›

Đồ án Thu nhận sophorolipids tổng hợp từ chủng Candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải

pdf 62 trang thiennha21 13/04/2022 5710
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thu nhận sophorolipids tổng hợp từ chủng Candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_thu_nhan_sophorolipids_tong_hop_tu_chung_candida_bombi.pdf

Nội dung text: Đồ án Thu nhận sophorolipids tổng hợp từ chủng Candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THU NHẬN SOPHOROLIPIDS TỔNG HỢP TỪ CHỦNG Candida bombicola VỚI NGUỒN ĐƯỜNG GLUCOSE VÀ DẦU HẠT CẢI Ngành : Cơng nghệ sinh học Chuyên ngành : Cơng nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hồng Dũng ThS. Lê Quỳnh Loan Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Yến Nhi MSSV: 1311100539 - Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài: Nguyễn Thị Yến Nhi Sinh viên trường: Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường Ngành: Cơng nghệ sinh học Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100539 Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hồng Dũng và ThS. Lê Quỳnh Loan, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hồn tồn trung thực, khơng sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp cĩ tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được cơng bố cơng khai trên các website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu cĩ bất cứ sự sao chép và khơng trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Yến Nhi i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong thời gian vừa qua, được sự giới thiệu của trường Đại Học Cơng Nghệ TP. HCM, em đã cĩ dịp thực tập và tìm hiểu về Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Tại trung tâm, em được ơn lại, kiểm chứng những kiến thức đã được tích lũy trên ghế nhà trường vào trong thực tiễn và học được nhiều bài học kinh nghiệm thực tế hơn, được tiếp xúc, tìm hiểu các lồi vi sinh vật và các trang thiết bị trong phịng vi sinh. Để hồn thành đợt thực tập này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cơ, các anh chị và các bạn. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hồng Dũng và Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan đã mở lịng nhận em vào thực tập tại trung tâm. Trong suốt thời gian thực tập, thầy và chị cũng đã hết lịng hướng dẫn em, để em cĩ thể đạt được kết quả nghiên cứu tốt nhất, cũng như am hiểu tồn bộ về các phương pháp nghiên cứu. Bên cạnh đĩ em xin cám ơn Tiến sĩ Hồng Quốc Khánh và thầy Ngơ Đức Duy. Dù khơng trực tiếp hướng dẫn nghiên cứu, nhưng vẫn cho em những lời khuyên vơ cùng quý báu, sâu sắc và những nụ cười rạng rỡ mỗi ngày. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến quý Thầy/Cơ Khoa Cơng nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trường, trường Đại học Cơng Nghệ TP. Hồ Chí Minh đẫ tận tình truyền đạt những kiến thức hết sức bổ ích cho em khi cịn ngồi trên giảng đường trường đại học. Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới tồn thể quý thầy quý cơ đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Yến Nhi ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 4 1.1. CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant) 4 1.1.1. Định nghĩa 4 1.1.2. Cấu trúc phân tử 4 1.1.3. Đặc điểm 5 1.1.4. Phân loại 6 1.1.5. Ứng dụng 7 1.2. SOPHOROLIPIDS 8 1.2.1. Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) 8 1.2.2. Sophorolipid 10 1.2.3. Cấu trúc 11 1.2.4. Đặc tính 13 1.2.5. Hạn chế 15 1.3. Candida bombicola ATCC 22214 15 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 18 1.4.1. Ngồi nước 18 1.4.2. Trong nước 19 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20 2.2. Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1. Chủng vi sinh 20 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 20 2.2.3. Hĩa chất 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 22 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu 22 2.3.2. Tăng sinh và bảo quản chủng Candida bombicola ATCC 22214 23 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 23 2.3.4. Lên men 23 2.3.5. Thu nhận sophorolipids thơ 24 2.3.6. Chạy sắc ký bảng mỏng (TLC) 25 2.3.7. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 26 2.3.8. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục (MIC) 27 2.3.9. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH 28 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola 31 3.2. Lên men sophorolipids từ C. bombicola 32 3.3. Thu nhận sophorolipids từ C. bombicola 32 3.4. Sắc ký bảng mỏng (TLC) 34 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch . 35 3.6. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục 37 3.7. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH 38 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1. Kết luận 40 4.2. Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID 1 1. Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 1 2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (mm) 2 3. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hĩa của SLs (OD517) 2 4. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp MIC (OD600) 3 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 4 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CHDBM Chất hoạt động bề mặt CHDBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl IC50 Inhibitory concentration 50% LB Luria Bertani LM Mơi trường lên men chính MIC Minimum inhibitory concentration OD Optical density SLs Sophorolipids TLC Thin-layer chromatography YM Mơi trường tăng sinh/giữ giống v
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs cs, 1997) 9 Bảng 1.2. Hoạt tính nhũ hĩa của SLs đối với một số loại dầu (Daverey và Pakshirajan, 2009) 14 Bảng 1.3. Phân lồi nấm Candida bombicola (Kurtzman và Fell, 2001) 15 Bảng 1.4. Khả năng sinh hĩa nguồn carbon của C.bombicola (Spencer vs cs, 1970). 17 Bảng 3.1. Đường kính vịng kháng khuẩn của hợp chất SLs 36 Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs lên một số chủng vi khuẩn 38 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phịng 4 Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước 5 Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt 5 Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử 6 Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự, 2012) 10 Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) 11 Hình 1.7. Quy trình sinh tổng hợp nên SLs trong tế bào (Van Bogaert và cộng sự, 2007) 12 Hình 1.8. Tế bào C.bombicola 16 Hình 1.9. Khuẩn lạc nấm C.bombicola 2 ngày tuổi trên mơi trường YM. 16 Hình 2.1. Quy trình thu nhận SLs thơ từ quá trình lên men chủng C. bombicola 25 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs trên đĩa 96 giếng. 28 Hình 2.3. Cơ chế chuyển màu của DPPH khi nhận một phân tử hydro từ chất chống oxy hĩa. 29 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hĩa của SLs trên đĩa 96 giếng. 30 Hình 3.1. Biểu đồ đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214. 31 Hình 3.2. Mơi trường lên men chính trước (trái) và sau (phải) sau 7 ngày 32 Hình 3.3. Dịch lên men sau 7 ngày vẫn cịn một lượng dầu. 32 Hình 3.4. Màng liên pha giữa Hexane và dịch lên men xuất hiện bọt. 33 Hình 3.5. Sophorolipids thơ thu nhận được 34 Hình 3.6. Kết quả chạy sắc ký TLC 35 Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. 37 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hĩa của hỗn hợp SLs thơ. 39 vii
  9. Đồ án tốt nghiệp Hình 1. Dịch lên men trước (trái) và sau (phải) khi chiết với hexane 4 Hình 2. Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate 4 Hình 3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Bacillus subtilis của SLs 5 Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Escherichia coli của SLs 5 Hình 5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Pseudonomas aeruginosa của SLs 6 Hình 6. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Salmonella typhimurium của SLs. 6 Hình 7. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Staphylococus aureus của SLs. 7 Hình 8. Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu 7 Hình 9. Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hĩa 8 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Mỗi năm trên tồn thế giới người ta sản xuất ra khoảng 10 triệu tấn chất hoạt động bề mặt (CHDBM), mức tiêu thụ được chia đều cho ứng dụng trong các hợp chất tẩy rửa và ứng dụng trong cơng nghiệp (Van Bogaert và cộng sự, 2007). CHDBM được biết đến bởi phạm trù ứng dụng rộng rãi như: chất tẩy rửa, thực/dược/mỹ phẩm, chế phẩm nơng nghiệp. Nhưng vì chủ yếu CHDBM được tổng hợp theo con đường hĩa học và nguồn gốc là từ dầu mỏ, khĩ phân hủy và cĩ khả năng gây độc cho mơi trường. Vì thế trọng tâm nghiên cứu CHDBM trong thời gian gần đây là tìm ra CHDBM cĩ nguồn gốc từ sinh học, chủ yếu là do vi sinh vật tổng hợp. Ưu điểm của chất hoạt động bề mặt sinh học (CHDBMSH) là độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao và khả năng ứng dụng rộng hơn. CHDBMSH chủ yếu là glycolipid, phospholipids, hợp chất polyme và lipopeptides. Sophorolipid (SLs) là một trong những CHDBMSH, được cấu thành từ đường sophorose liên kết với một chuỗi acid béo, chiều dài chuỗi phụ thuộc vào nguồn carbon được sử dụng. SLs là một trong những CHDBMSH cĩ thể tổng hợp từ các nguồn nguyên liệu tái sử dụng. Khơng chỉ dừng lại ở đĩ, SLs cịn cĩ khả năng ức chế một số loại nấm men (Van Bogaert và cộng sự, 2007), nấm bệnh thực vật (Yoo và cộng sự, 2005) và vi khuẩn (Mager và cộng sự, 1987; Lang và cộng sự, 1989). Ngồi ra SLs cịn cĩ khả năng chống bám, ức chế sự hình thành của màng sinh học (Zezzi do và cộng sự, 2012). Năm 2016, tại Việt Nam cơng trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hồn thành - Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Tuy vậy, nhưng kết quả khảo sát hoạt tính SLs của nghiên cứu này thu được chỉ từ một nguồn dầu dừa. Do đĩ nghiên cứu này sẽ tiếp tục mở rộng sang nguồn nguyên liệu lên men khác, sử dụng nguồn dầu hạt cải – chứa 61% acid oleic và đường glucose – đơn tử cấu thành sophorose, kế đĩ khảo sát một số hoạt tính sinh học của sophorolipid thu được. 1
  11. Đồ án tốt nghiệp 2. Tình hình nghiên cứu Van Bogaert và cộng sự đã cơng khai bài báo cáo khoa học nghiên cứu tồn diện về mọi khía cạnh trong quy trình sản xuất thu nhận SLs (tăng sinh nấm men, con đường tổng hợp sinh học, ảnh hưởng của thành phần mơi trường, điều kiện lên men). Chủ yếu nhĩm nghiên cứu tập trung vào mục tiêu tối ưu hĩa điều kiện lên men cho vi sinh vật để tổng hợp nên SLs trong quá trình lên men chìm. Đáng chú ý nhất là năm 2005, Vishal Shah và cộng sự đã đưa ra những kết quả đầu tiên chứng tỏ khả năng ức chế virus HIV của SLs. Tại nồng độ 3mg/ml tất cả các dẫn xuất SLs đều cĩ hoạt tính kháng virus HIV, khử hoạt tính của virus trong vịng chưa đầy 2 phút. Riêng dẫn xuất diacetate ethyl ester SLs là dẫn xuất hoạt động mạnh nhất. Ngồi ra năm 2012, Shao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư thực quản của SLs trên người. Kết quả chứng minh rằng cĩ sự ức chế của SLs lactonic lên tế bào thực quản (ở nồng độ 30 µg/ml). Sự khác biệt về độ bão hịa acid béo trong phân tử SLs cĩ ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng gây độc cho tế bào ung thư. Năm 2016, tại Việt Nam cơng trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hồn thành “Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa” (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Hứa hẹn cho cơng cuộc sản xuất một hợp chất CHDBMSH mới, cĩ ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống và cơng nghiệp. 3. Mục đích nghiên cứu Khảo sát hoạt tính của Sophorolipids thu nhận qua quá trình lên men chủng Candida bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng nấm Candida bombicola ATCC 22214 - Thu nhận SLs từ dịch lên men - Định tính SLs. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu nhận được - Khảo sát khả năng chống oxy của SLs thu nhận được. 5. Phương pháp nghiên cứu 2
  12. Đồ án tốt nghiệp Thu nhận SLs thơng qua nuơi cấy chủng C. bombicola ATCC 22214 ở điều kiện 25oC, tốc độ lắc 180 vịng/phút. Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Xác định khả năng chống oxy hĩa của SLs thơng qua khả năng bắt gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). 6. Kết quả đạt được Sản lượng SLs thơ thu được từ dịch nuơi cấy nấm C. bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose là 20.76 g/l. Trong hỗn hợp SLs thơ thu được cĩ sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate. Ngồi ra trong hỗn hợp thu được cịn cĩ các SLs cấu trúc khác và một số chất khác. Khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus là đáng chú ý, cao gấp 3 lần các chủng vi khuẩn khảo sát cịn lại. Khả năng kháng của SLs đối với các chủng Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella typhimurium khơng cĩ sự khác biệt đáng kể. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococus aureus là cao nhất (12.5 mg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với chủng Salmonella typhimurium là khá thấp so với các chủng khác (0.7812 mg/ml). Khả năng kháng oxy hĩa đạt 77.64% ở nồng độ 20 mg/ml. Nồng độ bắt gốc tự do của sophorolipids thu nhận là 4.51 mg/ml. 7. Kết cấu của đồ án - Chương 1: Tổng quan - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
  13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant) 1.1.1. Định nghĩa Chất cĩ hoạt tính bề mặt là những hợp chất làm giảm sức căng bề mặt liên pha giữa hai chất lỏng hoặc giữa chất rắn và chất lỏng. Từ “Surfactant” được viết tắt từ cụm từ surface active agent, tức là tác nhân hoạt động bề mặt. Chúng được ứng dụng làm chất tẩy rửa, chất thấm ướt, chất nhũ hĩa, chất tạo bọt, chất phân tán. Chất hoạt động bề mặt (CHDBM) là một thành phần khơng thể thiếu trong cuộc sống chúng ta, và ứng dụng của chúng hứa hẹn cịn vươn xa hơn so với nhu cầu của nhân loại. Do đĩ, sản lượng CHDBM thu được mỗi năm vượt qua con số 18 triệu tấn trên tồn thế giới, trong đĩ cĩ 3 triệu tấn được sản xuất ở Tây Âu. Một nửa sản lượng này là thành phần trong chất tẩy rửa, phần cịn lại ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, hĩa chất, sản xuất giấy, nơng nghiệp, CHDBM được sản xuất từ 2 nguồn nguyên liệu chính: dầu mỏ hoặc chất thải cĩ nguồn gốc sinh học. Việc tái sử dụng nguồn chất thải sinh học để sản xuất ra một nguyên liệu mới đã cải thiện đáng kể hiện tượng nhà kính, tuy vậy hoạt động sản CHDBM từ nguồn chất thải sinh học chỉ mới chiếm 25% trong tổng hoạt động sản xuất CHDBM. 1.1.2. Cấu trúc phân tử Chất hoạt động bề mặt thường là các hợp chất hữu cơ cĩ đồng thời một phần ưa nước (tan trong nước) và một phần kỵ nước (tan trong dầu). Khi hịa vào một hệ nhũ tương, surfactant sẽ tập trung ở các màng liên pha khơng khí – nước, dầu – nước, gắn kết hai pha lại với nhau, làm cho hệ trở nên ổn định hơn. Lượng chất hoạt động bề mặt sản xuất ra trên tồn thế giới ước tính khoảng 15 triệu tấn/năm, chiếm gần một nữa lượng xà phịng. Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phịng 4
  14. Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Đặc điểm Chất hoạt động bề mặt được dùng giảm sức căng bề mặt của một chất lỏng bằng cách làm giảm sức căng bề mặt tại màng liên pha (interface) của hai chất lỏng. Nếu cĩ nhiều hơn hai chất lỏng khơng hịa tan thì chất hoạt hĩa bề mặt làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai chất lỏng đĩ. Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước Khi hịa chất hoạt hĩa bề mặt vào trong một chất lỏng thì các phân tử của chất hoạt hĩa bề mặt cĩ xu hướng tạo đám (micelle), nồng độ mà tại đĩ các phân tử bắt đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn. Nếu chất lỏng là nước thì các phân tử sẽ chụm đuơi kị nước lại với nhau và quay đầu ưa nước ra tạo nên những hình dạng khác nhau như hình cầu (0 chiều), hình que (1 chiều), màng (2 chiều). Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt Tính ưa, kị nước của một chất hoạt hĩa bề mặt được đặc trưng bởi một thơng số là độ cân bằng ưa kị nước (tiếng Anh: Hydrophilic Lipophilic Balance-HLB), giá trị này cĩ thể từ 0 đến 40. HLB càng cao thì hĩa chất càng dễ hịa tan trong nước, HLB càng thấp thì hĩa chất càng dễ hịa tan trong các dung mơi khơng phân cực như dầu. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử 1.1.4. Phân loại Tùy theo tính chất mà chất hoạt hĩa bề mặt được phân theo các loại khác nhau. Nếu xem theo tính chất điện của đầu phân cực của phân tử chất hoạt hĩa bề mặt thì cĩ thể phân chúng thành các loại sau: 1.1.4.1. Chất hoạt hĩa ion Chất hoạt hĩa dương: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện dương, ví dụ: Cetyl trimêtylamơni brơmua (CTAB). - Cetyl trimetylammonium bromua (CTAB) - Cetyl pyridinium clorua (CPC) - Polyethoxylated tallow amin (POEA) - Benzalkonium clorua (BAC) - Benzethonium clorua (BZT) Chất hoạt hĩa âm: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện âm - Natri dodecyl sulfat (SDS), amoni lauryl sulfat, và các muối ankyl sulfat khác - Natri laureth sulfat, hay natri lauryl ete sulfat (SLSES) - Ankyl benzen sulfonat - Xà phịng và các muối của axit béo 1.1.4.2. Chất hoạt hĩa phi ion - Ankyl poly (etylen oxit) 6
  16. Đồ án tốt nghiệp - Copolymers của poly (etylen oxit) và poly (propylen oxit) - Ankyl polyglucozit, bao gồm: - Octyl glucozit - Decyl maltosit - Các rượu béo - Rượu cetyl - Rượu oleyl - Cocamit MEA, cocamit DEA 1.1.4.3. Chất hoạt hĩa lưỡng cực Khi bị phân cực thì đầu phân cực cĩ thể mang điện âm hoặc mang điện dương tùy vào pH của dung mơi, ví dụ: Dodecyl đimêtylamin ơxít. - Dodecyl betain - Dodecyl dimetylamin ơxít - Cocamidopropyl betain - Coco ampho glycinat 1.1.5. Ứng dụng Chất hoạt hĩa bề mặt ứng dụng rất nhiều trong đời sống hàng ngày. Ứng dụng phổ biến nhất là bột giặt, sơn, nhuộm Ngồi ra những ứng dụng trong các lĩnh vực khác như: - Trong cơng nghiệp dệt nhuộm: Chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm - Trong cơng nghiệp thực phẩm: Chất nhũ hĩa cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp - Trong cơng nghiệp mỹ phẩm: Chất tẩy rửa, nhũ hĩa, chất tạo bọt - Trong ngành in: Chất trợ ngấm và phân tán mực in - Trong nơng nghiệp: Chất để gia cơng thuốc bảo vệ thực vật, - Trong xây dựng: Dùng để nhũ hĩa nhựa đường, tăng cường độ đĩng rắn của bê tơng - Trong dầu khí: Chất nhũ hĩa dung dịch khoan - Trong cơng nghiệp khống sản: Làm thuốc tuyển nổi, chất nhũ hĩa, chất tạo bọt để làm giàu khống sản 7
  17. Đồ án tốt nghiệp 1.2. SOPHOROLIPIDS 1.2.1. Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) Biosurfactants là các hợp chất hoạt động bề mặt cĩ nguồn gốc sinh học (CHDBMSH), được sản xuất bới vi sinh vật. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đang chú trọng đến lĩnh vực này, bởi chúng cĩ độc tính thấp và phương thức sản xuất đơn giản. Bởi thế ứng dụng của CHDBMSH rất rộng: hĩa chất hữu cơ, phân bĩn, thức ăn, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và bao gồm cả các ứng dụng của chất hoạt động bề mặt hĩa học. Tuy rằng CHDBMSH cĩ mặt khá rộng rãi trong tự nhiên, nhưng chi phí cho các quy trình tách chiết ở quy mơ cơng nghiệp, quy trình tinh sạch đã tạo ra một rào cản khá lớn đối với các nhà sản xuất. Chi phí thu hồi, tinh sạch CHDBMSH luơn lớn hơn rất nhiều lần so với chi phí tổng hợp nên chúng. Trong nhĩm các CHDBMSH ngồi Sophorolipid ra thì cịn cĩ: Rhamnolipids được tổng hợp từ một số chủng trong chi Pseudomonas, và Lecithin được thu hồi từ đậu nành và lịng đỏ chứng. CHDBMSH phổ biến là các chất hoạt động bề mặt cĩ nguồn gốc từ vi sinh vật. Vì thời gian thế hệ và tốc độ phát triển của vi sinh vật cao hơn gấp nhiều lần so với các lồi động/thực vật, nên dễ dàng đưa vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp. 8
  18. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs cs, 1997) Chất hoạt động bề mặt sinh học Vi khuẩn tổng hợp Glycolipids Rhamnolipids Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp. Trehalolipids Rhodococus Erythropolis, Nocardia erythropolis Mycobacterium sp. Sophorolipids Candida. bombicola, Camdida. apicola, and Rhodotorula bogoriensis Mannosylerythritol lipids Pseudozyma antarctica Cellobiolipids Ustilago zeae, U. maydis Lipopeptides và lipoproteins Peptide-lipid Bacillus licheniformis Serrawettin Serratia marcescens Viscosin Ps. fluorescens Surfactin Bacillus. subtilis Gramicidins Bacillus. brevis Polymyxins Bacillus. polymyxa Acid béo, lipid trung tính và phospholipids Fatty acids C. lepus Neutral lipids R. erythropolis Phospholipids Thiobacillus thiooxidans Polymer Emulsan Acinetobacter calcoaceticus Biodispersan Acinetobacter. calcoaceticus Mannan-lipid-protein Candida. tropicalis Carbohydrate-proteinlipid Pseudomonas.fluorescens, Debaryomyces polymorphis Protein PA Pseudomonas. aeruginosa 9
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Sophorolipid Sophorolipid (SLs) là một hợp chất glycolipid hoạt động bề mặt, được tổng hợp bởi một số lồi nấm men vơ hại. Nghiên cứu đầu tiên về sophorolipid được cơng bố vào năm 1961 – một glycolipid ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia. Sau đĩ vào năm 1968, Tulloch và Spencer đã cơng bố rằng chủng sinh SLs thực tế là Torulopsis apicola, hiện nay gọi là Candida Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự, apicola. Tới năm 1970, Spencer 2012) tiếp tục phát hiện ra rằng chủng nấm men Candida bombicola cũng cĩ thể sản xuất ra SLs. Trong đĩ chủng Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và nghiên cứu nhiều nhất do cho năng suất cao (400g/l) và đặc biệt chủng này khơng gây bệnh. Năm 2006, Chen và đồng nghiệp đã tìm ra được một chủng Wickerhamiella domericqiae mới cĩ khả năng tổng hợp SLs. Chủng này tổng hợp ra hơn 6 glycolipids khác nhau. Một trong số đĩ cĩ 17-L-(-oxy)-octadecanoic acid 1,4”-lactone 6’,6”- diacetate, đây là thành phần chính cĩ trong SLs tổng hợp từ 2 lồi C. apicola và C. bombicola. Nhưng mãi đến đầu thế kỷ 20 người ta mới chú trọng đến việc nghiên cứu kỹ lưỡng và tìm kiếm ứng dụng của sophorolipid, vì lúc này nhân loại mới nhận thức ra tầm quan trọng của việc bảo vệ mơi trường. Ngày nay sophorolipid được xem là chất hoạt động bề mặt sinh học (bio-surfactants) cĩ triển vọng cao. 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Cấu trúc Sophorolipid thuộc nhĩm glycolipid biosurfactans, kết hợp từ 1 đuơi acid kị nước (16 hoặc 18 phân tử carbon) và đầu carbohydrate ưa nước (sophorose – đường đơi glucose) thơng qua liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’. Phân tử carbon cuối cùng trong chuỗi đuơi của SLs vừa cĩ thể este hĩa với nhĩm hydroxyl ở vị trí C 4” của sophorose tạo SLs dạng lactonic (dạng vịng); vừa cĩ thể ở dạng tự do tạo SLs dạng acidic (dạng mở). Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) Đuơi acid thường cĩ 16 hoặc 18 phân tử carbon và cĩ nhiều hơn một liên kết đơi. Tính chất hĩa lý và đặc tính sinh học của SLs thu được phụ thuộc vào tỷ lệ thành phần giữa 2 dạng lactonic và acidic trong canh trường, vì cả 2 dạng này đều được vi sinh vật tổng hợp song song trong quá trình lên men sản xuất. Cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp SLs là glucose và acid béo. Ngồi ra các dạng methyl, ethyl esters của acid béo hay triglycerides cũng cĩ thể dùng làm cơ chất (được esterases sẽ thủy phân dần thành acid béo). Do các chủng như C.bombicola, C.apicola cĩ thể tăng trưởng trong mơi trường alkan nên chúng cĩ hệ enzyme cần thiết cho quá trình oxy hĩa các alkan này để tạo nên acid béo. 11
  21. Đồ án tốt nghiệp 1. cytochrome P450 monooxygenase 2. alcohol-dehydrogenase 3. aldehyde-dehydrogenase 4. lipase 5. cytochrome P450 monooxygenase 6. glucosyltransferase I 7. glucosyltransferase II 8. lactonesterase 9. acetyltransferase Hình 1.7. Quy trình sinh tổng hợp nên SLs trong tế bào (Van Bogaert và cộng sự, 2007) Đầu tiên, các acid béo được hydroxyl hĩa ở vị trí cuối (ω) hay kế cuối (ω-1) bởi cytochrome P450 monooxygenase. Ở các chủng C.bombicola, người ta tìm thấy cĩ tận 5 đoạn gen khác nhau thuộc nhĩm CYP52 mã hĩa tổng hợp nên cytochrome P450 monooxygenase. Kế đĩ, glucose thứ nhất gắn vào vị trí C1’ của nhĩm hydroxyl bởi 12
  22. Đồ án tốt nghiệp glucosyltransferase I, glucose thứ 2 gắn vào vị trí C2’ của glucose thứ nhất bởi glucosyltransferase II. Lúc này sản phẩm mới chỉ là SLs dạng acidic. Quá trình tổng hợp cịn cĩ thể tiếp tục diễn ra bởi sự cĩ mặt của 2 enzyme lactonesterase và acetyltransferase để tạo ra SLs dạng lactonic và các dạng acetyl của SLs. Nhìn chung thì SLs lactonic cĩ chức năng làm giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn cao, trong khi SLs acidic thì mang chức năng tạo bọt. Ngồi ra cấu trúc của SLs cịn cĩ sự khác biệt về mức độ acetyl hĩa (ở vị trí 6’ và 6”) trên sophorose và thành phần acid béo (chiều dài chuỗi carbon, mức độ bão hịa, vị trí của nhĩm hydroxyl). Chúng bị chi phối bởi chủng vi sinh, điều kiện sinh trưởng và nguồn dầu. 1.2.4. Đặc tính Hai đặc tính nổi trội nhất của SLs đĩ chính là khả năng phân hủy sinh học và độc tính thấp, khơng như Rhamnolipids được tổng hợp từ chi Pseudomonads (bao gồm chủng gây bệnh Pseudomonas aeruginosa). 1.2.4.1. Giảm sức căng bề mặt Bên cạnh đĩ SLs mang hoạt tính bề mặt cao hơn so với nhiều chất hoạt động bề mặt hĩa học khác. Một chất hoạt động bề mặt tốt phải cĩ khả năng giảm sức căng bề mặt (surface tension - ST) của nước từ 72,8 mN/m xuống cịn 30 – 35 mN/m; sức căng bề mặt phân cách (interfacial tension - IT) giữa nước/hexadecane từ 40 xuống cịn 1 mN/m. Với nồng độ micelle tới hạn (CMC) cực ít (so sánh với chất hoạt động bề mặt tổng hợp khác), SLs cĩ thể giảm ST xuống cịn 29 mN/m và IT xuống 5 mN/m. Cụ thể là SLs sản xuất từ nấm men Candida bombicola (trong mơi trường chứa: mật rỉ mía, cao nấm men, ure, dầu đậu nành) giảm ST của nước xuống cịn 34,15 N/m và tại CMC là 59.43 mg/l. Năm 2005, người ta cũng xác định được chỉ số ST và CMC của SLs khi lên men trong các nguồn dầu khác nhau: dầu đậu nành đen (phụ phẩm trong ngành chế biến dầu đậu nành) - 150 mg/l và 48 mN/m; dầu đậu nành – 88 mg/l và 40,5 mN/m ; dầu bắp - 82 mg/l và 41 mN/m. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.2.4.2. Khả năng nhũ hĩa Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì SLs cịn nắm giữ khả năng nhũ hĩa. Năm 2009, Daverey và Pakshirajan đã chứng minh được rằng SLs tổng hợp bởi C. bombicola ATCC 22214 từ nguồn mật rỉ đường cho hoạt tính nhũ hĩa tốt và ổn định. Bảng 1.2. Hoạt tính nhũ hĩa của SLs đối với một số loại dầu (Daverey và Pakshirajan, 2009) Pha dầu Hoạt tính nhũ hĩa (OD600) Kerosene 1,584 Xylene 2,016 Benzene 26,784 Hexadecane 2,880 Năm 2012, trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự về hoạt tính sinh học và hoạt tính bề mặt của phân tử SLs tổng hợp từ Wickerhamiella domericqiae, cho thấy SLs cĩ khả năng nhũ hĩa mạnh đối với các cơ chất kị nước (cụ thể là paraffin lỏng, dầu hạt cải), nhưng lại yếu hơn đối với dầu thơ. Một điểm đáng chú ý là các hệ nhũ tương ổn định được trong suốt một tuần lễ. 1.2.4.3. Khả năng kháng khuẩn SLs cĩ phổ hoạt động rộng dưới nhiều mức nhiệt độ, áp suất và cường độ ion khác nhau. Ngồi ra SLs cịn cĩ khả năng kháng, kháng ung thư, điều hịa hệ miễn dịch (Van Bogaert và cộng sự, 2011), kháng virus (Shah và cộng sự, 2005). Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của SLs như sau: nồng độ ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Bacillus subtilis là 4 mg/l và đối với Propionibaterium acne là 0.5 mg/l (Kim và cộng sự, 2005). Kết quả này đã đưa SLs vào lĩnh vực ứng dụng sản xuất sản phẩm chăm sĩc sức khỏe, như là một tác nhân diệt khuẩn. 1.2.4.4. Khả năng kháng oxy hĩa SLs thơ và SLs dạng acidic cịn cĩ khả năng bắt gốc tự do hydroxyl (OH). Theo một nghiên cứu, SLs thơ ở nồng độ 0,028% và 0,083% (w/v) sẽ cĩ khả năng 14
  24. Đồ án tốt nghiệp bắt gốc tự tương ứng 97% và 100%. Kết quả tương tự ở SLs acidic sẽ là 98% và 100% (Hillion G, 1998). 1.2.5. Hạn chế Khơng cịn nghi ngờ gì khi nĩi SLs là một chất hoạt động bề mặt sinh học cĩ nguồn gốc từ vi sinh vật đầy triển vọng. Tuy thế khuyết điểm là điều khơng thể tránh khỏi. SLs khơng thể hịa tan vào mơi trường lỏng ở pH thấp. Tính tan của SLs sẽ bắt đầu tăng từ pH 5.0 và tan tốt khi pH trên 6.0. Nhưng khơng ổn định khi bảo quản ở ngưỡng pH 7,0 – 7,5. Và nếu pH mơi trường cao hơn nữa thì nhĩm acetyl và liên kết este sẽ bị thủy phân hồn tồn khơng nghịch đảo. Một điểm nữa đĩ là dù cho nồng độ cao nhưng khả năng tạo bọt của SLs vẫn kém. Những khuyết điểm trên đã giảm đi phần nào ứng dụng của SLs (sản xuất xà phịng) nhưng lại khiến cho SLs thích hợp hơn ở những lĩnh vực khác khơng cần đến bọt (nước lau kính, lau kim loại; phụ gia thực phẩm). Tuy rằng SLs cĩ khả năng kháng khuẩn, kháng virus cũng như ung thư, nhưng việc dung nạp SLs thơng qua đường tiêu hĩa là điều khơng thể. Vì SLs dễ dàng bị thủy phân trong bao tử cũng như trong đường ruột (Hirata và cộng sự, 2009). 1.3. Candida bombicola ATCC 22214 Bảng 1.3. Phân lồi nấm Candida bombicola (Kurtzman và Fell, 2001) Giới Nấm Ngành Ascomycota Ngành phụ Saccharomycotina Lớp Saccharomycetes Bộ Saccharomycetales Họ Incertae sedis Chi Candida Lồi Candida bombicola 15
  25. Đồ án tốt nghiệp Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola, được phân lập từ mật của lồi ong nghệ (Spencer và cộng sự, 1970). Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida apicola, Candida bororiensis, Wickerhamiella domericqiae và Rhodotorula bogoriensis được biết đến với khả năng tổng hợp nên Sophorolipids. Tế bào nấm men Candida bombicola cĩ dạng hình oval đến hình thon dài, thường phân bố riêng lẻ hoặc thành cặp. Kích thước tế bào khoảng 1.5–2.5x3-5 µm (Kurtzman và Fell, 2001). Sau 7 ngày nuơi cấy trên mơi trường thạch bột bắp ở 25oC, tế bào nấm men C. bombicola Hình 1.8. Tế bào C. bombicola khơng xuất hiện ty giả, tế bào bao gồm rất dưới kính hiển vi. nhiều các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc. Phát triển trong điều kiện hiếu khí, khuẩn lạc sẽ cĩ màu trắng sữa đến màu xám tro. Khuẩn lạc trơn, bĩng, lồi và rìa răng cưa (Kurtzman và Fell, 2001). Hình 1.9. Khuẩn lạc nấm C. bombicola 2 ngày tuổi trên mơi trường YM. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Nấm C. bombicola cĩ thể lên men glucose, sucrose và cĩ khả năng đồng hĩa glucose, galactose, sucrose, ethanol, glycerol, D-manitol, D-glucitol. Chúng cĩ thể sinh trưởng trong mơi trường cĩ nồng độ đường cao hơn 100 g/l (Van Bogaert và cộng sự, 2011). Bảng 1.4. Khả năng sinh hĩa nguồn carbon của C. bombicola (Spencer, 1970). LÊN MEN Glucose + Maltose - Galactose - Lactose - Sucrose + Raffinose + ĐỒNG HĨA Glucose + Lactose - Melibiose - Galactose + L-Sorbose + Raffinose + Sucrose + Cellobiose - Melezitose - Maltose - Trehalose - Soluble starch - Inulin - Glycerol + Salicin - D-Xylose - Erythritol - Lactic acid - L-Arabinose - Adonitol - Succinic acid - D-Arabinose - Dulcitol - Citric acid - D-Ribose - D-Mannitol + Inositol - L-Rhamnose - D-Sorbitol + D-Arabitol - α-Methyl-D- Ethanol + - glucose 17
  27. Đồ án tốt nghiệp 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.4.1. Ngồi nước Van Bogaert và cộng sự đã cơng khai bài báo cáo khoa học nghiên cứu tồn diện về mọi khía cạnh trong quy trình sản xuất thu nhận SLs (tăng sinh nấm men, con đường tổng hợp sinh học, ảnh hưởng của thành phần mơi trường, điều kiện lên men). Chủ yếu nhĩm nghiên cứu tập trung vào mục tiêu tối ưu hĩa điều kiện lên men cho vi sinh vật để tổng hợp nên SLs trong quá trình lên men chìm. Nhưng bên cạnh đĩ một số nhĩm nghiên cứu khác cũng nỗ lực khảo sát khả năng sản xuất SLs qua quá trình lên men thể rắn. Quy trình sản xuất chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi nguồn đường và nguồn dầu. Cũng cĩ một số nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu tái chế để giảm chi phí lên men. Những nguyên liệu này gồm: phụ phẩm dầu sinh học (Ashby và cộng sự, 2005), dầu ăn đã qua sử dụng (Fleurackers và cộng sự, 2006; Wadekar và cộng sự, 2012), dầu hạt xồi (Shah và cộng sự, 2007). Dù khắc phục được khoảng chi phí nhưng năng suất SLs thì lại giảm đáng kể. Năm 2005, Vishal Shah và cộng sự đã đưa ra những kết quả đầu tiên chứng tỏ khả năng ức chế virus HIV của SLs. Tại nồng độ 3 mg/ml tất cả các dẫn xuất SLs đều cĩ hoạt tính kháng virus HIV, khử hoạt tính của virus trong vịng chưa đầy 2 phút. Riêng dẫn xuất diacetate ethyl ester SLs là dẫn xuất hoạt động mạnh nhất. Năm 2012, Shao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư thực quản của SLs trên người. Các cấu trúc của 10 phân tử SLs khác nhau về mức acetyl hĩa sophorose, độ bão hịa acid béo và lacton hĩa (mở vịng). Kết quả chứng minh rằng cĩ sự ức chế của SLs lactonic lên tế bào thực quản (ở nồng độ 30 µg/ml). Sự khác biệt về độ bão hịa acid béo trong phân tử SLs cĩ ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng gây độc cho tế bào ung thư. Riêng SLs acidic thì hồn tồn khơng cĩ khả năng kháng tế bào ung thư thực quản. Nghiên cứu này đã phần nào chỉ ra mối quan hệ giữa khả năng chống ung thư của các SLs cĩ cấu trúc khác nhau. Bước đầu cho hoạt động nghiên cứu cơ chế hoạt hĩa sinh học của SLs, từ đĩ thay đổi cấu trúc SLs để đạt được những kết quả tốt hơn. 18
  28. Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Trong nước Tuy đất nước đang trong giai đoạn phát triển, nhu cầu cung cấp các sản phẩm chứa chất hoạt động bề mặt càng tăng, nhưng nước ta chỉ mới bắt đầu vài nghiên cứu về CHDBMSH: “Vi khuẩn tạo chất hoạt hĩa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biển Nha Trang” (L. T. Hiền và cộng sự, 2003); “Vi khuẩn tạo chất hoạt hĩa bề mặt sinh học Rhodococcus ruber TD2 phân lập từ nước ơ nhiễm dầu ven biển Vũng Tàu” (L. T. Hiền và cộng sự, 2013); “Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn KC31” (N. Q. Việt và cộng sự, 2004). Đa số các chủng vi khuẩn tạo chất hoạt hĩa được phân lập từ nguồn nước mặn và nhằm mục đích sử lý ơ nhiễm dầu. Năm 2016, tại Việt Nam cơng trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hồn thành “Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa” (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Hứa hẹn cho cơng cuộc sản xuất một hợp chất CHDBMSH mới, cĩ ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống và cơng nghiệp. 19
  29. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian bắt đầu nghiên cứu: ngày 14 tháng 2 năm 2017 đến ngày 10 tháng 6 năm 2017. Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Phịng vi sinh ứng dụng (lầu 1), Viện Sinh Học Nhiệt Đới (9/621 xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh) 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Chủng vi sinh Chủng nấm men Candida bombicola ATCC 22214 được cung cấp bởi giáo sư Kim EK, thuộc đại học Inha, Hàn Quốc. Các chủng vi khuẩn gây bệnh đối kháng Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium được lấy từ bộ sưu tập giống của viện sinh học nhiệt đới. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm - Bình tách chiết - Erlen 250ml - Đía petri - Đĩa nuơi cấy 96 giếng - Cân phân tích A&D HR – 200 (Nhật) - Nồi hấp khử trùng Autoclave ES – 315, Tomy (Nhật) - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu -80oC Arctical A/S ULTF80, Arctical (Nhật) - Tủ sấy Sanyo MCV – 710ATS, Sanyo (Nhật) - Tủ lắc điều nhiệt Stuart SI500, Stuart (Nhật) - Tủ ủ Sanyo MIR – 162, Sanyo (Nhật) - Máy ly tâm Hettich EBA 20, Hettich (Đức) - Máy khuấy từ Yellowline IKA, Yellowline (Đức) - Máy votex Disruptor Genie, Scientific Industries (Mỹ) 20
  30. Đồ án tốt nghiệp - Máy cơ quay LABOROTA 4001 – efficient, Heidolph (Đức) - Bản mỏng chạy sắc ký TLC Silicagel 60 F254, Merck (Đức) - Máy Elisa 2.2.3. Hĩa chất - Dung mơi tách chiết SLs thơ: ethyl acetate, hexane. - Hệ dung mơi chạy sắc ký bảng mỏng: Chloroform, methanol, H2SO4 40%. - Chất chuẩn SLs: 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate (Sigma) - Dung mơi pha lỗng SLs: Methanol, Dimethyl sulfoxide (DMSO) - Khảo sát khả năng kháng oxy hĩa: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma), acid ascorbic (vitamin C). - Các thành phần trong mơi trường tăng sinh/hồn nguyên nấm (YM) (g/l): Glucose 5 Yeast extract 0,3 Malt extract 0,3 Peptone 0,5 - Các thành phần trong mơi trường lên men chính thu nhận sophorolipids (LM) (g/l): Dầu hạt cải 100 CaCl2.2H2O 0,01 Yeast extract 0,5 NaCl 0,01 KH2PO4 0,1 Peptone 0,07 MgSO4.7H2O 0,05 Glucose 100 - Các thành phần trong mơi trường tăng sinh vi khuẩn đối kháng – Luria Bertani (LB) (g/l): Tryptone 10 Yeast extract 5 NaCl 10 Agar 20 21
  31. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu Candida bombicola ATCC Hồn nguyên giống Giữ giống Tăng sinh Lên men từ dầu và đường glucose Dịch lên men Ly tâm Thu dịch nổi Chiết với hexane Chiết với ethyl acetate Tế bào nấm Sophorolipids thơ Định tính bằng sắc ký bảng mỏng Khảo sát một số hoạt tính của SLs Khả năng kháng khuẩn Khả năng chống oxy hĩa 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Tăng sinh và bảo quản chủng Candida bombicola ATCC 22214 2.3.2.1. Hồn nguyên - tăng sinh Khi được bảo quản lạnh trong mơi trường cĩ chứa glycerol dưới nhiệt độ -80oC thì ít nhiều tế bào nấm sẽ bị tổn thương. Vì thế trước khi tăng sinh giống cấp 1 chuẩn bị cho quá trình lên men chính, thì giống cần được phải hồn nguyên trước đĩ vài ngày để đảm bảo tính ổn định trong quá trình sinh trưởng. - Cho tồn bộ giống C. bombicola ATCC 22214 từ ống eppendorf vào bình erlen 250ml chứa 100ml mơi trường YM đã tiệt trùng. - Nuơi trong điều kiện lắc 180 rpm, nhiệt độ 25oC, trong 48h. - Cấy truyền qua erlen khác chứa 100ml mơi trường YM tiệt trùng với tỷ lệ cấy giống 1% (giống cấp 1). 2.3.2.2. Bảo quản Giống thạch nghiêng: Cấy ria giống từ bình tăng sinh 48h trên sang 5 ống giống thạch nghiêng. Ủ ở 25oC trong 48h. Khi thấy đường sinh khối mọc đều dày đặc thì bảo quản ở 10oC để sử dụng cho các khảo sát sau. Thời gian bảo quản 1 – 2 tháng. Giống lạnh đơng: hút 500 µl dịch nuơi cấy sau 48h vào trong eppendorf 1.5ml vơ trùng. Tiếp tục cho vào 500 µl glycerol 40% (v/v). Votex trong 5 giây. Bảo quản ở -80oC. Thời gian bảo quản 1 – 2 năm. 2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 Nấm men C. bombicola được nuơi trong mơi trường YM ở 25oC, tốc độ lắc 180 vịng/phút. Sau đĩ sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên mơi trường PDA và tính mật độ tế bào theo các mốc thời gian 12 giờ. 2.3.4. Lên men Nấm men C. bombicola tổng hợp nên SLs khi được nuơi cấy trong mơi trường cĩ chứa đồng thời 2 nguồn carbon (đường và dầu) (Jose và cộng sự, 1999). Trong nghiên cứu này sẽ tiến hành lên men với 2 nguồn carbon là đường glucose và dầu hạt cải. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp - Chuẩn bị 10 erlen 250ml, mỗi bình chứa 100ml dịch mơi trường lên men chính (LM). Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. - Cấy giống cấp 1 vào các bình erlen với tỷ lệ giống cấy là 5% (v/v). - Nuơi cấy trong điều kiện lắc 180 rpm, ở 25oC trong 7 ngày. 2.3.5. Thu nhận sophorolipids thơ - Sau quá trình lên men, ly tâm tồn bộ dịch nuơi cấy với tốc độ 6.000 vịng/phút trong 5 phút. Thu phần dịch, loại bỏ sinh khối nấm. - Cho tồn bộ dịch sau ly tâm vào trong bình tách chiết dung lượng 1 lít. - Chiết dịch với dung mơi hexane theo tỷ lệ 1:1, 2 lần. Lượng dầu dư sẽ hịa tan với hexane trong dịch nổi phía trên. Lắc nhẹ đều và để yên trong 5 phút, đợi hỗn hợp tách lớp hồn tồn. Thu phần dịch chìm. - Tiếp tục chiết dịch với dung mơi ethyl acetate theo tỷ lệ 1:1, 2 lần. Sophorolipids sẽ hịa tan với ethyl acetate trong dịch nổi phía trên. Lắc mạnh và để yên trong 5 – 10 phút, đợi hỗn hợp tách lớp hồn tồn. Thu phần dịch nổi. - Đem hỗn hợp ethyl acetate/SLs thơ đi cơ quay chân khơng ở 40oC, để tách nhanh dung mơi ethyl acetate. Dừng máy khi lượng hỗn hợp cơ cạn cịn 5 – 10ml. - Để phần dịch sau cơ quay ở nhiệt độ phịng trong 3 – 5 ngày để bay hơi hồn tồn phần ethyl acetate cịn lại. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp Dịch lên men Ly tâm Thu dịch nổi Chiết với hexane Thu phần dịch Chiết với ethyl acetate Thu phần dịch Cơ quay chân khơng Sophorolipids Hình 2.1. Quy trình thu nhận SLs thơ từ quá trình lên men chủng C. bombicola 2.3.6. Chạy sắc ký bảng mỏng (TLC) Sắc ký bản mỏng thuộc dạng sắc ký phân chia dùng để tách những hỗn hợp khơng bay hơi. TLC được thực hiện trên một tấm giấy thủy tinh hoặc nhơm được phủ một lớp chất liệu hấp phụ. Chất liệu hấp phụ này là pha tĩnh và thường làm từ silica gel, oxit nhơm hoặc cellulose. Sau khi mẫu được chấm lên lớp pha tĩnh và bảng sắc ký được ngâm trong hỗn hợp dung mơi (pha động), các phân tử sẽ hịa tan vào pha động. Và như vậy chúng sẽ di chuyển trong pha động theo từng tốc độ khác nhau và bị tách riêng ra từng vệt. Dựa vào các vệt này, người ta dễ dàng xác định được hệ số phân bố (Rf), chính là tỷ lệ giữa khoảng cách chạy được của hợp chất riêng lẻ với tổng khoảng cách chạy của pha động.  Tiến hành: - Pha 30 ml dung dịch chloroform:methanol (80:10 v/v) lắc đều, đổ vào bình sắc ký và để yên 15 - 30 phút - Pha lỗng chất chuẩn và SLs thơ bằng ethyl acetate để đạt nồng độ 10mg/ml. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp - Dùng bút chì và thước kẻ vạch đường xuất phát, điểm (vạch xuất phát 1.5cm cách mép dưới; khoảng cách giữa 2 điểm mẫu 1cm; lề trái/lề phải 0.5cm; vạch đích 1cm cách mép trên) - Chấm chất chuẩn (5 – 10 lần) và SLs thơ (15 – 20 lần) lên bảng với ống cĩ đường kính 100 µm. - Cho bảng vào bình sắc ký và để yên trong khoảng 30 phút, đợi dịng dung dịch chạm vạch đích. - Lấy bảng sắc ký ra và sấy khơ để bay hơi tồn bộ dung mơi. - Phun H2SO4 40% thật nhanh và thật đều lên bảng. - Lập tức sấy bảng ở 100oC trong 3 – 5 phút để hiện vệt màu. - Tiến hành đo khoảng cách từ vệt màu đến vạch xuất phát của cả mẫu chuẩn và mẫu chấm. Từ đĩ tính được hệ số phân bố Rf. 2.3.7. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp khuếch tán đĩa thạch lần đầu tiên xuất hiện năm 1940 và hiện nay là phương pháp chính thức được sử dụng nhiều trong phịng thí nghiệm để kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với các hợp chất khác nhau. Phương pháp này cĩ thể sử dụng được cho cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên phương pháp này chỉ mang tính chất định tính và khơng xác định được chính xác khả năng ức chế sự tăng trưởng hay diệt khuẩn. Phương pháp này cĩ nhiều ưu điểm như: chi phí thấp, quy mơ kiểm tra lớn, kết quả rõ ràng.  Tiến hành - Nuơi cấy các chủng Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium trong mơi trường LB lỏng o ở 37 C trong 24h, điều kiện hiếu khí. Điều chỉnh chỉ số OD600 của các chủng gần bằng nhau. - Pha lỗng SLs bằng DMSO 10% sao cho đạt nồng độ 50 mg/ml. - Chuẩn bị 5 đĩa mơi trường thạch LB vơ trùng (lớp thạch dày). - Cấy trang từng chủng vi khuẩn lên các đĩa, thể tích cấy 100µl. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp - Đục 5 giếng trong mỗi đĩa thạch - 3 giếng phối 100µl sophorolipid pha lỗng, - 2 giếng cịn lại: 1 giếng phối 100µl dịch DMSO 10% vơ trùng (đối chứng âm) – 1 giếng phối dịch Chloramphenicol 2mg/ml (đối chứng dương) - Ủ đĩa 37oC trong 16h. - Tiến hành quan sát và đo vịng kháng khuẩn. - Hoạt tính kháng khuẩn được tính dựa theo cơng thức: Lz−Ls Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) = V Trong đĩ: Lz: diện tích vịng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2) Ls: diện tích lỗ đục V: thể tích mẫu bơm vào giếng 2.3.8. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục (MIC) Phương pháp khuếch tán đĩa thạch khơng thể xác định được nồng độ ức chế tối thiểu, vì khơng thể định lượng được nồng độ mẫu thử khuếch tán vào mơi trường. Phương pháp đo độ đục đã khắc phục được nhược điểm trên. Giá trị MIC xác định được chính là nồng độ thấp nhất của mẫu khảo sát cần để ức chế hồn tồn sự sinh trưởng của vi khuẩn/nấm, thường được biểu hiện dưới đơn vị µg/ml hoặc g/l.  Tiến hành: - Nuơi cấy các chủng Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium trong mơi trường LB lỏng o ở 37 C trong 6-8h. Điều chỉnh chỉ số OD600 của các chủng gần bằng nhau. - Pha lỗng sophorolipid bằng DMSO 10% sao cho đạt các nồng độ 25; 12.5; 6.25; 3.125; 1.5625; 0.7812 mg/ml - Hút 100 µl các nồng độ sophorolipid pha lỗng vào các giếng được bố trí như hình 2.1 (mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần). - Thêm lần lượt 100 µl dịch nuơi cấy từng chủng vào các giếng 27
  37. Đồ án tốt nghiệp - Đối chứng âm: 100 µl dịch nuơi cấy + 100 µl DMSO 10% - Đối chứng dương: 100 µl dịch nuơi cấy + 100 µl dịch kháng sinh Chloramphenicol 2mg/ml o - Đem đi đo OD600, rồi ủ ở 37 C. - Sau 24h, đem đĩa đi đo OD600 lần thứ 2. Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs trên đĩa 96 giếng. 2.3.9. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH Phương pháp DPPH rất phổ biến trong các thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hĩa của các hợp chất tự nhiên. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản và nhanh. DPPH là một trong những hợp chất nitơ cĩ tính ổn định tương đối và cĩ thế sản xuất. Hiệu quả chống oxy hĩa tỷ lệ thuận với tỷ lệ mất màu tím trong mẫu thử nghiệm. Sự thay đổi màu sắc này được đo bằng phương pháp đo quang phổ. Màu của DPPH cĩ mức hấp thụ mạnh nhất ở bước sĩng 517 nm (màu tím). 28
  38. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Cơ chế chuyển màu của DPPH khi nhận một phân tử hydro từ chất chống oxy hĩa.  Tiến hành: - Đối chứng âm: 100 µl methanol tuyệt đối - Đối chứng dương: 100µ l Vitamin C nồng độ 0,2mg/ml (1X) và nồng độ 2mg/ml (10X) - Mẫu sophorolipid thơ pha lỗng thành các nồng độ: 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.078 mg/ml - Phối dung dịch vào các giếng theo như hình 2.2 (mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần) - Bổ sung vào tất cả các giếng 100 µl DPPH. - Trộn đều, bao đĩa bằng giấy bạc và ủ 37oC trong 30 phút. - Đo OD517 và tính khả năng bắt gốc tự do bằng cơng thức: OD % chống oxy hĩa = (1 - mẫu ) x 100 ODđối chứng âm - Dùng chương trình SigmaPlot v10.0 để xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) của SLs thu nhận được. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hĩa của SLs trên đĩa 96 giếng. 30
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola Nấm men C. bombicola được nuơi trong mơi trường YM ở 25oC, tốc độ lắc 180 vịng/phút. Sau đĩ sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên mơi trường PDA và tính mật độ tế bào theo các mốc thời gian 12 giờ. Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng của C. bombicola được thể hện ở hình 3.1. 8.0 7,87 7,84 7,81 7,73 7.8 7,67 7,60 7.6 7,40 7.4 7.2 7,09 7.0 6,77 6.8 6,69 6.6 Mật độ tế CFU/ml) (Log bào tế độ Mật 6.4 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 Thời gian (giờ) Hình 3.1. Biểu đồ đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214. Kết quả ở biểu đồ cho thấy trong 24 giờ đầu nấm men C. bombicola bước vào pha tăng trưởng, bắt đầu gia tăng về số lượng tế bào. Từ 24 - 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của nấm men tiếp tục tăng nhanh theo cấp số nhân và số lượng tế bào đạt cực đại ở 48 giờ. Từ 48 - 168 giờ, bắt đầu cĩ sự suy giảm về số lượng tế bào nấm men. Sau 168 giờ số lượng tế bào nấm men giảm mạnh, lúc này chất dinh dưỡng đã cạn kiệt làm cho số lượng tế bào giảm dần theo thời gian. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Lên men sophorolipids từ C. bombicola Mơi trường lên men để thu nhận SLs cĩ màu như mật ong với lớp dầu nổi phía trên. Sau 7 ngày ủ, mơi trường nhạt màu và đục tồn phần, lượng dầu nổi khơng cịn dày đặc như trước, chứng tỏ một phần dầu đã được C. bombicola sử dụng trong quá trình tăng trưởng. Hình 3.2. Mơi trường lên men chính trước (trái) và sau (phải) sau 7 ngày. Hình 3.3. Dịch lên men sau 7 ngày vẫn cịn một lượng dầu. 3.3. Thu nhận sophorolipids từ C. bombicola Để hạn chế lượng dầu cịn lại quá nhiều ở bước chiết với Hexane, thường thì mẻ đầu ly tâm sẽ chứa rất nhiều dầu, nên sau khi ly tâm ta dùng pipet pasteur hút bớt 32
  42. Đồ án tốt nghiệp phần dầu nổi phía trên. Việc này sẽ tăng cao hiệu suất tách dầu ở bước tiếp theo. Dịch lên men sau khi ly tâm trong và đậm màu hơn so với lúc trước. Trong quá trình chiết với hexane, quan sát thấy được mặt phân cách giữ 2 pha là một lớp bọt. Phỏng đốn đây chính là một trong những đặc tính của SLs – khả năng tạo bọt, nhũ hĩa. Hình 3.4. Màng liên pha giữa Hexane và dịch lên men xuất hiện bọt. Hỗn hợp ethyl acetate thu được sau quy trình tách chiết sẽ gấp đơi lượng dịch lên men vì quá trình chiết được lặp lại 2 lần. Hỗn hợp đục nhẹ, chứng tỏ đã cĩ một phần hợp chất nào đĩ tan trong dung mơi ethyl acetate. SLs thơ thu được ở trạng thái lỏng, độ nhớt tương tự dầu, màu đất đỏ. Bề ngồi phù hợp với mơ tả của Cavalero và Cooper (2003) về SLs thơ mà họ thu nhận được từ quá trình lên men C. bombicola ATCC 22214. Nhưng sản lượng SLs thơ thu được chỉ là 20,76 g/l, ít hơn so với sản lượng mà Qing - Hua Zhou và Naim Kosaric đã ghi nhận khi lên men từ glucose và dầu hạt cải là 60 g/l (1995). 33
  43. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Sophorolipids thơ thu nhận được sau khi sấy loại bỏ hồn tồn dung mơi ethyl acetate. 3.4. Sắc ký bảng mỏng (TLC) Dựa vào vạch chất chuẩn ta xác định được hệ số phân tách Rf của mẫu và chất chuẩn lần lượt là 0.85 và 0.86, cho thấy trong hỗn hợp SLs thơ thu được cĩ sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate. Vạch mẫu cịn nhiều vùng màu khác chứng tỏ trong SLs thơ vẫn cịn các hợp chất khác ngồi 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate. C.bombicola tổng hợp SLs dưới một hỗn hợp của hai dạng SLs, SLs lactonic và SLs acidic. Tỷ lệ của 2 dạng này khác nhau trong các điều kiện lên men khác nhau. Vì thế những vạch cịn lại trong sắc ký đồ cĩ thể là một dạng SLs khác hoặc một hợp chất thứ cấp nào đĩ tổng hợp nên trong quá trình sinh trưởng của C. bombicola cĩ thể tan trong dung mơi ethyl acetate. Như vậy, SLs thơ thu được trong quá trình lên men nấm C. bombicola ATCC 22214 từ glucose và dầu hạt cải cĩ sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate, SLs cấu trúc khác và một số chất khác. 34
  44. Đồ án tốt nghiệp 1 2 Hình 3.6. Kết quả chạy sắc ký TLC 1: Mẫu SLs thơ, 2: đối chứng 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Bước đầu khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs, phương pháp khuếch tán đĩa thạch đã được thực hiện, với các chủng đối kháng là Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella typhimurium. Kết quả đạt được trình bày ở bảng 3.1. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.1. Đường kính vịng kháng khuẩn của hợp chất SLs Đường kính vịng kháng Vi khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn Stt khuẩn khảo sát (mm2/ml) (mm) Bacillus 1 13.33 ± 1.53 1125.17 ± 325.59 subtilis Escherichia 2 14 ± 1.00 1261.23 ± 219.85 coli Pseudonomas 3 14.67 ± 0.58 1407.77 ± 131.43 aeruginosa Salmonella 4 13.67 ± 1.15 1190.58 ± 253.8 typhimurium Staphylococus 5 24.33 ± 0.58 4367.22 ± 222.08 aureus Các nghiên cứu về khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trước đây đã kết luận sơ bộ rằng: SLs cĩ khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn Gram dương mạnh hơn so với các chủng vi khuẩn Gram âm (L.Q. Loan và cộng sự - SLs lên men từ dầu dừa và đường glucose, 2016; Jose và cộng sự - SLs lên men từ dầu hạt hướng dương và đường glucose, 1999; Kim và cộng sự - SLs lên men từ dầu ngơ và đường glucose, 2005). Trong nghiên cứu này khi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của SLs trên 2 chủng vi khuẩn gram dương, thì chỉ duy nhất khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus là đáng chú ý, cao gấp 3 lần các chủng vi khuẩn khảo sát cịn lại (4367.22 ± 222.08 mg/ml). Khả năng kháng đối với chủng Bacillus subtilis thấp nhất (1125.17 ± 325.59 mg/ml). Bên cạnh đĩ, kết quả cịn cho thấy khả năng kháng của SLs đối với các chủng Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella typhimurium khơng cĩ sự khác biệt đáng kể. Vì thế trong nghiên cứu này chưa thể kết luận rằng SLs cĩ khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn Gram dương tốt hơn so với các vi khuẩn Gram âm. 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. 3.6. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục Sau khi đã định tính được khả năng kháng khuẩn của SLs, ta bắt đầu tiến hành định lượng (xác định nồng độ ức chế tối thiểu – MIC). Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất SLs đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh được trình bày ở bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococus aureus là cao nhất (12.5 mg/ml). Kế đĩ nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với chủng Salmonella typhimurium là đáng chú ý nhất, thấp gấp 8 lần (0.7812 mg/ml). So sánh kết quả trên với kết quả nghiên cứu của ThS. Lê Quỳnh Loan và cộng sự, năm 2016 (bảng 3.2), ta vẫn chưa xác định được đặc điểm chung trong khả năng kháng khuẩn của SLs. Vì một số yếu tố sai khác như: chủng vi khuẩn khảo sát, mật 37
  47. Đồ án tốt nghiệp độ giống cấy. Nhưng cĩ thể kết luận rằng, khả năng kháng khuẩn của SLs phụ thuộc đáng kể vào nguồn dầu cung cấp trong quá trình lên men. Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs lên một số chủng vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (mg/ml) SLs thu nhận quá Stt Vi khuẩn khảo sát SLs thu nhận từ quá trình lên men từ dầu trình lên men từ dầu hạt dừa cải (L.Q. Loan và cộng sự, 2016) 1 Bacillus subtilis 12.5 4.5 2 Escherichia coli 12.5 4.5 Pseudonomas 3 6.25 5 aeruginosa Salmonella 4 0.7812 - typhimurium Staphylococus 5 12.5 3.5 aureus 3.7. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH Chỉ số IC50 là một thước đo hiệu quả khả năng ức chế sinh học/sinh hĩa của một hợp chất. Nhìn chung chỉ số IC50 càng thấp thì khả năng oxy hĩa của SLs càng cao. Tuy phương pháp thử khả năng kháng oxy hĩa bằng DPPH rất nhanh và chính xác, nhưng chúng ta khơng thể đảm bảo rằng liệu trong cơ thể sống hoạt tính kháng đĩ cĩ hoạt động như trong thí nghiệm hay khơng. Vì thế phương pháp chỉ được áp dụng trong phạm vi in vivo và in vitro. Kết quả thu được thể hiện dưới dạng đồ thị (hình 3.9). Khả năng kháng oxy hĩa của hợp chất SLs thơ thu được tăng dần đều theo nồng độ. Khả năng kháng oxy hĩa đạt 77.64% ở nồng độ 20 mg/ml. Nồng độ SLs oxy hĩa DPPH ở 50% (IC50) được tính bởi chương tình SigmaPlot v10.0 là 4.5138 mg/ml. Kết quả một lần nữa khẳng định khả năng của SLs cĩ thể ứng dụng trong ngành cơng nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm. 38
  48. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hĩa của hỗn hợp SLs thơ. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sản lượng SLs thơ thu được từ dịch nuơi cấy nấm C. bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose là 20.76 g/l. Dựa vào vạch chất chuẩn ta xác định được hệ số phân tách Rf của mẫu và chất chuẩn lần lượt là 0.85 và 0.86, cho thấy trong hỗn hợp SLs thơ thu được cĩ sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6” – diacetate. Ngồi ra trong hỗn hợp thu được cịn cĩ các SLs cấu trúc khác và một số chất khác. Khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus là đáng chú ý, cao gấp 3 lần các chủng vi khuẩn khảo sát cịn lại (4367.22 ± 222.08 mg/ml). Khả năng kháng của SLs đối với các chủng Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella typhimurium khơng cĩ sự khác biệt đáng kể. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococus aureus là cao nhất (12.5 mg/ml). Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với chủng Salmonella typhimurium là khá thấp so với các chủng khác (0.7812 mg/ml). Khả năng kháng oxy hĩa của hợp chất SLs thơ thu được tăng dần đều theo nồng độ. Khả năng kháng oxy hĩa đạt 77.64% ở nồng độ 20 mg/ml. Nồng độ SLs oxy hĩa DPPH ở 50% (IC50) được tính bởi chương tình SigmaPlot v10.0 là 4.5138 mg/ml. 4.2. Kiến nghị Phân tách và tinh sạch các dạng cấu trúc khác nhau trong hổn hợp SLs thu được từ glucose và dầu hạt cải. Tiếp tục khảo sát lên men thu nhận SLs với nhiều nguồn đường, nguồn dầu khác nhau với chi phí rẻ hơn, chẳng hạn như mật rỉ đường, dầu ăn sau chế biến. Cần nghiên cứu sâu hơn về các chất hoạt động bề mặt sinh học nĩi chung và sophorolipid nĩi riêng, bởi tiềm năng đáng chú ý của nĩ. Lên men sản xuất SLs trong quy mơ cơng nghiệp bằng các fermentor 2 – 5 lít. Kế đĩ ứng dụng thực tiễn vào cơng nghệ mỹ phẩm, dược phẩm. 40
  50. Đồ án tốt nghiệp Cần khảo sát thêm khả năng gây độc của SLs lên tế bào động vật, tiếp đĩ tiến xa hơn tới khả năng gây độc đối với cơ thể con người, nhằm tăng cao tính thực tiễn của nghiên cứu. 41
  51. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt L.Q. Loan; N.Đ. Duy; H.Q. Khánh; N.H. Dũng; N. L. H. Hịa; N. T. B. Huệ: Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipid từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa; Tạp chí phát triển KH&CN, tập 19, số T5-2016, 15 – 25 N.Q. Việt, N.B. Hữu, Đ.T.C. Hà, Khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của chủng vi khuẩn KC31, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, 501–510 (2004). Tài liệu nước ngồi A. Daverey, K. Pakshirajan, Production, characterization, and properties of sophorolipids from the yeast Candida bombicola using a low-cost fermentative medium, Appl Biochem Biotechnol, 158, 663–674 (2009). A.C. Jose, G.O. Felix, Sophorolipid production by Candida bombicola: Medium composition and culture method, J. Biosci Bioeng., 88, 4888–494 (1999). Ashby, R.; Nuđez, A.; Solaiman, D. Y.; Foglia, T., Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel co-product stream. Journal of the American Oil Chemists' Society 2005, 82 (9), 625-630. Chen, J.; Song, X.; Zhang, H.; Qu, Y. B.; Miao, J. Y., Sophorolipid produced from the new yeast strain Wickerhamiella domercqiae induces apoptosis in H7402 human liver cancer cells. Applied Microbiology and Biotechnology 2006, 72 (1), 52- 59. D. Develter, S. Fleurackers, I.V. Bogaert, Method for the production of mediumchain sophorolipids, US 8530206 B2 (2013). D.A. Cavalero, D.G. Cooper, The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced by Candida bombicola ATCC 22214, Journal of Biotechnology, 103, 31–41 (2003). D.W.G. Develter, L.M.L. Lauryssen, Properties and industrial applications of sophorolipids, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 112, 628–638 (2010). 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Desai, J. D.; Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular biology reviews 1997, 61, 47- 64. Fleurackers, S. J. J., On the use of waste frying oil in the synthesis of sophorolipids. European Journal of Lipid Science and Technology 2006, 108 (1), 5-12. Gorin, P. A. J.; Spencer, J. F. T.; Tulloch, A. P., hydroxyfatty acid glycosides of sophorose from torulopsis magnoliae. Canadian Journal of Chemistry 1961, 39 (4), 846-855 H. Marius, M.M. Markus, H.K. Johannes, B.L. Roberta, C. Jonas, S. Christoph, H. Rudolf, Rhamnolipids as biosurfactants from renewable resources: Concepts for next-generation rhamnolipid production, Process Biochemistry, 47, 1207–1219 (2012). Hirata, Y.; Ryu, M.; Oda, Y.; Igarashi, K.; Nagatsuka, A.; Furuta, T.; Sugiura, M., Novel characteristics of sophorolipids, yeast glycolipid biosurfactants, as biodegradable low-foaming surfactants. J Biosci Bioeng 2009, 108 (2), 142-146. H.S. Kim, Y.B. Kim, B.S. Lee, E.K. Kim, Sophorolipid production by Candida bombicola ATCC 22214 from a corn-oil processing byproduct, J. Microbiol Biotechnol., 15, 55–58 (2005). I.M. Banat, R.S. Makkar, S.S. Cameotra, Potential commercial applications of microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol, 53, 495–508 (2000). I.N. Van Bogaert, K. Saerens, C. DeMuynck, D. Develter, W. Soetaert, E.J. Vandamme, Microbial production and application of sophorolipids, Appl. Microbiol. Biotechnol., 76, 23–34 (2007). [21]. S. Vishal, B. Daniel, R. Peter, Sophorolipids Having Enhanced antibacterial activity, antimicrob, Agents Chemother., 51, 397–400 (2007). J. F. T. SPENCER; P. A. J. GORIN and A. P. TULLOCH. Torulopsis bombicola sp. n. National Research Council of Canada. Antonie van Leeuwenhoek 36 (1970) 129-133 J.D. Desai, I.M. Banat, Microbial production of surfactants and their commercial potential, Microbiol. Mol. Biol. Rev, 61, 47–64 (1997). 43
  53. Đồ án tốt nghiệp J.F.T. Spencer, P.A.J. Gorin, A.P. Tulloch, Torulopsis bombicola sp. n. Antonie Van Leeuwenhoek, 36, 129–133 (1970). Kurtzman, Cletus Kurtzman, J.W. Fell, Teun Boekhout. The Yeasts: A Taxonomic Study (4th edition), 2011 Lang S, Katsiwela E & Wagner F (1989) Antimicrobial effects of biosurfactants. Fat Sci Technol 91: 363–366. M.H. Gordon, I.A. Rahman, Effect of processing on the composition and oxidative stability of coconut oil, JAOCS 68, 574–576 (1991). P.A.J. Gorin, J.F.T. Spencer, A.P. Tulloch, Hydroxy fatty acid glycosides of sophorose from Torulopsis magnolia, Can. J. Chem., 39, 846–855 (1961). Parekh, V. J.; Pandit, A. B., Solid State Fermentation (SSF) for the Production of Sophorolipids from Starmerella bombicola NRRL Y-17069 using glucose, wheat bran and oleic acid. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy 2012, 6 (4), 418- 424. R.K. Hommel, L. Weber, A. Weiss, U. Himmelreich, O. Rilke, H.P. Kleber, Production of sophorose lipid by Candida (Torulopsis) apicola grown on glucose, J. Biotechnol., 33, 147–155 (1994). R.M. Maier, G. Soberĩn-Chávez, Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications, Appl Microbiol Biotechnol, 54, 625–633 (2000). R.M. Mann, J.R. Bidwell, The acute toxicity of agricultural surfactants to the tadpoles of four Australian and, two exotic frogs, Environ. Pollut., 114, 195–205 (2001). Shah, V.; Jurjevic, M.; Badia, D., Utilization of restaurant waste oil as a precursor for sophorolipid production. Biotechnol Prog 2007, 23 (2), 512-515. Shao L, Song X, Ma X, Li H, Qu Y. Bioactivities of sophorolipid with different structures against human esophageal cancer cells. J Surg Res. 2012 Apr;173(2):286-91. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp U. Gobbert, S. Lang, F. Wagner, Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola, Biotechnol. Lett, 6, 225–230 (1984) V.K. Morya, J.H. Park, T.J. Kim, S. Jeon, E.K. Kim, Production and characterization of low molecular weight sophorolipid under fed-batch culture, Bioresource Technology, 143, 282–288 (2013). Van Bogaert IN, Saerens K, De Muynck C, Develter D, Soetaert W & Vandamme EJ (2007) Microbial production and application of sophorolipids. Appl Microbiol Biot 76: 23–34 Vishal Shah, Gustavo F. Doncel, Theodoros Seyoum, Kristin M. Eaton, Irina Zalenskaya, Rena Hagver, Abul Azim, and Richard Gross. Sophorolipids, Microbial Glycolipids with Anti-Human Immunodeficiency Virus and Sperm-Immobilizing Activities. Antimicrob Agents Chemother. 2005 Oct; 49(10): 4093–4100. Wadekar, S.; Kale, S.; Lali, A.; Bhowmick, D.; Pratap, A., Sophorolipid production by starmerella bombicola (ATCC 22214) from virgin and waste frying oils, and the effects of activated earth treatment of the waste oils. JAOCS, Journal of the American Oil Chemists' Society 2012, 89 (6), 1029-1039. Yoo DS, Lee BS & Kim EK (2005) Characteristics of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus. J Microbiol Biot 15: 1164– 1169. Zezzi do Valle Gomes M, Nitschke M. Evaluation of rhamnolipid and surfactin to reduce the adhesion and remove biofilms of individual and mixed cultures of food pathogenic bacteria. Food Control 2012;25:441–7. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID 1. Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC 22214 Mật độ tế bào Thời gian Độ lệch (Log CFU/ml) Trung bình (giờ) chuẩn L1 L2 0 6,70 6,85 6,77 0,10 12 6,95 7,04 7,00 0,06 24 7,41 7,39 7,40 0,02 36 7,62 7,60 7,61 0,01 48 7,87 7,86 7,87 0,01 60 7,85 7,85 7,85 0,00 72 7,84 7,84 7,84 0,00 84 7,83 7,82 7,82 0,00 96 7,80 7,82 7,81 0,01 108 7,76 7,74 7,75 0,01 120 7,73 7,73 7,73 0,01 132 7,71 7,68 7,69 0,01 144 7,68 7,66 7,67 0,02 156 7,65 7,63 7,64 0,01 168 7,60 7,59 7,60 0,01 180 7,42 7,38 7,40 0,03 192 7,13 7,05 7,09 0,06 204 6,96 6,80 6,88 0,11 236 6,72 6,66 6,69 0,04 248 6,49 6,39 6,44 0,07 1
  56. Đồ án tốt nghiệp 2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (mm) Chloramphenicol Vi khuẩn Sophorolipid 50 mg/ml 2mg/ml – đối chứng khảo sát Lần 1 Lần 2 Lần 3 dương Bacillus 12 15 13 13 subtilis Escherichia 15 13 14 35 coli Pseudonomas 24 25 24 25 aeruginosa Salmonella 13 15 13 40 typhimurium Staphylococus 15 14 15 40 aureus 3. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hĩa của SLs (OD517) OD517 Tỷ lệ Nồng độ Độ lệch kháng oxy SLs (mg/ml) Lần 1 Lần 2 Trung bình chuẩn hĩa (%) 20 0,104 0,118 0,111 0,009 77,64 10 0,146 0,158 0,152 0,008 69,38 5 0,212 0,218 0,215 0,004 56,7 2.5 0,329 0,308 0,319 0,015 35,5 1.25 0,406 0,386 0,396 0,014 20,24 0.625 0,442 0,431 0,437 0,008 12,08 0.3125 0,476 0,486 0,481 0,007 3,12 0.156 0,496 0,495 0,496 0,001 0,2 0.078 0,499 0,496 0,498 0,002 0 Vit 10X 0,075 0,073 0,074 0,001 Vit 1X 0,074 0,074 0,074 0,000 2
  57. Đồ án tốt nghiệp Control 0,498 0,495 0,497 0,002 4. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp MIC (OD600) Vi khuẩn Đối chứng Nồng độ SLs (mg/ml) khảo sát (-) (+) 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,7812 Bacillus 0,337 0,303 0,596 0,42 0,362 0,349 0,337 0,361 subtilis 0,335 0,335 0,615 0,406 0,348 0,354 0,35 0,378 Escherichia 0,367 0,418 0,503 0,381 0,344 0,356 0,358 0,372 coli 0,415 0,391 0,567 0,382 0,352 0,367 0,358 0,367 C 0,463 0,454 0,615 0,524 0,453 0,458 0,448 0,471 Ớ Pseudonomas aeruginosa 0,456 0,449 0,609 0,491 0,451 0,442 0,44 0,459 TRƯ Salmonella 0,378 0,366 0,67 0,549 0,413 0,395 0,382 0,382 typhimurium 0,378 0,445 0,639 0,439 0,429 0,403 0,381 0,39 Staphylococus 0,26 0,267 0,461 0,267 0,244 0,268 0,286 0,279 aureus 0,263 0,324 0,465 0,269 0,236 0,262 0,272 0,28 Bacillus 1,217 0,358 0,546 0,538 1,074 1,355 1,223 1,121 subtilis 1,362 0,320 0,633 0,42 1,294 1,236 1,193 1,058 Escherichia 1,297 0,504 0,542 0,374 1,157 0,968 1,016 1,017 coli 1,221 0,306 0,652 0,381 1,177 0,975 1,017 0,972 Pseudonomas 1,359 0,441 0,694 0,56 1,439 1,409 1,332 1,303 SAU aeruginosa 1,346 0,523 0,695 0,568 1,449 1,359 1,303 1,313 Salmonella 1,344 0,287 0,674 0,442 0,464 0,404 0,374 0,41 typhimurium 1,219 0,341 0,716 0,411 0,441 0,5 0,423 0,372 Staphylococus 1,432 0,268 0,45 0,22 0,324 1,074 0,76 1,094 aureus 1,391 0,34 0,509 0,278 0,363 0,948 1,032 1,077 3
  58. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Hình 1. Dịch lên men trước (trái) và sau (phải) khi chiết với hexane Hình 2. Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate 4
  59. Đồ án tốt nghiệp Hình 3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Bacillus subtilis của SLs Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Escherichia coli của SLs 5
  60. Đồ án tốt nghiệp Hình 5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Pseudonomas aeruginosa của SLs Hình 6. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Salmonella typhimurium của SLs. 6
  61. Đồ án tốt nghiệp Hình 7. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Staphylococus aureus của SLs. Hình 8. Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu 7
  62. Đồ án tốt nghiệp Hình 9. Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hĩa 8