Đồ án Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

85 trang thiennha21 12/04/2022 5100

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_tim_hieu_ve_cac_ky_thuat_ung_dung_test_nhanh_tren_thuc.pdf

Nội dung text: Đồ án Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU VỀ CÁC KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TEST NHANH TRÊN THỰC PHẨM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN.Nguyễn Hoàng Mỹ Sinh viên thực hiện : Nguyễn Huỳnh Trung MSSV: 107111199 Lớp: 07DSH3 TP. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Chương I : GIỚI THIỆU 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 1.1 Đặt vấn đề Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng để cho chúng ta sống và tồn tại. Từ ngàn xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thức ăn của thiên nhiên để chế tạo ra nhiều món ăn phong phú tạo thành nét văn hóa ẩm thực riêng biệt cho từng quốc gia trên thế giới. Ngày nay, với lối sống hiện đại hóa, công nghiệp hóa các món ăn dần dần đã được chế biến theo quy mô công nghiệp để đáp ứng theo nhu cầu thị trường. Với sự can thiệp của máy móc, nguồn thực phẩm đã dần mất đi tính tự nhiên đồng thời cũng tạo ra nhiều hóa chất độc hại ảnh hưởng đến đời sống của xã hội. Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nhức nhối trên toàn xã hội. Hằng năm đã lấy đi không ít sinh mạng của nhiều người dân, làm ảnh hưởng sâu sắc đến cái nhìn về ngành thực phẩm tại Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Nhận thức được tầm quan trọng trong vấn đề an toàn thực phẩm, con người đã có các chính sách nghiêm ngặt để bảo vệ sức khỏe của người dân. Với sự tiến bộ của khoa học, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều phương pháp kiểm tra thực phẩm khác nhau với độ chính xác và thời gian phát hiện ngày càng được cái thiện. Để tìm hiểu rõ về phương pháp này, tôi thực hiện đề tài: “ Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh ngộ độc thực phẩm”. 1.2 Mục đích khóa luận Tìm hiểu về các kỹ thuật ứng dụng test nhanh trên thực phẩm 1.3 Nội dung khóa luận - Tổng quan về các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm. - Các phương pháp truyền thống xác định vi sinh vật trong thực phẩm - Các phương pháp hiện đại áp dụng vào các bộ Kit thực phẩm 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Chương II : NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 2.1 Khái niệm 2.1.1 Chất độc Chất độc là những chất vô cơ, hữu cơ nhiễm vào trong thức ăn được đưa vào cơ thể với nồng độ nhất định gây ra ngộ độc, làm rối loạn các hoạt động sinh lý, sinh hoá bình thường của cơ thể, và biểu hiện bằng những triệu chứng và bệnh lý khác thường. Tuỳ theo loại chất độc, mức độ nhiễm độc, lứa tuổi và tình trạng sức khoẻ của cơ thể mà triệu chứng ngộ độc nặng, gây tử vong hoặc nhẹ sau một thời gian dài tích luỹ mới gây biểu hiện ngộ độc. Chất độc được sinh ra từ nhiều nguồn gốc khác nhau từ tự nhiên hoặc do con người. Do có thể là các sản phẩm trao đổi chất độc tố của nấm mốc, tảo, vi khuẩn, vi nấm. Chúng có thể lẫn vào thức ăn do ô nhiễm môi trường hoặc cũng có thể do con người vô tình hay cố ý cho thêm vào các nguyên liệu để bảo quản và tăng khẩu vị. Nghiên cứu về chất độc thực chất đó là nghiên cứu về bản chất hoá học, cơ chế tác động, phương pháp xác định để từ đó có những biện pháp kỹ thuật loại trừ và hạn chế tác hại của nó tới cơ thể người và động vật. 2.1.2 Ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thực phẩm, có thể gây ra bởi nhiều nguyên nhân. Có thể do ăn phải chất độc tiêu thụ một lượng lớn vi sinh vật hoặc tiêu thụ sản phẩm có chứa độc tố. 2.1.3 Các trạng thái ngộ độc Ngộ độc cấp tính: là trạng thái ngộ độc sau khi nhiễm chất độc một thời gian ngắn,xuất hiện những triệu chứng khác thường rất nghiêm trọng hoặc gây ra tử vong cho ngườivà động vật. Ngộ độc tích lũy: (ngộ độc mãn tính) là trạng thái mà cơ thể nhiễm chất độc với liều lượng thấp, chưa gây ra triệu chứng liền mà phải trải qua một thời gian dài chất độc tích lũy trong cơ thể, làm biến đổi các quá trình sinh lý, sinh hóa lâu dài rồi mới gây ra triệu chứng. 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và Việt Nam Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và nhiễm các bệnh truyền qua thực phẩm mỗi năm. Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số, trung bình 175 ca trên 100.000 dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh: 190 ca trên 100.000 dân; ở Nhật là 20-40 ca trên 100.000 dân; ở Úc là 4,2 triệu ca/năm. Tại Việt Nam,. theo báo cáo của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm thuộc Bộ Y tế, tình hình ngộ độc thực phẩm trong năm 2010 diễn biến phức tạp, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ độc (trong đó có 34 vụ ngộ độc hàng loạt trên 30 người) xảy ra tại 47 tỉnh/thành phố, làm 5.664 người mắc và 42 trường hợp tử vong. So với 2006-2009, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 9.1%, số mắc giảm 17.6% và số tử vong giảm 19.2%. Khu vực miền núi phía Bắc có số vụ ngộ độc cao nhất (32.6%), tiếp đến là Tây Nguyên (12%), miền Trung (11.4), miền Đông Nam bộ (10.3%) và thấp nhất là đồng bằng Bắc bộ (4.6%). Thời gian xảy ra ngộ độc thực phẩm cao nhất vào mùa hè (tháng 5-9), chiếm trên 70% số ca mắc và tử vong do ngộ độc thực phẩm. Thời gian qua Nhà nước đã ban hành rất nhiều văn bản luật, pháp lệnh và các quy phạm pháp luật quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm, bên cạnh đó công tác kiểm tra, giám sát đối với cơ sở sản xuất, kinh doanh, chế biến thực phẩm của các cơ quan chức năng thường xuyên được tổ chức, nhưng tình trạng thực phẩm không an toàn lưu hành trên thị trường vẫn còn rất nhiều và không thể kiểm soát dẫn đến hậu quả nghiệm trọng cho đời sống nhân dân và xã hội. 2.3 Dấu hiệu và triệu chứng ngộ độc Khi vừa ăn phải thực phẩm nhiễm độc, cảm giác khó chịu xuất hiện do mùi vị thức ăn thay, không còn cảm giác hấp dẫn ngon miệng, độ ẩm, mềm của thực phẩm cũng thay đổi. Xuất hiện các triệu chứng ngộ độc sớm từ 1- 3 giờ sau khi ăn, chủ yếu là triệu chứng tiêu hóa như buồn nôn, nôn, đau bụng vùng thượng vị từng cơn co thắt rồi đi ngoài nhiều lần, lúc đầu có phân, sau phân ít nước nhiều. Các triệu chứng khác có thể xuất hiện là: ngứa, mề đay, đau đầu, mệt mỏi. 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Các triệu chứng trên có thể đỡ dần sau khi nôn và đi ngoài nhiều lần, nhưng cũng có thể nặng lên gây ra suy sụp cơ thể do mất nước, mất điện giải, toan chuyển hóa và rối loạn thân nhiệt (lạnh hạ nhiệt hay sốt cao, co giật). Các xét nghiệm tìm độc chất: tốt nhất là xét nghiệm từ các mẫu thức ăn còn lại hoặc từ các thức ăn mà người bệnh nôn ra. Các xét nghiệm máu, nước tiểu, phân thường cho kết quả chậm và không chính xác. Bảng 2.1 : Số lượng các vụ ngộ độc thực phẩm toàn quốc từ năm 2002 – 2010 Kết quả điều tra Năm Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người) 2002 218 4984 71 2003 238 6428 37 2004 145 3584 41 2005 144 4304 53 2006 165 7135 57 2007 247 7329 55 2008 204 7828 61 2009 151 5212 35 2010 175 5664 42 Trung bình/năm 202.2 ( 247 – 144) 5.525,1 (7828 –3584) 55.2 (71 – 35) Tổng cộng 1.820 49.726 497 (Nguồn : Cục thống kê) 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Chương III : NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 3.1 Nguyên nhân 3.1.1 Chất độc có sẳn trong nguyên liệu làm thức ăn và trong quá trình chế biến Trong tự nhiên các loại thực vật cũng như một số loại động vật đặc biệt đều có chứa một số lượng độc tố nhất định. Đó là những chất tích lũy, sản phẩm trung gian trong quá trình trao đổi chất của chúng hoặc là những chất được sinh vật tổng hợp. Ở thực vật, nhất là nhóm cây họ đậu có nhiều chất kháng dinh dưỡng nhằm hạn chế khả năng phát triển của vi sinh vật. Nhiều loại thực vật có chứa nhóm chất glucide độc, trong một số loại động vật có chứa những amit độc gây dị ứng rất mạnh cho cơ thể. 3.1.2 Chất độc do thực phẩm bị biến chất trong quá trình bảo quản Sự tồn trữ nguyên liệu trong kho lâu ngày, do tác động của oxy trong không khí oxy hóa hoặc do enzyme trong thực phẩm tác động làm biến đổi các chất dinh dưỡng trở thành các chất độc hay chất kháng dinh dưỡng.Ví dụ: các chất dầu thực vật để lâu ngày trong không khí sẽ biến thành các peroxyt, aldehyt độc. Các axit amin như histidine trong thịt cá tươi dưới tác động của enzyme decarboxylase khử nhóm cacboxyl trở thành histamin độc gây dị ứng mạnh cho cơ thể. Một số vitamin bi oxy hóa trở thành chất kháng vitamin. 3.1.3 Chất độc do nấm mốc sinh ra (mycotoxin) Các loại thức ăn sau khi thu hoạch về không được làm khô và chế biến kịp thời trước khi đem dự trữ trong kho. Nếu độ ẩm trên 14% rất dễ bị lên men hoặc nấm mốc phát triển sinh ra độc tố. Tùy theo loại độc tố, tùy theo hàm hượng cao hay thấp mà có thể gây ra độc cho người hay động vật. 3.1.4 Chất độc do vi khuẩn gây ra Ngộ độc thức ăn do độc tố vi khuẩn thường xãy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra. Thực phẩm có nguồn gốc động vật giàu protein như thịt sữa, trứng với tỉ lệ nhiễm cao. 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 3.1.5 Các hoá chất độc hại lẫn vào thức ăn Nguyên nhân gây ra sự ngộ độc thực phẩm hoặc không an toàn thực phẩm có thể do các yếu tố sau đây: Cho thêm vào thức ăn để bảo quản, nhóm này bao gồm: Các chất sát khuẩn, các chất chống nấm, các chất kháng sinh và các chất chống oxy hoá Các chất cho thêm vào thức ăn để tăng khẩu vị, hương liệu của thức ăn. Các chất tẩy màu hoặc cho vào để thay đổi màu thực phẩm, làm cho dai hoặc xốp thực phẩm. Các loại chất kích thích tố, hoặc các chất tăng đồng hóa, tăng giữ nước để cho gia súc tăng trọng nhanh.Các chất gây ô nhiễm môi trường bao gồm kim loại nặng của nhà máy thải ra hấp thụ vào cây thức ăn, thuốc trừ chuột, trừ sâu, trừ nấm và virus nhiễm vào thực phẩm 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính độc lực 3.2.1 Liều lượng chất độc Có nhiều chất ở liều thấp thì là yếu tố dinh dưỡng, nhưng ở liều cao thì gây ra ngộ độc. Ví dụ: như các nguyên tố vi lượng 3.2.2 Yếu tố giống, loài động vật Cùng một loại độc tố, cùng một liều lượng nhiễm nhưng có gia súc có triệu chứng trúng độc nhưng có loại lại không. Ví dụ: với tỷ lệ 10% bột lá keo dậu thì ở gà có hiện tượng bướu cổ, rụng lông nhưng ở gia súc nhai lại với mức trên 30% trong khẩu phần thì mới có triệu chứng ngộ độc. Hay cùng một tỷ lệ aflatoxin trong thức ăn thì vịt có biểu hiện ngộ độc trước gà. 3.2.3 Lứa tuổi của động vật Động vật non nói chung hệ thống đề kháng, hệ thống khử độc và thải độc tố ra ngoài của cơ thể phát triển chưa hoàn thiện, do đó sức đề kháng với độc tố của cơ thể gia súc non cũng yếu hơn gia súc trưởng thành. Ngược lại, cơ thể già yếu sự trao đổi chất cũng giảm xuống, sức đề kháng đối với độc tố cũng giảm. 3.2.4 Giới tính Ảnh hưởng của độc tố trên giới tính cũng chỉ là khái niệm tương đối. Ở trạng thái bình thường thì không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 2 loại giới tính trên lĩnh 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ vực đề kháng với độc tố. Tuy nhiên khi gia súc mang thai, sinh sản hoặc nuôi con thì rất mẫn cảm với độc tố. Ví dụ: độc tố nấm aflatoxin có thể gây chết phôi tỷ lệ cao; độc tố zearalenone (F2, có trong ngô) do nấm Furarium tiết ra có thể gây ra sẩy thai. Vì vậy, trong thời gian mang thai cần phải có chế độ ăn kỹ lưỡng hơn bình thường. 3.2.5 Tình trạng sức khỏe và chế độ dinh dưỡng Sức khỏe cơ thể có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng đề kháng đối với độc tố. Ví dụ: khi cơ thể bị bệnh viêm gan hoặc viêm thận do nguyên nhân khác không phải độc tố thì khả năng loại bỏ độc tố của cơ thể rất kém. Vì vậy cũng với một liều lượng giống nhau, nhưng cơ thể khỏe mạnh có thể vượt qua được. Khẩu phần ăn và chế độ dinh dưỡng của động vật cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức đề kháng của cơ thể đối với độc chất. Ví dụ: khi khẩu phần ăn thiếu cholin hoặcmethiomine sẽ gây ra hiện tượng tích mỡ gan làm cho chức năng của gan trở nên suy giảm, từ đó đề kháng với độc tố cũng sẽ kém. Hoặc khẩu phần mất cân bằng giữa năng lượng và chất đạm, quá dư thừa chất đạm có nguồn gốc động vật, có chứa nhiều chất hữu cơ purine và pirimidine mà lại thiếu vitamin A sẽ có nguy cơ phát sinh ra bệnh “gout” là chứng bệnh tích urat trong cơ thể, trong bể thận làm cho chức năng lọc và loại thải chất độc của cơ thể suy yếu. Từ đó có thể làm cho tình trạng ngộ độc trở nên nặng nề hơn. 3.2.6 Trạng thái vật lý của chất độc Cùng một loại chất độc, cùng một liều lượng, nhưng chất độc ở trạng thái hoà tan được trong nước thì sẽ gây ra triệu chứng ngộ độc nhanh hơn, nhưng nó loại thải ra ngoài cũng nhanh hơn. Ngược lại, ở trạng thái nhũ dầu hoặc ở dạng bột không tan thì chất độ chấp thu chậm nên gây ra triệu chứng ngộ độc muộn hơn, nhưng loại thải chất độc ra khỏi cơ thể cũng chậm hơn. 3.3 Các vi sinh vật có thể gây ngộ độc thực phẩm 3.3.1 Salmonella Số lượng Salmonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện diện cả triệu tế bào trong một gam thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng biểu hiện thường sau 12 giờ đến 36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng thường kéo dài ít nhất từ 2 đến 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Salmonella điều có biểu hiện bệnh, ngược lại một số người không có triệu chứng lâm sàng khi tiêu thụ phải thực phẩm nhiễm vi sinh vật này khi đó chúng bài tiết ra ngoài. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella như thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm của trứng, thủy sản. Nguồn nhiễm vi sinh vật vào các loại thực phẩm thường có nguồn gốc từ đường ruột của người và các loài động vật, chúng có thể được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Salmonella gây nên bệnh sốt thương hàn thuốc các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C các dòng này thường không gây bệnh cho các loài động vật. 3.3.2 Campylobacter Đây là vi sinh vật gây nên bệnh nhiễm đường ruột, bằng các phương pháp phân lập đã chứng minh vi sinh vật này hiện diện khắp nơi. Campylobacter là một trong những hệ vi vật của nhiều loại động vật và chim. Nhưng các dòng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm không thể phát triển khi nhiệt độ thấp hơn 30oC, đây là vi sinh vật ưa nhiệt bắt buộc. Sản phẩm sữa và thịt gia cầm là những nguồn có thể gây nên ngộ độc do vi sinh vật này. Nước cũng là một trong những nguồn mang bệnh này. Campylobacter là vi sinh vật rất nhạy với nhiệt độ, chúng bị tiêu diệt hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pasteur, chúng không thể sống sót trong thực phẩm có môi trường acid. Chúng không thể phát triển trong thực phẩm bảo quản trong điều kiện hiếu khí mà chỉ phát triển trong các loại thực phẩm hút chân không. Khi nhiễm Campylobacter , thời gian ủ bệnh thường từ 2 đến 11 ngày. Các triệu chứng do vi sinh vật này gân nên như đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sản, thỉnh thoảng có những biểu hiện giống như cảm cúm. 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 3.3.3 Clostridium perfringens Quan niệm về sự ngộ độc thực phẩm do Clostridium perfringens gây ra đã có những thay đổi trong những năm gần đây. Theo những quan niệm trước đây cho rằng các dòng Clostridium perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Nhưng trong những năm gần đây các dòng này nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật này gây nên. Clostridium perfringens có khả năng sinh bào tử kháng nhiệt nên chúng thường sống sót qua quá trình nấu chín. Tuy nhiên cũng phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với nhiệt. Nếu những bào tử sống sót, khi gặp điều kiện thích hợp chúng sẽ nẩy mầm và nhân lên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Các nguồn thực phẩm có thể gây ngộ độc với các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là các loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa. Clostridium perfringens cũng được tìm thấy trong đất, trong phân người và trong các loại thực phẩm khác. Các triệu chứng do vi sinh vật này gây ra thường là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy. Thời gian ủ bệnh từ 12 giờ đến 24 giờ 3.3.4 Clostridium botulinum Đây là vi sinh vật phân bố khắp nơi trong đất, trong nước và trong các gia súc, các loài thủy sản. Vi sinh vật này sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thịt cho người. Bệnh biểu hiện rất nghiệm trọng ở người. Bệnh gây ra do độc tố được hình thành bởi Clostridium botulinum nhiễm trong thực phẩm. Triệu chứng lâm sàng của bệnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể dẫn đến tử vong. Các triệu chứng trên biểu hiện sau 12 giờ đến 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc tố. Các triệu chứng thường kéo dài 2 đến 6 ngày tùy theo tình trạng nhiễm độc và sức khỏe của từng bệnh nhân. 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định lây nhiễm từ đất, phân động vật hay do chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng qui cách cũng có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất cao. Điều kiện thích hợp cho việc hình thành độc tố của vi sinh vật này là điều kiện môi trường kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh vật khác cạnh tranh. Độc tố botuline do Clostridium botulinum tiết ra gồm một số loại khác nhau như A, B, C1, C2, D, E, F, G. Các độc tố này là những protein có trọng lượng phân tử lớn khoảng 1 triệu danton. Nhưng những dạng có tác động mạnh đến con người là A,B và E. Đây cũng là một trong những loại độc tố sinh học có cường độ mạnh nhất. Trong những năm gần đây, các vụ ngộ độc botuline gây ra do Clostridium botulinum dòng E thường được phát hiện khi tiêu thụ cá và các sản phẩm thủy sản. Dòng vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ các mẫu bùn từ các đáy sông. 3.3.5 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là vi sinh vật có khả năng sản sinh một số loại độc tố đường ruột bền nhiệt, không bị phân hủy khi đun ở 100oC trong khoảng 30 phút. Khi vi sinh vật này lây nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết ra độc tố vào trong sản phẩm và gây độc. Khi con người tiêu thụ loại thực phảm có chứa độc tố này, sau 4 giờ đến 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, buồn nôn và ói mửa, các triệu chứng này thường kéo dài từ 6 giờ đến 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa hàm lượng muối cao thường có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này như jambon, kem tổng hợp, nước soup vì các loại thực phẩm này ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 40oC. Các loại thủy sản hay thực phẩm đóng hộp cũng thường hay bị nhiễm loài vi sinh vật này. Các nguồn lây nhiễm vào thực phẩm chủ yếu từ các khâu chế biến trong nhà bếp. Trong tự nhiên các vi sinh vật này thường tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng. 3.3.6 Vibrio spp. Các loài Virio có nguồn gốc từ biển, chúng cần ion Na+ để phát triển. Giống Vibrio có một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V.cholerae, 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.holliase, V.furnsii, V.mimicus, V.fluvialis, V.alginolyticus. V. cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới. Loài vi sinh vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính đó là O1 và non-O1, kiểu huyết thanh O1 bao gồm ba kiểu huyết thanh phụ như sau : Ogawa, Inaba (hai kiểu này được gọi chung là kiểu cổ điển – Classic) và kiểu Eltor (kiểu Eltor còn được gọi là kiểu O139). Hai kiểu huyết thanh Inaba và Ogawa ngày nay chỉ còn được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu Á. Trong khi đó các vụ dịch tả trên khắp thế giới gây ra do kiểu Eltor. Khi có các trận dịch do V.cholerae gây ra thường lan truyền rất nhanh qua con người và dịch bệnh ngày càng thêm nghiêm trọng. Vi sinh vật ngày sản sinh độc tố cholaratoxin, đây là độc tố đường ruột có cường độ mạnh, chỉ cần 5 µg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây tiêu chảy cho người trưởng thành. Một số độc tố khác cũng được vi sinh này tiết ra như hemolysine có độc tính tương tự tetrodotoxin (độc tố cá nóc) hay độc tố tương tự shiga-toxin. Các loại thực phẩm có thể lan truyền V.cholerae như nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa và các loại sản phẩm sữa, thậm chí bia cũng có khả năng nhiễm vi sinh vật này. Các loại sản phẩm thủy sản tươi sống, không qua gia nhiệt, gia nhiệt nhẹ hay do sự nhiễm chéo sau khi gia nhiệt cũng được khuyến cáo là có nguy cơ mang V.cholerae khá nghiêm trọng. Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tư như loài trên. Dĩ nhiên tùy từng loài và liều lượng mà có những biển hiện bệnh nặng nhẹ khác nhau. Chỉ riêng loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà chúng gây nhiệm trùng máu cho người. 3.3.7 Escherichia coli E. coli là vi sinh vật hiếu khí phổ biến trong đường tiêu hóa của người và các loài động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E.coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ việc ổn định sinh lý đường tiêu hóa. Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật : Enterobathogenic E.coli (EPEC) Enterotocigenic E.coli (ETEC) Enteroinvasive E.coli (EIEC) Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) Rõ ràng E.coli có thể phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường có thể bị ô nhiễm phân hay chất thải. Vi sinh vật này có thể phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. Trong những ngăm gần đây các nhà nghiên cứu cũng chứng minh rằng E.coli cũng có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ. Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E.coli cũng dễ dàng phân lập được từ các mẫu thực phẩm do nhiễm vào từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước. Các dòng E.coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu háo, các biểu hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người. 3.3.8 Shigella Giống Shigella cũng là một thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacae, chúng gồm có 4 loài sau : S.dysenteriae, S.plexneri, S.boydii, S.sonnei. Đây là giống vi sinh vật có tế bào chủ đặc hiệu , chúng chỉ thích nghi à phát triển trong tế bào chủ là người và các loại linh trưởng. Sự hiện diện của chúng trong môi trường là do sự nhiễm phân của người và các loài mang sinh vật này. Shigella có thể tồn tại hơn 6 tháng trong môi trường nước. Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở các nước kém phát triển, chế biến thực phẩm trong điều kiện kém vệ sinh. Bệnh cũng có thể truyền tực tiếp từ người qua người. Shigella chủ yếu gây nên các bệnh lị trực trùng. Thời gian ủ bệnh sau khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm là 1 đến 7 ngày. Các biểu hiện triệu chứng bệnh có thể nhẹ, 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ biễu hiện không rõ, chỉ thoáng qua như tiêu chảy nhẹ, nhưng đôi khi cũng có những biểu hiện nghiêm trọng như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc ruột, mất nước, sốt cao và bị co rút thành bụng. Các triệu chứng trên có thể kéo dài 12 đến 24 ngày hay lâu hơn. Đối với người lớn, các trường hợp tử vong do Shigella hiếm khi diễn ra, nhưng bệnh biểu hiện rất nghiêm trọng đối với trẻ em và người già. Hằng năm có khoảng nửa triệu người tử vong do vi sinh vật gây ra trên khắp thế giới. Sự lây nhiễm vi khuẩn Shigella chủ yếu là đường miệng. Nước là một môi trường truyền bệnh quan trọng, đặc biệt ở những nơi kém vệ sinh. Tuy nhiên các loại thực phẩm cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh do Shigella . Vi sinh vật này nhiễm vào thực phẩm qua nguyên liệu hay quá trình chế biến. Đôi khi nhiễm bệnh do vệ sinh cá nhân kém. 3.3.9 Listeria monocytogenes Trong những năm gần đây Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm. Đối tượng gây bệnh của vi sinh vật này là trẻ em, phụ nữ mang thai hay những người già. Đối với những vi sinh vật gây bệnh ngộ độc thực phẩm khác, chúng bộc phát bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh các triệu chứng lâm sàng biểu hiện. Ngược lại Listeria monocytogenes hiện diện với một số lượng nhỏ trong thực phẩm, khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại và chờ cơ hội. Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm vào các mô sâu và gây bệnh. Các bệnh do vi sinh vật này gây nên bắt đầu từ đường tiêu hóa như tiêu chảy, sốt nhẹ. Sau đó chúng xâm nhiễm vào các đại thực bào gây nên bệnh nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim mắt, và có thể xâm nhập vào bào thai gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi. Listeria monocytogenes thuộc loại vi sinh vật ưa lạnh, chúng có thể phát triển ở nhiệt độ từ 2 đến 44oC. Chúng thường được phân lập từ các loại thực phẩm như phomat sữa, thịt cá rau quả và thậm chí phân lập được từ trong nước mặn. Trong tất cả các công đoạn chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả đều có khả năng xâm chiếm vi sinh vật này. Đặt biệt trong công đoạn bảo quản các sản phẩm ở nhiệt độ thấp, vi 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ sinh vật này có cơ hội phát triển thành số lượng lớn. Các sản phẩm thanh trùng Pasteur và được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất cao. Salmonella E.coli Staphylococcus Shigella Vibrio Campylobacter 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Clostridium Listeria Flavobacterium Alcaligenes Pseudomonas fluorescens Aspergillus Flavus Hình 3.1 : Một số loại vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (Nguồn :Nguyễn Tiến Dũng,2008) 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 3.3.10 Các virus gây bệnh trong thực phẩm Các đợt dịch bệnh gây ra từ thực phẩm do tác nhân virus cho đến nay vẫn là vấn đề bí ẩn. Nhưng một số tác giả vẫn tin rằng virus trong thực phẩm là tác nhân gây nên các bệnh hiễm nghèo. Những tiến bộ trong các nghiên cứu về virus thực phẩm vẫn còn hạn chế. Cho đến nay các đặc điểm sinh lý của virus đường ruột vẫn còn biết rất hạn chế. Cho đến nay các phương pháp nuôi cấy để phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn chưa thể thực hiện được. Nhưng với các tiến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật lai phân tử, kỹ thuât PCR có thể phát hiện được các virus có hại cho con người trong thực phẩm. Sự lan truyền virus cho người qua còn đường thực phẩm được biết đến từ những năm 1950. Các virus gây bệnh đường ruột cho con người chủ yếu có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản. Cho đến nay được biết có khoảng hơn 100 loại virus đường ruột. Nhưng chỉ một vài loài trong số đó có khả năng gây bệnh cho người. theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có thể gây nguy hiểm cho người. Bao gồm :Hepatitis type A (HAV), Virus Norwalk, Calicivirus, Astrovirus. Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, chúng không thể tự nhân lên trong nước hay trong các sản phẩm thực phẩm cho dù ở bất kỳ điệu hiện hóa lý như thế nào. Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm. Các loài nhuyễn thể ăn lọc có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước. Hằng ngày một con nhuyễn thể có thể lọc 1500 lít nước, theo đó một số lượng lớn virus có thể vào cơ thể của con vật này và tích lũy tại đó. Vì thế mật độ virus trong cơ thể nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước chúng đang sinh sống. Liều lượng gây bệnh của virus có thể thấp hơn nhiều so với vi khuẩn khi con người tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Liều lượng gây nhiễm tối thiểu của một số loài virus đường ruột tương đương với số lượng hiện diện trong thực phẩm mà các phòng thí nghiệm có thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy. 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Cơ thể người và các loài động vật là nguồn chứa các virus đường ruột. Virus được tìm thấy với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm và tồn tại trong nhiều ngày đến nhiều tuần. Sự nhiễm phân vào trong thực phẳm bằng con đường gián tiếp hay trực tiếp là con đường xâm nhiễm virus vào thực phẩm. Sự sống sót của virus trong môi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc vào yếu tố như nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu cơ khác. Virus đường ruột cũng có khả năng tồn tại nhiều tháng trong nước biển ở nhiệt độ <10oC thậm chí có thể lâu hơn. Vì thế đây cũng là nhân tố chỉ thị ô nhiễm phân. Tất cả các virus đường ruột đều kháng với acid, các enzyme thủy giải, hay muối mật có trong đường tiêu hóa. Một số virus có thể kháng nhiệt như Hepatits type A, một số khác có thể kháng với các chất tẩy uế như phenolic, ethanol Ozon và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài virus đường ruột. Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín, khử virus trước khi tiêu thụ, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác trong những vùng nước không nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ. 3.3.11 Coliforms Coliforms và Feacal coliform đượx xem là vi sinh vật chỉ thị, bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms cao trong thực phẩm thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang được tranh cải về khoa học. Theo định nghĩa, nhóm Coliforms bao gồm cả những vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi, có Gram âm, không sinh bào tử, có hình que, lên men đường lactos và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng. Căn cứ vào nhiệt độ vi sinh vật có thể phát triển để chia nhóm Coliforms thành hai nhóm. Nhóm Coliforms có nguồn gốc từ phân của các loài độc vật, nhóm 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ này được gọi là Coliforms phân và nhóm không có nguồn gốc từ phân của các loài động vật. Trên thực tế, các phương pháp kiểm nghiệm chỉ xác định Coliforms phân là xác định nhóm Coliforms có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống như Escherichia : Klebsiella và Enterobater. Một câu hỏi được đặt ra là có phải tất cả các thành viên của nhóm Coliform phân có ý nghĩa chỉ thị vệ sinh như nhau hay không ? Cho đến nay vấn đề này vẫn còn đang được bàn luận, tuy nhiên trong các thành viên của nhóm này thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất của vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Bảng 3.1 : Các loại bệnh và các biểu hiện lâm sàng do VSV trong thực phẩm gây ra. Thời Vi sinh vật Nôn Tiêu Đau Sốt Thời Thực phẩm gian ủ mửa chảy thắt gian kéo thường gặp bệnh dài 30 phút – B.cereus +++ (+) (+) - Ngắn Gạo 4 giờ 8-12 giờ B.cereus - ++ ++ - 1-2 ngày Soup, sữa 4-6 giờ S.aureus ++ + ++ - 6-12 giờ Thịt lạnh, sữa, salad, kem, trứng 8-22 giờ C.perfringens - ++ ++ - 12-24 giờ Thịt qua gia nhiệt 8-48 giờ V.paraheamolyt - +++ - + 2-3 ngày Hải sản icus 12-48 giờ Salmonella (+) ++ - + 2-7 ngày Gia cầm, thịt, trứng 24-72 giờ C.botulinum - - - - 3 ngày Rau quả, thịt 2-11 ngày Campylobacter - +++ +++ ++ 3 – 21 Sữa, nước ngày uống, thịt, cá (Nguồn : Nguyễn Tiến Dũng,2008) 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 3.4 Sự phát triển vi sinh vật trong thực phẩm Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau. Hình 3.2 : Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín ( Nguồn : Prescott và ctv, 2007) Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase) : Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase) : Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân Bằng : Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng : Trong giai đoạn này số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Giai đoạn tử vong (Death Phase) : Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. 3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm 3.5.1 Yếu tố nội sinh * Độ ẩm Tỉ lệ nước trong tế bào vi sinh vật khá cao 75 đến 85% đối với vi khuẩn, 78 đến 82% đối với nấm men, 84 đến 90% đối với nấm mốc. Chính vì vậy, nếu thiếu hụt hoặc dư thừa quá nhiều nước sẽ làm cho vi sinh vật không thể tồn tại và phát triển được. Nếu môi trường thiếu nước ( đặc biệt là nước tự do ) nước sẽ loại khỏi tế bào vi sinh vật dẫn tới hiện tượng co nguyên sinh và làm cho tế bào chết. Sức đề kháng vi sinh vật ở trạng thái khô đều khác nhau, trong đó xạ khuẩn có sức đề kháng cao nhất sau đó là vi khuẩn và cuối cùng là nấm mốc. Ngoài ra, sức đề kháng của bào tử cao hơn sức đề kháng của tế bào sinh dưỡng. Vì vậy, độ ẩm môi trường là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm Nồng độ muối, đường và các chất hòa tan khác trong thực phẩm đều ảnh hưởng đến aW . Nếu nồng độ muối từ 3 đến 5% sẽ làm chậm sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm, từ 10 đến 12% thì sẽ làm mọi hoạt động của vi sinh vật ngưng lại. Nếu nồng độ đường từ 60 đến 70% sẽ hạn chế hoạt động của vi sinh vật. Tuy nhiên, các loài nấm mốc vẫn có thể phát triển ở nồng độ đường khoản 80 đến 90%. 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ * pH Tác động pH của nguyên liệu lên tế bào vi sinh vật chủ yếu vào hai hướng : Tác động lên hoạt tính enzyme trên thành tế bào của vi sinh vật đồng thời cũng tác động lên tính thấm của màng tế bào vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật đều có một giới hạn pH nhất định Nhóm ưa axit :pHopt = 3 Nhóm ưa trung tính : pHopt = 7 Nhóm ưa kiềm : pHopt = 9 – 10 Bảng 3.2 : Khoảng pH của các nhóm vi sinh vật Vi sinh vật pH pH tối ưu Vi khuẩn 4 - 8 6-7 Pseudomonas aeruginosa 5,6 - 8 6 Bacillus stearothermophilus 5,2 - 9,2 6 Clostridium sporogenes 5 - 9 6,5 Bacillus cereus 4,9 - 9,3 6,5 Salmonella 4 - 9,6 5 Escherichia coli 4,4 - 9 5 Lactobacillus spec 3,8 - 7,2 4-5 Nấm men 4 - 8 4-5 Saccharomyces cerevisiae 2,3 - 8 4,5 Nấm mốc 2 - 10 4-6 Penicillium italicum 1,9 - 9,3 5 Aspergillus oryzae 1,6 - 9,3 5 (Nguồn :Lương Đức Phẩm,2001) pH ở hầu hết trong tế bào vi sinh vật đều được duy trình bằng 7. Vì vậy, khi tế bào được đặt trong môi trường tối ưu sẽ tạo điều kiện tốt nhất cho vi sinh vật và nấm phát triển. Khi tế bào được đặt trong môi trường quá cao (dư kiềm) hoặc quá thấp (dư axit) sẽ làm cho mọi hoạt động của tế bào ngưng trệ hoặc ngừng phát triển. 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ * Oxy Các vi sinh vật sẽ thay đổi nhu cầu và phản ứng của chúng đối với oxy và khi có sự hiện diện của oxy trong môi trường. Môi trường có sự hiện diện của oxy là môi trường hiếu khí, không có oxy là môi trường kỵ khí. Các nhóm vi sinh vật sau được phân lập theo từng loại đối với sự hiện diện của oxy trong môi trường: Vi sinh vật hiếu khí bắt buộc: những vi sinh vật này cần oxy. Hiếu khí bắt buộc có giới hạn: giống như hiếu khí bắt buộc sinh vật cần oxy cho sự sống nhưng không thể phát triển ở nồng độ oxy là 20%. Vi sinh vật kỵ khí tùy ý: những vi sinh vật này có thể phát triển được trên môi trường có hoặc không có oxy. Vi sinh vật kỵ khí bắt buộc: các vi sinh vật loại này sẽ chỉ phát triển trong môi trường không có oxy và giải phóng năng lượng qua con đường lên men. Vi sinh vật độc lập với oxy: hầu hết vi khuẩn lên men lactic có thể phát triển trong môi trường có hay không có oxy nhưng vẫn sản xuất ra một lượng chất trung gian và năng lượng, và vì vậy chúng được gọi là độc lập với oxy. Hình 3.3 : Ảnh hưởng của oxy đến sự sinh trưởng của vi khuẩn (Nguồn : Lương Đức Phẩm, 2001) * Thành phần hóa học thực phẩm Để phát triển bình thường vi sinh vật cần một số yếu tố dinh dưỡng trong thực phẩm như: nước, nguồn năng lượng, nguồn nitơ, vitamin và muối khoáng Vi 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ sinh vật có sự ưa thích khác nhau đối với các loại thực phẩm khác nhau. Nấm mốc có nhu cầu dinh dưỡng ít nhất, tiếp đó là nấm men, vi khuẩn gram âm, sau cùng là vi khuẩn gram dương. Từ những yếu tố trên người ta phân loại thực phẩm ra làm 2 loại: Vi sinh vật thích (thực phẩm dễ hư): đạm ở hàm lượng cao, ít axit, đường và chất béo ở hàm lượng thấp, nước. Vi sinh vật kỵ (thực phẩm khó hư): đường, muối, mỡ chiếm tỷ lệ cao, cồn, hóa chất diệt khuẩn (thuốc trừ sâu, kháng sinh ở dạng dư lượng). Nhìn chung là các thực phẩm quá ngọt, quá mặn, quá chua, quá khô. 3.5.2 Yếu tố ngoại sinh * Nhiệt độ môi trường Mỗi một vi sinh vật có khả năng phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất định. Ngoài khoảng nhiệt độ đó ra vi sinh vật sẽ bị ức chế. Theo quan hệ của vi sinh vật với nhiệt độ người ta phân vi sinh vật ra làm ba nhóm: Nhóm ưa nóng (Thermophiles) Nhóm ưa ấm (Mesophiles) Nhóm ưa lạnh (Psychrophiles). Trong nhóm ưa lạnh lại được chia thành hai nhóm nhỏ là nhóm ưa lạnh bắt buộc và nhóm ưa lạnh không bắt buộc Hình 3.4: Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng của vi sinh vật (Nguồn : Prescott và ctv, 2007) 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Nhiệt độ thường gây cho vi sinh vật những chiều hướng sau: Đối với nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển hóa các hợp chất, làm ức chế hoạt động của enzyme làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm cho vi sinh vật mất khả năng phát triển và sinh sản Đối với nhiệt độ cao: thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng. Đa số vi sinh vật chết ở nhiệt độ 60 – 80oC. Một số chết ở nhiệt độ cao hơn. Đặc biệt bào tử của vi sinh vật có thể tồn tại ở nhiệt độ lớn hơn 100oC. * Độ ẩm không khí Độ ẩm không khí có ảnh hưởng đến hoạt độ của nước aw trong thực phẩm theo định luật Raoult. Vì vậy độ ẩm không khí có ảnh hưởng đến sự phát triển của các hệ vi sinh vật trên thực phẩm. Hơi nước trong không khí và nước hoạt động trong thực phẩm có khuynh hướng di chuyển qua lại để đạt đến sự cân bằng trên. * Ánh sáng Ánh sáng mặt trời có tác dụng trực tiếp đối với đại đa số vi sinh vật. Ánh sáng trực tiếp tiêu diệt vi sinh vật sau vài phút hay vài giờ. Ánh sáng khuếch tán ức chế một số vi sinh vật, nó chỉ gây chết khi tác dụng kéo dài. Các loài vi sinh vật khác nhau chịu tác dụng của ánh sáng khác nhau. Vi khuẩn gây bệnh nhạy cảm với ánh sáng: trực khuẩn lao chết sau 20 – 30 phút ngoài ánh sáng. Phần có tác dụng mạnh với vi sinh vật là tia tử ngoại. Tất cả các tia tử ngoại có bước sóng 2000 – 3000 Ao đều có tác dụng sát trùng, nhưng có hiệu quả nhất là bước sóng 2650 – 2660 Ao. Tia tử ngoại có tác dụng làm phân hủy một số chất hữu cơ trong tế bào, làm đông tụ protit, làm mất hoạt tính enzyme phá hủy tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên với một lượng nào đó tia này có thể tác dụng lên bộ gen làm ảnh hưởng đến tính di truyền và gây biến đổi. 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Bào tử của vi khuẩn, nấm cũng bị tiêu diệt bởi tia tử ngoại nhưng sức chịu đựng của bào tử cao hơn. Muốn tiêu diệt bào tử phải tăng liều lượng lên gấp 4 – 5 lần so với thể sinh dưỡng. Tia hồng ngoại ít có tác dụng với vi sinh vật, chỉ làm tăng nhiệt độ môi trường và thường dùng để sấy khô sản phẩm. * Siêu âm Siêu âm được tạo thành do những dao động có tần số cao trên 200000 dao động/giây (héc), siêu âm tác dụng mạnh lên tế bào vi sinh vật. Nhiều vi sinh vật bị chết chỉ sau khi bị tác dụng của siêu âm trong 1 phút. Siêu âm gây nên những chấn động trong dung dịch làm vi sinh vật bị ép và va chạm mạnh có thể làm vỡ vỏ tế bào đồng thời tạo nên trong môi trường những chất độc đối với vi sinh vật như H2O2, nitơ oxit. Siêu âm còn tạo nên những bọt khí hòa tan trong nguyên sinh chất và môi trường làm ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật. Hiện nay người ta đã ứng dụng ảnh hưởng này của siêu âm trong thanh trùng nước uống, rượu, nước giải khát * Thành phần khí quyển Thực phẩm được bảo quản trong môi trường chân không sẽ ức chế sự phát triển của nấm mốc và các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Đã có nhiều nghiên cứu về việc kết hợp giữa tồn trữ lạnh rau quả với việc điều chỉnh không khí trong phòng tồn trữ. Sự kiểm soát này bao gồm sự điều chỉnh đơn thuần nồng độ oxy, và khí trong không khí hoặc có thể bao gồm sự bổ sung hoặc bớt lại khí CO2 hay O2 hoặc bổ sung thêm ozone. Kiểm soát khí (CA: control atmosphere) biểu hiện sự thay đổi của nhiều loại khí khác với nồng độ không khí bình thường. Thông thường điều này được thực hiện bằng cách tăng nồng độ CO2 hay giảm nồng độ O2. Một thuật ngữ liên hệ đến sự thay đổi thành phần khí trong không khí (MA: modify atmosphere). Phương pháp MAP (modify atmosphere packing) là phương 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ pháp đóng gói thực phẩm trong bao PE có chứa thành phần hỗn hợp các khí (CO2+ N2+O2) hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí, nấm mốc. * Ảnh hưởng qua lại của hệ vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm Thực phẩm tươi thường bị nhiễm một hỗn hợp các vi sinh vật bao gồm cả vi sinh vật tự nhiên có nguồn gốc động vật hay thực vật và kể cả sự lây nhiễm từ môi trường. Trong khi phát triển ở thực phẩm, các loài vi sinh vật không chỉ tác động với nhau theo kiểu cộng sinh mà còn theo kiểu cạnh tranh, hiện tượng này luôn xảy ra, đan chéo vào nhau tạo ra một bức tranh sinh thái phong phú và còn được gọi là hiện tượng giao thoa vi sinh vật. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm: Vi khuẩn lactic sản sinh ra acid lactic trong sữa ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây hư hỏng sữa và gây bệnh Nấm men hiện diện trong hạt Kefir sẽ cung cấp vitamin B kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic Vi sinh vật có thể cho thấy sự tương tác hỗ trợ khi có sự kích thích phát triển qua lại và hiệu quả của hoạt động chung của 2 vi sinh vật được tăng cường. Điều này xảy ra trong việc lên men yoghourt trong đó sự tương tác giữa Streptococcus salivarius spp thermophilus và Lactobacillus delbreukii spp bulgaricus. 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Chương IV : CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 4.1 Các phương pháp định lượng vi sinh vật Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau, trực tiếp như đếm trên kính hiển vi, gián tiếp thông qua phương pháp đo độ đục, đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định, định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN). 4.1.1 Phương pháp đếm trực tiếp Được đếm bằng buồng đếm trên kính hiển vi. Thường áp dụng để xác định mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo Ưu điểm của phương pháp đếm này là cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết, độ chính xác không cao, dễ nhằm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu và không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp Phương pháp đếm trực tiếp này có thể được tiến hành trên kính hiển vi bằng các loại buồng đếm hồng cầu, buồng đếm Breed và buồng đếm huỳnh quang 4.1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc Cho phép xác định mật độ tế bào còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào còn sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán. Mật độ tế bào quá lớn sẽ làm các khuẩn lạc chồng chéo lên nhau hoặc tạo thành màng sinh khối, ngược lại số lượng khuẩn lạc quá nhỏ thì lại không có ý nghĩa thống kê. Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa tùy thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ không đủ dài. Thông thường điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Ngoài ra, do có khả năng nhiều tế bào hình thành chung một khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không biểu hiện chính xác số tế bào ban đầu được đưa vào môi trường, nên kết quả đếm và mật độ tế bào được trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit) CFU/g thay vì số tế bào/ml. Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Quy trình thao tác như sau: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân trải đĩa hoặc đổ đĩa ủ ở điều kiện và thời gian thích hợp đếm số khuẩn lạc và tính kết quả. Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu được tính theo công thức sau: N A (CFU/g hay CFU/ml) = n1Vf1 + + niVfi Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng 4.1.3 Phương pháp MPN Là phương pháp đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu. Phương pháp này có thể 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp. Đây cũng là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau (Thông thường, là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng: 3x3=9 ống nghiệm). Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn. Quy trình thực hiện phương pháp này như sau: - Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích xác định dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp. - Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp - Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (phản ứng dương tính), ghi nhận số lượng ở từng độ pha loãng. - Sử dụng số liệu này dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. 4.1.4 Phương pháp đo độ đục Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm. Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng. phương pháp này cho kết quả nhanh chóng và thường được ứng dụng trong theo dõi hoặc nghiên cứu đặc trưng tăng trưởng của các chủng vi sinh vật trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất tuy nhiên không thích hợp dùng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. N A (CFU/g hay CFU/ml) = n1Vf1 + + niVfi 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng 4.2 Các thử nghiệm sinh hóa Có thể định danh vi sinh vật dựa vào các đặc điểm sinh hóa đặc trưng của loài (hay nhóm) vi sinh vật đó. Có ba cách tiếp cận để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa dùng cho mục đích định danh là cách truyền thống, cách sử dụng các bộ KIT và dùng các thiết bị tự động. Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng thường được sử dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật bao gồm:  Thử nghiệm khả năng lên men: nhằm xác định khả năng sử dụng một nguồn cacbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng. Nguồn cacbon này được chia làm 3 nhóm: đường đơn, đường đa và rượu. Khả năng lên men được đánh giá sự làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Ngoài ra, CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại thành bọt khí trong ống chuông Durham làm nổi ống chuông này (môi trường lỏng) hoặc làm vỡ thạch (môi trường rắn). Được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột.  Thử nghiệm khả năng oxy hóa – lên men: còn được gọi là thử nghiệm Hugh – Leifson nhằm xác định vi sinh vật đang thử nghiệm biến dưỡng hydratcacbon theo phương thức oxy hóa hay phương thức lên men. Thử nghiệm này được thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng thử nghiệm trên môi trường Hugh – Leifson có glucose là nguồn cacbon duy nhất và chỉ thị pH là bromothymol blue. Các sản phẩm có tính axit của quá trình lên men sẽ làm thay đổi màu chỉ thị. 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ  Thử nghiệm Bile esculin: thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculin thành esculetin và glucost khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng với muối sắt trong môi trường tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.  Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate: môi trường thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất và có chứa muối ammonium dùng làm nguồn đạm làm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.  Thử nghiệm catalase: catalase là enzyme chỉ chứa trong tế bào vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2 ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự giải phóng O2 sẽ được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí.  Thử nghiệm decacboxylase: thường dùng để định danh và phân loại các vi khuẩn đường ruột họ Enterobacteriaceae. Các vi sinh vật này thường cảm ứng tạo thành các enzyme decacboxylase khi môi trường có tính axit và có chất cảm ứng đặc hiệu (một loại axit amin nào đó: lizin, ornithin, arginin, ) trong tất cả các trường hợp, CO2 sinh ra làm tăng pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.  Thử nghiệm coagulase: một số loài vi khuẩn đặc biệt là nhóm Staphylococcus, có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương. Thử nghiệm này được dùng ở bước cuối cùng trong các chỉ tiêu thử nghiệm để định danh các loài trong giống Staphylococcus: Staphylococcus aureus (+), Staphylococcus epidermidis (-).  Thử nghiệm urease: một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp urease để thủy phân ure. Sự phóng thích NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường và 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ có thể được theo dõi qua sự đổi màu chất chỉ thị pH. Thử nghiệm urease đặc trưng cho các loại Proteus spp.  Thử nghiệm gelatinase: một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin trong môi trường nuôi trường nuôi cấy. Trong thử nghiệm này, phản ứng (+) khi môi trường đặc tan chảy thành dạng lỏng.  Thử nghiệm khả năng tăng sinh H2S: trong quá trình phân giải các axit amin chứa lưu huỳnh khí H2S được giải phóng, tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfite có trong môi trường.  Thử nghiệm khả năng sinh indol: một số vi sinh vật có khả năng oxy hóa tryptophan thành các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinon có màu đỏ.  Thử nghiệm KIA, TSI: môi trường KIA (Kligler Iron Agar) và môi trường TSI (Triple Sugar Iron agar) được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của chủng vi sinh vật. Nếu vi sinh vật chỉ lên men đường glucose thì sau 18 – 24 giờ nuôi cấy môi trường thạch nghiêng phần trên sẽ có màu đỏ, phần sâu sẽ có màu vàng. Nếu vi sinh vật lên men cả đường glucose và lactose thì thị sau 18 – 24 giờ toàn bộ môi trường sẽ có pH acid, môi trường có màu vàng. Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn cacbon trên thì chỉ có phần trên thạch chuyển sang màu đỏ. Trong các trường hợp trên nếu sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí thì sẽ làm vỡ thạch.  Thử nghiệm nitratase: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrit và nitơ phân tử của vi sinh vật. 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ  Thử nghiệm oxidase:thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật.  Thử nghiệm ONPG: Xác định sự có mặt của enzyme β-galactosedase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose trong tế bào vi sinh vật dựa vào một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPD). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu vàng.  Thử nghiệm MR (methyl red): Thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính axit bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Thử nghiệm MR phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy, các vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính là tích lũy axit trong môi trường ngày càng nhiều, pH trong môi trường ngày càng giảm. Các vi sinh vật có phản ứng MR (-) sẽ tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm có tính axit thành các sản phẩm trung tính, pH sẽ chuyển về phía trung tính. Chỉ thị metyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men.  Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer): thử nghiệm VP giúp phân biệt các loài trong họ Enterobacteriaceae dựa trên sự oxi hóa acetoin.  Thử nghiệm CAMP: Là phản ứng phối hợp giữa nhân tố protein và nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng Staphyloccocus aureus gây ra hiện tượng làm tan máu hồng cầu của cừu hoặc bò trên môi trường thạch máu. Nếu thử nghiệm (+) thì sẽ xuất hiện đường tan huyết phân biệt rõ với vùng sẫm màu còn lại trong môi trường.  Thử nghiệm tính di động: khả năng di động của vi sinh vật có thể theo dõi được trên môi trường thạch mềm. ngoài ra, triphenyltetrazolium chloride (TTC) có thể được bổ sung vào môi trường để giúp phát hiện dễ dàng vị trí 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ. Ngày nay các thử nghiệm sinh hóa truyền thống để định danh vi sinh vật đã có thể được thực hiện ỏ các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngoài ra, còn có các bộ kit cho phép thực hiện hàng loạt các phản ứng sinh hóa theo một quy trình lựa chọn để định danh vi sinh vật. Các bộ kit này sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm ví dụ như mỗi bộ kit chỉ cho phép định danh được một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn. Ngoài ra, nhu cầu phân tích số lượng mẫu lớn của thực tế công tác kiểm nghiệm nhanh để rút ngắn thời gian từ khi nhận mẫu đến khi có kết quả. Do vậy, nhiều thiết bị được chế tạo nhằm tự động hóa công tác kiểm nghiệm, đặc biệt là không yêu cầu kiểm nghiệm viên luôn phải có mặt để giám sát công việc, có thể thực hiện qua đêm. 4.3 Một số chỉ tiêu vi sinh vật xác định bằng phương pháp truyền thống 4.3.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TPC) : Chỉ số này còn có tên gọi khác là: số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm. Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 25g mẫu + 225ml SPW Đồng nhất 30s Độ pha loãng 10-1 Pha loãng trong nước muối sinh lý (10-2,10-3,10-4) Cấy 1ml trên 2 đĩa petri Lắc đều Đổ môi trường PCA làm Úp ngược nguội trong 45oC Ủ ( t:30oC, 72h) Đọc kết quả từ 25-250 khuẩn lạc Tính toán theo công thức (3.1.2) Sơ đồ 4.1 :Quy trình phân tích TPC 4.3.2 Coliforms và Escherichia coli Coliforms là những trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh axit và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Chúng bao gồm: Escherichia coli, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ sinh vật gây bệnh khác. Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi chung là IMViC. 25g mẫu + 225ml SPW Đồng nhất 30s Độ pha loãng 10-1 Cấy 1ml trên 2 đĩa petri Đổ môi trường TSA làm nguội trong 45oC Đổ VRB lên TSA Ủ ở t = 37oC Time = 24h Chọn và đếm khuẩn lạc (màu đỏ sậm, có quầng tủa muối mặt, d > 0.5mm) Chọn mỗi đĩa 3-5 khuẩn lạc, cấy sang mt BGBL Ủ ở t =37oC, 24h n1 : khuẩn lạc trong BGBL n1 R= n : khuẩn lạc đã cấy n N A= *R nVf Sơ đồ 4.2 : Quy trình phân tích Coliforms 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 4.3.3 Staphylococcus aureus: S. aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không. Staphylococcus. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 25g mẫu + 225ml SPW Đồng nhất 30s Độ pha loãng 10-1 Cấy 1ml trên 1 đĩa petri mt BP( có egg yolk) o Khuẩn lạc : tròn, lồi, tâm Ủ, t = 37 C đen và có quần sáng Thời gian : 48h Chọn 5 khuẩn lạc cấy vào mt TSA Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ Ủ, t = 37oC Theo dõi :2h,4h,6h,8h Đọc kết quả và tính toán Sơ đồ 4.3 : Quy trình định lượng Staphylococcus Aureus 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 4.3.4 Clostridium Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens. C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giài protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, còn các kiểu C, D, E không có khả năng này. Kiểu A thường thấy trên các mẫu thịt trong khi kiểu E chỉ được phân lập trên các mẫu cá. C. perfringens là loài kỵ khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử trên môi trường nuôi cấy Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài này có 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường. 4.3.5 Salmonella: Salmonella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh axit nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh H2S. 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 25g mẫu + 225ml SPW Ủ, t = 37oC Đồng nhất 30s Thời gian : 24h Độ pha loãng 10-1 0,1 ml dd 10ml mt RV Ủ, t = 42oC Thời gian : 24h Cấy chuyển qua mt XLD Ủ, t = 37oC Khuẩn lạc : tròn, lồi, tâm Thời gian : 24h đen, mt chuyển màu đỏ Cấy chuyển qua mt TSA o Ủ, t = 37 C Thời gian : 24h Cấy chuyển qua mt TSI, Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC broth Ủ, t = 37oC Thời gian : 24h Biểu hiện : TSI (đỏ/vàng/H S(+)/gas(+)), 2 Mannitol (+), Urea (-), LDC (+) Kết luận Sơ đồ 4.4 : Quy trình định tính Salmonella 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 4.3.6 Tổng số nấm men, nấm mốc: Trong thực phẩm, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng số nấm mốc, nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar (DRBC). Khuẩn lạc đặc trưng Coliforms Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella Khuẩn lạc đặc trưng Staphylococcus Aureus Khuẩn lạc đặc trưng Clostridium Hình 4.1 : Các dạng khuẩn lạc đặc trưng của vi sinh vật 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Ưu điểm các phương pháp truyền thống : Thực hiện với các thao tác đơn giản, không phức tạp. Chi phí để phát hiện vi khuẩn không cao. Được nhiều nước công nhận và đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn Nhược điểm : Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm, sai lệch, mất nhiều công sức và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện và có độ nhạy và độ chính xác cao. Như vậy, để xác định vi sinh vật trong thực phẩm có nhiều phương pháp khác nhau. Tuy nhiên các phương pháp này đều đòi hỏi thời gian, môi trường hóa chất và luôn tuân theo một quy trình nghiêm ngặt. Để khẳng định kết quả cần dựa trên kết quả tổng hợp của nhiều thí nghiệm khác nhau đòi hỏi người thực hiện có kiến thức và kinh nghiệm chuyên sâu. Do đó, để hỗ trợ cho công tác phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm nhanh chóng và tiện lợi hơn, hiện nay đã có nhiều công trình ứng dụng các kỹ thuật mới trong lĩnh vực này. 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Chương V : CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 5.1 Tổng quan Ngày nay, với tiến bộ của khoa học kỹ thuật đã tạo một bước tiến vượt bậc trong mọi lĩnh vực khoa học nói chung và sinh học nói riêng. Các nghiên cứu khoa học gần đây đã cải thiện đáng kể về các phương pháp xác định vi sinh vật trong thực phẩm. Tăng hiệu suất công việc cũng như đáp ứng nhu cầu của thị trường thế giới. Được nghiên cứu và phát triển vào những năm 1960, sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Với ưu điểm nhanh và chính xác, các phương pháp hiện đại đã dần thay thế các phương pháp truyền thống trong việc xác định vi sinh vật. Việc áp dụng phương pháp hiện đại trong lĩnh vực nghiên cứu đã mở ra một cách nhìn nhận hoàn toàn mới về vi sinh vật. Hiện tại các phương pháp hiện đại đã được áp dụng một cách rộng rãi trên toàn thế giới. Áp dụng phương pháp này người ta đã chế ra các bộ kit dùng trong thực phẩm, phục vụ cho mọi công tác kiểm tra vi sinh cũng như đảm bảo an toàn cho đời sống nhân dân. Du nhập vào Việt Nam vào đầu những năm 1990, các phương pháp hiện đại đã dần thay thế các phương pháp truyền thống. Hiện nay, trên thị trường đã không ít các bộ kit áp dụng các phương pháp hiện đại áp dụng và một số kit đã được chế tạo trực tiếp tại thị trường Việt Nam. 5.2 Các nghiên cứu về Kit thực phẩm tại Việt Nam Kit kiểm tra nhanh là sản phẩm của các chuyên gia thuộc Viện kỹ thuật Hoá sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Tổng Cục Kỹ thuật-Bộ Công an). Chúng được sản xuất dưới dạng ống thuỷ tinh, que nhựa hoặc túi nhỏ, bằng nguyên liệu sẵn có trong nước. Những loại kit này có chung một đặc điểm là phát hiện sự hiện diện của một loại hoá chất độc hại trong thực phẩm thông qua sự thay đổi màu sắc của thuốc thử nằm sẵn bên trong kit, do vậy có thể dễ dàng đọc kết quả bằng mắt thường. 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Hiện Viện đã chế tạo được 15 bộ kít khác nhau có thể thử nhanh và cho ngay kết quả nhiều lọai độc chất thường được cho vào thực phẩm như nitrit trong thịt đã chế biến, chì trong thực phẩm, thức uống Ngoại trừ kit kiểm tra thuốc trừ sâu cho kết quả sau khoảng 50 phút, các loại kit còn lại cho kết quả sau không quá 5 phút với độ nhạy và chính xác cao. Với những ưu điểm này, các cơ quan quản lý nhà nước và người tiêu dùng có thể sử dụng kit thử nhanh để kiểm tra ngay tại cơ sở sản xuất, chế biến thực phẩm, các chợ và cửa hàng. Theo Thạc sĩ Lê Trọng Văn, Phó trưởng phòng kỹ thuật sinh học nghiệp vụ, công nghệ sản xuất kit kiểm tra nhanh từ lâu đã được áp dụng để phục vụ trong ngành công an từ nhiều năm nay. Chỉ đến gần đây, công nghệ sản xuất kít đã được mở rộng sang lĩnh vực dân sự để bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng. Mỗi loại kit kiểm tra được chế tạo bằng một công nghệ khác nhau, tuân thủ các quy định của Bộ Y tế, Tiêu chuẩn Việt Nam hoặc Dược điển Việt Nam. ''Đây hoàn toàn là kết quả nghiên cứu của chúng tôi - một loại sản phẩm hoàn toàn của Việt Nam'', Thạc sĩ Văn khẳng định. Để nghiên cứu, sản xuất những loại kit thử nhanh, tiện lợi và đơn giản cho người tiêu dùng, nhóm nghiên cứu đã phải thử hàng chục phương án khác nhau, dần dần khắc phục các nhược điểm và hiện đang sản xuất trên quy mô nhỏ. Không dừng lại đó, để phục vụ các cơ quan quản lý Nhà nước về VSATTP, nhóm đã thiết kế một loại valy gọn nhẹ, phù hợp với công tác kiểm tra cơ động, chứa 15 loại kit trên cùng với một số dụng cụ phục vụ việc xử lý mẫu, thu thập mẫu cho xét nghiệp tiếp theo trong phòng thí nghiệm. Trên phương diện quản lý Nhà nước, các kit này đã được thử nghiệm thực tế tại Viện Dinh dưỡng và một số trung tâm y tế dự phòng. Chi cục Bảo vệ thực vật Hà Nội cũng đã tiến hành thử nghiệm bộ kit kiểm tra nhanh thuốc trừ sâu trước khi áp dụng thực tế. Theo đánh giá của Chi cục, sản phẩm này có cách sử dụng đơn giản hơn so với sản phẩm ngoại nhập cùng loại và cho kết quả chính xác. Hiện nay Chi cục đã mua sản phẩm này để áp dụng cho công tác kiểm tra hàng năm. 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Riêng trên thị trường nước ta, hiện chưa có các loại kit nội tương tự dành cho người tiêu dùng. Các kit ngoại thì chưa phù hợp lắm với điều kiện của Việt nam, khi sử dụng phải đong, đo hoá chất từ các lọ nhỏ đóng sẵn, vì vậy không loại trừ được sai số chủ quan do người sử dụng gây ra. Còn lượng hoá chất trong các kit thử của Viện Kỹ thuật Hoá Sinh và Tài liệu nghiệp vụ (Tổng Cục Kỹ thuật-Bộ Công an) đã được định lượng sẵn, do vậy loại bỏ được sai số nói trên. 5.3 Phương pháp phân tích vi sinh vật trong các Kit test nhanh thực phẩm 5.3.1 Phân loại các kit : Các phương pháp nhanh và tự động hóa trong phân tích vi sinh vật thực phẩm đều dựa trên nguyên tắc của vi sinh học, sinh hóa học, hóa lý, miễn dịch học, sinh học phân tử học để phát hiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại của chúng trong thực phẩm, môi trường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn bị mẫu, phân tích .đều được nghiên cứu cải tiến theo hướng tự động hóa, đơn giản hóa cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp xét nghiệm nhanh thực phẩm Phương pháp Phương pháp Phương pháp Phương pháp Phương pháp miễn dịch vi sinh sinh học phân tử sinh hóa hóa lý Phương pháp Phương pháp Phương pháp Phương pháp phát ELISA PCR lai DNA quang sinh học ATP Sơ đồ 5.3.1 : Phân loại các phương pháp áp dụng trong Kit 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 5.3.2 Phương áp dụng trong kit : 5.3.2.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh Nguyên tắc : Nguyên tắc chung của quy trình phát quang sinh học này như sau: Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhỏ nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra. Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã biết trước. Cơ chế : Adenosin triphotphat (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg (10-12g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15gATP/ tế bào). Độ nhạy này có được khi sử dụng các hóa chất thương mại đắt tiền, sự phân tích thường chỉ diễn ra vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sang phát ra (giảm giá thành và có thể mang đi được) và những hóa chất ổn định sự phát sang. Phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những chất lỏng như 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra. Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm trải qua hai giai đoạn: E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng có thể được viết lại như sau: E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi (E: Luciferase; LH2: Luciferin) Phản ứng phát sáng của đom đóm là có hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. Phản ứng này đòi hỏi D- Luciferin và ion Mg2+ để hoạt động, đây là thành phần cơ bản trong bộ kit thương mại. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxi và phức hợp Mg – ATP. Sau đó, ánh sáng vàng - xanh (bước song cao nhất là 562nm) được phát ra. Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm, người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của eukaryote và của tế bào vi sinh vật. Thông thường ATP không có nguồn gốc là của tế bào vi sinh vật sẽ được tách chiết bởi những chất tẩy không ion ví dụ như Triton X-100. ATP này sau khi tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được ly trích bằng chất tricloaxetic 5%. Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp. Các sản phẩm áp dụng phương pháp ATP : Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ giá chất lượng thực phẩm, mĩ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, nhanh chóng chỉ trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Các sản phẩm bao gồm : ProbesATP Kit Máy đo APT được nối với máy tính và đo bằng chương trình Advance.im Và còn một số sản phẩm hiện đại khác trên thị trường thế giới Hình 5.1 : Máy đo 3MTM Clean-TraceTM Surface ATP Ưu điểm : Nhanh, chính xác và thao tác đơn giản Tiết kiệm thời gian, tăng năng suất công việc Thực hiện mẫu trong các loại sản phẩm khác nhau Nhược điểm : Cồng kềnh, khó di chuyển Tốn chi phí rất lớn cho việc mua mẫu ATP và các lọ thuốc thử Đòi hỏi kỹ thuật chuyên môn cao 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 5.3.2.2 PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát triển của các kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh. Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác định các chất độc hại trong môi trường như dộc tố, dư lượng kháng sinh Nguyên tắc của phương pháp ELISA dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Phản ứng miễn dịch xảy ra được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme). Nguyên lý : Phương pháp ELISA là phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay). Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tính hiệu (thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy, chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: (1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt; (2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme; (3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Hình 5.2 : Nguyên tắc phản ứng ELISA Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Cơ chế : ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme). Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KT (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. Sandwich ELISA: Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT. Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Hình 5.3 : Các bước trong Sandwich ELISA ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN. (2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN. (3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh". (4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym. (5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu. Các sản phẩm áp dụng phương pháp ELISA: Định danh Campylobacter (kit : TECRA,EiaFOSS ) Xác định độc tố Clostridium botulinum toxin (kit : ELCA ) Định danh Staphylococcus aureus ( kit : S. aureus VIA ) Và còn một số sản phẩm hiện đại khác trên thị trường thế giới Ưu điểm : Nhanh, chính xác và thao tác đơn giản Tiết kiệm thời gian, tăng năng suất công việc Thực hiện mẫu trong các loại sản phẩm khác nhau Gọn, nhẹ và dễ dàng di chuyển 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Nhược điểm : Tốn kém, hóa chất phụ thuộc vào nhập khẩu. Gặp nhiều khó khăn khi thiết bị hỏng và sai lệch số liệu Đòi hỏi kỹ năng chuyên môn cao FSH ELISA Kit S. aureus VIA AgraQuant® Mycotoxin ELISA Kits ELISA Starter Kit (BSA) Hình 5.4 : Các loại Kit Elisa (Nguồn : www.cellular-product.com) 5.3.2.3 Phương pháp lai phân tử Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Nguyên tắc : ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai. Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên. Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau.Phép lai được tiến hành ở đây dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung. Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợi đơn ADN tách nhau được gọi là trạng thái biến tính ADN (denature). Nếu tại thời điểm này người ta cho vào một ADN đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện (renature), lúc đó sẽ cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn của mẫu ADN ban đầu (target ADN). Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng nhưđiều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện mẫu dò, kích thước mẫu dò). Như vậy, việc chọn điều kiện chính xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính đặc hiệu của kết quả phép lai. Sau khi lai, bước tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại mẫu dò dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tuỳ theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng của phép lai. 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai là: mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai và điều kiện tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai. Cơ chế : Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Chọn mẫu dò Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai. : Mẫu dò sẽ lai với AND đích (target) và không lai với các nguồn ADN khác có mặt trong mẫu lai. Khi phân tích các mẫu vi sinh vật với nhau thì mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu phân tích để phân biệt với các sinh vật khác. Tuy việc chọn mẫu dò cũng mang tính kinh nghiệm, mẫu dò đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể là yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó trên plasmid). Với cách chọn mẫu dò có kích thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi là các mẫu dò được tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh (dưới 30 phút) trong khi đó với các mẫu dò lớn thời gian kéo dài hơn (khoảng 16 giờ). Hạn chế lớn nhất đối với các mẫu dò nhỏ là khó khăn khi đánh dấu và dẫn đến giảm tính đặc hiệu của phép lai. Một cách thường được sử dụng là thiết kế các mẫu dò từ các chuỗi ARN thông tin 16S. Cách chọn có thể căn cứ vào đoạn ADN có mặt trong các đại diện mức độ dưới loài, trong loài hay thuộc chi nghiên cứu. 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Các phương pháp đánh dấu Các kỹ thuật đánh dấu ADN được xem là lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong sinh học phân tử. Nói chung kỹ thuật đánh dấu được chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp và gián tiếp. Trong phương pháp trực tiếp thì phần đánh dấu để phát hiện được gắn vào acid nucleic. Đối với phương pháp gián tiếp thì có một phần chức năng được gắn vào acid nucleic và phần này lại được phát hiện gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu được phát hiện bằng kỹ thuật miễn dịch. Sau đây là chi tiết các phương pháp đánh dấu. Đánh dấu trực tiếp 2 bước chính: Tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị của nhóm tín hiệu với mẫu dò Thực hiện phép lai giữa mẫu nghiên cứu và mẫu dò. Đánh dấu gián tiếp được thực hiện theo 3 bước: Thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích Phản ứng giữa nhóm chức năng và protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo (reporter) Tạo ra tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu. Quá trình lai Nói chung quá trình lai (Hybridization ) được tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang (solid support). Trên thực tế hầu hết các KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật đều tiến hành trong môi trường dịch thể. Vi sinh vật trong mẫu đầu tiên được phân giải trong điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò. Sau đó là bước lai và tách phức hệ mẫu dò và ADN đích dựa vào các thông số của phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể. Các phép lai theo kiểu kẹp díp cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; một đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang và một đoạn là mẫu dò. Điều quan trọng là hai đoạn ADN này phải có trình tự khác nhau cho dù chúng đều gắn với hai vùng khác nhau trên đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung. Mẫu dò đánh dấu được bổ 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ sung vào trong dung dịch có các đoạn ADN đích nghiên cứu. Như vậy theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát hiện gắn với ADN đích và phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang đã được hình thành. Phức hợp này được tách ra khỏi dung dịch và khi có mặt cơ chất thích hợp để phát hiện được mẫu dò đánh dấu. Khi dùng hệ thống phát hiện dựa vào các hoá chất huỳnh quang hay tạo màu có thể dùng thiết bị phát hiện kết quả một cách tự động. Plasmid DNA Extraction Kit. DNA Kit. DNA Explorer Kit DNA purification Kit Hình 5.5 : Một số loại Kit dùng phương pháp lai DNA (Nguồn : www.wannalearn.com) 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Ví dụ: ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. mẫu dò là những đoạn oligomer AND đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể chia làm 6 bước: 1) Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA 2) Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate ở đầu 5` và 3` của phân tử được đặt vào phản ứng. 3) Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò. 4) Que thử được đặt trong ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme 5) Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu. 6) Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm. Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó. Ưu điểm: Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật. Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên thị trường. Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn giản cho việc phân tích kết quả. Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để lưu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm. Nhược điểm : Phương pháp sử dụng khá phức tạp và tốn thời gian. Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế 62
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn AND plasmid. Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp thì phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao hơn. Cho dù kỹ thuật này được sử dụng tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác. Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí enzym cắt hạn chế trên ADN của ribosom. Tuy nhiên, sự khác biệt ở chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, còn đối với PFGE phản ánh sự phân bố của các enzym cắt hạn chế phân bố trên toàn bộ gene nghiên cứu. Nghiên cứu của Prevost (1992) cho thấy là kỹ thuật PFGE có thể hiệu quả hơn kỹ thuật ribotyping đối với phép phân tích các chủng Staphylococus aureus kháng methicillin. 5.3.2.4 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis mà cộng sự phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm Nguyên lý : Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen 63
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Cơ chế : Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1: biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn o Tm của phân tử, thường là 94 – 95 C trong 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn. - Bước 2: bước lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ này khoảng 40 – 70oC, trong khoảng 30 – 60 giây. - Bước 3: tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng phải bám 64
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật. Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR như sau: - Bước 1: tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc trong thời gian từ 10 – 20 giờ. - Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR. - Bước 3: thực hiện phản ứng PCR - Bước 4: điện di trên gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV. Các sản phẩm áp dụng phương pháp PCR : Định danh Clostridium botulinum ( Kit : Probelia ) Định danh E.coli O157:H7 (Kit : BAX ) Định danh Salmonella (Kit : BINDb ) Và một số sản phẩm khác trên thị trường thế giới . Ưu điểm : Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật. Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên thị trường. Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn giản cho việc phân tích kết quả. Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để lưu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm. 65
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Nhanh, chính xác và thao tác đơn giản Tiết kiệm thời gian, tăng năng suất công việc Một số khó khăn với phản ứng PCR: PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễm ADN đều có thể đưa đến sản phẩm dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết được sự nhiễm tạp từ các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm. Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao chép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số lượng tương ứng khoảng 40 000 nucleotid. Bảng 5.2 : Thành phần phản ứng PCR Thành phần Số lượng ADN khuôn 10-100 ng dNTP (mỗi loại) 200 mM Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM Taq polymerase 1 U KCL 50 mM Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM MgCl2 2.85 mM Gelatin 100 mg/l Nonidet-40 0.05% (Nguồn :Lương Đức Phẩm, 2001) 66
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ (1) (2) Sơ đồ 5.3.2 : Phản ứng trong phương pháp ATP(1) và ELISA(2) 67
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Sơ đồ 5.3.3 : Phản ứng PCR 68
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ 5.3.3 Một số phương pháp thử nhanh khác 5.3.3.1 Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng bậc 10 tạo một thể tích lớn nguyên liệu ban đầu (250ml). Nhưng có thể chỉ dùng vài mililite cho những bước tiếp theo trong quy trình phát hiện. Như vậy chúng ta có thể dùng bước tăng mật độ các vi sinh vật mục tiêu trong mẫu để rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện. Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là miễn dịch phân tách (Immunomagnetic separation – IMS). Với phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể được rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng quy trình tương tự không cần nuôi cấy. IMS sử dụng những hạt siêu thuận từ được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu. Các hạt này có chức năng phân tách chọn lọc vi sinh vật mục tiêu này ra khỏi một hỗn hợp quần thể. Các vi sinh vật mục tiêu này có thể được phát hiện bằng các quy trình vi sinh truyền thống. Tính siêu thuận từ các hạt chỉ được thể hiện khi chịu sự tác động của một lực từ tính bên ngoài tác động. Dynabeads ® (Dynal A/S, Oslo, Norway) là một sản phẩm dực trên kỹ thuật IMS. Quy trình này sử dụng những hạt polystyren siêu thuật từ có đường kính 2,8µm (Dynabeads ® M-280) và 4.5µm (Dynabeads ® M-450). Cả hai loại M-280 và M-450 đều có thể được bao bên ngoài bởi lớp kháng thể do người dùng lựa chọn. Một ví dụ về chất hấp thụ từ tính khác có thể được lựa chọn là BioMag (Metachem Diagnostics Ltd, Northampton). Các hạt từ tính oxide sắt (đường kính 0.5 – 1.5 µm) được bao phủ bên ngoài bởi các nhóm amino-, carboxy- hoặc thiol-. Ngoài ra một số hệ thống khác còn có khả năng tạo từ tính cho các tế bào vi sinh vật bằng cách cho chúng hấp thu trực tiếp những hạt siêu hiển vi oxide sắt mang từ tính lên bề mặt tế bào (Safarik và cộng sự, 1995). 69
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Vi sinh vật Hạt polystyren bao bọc vi sinh vật Hạt từ tính oxide sắt hút vi sinh vật xuống đáy Hình 5.6 : Các bước của kỹ thuật phân tách (Nguồn : www.ebiotrade.com) 5.3.3.2 Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp ( Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) Cơ sở của việc sử dụng phương pháp màng lọc là thu nhận tế bào từ một lượng lớn thể tích được lọc. Sau đó có thể kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc bằng cách đểm khuẩn lạc. Phương pháp này thích hợp đối với mẫu có mật độ tế bào thấp. Màng lọc có thể được làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon, polyvinylchloride và polyester (Sharpe, 1994). Kích thước lổ sử dụng là 0,45µm (hoặc 0,22µm) đường kính 13mm đến 150mm. Tạo lực đẩy qua lọc bằng hút chân không hoặc lực ép. Màng lọc được sử dụng như một biến thể của kỹ thuật truyền thống với nhiều mục đích: tăng mật độ vi sinh vật mục tiêu trong một thể tích lớn nhằm tận dụng giới hạn phát hiện: loại bỏ tác nhân ức chế sự tăng trưởng. Độ nhạy của kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế bào trước khi nhóm được lọc bởi màng lọc. Có thể phân biệt tế bào sống và tế 70
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ bào chết bằng cách nhuôm nhân với fluorochrome acidine orange. Màu sắc phát quang trong tế bào thay đổi trong suốt các quá trình tăng trưởng. Thuốc nhuộm phát màu đỏ với RNA và màu xanh với DNA. Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào chết cho màu xanh lục. Năm 1991, phương pháp ISO- GRID ® ứng dụng trên đối tượng Salmonella đã được AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm. (Method 991.12). Hình 5.7 : Hệ thống ISO-GRID ® (Nguồn : www.ebiotrade.com) 5.3.3.3 Kỹ thuật màng Petri (Petrifilm) Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được năng lên và nhỏ vào một 1ml dịch mẫu rồi đậy lại. Một đĩa petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khuôn tròn. Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc trên Petrifilm. Petrifilm đã được dùng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, số coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản. Thời hạn sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xử lý nhiệt như phương pháp thông thường. Có thể dùng nước cất vô trùng để làm ướt lại môi trường đông khô. 71
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD : Nguyễn Hoàng Mỹ Hình 5.8 : Kỹ thuật màng Petri (Nguồn : www.ebiotrade.com) 5.3.3.4 Kỹ thuật Redigel Kỹ thuật này sử dụng các chất dinh dưỡng và pectin gel chứa trong một ống nghiệm. Có thể sử dụng ống nghiệm này bất cứ lúc nào mà không cần phải đun chảy thạch. Trước tiên nhỏ 1ml mẫu vào ống nghiệm, trộn đầu. Sau đó đổ tất cả vào một đĩa petri đặc biệt đã được tráng sẵn một lớp calci. Khi chất lỏng tiếp xúc với calci, gel Ca-pectate sẽ hình thành và phức chất này sẽ trương lên môi trường thạch thông thường. Sau khi ủ ở chế độ thích hợp có thể đếm khuẩn lạc giống như phương pháp đếm đĩa thông thường. 72