Đồ án Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hoá, phương pháp tăng sinh, phân lập và xác định hoạt tính của vi khuẩn

79 trang thiennha21 12/04/2022 7200

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hoá, phương pháp tăng sinh, phân lập và xác định hoạt tính của vi khuẩn", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_tim_hieu_ve_vi_khuan_nitrat_hoa_phuong_phap_tang_sinh.pdf

Nội dung text: Đồ án Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hoá, phương pháp tăng sinh, phân lập và xác định hoạt tính của vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU VỀ VI KHUẨN NITRAT HOÁ, PHƯƠNG PHÁP TĂNG SINH, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA VI KHUẨN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS: Huỳnh Văn Thành Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Hạnh Nguyên MSSV: 1191111033 Lớp: 11hsh02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Các chế phẩm vi sinh vật được sử dụng sẽ loại bỏ hàm lượng các chất C, N, P dư thừa trong nước theo các quá trình khác nhau như: tạo sinh khối tế bào vi sinh vật, oxy hoá các chất thành sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O, chuyển hoá Nitơ dạng hữu cơ và vô cơ thành dạng khí Nitơ thoát ra ngoài môi trường, tích tụ P trong cơ thể tế bào Quá trình loại bỏ Nitơ dư thừa trong nước hồ diễn ra chủ yếu bởi các quá trình amon hoá, nitrat hoá, phản nitrat hoá. Trong đó, nitrat hoá là quá + - - trình hiếu khí, đầu tiên NH4 oxy hoá thành nitrit NO2 , sau đó nitrit NO2 sẽ - chuyển hoá thành nitrat NO3 , các biến đổi này được thực hiện bởi 2 vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter. Tiếp đó nitrit, nitrat chuyển thành Nitơ phân tử phát tán vào trong không khí nhờ tác dụng của những vi khuẩn phản Nitrat hoá. Ngày nay, việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật để xử lý nước các hồ bị ô nhiễm được sử dụng ngày một phổ biến. Khác với phương pháp vật lý, hoá lý việc bổ sung các chế phẩm vi sinh vào trong hồ giúp tăng cường khả năng phục hồi và thúc đẩy quá trình tự làm sạch trong hệ sinh thái của hồ. Do vậy, đây là phương pháp có tính ổn định cao và là một hướng đi rất thân thiện với môi trường. Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ở nước ta đã phát triển không ngừng trong những năm gần đây và đang là ngành mũi nhọn trong việc thúc đẩy phát triển nền kinh tế của nước nhà, mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế cho đất nước, tạo ra nhiều công ăn việc làm cho người dân Tuy nhiên, bên cạnh những mặt tích cực ấy, thì còn rất nhiều công ty, nhà máy xí nghiệp chế biến thủy hải sản ở nước ta chưa có đầu tư và vận hành hệ thống xử lý nước thải; nước thải chế biến thủy sản được thải với lượng lớn ra ngoài môi trường, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, đặc biệt là môi trường nước. Chính vì vậy để khắc phục tình trạng ô nhiễm này đã có nhiều biện pháp xử lý khác nhau nhằm hạn chế và giảm bớt hàm lượng chất thải hữu cơ có chứa nitơ trong hệ thống xử lý nước thải trước khi nước được thải ra ngoài. Và phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là xử lý bằng phương pháp sinh học để xử lý nước thải chế biến thủy sản, với việc bổ sung vi sinh vật 1 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH được phân lập nuôi cấy từ bên ngoài vào hệ thống xử lý nước thải nhằm tăng cường hiệu quả xử lý trước khi nước được thải ra ngoài. Dựa vào điểm này, nên em đã quyết định chọn đề tài “Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hoá: Nitrosomonas và Nitrobacter, phương pháp tăng sinh, phân lập, xác định hoạt tính và ứng dụng của chúng trong việc xử lý nước thải” với mục đích là biết rõ hơn về vi khuẩn nitrat hoá, các quá trình tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa, khả năng xử lý nitơ từ các nguồn nước thải. 2. Tình hình nghiên cứu: 2.1 Trên thế giới: Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống thực hiện (Schloesing & Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự (1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại. Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu). Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hóa NH3 khác. Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch được Nitrosomonas spp.và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935). 2 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 2.2 Tại Việt Nam: Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007) đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn nitrate hóa ứng dụng vào xử lý nước hồ bị ô nhiễm. Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa từ nước lợ nuôi tôm và ứng dụng xử lý nitơ trong ao nước nuôi tôm. 3. Mục đích nghiên cứu: Tìm hiểu về quá trình nitrat hoá và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này. Qui trình tăng sinh, phân lập, các cách xác định hoạt tính của vi khuẩn Nitrosomonas spp. và Nitrobacter spp. Biết được các phương pháp định lượng nitrite và amoni trong các mẫu nước thải. Tìm hiểu về ứng dụng của vi khuẩn nitrat hoá trong nghành công nghiệp hiện nay. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Tìm hiểu về qui trình tăng sinh, phân lập, xác định hoạt tính của vi khuẩn Nitrosomonas spp. và Nitrobacterspp. có nguồn gốc từ các mẫu nước thải. Tìm hiểu về ứng dụng của vi khuẩn nitrat hoá trong nghành công nghiệp hiện nay 3 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.1 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải: Sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ và những chất thải có chứa nitơ trong nước thải cuối cùng của một hệ thống nước thải nhà máy hay xí nghiệp được thải ra, có thể tác động bất lợi và gây ô nhiễm đến chất lượng của nguồn nước tiếp nhận (các nguồn nước mặt như: sông, suối, ao, hồ ). Nguồn gốc của những + chất thải có bản chất nitơ gây ô nhiễm nguồn nước nhận chính là những ion NH4 , - - NO2 và NO3 . Những tác động gây ô nhiễm quan trọng có liên quan tới sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ ấy bao gồm: sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO), độc tính (Toxicity), sự thiếu oxi trong nước (Eutrophications) và sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia). Để giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của những chất thải có bản chất nitơ cho nguồn nước tiếp nhận, một hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo yêu cầu xử lý và giảm lượng chất thải có bản chất nitơ xuống dưới hoặc bằng mức cho phép của tiêu chuẩn xả thải trong nước thải đầu ra của hệ thống xử lý nước thải ấy. Hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo quá trình oxi hóa nitơ (nitrify) và quá trình khử nitơ (denitrify) những chất thải có bản chất nitơ xảy ra hoàn tất trong cả quá trình hoạt động của hệ thống. Yêu cầu của quá trình nitrate hóa (nitrification) thường được đưa ra như giới hạn thải ra NH3 và yêu cầu của quá trình phản nitrate (denitrification) thường được đưa ra như giới hạn Tổng nitơ hay Tổng nitơ Kjeldahl (TKN). 1.1.1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO): Việc thải ra những chất thải có bản chất nitơ vào nguồn nước nhận là kết quả của sự cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nguồn nước nhận ấy. Sự cạn kiệt xảy ra thông qua sự tiêu thụ oxi hòa tan bởi hoạt động của vi khuẩn. + - - - Đầu tiên, NH4 được oxi hóa thành NO2 và NO2 được oxi hóa thành NO3 bên trong nguồn nước tiếp nhận. Quá trình oxi hóa mỗi ion xảy ra bằng oxi hòa tan + được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn và gia tăng thêm NH4 và - + - - NO2 . Tiếp theo, NH4 , NO2 và NO3 đáp ứng như là nguồn nitơ dinh dưỡng cho sự 5 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH tăng trưởng của những thực vật sống ở nước, chủ yếu là những loài tảo. Khi những thực vật ấy chết đi, oxi hòa tan sẽ được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn để phân hủy những thực vật đã chết ấy. + O2 + O2 + - - NH4 NO2 NO3 1.1.2 Độc tính (Toxicity): + - - Ba ion có bản chất nitơ trên (NH4 , NO2 & NO3 ) có thể là độc chất cho sự + - sống của những loài thủy sinh vật, đặc biệt nhất là cá. Những ion NH4 và NO2 là - vô cùng độc. Và NO2 là độc nhất trong 3 loại ion có bản chất nitơ. + Mặc dù NH4 là nguồn dinh dưỡng nitơ ưa thích nhất cho phần lớn sinh vật + sống, NH4 được biến đổi thành NH3 với sự tăng lên của pH và gây độc cho sự sống của thủy sinh vật. 1.1.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication): 2- Trong khi phosphate (PO4 ) là nguồn gốc chính yếu của sự thiếu oxi trong nước thì những chất thải có bản chất nitơ cũng góp phần quan trọng cho vấn đề ô nhiễm nước này. Sự thiếu oxi trong nước nói đến sự thải ra những chất dinh dưỡng của thực vật (chủ yếu là: phốt pho và nitơ) vào nước sạch (như: hồ và ao). Sự hiện diện những chất dinh dưỡng này kích thích sự tăng trưởng nhanh chóng hay sự ra hoa của thực vật thủy sinh, bao gồm cả tảo. Khi những thực vật thủy sinh này già và chết đi, xác của chúng sẽ làm cho nguồn nước thiếu oxi do quá trình hoạt động phân hủy hiếu khí của những vi sinh vật diễn ra. Sự thiếu oxi trong nước dẫn đến sự lão hóa nhanh chóng của nguồn nước ngọt khi chúng mất khá nhiều oxi cho sự phân hủy này. Và sự tích lũy xác những thực vật thủy sinh ngày càng nhiều dẫn đến khả năng phân hủy của nguồn nước bị giảm đi đến mức chúng không thể phân hủy được nữa, không tự làm sạch được nữa thì dẫn đến nguồn nước ấy bị ô nhiễm. 6 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.1.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia): Từ “Methemoglobinemia” hay “Hội chứng da xanh ở trẻ em” nói đến một căn bệnh của những đứa trẻ còn nhỏ (dưới 6 tháng tuổi) ăn uống phải nước ngầm - đã nhiễm bẩn NO3 . Khi một đứa bé ăn uống những thứ được làm ra từ nước ngầm - - đã bị nhiễm bẩn NO3 thì những ion này dễ dàng được biến đổi thành NO2 trong - đường tiêu hóa của đứa bé. Ion NO2 này xâm nhập vào hệ tuần hoàn của đứa trẻ và nhanh chóng liên kết với Fe trong nhân của Hemoglobin hay những tế bào hồng cầu. - Sự hiện diện của NO2 trong nhân ngăn cản Hemoglobin thu được oxi khi nó đi qua phổi của đứa trẻ. Sự thiếu oxi trong cơ thể của đứa trẻ dẫn đến da của đứa trẻ trở nên xanh xao, vì thế mới có thuật ngữ “Blue baby syndrome”. Nếu thiếu oxi trong não của đứa trẻ, chứng liệt hay chết có thể xuất hiện. Methemoglobinemia thường xuất hiện ở những vùng nông thôn, nơi mà nước dùng để uống được thu từ nước ngầm. Methemoglobinemia không có dấu hiệu để cảnh báo và mặc dù nó có thể xuất hiện với những người trưởng thành, nó có thể độc hơn nhiều với những đứa trẻ sơ sinh bởi vì pH trong cơ thể chúng thấp hơn và trọng lượng cơ thể chúng thấp hơn khi so sánh với những người trưởng thành. Và - khi ion NO3 ở nồng độ cao cũng có thể làm tăng nguy cơ gây ung thư dạ dày ở mọi lứa tuổi. 1.2 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle): 7 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.1: Chu trình nitơ trong nước thải. Có nhiều hợp chất có bản chất nitơ tồn tại trong môi trường sống và trong hệ thống xử lý nước thải. Phần lớn nitơ tìm thấy trong môi trường sống tồn tại dưới dạng nitơ phân tử (N2) trong bầu khí quyển chúng ta (chúng chiếm tới 76% trong bầu khí quyển so với các khí khác). Mặc dù sự cấu thành không nhiều của nitơ trong sinh khối so với carbon hay oxi nhưng nitơ là một yếu tố thiết yếu của tất cả sự sống sinh vật. Nó được kết hợp chặt chẽ trong nguyên liệu tế bào và được dùng cho sự tăng trưởng, tạo ra enzyme và thông tin về di truyền học. Tuy nhiên, nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3 dây nối NN, nó rất khó để hầu hết sinh vật có thể bẻ gãy. May thay, nitơ phân tử được tạo ra sẵn có cho sự sống sinh vật khi mà liên kết 3 bị bẻ gãy bởi một nhóm vi khuẩn duy nhất và được cố định lại hay biến đổi thành + NH4 . 8 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH + Những vi khuẩn biến đổi nitơ phân tử thành NH4 là những vi khuẩn cố định nitơ. Những vi khuẩn này có thể sống tự do trong đất xung quanh rễ của thực vật hay có thể tăng trưởng cộng sinh trong rễ của những cây họ đậu. + Sự cố định nitơ tức là sự chuyển đổi nitơ phân tử thành NH4 , được hoàn thành bởi enzyme nitrogenase chỉ được tìm thấy trong những vi khuẩn cố định nitơ. Trước khi sự sử dụng phân bón nitơ lan rộng, thực vật tăng trưởng nốt sần hay những cây họ đậu cung cấp nitơ cho đất. Ví dụ những cây họ đậu bao gồm: Cỏ linh lăng, Cỏ ba lá và những cây Đậu nành. Một vài loài tảo cũng có thể sử dụng nitơ phân tử để sản xuất ra amino acid và protein. Tảo lấy nitơ phân tử từ không khí và đồng hóa chúng thành những phân tử hữu cơ. Cuối cùng, những phân tử hữu cơ này với nitơ liên kết thành cấu trúc của chúng và được tiêu thụ trong suốt chiều dài của chuỗi thức ăn; như là tảo được tiêu thụ bởi những dạng sống cao hơn. Sự di chuyển của nitơ và sự thay đổi chính nó trong các trạng thái oxi hóa từ không khí sang sinh vật sống đến hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) và sự trở lại của nó vào không khí là chu trình nitơ trong nước thải. Chu trình này liên kết với những hợp chất có bản chất nitơ then chốt liên tiếp như: nitơ phân + - - tử (N2), amino acid, protein, urea, NH4 , NH3, NO2 và NO3 . Trong đó, amino acid + - và protein là những dạng hữu cơ của nitơ; còn nitơ phân tử (N2), NH4 , NH3, NO2 - và NO3 là những dạng vô cơ của nitơ. - - Sự sản sinh ra NO2 và NO3 trong hệ thống cống rãnh là hiếm thấy. Những điều kiện trong hệ thống cống rãnh là không phù hợp cho sự tạo ra hay quá trình nitrate hóa của những ion này. Những điều kiện bất lợi trong hệ thống cống rãnh ngăn cản quá trình nitrate hóa bao gồm: sự thiếu oxi thích hợp, quần thể vi khuẩn - nitrate hóa nhỏ và thời gian nước được giữ lại ngắn. Tuy nhiên, lượng rất lớn NO2 - và NO3 có thể được tìm thấy trong hệ thống cống rãnh nếu chúng được thải ra từ nguồn nước thải công nghiệp có những ion này, như là nước thải nhà máy thép. Những amino acid và protein trong mô thực vật, trong rễ, trong hạt và từ thịt vật nuôi được thải trực tiếp vào hệ thống cống rãnh (rác vứt bỏ đi, nước thải chế 9 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH biến thực phẩm) và gián tiếp vào hệ thống cống rãnh (chất thải có bản chất là phân). Nhiều vi khuẩn trong hệ thống cống rãnh khử nhóm amino (-NH2) ra khỏi các amino acid và protein. Sự khử nhóm NH2 được hoàn thành với enzyme + + deaminase và đưa đến kết quả là tạo ra NH4 . Sự tạo thành NH4 còn được biết đến như là quá trình amôn hóa. Sự khử nhóm NH2 của amino acid phenylalanine được cho thấy: + Phenylalanine–Proteus NH4 Phenylpyruvic acid Urea: là một hợp chất nitơ hữu cơ, chúng được tìm thấy trong nước tiểu, phân bón và những chất thải từ chăn nuôi. Khi mà được thủy phân bởi enzyme + urease của vi khuẩn, NH4 được giải phóng. Enzyme urease được tìm thấy trong nhiều sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ liên kết với phân bao gồm: Citrobacter. Sự thủy phân urea thành NH3 và CO2 bởi hoạt động của vi khuẩn là rất nhanh + chóng. Ở pH của hệ thống cống rãnh NH3 nhanh chóng được biến đổi thành NH4 . NH2COHN2 H2O –Citrobacter 2NH3 CO2 Những amino acid và những protein không được phân hủy trong hệ thống cống rãnh có thể được phân hủy trong hệ thống xử lý nước thải (bể aerotank). Sự phân hủy những amino acid và protein trong bể aerotank cũng đưa đến kết quả sản + sinh ra NH4 . + Những ion NH4 trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có vài nhiệm vụ. Chúng có thể được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ và vi khuẩn nitrate hóa. Chúng có thể được giải phóng ra ngoài không khí như NH3 ở pH cao và dưới những điều kiện hoạt động - + thích hợp, Nitrosomonas có thể oxi hóa chúng thành NO2 . Nếu những ion NH4 không được sử dụng như nguồn dinh dưỡng, hóa thành khí hay oxi hóa, chúng được chảy vào trong hệ thống nhánh của bể aerotank. - Dưới nhiệt độ lạnh hay điều kiện phương pháp hệ thống có giới hạn, ion NO2 - có thể tích lũy lại trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). NO2 - cũng có một vài nhiệm vụ trong hệ thống bùn hoạt tính. NO2 còn có thể được oxi 10 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - hóa sinh học bởi Nitrobacter tạo thành NO3 dưới những điều kiện hoạt động thuận + - - lợi. Nếu NH4 và NO2 không có sẵn trong bể aerotank, NO3 được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ bởi những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Nếu những - ion NO2 không bị oxi hóa hay được dùng như nguồn dinh dưỡng nitơ, chúng được - chảy vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể lắng 2, NO2 có thể được khử thành các khí N2O và N2. - NO3 trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) có một vài + - nhiệm vụ. Trong sự vắng mặt của NH4 trong bể aerotank, NO3 có thể được dùng - như nguồn dinh dưỡng nitơ. Nếu NO3 không được dùng như một nguồn dinh dưỡng nitơ thì chúng được chảy vào hệ thống nhánh của bể aerotank. Trong bể - lắng 2, NO3 có thể được khử nitrate. - Những ion NO3 là quan trọng chủ yếu trong chu trình nitơ nước thải. Chúng là sản phẩm của quá trình nitrate hóa, cơ chất của quá trình phản nitrate hóa và là + - nguồn dinh dưỡng nitơ khi mà NH4 không có sẵn. NO3 được sử dụng như nguồn dinh dưỡng nitơ thông qua một hệ thống sinh học được biết như sự đồng hóa - nitrate. Những ion NO3 rất dồi dào, nguồn nitơ vô cơ trong nguồn nước. Sự phản nitrate có thể xảy ra trong lớp bùn của bể lắng 2 (trong Hệ thống xử lý nước thải) khi mà điều kiện kỵ khí xảy ra trong lớp bùn. Ở đây vi khuẩn kỵ khí - - tùy nghi sử dụng NO2 và NO3 để phân hủy cBOD hòa tan (carbonaceous BOD). Sự phân hủy này được liên kết với sự giải phóng phân tử nitơ. + Những ion NH4 có thể được loại bỏ bởi hoạt động trộn hay sự hóa khí vào không khí như NH3. Tuy nhiên lượng NH3 mất đi qua sự hóa khí là rất nhỏ, tức là ít hơn 10%. Khi mà những chất thải nitơ hữu cơ không còn có sẵn nữa để giải phóng ra + + + NH4 , lượng NH4 giảm. Sự giảm NH4 xảy ra vì chúng được dùng như là nguồn - - dinh dưỡng nitơ và bị oxi hóa thành NO2 và NO3 . Nếu quá trình nitrate hóa bắt - - đầu một cách đúng đắn, không có sự tích lũy của NO2 xảy ra. Một vài ion NO3 có + thể được loại bỏ đi như là nguồn dinh dưỡng nitơ khi mà NH4 bị cạn kiệt. Nếu quá - trình phản nitrate xảy ra thì lượng NO3 sẽ bị giảm rất lớn, có lẽ được loại trừ. 11 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.3 Quá trình nitrate hoá 1.3.1 Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to Nitrification): + - Quá trình nitrate hóa sinh học là sự biến đổi hay oxi hóa NH4 thành NO2 và - + - sau đó thành NO3 . Trong thời gian oxi hóa NH4 và NO2 , oxi được cộng thêm vào những ion này bởi một nhóm sinh vật duy nhất, những vi khuẩn nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa xảy ra trong tự nhiên và trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). Quá trình nitrate hóa trong đất là đặc biệt quan trọng trong tự nhiên, - bởi vì nitơ được hấp thu bởi thực vật như là nguồn dinh dưỡng dưới dạng NO3 . Quá trình nitrate hóa trong nước có liên quan đến xử lý nước thải, nhất là đảm bảo yêu cầu xả thải theo đúng quy chuẩn cho phép. + NH4 và NH3 là những dạng của hợp chất nitơ, chúng được oxi hóa trong suốt + quá trình nitrate hóa. Số lượng của NH4 và NH3 trong bể aerotank của hệ thống xử lý nước thải được quyết định bởi pH và nhiệt độ trong hệ thống. + - Sự oxi hóa NH4 và NO2 được hoàn thành thông qua sự thêm vào oxi hòa tan bên trong những tế bào vi khuẩn. Bởi vì quá trình nitrate hóa hay sự thêm vào oxi của những phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong những tế bào sinh học, quá trình nitrate hóa xảy ra thông qua những phản ứng hóa sinh. + Những ion NH4 được tạo ra trong nước thải từ sự thủy phân urea và sự phân hủy những hợp chất nitơ hữu cơ. Sự thủy phân và sự phân hủy những hợp chất nitơ hữu cơ đưa đến kết quả là sự giải phóng ra những nhóm amino (-NH2) và sự tạo + thành NH4 . + - Mặc dù có nhiều sinh vật có khả năng oxi hóa NH4 và NO2 , nhưng những sinh vật ban đầu chịu trách nhiệu chính trước nhất cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) đó là 2 giống vi khuẩn nitrate hóa, Nitrosomonas và Nitrobacter. Những giống này sở hữu những enzyme và cấu trúc tế bào đặc biệt cho phép chúng hoàn thành quá trình nitrate hóa quan trọng này. 12 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Tốc độ của quá trình nitrate hóa đạt được bởi những vi khuẩn nitrate hóa thường là 1.000 – 10.000 lần lớn hơn tốc độ của quá trình nitrate hóa bằng những sinh vật khác. Bên cạnh những vi khuẩn nitrate hóa, có 2 Protozoa chúng hiện diện với số lượng rất lớn trong lúc quá trình nitrate hóa diễn ra nhanh nhất. Những Protozoa này là: Epistylis và Vorticella. Mặc dù hệ thống bùn hoạt tính được dùng cho quá trình nitrate hóa, nhưng hệ thống này không phải là lý tưởng cho quá trình nitrate hóa. Vì kích thước quần thể lớn và sự tăng trưởng nhanh chóng của các sinh vật khác trong bể aerotank so sánh với kích thước quần thể nhỏ và sự tăng trưởng chậm của những vi khuẩn nitrate hóa, kích thước quần thể của những vi khuẩn nitrate hóa được làm giảm đi từ từ, tạo ra khó khăn để đạt được và duy trì quá trình nitrate hóa mong muốn. Khoảng chừng 90% đến 97% vi khuẩn trong hệ thống bùn hoạt tính là những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ, còn khoảng chừng 3% đến 10% là vi khuẩn nitrate hóa. 1.3.2 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria) Vi khuẩn nitrate hóa sống rất đa dạng trong môi trường sống của chúng ta bao gồm: nước ngọt, nước có thể uống được, nước thải, nước biển, nước lợ và trong đất. Mặc dù một vài giống vi khuẩn nitrate hóa có khả năng sử dụng một vài hợp chất hữu cơ để thu carbon, giống chủ yếu của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính), Nitrosomonas và Nitrobacter, sử dụng CO2 hay carbon vô cơ như là nguồn carbon cho sự tổng hợp nguyên liệu tế bào. Mỗi phân tử CO2 đồng hóa thành nguyên liệu tế bào bởi những vi khuẩn + - nitrate hóa, khoảng chừng 30 phân tử của NH4 hay 100 phân tử của NO2 có thể được oxi hóa. + - Vì lượng NH4 và NO2 rất lớn cần để đồng hóa CO2, vi khuẩn nitrate hóa có tốc độ sinh sản rất chậm. Thậm chí dưới những điều kiện tốt nhất thì tốc độ sinh sản của vi khuẩn nitrate hóa là rất nhỏ. 13 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Vi khuẩn nitrate hóa thu được năng lượng bởi quá trình oxi hóa những cơ chất + - - + vô cơ, cụ thể là NH4 và NO2 . Ion NO2 là sản phẩm của sự oxi hóa NH4 bởi - Nitrosomonas cung cấp như là cơ chất cho Nitrobacter. Nếu NO2 không được thải - ra khỏi hệ thống bùn hoạt tính thì NO2 có thể được sản sinh ra trong bể aerotank để mà Nitrobacter dùng làm cơ chất năng lượng. Có 2 phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong suốt quá trình nitrate hóa. Nhiều năng + lượng được lấy từ dạng phản ứng đầu tiên, tức là, sự oxi hóa NH4 , hơn là phản - ứng thứ 2, tức là sự oxi hóa NO2 . + - + NH4 1.5O2–Nitrosomonas NO2 2H H2O Năng lượng. - - NO2 0.5O2–Nitrobacter NO3 Năng lượng. Phản ứng sinh năng lượng xảy ra trong những tế bào vi khuẩn và cả 2 phản - ứng này đều sử dụng oxi phân tử tự do. Từ đó sự tích lũy NO2 không xuất hiện. + - Toàn bộ phản ứng nitrate hóa được điều khiển bằng sự oxi hóa NH4 sang NO3 . Toàn bộ phản ứng nitrate hóa là một sự kết hợp của 2 phản ứng sinh năng lượng trên: + - + NH4 2O2–Vi khuẩn Nitrate hóa NO3 2H H2O. + Mặc dù NH4 được dùng như một nguồn năng lượng bởi những vi khuẩn + nitrate hóa, không phải tất cả NH4 có trong tế bào vi khuẩn đều được nitrate hóa. + Một vài ion NH4 được dùng như là nguồn dinh dưỡng nitơ và được đồng hóa thành nguyên liệu tế bào mới (C5H7O2N). Sự tăng trưởng của những tế bào mới trong hệ thống bùn hoạt tính được tạo thành do sự tăng lên của những chất rắn lơ lửng huyền phù trộn lẫn trong nước (MLVSS) (Mixed liquor volatile suspended solids). - + 4CO2HCO3 NH4 4H2O C5H7O2N 5O23H2O. Có vài giống vi khuẩn nitrate hóa. Các giống có thể được tập hợp lại thành + - nhóm với nhau dựa vào oxi hóa NH4 hay NO2 14 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Bảng 1.1. Các giống vi khuẩn nitrat hoá tập hợp lại thành nhóm dựa vào sự oxi + - hoá NH4 hay NO2 Cơ chất năng lượng Sản phẩm oxi hóa Các giống vi khuẩn (Energy Substrate) (Oxidized Product) nitrate hóa (Genera of Nitrifying Bacteria) + - NH4 NO2 Nitrosococcus Nitrosocystis Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira - - NO2 NO3 Nitrobacter Nitrococcus Nitrospira Những vi khuẩn nitrate hóa không có khả năng gây bệnh, chúng không có trong đường ruột của con người. Vì vậy những vi khuẩn nitrate hóa không đi vào hệ thống cống rãnh và hệ thống xử lý nước thải với lượng lớn thông qua nước thải gia đình. Vi khuẩn nitrate hóa xuất xứ từ đất và nước. Những vi khuẩn nitrate hóa Nitrosomonas và Nitrobacter có ở mức độ lớn, nếu không hoàn toàn, là nguyên nhân của quá trình nitrate hóa trong đất. Bởi vì những vi khuẩn nitrate hóa bị tiêu diệt bởi ánh sáng tử ngoại, chúng không được tìm thấy lượng lớn trên bề mặt của đất. Tuy nhiên, chúng được tìm thấy với số lượng lớn trực tiếp bên dưới bề mặt của đất nơi ánh sáng cực tím không thể lọt vào được. Trong hệ thống xử lý nước thải, 2 loài vi khuẩn nitrate hóa chịu trách nhiệm + - chính cho sự oxi hóa NH4 và NO2 là Nitrosomonas europeae và Nitrobacter 15 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH winogradsky. Những giống vi khuẩn nitrate hóa khác cũng quan trọng không kém trong hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính). Nitrosomonas và Nitrobacter là những vi khuẩn gram âm và hiếu khí bắt buộc, chúng yêu cầu oxi phân tử tự do hay oxi hòa tan nhằm để oxi hóa cơ chất. Mặc dù những vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh trưởng phát triển và sinh sản trong sự hiện diện của phần lớn những hợp chất hữu cơ, một vài dạng hợp chất hữu cơ có thể ức chế hoạt động của chúng, tức là, ức chế quá trình nitrate hóa. Những hợp chất ức chế đó bao gồm: Cồn và Acid. Một vài hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino (-NH2), như là Methylamine (CH2NH2), cũng ức chế hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa. Với vài ngoại lệ, những vi khuẩn nitrate hóa là những sinh vật tự dưỡng bắt buộc (nghiêm ngặt). Bởi vì chúng là những vi sinh vật tự dưỡng bắt buộc, vài dạng hợp chất hữu cơ đơn giản còn lại trong bể aerotank có thể ức chế vi khuẩn nitrate hóa, tức là, ức chế quá trình nitrate hóa. Vì vậy một quần thể sinh vật tự dưỡng hóa năng hữu cơ lớn và đa dạng hiện diện trong bể aerotank để mà oxi hóa những hợp chất hữu cơ có dạng đơn giản ấy. Vi khuẩn nitrate hóa có thể tăng trưởng và sinh sản bằng những tế bào riêng biệt hay khối tập hợp nhỏ dính chặt vào nhau trong chất nhờn. Trong hệ thống bùn hoạt tính, những vi khuẩn nitrate hóa được tìm thấy hút bám trên bề mặt của những hạt keo và lơ lửng trong bể. Những vi khuẩn nitrate hóa sinh sản vô tính. Nitrosomonas: sinh sản bằng sự tự phân đôi hay sự phân cắt hoàn toàn thành hai phần; trong khi đó, Nitrobacter: sinh sản bằng cách nảy chồi. Vì những vi khuẩn nitrate hóa thu được một lượng rất nhỏ năng lượng từ sự + - oxi hóa NH4 và NO2 , sự sinh sản hay thời gian thế hệ là chậm và quần thể nhỏ. Kích thước quần thể vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính là rất nhỏ khi mà so sánh với kích thước quần thể của các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ. 16 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Sự khác nhau trong kích thước quần thể giữa vi khuẩn nitrate hóa và những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ là do 2 lý do. Thứ nhất, trong hầu hết hệ thống bùn hoạt tính thành phố và công nghiệp, nồng độ của chất thải có bản chất carbon vượt quá giới hạn nồng độ của những chất thải có bản chất nitơ. Vì vậy nhiều cơ chất có giá trị để tăng trưởng nhiều vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ. Thứ hai, những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ thu được nhiều năng lượng từ sự sinh sản hơn những vi khuẩn nitrate hóa khi chúng oxi hóa những cơ chất tương ứng của chúng. Vì vậy những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ có thể sinh sản nhanh hơn nhiều những vi khuẩn nitrate hóa có thể sinh sản. So sánh thời gian thế hệ của những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ với vi khuẩn nitrate hóa thì vi khuẩn nitrate hóa dài hơn nhiều. Thời gian thế hệ của hầu hết những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ trong hệ thống bùn hoạt tính là 15 đến 30 phút. Dưới những điều kiện thuận lợi,thời gian thế hệ của những vi khuẩn nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính là 48 đến 72 giờ. Trong quần thể vi khuẩn nitrate hóa cũng có một kích thước quần thể khác biệt giữa Nitrosomonas và Nitrobacter. Kích thước quần thể Nitrosomonas là lớn hơn Nitrobacter. Bởi vì Nitrosomonas thu được nhiều năng lượng từ sự oxi hóa + - NH4 hơn Nitrobacter thu được từ sự oxi hóa NO2 , Nitrosomonas có thời gian thế hệ ngắn hơn và có thể tăng nhanh chóng về số lượng khi so sánh với Nitrobacter. Một kích thước quần thể lớn của Nitrosomonas hơn Nitrobacter trong hệ thống bùn + - hoạt tính đáp ứng cho khả năng oxi hóa NH4 nhiều hơn khả năng oxi hóa NO2 . Sự khác nhau trong thời gian thế hệ giữa Nitrosomonas và Nitrobacter ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình nitrate hóa. Sự khác nhau ấy là nguyên nhân gây nên - sự tích lũy NO2 trong suốt thời gian những điều kiện hoạt động không thuận lợi trong hệ thống bao gồm: nhiệt độ lạnh, quá trình rửa trôi cơ học, mức oxi hòa tan thấp, độc chất Mặc dù kích thước quần thể cơ bản của vi khuẩn nitrate hóa phụ thuộc vào + - lượng cơ chất sẵn có (NH4 và NO2 ), sự tăng trưởng và sinh sản của quần thể bị ảnh hưởng mạnh bởi vài yếu tố hoạt động bao gồm: oxi hòa tan, tính kiềm và pH, 17 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH nhiệt độ, chất ức chế, chất độc và phương thức hoạt động của cả hệ thống xử lý nước thải. 1.4 Những sinh vật chỉ thị hay những chất chỉ thị cho quá trình Nitrate hóa (Indicators of Nitrification): Hệ thống bùn hoạt tính (của một hệ thống xử lý nước thải) oxi hóa nitơ nếu - - NO2 và NO3 được sinh ra trong bể aerotank. Dù có nhiều cơ chế khác nhau của sự + mất đi và sinh ra NH4 trong bể aerotank, do đó, một mình sự giảm nồng độ của + NH4 trong bể aerotank không biểu lộ quá trình nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa - - được chứng minh bằng sự sản sinh ra NO2 hay NO3 . Tuy nhiên, nếu sự kiểm tra - - NO2 hay NO3 trong hệ thống không được thực hiện, thì quá trình nitrate hóa có thể được nghi ngờ bởi sự hiện diện của sinh vật chỉ thị sinh học, chất chỉ thị hóa học và những sinh vật báo hiệu tự nhiên khác. Những sinh vật chỉ thị sinh học của quá trình nitrate hóa bao gồm: sự tăng trưởng của Tảo và Bèo tấm trong bể lắng 2, sự tăng lên có ý nghĩa của nhu cầu oxi pha trộn trong nước và sự giảm đi có ý nghĩa của mức oxi hòa tan trong hệ thống. - Tảo và Bèo tấm thu được chất dinh dưỡng nitơ từ NO3 . Vì vậy sự hiện diện của - chúng trong bể lắng 2 là một sự chỉ thị của sự sản sinh ra NO3 hay quá trình nitrate hóa trong bể aerotank. Bèo tấm: là những thực vật có hoa bé nhỏ nhất và đơn giản nhất. Bèo tấm sinh sôi nảy nở nhanh chóng và nổi trên mặt nước. Có 3 giống Bèo tấm chúng được tìm thấy trong hệ thống bùn hoạt tính của hệ thống xử lý nước thải. Những giống này là: Lemna, Spirodella, và Wolffia. Khi mà quá trình nitrate hóa xảy ra trong bể aerotank, lượng lớn oxi hòa tan + - được tiêu thụ bởi những vi khuẩn nitrate hóa do chúng oxi hóa NH4 và NO2 . Vì vậy, khi quá trình nitrate hóa xảy ra, sự đòi hỏi có ý nghĩa của sinh khối về oxi hòa tan xuất hiện và mức độ oxi hòa tan trong bể aerotank giảm đi. Những chất chỉ thị hóa học của quá trình nitrate hóa bao gồm sự tăng lên nhu cầu Cl2 để khử trùng trong phụ lưu bể lắng 2. Nếu quá trình nitrate hóa không hoàn 18 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - - tất xảy ra, NO2 tích lũy và NO2 phản ứng nhanh chóng với Cl2, đưa đến kết quả là - sự tiêu diệt coliform kém đi trong phụ lưu của bể lắng 2. Sự sản sinh ra NO2 trong bể aerotank đưa đến kết quả là sự phá hủy tính kiềm. Sự phản nitrate hóa trong bể lắng 2 (do kết quả nitrate hóa trong bể aerotank) trả lại tính kiềm cho nước thải. Sự trả lại tính kiềm đưa đến sự tăng tính kiềm hay pH. Nếu vài sinh vật chỉ thị sinh học, hóa học hay tự nhiên của quá trình nitrate hóa xảy ra trong hệ thống bùn hoạt tính chúng không được yêu cầu nitrate hóa, khi đó sự nitrate hóa sẽ bị nghi ngờ. Để xác định dạng nitrate hóa đang xảy ra, sự kiểm + - - tra nước trong hệ thống về nồng độ NH4 , NO2 và NO3 sẽ được thực hiện. 1.5 Cơ chế hoạt động của vi khuẩn Nitrat hoá Các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ (chemolithotrophic) thường là loại tự dưỡng, đều sử dụng chu trình Calvin để cố định CO2 như nguồn carbon duy nhất. Ở vi khuẩn nitrate hoá được xếp vào loại tự dưỡng sẽ sử dụng năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá ammonia hay nitrite để phục vụ cho việc khử CO2 thành carbonhydrat. Khi một phân tử CO2 đi vào chu trình Calvin, nó cần đến 3 phân tử ATP và 2 phân tử NADH. Điều khó khăn là năng lượng thu từ quá trình oxi hoá các phân tử vô cơ (nói chung) của vi khuẩn nitrate lại nhỏ hơn rất nhiều so với việc oxi hoá hoàn toàn glucose ở loại vi khuẩn thông thường. Tỉ lệ P/O trong quá trình oxi hoá phosphoryl hoá ở vi khuẩn nitrate hoá thường bằng 1, chính vì tỉ lệ quá thấp như vậy nên vi khuẩn nitrate hoá nói riêng và các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ khác nói chung cần oxi hoá một lượng lớn các hợp chất vô cơ để sinh trưởng và sinh sản, điều này nói lên tác động của hệ vi khuẩn này đối với môi trường sống rất sâu sắc. 19 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Bảng 1.2. Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với glucose (-686kcal/mol) Phản ứng ΔG (kcal/mol) H2 +1/2 O2 H2O -56,6 - = NO2 + 1/2 O2 NO3 -17,4 + - NH4 + ½ O2 NO2 + H2O + 2H -65,0 -118,5 o S + ½ O2 + H2O H2SO4 2- 2- S2O3 + 2O2 + H2O 2SO4 + 2H -223,7 2+ + 2Fe + 2H + 1/2 O2 2Fe+ H2O -11,2 Ở vi khuẩn nitrate hoá, năng lượng giải phóng từ quá trình oxy hoá ammonia lẫn nitrite được sử dụng để tổng hợp nên ATP hoạt hoá các enzyme, cơ chất, là hợp chất dự trữ năng lượng và NADH (nguồn cung cấp electron trong chuỗi vận chuyển điện tử, cung cấp H+ để khử các hợp chất khác, là hợp chất chứa năng lượng khử). Chính 2 hợp chất quan trọng này, mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng để khử CO2 và các hợp chất khác phục vụ cho quá trình biến dưỡng của tế bào. Quá trình tổng hợp ATP ở vi khuẩn nitrate hoá về nguyên tắc rất giống với hoạt động tổng hợp ATP của ti thể ở các vi sinh vật có nhân thật. Con đường chính để tạo ATP là thông qua các hoạt động oxi hoá ammonia và phân ly nước (ở vi khuẩn nitrate hoá) và oxi hoá nitrite, H+ được tạo ra và đẩy vào periplasm (là khoảng không gian giữa màng trong và màng ngoài của tế bào vi khuẩn), từ đó tạo nên gradient H+ làm cho H+ chạy qua phức ATPase vào trong cytoplasm (nguyên sinh chất) giúp tái tạo ADP thành ATP. Con đường phụ (diễn ra ở Nitrobacter sp., trong khi ở Nitrosomonas sp. thì không hiện diện) để tạo ATP là thông qua hoạt động của chất khử NADH và hoạt động của phức vận chuyển điện tử trên màng, giúp tổng hợp ATP. 20 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Quá trình tổng hợp NADH thì khó khăn hơn nhiều và hiện chưa được lý giải hoàn toàn, vì nó liên quan đến quá trình vận chuyển electron theo chiều ngược lại (reverse electron transport – RET). Lý do chính vì những phân tử như ammonia, nitrite thì có thể khử cao hơn so với NAD+ nên vi khuẩn nitrate hoá không thể cung cấp electron trực tiếp từ quá trình oxi hoá ammonia và nitrite để tổng hợp nên NADH qua hệ enzyme NADH-oxidoreductase. Bởi vì electron chỉ có thể di chuyển từ chất cho đến chất nhận. Để giải quyết khó khăn này, vi khuẩn nitrat hoá đã sử dụng lực đẩy proton để đảo lại chiều di chuyển electron, qua các chất vận chuyển điện tử, nhằm khử NAD+ về NADH. Có thể thấy nếu so sánh với quá trình tạo nên NADH và ATP qua con đường đường phân hay chu trình Krebs ở các vi sinh vật khác, thì quá trình tạo NADH và ATP ở vi khuẩn nitrate hoá tiêu tốn nhiều năng lượng hơn và lượng sản phẩm tạo ra ít hơn. Nhưng vì nguồn cơ chất ammonia, nitrite mà vi khuẩn nitrate hoá sử dụng lại không bị cạnh tranh như các nguồn cơ chất khác (glucose, lipid, protein) nên vi khuẩn nitrate hoá vẫn thích nghi được với con đường biến dưỡng bằng các hợp chất này. . 21 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.2: Hướng di chuyển electron dựa trên thể khử của các chất trong tế bào 1.6 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa và quá trình nitrate hóa - 1.6.1 Sự tích lũy NO2 : - Sự tích lũy NO2 một phần ức chế đến hoạt động của enzyme bên trong vi - khuẩn nitrate hóa. Sự ức chế này ngăn cản sự oxi hóa nhanh chóng NO2 thành - NO3 . Những yếu tố hoạt động chịu trách nhiệm chính cho sự ức chế này bao gồm: + nhiệt độ lạnh, sự thiếu hụt những chất dinh dưỡng then chốt, nồng độ NH4 cao ở phụ lưu, những chất thải ức chế và độc, sự thay đổi pH, thời gian lưu nước ngắn trong bể aerotank và mức oxi hòa tan thấp nhất thời. 22 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - Sự tích lũy NO2 trong hệ thống bùn hoạt tính có thể là sự cố thay đổi theo mùa - vì sự thay đổi nhiệt độ và nồng độ MLVSS. Sự tích lũy NO2 thường xảy ra tại thời điểm cuối mùa đông hay ngay từ đầu mùa xuân trong hệ thống bùn hoạt tính. 1.6.2 Oxi hòa tan (DO): Có nhiều nhu cầu hoạt động được biết ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa hay quá trình nitrate hóa, nồng độ oxi hòa tan là một trong những nhu cầu quan trọng ấy. Tuy nhiên nồng độ DO tối ưu nhất để hoàn thành quá trình nitrate hóa là rất thấp, từ 2 – 3 mg/l và không may, nhiều hệ thống bùn hoạt tính được thông khí vượt qúa để hoàn thành quá trình nitrate hóa. Sự thông khí vượt quá thực tiễn không mang lại lợi nhuận và có thể góp phần làm chia cắt những hạt keo hay làm tăng những bọt khí. Để quá trình nitrate hóa có hiệu quả, lượng DO được duy trì trong bể aerotank sẽ được điều chỉnh để phù hợp + - - với nồng độNH4 trong phụ lưu nước pha trộn, NO2 và NO3 . Ngoài ra, để nồng độ DO trong bể aerotank, xáo trộn đủ phải được duy trì để ngăn cản sự phân tầng của DO. Và DO phải thâm nhập vào lõi của những hạt keo. Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa là hiếu khí bắt buộc, chúng chỉ có thể oxi hóa nitơ khi có sự hiện diện của oxi hòa tan. Ở nồng độ DO 0.5 mg/l quá trình nitrate hóa không xảy ra. Những yếu tố chủ yếu cho giới hạn này về lượng của quá trình nitrate hóa là sự thiếu oxi cho sự khuếch tán qua các hạt keo và sự cạnh tranh về oxi bởi những sinh vật khác. Sự tăng nồng độ oxi cho phép tốt hơn sự thâm nhập DO vào hạt keo và khuyến khích thêm quá trình nitrate hóa. Trong khoảng DO từ 0.5 – 1.9mg/l, quá trình nitrate hóa tăng tốc, nhưng nó không có hiệu quả lắm. Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa được hoàn tất ở nồng độ DO từ 2.0 – 2.9mg/l, trong khi đó quá trình nitrate hóa đạt cao nhất xuất hiện gần với nồng độ DO 3.0mg/l. 23 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Bảng1.3: Nồng độ DO và quá trình nitrate hóa đạt được Nồng độ DO (mgO2/l) Quá trình nitrate hóa đạt được 0.5mg/l Ít, một số lượng không xác định, quá trình nitrate hóa xuất hiện. 0.5 – 1.9mg/l Quá trình nitrate hóa xảy ra nhưng yếu kém. 2.0 – 2.9mg/l Quá trình nitrate hóa có ý nghĩa xảy ra. 3.0mg/l Quá trình nitrate hóa đạt tối đa. Bởi vì vi khuẩn nitrate hóa phải giảm bớt CO2 cho tăng trưởng tế bào, sinh sản + - và thu được ít năng lượng từ sự oxi hóa NH4 và NO2 . Chúng cạnh tranh kém với những vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ về DO trong bể aerotank. Vì vậy mức DO trong bể aerotank sẽ được giám sát một cách cẩn thận và không cho phép xuống dưới 1.5mg/l. Dưới giá trị này sự giảm bớt hoạt động nitrate hóa xuất hiện. Những vi khuẩn nitrate hóa có thể vẫn còn sống trong sự vắng mặt của DO chỉ trong một khoảng thời gian rất ngắn. Sự vắng mặt của DO ít hơn 4 giờ không ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi DO được khôi phục. Sự vắng mặt DO nhiều hơn 4 giờ ảnh hưởng bất lợi đến hoạt động của vi khuẩn nitrate hóa cho đến khi DO được khôi phục lại. Sự vắng mặt DO trong 24 giờ hay nhiều hơn có thể phá hủy quần thể vi khuẩn nitrate. 1.6.3 Tính kiềm và pH: Nồng độ ion H+ hay pH của môi trường sống của sinh vật có ảnh hưởng tác động rất lớn đến bên trong sinh vật. Quá trình nitrate hóa bắt đầu rất chậm ở pH thấp và nó có thể xảy ra trong hầu hết môi trường; quá trình nitrate hóa xảy ra ở pH dưới 5.0 không phải do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện mà do những sinh vật dị 24 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH dưỡng hóa năng hữu cơ thực hiện, bao gồm cả nấm. Ở giá trị pH trung tính thì vi khuẩn nitrate hóa có ưu thế hơn. Và ở giá trị pH kiềm thì quá trình nitrate hóa chủ yếu là do vi khuẩn nitrate hóa thực hiện. Bảng 1.4: pH và quá trình nitrate hóa pH Tác động đến quá trình nitrate hóa 4.0 – 4.9 Sự hiện diện của vi khuẩn nitrate hóa; nitrate hóa của những sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ xảy ra. 5.0 – 6.7 Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc độ nitrate hóa chậm chạp. 6.7 – 7.2 Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc độ nitrate hóa tăng lên. 7.2 – 8.0 Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa; tốc độ nitrate hóa được xem là hằng số. 7.5 – 8.5 Quá trình nitrate hóa bởi những vi khuẩn nitrate hóa. pH thấp trong nước thải có một ảnh hưởng đầu tiên đến vi khuẩn nitrate hóa bởi sự ức chế hoạt động của enzyme và ảnh hưởng thứ 2 là đến tính kiềm. Quá trình nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính bắt đầu tăng tốc khi pH 6.7. Khoảng pH tối ưu cho quá trình nitrate hóa là 7.2 đến 8.0. Ở khoảng pH từ 7.2 đến 8.0 thì tốc độ của quá trình nitrate hóa được thừa nhận là không thay đổi. Và nhiều hệ thống bùn hoạt tính oxi hóa nitơ ở pH gần trung tính. Ở pH cao hơn sẽ tác động bất lợi đến các sinh vật dị dưỡng hóa năng hữu cơ làm nhiệm vụ phân hủy cBOD. May thay những vi khuẩn nitrate hóa thích nghi với môi trường chậm hơn khi ở pH thấp hơn tối ưu. Tuy nhiên, sự thích nghi với môi trường này có thể yêu cầu sự tăng dần dần hay giảm dần dần của pH. 25 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.6.4 Nhiệt độ (Temperature): Trong tất cả các yếu tố hoạt động ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa, nhiệt độ có sự ảnh hưởng ý nghĩa trên hết trong sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa và do đó, ảnh hưởng đến tốc độ của quá trình nitrate hóa. Tốc độ của quá trình nitrate hóa giảm theo sự giảm của nhiệt độ và ngược lại, tăng theo sự tăng của nhiệt độ và nhất là trong khoảng từ 8 đến 30oC. Nitrosomonas tăng gần 10% tốc độ tăng trưởng khi nhiệt độ tăng 1oC. Dưới 10oC tốc độ quá trình nitrate hóa hạ xuống đột ngột. Trên 10oC thì tốc độ quá trình nitrate hóa hầu như tương ứng về nhiệt độ. Nitrosomonas được phân lập từ hệ thống bùn hoạt tính có tốc độ tăng trưởng tối ưu ở 30oC. Vì vậy, những mục đích của hoạt động, nhiệt độ tối ưu cho quá trình nitrate hóa trong hệ thống bùn hoạt tính được tính toán phổ biến là ở 30oC. Không có sự tăng trưởng của Nitrosomonas hay Nitrobacter xảy ra dưới 4oC. Bảng 1.5: Nhiệt độ và quá trình Nitrate hóa Nhiệt độ (toC) Sự ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa 45oC Quá trình nitrate hóa dừng lại. 28 – 32oC Khoảng nhiệt độ tối ưu. 16oC Tốc độ quá trình nitrate hóa khoảng chừng 50% so với khi ở 30oC. 10oC Sự giảm bớt có ý nghĩa về tốc độ, khoảng chừng 20% về tốc độ so với khi ở 30oC. 5oC Quá trình nitrate dừng lại. Tác động ức chế của nhiệt độ lạnh là rất lớn đến Nitrobacter hơn Nitrosomonas. - Vì vậy mà không kỳ lạ khi NO2 tích lũy lại trong thời gian nhiệt độ lạnh vào mùa đông. 26 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.6.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity): Có vài dạng sự ức chế và độc tính có thể xảy ra trong thời gian quá trình nitrate hóa. Sự ức chế là sự mất đi tạm thời của hoạt động enzyme. Độc tính là sự mất đi lâu dài của hoạt động enzyme hay hư hại không thể thay đổi được của cấu trúc tế bào. Tất cả vi khuẩn nitrate hóa có thể khắc phục sự ức chế bằng sự sửa chữa những hệ thống enzyme đã bị hỏng. Vì vi khuẩn nitrate hóa chỉ thu được một + - lượng rất nhỏ năng lượng từ sự oxi hóa NH4 và NO2 , và không may, năng lượng đủ thường không có sẵn cho duy trì sự thích nghi với khí hậu. Vì vậy, với sự tăng lên dù là rất ít của những chất gây ức chế cũng có thể gây ra những sự thay đổi đáng chú ý trong sự tăng trưởng của vi khuẩn nitrate hóa. Với lượng năng lượng rất ít có sẵn để thích nghi với khí hậu, vi khuẩn nitrate hóa dễ bị tổn thương với nồng độ rất thấp của những chất thải vô cơ và những chất thải hữu cơ. Những chất thải có độc tính cao với vi khuẩn nitrate hóa bao gồm: cyanide, những hợp chất halogenated, những kim loại nặng, hydantoin, mercaptans, phenols và thiourea. Vi khuẩn nitrate hóa còn bị ức chế bởi nồng độ rất thấp của NH3 tự do và + nitrous acid tự do. NH3 tự do được sinh ra từ NH4 dưới pH cao trong bể aerotank. - Còn acid nitrous tự do được sinh ra từ NO2 dưới pH thấp trong bể aerotank. Sự ức chế hay độc tính từ NH3 tự do và acid nitrous tự do được biết đến như là sự ức chế bởi cơ chất ban đầu gây ra. + Với sự tăng lên của pH, những ion NH4 dễ dàng chuyển đổi thành NH3 tự do: + - NH4 OH NH3 H2O NH3 tự đo ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter. NH3 tự do có thể ức chế Nitrosomonas ở nồng độ bằng với 10mg/l. NH3 tự do có thể ức chế Nitrobacter ở những nồng độ bằng với 0.1mg/l. - Với sự giảm pH, ion NO2 dễ dàng chuyển đổi nhiều hơn thành acid nitrous tự do: 27 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - + NO2 H ↔ NHO2 Acid nitrous tự do ức chế Nitrosomonas và Nitrobacter ở nồng độ rất thấp. Cả 2 giống vi khuẩn có thể bị ức chế bởi acid nitrous tự do ở nồng độ bằng với 1.0mg/l. Sự ức chế cơ chất trong hệ thống bùn hoạt tính thường xảy ra ở nồng độ + + - từ 400 đến 500mg/l NH4 , hay khi NH4 được biến đổi thành NO2 ở tốc độ cao - - + hơn NO2 được biến đổi thành NO3 . Vì vậy sự quá dư thừa NH4 chảy ra hay sự khử nhóm NH2 của những hợp chất nitơ hữu cơ có thể ức chế quá trình nitrate hóa. Ngoài những vi khuẩn có khả năng quang hợp ra, sự bức xạ cực tím gây tổn hại đến hầu hết các loại vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn nitrate hóa. Hầu hết những bước sóng gây hại là 265nm. Có thể do bức xạ tia cực tím là nguyên nhân gây ra sự ngưng hoạt động của hệ thống enzyme, đặc biệt là những tế bào còn non hay những tế bào đang tăng trưởng nhanh chóng. Bảng 1.6: Những dạng của sự ức chế và độc chất Dạng của sự ức chế hay độc Sự mô tả và ví dụ chất Cl2 tự do còn dư lại Khử trùng bằng clo của RAS và nhánh. Vô cơ Những kim loại nặng và cyanide. Hữu cơ Những chất thải công nghiệp, e.g., phenol. pH 5.0 Cơ chất NH3 tự do và NHO2 tự do. Ánh sáng mặt trời Sự bức xạ cực tím. Nhiệt độ 5oC 28 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.7 Giới thiệu về vi khuẩn oxi hoá ammonia Winograsky là người đặt nền tảng nghiên cứu về các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia vào năm 1892. Tuy vậy, việc phân lập và nghiên cứu sâu hơn về các loại vi khuẩn này đã không được tiếp nối trong một thời gian dài, người ta chỉ biết đến chủng Nitrosomonas europaea. Bắt đầu từ năm 1960, Waston và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia khác nhau. Từ đó đến nay, kiến thức về loại vi khuẩn này liên tục được cập nhật, người ta đã dùng kĩ thuật PCR để xác định đoạn gen amoA (mã hoá cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khoá trong quá trình oxi hoá ammonia là ammonia monooxygenase- AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridiza-tion). Với các thành tựu này, việc kiểm soát các loài vi khuẩn oxi hoá ammonia trong thực tế trở nên dễ dàng hơn rất nhiều. 1.7.1 Đặc điểm về giống Việc phân loại vi khuẩn này về cơ bản dựa vào hình dáng của tế bào, sau đó là sự sắp xếp của màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane). Với các tiêu chí này, người ta đã phân loại vi khuẩn nitrat hoá thành 5 giống chính là: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Trong đó, hiện có 16 loài vi khuẩn đã được phân biệt dựa vào hoạt động của carboxysome, hoạt tính urease, tốc độ chuyển hoá NH3, nồng độ tới hạn ammonia trong môi trường, yêu cầu về độ mặn và nồng độ muối tới hạn. 29 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Bảng 1.7 : Các đặc điểm phân loại giống của vi khuẩn Nitrat hoá Đặc điểm Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosovibrio Hình dạng Dạng tròn đến Dạng thuỳ Dạng que Cuộn xoắn Dạng que ellipse đa thẳng mảnh, ốc hình hơi cong Kích thước 1,5-1,8x1,7-2,5 1,0-1,5x1,0- 0,7-1,5x1,0- 0,3-0,8x1,0- 0,3-0,4x1,1- (μm) 2,5 2,4 8,0 3,0 Kiểu tiên Mọc thành Mọc rải rác Mọc ở cực Mọc rải rác Mọc ở cực mao chùm Cấu trúc Có lỗ xuất hiện Chia thành Có lỗ xuất Gấp cuộn Gấp cuộn vào thành cụm nhiều ngăn hiện rải rác vào bên trong màng bên trong 1.7.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các giống vi khuẩn oxi hoá ammonia 1.7.2.1 Giống Nitrosomonas sp (Winogradsky, 1982): tế bào về cơ bản là hình que, màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rải rác, đôi khi lớp màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất. Không di động hoặc có một tiên mao ở cực, thường đứng riêng lẻ, theo cặp, chuỗi ngắn, tạo thành những đám tế bào phân bố không đều. Oxi hoá ammonia thành nitrit nhanh nhất trong các loài vi khuẩn thuộc cùng họ. + Nitrosomonas europaea: dạng hình que, khuẩn lạc nhỏ, đặc, dễ nhận thấy, có màu hơi nâu trên silica gel. Phát triển dễ dàng ở môi trường lỏng không có chất hữu cơ. Môi trường sống phải chứa ammonium sulfate, potassium phosphate và magnesium carbonate. Tế bào tích luỹ thành những lớp sinh khối mỏng xung quanh những hạt magnesium carbonate ở dưới đáy erlen. Dịch tế bào đôi khi bị đục do sự phát triển bởi sự di động của đám tế bào đứng cụm hoặc riêng lẻ. Sống hiếu khí, sống tự dưỡng nghiêm ngặt. + Nitrosomonas monocella: Dạng que ovan, 0.6-0.9μm, khi tế bào còn nhỏ có dạng hình cầu. Thường đứng theo cặp, di động nhờ tiên mao ở cực có chiều dài từ 3-5 lần so với tế bào, gram dương. Trên silica gel hay đĩa petri agar thì không có khuẩn 30 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH lạc đặc trưng. Nhưng có màu hơi vàng nâu, sinh khối phát triển xung quanh các hạt CaCO3 trong môi trường. Phát triển trong môi trường khoáng vô cơ có chứa muối ammonium, phát triển đồng nhất trong dung dịch cũng như trong cặn CaCO3 dưới đáy erlen. Thậm chí trong môi trường có tích luỹ nồng độ thấp chất hữu cơ cũng làm chậm hoặc ức chế sự bắt đầu sinh trưởng của vi khuẩn. Dịch chiết từ thực vật gây độc cho vi khuẩn. Khí CO2 và O2 cần thiết cho sư sinh trưởng. Sống hiếu khí, sống tự dưỡng nghiêm ngặt. Phân bố ở trong đất trồng trọt. Hình 1.3: Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học Hình 1.4: Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử 1.7.2.2 Giống Nitrosococcus sp: tế bào có hình cầu lớn, không di động, không tạo thành đám khuẩn lạc nhầy (zoogloea) 31 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH + Nitrosococcus nitrosus: hình cầu lớn, kích thước 1.5-1.7μm với lớp màng mỏng ở ngoài, khả năng di động chưa được chứng minh, gram dương. Trên silica gel thì có cả khuẩn lạc tối và khuẩn lạc sáng, bề mặt khuẩn lạc trong giống như một giọt dịch vàng nhạt, hơi đục. Phát triển làm đục môi trường lỏng, song hiếu khí, nhiệt độ tối ưu trong khoảng 20-25oC, phân bố ở trong đất. Hình 1.5: Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus 1.7.2.3 Giống Nitrosospira sp: tế bào có dạng xoắn ốc, oxi hoá ammonia thành nitrit rất chậm +Nitrosospira briensis: tế bào cuộn xoắn rất chặt tạo thành những ống dài đến 15- 20μm. Những vòng xoắn nhỏ hơn được tạo từ các tế bào có hình que ngắn hoặc elip. Một số tế bào dạng cầu nhỏ được quan sát thấy ở những dịch nuôi cấy lâu ngày. Khuẩn lạc trên silica gel nhỏ, thỉnh thoảng những tế bào kết lại thành dạng u nhỏ nhưng những hạt này phát triển kém hơn so với những hạt khuẩn lạc ở giống Nitrosocystis. Sống hiếu khí, pH thích hợp từ 7-7.2, phân bố ở trong đất. + Nitrososipira Antarctica: tế bào và khuẩn lạc trông rất giống dòng Nitrosospira briensis ngoại trừ tế bào về tổng thể thì cuộn lại với nhau tạo những vòng xoắn chặt hơn. 32 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.6: Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira 1.7.2.4 Giống Nitrosocystis sp.: tế bào hình elip hoặc dạng dài, kết hợp khá chặt, liên kết thành từng đám bởi một lớp màng tạo thành các khối u nhỏ. Những khối u này khi tan ra sẽ giải phóng tế bào tự do, đặc biệt khi chuyển sang môi trường mới. Các tế bào bên trong khối u này gắn với nhau bởi chất nhầy. Khả năng oxi hoá ammonia thành nitrit thì thấp hơn Nitrosomonas sp. nhưng cao hơn Nitrosospira. +Nitrosocystis javanensis: có dạng elip nhỏ, có đường kính 0.5-0.6μm, có tiên mao ở cực, có chiều dài gấp 20 lần tế bào. Trên silica gel thì khuẩn lạc có dạng tròn đến elip, trở nên nhạt hoặc có màu nâu nhạt. Trong dịch lỏng, sinh khối tạo thành những đám tế bào rất đặc (giống hạt bùn nhỏ). Sống hiếu khí, tự dưỡng nghiêm ngặt. Phân bố trong đất. +Nitrosocystis coccoides: tế bào hình elip có đường kính 1.5μm, tế bào liên kết rất chặt chẽ với nhau tạo thành những đám dịch nhầy. Tế bào ít khi đứng riêng lẻ mà thường đứng thành cặp và những nhóm nhỏ từ 4 tế bào trở lên. Có khả năng di động. Khuẩn lạc trên silica gel phát triển thì làm lớp áo CaCO3 bên ngoài có màu vàng nhạt và hoà tan, khuẩn lạc xuất hiện phình ra và cứng chắc, tạo thành những hạt nhỏ màu nâu có đường kính 0.5mm. Tế bào phát triển chặt với nhau tạo thành 33 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH những quần thể phồng ra không đều. Sống hiếu khí, xuất hiện trong đất rừng, phân bón. 1.7.2.5 Giống Nitrosogloea sp.: tế bào dạng elip hoặc dạng que. Gắn với nhau bởi lớp nhầy tạo thành đám khuẩn lạc nhầy. Không có màng bao xung quanh những đám khuẩn lạc này. + Nitrosogloea merismoides: tế bào elip từ 0.5-1.5μm. Hình ovan hay que ngắn tạo thành chuỗi, mỗi nhóm có màng bao riêng. Các nhóm này rất khác nhau về mức độ phân nhánh của chuỗi, là tập hợp tế bào khá chặt và không theo quy luật. Tế bào trên silica gel thì bao bọc bởi lớp nhầy màu vàng làm cho khuẩn lạc có dạng đục không rõ. Khuẩn lạc trên bề mặt thạch rải rác tạo thành những hạt u nhỏ. Sống hiếu khí, phân bố ở bùn hoạt tính. + Nitrosogloea schizobacteroldes: dạng que dài hoặc sợi nhỏ, dài từ 3- 4μm. Khuẩn lạc trên silica gel thì tạo thành nhóm tế bào bằng phẳng được liên kết bởi lớp màng mỏng. Tập hợp này hình thành những miếng cơ giả, do sự đan xen của những sợi nhỏ giống như miếng đệm của sợi nấm. Miếng đệm này có thể lấy ra như một phần tử khỏi môi trường. Sống hiếu khí + Nitrosogloea membranacea: tế bào dạng elip thường xuất hiện thành cặp hoặc đứng riêng lẻ. Khuẩn lạc trên silica gel tạo thành những hạt nhầy có màu vàng rơm. Sống hiếu khí, phân bố trong bùn hoạt tính. 1.7.3 Những loài vi khuẩn Nitrosomonas sp. tiêu biểu: 1.7.3.1 Nitrosomonas europaea Vi khuẩn này được đặt tên là europaea vì được phân lập lần đầu tiên ở châu Âu (1892), có dạng hình que, hai cực tế bào có dạng hình tròn, kích thước từ 0,8- 1,1 x 1,0-1,7 μm, về cơ bản thì tồn tại từng tế bào riêng lẽ, Gram âm. Khả năng di động thì chưa được ghi nhận. Carboxysome cũng không có trong tế bào chất. Không có hoạt tính urease. Ở pH khoảng 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ muối ammonium lên đến 400 mM. Hằng số Ks oxi hoá NH3 nằm trong khoảng 30-56 μM. Tuy không đòi hỏi phải có muối trong môi trường, nhưng tế bào có thể chịu 34 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH được nồng độ muối NaCl lên đến 500 mM. Vi khuẩn phân bố ở các hệ thống xử lý rác, nguồn nước bị phú dưỡng hoá và thỉnh thoảng tồn tại trong đất. Hình 1.7: Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học. Bar = 5 μm Hình 1.8: Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử. Ba r = 1 μm 35 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.7.3.2 Nitrosomonas eutropha Vi khuẩn này có tên eutropha có nghĩa là sống ở nơi có hàm lượng dinh dưỡng cao, có nhiều hình dạng từ hình que đến hình trái lê, kích thước 1,0-1,3 x 1,6-2,3 μm, thỉnh thoảng kết thành chuỗi ngắn. Cấu trúc thành tế bào Gram âm. Hầu hết các dòng đều có thể di động được. Carboxysome nằm trong tế bào chất. Tế bào không có hoạt tính urease. Ở pH 7,8 thì khả năng chịu nồng độ muối ammonium lên đến 600 mM và hằng số Ks oxi hoá NH3 là 35-36 μM. Không đòi hỏi phải có muối trong môi trường, nhưng tế bào vẫn sống được khi nồng độ NaCl lên đến 500 mM. Rất thường thấy ở số lượng nhiều trong các cống rãnh, nguồn nước phú dưỡng và thỉnh thoảng ở trong đất. Hình 1.9: Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm 1.7.3.3 Nitrosomonas marina Vi khuẩn này có tên marina vì thường gặp ở biển. Tế bào dạng que dài, ở 2 đầu có dạng hình tròn, kích thước 0,7-0,9 x 1,4-2,3 μm. Cấu tạo thành tế bào Gram âm, có thêm một lớp bổ sung bên ngoài được cấu tạo bởi một dãy các đại phân tử. Khả năng di động chưa được ghi nhân. Không có carboxysome. Cần phải có muối trong môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl tối ưu cho vi khuẩn nằm trong khoảng 400 mM, tế bào có thể chịu đến nồng độ 800 mM. Ngoài ra, tế bào có thể chịu 36 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH được nồng độ muối ammonium đến 200 mM ở pH 7,8. Hoạt tính urease dương tính. Phân bố phổ biến ở biển và các khu vực ven biển. Hình 1.10: Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1 μm Hình 1.11: Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm 37 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.7.3.4 Nitrosomonas mobilis Vi khuẩn có tên mobilis nghĩa là di động được. Về cơ bản, tế bào có dạng hình cầu, đường kính từ 1,5 đến 1,7 μm. Tuy nhiên, một số dòng có dạng hình que, kích thước 1,5-1,7 x 1,7-2,5 μm. Tế bào thường ở dạng đơn hoặc cặp đôi, thỉnh thoảng kết thành chuỗi ngắn. Cấu trúc thành tế bào Gram âm. Tế bào di động nhờ một bó sợi gồm từ 1 đến 22 tiên mao, có chiều ngang khoảng 12 nm và chiều dài 3- 5 μm. Không có carboxysome trong tế bào chất. Tế bào sống ở nơi có độ mặn vừa, với nồng độ NaCl tối ưu khoảng 100 mM, tuy nhiên khi tăng nồng độ lên đến 600 mM thì tế bào vẫn sống được. Ở pH 7,8 thì tế bào chịu được nồng độ các hợp chất ammonium đến 300 mM. Hoạt tính urease âm tính. Dòng vi khuẩn này được phân lập ở khu vực nước lợ và các hệ thống xử lý nước thải. Hình 1.12:. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1μm 38 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.13: Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm 1.8 Giới thiệu về vi khuẩn oxi hoá nitrite Phần lớn vi khuẩn oxi hoá nitrite thuộc nhóm Gram âm, sử dụng nitrite là nguồn sinh năng lượng và CO2 là nguồn carbon chính. Các vi khuẩn thuộc nhóm này sống tự dưỡng hoá vô cơ nghiêm ngặt, ngoại trừ giống Nitrobacter có thể sống trên môi trường hữu cơ. Đồng thời Nitrobacter còn có khả năng khử nitrate trong điều kiện kị khí để thu năng lượng. Vi khuẩn oxi hoá nitrite có nhiều hình dạng khác nhau như dạng que, cầu và dạng xoắn. Về mặt lịch sử nhóm vi khuẩn này được tìm ra dựa trên hình dạng tế bào và sự sắp xếp của màng bao tế bào chất, các khoá phân loại dựa trên công trình nghiên cứu của Sergei và Helene Winogradsky năm 1892. Thời gian sinh trưởng của nhóm vi khuẩn này thường thấp, thời gian thế hệ kéo dài từ 8 giờ đến vài ngày. Tốc độ sinh trưởng bị chi phối bởi mức độ tập trung cơ thể, nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxy hoà tan. Phần lớn vi khuẩn oxi hoá nitrite phát triển rất tốt ở nồng độ nitrite từ 2-30mM ở pH 7.5-8 và nhiệt độ 25-30oC. Khi lên men trong môi trường hỗn hợp giữa khoáng vô cơ và các chất hữu cơ thì sinh khối cao gấp 10 lần so với trong môi trường chỉ có khoáng vô cơ. 39 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.8.1. Đặc điểm về giống Việc phân loại vi khuẩn oxi hoá nitrite về cơ bản là sự khác nhau ở đặc điểm hình thái, kiểu gen và đặc tính sinh hoá. Với các tiêu chí này, người ta đã phân loại vi khuẩn oxi hoá nitrite thành 4 giống chính: Nitrobacter, Nitrosococcus, Nitrospina, Nitrospira. Trong đó có 8 loài vi khuẩn được phân biệt dựa trên các đặc điểm cụ thể: kích thước tế bào, cấu trúc tinh thể màng bao tế bào, sự hiện diện của carboxysome và đặc điểm phân bố. 1.8.2. Đặc điểm sinh lý-sinh hoá của các giống vi khuẩn oxi hoá nitrite 1.8.2.1 Giống Nitrobacter sp: tế bào dạng que, oxi hoá nitrite thành nitrate. + Nitrobacter winogradsky: hình que nhắn, không di động với màng bao gelatin, không dễ nhuộm màu, gram âm. Khuẩn lạc trên agar từ 7-10 ngày rất bé, có màu nâu nhạt, có dạng tròn, sau 10 ngày thì khuẩn lạc đậm màu hơn. Trên silica gel thì khuẩn lạc nhỏ hơn nhưng đậm đặc hơn trên agar. Trên thạch nghiêng sau 7-10 ngày thì khuẩn lạc xuất hiện ít, không rõ, có màu xám. Có thể nuôi cấy trong môi trường không có chất hữu cơ, nhạy cảm với sự có mặt của một số hợp chất hữu cơ nhất định. Trong môi trường không có chất hữu cơ, sau 10 ngày tạo thành bùn kết bông, nhạy cảm với muối ammonium trong môi trường kiềm. Sống hiếu khí, sông tự dưỡng nghiêm ngặt. + Nitrobacter agilis (sau này người ta xếp loại này vào một dòng của Nitrobacter winogradsky): hình que 0.5-0.9μm, thỉnh thoảng đứng thành cặp hoặc đám tế bào lớn. Di động rất nhanh nhờ vào một tiên mao dài từ 7-10 lần chiều dài tế bào. Trên agar có nitrite thì sau 2 tuần, khuẩn lạc có dạng nửa cầu nhô lên, khuẩn lạc trong suốt. Môi trường vô cơ phải chứa nitrite, tế bào phân tán đều trong môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ thích hợp từ 25-30oC, cho oxi hoá là 28oC, nhiệt độ bị chết ở 60oC trong 5 phút. Sống tự dưỡng, phân bố ở nhà kính, bùn hoạt tính, đất, ao nuôi thuỷ sản. 40 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 1.8.2.2 Giống Nitrocystis sp.: tế bào dính với nhau thành màng lớn, khuẩn lạc nhầy, nổi lên khối u nhỏ + Nitrocystis sarcinoides: dạng que nhỏ, kích thước 0.5×1μm. Tế bào có dạng elip, tập hợp tế bào giống như những hạt kê nhỏ. Trên silica gel khuẩn lạc xuất hiện như những hột nhỏ có màu hổ phách, nổi lên. Khuẩn lạc có thể lớn đến 5mm về đường kính, rất nhầy và nhớt khi còn nhỏ và trở nên nâu dần theo thời gian, chặt lại giống như lớp vảy và hình thành những hạt nhỏ như cát. Mỗi khuẩn lạc được bao bên ngoài bởi một vài lớp màng nhầy để giữ chúng sát nhau và do đó cả khuẩn lạc sẽ dính vào que cấy khi cấy chuyền. Sống hiếu khí, ở bùn hoạt tính. + Nitrocystis micropunetata: tế bào dạng que, elip, khoảng 0.5μm đường kính, rất khó nhuộm ngoại trừ ở 2 đầu tế bào, bao bọc bởi lớp vỏ nhầy. Khuẩn lạc trên silica gel thì giống như Nitrocystis sarcinoides ngoại trừ có viền rất rõ và chắc hơn. Tế bào không dính với nhau bởi lớp màng nhầy trong khuẩn lạc như ở Nitrocystissarcinoides. Lớp vỏ của khuẩn lạc thì rất dễ phân biệt giữa khuẩn lạc già và trẻ. 1.8.3 Những loài vi khuẩn Nitrobacter sp. tiêu biểu 1.8.3.1 Nitrobacter winogradsky Tên dòng vi khuẩn này được đặt theo tên nhà sinh vật học Winogradsky là người đầu tiên phân lập được nó. Vi khuẩn có dạng que ngắn, hình quả lê, thỉnh thoảng có dạng cầu, kích thước 0.6-0.8 x 1.0-2.0 μm. Carboxysome thường xuất hiện ở dạng thể vùi trong nguyên sinh chất. Tế bào có thể di động nhờ tiên mao ở gần cực và bên hông. Nhiều dòng vi khuẩn nitrite hoá này là loại hoá tự dưỡng không bắt buộc. Khi nuôi trên môi trường có nhiều loại dinh dưỡng, vi khuẩn nitrite hoá sẽ ưu tiên dùng nitrite trước, sau đó mới oxi hoá các hợp chất hữu cơ còn lại. Vi khuẩn cũng có thể sử dụng pyruvate, acetate và glycerol như nguồn sinh năng lượng, cùng với dịch chiết nấm men, casamino acid, peptone, NH3 và nitrate như nguồn cung cấp nitơ. Dưới điều kiện môi trường gồm các chất khoáng vô cơ hay môi trường hỗn hợp nhiều loại dinh dưỡng, thời gian thế hệ dao động từ 8 đến 14 giờ. Trong khi ở môi trường giàu chất hữu cơ thì vi khuẩn phát triển chậm 41 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH nên thời gian thế hệ từ 70 đến 100 giờ. Vi khuẩn có khả năng sống trong điều kiện kị khí với nitrate là chất nhận điện tử và tạo ra các dạng nitrite, nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O). Tế bào ít nhạy cảm với oxy khi được chuyển từ điều kiện kị khí sang điều kiện hiếu khí. NO có thể là nguồn cơ chất thay thế nitrite cho vi khuẩn oxi hoá trong điều kiện hiếu khí thành nitrate. Những dòng vi khuẩn điển hình chủ yếu được phân lập từ đất. Ngoài ra, vi khuẩn này còn phân bố ở nước ngọt, biển, cống rãnh, hệ thống xử lý nước thải và phân bón. Hình 1.14: Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng que ngắn. Bar =1 μm 1.8.3.2 Nitrobacter alkalicus Vi khuẩn này có tên alkalicus nghĩa là alkaline, độ kiềm vì khả năng sống trong pH kiềm khá cao từ 6.5 đến 10.2 và pH tối thích là 9.5. Vi khuẩn có dạng quả lê, kích thước từ 0.6-0.8 x 1.2-1.8 μm. Vách tế bào có thêm một lớp bọc bên ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein theo một trật tự nhất định. Nitrite là nguồn sinh năng lượng cho vi khuẩn ở điều kiện môi trường khoáng vô cơ, trong khi môi trường hữu cơ thì người ta không ghi nhận được sự phát triển của vi khuẩn. Đối lập với các loại vi khuẩn nitrite hoá khác, người ta không phát hiện thấy carboxysome trong vi khuẩn này, do đó để sinh trưởng thì vi khuẩn bắt buộc phải dùng nguồn carbon ở dạng ion carbonate. Vi khuẩn này được phân lập ở lớp 42 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH bùn trong các hồ nước khoáng có hàm lượng Na2CO3 cao (soda lake) hoặc từ đá vôi, đá khoáng ở Siberia và Kenya. Hình 1.15: Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10. Bar = 0,1 cm Hình 1.16: Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi. Bar = 1 μm 43 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.17: Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm 1.8.3.3 Nitrobacter hamburgensis Vi khuẩn được phân lập đầu tiên ở thành phố Hamburg, Đức, và để tưởng nhớ sự kiện đó người ta đã đặt tên thành phố cho dòng vi khuẩn này. Hình thái và cấu trúc tế bào tương tự như các dòng vi khuẩn nitrite hoá khác. Carboxysome hiện diện ở tế bào chất. Khả năng di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông. Phát triển kém trên môi trường khoáng vô cơ nhưng lại có khả năng phát triển tốt ở môi trường hỗn hợp. Khi môi trường có nitrite, pyruvate, dịch chiết nấm men và peptone thì tốc độ sinh trưởng đạt cao nhất. Đây là dòng duy nhất có thể phát triển tốt trong môi trường có chất hữu cơ. Cả nirtite và chất hữu cơ đều được sử dụng trong quá trình biến dưỡng của tế bào. Tế bào còn có thể khử nitrate để phục vụ quá trình sinh trưởng. Vi khuẩn khá nhạy cảm với oxy khi chuyển từ điều kiện kị khí sang hiếu khí. Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất ở Hamburg (Đức), Yucatan (Mecico) và Corse (Pháp). 44 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.18: Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. Bar =250nm. 1.8.3.4 Nitrobacter vulgaris Vulgaris trong tiếng La tinh nghĩa là phổ biến. Đặc điểm hình thái và cấu trúc tương tự như các dòng nitrite hoá khác. Carboxysome hiện diện trong tế bào chất. Phần lớn tế bào trong dòng này có 2 pha sinh trưởng, pha đầu tiên sẽ oxi hoá nitrite thường, pha thứ hai oxi hoá các hợp chất hữu cơ khác. Mức độ sinh trưởng trong pha đầu tiên (hoá tự dưỡng) thường chậm hơn pha thứ hai (hoá dị dưỡng). Cả nitrate và oxy đều là chất nhận điện tử và acetate hoặc pyruvate là chất cho điện tử khi tế bào sử dụng hợp chất hữu cơ. Tế bào sản sinh ra những polymer ngoại bào giúp liên kết những tế bào xung quanh lại tạo thành cụm, màng (biofilm). Điểm khác biệt với các dòng nitrite hoá khác là vi khuẩn Nitrobactervulgaris không nhạy cảm với oxy chuyển từ môi trường kị khí sang môi trường hiếu khí. Trên màng nguyên sinh chất ở Nitrobacter vulgaris thì chỉ có duy nhất một loại cytochrome 32 kDa trong khi ở N. winogradsky và N. hamburgensis thì có cả loại cytochrome 30 kDa. Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất, nước ngầm, nước ngọt hoặc nước lợ, cống rãnh và cả trong tổ mối. N. vulgaris là loài phổ biến nhất trong loài Nitrobacter, thậm chí nó có xuất hiện trong bê tông và những toà nhà xây dựng từ đá, gạch. 45 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.19: Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và carboxysome. Bar = 250 nm. 46 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ TĂNG SINH, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH VI KHUẨN NITRAT HOÁ 47 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 2.1 Các nghiên cứu liên quan đến quá trình phân lập, nuôi cấy các chủng vi khuẩn Nitrate hóa Sự phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã được thực hiện thành công đầu tiên bởi Winogradsky (1890). Sự thành công này của ông đã được biết đến vài năm trước khi quá trình nitrate hóa được tìm ra là do những sinh vật sống thực hiện (Schloesing &Muntz, 1877) và sự cố gắng của Frankland cùng các cộng sự (1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại. Bằng sự hiểu biết sâu sắc của mình, Winogradsky đã khám phá ra phương thức tự dưỡng trong sự sống của những vi khuẩn oxi hóa lưu huỳnh và sắt; và đi đến kết luận rằng những vi khuẩn nitrate hóa cũng có thể là tự dưỡng, và vì vậy ông đã thành công trong việc phân lập chúng bằng việc sử dụng những môi trường phân lập nuôi cấy không phải từ chất liệu hữu cơ. Trong năm 1892, Winogardsky đã mô - tả được 2 chủng, Nitrosomonas vàNitrosococcus (chúng oxi hóa NH3 ) và một - chủng Nitrobacter (chúng oxi hóa NO2 ). Và sau đó, những phương pháp nghiên cứu phân lập của ông đã được sử dụng rộng rãi thành công bởi những nghiên cứu tiếp theo sau của các nhà khoa học cùng các cộng sự của họ như: Boullanger & Massol (1903), Bonazzi (1919), Gibbs (1919), Nelson (1931) và Kingma Boltjes (1934, 1935). Năm 1950, bằng phương pháp cải tiến từ phương pháp của Winogradsky, Jane Meiklejohn đã thành công trong việc phân lập chủng Nitrosomonas europaea từ sự nuôi cấy thuần khiết. Và cũng trong nghiên cứu này, bà cũng đã tìm ra được môi trường thích hợp (có bổ sung thành phần vi lượng cần thiết) để duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa (qua nhiều lần cấy chuyển môi trường để tăng sinh mà không bị mất hoạt tính như ban đầu bà đã vấp phải khi mới bắt đầu nghiên cứu). Năm 1958, bằng nghiên cứu thực nghiệm của mình, R.F.Lewis và D.Pramer đã khám phá ra rằng: sự phân lập Nitrosomonas tốt hơn khi có sự kết hợp với những vi khuẩn dị dưỡng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy. 48 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện ra và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hóa NH3 khác. Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch được Nitrosomonas và Nitrosocystis spp. bằng việc sử dụng môi trường agar tinh chế và một phương pháp thu nhận những tập đoàn với những pipet mao quản thủy tinh được hoạt động bởi máy vi thao tác đơn trước đây đã được mô tả bởi Soriano (1935). Năm 1998, Martin Hesselsøe và Sørensen đã tìm ra được một kỹ thuật vi khuẩn lạc để ước lượng khả năng phát triển của vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas europaea và Nitrosospira sp. dựa trên sự phân ra trên những màng lọc. Năm 2003, Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer và nhiều cộng sự khác nữa đã thành công trong việc tìm ra và hoàn tất chuỗi gene của vi khuẩn nitrite hóa và chủng Nitrosomonas europaea. Mới đây, 3 nhà khoa học: Kh.Elbanna, R.M.El-Shahawy và K.M.Atalla (2011) đã tìm ra được một phương pháp mới đơn giản là sử dụng những chất chỉ thị hóa học thay thế những phương pháp hóa học cổ điển để điều tra những vi khuẩn nitrate hóa trong những môi trường khác nhau với hiệu quả rất cao. Và ngày nay với sự tiến bộ vượt bậc về mặt khoa học kỹ thuật, người ta đã áp dụng kỹ thuật PCR để xác định đoạn gene amoA (mã hóa cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khóa trong quá trình nitrite hóa là ammonia monooxygenase- AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (Fluorescence in situ hybridization). Và đã có nhiều ứng dụng các chủng vi khuẩn nitrate hóa vào thực tiễn cuộc sống và đặc biệt nhất là ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào hệ thống xử lý nước thải để xử lý các chất thải có bản chất nitơ với hiệu quả rất cao. Trên thị trường Việt Nam hiện nay có rất nhiều chế phẩm sinh học được giới thiệu để xử lý nước thải, trong đó có nước thải giàu nitơ như:TP- 05- Super (Công 49 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Thú Y, Biên Giang, Thành phố Hà Đông, Hà Nội), Tidy Pro, Bio 100 Treatment (Công ty TNHH Giải Pháp chăn Nuôi Xanh, 18/6A ấp Mới 1, xã Tân Xuân, huyện Hóc Môn, Tp Hồ Chí Minh), C.Zyme, M.Zyme (Công ty TNHH Long Hiệp, Lô B1, KCN Suối Dầu, Cam Lâm, Khánh Hoà) , theo đăng ký có ghi sự có mặt của các vi khuẩn nitrate hóa . Tuy nhiên, hoạt lực của các chế phẩm này không rõ ràng, đó là lý do tại sao chúng tôi quyết định tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập vi khuẩn nitrate hóa để xử lý nước thải giàu nitơ. 2.2. Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính vi khuẩn nitrate hóa Hai đối tượng vi khuẩn nitrate hóa được quan tâm, vi khuẩn oxy hóa amoni (ammonium oxidizing bacteria – AOB) sinh ra nitrite và vi khuẩn oxy hóa nitrite (nitrite oxidizing bacteria – NOB) sinh ra nitrate. 2.2.1 Nguồn phân lập Phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa trên mẫu nước thải chế biến thủy sản, nước thải sinh hoạt 2.2.2. Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát vi khuẩn nitrat hoá 50 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Mẫu nước thải Tăng sinh AOB Tăng sinh NOB Khảo sát định tính khả năng chuyển Phân lập chủng thuần khiết + hóa NH4 - Khảo sát khả năng chuyển hóa NO2 + Khảo sát động học chuyển hóaNH4 - Khảo sát động học chuyển hóa NO2 Hình 2.1. Sơ đồ tăng sinh, phân lập và khảo sát vi khuẩn nitrate hóa 2.2.3 Mô tả phương pháp tiến hành - Môi trường Winogradsky phân lập Nitrosomonas spp. (W1) (NH4)2SO4: 2g/l K2HPO4.3H2O : 1.308g/l MgSO4.7H2O : 0.5g/l FeSO4.7H2O : 0.4g/l NaCl : 2g/l CaCO3: 5g/l Nước cất 1l - Môi trường phân lập Nitrobacter spp. (W2) NaNO2: 1.0g/l 51 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH MgSO4.7H2O : 0.5g/l FeSO4.7H2O :0.03g/l NaCl : 0.3g/l Na2CO3: 1.0g/l K2HPO4.3H2O : 1.308g/l Nước cất 1l + + Tăng sinh và phân lập vi khuẩn nitrite hóa và khảo sát chuyển hóa NH4 trong môi trường nước thải nhân tạo: Mẫu nước thải chế biến thủy sản được pha loãng theo dãy thập phân đến nồng độ 10-3, dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu cho vào từ các nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 và 10-3 vào 10 bình tam giác đã chứa sẵn môi trường AOB hoặc W1 vô trùng. Bình đối chứng (ĐC) thay thế nước thải bằng nước cất. Lắc 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 2oC), trong vòng 2 – 3 tuần trong tối. + + Khảo sát hoạt tính chuyển hóa NH4 trong môi trường nhân tạo: Các bình mẫu sau thời gian tăng sinh, tiến hành kiểm tra hoạt tính AOB trong + môi trường nhân tạo có chứa NH4 , khảo sát theo dõi tại các thời điểm sau mỗi 2 + - - ngày. Kiểm tra định tính và định lượng NH4 , NO2 & NO3 , kiểm tra hàm lượng N- ammoni còn lại, kiểm tra hàm lượng N-nitrite và hàm lượng N-nitrate tạo thành. Từ kết quả định tính và định lượng, tiến hành loại bỏ các bình mẫu tăng sinh không cho hoạt tính AOB, chọn lọc các bình có hoạt tính AOB tốt để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. Giống AOB được tăng sinh trong thí nghiệm trên sau khi kiểm tra có hoạt tính + chuyển hóa tốt được cấy vào bình chứa môi trường AOB chứa N-NH4 . Bình đối chứng không cấy giống vi khuẩn AOB. pH của môi trường được chỉnh về ở 7.6 - 7.8. Các mẫu được lắc 210 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong tối. Tại các thời điểm: 0 ngày, 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày tiến hành lấy mẫu và 52 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH định lượng 3 chỉ tiêu N-ammoni còn lại, N-nitrite và N-nitrate tạo thành trong canh trường nuôi cấy. + + + Hiệu quả xử lý NH4 là tỉ lệ giảm N-NH4 trong môi trường giàu NH4 , trong khi + - đó hiệu quả nitrate hóa là tỉ lệ phần trăm N-NH4 chuyển hóa thành tổng N-NO2 và - N-NO3 . + Hiệu quả xử lý NH4 (%) (N-amoniĐC– N-amoniTN)/N-amoniĐC*100 Hiệu quả nitrate hóa (%) (N-nitriteTN N-nitrateTN)/N-amoniĐC*100 + Tăng sinh NOB: Từ mẫu nước thải tiến hành tăng sinh vi khuẩn nitrate hóa NOB trên môi trường W2 tương tự như đối với AOB, kiểm tra tính nitrate hóa bằng phương pháp định tính, chọn các ống nghiệm có hoạt tính nitrate hóa, tăng sinh trong bình tam giác chứa môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l) trong 48 giờ, lắc 210 vòng/ phút trong tối, chọn các bình định tính khả năng nitrate hóa mạnh để tiến hành phân lập chủng thuần khiết. + Phân lập chủng thuần khiết NOB: Từ các bình tăng sinh có hoạt tính nitrate hóa, chủng thuần khiết được thu nhận bằng cách ria trên đĩa thạch chứa môi trường W2 agar. Tiến hành quan sát khuẩn lạc, nhuộm gram, nhuộm tiêm mao, nhuộm bào tử, khảo sát khả năng di động. + Chọn lọc chủng NOB: Từ những những vi khuẩn nitrate hóa được phân lập thuần khiết trên, chọn chủng có khả năng chuyển hóa nitrite mạnh nhất bằng cách lập lại thí nghiệm tăng - sinh NOB nhưng cấy vi khuẩn đã phân lập thuần khiết. Khảo sát chuyển hóa NO2 - - qua phân tích NO2 và NO3 . - + Khảo sát động học oxy hóa NO2 của các chủng chọn lọc: Nhân giống NOB: Các chủng NOB đã chon lọc được nhân giống trong bình tam giác chứa môi trường lỏng NOB (1g NaNO2/l) lắc 48 giờ. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD ở 600nm, từ đó chuẩn hóa nồng độ tế bào khi cấy vào bình khảo sát. Bình khảo sát cũng chứa môi trường NOB như trên. Điều kiện - - thí nghiệm như điều kiện tăng sinh NOB. Theo dõi NO2 và NO3 ở thời điểm 0 ngày – 2 ngày – 4 ngày – 6 ngày – 8 ngày – 10 ngày và 12 ngày. 53 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - - - Hiệu quả xử lý NO2 là tỉ lệ giảm N-NO2 trong môi trường giàu NO2 , trong khi đó - - hiệu quả nitrate hóa là tỉ lệ N-NO2 thành N-NO3 - - - - Hiệu quả xử lý NO2 (%) (N-NO2 ĐC– N-NO2 TN)/N-NO2 ĐC*100 - - Hiệu quả nitrate hóa (%) (N-NO3 TN)/N-NO2 ĐC*100 - 2.2.4. Phương pháp định lượng N-NO2 (Nguyễn Văn Phước, 2005) - Xác định hàm lượng nitrite trong mẫu bằng phương pháp so màu, với sự bắt màu của nitrite trong mẫu với acid sulfanilic và napthylamine. Sử dung máy so màu spectrophotometer ở bước sóng 520nm. - Từ bình mẫu nuôi cấy, lắc đều, dùng micropipet và đầu tuýt vô trùng hút 10µl mẫu cho vào Erlen thêm 25ml mước cất vào Erlen chứa mẫu thêm: 0.5ml dd EDTA và 0.5ml dd Acidsulfanilic vào Erlen đợi trong 10 phút thêm tiếp: 0.5ml dd Naphthylamine và 0.5ml dd đệm Acetate vào Erlen đợi trong 20 phút lắc mẫu thật đều và đem đo quang OD 520nm. - Tính hàm lượng nitrite trong mẫu theo phương trình tuyến tính: Y= aX + b Dựa vào trị trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng nitrite trong dung dịch. + 2.2.5. Phương pháp định lượng N-NH4 (Nguyễn Văn Phước, 2005) - Từ bình mẫu nuôi cấy, lắc đều, dùng pipet vô trùng hút 3ml mẫu cho vào cốc thủy tinh và thêm 297ml nước cất vào để pha loãng mẫu, từ mẫu đã được pha loãng 100 lần ấy ta khuấy đều và hút ra 3 bình mỗi bình 50ml mẫu đã được pha loãng và tiến hành thêm lần lượt các hóa chất vào như sau: thêm 0.5ml ZnSO4 và 0.25ml NaOH 6N vào 50ml mẫu khuấy đều rồi lọc mẫu qua giấy lọc để loại tủa mẫu sau khi được lọc thêm: 1ml Na2S2O3 N/70, 1 giọt EDTA và 2ml Nessler đợi 5 phút đem mẫu đo quang ở OD 430nm. - Tính hàm lượng amoni trong mẫu theo phương trình tuyến tính: Y= aX + b 54 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Dựa vào trị trị số hấp thu của mẫu, ta tính toán hàm lượng amoni trong dung dịch nuôi cấy. 2.2.6 Khảo sát hoạt tính nitrat hoá của vi khuẩn 2.2.6.1 Nguyên tắc: Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy nhằm mục đích kiểm tra nhanh chóng trong canh trường nuôi cấy của chúng ta có hay không có vi sinh vật mà ta cần phân lập bằng cách sử dụng các loại thuốc thử tương ứng khác nhau đối với từng mục đích phân lập của chúng ta. 2.2.6.2 Cách thực hiện: Sau 2 đến 3 tuần ủ và lắc mẫu trên máy lắc: ta thấy môi trường trong các bình mẫu thí nghiệm chuyển sang đục (có sinh khối vi sinh vật phát triển) hơn so với môi trường trong bình đối chứng (không cấy mẫu nước thải vào) thì ta tiến hành lấy mẫu để thực hiện các phản ứng định tính và kiểm tra các thành phần trong canh trường nuôi cấy của chúng ta như sau: + +Phản ứng định tính amoni (NH4 ): Dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) sau đó nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên giọt canh trường nuôi cấy ta thấy: giọt canh trường xuất hiện màu vàng có kết tủa nâu thì là phản ứng dương tính (+), còn nếu giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Nessler. - +Phản ứng định tính nitrite (NO2 ): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) sau đó nhỏ lần lượt từng giọt thuốc thử Griess A và Griess B lên giọt canh trường nuôi cấy ta thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu hồng là phản ứng dương tính (+), còn giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Griess A và Griess B. 55 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - + Phản ứng định tính nitrate (NO3 ): dùng pipet vô trùng lấy một giọt canh trường trong bình mẫu nuôi cấy cho lên lam kính sạch (làm tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương) sau đó nhỏ 1 giọt thuốc thử Diphenylamine lên giọt canh trường nuôi cấy ta thấy: giọt canh trường nuôi cấy xuất hiện màu xanh dương là phản ứng dương tính (+), còn giọt canh trường không chuyển màu tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Diphenylamine. 56 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH + - - Bảng 2.1: Cường độ màu của NH4 - NO2 & NO3 với thuốc thử tương ứng trong phản ứng định tính. Phản ứng định tính của amoni + (NH4 ) với thuốc thử Nessler Không màu - Màu vàng Màu vàng Màu nâu - rất + + không có nhạt - ít NH4 sậm - nhiều NH4 + + NH4 NH4 trung bình Ký hiệu: - + ++ +++ Phản ứng định tính của nitrite - (NO2 ) với thuốc thử Griess A & Màu hồng rất Griess B Không màu - Màu hồng Màu hồng sậm - rất - không có nhạt - ít NO2 đậm vừa - - nhiều NO2 - - NO2 NO2 trung bình Ký hiệu: - + ++ +++ Phản ứng định tính của nitrate - (NO3 ) với thuốc thử Không màu - Màu xanh Màu xanh Màu xanh Diphenylamine không có dương nhạt - dương đậm dương thẫm - - - - NO3 ít NO3 vừa - NO3 rất nhiều - trung bình NO3 Ký hiệu: - + ++ +++ 57 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 2.2.7 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập: Việc xác định các đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được, bước đầu giúp chúng ta định danh sơ bộ các chủng ấy và thuận lợi hơn cho các nghiên cứu tiếp theo. Đặc điểm hình thái vi khuẩn được xác định qua các phương pháp phổ biến sau đây: 2.2.7.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc: phương pháp này giúp chúng ta có thể quan sát được hình thái khuẩn lạc (tròn hay méo, nhăn hay không nhăn, bóng hay không bóng, lồi hay lõm, màu sắc ) của các chủng vi khuẩn phân lập được bằng mắt thường khi vi khuẩn được cấy lên môi trường thạch. Phương pháp này được thực hiện từng bước theo tài liệu của Benson (2001). 2.2.7.2 Phương pháp nhuộm gram: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được hình thái tế bào vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi quang học như:hình cầu, hình que hay hình xoắn, có liên kết với nhau không hay riêng lẻ, gram âm (-) hay gram dương (+) 2.2.7.3 Phương pháp nhuộm tiên mao: phương pháp này giúp chúng ta quan sát được vi khuẩn có tiên mao hay không và các kiểu tiên mao của chúng như thế nào Từ đó biết được chúng di động theo kiểu nào. 2.2.7.4 Phương pháp kiểm tra khả năng di động: phương pháp này giúp chúng ta khẳng định chính xác hơn vi khuẩn phân lập được có khả năng di động hay không thông qua việc cấy vi khuẩn vào thạch mềm trong ống nghiệm. 2.2.8 Định danh 2.2.8.1 Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp. + Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh hóa gồm 2 phép thử: - - Kiểm tra khả năng khử NH3 thành NO2 của nhóm vi khuẩn AOB: thuốc thử - Griess - Ilosvay được sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển hóa từ NH3 thành NO2 của nhóm vi khuẩn oxi hóa ammonium (AOB) sau khi đã nuôi tăng sinh. - Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram. 58 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH + Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử gồm các bước: - Trích ADN (dựa theo phương pháp của Boon et al., (2002)) - Kiểm tra chất lượng ADN sau khi trích (Trần Nhân Dũng, 2011) - Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR - Kiểm tra sản phẩm PCR - Giải trình tự đoạn gen đã khuếch đại - Tra ngân hàng gene (gene bank) 2.2.8.2 Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrobacter sp. + Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh hóa gồm 2 phép thử: - - - Kiểm tra khả năng khử NO2 thành NO3 của nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB): thuốc thử Griess - Ilosvay được sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển hóa - - từ NO2 thành NO3 của nhóm vi khuẩn NOB sau khi đã nuôi tăng sinh. - Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram. + Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử: - Phương pháp trích và kiểm tra chất lượng ADN được tiến hành theo các bước như đối với vi khuẩn Nitrosomonas sp 2.3. Các ứng dụng của vi khuẩn nitrat hoá + Hiện nay vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước (nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải từ nuôi trồng thủy sản). Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực sản xuất giống thủy sản và nuôi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất được thực hiện thông qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, nước thải từ các bể ương nuôi tôm cá chứa hàm lượng NH3 (do tôm cá bài tiết ra) được đưa vào bể lọc sinh học để xử + - lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hóa NH4 thành NO2 - - (giai đoạn nitrite hóa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa NO2 thành NO3 59 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH (giai đoạn nitrate hóa). Nước sau khi xử lý qua bể lọc sinh học hoàn toàn không độc cho tôm cá và được được tái sử dụng để ương nuôi tôm cá (đưa trở lại bể ương nuôi). Trong suốt quá trình nuôi, nước sẽ tuần hoàn trong một hệ thống kín và hoàn toàn không thay nước, chỉ có một lượng nhỏ nước mới được cấp thêm vào hệ thống đề bù đắp cho lượng nước hao hụt do bốc hơi. Hiện nay, các nước phát triển đã ứng dụng rất thành công quy trình lọc sinh học tuần hoàn trong sản xuất thâm canh cá trê phi, cá chình, cá hồi và cá bơn và cả cá rô phi. Năng suất nuôi cá trê phi có thể đạt 500kg/m3/vụ, cá chình khoảng 600 tấn/m3/vụ và cá rô phi là 140 kg/m3/vụ. Ở Việt Nam, quy trình lọc sinh học tuần hoàn được áp dụng phổ biến trong các trại sản xuất giống tôm càng xanh và tôm sú, đặc biệt là các trại giống ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Những lợi ích của qui trình sản xuất này gồm: - Quy trình sản xuất dựa hoàn toàn vào nhóm vi sinh vật tự nhiên nên không sử dụng hoá chất, kháng sinh nên sản phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm thuỷ sản. - Do quá trình sản xuất trong hệ thống kín nên hạn chế được dịch bệnh - Không thay nước nên không gây ô nhiễm môi trường - Lượng nước sử dụng trên một đơn vị sản phẩm thấp - Chi phí công lao động thấp Mặc dù mới chỉ mới được ứng dụng trong lãnh vực sản xuất giống, nhưng nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas, Nitrobacter ) đã mang lại lợi ích thiết thực cho nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Nhóm vi khuẩn này còn có nhiều triển vọng cho sự phát triển nuôi thủy sản thâm canh trong tương lai. + Ngoài ra, chúng ta phải biết kết hợp vi khuẩn nitrat hoá với những vi khuẩn khác để đem lại lợi ích, năng suất cao hơn trong việc nuôi trồng thuỷ sản: Việc sử dụng men vi sinh trong nuôi thuỷ sản là hướng đi có ý nghĩa thực tiễn về khía cạnh bảo vệ môi trường và bảo đảm hiệu quả sản xuất.Qua đó, hạn chế sử dụng thuốc hoá học, hoá chất, kháng sinh trong phòng trừ dịch bệnh mà thay vào đó là tăng cường sử dụng các loại chế phẩm sinh học (men vi sinh), nhằm góp phần 60 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH đưa nghề nuôi thuỷ sản phát triển bền vững.Để sử dụng men vi sinh có hiệu quả, người nuôi tôm cần chú ý một số vấn đề sau: Về thành phần: Trong men vi sinh có 2 thành phần chủ yếu là vi khuẩn có lợi và các chất dinh dưỡng để nuôi vi khuẩn. Chúng gồm các loài như: Bacillus sp, Nitrosomonas, Nitrobacter , chất dinh dưỡng là các loại đường, muối canxi, muối magie Về hình thức: Men vi sinh có 2 dạng, dạng nước và dạng bột (hay dạng viên). Thông thường men vi sinh dạng bột có chứa thành phần vi khuẩn có lợi cao hơn so với dạng nước. Về chủng loại: Men vi sinh có 2 loại, loại dùng để xử lý môi trường (loài vi khuẩn chủ yếu là Bacillus sp, Nitrosomonas, Nitrobacter ) và loại trộn vào thức ăn cho tôm, cá (loài vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus, các loại enzyme ). Có 2 cách sử dụng men vi sinh trong nuôi thuỷ sản: - Đưa trực tiếp vào nước để vi khuẩn men vi sinh lưu trú trong nước. - Trộn men vi sinh vào thức ăn. * Tác dụng của men vi sinh: Khi đưa men vi sinh vào môi trường nước ao, các vi khuẩn có lợi sẽ sinh sôi và phát triển nhanh. Hoạt động của các vi khuẩn có lợi sẽ có tác dụng cho các ao nuôi tôm như: - Phân huỷ các chất hữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trường nước bị ô nhiễm), phân huỷ xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy ao. - Giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí độc: NH3, H2S, NO2 phát sinh), sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm phát triển tốt. - Nâng cao khả năng miễn dịch của tôm (kích thích tôm sản sinh ra kháng thể). 61 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH - Ức chế hoạt động và phát triển của vi khuẩn có hại (các loài vi khuẩn có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi khuẩn có hại). Trong môi trường nước, nếu vi khuẩn có lợi nhiều sẽ kiềm hãm, ức chế, lấn át sự phát triển của vi khuẩn có hại. Hạn chế tối đa sự xuất hiện của các loài vi khuẩn có hại trong ao nuôi tôm. - Giúp ổn định độ pH của nước, ổn định màu nước do vi sinh vật trong men vi sinh hấp thu chất dinh dưỡng hoà tan trong nước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, sẽ giảm chi phí bơm thay nước. - Trong quá trình hoạt động, vi khuẩn trong men vi sinh có khả năng tiết ra một số chất kháng sinh, enzyme để kiềm hãm hay tiêu diệt mầm bệnh và tảo độc. Ngoài ra, men vi sinh khi được trộn vào thức ăn có thể nâng cao khả năng hấp thu thức ăn của cơ thể tôm, làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn và phòng, chống các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cho tôm nuôi. 62 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN 63 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Bước đầu tìm hiểu tổng quan về quá trình nitrat hoá, các vi khuẩn tham gia trực tiếp đến quá trình nitrat hoá, cơ chế hoạt động của vi khuẩn nitrat hoá. Đi sâu vào tìm hiểu hai giống vi khuẩn có mối quan hệ mật thiết với nhau: + - Nitrosomonas và Nitrobacter. Đầu tiên, NH4 được chuyển hóa thành NO2 bởi vi - - khuẩn Nitrosomonas, sau đó vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa NO2 thành NO3 . - NO3 có thể được các thực vật thủy sinh sử dụng như là một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2) qua hoạt động của các vi khuẩn yếm khí như Pseudomonas . Tìm hiểu quá trình tăng sinh, phân lập, đồng thời xác định hoạt tính của vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter. Với tình trạng ô nhiễm nước thải hiện nay, việc ứng dụng các giống vi khuẩn nitrat hoá là sự lựa chọn đúng đắn hàng đầu cho ngành thuỷ sản ở Việt Nam. Tuy nhiên, xét về toàn diện trong chu trình nitơ, nếu chỉ tồn tại vi khuẩn nitrat hoá thì + - qui trình chỉ xử lý từ NH4 đến NO3 , vì vậy qui trình chỉ được hoàn thiện nếu có sự góp mặt của nhiều loại vi khuẩn khác nhau. 64 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu Tiếng Việt: [1] Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007). Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nitrat hóa để ứng dụng trong xử lý nước hồ ô nhiễm. Tạp chí Khoa Học Và Công Nghệ. Tập 45, số 3, 2007. Tr.95 – 100. [2] Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008). Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại Quãng Bình và Hà Tĩnh. Khoa Học Công Nghệ. Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn – Số 2 – Tháng 2/2008. [3]Egorov. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học quốc gia Moscow. [4] Nguyễn Văn Phước (2005). Thí nghiệm Hóa Kỹ Thuật Môi Trường – Phần I: Phân tích chất lượng nước, NXB ĐHQG TP.Hồ Chí Minh. [5] TS. Trần Cẩm Vân (2001). Giáo trình Vi sinh vật học môi trường, NXB ĐHQG Hà Nội. B. Tài liệu Tiếng Anh: [6]Annette Bollmann, Elizabeth French, and Hendrikus J.Laanbroek (2011).Isolation, Cultivation, and Characterization of Ammonia-Oxidizing Bacteria and Archaea Adapted to low Ammonium Concentrations. Methods in Enzymology, Volume 486. [7] AWWA/APHA/WEF (1999). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Edition – Method 4500-N. [8]Benson (2001). Microbiological Applications Lab Manual. Eighth Edition. The McGraw−HillCompanies. [9] Eva Spieck and Andre Lipski (2011).Cultivation, Growth Physiology, and Chemotaxonomy of Nitrite-Oxidizing Bacteria. Methods in Enzymology, Volume 486. [10] Gray NF. (2004). BIOLOGY OF WASTEWATER TREATMENT (2nd Edition). Imperial College Press, London. 1439p. [11] Jane Meiklejohn (1950). The Isolation of Nitrosomonas europaea in Pure Culture. Journal of General Microbiology, Vol.4, No.2 65 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH [12]Jane Meiklejohn (1953). Iron and the Nitrifying Bacteria. J.gen.Microbiol. 8, 58 – 65. [13]Kh.Elbanna1,2, R.M.El-Shahawy1, K.M.Atalla1 (2011). A new simple method for the enumeration of nitrifying bacteria in different environments. PLANT SOIL ENVIRON., 58, 2012 (1): 49 – 53. [14] Koops HP, Purkhold U, Pommerening-röser A, Timmermann G. Wagner M (2006). The Lithoautotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria in The Prokaryotes. T. 5, Third Edition Springer. [15]Martin Hesselsøe and Jan Sørensen (1998). Microcolony formation as a viability index for ammonia-oxidizing bacteria: Nitrosomonas europaea and Nitrosospira sp FEMS Microbiology Ecology 28 (1999) 383 – 391. [16]Michael H.Gerardi (2002). Nitrification and Denitrification in the Activated Sludge Process. Wastewater Microbiology Series, Environmental Protection Magazine Series. [17] Patrick Chain, Jane Lamerdin, Frank Larimer, Warren Regala, Victoria Lao, Miriam Land, Loren Hauser, Alan Hooper, Martin Klotz, Jeanette Norton, Luis Sayavedra-Soto, Dave Arciero, Norman Hommes, Mark Whittaker and Daniel Arp (2003). Complete Genome Sequence of the Ammonia-Oxidizing Bacterium and Obligate Chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea. Journal of Bacteriology, May 2003, p. 2759 – 2773. [18]R.F.Lewis and D.Pramer (1958). Isolation of Nitrosomonas in Pure Culture. Paper of the Journal Series, New Jersey Agricultural Experiment Station, Rutgers, The State University, Department of Agricultural Microbiology, New Brunswick, N.J. [19] Speck E. and Bock E.(2005). The Lithoautotrophic Nitrite-Oxidizing Bacteria. Bergey manual of systematic bacteriology, Springer 2005. [20] S.Soriano and N.Walker(1968). Isolation of Ammonia-oxidizing Autotrophic Bacteria. Soriano, S. & Walker, N. (1968). J. appl. Bact. 31, 493 – 497. [21] Verhagen.F.J.M., and Laanbroek.H.J.(1991). Competition for ammonium between nitrifying and heterotrophic bacteria in dual energy limited chemostats. Appl. Environ. Microbiol.57, 3255 – 3263. 66 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH C. Tài liệu Internet: [22] dinhtenvk03.htm [23] [24] THÔNG TƯ Số: 12/2010/TT-BNNPTNT ngày 11.03.2010 Ban hành “Danh mục bổ sung sản phẩm xử lý, cải tạo môi trường nuôi trồng thuỷ sản được phép lưu hành tại Việt Nam”. 67 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 68 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 69 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 70 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 71 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 72 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 73 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 74 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 75 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 76 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 77 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH 78 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN