. Sản phẩm phần lớn là cellobiose (95%). Endoglcanase (EC 3.2.1.4) phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucosid ngay ở vùng trong của chuỗi cellulose được xử lý với acid phosphoric và cũng phân cắt các dẫn xuất của cellulose như CMC và HEC (hydroxyethyl cellulose). Vì bản chất của cơ chất lẫn enzyme đều phức tạp, nên việc phân tích hoạt tính cellulase cũng không đơn giản. Cellulase thu nhận được từ các vi sinh vật khác nhau cho thấy có rất nhiều dữ liệu khác nhau. Thành phần của enzyme từ cùng một chủng vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào phương pháp lên men, thành phần môi trường và các điều kiện lên men. 22
36. Đồ án tốt nghiệp Cơ chất để phân tích hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase là cellulose tinh thể không tan như Avicel, Solkafloc và đặc biệt là giấy lọc. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các cơ chất này rất khó, vì bản chất đại phân tử như mức độ polymer hóa, mức độ tinh thể, mức độ tinh sạch và nguồn gốc của cơ chất; tất cả đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Các cơ chất phân tử nhỏ như p-nitrophenyl-β-glucoside, cellobiose hoặc oligocellulodextrin là cơ chất lý tưởng để chuẩn hóa việc phân tích hoạt tính cellulose. Tuy nhiên, các cơ chất này không thích hợp cho hoạt động phối hợp của cả hệ cellulase mà chỉ thích hợp cho β-glucosidase. 2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase (hoạt tính giấy lọc) Hoạt tính giấy lọc được định nghĩa là lượng đường được tạo ra khi ủ giấy lọc Whatman No. 1 (50 mg) với 0,5 ml dung dịch enzyme ở pH 4,8 (đệm Na-citrate) trong một giờ với tổng thể tích 1,5 ml. Vì phản ứng xác định hoạt tính FPU không tuyến tính, phản ứng tuyến tính là phản ứng mà sản phẩm tạo ra tỷ lệ thuận với lượng enzyme trong mỗi phút của phản ứng, nên enzyme phải được pha loãng đến nồng độ mà có thể thủy phân giấy lọc sinh ra 2 mg đường khử/giờ. 2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase Cơ chất ở đây là dẫn xuất của cellulose hòa tan trong nước như CMC hoặc HEC được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, phương pháp này không xác định hoạt tính cellulase thực sự mong muốn mà chỉ xác định hoạt tính endoglucanase là chính. Phân tích hoạt tính endoglucanase bằng cách đo lượng đường khử tạo ra sau phản ứng thủy phân cơ chất CMC hay HEC bằng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid hoặc thuốc thử Nelson – Somogy hoặc sử dụng ferric cyanide theo phương pháp của Wood và McCrae (1972). 23
37. Đồ án tốt nghiệp 2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel 2.9.1. Bản chất của phương pháp (Phan Thị Ánh Nhung, 2011) Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử. Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel (  Một số thông số vật lý của phương pháp  Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G-75 có FR từ 30.000 – 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel.  Phạm vi tách (fractionation range): Thí dụ, sephadex G-75 có FR từ 30.000 – 80.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G-75.  Độ ngậm nước (water regain): là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hấp thụ vào. Thí dụ G-50 có WR là 5,0 ± 0,3g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng để tính thể tích của cột.  Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trương nở trong nước. G-50 có thể tích nền 9 – 11 ml/g gel khô. 24
38. Đồ án tốt nghiệp  Hạt gel (gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo µm. Hạt có kích thước lớn (50 – 100 mesh, 100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 – 40 µm) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, hiệu quả tách cũng không tốt. Các hạt gel có kích thước 100 – 200 mesh (50 - 150 µm) thường được chọn.  Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons.  Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi cột. 2.9.2. Đặc tính của gel (Trần Lương Hồng Yến, 2012) Có 4 loại gel thường được sử dụng.  Dextran: có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB (Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Saphadex. Giới hạn tách của gel dextran – 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N, N’ – methylenebisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia – LKB cung cấp).  Gel polyacrylamide: tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và N, N’ – methylenebisacrylamide (Bio-Rad cung cấp, Bio-gel – P là tên thương hiệu).  Gel agarose: là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thương mại là Bio-gel A, còn Pharmacia cung cấp với tên thương mại là sepharose và seperose. 25
39. Đồ án tốt nghiệp Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách. 2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide (Trần Linh Thước, 2003) Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrymide và N, N’ – methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammonium persulfate (APS), N, N, N’, N’-Tetramethyl ethylenediamine (TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis- acrylamide. Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiothreitol (DTT). Với tác nhân này, protein có cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, cần so sánh với một thang phân tử chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuos gel). Trong phương pháp này gel gồm hai lớp: 26
40. Đồ án tốt nghiệp - Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): các protein trong mẫu được dồn lại và trong một lớp băng mỏng. - Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này được phân biệt nhau dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kỹ thuật SDS – PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 – 20.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%. Ngoài kỹ thuật SDS – PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein, (Denaturing condition), người ta dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính protein như tạo liên kết giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng giữa những protein khác, người ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelctic focusing gel electrophoresis). 27
41. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện nghiên cứu từ 16/05/2015 đến 16/08/2015 ở phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thuộc trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Nguồn vi sinh vật Giống nấm mốc Trichoderma koningii được cung cấp bởi phòng vi sinh ứng dụng – Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh. 3.2.2. Cơ chất Bã mía được phơi khô, cắt nhỏ và cám gạo do Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. 3.2.3. Hóa chất Các hóa chất dùng để chuẩn bị môi trường giữ giống và bổ sung vào môi trường lên men bán rắn gồm: (NH4)2SO4, K2HPO4, urea, glucose, peptone, CaCl2, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CoCl2 của Trung Quốc sản xuất. Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm: CH3COONa.3H2O, CH3COOH. Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme: glucose (Trung Quốc), CMC, giấy lọc, thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid). Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng protein: albumine, thuốc thử Bradford (Coomassie Brilliant Blue, Ethanol 960, Acid phosphoric 85%). Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di: Sodium dodecyl sulphate, ammonium persulfate, bromophenol blue, N,N,N’,N’-Tetramethyl ethylenediamine (C6H16N2-TEMED), acrylamide/bisacrylamide, β-mercaptoethanol, thang phân tử lượng nhỏ (sigma) glycerol, glycine (C2H5O2N). 28
42. Đồ án tốt nghiệp Cách pha một số thuốc thử: - Dung dịch đệm acetate 0,05 M pH 5: dung dịch acid acetic 0,05 M hút 2,91 ml acid acetic định mức tới 1000 ml. Cân 4,1 g natri acetate định mức tới 1000 ml, chỉnh pH bằng máy đo pH. - Dung dịch thuốc thử lugol: cân đúng 2 g KI hòa tan trong khoảng 100 ml nước cất. Nghiền 1 g tinh thể iode trong cối và thêm 50 – 100 ml nước cất. Cho dung dịch iode vào dung dịch KI khuấy cho tan hoàn toàn rồi thêm nước cất đến 300 ml. - Dung dịch thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic): + Cân 10 g DNS cho vào beaker 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt cốc vào chậu nước 800C và khuấy đều. + Hòa tan 16 g NaOH trong 150 ml nước cất. Thêm dung dịch NaOH từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C. + Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800C. + Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng sau đó chuyển dung dịch vào bình định mức 1000 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp. - Dung dịch CMC (1%): cân 10 g CMC hòa tan với 800 ml nước cất, tiếp tục cho vào 100 ml acid acetic 1 M. Điều chỉnh pH 5 với NaOH 1N. Định mức với nước cất 1000 ml. 3.3. Thiết bị và dụng cụ 3.3.1. Thiết bị - Autoclave (Memmert – Đức). - Máy đo quang phổ kế UV – Vis 2500. - Kính hiển vi quang học Nikon. - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Tủ cấy vô trùng. - Tủ mát Alaska. - Bể ủ nhiệt Memmert. 29
43. Đồ án tốt nghiệp - Tủ sấy (Memmert – Đức). - Máy ly tâm. - Máy đo pH. - Bộ điện di đứng. - Hệ thống máy sắc ký cột áp suất thấp BIO-RAD BioLogic. - Bếp điện, bếp từ. - Máy nước cất. 3.3.2. Dụng cụ - Đĩa petri. - Cốc thủy tinh 100 ml, 200 ml, 1000 ml. - Erlen 100 ml, 250 ml, 500 ml. - Ống đong 50 ml, 100 ml, 500 ml. - Pipet thủy tinh 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml. - Pipetman 100 – 1000 µl. Đầu típ. - Ống ly tâm. - Que cấy, que gắp. - Đũa thủy tinh. - Giá đỡ ống nghiệm. - Đèn cồn. - Bình định mức. - Bóp cao su - Bông thấm nước. - Bông không thấm nước - Lamlle, lamelle. - Buồng đếm hồng cầu. - Phễu, giấy lọc. - Bao nilon hấp, dây thun. - Giấy gói, 30
44. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Môi trường  Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men bán rắn). Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek Thành phần Hàm lượng NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g (NH4)2SO4 30 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4 0,01 g Saccaroza 30 g Nước 1000 ml 3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất Tiến hành theo nguyên tắc: áp dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng sản phẩm không đổi. Sử dụng tủ sấy: - Tiến hành: sấy 3 cốc sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C đến trọng lượng không đổi, dùng cân phân tích cân xác định trọng lượng cốc cân 0 (g). Cho vào mỗi cốc 2 g cơ chất, đem cân phân tích, ghi nhận khối lượng, khi đó tổng khối lượng cốc và mẫu 1 (g). - Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 30 phút trong bình hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy. Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu các lần sấy không thay đổi. Ghi nhận khối lượng 2 (g). Kết quả tính độ ẩm: ( − ) × 100 W = 1 2 1− 0 31
45. Đồ án tốt nghiệp Trong đó: 0: khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi. 1: khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy 2: khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi. 3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy (Karimi, 2009) Công thức tính lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường: × ( − ) F = 100 − Trong đó: A: khối lượng cơ chất nuôi cấy (g) B: độ ẩm môi trường mình cần (%) C: độ ẩm trong cơ chất A (%) F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml) 100: độ ẩm 100%. Ví dụ: 20 g cơ chất có độ ẩm khoảng 10% nhưng cần đạt độ ẩm 50%. 20 × (50 − 10) Từ công thức trên suy ra: F = = 16 ml 100 − 50 Như vậy cần bổ sung thêm 16 ml nước cất sẽ được độ ẩm là 50%. 3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii Cấy chuyển giữ giống và nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii trên môi trường bán rắn nhằm thu nhận enzyme cellulase phục vụ cho quá trình nghiên cứu. 3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA  Mục đích: ổn định giống.  Chuẩn bị: Môi trường giữ giống PGA gồm có: khoai tây 200 g, glucose 20 g, agar 20 g, nước cất 1000 ml, pH môi trường là 6,5. Khoai tây sau khi gọt vỏ, rửa sạch, cắt miếng nhỏ cho vào cốc, cho nước cất vào nấu đến khi khoai tây chín mềm trong khoảng 30 phút sau đó đem ra để nguội rồi lọc chiết lấy nước. Cho agar vào và tiếp tục nấu, trong quá trình nấu phải khuấy đều, cuối cùng cho glucose vào và khuấy cho tan hết. 32
46. Đồ án tốt nghiệp Cho môi trường vào 1/4 các ống nghiệm, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút, sau đó xếp nghiêng các ống nghiệm, để nguội tạo môi trường thạch nghiêng. Mặt thạch không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm.  Thao tác thực hiện: Dùng que cấy móc đã khử trùng, lấy một ít bào tử từ ống giống cấy nhẹ nhàng lên bề mặt thạch nghiêng được chuẩn bị ở trên theo hình ziczăc. Sau 2 ngày ở nhiệt độ phòng, bào tử nấm phát triển và mọc đều, các ống nghiệm giữ giống sẽ được cấy sang môi trường giữ giống cấp 2 (môi trường lúa) hoặc được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 90C để sử dụng cho các thí nghiệm về sau. Tất cả các thao tác trên đều được thực hiện trong điều kiện vô trùng. 3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa  Mục đích: nhằm tạo giống tốt hơn, bảo quản được lâu hơn và chuẩn bị giống, đảm bảo lượng giống cho việc nuôi cấy trên môi trường bán rắn.  Chuẩn bị: Lấy 40 g lúa cho đều vào 2 bình tam giác 500 ml, bổ sung môi trường khoáng tối ưu và nước sao cho độ ẩm môi trường đạt 50%, hấp thanh trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút. Môi trường lúa sau khi nguội sẽ được cấy mốc giống từ môi trường thạch nghiêng vào. Lượng khoáng bổ sung vào môi trường được tính theo công thức đã được trình bày ở phần 3.5.2.  Thao tác thực hiện: Dùng pipet hút 2 ml nước cất vô trùng cho vào ống thạch nghiêng chứa giống, dùng que cấy cạo lớp sinh khối, sau đó chuyển dịch chứa sinh khối sang bình môi trường lúa. Trộn đều, đậy nút bông lại, bao gói, ủ ở nhiệt độ 300C. Các thao tác cấy phải tiến hành gần ngọn đèn cồn, dụng cụ phải vô trùng bằng cồn 700. Sau khi cấy 2 – 3 ngày, quan sát thấy nấm mốc mọc đều và bao phủ kín bề mặt các hạt lúa thì được đem bảo quản ở 40C trong tủ lạnh. 33
47. Đồ án tốt nghiệp 3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase (Raimbault, 1998), (Tolan, 1999)  Mục đích: tạo môi trường dinh dưỡng tối ưu nhất cho nấm mốc phát triển để thu nhận enzyme hiệu quả nhất.  Chuẩn bị: Phối trộn bã mía với cám gạo (BM:CG) theo các tỷ lệ khối lượng cần khảo sát. Cơ chất được chứa trong các erlen có dung tích 250 ml và được làm ẩm bằng nước có bổ sung môi trường dinh dưỡng Czapek (lượng nước và khoáng bổ sung được tính theo công thức đã trình bày ở phần 3.5.2). Điều chỉnh theo độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống. Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1 atm trong 20 phút, làm nguội.  Thao tác thực hiện: Cho nước cất vô trùng từ bình erlen vào bình môi trường lúa sao cho vừa ngập hết cơ chất, lắc đều, dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy đều (để bào tử nấm mốc tách khỏi môi trường lúa) để có huyền phù. Dùng pipet hút dung dịch chứa nấm mốc trong bình môi trường lúa vào bình môi trường bán rắn, khuấy đều, đậy nút bông lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp sẽ trích ly thu nhận enzyme. Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme, nấm mốc được nuôi trên môi trường có tỷ lệ bã mía và cám gạo khác nhau (2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3), độ ẩm môi trường ban đầu từ 45 – 65%, pH ban đầu từ 4 – 8, nồng độ dung dịch dinh dưỡng từ không bổ sung đến nồng độ gấp 0,5 – 3 lần nồng độ chuẩn (NĐC), thời gian nuôi cấy từ 8 – 112 giờ, tỷ lệ giống từ 0,5x107 – 3x107 bào tử/môi trường. 34
48. Đồ án tốt nghiệp 3.5.4. Phương pháp mô tả hình thái T. koningii (Trần Linh Thước, 2003) Thí nghiệm quan sát hình thái nhằm khẳng định lại các đặc điểm khuẩn lạc của chúng trên môi trường PGA, hình thái vi thể và các đặc tính các chủng vi nấm.  Quan sát đại thể Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ trên bào tử đính của nấm mốc, chuyển sang đĩa petri chứa môi trường PGA đã hấp vô trùng, cắm đầu móc xuống mặt thạch thành 3 điểm. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3 – 7 ngày. Quan sát khuẩn lạc của nấm mốc (hình dạng và màu sắc).  Quan sát vi thể Để quan sát thấy hình dạng của vi nấm trước tiên ta phải nuôi cấy buồng ẩm. Chuẩn bị 5 đĩa petri có giấy thấm nước vừa đĩa petri đặt ở đáy đĩa, trên giấy đặt một miếng lamlle và một miếng lamelle, ta đem hấp khử trùng cùng với nước cất, môi trường 50 ml môi trường PGA, 1 đĩa petri sạch. Sau khi hấp khử trùng xong, trong tủ cấy vô trùng dưới ngọn đèn cồn đổ môi trường PGA vào đĩa petri, chờ cho môi trường PGA trong đĩa nguội và đặc lại. Sau đó ta dùng dao có mũi nhọn được khử trùng dưới ngọn đèn cồn, ta cắt và chia đều thạch PGA trong đĩa thành miếng vuông có kích thước 1,5 x 1,5 cm. Cho miếng thạch vuông lên miếng lamlle trong đĩa petri đã chuẩn bị sẵn, sau đó dùng que cấy móc lần lượt cấy giống trong thạch nghiêng môi trường PGA lên 4 góc của miếng thạch vuông. Tiếp đó dùng lamelle đặt lên trên mặt thạch vừa cấy mẫu, rồi cho vài giọt nước cất vô trùng lên miếng giấy thấm nước đặt ở đáy đĩa, đậy nắp đĩa petri lại để ở nhiệt độ phòng. Chờ sau 24 – 48 giờ lấy miếng lamelle ra khỏi đĩa petri. Nhỏ vài giọt cồn 960 lên lamelle, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho vài giọt NaOH 10%, đậy lá kính lên và quan sát dưới kính hiển vi (vật kính 40X) cuống sinh bào tử đính và ti thể. Mục đích của việc trên là tăng khả năng thấm nước của sợi nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm và làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát. 35
49. Đồ án tốt nghiệp 3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê Duy Linh và cộng sự, 1997) Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc). Các loại buồng đếm hồng cầu thường được sử dụng: buồng đếm Thomas và buồng đếm Goriep. Nguyên tắc cấu tạo của hai loại buồng đếm này đều giống nhau. Đó là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành ba khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành hai khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô lớn có diện tích là 1/25 mm2 lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 0,1 mm. Như vậy thể tích của một ô nhỏ là 1/400 mm2 x 0,1 mm = 1/4000 mm3 hay 1/4000000 ml. 3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô  Mục đích: tách dịch enzyme thô từ môi trường bán rắn.  Nguyên tắc: dùng nước cất để hòa tan enzyme trong sinh khối nuôi cấy để thu được dung dịch có chứa enzyme ta gọi là enzyme thô.  Thao tác thực hiện: Sau thời gian nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, cân lấy 10 g canh trường. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy bằng máy khuấy với tốc độ 600 vòng/phút trong vòng 30 – 45 phút, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút để loại bỏ tạp chất và thu dịch. Dịch chiết enzyme thô để mát ở nhiệt độ 40C. 3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose CMC là cacbonxylmethylcellulose các đơn vị glucose liên tiếp với nhau bằng liên kết 1-4-β glucose được sử dụng như một phần nguồn cacbon. Ta tiến hành pha môi trường và chuẩn bị đĩa petri hấp khử trùng cùng với môi trường. Sau đó tiến hành đổ đĩa trong tủ cấy vô trùng. Chờ môi trường nguội tiến hành cấy giống. Ủ ở nhiệt độ phòng và sau 48 giờ tiến hành nhỏ lugol đo đường kính phân giải CMC. Tiến hành pha môi trường CMC – agar trong nước cất. Cân 2 g CMC thêm nước cất thành 200 ml môi trường, tiến hành đổ khoảng 18 đĩa môi trường. Sau khi 36
50. Đồ án tốt nghiệp môi trường nguội ta tiến hành đục mỗi đĩa 3 lỗ. Sau thời gian trích ly, chuẩn bị đĩa thạch và nhỏ dịch enzyme vào lỗ thạch. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt lugol vào đĩa petri và quan sát vòng phân giải CMC. Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật Hóa chất Hàm lượng NaNO3 0,4 g K2HPO4 0,2 g MgSO4 0,1 g KCl 0,1 g CMC 1 g Pepton 0,04 g Agar 2,5 g Nước cất 200 ml Sau khi hấp đĩa và môi trường xong tiến hành đổ 5 đĩa. Đợi môi trường nguội tiến hành cấy điểm. Sau 24 – 48 giờ, nhỏ thuốc thử lugol lên và đo đường kính vòng phân giải. 3.5.8. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (Đinh Hoàng Yến, 2012) Nguyên lý của phương pháp Bradford là dựa vào sự thay đổi giữa 3 trạng thái tồn tại của Coomassie Blue G: cation (màu đỏ), trung tính (màu xanh lá cây) và anion (màu xanh da trời). Dưới điều kiện acid mạnh, Coomassie Blue G chủ yếu tồn tại ở trạng thái bị proton hoá do bị gắn 2 H+ hoặc còn gọi là cation có màu đỏ. Ở trạng thái này Coomassie Blue G có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 470 nm. Tuy nhiên, khi gắn với protein, nó chuyển sang dạng ổn định ở trạng thái không bị proton hoá hay còn gọi là anion và có màu xanh da trời. Trong quá trình phản ứng tạo phức với protein có 2 dạng tương tác hoá học xảy ra. Dạng cation (màu đỏ) chuyển các điện tử tự do của nó vào các nhóm có thể ion hoá có trong phân tử protein dẫn đến việc bộc lộ một số vùng kị nước trong phân tử protein. Những vùng này sẽ phản ứng với vùng 37
51. Đồ án tốt nghiệp không phân cực của Coomassie Blue G thông qua lực van der Waals (giữa các nhóm amin mang điện tích dương và nhóm mang điện tích âm của chất màu ở khoảng cách rất gần nhau). Liên kết này đồng thời cũng được giữ ổn định thêm bởi sự tương tác ion giữa 2 nhóm này. Độ hấp thụ ánh sáng tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu. Hàm lượng protein có trong mẫu sẽ được xác định dựa vào đường chuẩn albumin.  Hóa chất Dịch chiết enzyme cellulase đã thu cần xác định hàm lượng protein. Dung dịch albumine 1 mg/ml: cân chính xác 10 g albumine pha trong 1 ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở 200C, khi dùng thì pha loãng 100 lần để có được dung dịch albumine có nồng độ 0,1 mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford gồm: Coomassie brilliant blue (CBB: 0,005 g), 0 Ethanol 96 : 50 ml, Acid phosphoric (H3PO4) 85%: 42,5 g. Phẩm màu coomassie brilliant blue được làm tan bằng ethanol trong chai màu tối có nắp đậy kín có bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 500 ml bằng nước cất.  Thiết bị: Máy đo quang phổ UV – Vis.  Dựng đường chuẩn Albumine Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, cần xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Dung dịch protein chuẩn dùng trong phòng thí nghiệm là bovine serum albumine. Để dung dịch albumine chuẩn có các nồng độ từ 10 – 50 µg/ml, cần thực hiện như bảng 3.3. 38
52. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Thể tích Albumine chuẩn (ml) 0 1 1 1 1 1 Nước (ml) 1 0 0 0 0 0 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2  Tính kết quả Tiến hành đo trị số mật độ quang (OD) cho các dung dịch trong các ống nghiệm ở bước sóng 595 nm. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 – 5 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein.  Xác định nồng độ protein của mẫu Dịch chiết enzyme thô của chủng nấm mốc cũng được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, sau đó dựa vào đường chuẩn để tính ra lượng protein trong mẫu thí nghiệm (g/ml).  Công thức xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Hàm lượng protein (mg/g) = (X × V × f × 10-3)/m. Trong đó: X: hàm lượng protein trong mẫu dựa vào phương trình đường chuẩn (µg/ml). 10-3: hệ số chuyển đổi từ g sang mg. V: thể tích dịch chiết enzyme thu được (ml). f: là hệ số pha loãng. m: khối lượng cơ chất tiến hành tách chiết enzyme (g). 39
53. Đồ án tốt nghiệp 3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) (Pitt và Hocking, 1997)  Nguyên tắc Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 400C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với 2-hydroxy-3,5- dinitrosalicylic acid (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm. Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme sẽ giải phóng đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng thực nghiệm.  Hóa chất Tiến hành pha dung dịch đệm: pha 1000 ml nước cất với 4,1 g acid acetic (CH3COOH), chuẩn độ tới pH 5 (dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N) để có được dung dịch đệm CH3COONa 50 mM, pH 5. Tiến hành pha dung dịch cơ chất CMC 1% w/v: cân chính xác 1 g CMC, hòa tan trong 100 ml dung dịch đệm Na – acetate (CH3COONa) 50 mM, pH 5, đun đến khi CMC tan hết, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm cho đến vạch 100 ml và lắc đều để được dung dịch đệm CMC 1%. Tiến hành pha dung dịch 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS): cân 10 g DNS cho vào becher 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt becher trong chậu nước 800C và khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16 g NaOH trong 150 ml nước cất), từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C. Tiếp tục thêm 300 g potassium sodium tartrate tetrhydate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800C. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp. Hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch 100 ml và lắc đều. 40
54. Đồ án tốt nghiệp  Xây dựng đường chuẩn glucose Việc dựng đường chuẩn glucose được thực hiện như bảng 3.4. Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose trên cơ chất CMC Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 (mg/ml) Thể tích dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 (mg/ml) Thể tích dd CMC 1 1 1 1 1 1 1 1% (ml) Thể tích dd DNS- 2 2 2 2 2 2 2 lactose (ml) Thể tích nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 (ml) Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm.  Tiến hành phản ứng Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật, 1ml dung dịch enzyme đã đun sôi làm mất hoạt tính đối với ống đối chứng mẫu và 1 ml nước cất làm ống đối chứng. Đặt 3 ống nghiệm vào bể ổn nhiệt ở 400C/5 phút. Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào 2 ống nghiệm (ống mẫu và đối chứng mẫu) sau đó lắc đều. Phản ứng ở 400C trong thời gian chính xác 10 phút. Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose vào 3 ống nghiệm, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống đối chứng. Đun sôi cách thủy 3 ống nghiệm trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong 1 chậu nước mát. So màu ở bước sóng 540 nm dựa theo đường glucose chuẩn trên máy đo quang phổ UV – Vis. 41
55. Đồ án tốt nghiệp Công thức xác định hoạt tính enzyme CMCase: 0,1 0,2 0,3 0,6 ( ⁄ + ⁄ + ⁄ + + ⁄ ) Giá trị F = 0,1 0,2 0,3 0,6 6 ( − ) × 1000 × 퐹 CMCase (U/g) = 180 × 10 ℎú푡 × 1 푙 × Trong đó: : độ hấp thu của dung dịch phản ứng enzyme. : độ hấp thu của dung dịch không có phản ứng enzyme. F: yếu tố glucose (mg/ml). 1000: chuyển mg thành µg. 180: phân tử lượng của glucose monohydrate, chuyển thành µmol. 10: thời gian phản ứng (phút). 1: thể tích dung dịch enzyme (ml). C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase Đối chứng Mẫu không phản ứng Mẫu thí nghiệm 1 ml enzyme 1 ml đệm 1 ml enzyme (đun sôi 5 phút) 2 ml thuốc thử 1 ml CMC 2 ml thuốc thử DNS-lactose DNS-lactose (ủ 400C trong 10 phút) 1 ml CMC 1 ml CMC 2 ml thuốc thử DNS-lactose Đun sôi cách thủy 15 phút, làm nguội, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm 3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase T. koningii sau khi được nhân giống trên môi trường lúa được đưa sang môi trường bán rắn có cơ chất cảm ứng để tạo ra cellulase. Môi trường lên men bán rắn được điều chỉnh sao cho việc thu nhận enzyme là tốt nhất. Để biết được điều kiện nào tốt nhất phải tiến hành khảo sát các yếu tố sau. 42
56. Đồ án tốt nghiệp 3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất Độ ẩm môi trường ban đầu là 55%, pH ban đầu là 5, nhiệt độ nuôi cấy 300C, trong 40 giờ nuôi cấy. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy có tỷ lệ cơ chất BM:CG như bảng 3.6. Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất Tỷ lệ cơ chất BM:CG (g:g) Bã mía (g) Cám gạo (g) 2:8 2 8 3:7 3 7 4;6 4 6 5:5 5 5 6:4 6 4 7:3 7 3 Tổng khối lượng cơ chất trong mỗi bình là 10 g. Mỗi nghiệm thức tỷ lệ cơ chất lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT (bào tử/môi trường). Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra tỷ lệ cơ chất cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu Sau khi chọn ra được tỷ lệ BM:CG tốt nhất, cố định yếu tố này để khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường ban đầu. Khảo sát các độ ẩm như sau: 45%, 50%, 55%, 60%, 65% với pH ban đầu là 5, ở nhiệt độ 300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT. Cách xác định độ ẩm được thực hiện theo bảng 3.7. 43
57. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường Dung dịch dinh dưỡng cần Nghiệm thức Độ ẩm (%) bổ sung (ml) 1 45 6,07 2 50 7,67 3 55 9,64 4 60 12,09 5 65 15,25 Tổng khối lượng cơ chất trong mỗi bình là 10 g. Mỗi nghiệm thức độ ẩm ban đầu được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra độ ẩm ban đầu cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu tốt nhất. Cố định 2 yếu tố này để khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu. Khảo sát ở các pH ban đầu: pH 4, 5, 6, 7 và 8 với tỷ lệ cơ chất, độ ẩm ban đầu tốt nhất đã được chọn, ở nhiệt độ 300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT. Mỗi nghiệm thức pH ban đầu được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra pH ban đầu cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 44
58. Đồ án tốt nghiệp 3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng. Gọi x là nồng độ dinh dưỡng môi trường Czapek 100%, khảo sát các nồng độ 0, 0,5x, x, 1,5x, 2x, 2,5x, 3x. Bổ sung 7,67 ml dung dịch dinh dưỡng tương ứng với các nồng độ trên vào các bình tam giác chứa môi trường tỷ lệ cơ chất BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu tốt nhất đã được chọn, ở nhiệt độ 300C, trong 40 giờ nuôi cấy với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT. Thể tích dung dịch dinh dưỡng bổ sung vào bình tam giác được tính theo công thức tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy đã trình bày ở 3.5.2. Mỗi nghiệm thức nồng độ dinh dưỡng lặp lại 3 lần nên có 18 nghiệm thức. Sau thời gian 40 giờ, khi tơ trắng bao phủ toàn bộ trên bề mặt lớp cơ chất, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra nồng độ dinh dưỡng cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, nồng độ dinh dưỡng tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo sát thời gian nuôi cấy. Thời gian khảo sát như sau: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 96, 104, và 112 giờ với tỷ lệ giống là 107 bào tử/MT. Mỗi nghiệm thức thời gian lặp lại 3 lần nên có 42 nghiệm thức. Sau những khoảng thời gian nuôi cấy trên, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra thời gian nuôi cấy cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống Sau khi khảo sát và chọn ra được tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, nồng độ dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy tốt nhất. Cố định những yếu tố này để khảo sát tỷ lệ giống. Hòa 30 – 40 ml dung dịch nước muối sinh lý có chứa tween 80 0,1% 45
59. Đồ án tốt nghiệp vào bình giống cấp 2, khuấy trộn đều, đếm bào tử ở độ pha loãng 1000 lần. Sau khi tính được số bào tử trong 1 ml, nếu có nhiều hơn 107 bào tử/ml phải pha loãng để đạt được tỷ lệ 107 bào tử/ml dịch huyền phù bào tử. Sau đó cấy huyền phù bào tử giống cấp 2 vào các môi trường đã chuẩn bị ở trên với thể tích huyền phù bào tử lần lượt như sau: 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml và 3 ml tương ứng 0,5x107, 1x107, 1,5x107, 2x107, 2,5x107 và 3x107 bào tử. Mỗi yếu tố tỷ lệ giống lặp lại 3 lần nên có 18 nghiệm thức. Sau thời gian nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, cân lấy 10 g canh trường ở mỗi bình. Thêm nước cất với tỷ lệ canh trường và nước là 1:4. Tiến hành khuấy, lọc qua vải, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch enzyme, xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme để chọn ra tỷ lệ giống cho hàm lượng và hoạt tính enzyme cellulase cao nhất. 3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm (Nguyễn Cảnh, 1993) (N.X.ÊGÔROOV và Nguyễn Lân Dũng, 1976) Phương pháp quy hoạch thực nghiệm không chỉ cho phép nghiên cứu tác động đồng thời của nhiều yếu tố lên quá trình mà còn cho phép đánh giá một cách định lượng mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đó. Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ BM:CG, độ ẩm ban đầu, pH ban đầu, nồng độ dung dịch dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. koningii, xác định được thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy cơ sở được gọi là môi trường cơ sở cho chủng nấm mốc sinh trưởng và tạo ra cellulase. Từ môi trường cơ sở tiến hành tối ưu hóa các yếu tố trên. Quy hoạch thực nghiệmtheo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thực nghiệm là môi trường cơ sở đã xác định được. 46
60. Đồ án tốt nghiệp 3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme Loại dung môi tủa enzyme (tác nhân tủa) và tỷ lệ dung môi tủa enzyme là những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme. Dịch enzyme sau khi tác chiết được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng của dung môi tủa và tỷ lệ tủa enzyme. 3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa Tủa dịch enzyme bằng 2 loại dung môi là ethanol 960 lạnh và acetone lạnh theo các tỷ lệ như bảng 3.8. Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme Tỷ lệ dịch enzyme và dung môi Dịch enzyme Dung môi tủa (ml) (ml) (ml) 1:1 10 10 1:2 10 20 1:3 10 30 1:4 10 40 1:5 10 50 1:6 10 60 1:7 10 70 Mỗi nghiệm thức tỷ lệ được lặp lại 3 lần nên có 21 nghiệm thức. Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào erlen có thể tích 100 ml. Đặt erlen vào bình bercher chứa nước đá vụn. Khuấy nhẹ dung dịch enzyme trong erlen. Cho từ từ lượng dung môi tủa (ethanol, acetol) vào erlen. Khuấy tiếp đến 10 phút và giữ yên trong 30 phút ở môi trường lạnh. Sau đó ly tâm dịch ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa, hòa tan trong 5 ml dung dịch đệm acetate 50 mM, pH 5. Enzyme được bảo quản trong lọ ở nhiệt độ 40C. Tủa thu được với hai loại dung môi khác nhau được xác định hàm lượng protein và xác định hoạt tính CMCase nhằm chọn ra dung môi tủa enzyme tốt nhất cho quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase. 47
61. Đồ án tốt nghiệp 3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme Sau khi chọn ra được tỷ lệ tủa enzyme tốt nhất, so sánh 2 nghiệm thức có tỷ lệ tủa cho hoạt tính CMCase và hàm lượng protein cao nhất của 2 loại dung môi với nhau để chọn ra được loại dung môi nào tủa enzyme tốt nhất cho các thí nghiệm về sau. 3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase pH và nhiệt độ là các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. Mỗi enzyme có pH và nhiệt độ hoạt động thích hợp nhất định. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính CMCase là rất cần thiết. 3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase Mẫu enzyme được tủa bằng dung môi tốt nhất với tỷ lệ cho hoạt tính cao nhất được sử dụng cho thí nghiệm này. Tiến hành hút 5 ml dung dịch đệm acetate đã được chuẩn độ ở các mức pH 4, 5, 6, 7 và 8 hòa tan vào mẫu enzyme và được giữ ở nhiệt độ 400C. Mỗi yếu tố pH được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Chuẩn bị dung dịch CMC 1% được giữ ấm ở 400C trong bể ổn nhiệt. Tiến hành xác định hoạt tính enzyme cellulase để xác định được độ pH tốt nhất mà enzyme có thể hoạt động. 3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase Mẫu enzyme được tủa bằng dung môi tốt nhất với tỷ lệ cho hoạt tính cao nhất được sử dụng cho thí nghiệm này. Tiến hành hút 5 ml dung dịch đệm acetate ở pH tốt nhất cho hoạt động của enzyme, hòa tan vào mẫu enzyme và được giữ nhiệt ở 400C. Chuẩn bị dung dịch CMC 1% được giữ ấm ở 400C trong bể ổn nhiệt. Sau đó cho enzyme phản ứng ở các nhiệt độ là 30, 40, 50, 60 và 700C. Mỗi yếu tố nhiệt độ được lặp lại 3 lần nên có 15 nghiệm thức. Tiến hành xác định hoạt tính enzyme cellulase để chọn ra nhiệt độ tốt nhất mà enzyme có thể hoạt động. 3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô Cân 50 g canh trường với 200 ml nước cất, khuấy trong vòng 30 phút, tiếp tục lọc qua vải thô, thu dịch và ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch chiết, tiến hành hút chân không, điều chỉnh dịch enzyme vào 200 ml. Thu dịch chiết enzyme, xác đinh hoạt tính của dịch chiết enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm sau. 48
62. Đồ án tốt nghiệp 3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel 3.5.14.1. Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho các phân tử đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel. 3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ  Hóa chất Gel Sephadex G-75 có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 – 90 µm; khả năng ngậm nước là 12 ml/g gel khô; phạm vi phân tách là 30.000 – 80.000 Daltons. Đệm acetate có pH 5 phải khử bọt khí trước khi dùng.  Dụng cụ - Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad BioLogic - Phễu đổ gel - Flow adaptor 1,5 cm - Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50 x 1,5 cm - Thiết bị đuổi khí 3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm  Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký là enzyme được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm acetate có pH 5.  Chuẩn bị gel và nhồi cột Cân 10 g gel Sephadex G-75 khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm acetate pH 5 chứa trong cốc. Dùng dung dịch đệm acetate pH 5 với thể tích nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho vào cột sắc ký. Cụ thể ít nhất là 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn cản trở quá trình lọc gel. 49
63. Đồ án tốt nghiệp Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm vào làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel ra ngoài, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel. Khi cột đã được nạp đầy, khóa đầu ra lại và gắn adaptor vào. Chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm acetate pH 5 với lượng đệm bằng 2 – 3 lần thể tích cột. Sau khi cột ổn định, khóa đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel.  Quá trình nạp mẫu Tủa 10 ml dung dịch enzyme thô ủ lạnh với acetone, ly tâm thu cặn, pha với đệm cho đủ 2 ml, lấy 1 ml mẫu này để tinh sạch bằng sắc ký. Dùng xi lanh bơm mẫu vào hệ thống sắc ký. Sau khi mẫu thấm hết vào cột, nối cột với bình chứa dịch thổi cột. Khởi động cho máy chạy mẫu, mẫu tinh sạch sẽ hòa tan vào trong đệm acetate có pH 5 và đi ra các ống nghiệm hứng mẫu. Dựa vào sắc ký đồ hiển thị trên máy tính để xác định những ống nghiệm chứa enzyme có cùng trọng lượng phân tử.  Thu và xác định mẫu tách được Dịch thổi cột được ổn định ở tốc độ thích hợp, liên tục. Tốc độ thổi cột cao cho kết quả tách mẫu thấp và nếu tốc độ thổi cột quá thấp thì lại kéo dài thời gian tách mẫu, các peak bị hoãn ra cũng cho kết quả tách thấp. Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng đầu dò (detector). Độ hấp thụ được thể hiện trên máy tính dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP – Data View. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector). Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ được xác định hàm lượng protein và hoạt tính CMCase sau tinh sạch.  Xác định lượng protein và hoạt tính enzyme cellulase sau tinh sạch Thu dịch chứa enzyme cellulase đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp xác định hoạt tính carboxymethyl cellulase (CMCase) và hàm lượng protein. 50
64. Đồ án tốt nghiệp 2  Công thức tính hiệu suất tinh sạch: H % = × 100 1 Trong đó: H %: hiệu suất tinh sạch HT1: hoạt tính mẫu cellulase trước sắc ký (U). HT2: hoạt tính mẫu cellulase sau sắc ký (U). 2  Công thức tính hoạt tính riêng: HTR = (U/mg) 퐿1 Trong đó: HTR: hoạt tính riêng của mẫu sau sắc ký (U/mg) HT2: hoạt tính mẫu cellulase sau sắc ký (U). HL2: Hàm lượng protein của mẫu sau sắc ký (mg). 푅2  Công thức tính độ tinh sạch: ĐTS = 푅1 Trong đó: ĐTS: Độ tinh sạch của mẫu sau sắc ký. HTR2: Hoạt tính riêng của mẫu sau sắc ký (U/mg). HTR1: Hoạt tính riêng của mẫu trước sắc ký (U/mg). 3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide (Trần Linh Thước, 2003)  Nguyên tắc Điện di trên gel polyacrylamide làm tăng khả năng phân tách mẫu protein vì sự di chuyển của mẫu trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide; nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn; ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ, vì vậy chỉ có khả năng phân tách những phân tử sinh học có kích thước nhỏ. Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS – PAGE) là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS (sodium 51
65. Đồ án tốt nghiệp dodecyl sulfate), một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phần tử. Phương pháp này thường được sử dụng để xác định trọng lượng phân tử protein thành phần và độ tinh sạch của chế phẩm protein trong quá trình tinh chế. Trong kỹ thuật này, protein được xử lý bằng SDS và các tác nhân khử các cầu nối disulfate là mercatoethanol hoặc dithiothreitol (DTT). Với tác nhân này, protein cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein chỉ phụ thuộc kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định. Trong thực tế, để xác định phân tử lượng của một protein, cần phải so sánh với một phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Với mục đích đưa các protein trong mẫu về cùng một mẫu xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, có thể sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục gồm 2 lớp: - Lớp gel gom (stacking gel): các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. - Lớp gel phân tách (separating gel): tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.  Hóa chất Thang phân tử lượng nhỏ (sigma), gồm các protein chuẩn có kích thước (Daltons) xác định như sau: 209.000, 124.000, 80.000, 49.100, 34.800, 28.900, 20.600, 7.100. SDS 10%: cân chính xác 10 g SDS cho vào becher 100 ml, thêm vào 80 ml nước cất, khuấy đều, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch 100 ml và lắc đều. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 0,4% SDS; cân 36,3 g Tris pha trong 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch lên cho tới khi pH đạt 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều và giữ ở 40C. Dung dịch đệm gel gom (stacking gel buffer) Tris-HCl 0,5M, pH 6,8, 0,4% SDS; cân 6,8 g Tris pha trong 100 ml nước cất thêm dần HCl 6 N và khuấy dung dịch 52
66. Đồ án tốt nghiệp trên cho đến khi pH đạt 6,8. Hút 4 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100 ml, lắc đều và giữ ở 40C. Ammonium persulfate 10% (chỉ pha trước khi dùng): cân 0,1 g cho vào một eppendorf 1000 µl thêm 1 ml nước cất, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch điện di Tris-glycerine pH 8,3 (10X); 30 g Tris, 144 g glycine và 10 g SDS hòa trong 1000 ml nước cất. Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer); 2,5 ml dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; 4 ml dung dịch SDS 10%; 2 ml glycerol; 2 mg bromophenol blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml. Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625 g coomassie blue G 250, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 112,5 ml nước cất và 25 ml acid acetic đậm đặc, lắc đều, giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm, 30 ml methanol: 10 ml acid acetic; 60 ml nước cất.  Gel phân tách Chuẩn bị đổ gel có kích thước 100 x 100 x 0,75 mm có nồng độ acrylamide là 10%. Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml. Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách Thành phần Thể tích 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 – SDS 0,4% 2,5 ml Nước cất 4,445 ml TEMED 5 µl Ammonium persulfate 10% 50 µl Tổng thể tích 10 ml Sau khi cho ammonium persulfate vào, dùng pipette Pasteur hoặc micropipette bơm dung dịch vào khuôn đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao 7 cm. Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp gel vừa đổ để quá trình polymer hóa xảy ra, chờ gel đông. 53
67. Đồ án tốt nghiệp  Gel gom (stacking gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào một becher 50 ml khác theo bảng 3.10. Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom Thành phần Thể tích 40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) 0,5 ml Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 – SDS 0,4% 1 ml Nước cất 2,476 ml TEMED 4 µl Ammonium persulfate 10% 20 µl Tổng thể tích 10 ml Sau khi gel phân tách đã đông hoàn toàn (sau 25 – 30 phút), hút hết nước bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng piptte Pasteur hoặc micropipette bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu. Sau khi gel đông, lấy lược ra và lắp đĩa gel vào bộ điện di. Cho dung dịch điện di vào buồng điện di.  Xử lý mẫu Hút 30 µl mẫu trộn với 30 µl dung dịch nạp mẫu trong một eppendorf sạch, đậy nắp và lắc nhẹ, đều, đun sôi cách thủy 5 – 10 phút. Đối với thang phân tử lượng nhỏ, hút 2 µl vào eppendorf 1 ml chứa 8 µl nước cất vào 10 µl dung dịch nạp mẫu. Nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lượng protein trong một giếng không vượt quá 20 – 40 µg.  Tiến hành chạy điện di Dùng micropipette hút 10 µl mẫu được xử lý nạp vào các giếng (20 µl/giếng). Tiến hành chạy điện di với hiệu điện thế ổn định 100 V, cường độ dòng điện dao động cho phép từ 25 – 50 mA. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị (45 – 60 phút). Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Thay mới dung dịch giải nhuộm khi dung dịch này có màu tương đương với màu trong nền gel. 54
68. Đồ án tốt nghiệp Đo khoảng cách di chuyển của các protein trong thang chuẩn và trong các dịch enzyme cellulase. Đo khoảng cách di chuyển của phẩm màu bromophenol blue. Tính giá trị 푅 của từng protein trong thang chuẩn và các vạch protein trong các dung dịch enzyme cellulase. Công thức tính giá trị 푅 Khoảng cách di chuyển của protein 푅 = Khoảng cách di chuyển của phẩm mầu bromophenol blue Vẽ đồ thị thể hiện sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong thang chuẩn với 푅 . Từ giá trị 푅 xác định được, dựa vào đồ thị chuẩn đã vẽ, xác định trọng lượng phân tử của các vạch protein. 3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại. Số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel và phần mềm MSTATC, được phân tích biến lượng đơn yếu tố (one-way ANOVA) để đánh giá sự khác biệt và phân nhóm xếp hạng bằng trắc nghiệm Duncan’s test mức P ≤ 0,005. Sau khi thu nhận kết quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tiến hành nuôi cấy nấm mốc theo các yếu tố để hoạt tính cellulase tối ưu nhất để thu chế phẩm enzyme nhằm phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme về sau. Mục đích của quá trình này nhằm khảo sát từng thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase và quá trình tinh sạch sơ bộ enzyme. Qua kết quả từ các thí nghiệm, lấy kết quả trung bình để chọn ra thông số tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo và cũng chính là thông số tối ưu của quá trình nghiên cứu. 55