›

Đồ án Tận dụng bã chưng cất hốn hợp lên men rơm rạ thành bioethanol làm nguồn dinh dưỡng thay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình sản xuất bioethanol theo công nghệ thủy phân và lên men đồng thời

pdf 78 trang thiennha21 12/04/2022 6370
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tận dụng bã chưng cất hốn hợp lên men rơm rạ thành bioethanol làm nguồn dinh dưỡng thay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình sản xuất bioethanol theo công nghệ thủy phân và lên men đồng thời", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_tan_dung_ba_chung_cat_hon_hop_len_men_rom_ra_thanh_bio.pdf

Nội dung text: Đồ án Tận dụng bã chưng cất hốn hợp lên men rơm rạ thành bioethanol làm nguồn dinh dưỡng thay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình sản xuất bioethanol theo công nghệ thủy phân và lên men đồng thời

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TẬN DỤNG BÃ CHƯNG CẤT HỐN HỢP LÊN MEN RƠM RẠ THÀNH BIOETHANOL LÀM NGUỒN DINH DƯỠNG THAY THẾ BỘT NGÔ CHUYÊN DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BIOETHANOL THEO CÔNG NGHỆ THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN ĐÌNH QUÂN Sinh viên thực hiện : THÁI THỊ THÙY TRANG MSSV: 1051110165 Lớp: 10DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ Giáo viên hướng dẫn là TS. Nguyễn Đình Quân. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả luận văn của mình. Thái Thị Thùy Trang
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện tại trường, luận văn tốt ngiệp là sản phẩm đúc kết lại quá trình nghiên cứu và thực hành của sinh viên. Chính vì vậy những kiến thức mà em đã tiếp thu được là nền tảng vững chắc giúp em hoàn thành luận văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, bộ môn Công nghệ sinh học trường đại học Công Nghệ T.p Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ em trong thời gian qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Đình Quân là người đã đưa em tới hướng nghiên cứu, đồng thời giúp đỡ về kiến thức cũng như tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này. Em cũng xin cảm ơn chị Trần Phước Nhật Uyên, chị Vũ Lê Vân Khánh, anh Phạm Đình Đông đã nhiệt tình giúp đỡ em Em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn là chỗ dựa vững chắc trong học tập và là nguồn động lực rất lớn để em phấn đấu. Vì thời gian có hạn, kinh nghiệm lẫn kiến thức chuyên môn còn thiếu và do điều kiện khách quan nên trong quá trình làm luận văn còn nhiều thiếu sót. Vì vậy em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của Thầy cô cùng các bạn để em có thế khắc phục những sai sót nhằm hoàn thiện hơn bài luận văn tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn và gởi lời chúc thành công đến tất cả mọi người. Thái Thị Thùy Trang
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN 1 MỞ ĐẦU 2 Đặt vấn đề 2 Lý do chọn đề tài và nhiệm vụ của luận văn 3 Lý do chọn đề tài: 3 Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Nguyên liệu lignocellulose 5 1.2. Enzyme cellulase 7 1.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 9 1.3.1. Hình thái và cấu tạo nấm men 10 1.3.2. Sinh trưởng của nấm men 11 1.4. Quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ 13 1.4.1. Quy trình chung 13 1.4.2. Quy trình thực hiện 13 1.4.2.1. Tiền xử lý: 13 1.4.2.2. Thủy phân: 16 1.4.2.3. Lên men 18 2.4.2.4. Chưng cất: 22 1.5. Đối tượng của luận văn 23 1.5.1. Đặt vấn đề 23 1.5.2. Bã lên men (SSF Residue) [15] 24 1.5.3. Corn steep liquor (CSL) 25 1.6. Các kỹ thuật chìa khóa cho quá trình lên men. 26 1.6.1. Thủy phân và lên men đồng thời (SSF).[20] 26 1.6.2. Nhập liệu nhiều lần theo đợt. 26 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 28 2.1. Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thí nghiệm 29 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.1.1. Rơm rạ 29 Hình 2.4. Máy cắt tinh 29 2.1.2. Nguồn dinh dưỡng bã lên men 31 2.1.3. Hoá chất sử dụng 32 4.1.3.1. Enzyme cellulase: 33 4.1.3.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 33 2.1.3.3. Corn steep liquor (CSL): 34 2.2. Tiến hành thí nghiệm 34 2.2.1. Định lượng Nitơ tổng bằng phân tích C H N.[21] 34 2.2.2. Phân tích thành phần sơ sợi. 36 2.2.2.1. Hóa chất và dụng cụ sử dụng: 36 2.2.2.2. Cách tiến hành: 36 2.2.3. Phân tích hàm lượng Nitơ hòa tan bằng phương pháp Sorensen. 38 2.2.4. Thủy phân và lên men đồng thời. 39 2.2.5.1. Nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae 40 2.2.5.1.1. Nhân giống men sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng: 40 2.2.5.1.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình nhân giống men: 42 2.2.5.1.3. Nhân giống men sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng: 42 2.2.5.2. Thủy phân và lên men đồng thời. 42 2.2.5.2.1. Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: 45 2.2.5.2.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SFF: 46 2.2.5.2.3. Sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: 46 2.2.5.2.4. Quá trình SSF không sử dụng dinh dưỡng bổ sung: 46 2.2.5.3. Quá trình SSF ở quy mô mini-pilot: 47 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.2.5.3.1. Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: 47 2.2.5.3.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SSF: 48 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 3.1. Kết quả phân tích thành phần của rơm. 50 3.1.1. Thành phần rơm khô trước nổ hơi. 50 3.1.2. Thành phần rơm rạ sau nổ hơi. 51 3.1.3. Thành phần rơm rạ sau tiền xử lý. 52 3.2. Kết quả phân tích xơ sợi các nguồn dinh dưỡng. 53 3.3. Kết quả phân tích đạm các nguồn dinh dưỡng. 54 3.3.1. Kết quả phân tích mẫu bằng máy phân tích nguyên tố CHN 54 3.3.2. Kết quả phân tích bằng phương pháp chuẩn độ formol (Sorensen) 55 3.4. Kết quả nhân giống men: 56 3.5. Kết quả thủy phân và lên men đồng thời: 57 3.6. Kết quả SFF ở thiết bị mini-pilot: 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 Kết luận 61 Kết luận về thành phần rơm rạ trước và sau tiền xử lý. 61 Kết luận về kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng có trong nguồn dinh dưỡng. 61 Kết luận về kết quả thủy phân và lên men đồng thời. 61 Kiến nghị. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 1 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ 6 Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần trong rơm rạ 6 Bảng 1.3. Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô. 10 Bảng 1.4. Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[9] 10 Bảng 1.5. Kết quả phân tích hàm lượng nitơ trong bã lên men bằng thực nghiệm: 24 Bảng 1.6. Thành phần của CSL (%KL)[16 ] 25 Bảng 4.1 : Hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm. 32 Bảng 2.2 Kết quả thí nghiệm trong bã SSF 39 Bảng 2.3. Kết quả thí nghiệm trong CSL 39 Bảng 2.4. Tỉ lê thành phần cơ chất cho 1 lần lên men. 44 Bảng 2.5. Thành phần cho quá trình SSF 45 Bảng 2.6. Thành phần cho quá trình SSF 46 Bảng 2.7. Thành phần cho quá trình SSF 46 Bảng 2.8. Thành phần cho quá trình SSF 46 Bảng 2.9. thành phần cho quá trình SFF 47 Bảng 2.10. Khối lượng rơm nhập liệu 48 Bảng 2.11. Khối lượng rơm nhập liệu 48 Bảng 2.12. Khối lượng rơm nhập liệu 49 Bảng 3.1. Thành phần xơ sợi của rơm rạ theo Hồ Tráng Sỹ [26] 50 Bảng 3.2. Thành phần xơ sợi có trong các nguồn dinh dưỡng. 53 Bảng 3.3. Kết quả phân tích nitơ tổng. 54 Bảng 5.4. Kết quả phân tích hàm lượng acid amin. 55 iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose 5 Hình 1.2. Cấu trúc của tế bào và thành tế bào của thảo mộc. 7 Hình 1.3 . Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase 9 Hình 1.4. Nấm men Sacchromyces cerevisiae dưới dạng bột khô. 10 Hình 1.5. Cấu trúc rơm rạ sau tiền xử lý. 14 Hình 1.6. Quy trình sản xuất ethanol từ rơm rạ của hệ thống Pilot 23 Hình 1.7. Bột ngô (CSL) 25 Hình 2.1. Rơm thô 29 Hình 2.2. Rơm sau tiền xử lý 29 Hình 2.3. Máy cắt thô 29 Hình 2.4. Máy cắt tinh 29 Hình 2.5. Thiết bị nổ hơi 30 Hình 2.6. Rơm sau nổ hơi 30 Hình 2.7. Rơm được ngâm kiềm 30 Hình 2.8. Thiết bị lọc ép 30 Hình 2.9 . Rơm rạ sau tiền xử lý 31 Hình 2.10. Bã rắn sau khi sấy 32 Hình 2.11. Bã rắn sau khi nghiền 32 Hình 2.12. Enzyme Cellulase 33 Hình 2.13. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 33 Hình 2.14. Corn steep liquor (CSL) 34 Hình 2.15. Viên nang 35 Hình 2.16. Cân điện tử 35 Hình 2.17. Cân điện tử hình 35 Hình 2.18. Máy phân tích C H N 35 Hình 2.19. Dịch kích hoạt men giống 41 Hình 2.20. Thiết bị tiệt trùng 41 v
  9. Đồ án tốt nghiệp 41 41 Hình 2.21. Tủ lắc 41 Hình 2.22. Máy quang phổ kế 41 Hình 2.23. Thiết bị ly tâm. 42 Hình 4.24. Máy đo độ ẩm 43 Hình 2.25. Các erlen chứa rơm trước khi tiệt trùng 44 Hình 2.26. Bình thủy phân và lên men đồng thời 45 Hình 2.27. Lấy mẫu sau mỗi lần nhập liệu 48 Hình 3.1. Thành phần xơ sợi của rơm khô 50 Hình 5.2. Thành phần xơ sợi của rơm sau nổ hơi. 51 Hình 3.3. Thành phần rơm sau tiền xử lý. 52 Hình 3.4. Sự phát triển của con men trong quá trình nhân giống:(1) 0,1% bã SSF; (2) 200ml dịch nước SSF; (3) 0,1% CSL. 56 Hình 3.5. Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm 57 Hình 3.6. Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm 58 Hình 3.7. Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF. 59 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF 60 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp TÓM TẮT LUẬN VĂN Hiện nay nguồn nguyên liệu dầu mỏ đang cạn kiệt, cùng với việc giá thành tăng cao và ô nhiễm môi trường đang là thách thức lớn trong việc sử dụng nhiên liệu trong tương lai. Trong bối cảnh đó, ethanol được đánh giá là nguồn cung cấp nhiên liệu tốt vì con người có khả năng sản xuất với sản lượng lớn, không gây ô nhiễm môi trường và có thể thay thế được hoàn toàn cho xăng. Ethanol hoàn toàn có thể sản suất được từ nguồn cellulose thực vật như rơm rạ. Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam. Với thành phần chứa hơn 40% cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol. Trong quá trình lên men ethanol từ rơm rạ, nấm men cần nguồn dinh dưỡng bổ sung để sinh sản và sinh trưởng tốt. Nguồn dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay là bột ngô chuyên dụng (CSL) cho kết quả rất tốt. Nhưng sau quá trình lên men, lượng bã thải thường được thải bỏ hoặc sử dụng làm phân bón cho cây trồng. Luận văn này nghiên cứu khả năng sử dụng bã thải của quá trình lên men và thủy phân đồng thời để thay thế cho CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung trong quá trình lên men rơm rạ thành ethanol. Bã lên men sau khi lấy từ quá trình chưng cất được để lắng chia làm 2 phần bã rắn và bã lỏng. Bã rắn sấy để giảm độ ẩm xuống dưới 10%, nghiền mịn và tiến hành phân tích hàm lượng dinh dưỡng (Nitơ, protein). Sau đó tiến hành thủy phân và lên men đồng thời rơm sử dụng nguồn dinh dưỡng là bã rắn, bã lỏng rồi so sánh với kết quả khi sử dụng nguồn dinh dưỡng là CSL. Hàm lượng nitơ tổng trong bã lên men là 3,97 % (CSL là 8,42%), hàm lương nitơ amin tự do là 2,42 g/l (CSL là 3,64 g/l). Kết quả thủy phân và lên men đồng thời cho thấy rằng, bã lên men hoàn toàn có thể thay thế CSL làm nguồn dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng và phát triển. - 1
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Rơm rạ là một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào lignocellulose nhất trên thế giới. Về tổng sản lượng, lúa là cây trồng quan trọng thứ ba sau lúa mì và ngô. Theo thống kê của FAO sản xuất lúa gạo trung bình thế giới năm 2007 khoảng 650 triệu tấn. Thu hoạch 1kg hạt lúa thu được tương ứng 1 - 1,5 kg rơm (Maiorella, 1985). Ước tính 650 - 975 triệu tấn rơm rạ được sản xuất mỗi năm trên toàn thế giới và phần lớn chúng được dùng làm thức ăn cho gia súc và phần còn lại là lãng phí. Nước ta là một nước nông nghiệp với sản lượng gạo hằng năm trên 35 triệu tấn. Đồng bằng Sông hồng, khu vực trung du và đồng bằng Sông cửu long là 3 khu vực sản xuất lúa gạo chính của nước ta. Từ đó có thể thấy sản lượng rơm rạ trên cả nước hằng năm là rất lớn và tập trung. Việc giá dầu mỏ tăng lên từng ngày cùng với tình trạng ô nhiễm môi trường đang dần trở thành một thách thức lớn cho việc sử dụng nhiên liệu trong tương lai. Nguồn rơm rạ dồi dào nhưng những ứng dụng lại hạn chế. Sự lãng phí nguồn năng lượng cùng với ô nhiễm môi trường do việc sử dụng rơm rạ không đúng cách như hiện nay đang dần trở thành mối quan tâm của nhiều nhà khoa học và quản lý. Ethanol được đánh giá là nguồn cung cấp nhiên liệu tốt cho tương lai vì con người có khả năng sản xuất với sản lượng lớn, không gây ô nhiễm môi trường và có thể thay thế được hoàn toàn cho xăng. Ethanol hoàn toàn có thể sản suất được từ nguồn cellulose thực vật như rơm rạ. Theo đánh giá sơ bộ, lượng rơm rạ hằng năm trên cả nước nếu được chuyển thành ethanol hoàn toàn có khả năng thay thế toàn bộ nhu cầu xăng dầu cả nước như hiện nay. Để quá trình lên men đạt hiệu suất cao, vi sinh vật cần được nuôi cấy và được cung cấp nguồn dinh dưỡng thích hợp cho việc sinh sản. Tuy nhiên, các nguyên liệu biomass nguồn gốc lignocelluloses thường không có đủ hàm lượng nitơ cần thiết cho quá trình tạo protein trong chuỗi sinh sản của vi sinh vật (nấm men). Vì vậy, cần phải có một nguồn bổ sung từ bên ngoài. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp Nguồn dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay tại pilot trường đại học Bách Khoa T.p Hồ Chí Minh là bột ngô chuyên dụng (CSL), đây là nguyên liệu không phải lúc nào cũng có sẵn tại địa phương, và có giá trị cao trong công nghệ vi sinh. Trong khi đó bã thải quá trình SSF chứa rất nhiều xác nấm men, và các hợp chất carbohydrate nhưng hiện nay chỉ mới được cân nhắc sử dụng làm phân bón hoặc đổ thải ra môi trường. Nếu chúng ta có thể thay CSL bằng bã thải SSF thì quá trình sản xuất bioethanol từ rơm rạ sẽ càng bền vững hơn vì bớt phụ thuộc vào nguyên liệu bên ngoài, giảm lượng bã thải, nâng cao hiệu quả sản xuất qua việc tận dụng những thành phần có trong bã thải SSF. Trên cơ sở đó, mục tiêu luận văn là nghiên cứu khả năng sử dụng bã thải lên men để thay thế cho CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung trong quá trình lên men rơm rạ thành ethanol. Lý do chọn đề tài và nhiệm vụ của luận văn Lý do chọn đề tài: Trong những nghiên cứu trước, quá trình lên men sản xuất cồn từ rơm rạ sử dụng nguồn dinh dưỡng là bột ngô chuyên dụng ( tên gọi thương mại là CSL - Corn steep liquor). Nguồn dinh dưỡng này mang lại hiệu quả khá tốt, tuy nhiên, do nhập khẩu từ Pháp và giá thành khá đắt đỏ, hơn nữa lượng bã thải sau chưng cất thường chỉ được sử dụng làm phân bón hoặc thải ra ngoài môi trường gây lãng phí. Sau khi chưng cất thì xem như hỗn hợp đã được tiệt trùng, việc dùng nó làm nguồn dinh dưỡng sẽ giảm thiểu được việc xử lý có nghĩa là sẽ sử dụng trực tiếp nguồn dinh dưỡng này. Bên cạnh đó trong bã thải còn có thành phần cellulose chưa lên men và xác con yeast, khi sử dụng sẽ tận dụng nguồn cellulose, còn xác con yeast sẽ là nguồn dinh dưỡng bổ sung cho con men trong các mẽ lên men sau. Việc tận dụng bã sau lên men này sẽ tận thu được lượng ethanol còn trong bã, hơn nữa sẽ giảm thiểu được khối lượng và thể tích chất thải ra môi trường. Tuy nhiên bã thải có hai phần bã rắn và bã lỏng, nên luận văn sẽ nghiên cứu việc sử dụng bã lỏng để thay thế cho nguồn dinh dưỡng và nước mất, bên cạnh đó sẽ nghiên cứu việc sữ dụng bã thải rắn làm nguồn dinh dưỡng thay thế CSL trong 3
  14. Đồ án tốt nghiệp quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn Nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng (Nitơ, protein) trong bã lên men, CSL. Nghiên cứu thành phần rơm rạ trước và sau quá trình thủy phân và lên men đồng thời (SSF). Khảo sát quá trình thủy phân và lên men đồng thời ethanol từ rơm rạ sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau (CSL, bã rắn, bã lỏng). Nghiên cứu vai trò của bã rắn, bã lỏng (bã lên men) làm nguồn dinh dưỡng thay thế bột ngô chuyên dụng trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguyên liệu lignocellulose Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose có trong phế phẩm nông nghiệp, trong sản phẩm phụ công của công nghiệp sản xuất giấy Do đó lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất bioethanol. Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose. Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích ly và tro. Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau tạo thành liên kết cộng hóa trị với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O- methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin [4] Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose Đối với các loại thực vật dạng thân gỗ thường chứa khoảng 40% - 60% cellulose, 20% - 40% hemicellulose và 10% - 25% lignin. Tuy nhiên đối với thực vật dạng thảo mộc hàm lượng lignin thường thấp hơn 20%. Thành phần trong rơm rạ được nghiên cứu và trình bày bởi nhiều tác giả [5]. Ở mỗi điều kiện phát triển và giống khác nhau thì thành phần trong rơm rạ cũng khác nhau. Nhìn chung thành phần rơm rạ được trình bày bởi một số tác giả như sau: 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rơm rạ Tên Thành phân Hemicellulose 27.7% Cellulose 39.7% Xylan 20.7% Glucan 37.6% Lignin 12.7% Tro 11.7% Theo báo cáo của phòng thí nghiệm năng lượng sinh học – Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, thành phần rơm rạ sau khi nổ hơi ở vùng Củ Chi là: Bảng 1.2. Tỉ lệ các thành phần trong rơm rạ Thành phần cellulose Hemicellulose Lignin Tro Hàm lượng (%) 43.05 23.82 18 15.3 lượng Bên cạnh thành phần hóa học, tính chất các thành phần trong rơm rạ và cấu trúc tế bào thực vật cũng quan trọng không kém trong việc nghiên cứu xử lý rơm rạ. Cũng giống như động vật, cơ thể thực vật cũng được xây dựng từ các tế bào. Do không được bảo vệ bằng cơ chế phản xạ và miễn dịch, tế bào thực vật được bảo vệ kỹ trong lớp vỏ rắn chắc. Về cấu trúc, các tế bào thực vật được sắp xếp đặc khít và liên kết với nhau rất bền vững. Rắn chắc là yếu tố tạo nên sự bền vững của thực vật trong tự nhiên. Khi tế bào thực vật chết đi, khối lượng khô của tế bào chủ yếu tập trung ở thành tế bào. Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với Trong lignocelluloses các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. [6] 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Cấu trúc của tế bào và thành tế bào của thảo mộc. 1.2. Enzyme cellulase Enzyme cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axit amin được nối với nhau bởi lien kết peptid –CO-NH- . Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác. Cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn them vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. [7] Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5. Nhiệt độ tối ưu từ 40-500 C. Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 800C trong 10-15 phút. Enzyme cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các 7
  18. Đồ án tốt nghiệp ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ. Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 -110 KDa (Begunin, 1990; Gilkes và cộng sự, 1991). Enzyme cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật thường sử dụng như: nấm mốc Aspergillus niger, xạ khuẩn Actinomyces griseus, vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus pumilis Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ; 1,4- -D- glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) ; -D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) . Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Theo Erikson và cộng tác viên (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như sau: đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do. Tiếp đó exoglucanase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành. Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose. β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose. 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 . Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase 1.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae thuộc: - Bộ: Endomycetales. - Họ: Saccharomycetaceae. Saccharomyces có khoảng 40 loài và các loài trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu Chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa Nấm men cấu tạo gồm vỏ tế bào thành phần là carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào chất, tế bào chất và nhân. S. cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường kính lớn từ 5-10nm và đường kính nhỏ từ 1-7nm, tế bào gia tăng kích thước theo độ tuổi. Thể tích tế bào đơn bội là 29 mm3 và tế bào lưỡng bội là 55 mm3. Các tế bào của nấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao, được sử dụng như là một mô hình hữu ích đại diện cho các tế bào eukaryote. Các thành phần cấu trúc và hóa học của tế bào được được minh họa theo bảng 2.3 và bảng 2.4[8] 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô. Thành phần Protein Acid Chất Độ ẩm Carbonhydrate Lipid trong cấu nucleic khoáng trúc Phần 2-5% 42-46% 30-37% 6-8% 4-5% 7-8% trăm Bảng 1.4. Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[9] Thành phần Cacbon Hydro Oxy Nito Phospho Magie Kali Phần trăm khối lượng 48.2 6.5 33.8 6.0 1.0 0.04 2.1 khô (%) Hình 1.4. Nấm men Sacchromyces cerevisiae dưới dạng bột khô. 1.3.1. Hình thái và cấu tạo nấm men Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, hình trứng hoặc hình ovan. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn. Kích thước tế bào nấm men cũng rất khác nhau, điều đó phụ thuộc vào các chủng nấm men và điều kiện nuôi cấy, thường là (2,5 - 4,5µm) x (10,5 - 20µm), thể tích tế bào chiếm khoảng từ 50 - 5000µm. 10
  21. Đồ án tốt nghiệp Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở thực vật, động vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhẩy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Một số tế bào nấm men chứa kitin và mannan. Trong thành tế bào nấm men còn chứa 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là các enzyme. Trên thành tế bào còn thấy có một lượng nhỏ lipid[14]. Nhân tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. DNA trong tế bào nấm men đơn bội có khối lượng phân tử là 1 x 1010 Da (1 Da = 1,67 x 10-24 g), so với khối lượng phân tử của DNA vi khuẩn Escherichia coli thì lớn hơn 10 lần nhưng so với DNA của người thì nhỏ hơn 100 lần [10] 1.3.2. Sinh trưởng của nấm men Thuật ngữ sinh trưởng đối với vi sinh vật bao hàm 2 ý nghĩa: sinh sản và phát triển. Nấm men có 2 hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vô tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào). Tùy theo điều kiện nuôi cấy mà tế bào nấm men sẽ sinh sản theo cách cách sinh sản vô tính hay hữu tính.[11] Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở nhanh, quan sát dưới kính hiển vi thấy hầu hết các tế bào nấm men nào cũng có chồi. Khi chồi xuất hiện các enzyme thủy phân sẽ phân giải phần polysaccharide của thành tế bào cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và thành tế bào mẹ. Thành phần của vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào. Khi tế bào chồi tách khỏi tế bào mẹ ở chổ tách ra còn giữ lại một vết sẹo của chồi, trên tế bào con cũng mang một vết sẹo. Các vết sẹo này có thể nhìn thấy rõ khi xử lý bằng thuốc nhuộm như calcafluor hoặc primulin rồi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dưới kính hiển vi điện tử càng có thể thấy rất rõ hơn. 11
  22. Đồ án tốt nghiệp Nấm men có khả năng đồng hóa hoàn toàn đường glucose, fructose và mannose. Ngoài ra tùy thuộc vào giống, nấm men còn có thể đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần đường galactose. Đường disaccharide thì nấm men đồng hóa rất tốt maltose và saccharose, đồng hóa hoàn toàn hoặc một phần đường lactose, riêng melibiose chỉ lên men được khi có enzyme melibiase. Các polysaccharide thì cần được phân hủy hoàn toàn nấm men mới sử dụng được. Nấm men có thể tự tổng hợp các acid amin. Tuy nhiên nếu cho các acid amin vào môi trường thì quá trình sinh sản và phát triển của tế bào sẽ nhanh hơn. Dễ 4+ đồng hóa hơn cả là ion amon NH và amoniac NH3 với lượng sử dụng lớn nhất là 20 - 35 mg nitơ/109 tế bào. Nguồn nitơ được coi là tốt nhất và được đồng hóa hoàn toàn là ure. Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng nhất định các chất khoáng để đảm bảo cho tế bào phát triển như phospho, kali, natri, magie, kẽm Đa số các chủng nấm men đang ở giai đoạn nhân giống cần đến các vitamin như isositol, canxi pantothenat, thiamin và đặc biệt là biotin. Nồng độ của vitamin có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển là 0,01 - 1,10 mg/l 12
  23. Đồ án tốt nghiệp 1.4. Quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ 1.4.1. Quy trình chung Rơm Tiền xử lý Thuỷ phân Thuỷ phân và lên men đồng thời Lên men Chưng cất Ethanol 1.4.2. Quy trình thực hiện 1.4.2.1. Tiền xử lý: Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy nhiên, bản chất của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu có thể bị phá hủy bởi acid mà không cần được tiền xử lý. Tóm lại quá trình tiền xử lý nhằm: Tăng vùng vô định hình của cellulose. 13
  24. Đồ án tốt nghiệp Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass. Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose với cellulose. Tránh thất thoát cellulose hay tạo ra những sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân và lên men. Hình 1.5. Cấu trúc rơm rạ sau tiền xử lý. Các phương pháp tiền xử lý có thể chia thành một số nhóm: Phương pháp vật lý: cắt, xay, nhiệt phân. Phương pháp lý hóa: nổ hơi, nổ sợi kết hợp kiềm, nổ khí CO2. Phương pháp hóa học: xử lý bằng ozone, thủy phân môi trường acid, thủy phân môi trường kiềm, oxy hóa khử lignin Phương pháp sinh học. Phương pháp xung điện trường. Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh thể chống lại được sự tấn công của enzyme. Trong một bài báo của mình, Fan et al ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90%. Tuy nhiên, không có sự liên quan giữa mức độ tinh thể của cellulose và khả năng phân hủy enzyme đối với rơm rạ. [12] Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu trúc mô vững chắc cực kì. Những mô được bền hóa với lignin tương tự 14
  25. Đồ án tốt nghiệp như nhựa được gia cố bằng sợi, trong đó lignin đóng vai trò kết dính những sợi cellulose. Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của môi trường và khí hậu. Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn công của enzyme đến cellulose được công nhận nhiều nhất. Nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân của enzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách. Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, không có nghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà không kèm theo sự phân hủy hemicellulose. Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở nhiệt độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng có 5% hemicellulose bị hòa tan. Các phương pháp xử lý cơ học: Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này. Các phương pháp tiền xử lý hóa học: Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình xử lý. Gồm có các quá trình chính: Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid. Trong đó, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nó rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý axit là thiết bị phải chịu được ăn mòn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hòa acid với CaOH. Với kiềm: đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hóa chất khác. Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hóa chất, thì vôi tôi là hóa chất thích hợp. Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng có phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine có thể còn hiệu quả hơn. [12] Ngoài ra còn có những phương pháp như xử lý với dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin; xử lý bằng khí SO2,khí 15
  26. Đồ án tốt nghiệp CO2, NH3 Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. 1.4.2.2. Thủy phân: Phản ứng: (C6H10O5)n + nH2O (C6H12O6)n Mục đích: Phá vỡ mạch carbon, giải phóng các loại đường phục vụ lên men. Quá trình thủy phân có hai hướng: Thủy phân acid: là công nghệ được sử dụng từ khá lâu, acid loãng được sử dụng trong môi trường nhiệt độ cao, áp suất cao hoặc acid đặc trong môi trường nhiệt độ thấp hơn, áp suất thường. Thủy phân dưới tác dụng của acid là quá trình có thể gây độc hại cho sản phẩm sau thủy phân cũng như môi trường lên men, ăn mòn thiết bị. Thủy phân enzyme: Cellulase là loại enzyme được dùng phổ biến nhất và có tầm quan trọng rất lớn trong công nghệ biomass hiện nay. Cellulase được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào, có khả năng phân hủy cả cellulose và hemicellulose. [13] Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân: [14] Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu : Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn công của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian. Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau: sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose. Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu. Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khó thủy phân hơn gỗ cứng. Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enzyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân. Ảnh hưởng của nhiệt độ Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng 16
  27. Đồ án tốt nghiệp theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu. Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ o o 40 – 50 C. Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50 C. Những enzyme khác nhau đều có nhiệt độ tối ưu khác nhau. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt o tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 0 C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một. Ảnh hưởng của pH pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở môi trường acid yếu. Một số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở cả pH kiềm và acid. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5, trong đó tốt nhất là 4.8. Nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đó, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng nữa mà là một đường nằm ngang. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất : Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ có nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất. Vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ không thay đổi đáng kể. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: 17
  28. Đồ án tốt nghiệp Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được cân bằng. Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động và vì vậy, cơ chất không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm. Chất kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme. Các chất kìm hãm không cạnh tranh thường gồm hai loại: kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất. 1.4.2.3. Lên men Phương trình chuyển hóa tổng quát: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Quá trình lên men gồm 2 giai đoạn: Đường phân glucose thành acid pyruvic (CH3COCOOH) và NADH2. Lên men thật sự. 2CH3COCOOH. CH3CHO + NADH2 18
  29. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn lên men diễn ra 2 phản ứng: 2CH3COCOOH CH3CHO + CO2 CH3CHO + NADH2 CH3CH2OH + NAD Ở giai đoạn này đường glucose được nấm men chuyển hóa thành ethanol trong môi trường kị khí. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men: Nhiệt độ: Mỗi vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm khoảng 28-320C, ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn saccharomyces 2-3 lần, còn ở nhiệt độ 380C chúng phát triển nhanh hơn 6-8 lần. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyde và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng. pH: Nồng độ ion H+ trong môi trường lên men ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích lớp vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng theo chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh nhất định chỉ có thể hoạt động tốt trong một trạng thái, trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường. Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.0. Nếu pH thấp khoảng 3.0-4.0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp. Nồng độ của dịch lên men: Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn tới làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý nấm men. Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế không những các tạp chất mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Nếu nồng độ đường của dịch lên 19
  30. Đồ án tốt nghiệp men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển. Thông thường, nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ). Thời gian: Thời gian cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ đường, chủng nấm men, Thời gian lên men bắt đầu từ lúc cấy nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men. Trong giai đoạn đầu lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy lượng sinh khối cần thiết cho lên men. Tiếp theo, để chuyển hóa glucose thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong môi trường yếm khí hoàn toàn. Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và cần thiết thì nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để áp dụng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2. Đó là nguyên nhân muốn có ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường. Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành axit acetic làm chua sản phẩm. Nồng độ CO2 trong môi trường: CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi. Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiêm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho CO2 bay ra mà không cho không khí vào. 20
  31. Đồ án tốt nghiệp Hàm lượng giống nấm men Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO2. Mỗi loài nấm men có khả năng lên men khác nhau. Cùng loại nấm men, nhưng ở những điều kiện khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. Các loại nấm men[14] Nấm men tiến hành lên men đường tạo thành ethanol. Một số loại nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men ethanol: Saccharomyces cerevisiae: được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất rượu bia Saccharomyces cerevisiae có thể lên men đường 6 (glucose) hiệu quả nhưng không lên men đường 5 (xylose). Saccharomyces cerevisiae được sử dụng phổ biến cho lên men glucose vì những ưu điểm như: chịu được nồng độ ethanol cao, ít sản phẩm phụ, tốc độ lên men cao trong môi trường acid, chịu được acid acetic. Trong luận văn chỉ sử dụng một lọai lấm men này. Pichia stipitis: không được sử dụng trong sản xuất bia rượu vì khả năng hạn chế trong môi trường hiếm khí, tuy nhiên khả năng lên men trực tiếp đường xylose thành ethanol được cho là hiệu quả nhất trong các loại men hiên nay. Xylose là một loại đường có trữ lượng thứ hai trong tự nhiên, được thủy phân từ lignocellulose có nguồn gốc từ gỗ và phụ phẩm nông nghiệp. Dinh dưỡng cho nấm men [14] Trong quá trình lên men, cần có nguồn dinh dưỡng làm thức ăn cho con men. Nhiệm vụ của dinh dưỡng là cung cấp hàm lượng nitơ hữu cơ có trong acid amin và vitamin, muối khoáng cho con men trong quá trình sinh trưởng và sinh sản của nó. Các loại nguồn dinh dưỡng cần thiết cho nấm men: Dinh dưỡng cacbon: các chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các rượu, axit hữu cơ, axit amin, có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon cho nấm men. Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men là các hợp chất hữu cơ và vô cơ có sẵn trong môi trường. Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ. Nguồn nitơ các nguồn nitơ hữu cơ thường là 21
  32. Đồ án tốt nghiệp hỗn hợp các axit amin, các peptit, các nucleotit Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc ) làm nguồn hữu cơ. Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ: các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê, lưu huỳnh Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như mangan, đồng, sắt, kẽm, cũng rất cần để quá trình sinh lý của nấm men xãy ra bình thường. Dinh dưỡng các chất sinh trưỡng: những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazơ purin và pyrimidin. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám, Một số loại dinh dưỡng phổ biến cho lên men: CSL (Corn Steep Liquor): là sản phẩm được trích từ tinh bột ngô, thành phần chính xấp xỉ 50% là nước. CSL cung cấp lượng nitơ thông qua các protein, acid amin và các dinh dưỡng khác như đường, muối khoáng, vitamin, acid hữu cơ, enzyme CSL còn được dùng làm thức ăn gia súc do chứa ít chất béo, chất xơ. DAP (Diammonium Phosphate): có công thức hóa học (NH4)2HPO4, với 1g/L DAP sẽ cung cấp khoảng 258mg/L Nitơ cho lên men. DAP chủ yếu được sử dụng trong quá trình lên men rượu. YNB (Yeast Nitrogen Bases): thành phần chủ yếu từ các muối potassium phosphate, magnesium sulfate, podium chloride, calcium chloride và các vitamin. YNB thường được dùng kết hợp với ammonium sulfate để tạo môi trường lên men. 2.4.2.4. Chưng cất: Sau khi kết thúc quá trình lên men, sản phẩm lên men sẽ được mang đi chưng cất để thu ethanol. Quá trình chưng cất chia làm 2 công đoạn: chưng cất thô và tinh luyện. Chưng thô để thu được ethanol thô nồng độ khoảng 60-70%. Sau đó được tinh luyện để thu ethanol tuyệt đối (>99%). Có thể tiến hành tinh luyện ethanol bằng cách dùng tháp đệm chưng cất hoặc dùng hóa chất để tách nước và các sản phẩm khác. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp Quy trình sản xuất thực tế tại trung tâm Biomass ĐH Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh. [15] Hình 1.6. Quy trình sản xuất ethanol từ rơm rạ của hệ thống Pilot 1.5. Đối tƣợng của luận văn 1.5.1. Đặt vấn đề Để quá trình lên men đạt hiệu suất cao, vi sinh cần được nuôi cấy và được cung cấp nguồn dinh dưỡng thích hợp cho việc sinh sản. Tuy nhiên, các nguyên liệu biomass nguồn gốc lignocelluloses thường không có đủ hàm lượng nitơ cần thiết cho quá trình tạo protein trong chuỗi sinh sản của vi sinh vật (nấm men). Vì vậy, cần phải có một nguồn bổ sung từ bên ngoài. Nguồn dinh dưỡng phổ biến trong công nghệ vi sinh hiện nay là bột ngô chuyên sụng (CSL) chế biến từ việc nghiền ướt ngô thành tinh bột mịn. Nguồn dinh dưỡng này tuy thông thường, nhưng hiện nay chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài. Thêm vào đó, nếu sản xuất cồn sinh học từ biomass được tiến hành ở quy mô công nghiệp, thì lượng dinh dưỡng này trở nên rất lớn và chi phí không nhỏ, cũng như làm giảm ý nghĩa của chiến lược an ninh lương thực. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp Trong khi đó, có rất nhiều nguồn nitơ dinh dưỡng khác tận dụng từ nguồn phụ phẩm hoặc phế phẩm của quá trình chế biến thực phẩm hứa hẹn thay thế cho bột ngô. Một số nguồn dinh dưỡng thay thế được xem xét và tiến hành nghiên cứu bao gồm bã đậu nành từ công nghiệp sản xuất sữa đậu nành và đậu phụ, vỏ khoai tây, hèm bia, bã nước mắm là những phụ phẩm hoặc phế phẩm của sản xuất thực phẩm, có thành phần protein cao. Trong luận văn này, bã lên men được chọn làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình lên men. Sau khi thực hiện quá trình lên men, nấm nem sẽ chết đi nhưng xác của nó vẫn tồn tại trong bã lên men, do đó hàm lượng protein, Nitơ từ xác của nấm men vẫn còn lưu lại trong bã lên men và có thể sử dụng hàm lượng dinh dưỡng này cho những lần lên men tiếp theo. 1.5.2. Bã lên men (SSF Residue) [15] Xét trên quy mô pilot thực nghiệm, mỗi mẻ lên men sau khi chưng cất sẽ thu được khoảng 480 kg bã, trong đó thành phần rắn chiếm khoảng 11%. Thông thường lượng bã này sẽ được thải ra môi trường. Đó là một sự lãng phí lớn nếu không tận dụng được các nguồn dinh dưỡng còn lại trong bã lên men. Hiện nay chưa có nghiên cứu chính thức nào để xác định thành phần các hợp chất có trong bã lên men rơm rạ nên luận văn sử dụng một số phương pháp đơn giản như phân tích hàm lượng nitơ amin tự do và phân tích hàm lượng nitơ tổng để xác định hàm lượng protein có trong bã lên men. Bảng 1.5. Kết quả phân tích hàm lượng nitơ trong bã lên men bằng thực nghiệm: Nitơ tổng wt,% Nitơ amin hòa tan, g/l Bã lên men 3.97 2.42 CSL 8.5 3.64 Kết quả sơ bộ trên cho thấy bã lên men có thể thay thế được CSL làm dinh dưỡng bổ sung cho nấm men. 24
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.5.3. Corn steep liquor (CSL) Đây là chế phẩm được sản xuất từ ngô, có màu vàng tươi, mùi thơm đặc trưng và có tính acid. Là một loại thực phẩm giàu năng lượng, cung cấp protein và khoáng chất cho sinh vật. Thành phần gồm chất béo, chất xơ, silica và acid lactic từ 20-25%. Bảng 1.6. Thành phần của CSL (%KL)[16 ] Tro 11 Acid lactic 25 Nitơ 8.5 Acid Phytic 7 Đường 2.5 Nước 46 Hình 1.7. Bột ngô (CSL) Trong quá trình thủy phân lên men đồng thời thì sau khi enzyme cellulase cắt mạch rơm ra thì đồng thời nấm men Saccharomyces cerevisiae đường phân glucose thành acid pyruvic (CH3COCOOH) và NADH2 . Ở giai đoạn này đường glucose được nấm men chuyển hóa thành ethanol trong môi trường kị khí. Nhưng trong quá trình thủy phân lên men đồng thời thì không có nguồn bổ sung protein làm nguồn dinh dưỡng cho nấm men Saccharomyces cerevisiae nên trong quá trình này ta phải 25
  36. Đồ án tốt nghiệp bổ sung nguồn dinh dưỡng. Luận văn này nghiên cứu tìm ra nguồn dinh dưỡng mới thay thế cho CSL. 1.6. Các kỹ thuật chìa khóa cho quá trình lên men. 1.6.1. Thủy phân và lên men đồng thời (SSF).[20] Quá trình thủy phân và lên men đồng thời (còn gọi là quá trình đường hóa và lên men đồng thời), khi đó lượng glucose được sinh ra lập tức được nấm mem sử dụng để len men thành ethanol. Quá trình được thực hiện trong cùng một thiết bị. Thời gian thực hiện mỗi mẻ khoảng 5-6 ngày. Thủy phân và lên men đồng thời là một kỹ thuật quan trọng vì: Glucose tạo thành trong quá trình thủy phân được tiêu thụ ngay lập tức bởi nấm men. Vì vậy, lượng cellobiose và glucose tích tụ trong hệ thống là rất ít. Điều này sẽ giải quyết vấn đề ức chế enzyme, nhờ đó tốc độ tạo glucose sẽ được tăng đáng kể, lượng enzyme cần dùng cũng nhỏ đi. Thiết bị cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cũng ít hơn số thiết bị cần cho phương pháp truyền thống vì cả quá trình thủy phân và lên men được tiến hành trong cùng một thiết bị. Điều này giúp giảm vốn đầu tư. Việc ethanol tạo thành trong suốt quá trình sẽ làm giảm khả năng phát triển của những vi sinh vật tạp nhiễm, glucose được lên men ngay lập tức. Vì vậy, điều kiện vô trùng được đòi hỏi ít hơn. Chính vì những ưu điểm trên mà quá trình SSF được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế gới với các nguồn nguyên liệu khác nhau. Tuy nhiên, những bất lợi cần được xem xét với quá trình SSF bao gồm: Nhiệt độ không tương hợp của sự thủy phân và lên men. Sự ảnh hưởng của ethanol đối với vi sinh vật. Sự ức chế enzyme của ethanol. 1.6.2. Nhập liệu nhiều lần theo đợt. Vì sao phải nhập liệu nhiều lần theo đơt: Lượng rơm tối đa cho mỗi mẻ lên men (tỷ lệ rắn/lỏng) là có giới hạn. 26
  37. Đồ án tốt nghiệp Nồng độ rơm tối đa của rơm là 80g/l, nếu nhập liệu nhiều lần thì nồng độ rơm tại mỗi thời điểm khoảng 20-25g/l. Nồng độ ethanol sau khi lên men thực hiện nhập liệu nhiều lần cao hơn so với nhập liệu một lần. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM Sơ đồ lên men trong luận văn: 1% CSL, 5% Tiệt trùng Cho 0,1% nấm men đường, nước 121oC,20 giống, lắc đều nhiệt Ly tâm lọc phút 35 0C, 8 giờ Nấm men Saccharomyces cerevisiae Nước lọc Enzym cellulase Thủy phân lên men đồng thời Lấy mẫu chạy (SSF) Nguồn dinh dưỡng HPLC Lọc ép, trung Lọc ép (rơm hòa sau tiền xử lý ) Xử lý bằng Phân tích thành Phân tích Phân tích kiềm phần sơ sợi C H N Nitơ tự do Nổ hơi Rơm rạ (cắt (puffing ) nhỏ 1-2cm) 28
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.1. Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thí nghiệm 2.1.1. Rơm rạ Rơm sử dụng trong nghiên cứu là rơm thuộc giống lúa “Trâu Nằm” lấy từ xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh. Rơm rạ được bảo quản trong điều kiện khô ráo, độ ẩm <12% trong vòng 6 tháng. Hình 2.1. Rơm thô Hình 2.2. Rơm sau tiền xử lý Rơm rạ được cho qua máy cắt thô. Sau khi cho qua máy cắt thô chiều dài rơm khoảng 3-4 cm. Hình 2.3. Máy cắt thô Hình 2.4. Máy cắt tinh 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Rơm rạ qua máy cắt thô được chuyển qua máy cắt tinh và chiều dài rơm sau khi cắt tinh là <2 cm. Sau khi rơm được cắt được đưa vào thiết bị nổ hơi để phá vỡ cấu trúc bó sợi chặt chẽ của rơm rạ. Hình 2.5. Thiết bị nổ hơi Hình 2.6. Rơm sau nổ hơi Rơm sau nổ hơi được ngâm trong dung dịch NaOH 0,1N trong vòng 24 giờ. Tại đây, NaOH sẽ thủy phân lớp lignin bao bọc quanh cellulose, giúp cho enzym dễ dàng tiếp cận với cellulose. Tỉ lệ rơm, nước, NaOH như sau: 30 kg rơm 300 lít nước 3.6 Kg NaOH ( quy mô pilot). Sau khi ngâm kiềm được lọc ép để loại bỏ nước, sau đó cho nước và HCl 36,5% vào để trung hòa lượng NaOH 0,1 N còn dư, sao cho pH của hỗn hợp xuống còn từ 4.8-5.5. Sau đó lọc vắt ép rơm đã được tiền sử lý và sử dụng được. Hình 2.7. Rơm được ngâm kiềm Hình 2.8. Thiết bị lọc ép 30
  41. Đồ án tốt nghiệp Rơm sau khi tiền sử lý đem kiểm tra độ ẩm, yêu cầu độ ẩm sau khi tiền sử lý từ 55%-70% là đạt yêu cầu. Hình 2.9 . Rơm rạ sau tiền xử lý 2.1.2. Nguồn dinh dưỡng bã lên men Sau khi lên men sẽ thu được hỗn hợp sau chưng cất gồm bã rắn và bã lỏng, để yên cho phần bã lắng xuống dưới, thu phần bã lỏng bảo quản ở nhiệt độ dưới 0oC. Sau khi thu gom bã rắn lên men từ quá trình chưng cất, bã sẽ được sấy trong tủ sấy ở 40 oC trong 2-3 ngày để loại bỏ nước, sau đó được nghiền mịn để thu được nguồn dinh dưỡng bã lên men. Trong quá trình sấy tránh cần tránh tình trạng nhiệt độ tăng quá cao, sẽ gây cháy mẫu và biến tính các thành phần hữu cơ trong mẫu. Mẫu sau khi nghiền cần được bảo quản trong vật liệu hút ẩm. Ta thấy công đoạn chế biến bã lên men rất dễ thực hiện và ít tốn kém hơn nhiều so với CSL. Tuy nhiên khi sử dụng bã lên men còn có những hạn chế như: bã rắn khi nghiền không đạt độ mịn như CSL, cũng như không xác định được những chất có thể gây ức chế quá trình lên men trong bã, bã lỏng cũng còn chứa một vài thành phần rắn chưa lắng xuống hết. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.10. Bã rắn sau khi sấy Hình 2.11. Bã rắn sau khi nghiền 2.1.3. Hoá chất sử dụng Bảng 4.1 : Hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Thí Hóa chất Mục đích nghiệm Acid H2SO4 98%, d=1,825 Thủy phân các hydrolysis thành các g/ml dạng dơn giản hơn. Phân tích CaCO3 sơ sợi Nước qua cột trao đổi ion Pha loãng D-cellulose, D(+)glucose, Dựng đường chuẩn D(+)xyclose Acid H2SO4 98%,d=1,825 Dung môi pha động HPLC g/ml Nước qua cột trao đổi ion Dung môi pha động Dung dịch NaOH 0,1 N Trung hòa Dung dịch formaldehyd ½ Sorensen Trung hòa acid amin 30% Phenolphtalein 3% Chất chỉ thị màu Dung dịch NaOH 0,1 N Thủy phân Tiền xử lý Dung dich H2SO4 36,5% Trung hòa 32
  43. Đồ án tốt nghiệp Một số nguyên liệu đã được chuẩn bị trước: 4.1.3.1. Enzyme cellulase: Hình 2.12. Enzyme Cellulase Enzyme được sử dụng là Acermomium Cellulase được cung cấp bởi Meiji Seika Co. (Japan). Nhiệt độ hoạt động tối ưu : 500C pH hoạt động tối ưu : 4.8 4.1.3.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae Chủng nấm men EthanolRedTM (Dry yeast, S. serevisiae, Ementics, France). Nồng độ men để lên men 12 -15 triệu tế bào/ml. Nấm men cần được kích hoạt trước khi sử dụng. Hình 2.13. Nấm men Saccharomyces cerevisiae 33
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.1.3.3. Corn steep liquor (CSL): Đây là chế phẩm được sản xuất từ ngô, có màu vàng tươi, mùi thơm đặc trưng và có tính acid. Là một loại thực phẩm giàu năng lượng, cung cấp protein và khoáng chất cho sinh vật. Thành phần gồm chất béo, chất xơ, silica và acid lactic từ 20-25%. Sản phẩm được nhập khẩu từ Nhật Bản và cần được bảo quản nơi khô ráo, tránh hút ẩm. Hình 2.14. Corn steep liquor (CSL) 2.2. Tiến hành thí nghiệm 2.2.1. Định lượng Nitơ tổng bằng phân tích C H N.[21] Các mẫu thử được cân trong viên nang (hình trụ tròn được làm bằng giấy bạc), lượng mẫu cần thiết cho mỗi viên nang khoảng 1-1,5 mg. Sau đó viên đang được đưa vào thiết bị chứa mẫu. Sau đó mẫu được đưa vào thiết bị oxi hóa trong 0 điều kiện dư O2. Ở khoảng 990 C mẫu bị oxi hóa thành các khí gồm CO2 , H2O và NOx, có thể có CO trong điều kiện dư O2. Để nhận biết quá trình oxi hóa hoàn toàn ta dùng xúc tác vonfram trioxit khi O2 dư qua lớp xúc tác. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.15. Viên nang Hình 2.16. Cân điện tử Hỗn hợp khí qua một ống silica bọc đồng, môi trường trong ống là 5000C chứa khí oxi để chuyển hóa NOx về N2. Dòng khí ra khỏi ống gồm CO2 , H2O và N2. Dùng khí heli tinh khiết để vận chuyển khí sau đó ta xác định thể tích và áp suất hỗn hợp khí trước khi cho qua máy phân tích sắc kí khí. Kết quả từ máy sắc kí khi sẽ cho ta biết hàm lượng C, H, N trong mẫu. Hình 2.17. Cân điện tử hình Hình 2.18. Máy phân tích C H N 35
  46. Đồ án tốt nghiệp 2.2.2. Phân tích thành phần sơ sợi. 2.2.2.1. Hóa chất và dụng cụ sử dụng: Hóa chất : Acid (sử dụng 100 ml H2SO4 98% d=1,825g/ml) hòa tan trong 65,9 ml nước qua cột lọc trao đổi ion, tạo thành dung dịch acid H2SO4 72%. CaCO3 Nước đã qua cột trao đổi ion . Các chất làm đường chuẩn có độ tinh khiết cao D-cellulose, D(+)glucose, D(+)xyclose. Dụng cụ: Bình có nắp 100ml (3 bình ). Động cơ khuấy và cá từ. Cốc thủy tinh hình nón 100ml (3 bình). Bình filter 200 – 300ml. Pipet các loại. Ống tiêm và màng lọc 0,2 m. Bình lọc. 2.2.2.2. Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu để tiến hành thủy phân : Cân 300 10 mg mẫu cho vào bình có nắp 100 ml (3 bình). Cho 3 0,01 ml acid H2SO4 72% vào bình và khuấy trộn hoàn toàn. Đặt bình vào thiết bị điều nhiệt nước ở 30 0C trong 60 5 phút, luôn được khuấy bởi cá từ. Lấy 1 bình ra và pha loãng nồng độ axit đến 4% bằng cách cho thêm 84 0,04 ml nước qua thiết bị trao đổi ion, trộn đều để loại bỏ các lớp nồng độ acid trong bình. Thiết lập đường chuẩn của cellulose, glucose và xyclose 5000, 3000, 1000 mg/l Đặt các bình vào nồi hấp 121 0C, sau đó chuẩn bị lấy mẫu. Phân tích mẫu chứa lignin không hòa tan trong axit: Cho mẫu vào lò nung ở 600 0C trong 4 giờ. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Lấy ra để nguội trong 2 giờ. Cho vào bình hút ẩm. Lấy 50 ml mẫu dùng để đo lignin hòa tan bởi acid. Pha loãng mẫu từ 5 – 10 lần với H2SO4 4% Đo mẫu trên máy UV-Vis với bước sóng 240nm và 320 nm Phân tích mẫu chứa cacbohydrate Cho 0,84 g CaCO3 vào 20ml mẫu, lọc qua giấy lọc. Lọc lại qua màng lọc sinh học 0,2 m. Đem phân tích bằng HPCL Tro được xác định bằng cách xác định khối lượng còn lại sau lọc. Tính toán: AIR = msau lọc – mđầu AIR% = AIR/(mđầu – mẩm) (giả sử mẩm chiếm 3% khối lượng đầu) Ash = msau nung – mđầu Ash% = Ash/(mđầu – mẩm) AIL = msau lọc – msau nung AIL% = AIL/(mđầu – mẩm) ASL% = UVabs × volumefiltrate × Dilution × 100 / ( ×/(mđầu – mẩm)) Với: UVasb = trung bình mẫu đo tại 240 nm Volumefiltrate = volume of filtrate (thể tích lọc) Dilution = Dilution factor (độ pha loãng 5 - 10 lần) = 25 (240 nm) Xylose : được phân tích bởi máy HPLC Xyclose% = Cxyclose xVxyclose /(mđầu – mẩm) Glucose : được phân tích bởi máy HPLC Glucose% = Cglucose xVglucose /(mđầu – mẩm) Kết luận : Phần trăm glucose chính là phần trăm của cellulose. 37
  48. Đồ án tốt nghiệp Phần trăm xyclose chính là phần trăm của hemicelluloses . Phần trăm ASL và AIL là phần trăm của lignin, (chất trích ly protein chiếm thành phần không đáng kể). Phần trăm Ash là phần trăm của tro. 2.2.3. Phân tích hàm lượng Nitơ hòa tan bằng phương pháp Sorensen. Nguyên liệu và hóa chất Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chỉ chuẩn bị trước khi dùng). Dịch bã lên men, CSL. Dung dịch NaOH 0,1N. Thuốc thử Phenolphtalein 3%. Dụng cụ Erlen 250 ml. Pipet 1 ml. Buret 25 ml. Giá đở Ống chứa mẫu Tiến hành thí nghiệm. Lấy 2 bình nón và đánh dấu bình 1 và bình 2. Bình 1: Dùng làm bình kiểm tra. Cho vào 50ml dung dịch formol ½ và thêm vào đó 3 giọt phenolphthalein 3%. Sau đó dùng dd NaOH 0,1 N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt. Ta được formon ½ trung hòa. Bình 2: Dùng làm bình thí nghiệm. Cho vào 10 ml dịch mẫu (đã được pha loãng 10 lần), thêm 10ml dd formol ½ đã trung hoà và 3 giọt phenolphthalein 3%, lắc đều cho phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn màu ở bình 1). Thực hiện chuẩn độ lại giống như chuẩn độ bình 2 nhưng thay dịch mẫu bằng nước lọc để kiểm tra độ đạm hòa tan trong nước. Kết quả: 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2 Kết quả thí nghiệm trong bã SSF Lần TN Nước cất, V1 (ml) Dung dịch mẫu, V2 (ml) 1 0,05 1,80 2 0,05 1,80 3 0,05 1,75 TB 0,05 1,783 Bảng 2.3. Kết quả thí nghiệm trong CSL Lần TN Nước cất, V1 (ml) Dung dịch mẫu, V2 (ml) 1 0,05 1,80 2 0,05 1,80 3 0,05 1,75 TB 0,05 1,783 Tính toán kết quả: 1 ml dung dịch NaOH 0,1 N tương đương 1,4 mg Nitơ, lượng Nitơ amin của dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức: M(g/l) = 1,4.( V2 – V1 )/a Trong đó: V1 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không V2 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a=1ml =0,001 l). 2.2.4. Thủy phân và lên men đồng thời. Vì bã thải lên men gồm hai phần là bã rắn và bã lỏng nên ta sẽ tiến hành khảo sát: Thứ 1: chỉ sử dụng bã mà không sử dụng nước. Thứ 2: chỉ sử dụng bã lỏng thay thế cho nước mới Đối với bã rắn: Bước 1:Phân tích và sử dụng bã khô dạng bột để nhân giống men để xem xét khả năng phát triển của con men. 39
  50. Đồ án tốt nghiệp Bước 2:có kết quả tốt ở bước 1 ta sẽ tiến hành lên men ở quy mô pilot sử dụng bã sau chưng cất làm chất dinh dưỡng thay thế trong quá trình SSF. Đối với bã lỏng: Bước 1: Sử dụng bã lỏng làm môi trường nhân giống men thay cho nước cất. Bước 2: có kết quả tốt ở bước 1 ta tiến hành ở quy mô pilot, sử dụng bã lỏng làm môi trường SSF 2.2.5.1. Nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae  Nguyên liệu: Đường. Bã rắn sau chưng cất( đã nghiền mịn),dịch nước sau chưng cất, CSL. Chủng nấm men Ethanol RedTM (Dry yeast, S. serevisiae, Ementics, France.)  Dụng cụ và thiết bị: Erlen 1000 ml Bình định mức 200 ml. Giấy bạc Cân điện tử. Thiết bị tiệt trùng. Tủ vô trùng. Tủ lắc. Máy phân tích quang phổ 2.2.5.1.1. Nhân giống men sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng: Tiến trình thí nghiệm: Rửa sạch và lau khô erlen 1000 ml Cân 10 g đường và bã SSF (1% rơm khô) làm nguồn dinh dưỡng cho vào erlen, sau đó thêm vào 200 ml nước cất bằng bình định mức, dùng giấy bạc bịt kín erlen lại. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Cho erlen vào thiết bị hấp tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút. Quá trình này để loại bỏ vi sinh vật lạ và nấm men cạnh tranh với nấm men Yeart. Sau khi hấp xong để nguội đến 35 0C, lấy erlen ra khỏi tủ hấp. Cho 0,1 g nấm men vào erlen, đưa vào tủ lắc 150 rpm, 350C trong 8 giờ. (chú ý không đậy giấy bạc). Pha loãng mẫu 20 lần băng nước cất. Kiểm tra mật độ vi sinh (đo OD) Hình 2.19. Dịch kích hoạt men giống Hình 2.20. Thiết bị tiệt trùng Hình 2.21. Tủ lắc Hình 2.22. Máy quang phổ kế 41
  52. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.23. Thiết bị ly tâm. 2.2.5.1.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình nhân giống men: Làm tương tự như trong thí nghiệm mục 4.2.5.1.1. Trong thí nghiệm này ta thay 200ml nước cất bằng 200ml bã lỏng sau chưng cất và không có bã SSF. 2.2.5.1.3. Nhân giống men sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng: Làm tương tự như trong thí nghiệm mục 4.2.5.1.1. Trong thí nghiệm này ta thay bã SSF bằng CSL (1% rơm khô) làm nguồn dinh dưỡng. 2.2.5.2. Thủy phân và lên men đồng thời. Nguyên liệu: Rơm (sau tiền xử lý). Dinh dưỡng ( CSL, bã lên men). Nước lọc trao đổi ion. Yeast (thu được ở trên). Enzyme cellulase. Dụng cụ và thiết bị: Erlen 200 ml có nắp đậy. Ống đong 100 ml. 42
  53. Đồ án tốt nghiệp Giấy bạc. Cân điện tử. Thiết bị tiệt trùng. Tủ vô trùng. Tủ lắc. Típ chứa mẫu. Đầu lọc vi sinh. Kim tiêm. Tiến hành thí nghiệm. Rửa sạch bằng nước cất và lâu khô các dụng cụ thí nghiệm. Kiểm tra độ ẩm của rơm: khởi động máy đo độ ẩm, đặt rơm lên khay chứa mẫu của máy đo sao cho lượng rơm khoảng 0,5÷0,7 g là hợp lý. Bấm nút “start” để máy tiến hành đo. Độ ẩm của rơm sẽ hiển thị khi máy đo xong. (chú ý không dịch chuyển máy khi đo) Hình 4.24. Máy đo độ ẩm Sau khi đo độ ẩm, ta tiến hành tính toán lượng rơm và các nguyên liệu cần thiết cho 1 lần lên men. Tổng lượng cơ chất cho vào erlen là 125 g gồm rơm, dinh dưỡng, enzyme, nước (d=1g/ml). 43
  54. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.4. Tỉ lê thành phần cơ chất cho 1 lần lên men. Tỉ lệ % so với tổng cơ chất (125 g) Rơm 8% 16% Dinh dưỡng 1% 0,1% 1% 0.1% Yeast Tính theo phụ lục B Tính theo phụ lục B Enzyme 1,875 % rơm 1,875 % rơm Nước Thêm vào cho vừa đủ 125 g Thêm vào cho vừa đủ 125 g Sau khi tính toán lượng rơm cần thiết, ta chia đều rơm sao cho mỗi lần nhập mẫu rơm là 4% rơm. Sau đó tiến hành cân các nguyên liệu. Lấy 6 erlen sử dụng cho 1 lần lên men, cân lượng rơm của lần nhập liệu thứ nhất cho vào mỗi erlen, những lần nhập tiếp theo cân xong rồi dùng giấy bạc quấn chặt rơm lại. Cân dinh dưỡng cho vào mỗi erlen, sau đó thêm vào 30 ml nước rồi dùng giấy bạc bịt kín miệng erlen. Các nút đậy erlen khi lên men cũng được quấn chặt bằng giấy bạc. Sau đó mang các erlen, rơm, nút đậy đi tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút. Mục đích là để loại bỏ nấm mốc và các vi sinh vật lạ. Hình 2.25. Các erlen chứa rơm trước khi tiệt trùng Sau khi tiệt trùng xong, để nguội và đưa và tủ vô trùng. Cân lượng enzyme cần thiết cho vào mỗi erlen (đối với thí nghiệm 16% rơm, chia lượng enzyme làm 2 lần), tính lượng nước cần thiết (chú ý trừ đi 30 ml nước đã thêm vào lúc tiệt trùng). Lượng Yeast sau khi ly tâm được cho vào erlen bằng cách dùng nước vừa tính ở trên tráng rửa ống nhựa rồi cho vào erlen. Dùng nút đậy kín erlen lại và cho vào tủ lắc, lắc ở 35 0C – 140 vòng/phút. (chú ý khủ trùng tủ lắc bằng cồn trước khi sử dụng) 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Lấy mẫu và nhập rơm: tại thời điểm lấy mẫu, ta lấy các erlen ra khỏi tủ lắc cho vào tủ vô trùng. Dùng kim tiêm hút mẫu ra và nhập rơm vào erlen. Sau đó đưa các erlen vào tủ lắc với điều kiện như ban đầu. Hình 2.26. Bình thủy phân và lên men đồng thời Bơm lượng mẫu vừa lấy qua đầu lọc vi sinh vào típ chứa mẫu, sau đó cho vào tủ lạnh để đóng băng mẫu chờ đến lúc đo HPLC. Thí nghiệm được tiến hành trong 7 ngày, sau đó rửa sạch dụng cụ cho lần lên men tiếp theo. (Chú ý mọi thao tác thí nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng và khử trùng các dụng cụ trước khi thí nghiệm) 2.2.5.2.1. Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: Bảng 2.5. Thành phần cho quá trình SSF Tổng khối lượng rơm khô 10g tỉ lệ: 8% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 125g Rơm ẩm (13.1%) 11,5g dinh dưỡng (0,15% rơm khô) 0,204 g (ẩm 8.1%) Enzyme (1,875% rơm khô) 0,1875g Yeast (OD=0.454) 6,12 ml mang đi ly tâm Nước 113 ml 45
  56. Đồ án tốt nghiệp 2.2.5.2.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SFF: Bảng 2.6. Thành phần cho quá trình SSF Tổng khối lượng rơm khô 10g tỉ lệ: 8% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 125g Rơm ẩm (13.1%) 11,5g dinh dưỡng (0,15% rơm khô) 111g dịch nước SSF Enzyme (1,875% rơm khô) 0,1875g Yeast (OD=0.454) 6,12 ml mang đi ly tâm 2.2.5.2.3. Sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: Bảng 2.7. Thành phần cho quá trình SSF Tổng khối lượng rơm khô 10g tỉ lệ: 8% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 125g Rơm ẩm (13.1%) 11.5g dinh dưỡng (0,1% rơm khô) 0,01g (CSL) Enzyme (1,875% rơm khô) 0,1875g Yeast (OD=0.454) 6,12 ml mang đi ly tâm Nước 113,3 ml 2.2.5.2.4. Quá trình SSF không sử dụng dinh dưỡng bổ sung: Bảng 2.8. Thành phần cho quá trình SSF Tổng khối lượng rơm khô 10g tỉ lệ: 8% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 125g Rơm ẩm (13.1%) 11,5g dinh dưỡng 0g Enzyme (1,875% rơm khô) 0,1875g Yeast (OD=0.454) 6,12 ml mang đi ly tâm Nước 113,31 ml 46
  57. Đồ án tốt nghiệp 2.2.5.3. Quá trình SSF ở quy mô mini-pilot: 2.2.5.3.1. Sử dụng bã SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình SSF: Bảng 2.9. thành phần cho quá trình SFF Tổng khối lượng rơm khô 2,85 kg tỉ lệ: 16% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 17,8 kg Rơm ẩm (68%) 8,91 kg dinh dưỡng (0,15% rơm khô) 4,275g Enzyme(1,875% rơm khô) 53,4g-100ml nước yeast 500ml dd yeast Sau khi tính toán sơ bộ cho quá trình nhập liệu theo Bảng 2.10 Ta chia tổng khối lượng rơm khô thành 6 phần nhập liêu: Ngày đầu: nhập 3 phần, lần đầu nhập 2 phần 2,97 kg (68%),lần 2 nhập 1,48 kg (68%). Ngày thứ 2: nhập liệu 3 lần mỗi lần 1 phần. Theo kinh nghiệm sau khi nhập hết 6 phần rơm đã tính trên ta sẽ nhập thêm 3 phần với khối lượng rơm khô tương tự 6 lần đầu Ngày thứ 3: nhập liệu 3 lần, mỗi lần 1 phần,lần đầu ta sẽ thêm 30g cellulase- 100ml nước. 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.27. Lấy mẫu sau mỗi lần nhập liệu Bảng 2.10. Khối lượng rơm nhập liệu Lần 1 2,97kg (68%) Lần 2 1,48kg (68%) Lần 3 1,19kg (60,2%) Lần 4 1,19kg (60,2%) Lần 5 1,19kg (60,2%) Lần 6 1,01kg (53,2%) Lần 7 1,01kg (53,2%) Lần 8 1,01kg (53,2%) Thí nghiệm được duy trì trong ba ngày tiếp theo, mỗi ngày lấy mẫu 1 lần 2.2.5.3.2. Sử dụng dịch nước SSF làm môi trường và nguồn dinh dưỡng cho quá trình SSF: Bảng 2.11. Khối lượng rơm nhập liệu Tổng khối lượng rơm khô 2,85kg tỉ lệ: 16% (tổng bình) Tổng khối lượng lên men 17,8kg Rơm ẩm (75%) 11,4kg dinh dưỡng 6,4kg bã lỏng cellulase 52,5g-100ml nước yeast 500ml dd yeast 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Sau khi tính toán sơ bộ cho quá trình nhập liệu theo Bảng 2.12 Ta chia tổng khối lượng rơm khô thành 6 phần nhập liêu: Ngày đầu: nhập 2 phần, lân đầu 3,8kg (75%). Ngày thứ 2: nhập liệu 3 lần mỗi lần 1 phần. Theo kinh nghiệm sau khi nhập hết 6 phần rơm đã tính trên ta sẽ nhập thêm 3 phần với khối lượng rơm khô tương tự 6 lần đầu Ngày thứ 3:nhập liệu 2 lần, mỗi lần 1 phần,lần 2 ta sẽ thêm 30g cellulase- 100ml nước. Ngày thứ 4:nhập liệu 2 phần. Lấy mẫu trước mỗi lần nhập liệu. Bảng 2.12. Khối lượng rơm nhập liệu Lần 1 3,8 kg (75%) Lần 2 1,1 (56,8%) Lần 3 1,1 (56,8%) Lần 4 1,1 (56,8%) Lần 5 0,68 (30%) Lần 6 0,68 (30%) Lần 7 0,76 (37,2%) Lần 8 0,76 (37,2%) Thí nghiệm được duy trì trong ba ngày tiếp theo, mỗi ngày lấy mẫu 1 lần. 49
  60. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả phân tích thành phần của rơm. 3.1.1. Thành phần rơm khô trước nổ hơi. Phương pháp phân tích được trình bày ở phần 4.2.2, rơm đem phân tích có độ ẩm 12,3 %. Hình 5.1 trình bày kết quả phân tích thành phần xơ sợi của nguyên liệu rơm đầu vào chưa qua tiền xử lý. Rơm khô %Lignin %Hemicellulose %Cellulose %Tro %other 4% 9% 21% 22% 44% Hình 3.1. Thành phần xơ sợi của rơm khô Rơm khô chứa 44 % cellulose, 22 % hemicellulose, cả hai polysaccharide này là thành phần quan trọng cho quá trình tổng hợp ethanol. Kết quả cho thấy rơm là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình tổng hợp ethanol. Bảng 3.1. Thành phần xơ sợi của rơm rạ theo Hồ Tráng Sỹ [26] %Lignin %Hemicellulose %Cellulose %Tro Rơm khô 12 32 – 40 34 – 38 14 – 18 Bảng 3.1 biểu diễn thành phần rơm rạ theo Hồ Tráng Sỹ, so sánh với kết quả phân tích rơm khô ở trên thì có chút khác biệt nhưng không đáng kể. Nguyên nhân là do thực hiện phương pháp phân tích khác nhau nên kết quả sẽ khác nhau, tuy nhiên cũng phải kể đến sai số trong phương pháp phân tích. Ngoài ra, việc sử dụng các nguyên liệu khác nhau cũng sẽ cho kết quả khác nhau. 50
  61. Đồ án tốt nghiệp Như vậy, nếu công nghệ chuyển hóa lignocellulose thành cồn có thể đựơc thương mại hóa sau khi giải quyết các bài toán về kinh tế, thì những phụ phế phẩm nông nghiệp như rơm rạ sẽ trở thành nguồn nguyên liệu đầy giá trị có khối lượng khổng lồ làm đầu vào cho quá trình sản xuất ethanol. 3.1.2. Thành phần rơm rạ sau nổ hơi. Về lý thuyết, các phương pháp vật lý tiền xử lý rơm rạ sẽ không làm thay đổi thành phần hóa học. Tuy vậy, khi áp dụng phương pháp nổ hơi, không thể không tính đến khả năng nhiệt độ và áp suất cao làm biến tính một số hợp chất. Để kiểm nghiệm điều này và phục vụ trực tiếp cho quá trình tính toán ở các bước sau, chúng tôi đã thực hiện phân tích thành phần rơm sau khi nổ hơi. Rơm sau nổ hơi %Lignin %Hemicellulose %Cellulose %Ash %other 15% 23% 10% 16% 36% Hình 5.2. Thành phần xơ sợi của rơm sau nổ hơi. Kết quả trên cho thấy rằng hàm lượng Hemicellulose, cellulose và thành phần không xác định (other) đã thay đổi so với rơm khô ban đầu. Cụ thể, hàm lượng hemicellulose và cellulose giảm (16% và 36%), trong khi đó hàm lượng không xác định tăng lên (15%). Các thành phần khác thay đổi không nhiều. Điều này cho thấy qua quá trình nổ hơi, hemicellulose và cellullose đã bị biến tính một phần do hơi và nhiệt tác động, kết quả tạo ra các thành phần không xác định được. Tất nhiên cũng phải kể đến sai số khi phân tích nhưng nhìn chung lượng thay đổi này là không 51
  62. Đồ án tốt nghiệp đáng kể và rơm sau nổ hơi vẫn đảm bảo hàm lượng cellulose và hemicellulose cần thiết cho quá trình tạo lên men bioethanol. 3.1.3. Thành phần rơm rạ sau tiền xử lý. Sau các bước tiền xử lý bằng phương pháp vật lý, rơm rạ tơi xốp sau nổ hơi được ngâm trong dung dịch kiềm 1% KL để lọai bỏ một phần lignin bao bọc quanh các cấu trúc xơ sợi. Do đây là phương pháp tiền xử lý hóa học, nên thành phần trong nguyên liệu sẽ có sự thay đổi đáng kể như trình bày trong Hình 5.3. Rơm sau tiền xử lý %Lignin %Hemicellulose %Cellulose %Ash %other 2% 6% 18% 23% 51% Hình 3.3. Thành phần rơm sau tiền xử lý. Số liệu trên đã chứng minh được quá trình thủy phân bằng kiềm đã loại bỏ được đáng kể thành phần không mong muốn, giữ lại được 2 polysaccharide quan trọng đó là hemicellulose và cellulose. Cụ thể, thành phần lignin, tro và thành phần không xác định giảm xuống, đặc biệt là thành phần tro và không xác định (2% và 6%). Như vậy sau khi rơm được ngâm trong kiềm lignin, tro và các thành phần không xác định đã bị hòa tan trong pha lỏng và bị loại bỏ (tất nhiên không thể loại bỏ hoàn toàn được). Kết quả làm cho hàm lượng cellulose và hemicellulose tăng lên rõ rệt (51% KLvà 23% KL). Tuy nhiên, cần lưu ý rằng thành phần %KL tương đối trong tổng thành phần thì tăng chứ không tăng tổng lượng cellulose và hemicellulose ban đầu. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp Quá trình xử lý bằng kiềm chiếm vai trò rất quan trọng vì nó loại bỏ 1 phần lignin trong rơm rạ cùng các chất gây ảnh hưởng khác, phá vỡ cấu trúc rắn chắc của lignocellulose, tạo điều kiện cho enzyme xâm nhập thủy phân cellulose. Tuy nhiên, nếu rơm rạ không được nổ hơi trước đó để giúp trở nên xốp hơn, thì hiệu quả xử lý bằng kiềm cũng sẽ rất hạn chế. 3.2. Kết quả phân tích xơ sợi các nguồn dinh dƣỡng. Nguồn dinh dưỡng bổ sung cung cấp protein với nguyên tố nitơ cần thiết cho vi sinh nhân đôi trong quá trình sinh sản. Điều này ảnh huởng trực tiếp đến chất lượng và hiệu quả của quá trình lên men đường thành bioethanol. Tuy nhiên, các thành phần khác, đặc biệt là xơ sợi trong nguyên liệu dinh dưỡng thay thế cũng được con men chuyển hóa thành bioethanol. Có nghĩa là, để phân tách rạch ròi chức năng dinh dưỡng thuần túy cung cấp nitơ protein cho nấm men Saccaromyces sinh trưởng, và tác dụng gia tăng bioethanol trực tiếp bằng các carbohydrates có sẵn trong nguồn dinh dưỡng, việc phân tích thành phần của nguồn dinh dưỡng là rất cần thiết. Bảng 5.2 tóm tắt kết quả phân tích thành phần xơ sợi có trong CSL và bã lên men sử dụng trực tiếp làm dinh duỡng bổ sung cho Saccaromyces cereavises. Bảng 3.2. Thành phần xơ sợi có trong các nguồn dinh dưỡng. %Xơ sợi gốc %Xơ sợi gốc %Lignin %Tro %Khác xylose glucose CSL 1.050 15.470 60.020 3.360 20.100 Bã lên men 31.413 15.723 15.514 20.045 17.305 Từ kết quả phân tích, ta thấy CSL và bã lên men có hàm lượng xơ sợi rất khác nhau. Cụ thể hàm lượng xơ sợi cấu thành từ monomer glucose trong CSL cao hơn gấp 4 lần bã lên men, các thành phần khác như lignin và tro thì bã lên men cao hơn CSL, chỉ có xơ sợi gốc xylose và thành phần không xác định của 2 nguồn dinh dưỡng này là tương đương nhau. Điều này có thể được giải thích bằng thực tế là CSL chứa nhiều tinh bột vì CSL là những bột bắp được sản xuất bằng việc cô sấy dung dịch bắp nghiền mịn. Trong khi đó, bã lên men là phế phẩm của quá trình 53
  64. Đồ án tốt nghiệp SSF, đa phần hàm lượng xơ sợi gốc glucose đã được chuyển hóa thành ethanol, các thành phần còn lại như lignin, xơ sợi gốc xylose không thay đổi sau quá trình SSF. Với thành phần giàu tiền chất glucose của CSL (60%) và bã lên men (15%) , ta có thể nhận định rằng, nếu lượng dinh dưỡng thay thế là CSL hoặc vỏ khoai tây đáng kể so với lượng nguyên liệu lignocellulose trong quá trình lên men, thì lượng dinh dưỡng này đóng góp đáng kể vào sự gia tăng nguyên liệu carbohydrate để hình thành trực tiếp bioethanol. Tuy vậy, quan trọng hơn là lượng dinh dưỡng đó phục vụ thế nào vào sự tăng trưởng nấm men thì phụ thuộc vào chất và lượng protein trong thành phần của nó. Ở phần tiếp theo, chúng tôi xin trình bày kết quả phân tính thành phần đạm (protein) của các nguyên liệu dinh dưỡng nói trên. 3.3. Kết quả phân tích đạm các nguồn dinh dƣỡng. Để nấm men sinh trưởng về số lượng cũng như chất lượng trong quá trình nuôi cấy và lên men bioethanol, nguồn protein bổ sung là rất cần thiết vì tế bào sinh trưởng cần đầy đủ dưỡng chất để hoàn thiện cấu trúc sinh học. Muốn so sánh và đánh giá tác dụng dinh dưỡng này, cũng như khả năng ứng dụng vào quy trình sản xuất bioethanol, thành phần đạm của các nguyên liệu dinh dưỡng thay thế được phân tích và so sánh với CSL như trình bày sau đây. 3.3.1. Kết quả phân tích mẫu bằng máy phân tích nguyên tố CHN Tổng lượng nitơ từ các tất cả hợp chất chứa nitơ trong tế bào hay trong các mô được gọi là N tổng. Tuy vậy, chức năng dinh dưỡng của nguyên liệu chủ yếu là từ nitơ có trong các acid amin của protein, xin gọi là N protein. Còn lại, nitơ không có trong protein như mà từ các muối đạm vô cơ hay những chất hữu cơ, vô cơ khác mà như acid nitric, ure và các dẫn xuất của ure, alcaloit, các bazơ purin và pyrimidin thì xin được gọi là các N phi protein. Theo đó: N tổng = N protein + N phi protein. Bảng 3.3. Kết quả phân tích nitơ tổng. Chất dinh dưỡng Hàm lượng nitơ tổng hợp(%) CSL 8,42 Bã 3,97 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Kết quả cho thấy hàm lượng nitơ tổng trong CSL là 8,42 %, bã lên men là 3,97%. Như vậy nitơ tổng trong CSL cao gấp đôi so với bã lên men. Điều này gần đúng với kết quả tham khảo trong tài liệu. Tuy vậy, kết quả phân tích N tổng chưa đủ để có thể kết luận được nguồn dinh dưỡng nào là tốt cho quá trình sinh trưởng phát triển và làm việc cho nấm men. Bởi vì không phải bất cứ nguồn N nào nấm men cũng sử dụng được. Nguồn N vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ. Trong khi đó, N hữu cơ thường là các acid amin, các peptit và các nucleotit. Một điều cần lưu ý rằng nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, nhưng tiêu thụ chuỗi peptit kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein. Tiến thêm một bước phân tích sâu hơn nhằm đánh giá lượng acid amin có trong các nguồn dinh dưỡng, chúng tôi tiến hành định lượng các acid amin bằng phương pháp chuẩn độ formol hay còn gọi là phương pháp Sorenson như trình bày trong phần tiếp theo. 3.3.2. Kết quả phân tích bằng phương pháp chuẩn độ formol (Sorensen) Bảng 5.4. Kết quả phân tích hàm lượng acid amin. Chất dinh dưỡng Hàm lượng acid amin (%) CSL 3,640 Bã 2,420 Thực sự trong thí nghiệm này việc xác đinh hàm lượng Acid amin 1 cách chính xác là không thể. Từ kết quả này ta có chỉ có thể biết được rằng hàm lượng acid amin trong CSL cao gấp 1,5 lần so với hàm lượng acid amin trong bã. Từ đó khi chúng ta sử dụng bã làm chất dinh dưỡng thay thế cho CSL với khối lượng gấp 1,5 lần so với khối lương CSL cần dùng chính là kết quả cần khảo sát qua đó cân bằng lượng nitơ mà con men có thể sử dụng. 55
  66. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Kết quả nhân giống men: 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 OD 2.0 1.5 (1) (2) 1.0 (3) 0.5 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time (h) Hình 3.4. Sự phát triển của con men trong quá trình nhân giống:(1) 0,1% bã SSF; (2) 200ml dịch nước SSF; (3) 0,1% CSL. Kết quả đo OD ở Hình 3.4 cho ta thấy sự phát triển của con men ở cả ba trường hợp khảo sát. Tuy hai trường hợp (1) sử dụng bã SSF; (2) sử dụng dịch nước SSF sự phát triển của con men còn thấp hơn khá nhiều so với trường hợp (3) sử dụng CSL nhưng điều này một lần nữa giúp ta đánh giá về khả năng sử dụng bã SSF và dịch nước SSF cho quá trinh thủy phân và lên men đồng thời (SSF). Từ kết quả tích cực đó chúng tôi đã tiến hành SSF để so sánh hiệu quả thực sự của chúng. 56
  67. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Kết quả thủy phân và lên men đồng thời: 1.4 1.2 wt %) wt ( 1.0 0.8 0.6 (1) 0.4 (2) (3) Ethanol concentration concentration Ethanol 0.2 (4) 0.0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 Time (h) Hình 3.5. Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm Hình 5.5 trình bày nồng độ ethanol thu được theo thời gian. Từ kết quả ta thấy rằng hàm lượng ethanol ở trường hợp (2) 8% rơm + dịch nước SSF còn cao hơn cả trường hợp (3) 8% rơm + 0,1% CSL mặc dù CSL là nguồn dinh dưỡng bổ sung chuyên dụng. Điều này có thể giải thích là do lượng dịch nước SSF đã có một hàm lượng ethanol có sẵn như trong đồ thị ở thời điểm ban đầu là 0,103 % trong khi nồng độ cao nhất ở trường hợp (2) 8% rơm + 111 dịch nước SSF chỉ cao hơn ở (3) 8% rơm + 0,1% CSL 0,03%. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp Để đánh giá hiệu quả giữa nguồn dinh dưỡng bổ sung với nhau và khi không sử dụng nguồn dinh dưỡng bổ sung ta sẽ đánh giá quá đồ thị hiệu suất lên men theo thời gian ở Hình 3.6 bên dưới. 70 60 50 40 30 Efficiency (%) Efficiency (1) 20 (2) (3) 10 (4) 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 . Time (h) Hình 3.6. Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 8% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 8% rơm + dịch nước SSF; (3) 8% rơm + 0,1% CSL; (4) 8% rơm Từ đồ thị hiệu suất lên men theo thời gian trên Hình 3.6 ta nhận thấy: Thứ nhất: Hiệu suất của quá trình SSF khi không có chất dinh dưỡng (4) thấp hơn nhiều so quá trình lên men có chất dinh dưỡng là CSL (3). Điều này cho ta kết luận rằng chất dinh dưỡng có một vai trò quan trọng trong quá trình SSF, giúp tăng hiệu suất của quá trình một cách đáng kể. Thứ hai:Khi ta sử dụng bã SSF, dịch nước SSF làm nguồn dinh dưỡng cho quá trình SSF thì nồng độ ethanol của quá trình đạt được gần nhứ là xấp xỉ với trường hợp sử dụng CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung. Điều này giúp ta một lần nữa khẳng định khả năng sử dụng bã SSF và dịch nước SSF làm nguồn dinh dưỡng thay thế. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp 3.6. Kết quả SFF ở thiết bị mini-pilot: 5.0 4.5 4.0 3.5 wt %) wt ( 3.0 2.5 2.0 1.5 (1) (2) 1.0 Ethano concentration concentration Ethano 0.5 0.0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 Time (h) Hình 3.7. Nồng độ ethanol trong quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF. 59
  70. Đồ án tốt nghiệp 80 70 60 50 40 30 Efficiency(%) (1) 20 (2) 10 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 . Time (h) Hình 3.8. Hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian:(1) 16% rơm+ 0,15% bã SSF; (2) 16% rơm + dịch nước SSF Từ đồ thị nồng độ ethanol và hiệu suất lên men theo thời gian trên Hình 3.7 và Hinh 3.8 ta nhận thấy rằng sử dụng bã SSF và dịch nước SSF làm nguồn dinh dưỡng bổ sung khá hiệu quả khi nguồn ethanol tạo ra khá cao. Đặc biệt nhìn vào hiệu suất ta còn thấy cao hơn cả khi làm làm ở quy mô phòng thí nghiệm. Điều này có thể được lý giải là: Nguồn dinh dưỡng bổ sung là bã SSF và dịch nước SSF đều phát huy hiệu quả ổn định cả quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot. Trong quy trình thực hiện ở quy mô pilot thì ta chia nhỏ rơm ra nhiều lần. Một điều quan trọng hơn đó là vào ngày thứ ba của quá trình lên men, theo kinh nghiệm, ta sẽ cho them enzyme thủy phân và thêm rơm vào tiếp. Kết luận: Từ các kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi thấy rằng bã lên men, về mặt kĩ thuật, hoàn toàn có thể thay thế được CSL làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho quá trình lên men rơm rạ thành cồn. Với ưu thế về sự tiện lợi, yếu tố kinh tế và vấn đề môi trường, bã lên men là nguồn dinh dưỡng thay thế đầy hứa hẹn trong tương lai khi công nghiệp sản xuất ethanol từ rơm rạ phát triển lên quy mô công nghiệp. 60
  71. Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kết luận về thành phần rơm rạ trước và sau tiền xử lý.  Thành phần rơm khô. Rơm khô chứa 44% cellulose và 22% hemicellulose, kết quả trên là thích hợp cho quá trình sản xuất bio-ethanol.  Thành phần rơm sau tiền xử lý. Sau tiền xử lý, lượng cellulose trong rơm tăng lên 51%, lượng lignin và thành phần khác giảm xuống. Quá trình tiền xử lý giúp cho rơm tơi xốp, phá vỡ cấu trúc bền bỉ của bó sợi, tạo điều kiện thuận lợi cho enzym tiếp cận và thủy phân celulose thành glucose. Kết luận về kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng có trong nguồn dinh dưỡng. Hàm lượng Nitơ tổng trong bã lên men là 3,97 %, hàm lượng Nitơ amin hòa tan là 2,24 g/l. Thành phần dinh dưỡng trên là đảm bảo dinh dưỡng cho quá trình sinh sản và sinh dưỡng của vi sinh vật trong quá trình lên men. Kết luận về kết quả thủy phân và lên men đồng thời. Trong đồ án này sau khi đánh giá việc tận dụng nguồn bã thải sau chưng cất sử dụng làm chất dinh dưỡng cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cho kết quả tích cực về hiệu quả khi sử dụng chúng làm nguồn dinh dưỡng thay thế. Hiệu suất cho ethanol khi sử dụng bã lên men làm dinh dưỡng bổ sung chênh lệch không nhiều so với khi sử dụng CSL. Để thu được hiệu suất theo yêu cầu cần sử dụng lượng bã lên men gấp 1,5 lần lượng CSL, thời gian lên men tối thiểu là 100 giờ, tối đa là 150 giờ. Bã lên men là nguồn dinh dưỡng bổ sung có khả năng thay thế CSL trong quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ, tuy nhiên cần nghiên cứu sâu hơn nữa để có thể thay thế hoàn toàn CSL làm dinh dưỡng trong tương lai. 61
  72. Đồ án tốt nghiệp Kiến nghị. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi chỉ thực hiện các phương pháp nghiên cứu cơ bản để đánh giá khả năng thay thế của bã lên men làm dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ. Tuy nhiên, để thay thế hoàn toàn CSL, cần nghiên cứu sâu hơn về bã lên men, chúng tôi xin đưa ra một số kiến nghị sau: Cần phân tích kỹ hơn nữa về thành phần và hàm lượng các chất có trong bã lên men, để xem xét khả năng có một số chất có thể gây ức chế quá trình lên men cũng như gây ảnh hưởng đến chức năng dinh dưỡng của bã lên men. Ngoài thành phần dinh dưỡng Nitơ, cần xác định các thành phần dinh dưỡng khác như thành phần các vitamin, các nguyên tố vi lượng, Các thành phần này cũng góp phần quan trọng và quá trình sinh dưỡng của vi sinh vật. Quá trình xử lý bã cần thực hiện ở nhiệt độ ổn định đế tránh quán tính nhiệt sẽ gây biến đổi hóa học các protein trong bã lên men, làm giảm tác dụng dinh dưỡng của bã. Nghiên cứu kỹ hơn về quá trình thủy phân và lên men đồng thời để tăng hiệu suất thu hồi ethanol. Hiệu quả chuyển hóa cellulose còn chưa đạt mức tối đa, trong khi đó, hemicelluloses được chuyển hóa thành đường xylose không bị nấm men lên men thành ethanol. Việc áp dụng một chủng men lên men có thể chuyển hóa xylose sẽ nâng cao hiệu suất thêm 30-40 % nữa. 62
  73. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đinh Văn Kha, Tình hình nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới và Việt Nam, Viện hóa học công nghiệp Việt Nam. [2] Nguyễn Ngọc Quế, Trần Đình Thao (báo cáo tổng quan ngành lúa gạo Việt Nam ,viện chính sách và viện phát triển nông nghiệp nông thôn 2005) [3] Hetti Palonen, “Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose”, VTT Biotechnology, 2004, pages 11-39 [4] Abreu P, Relva A, Matthew S, Gomes Z, Morais Z (2007) High-performance liquid chromatographic determination of glycoalkaloids in potatoes from conventional, integrated, and organic crop systems. Food Control 18, 40-44 [5] Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, 1996. [6] Yukihiko Matsumuraa, Tomoaki Minowab, Hiromi Yamamoto, Amount, availability, and potential use of rice straw (agricultural residue) biomass as an energy resource in Japan, 2005 [8] Keikhosro Karimi, Giti Emtiazi, Mohammad J. Taharzadeh, Ethanol production from dilute-acid pretreated rice straw by simultaneous saccharification and fermentation with Mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Science Direct, Enzyme and microbial Technology 40, 2006. [9] Abreu P, Relva A, Matthew S, Gomes Z, Morais Z (2007) High-performance liquid chromatographic determination of glycoalkaloids in potatoes from conventional, integrated, and organic crop systems. Food Control 18, 40-44 [10] Pascal Ribéreau-Gayon, Denis Dubourdieu, B. Donèche, A. Lonvaud. Handbook of Enology, The Microbiology of Wine and Vinifications. John Wiley & Sons. 2006 [11] Nutawan Yoswathana, “Bioethanol Production from Rice Straw”, Energy Research Journal 1, 2010, pages 26-31. [12] Hetti Palonen, Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT Biotechnology, 2004. 63
  74. Đồ án tốt nghiệp [13] Charles E.Wyman, Handbook on Bioethanol: Product and Utilization, Taylor&Francis, 1996. [14] PGS.TS Đỗ Quý Hải, Giáo trình enzyme, Đại Học Huế. [15] Lương Đức Phẩm. Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội 2005 [16] Số liệu thực nghiệm tháng 8/2013 tại xưởng thực nghiệm – phòng thí nghiệm năng lượng sinh học (JICA), Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. [17] Biền Văn Minh, Giáo trình điện tử - Vi sinh vật học công nghiệp, Đại học Huế, 2008 [18] Cao Đình Khánh Thảo, Nghiên cứu thử nghiệm khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol, Luận văn Đại học, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Khoa CôngNghệ Hóa Học, 01/2007 [19] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm công nghệ sinh học, Tập 1 – Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh [20] ThS. Trịnh Hoài Thanh, Nghiên cứu quá trình xử lý rơm rạ để chế biến cồn nhiên liệu, Luận văn Thạc sĩ, Bộ môn Máy Thiết bị - Khoa Công nghệ Hóa học [21] Trần Diệu Lý, Nghiên cứu sản xuất ethanol từ rơm rạ, Luận văn Đại học, Bộ môn Kỹ Thuật Hữu Cơ – Khoa Công Nghệ Hóa Học, 01/2008 64
  75. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. Đo nồng độ glucose, xylose, ethanol bằng phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Chuẩn bị: Chuẩn bị pha động (mobile phase). Hóa chất gồm acid H2SO4 98 % tinh khiết 267μl. Nước cất 1000 ml. Lọc nước cất bằng màng lọc cellulose acetate, kích thước lỗ là 0,45 μm. Cho 1000 ml nước cất đã được lọc vào bình chứa, cho 267 μl H2SO4 98 % vào và khuấy kĩ. Lọc dung dịch qua màng lọc sinh học, kích thước lỗ 0,22 μm. Cho vào tủ điều nhiệt để nâng nhiệt độ của dung dịch lên 350C Cho vào máy siêu âm (để loại bỏ khí trong pha động), hút chân không bình chứa pha động. Thực hiện quá trình này trong 45 – 60 phút đến khi không còn thấy bọt khí trong bình. Khởi động máy : Kiểm tra lại thể tích pha động trong bình. Đặt bình chứa pha động vào vị trí, nhúng đầu hút vào bình, dùng giấy bạc bọc xung quanh bình. Bật các công tắc nguồn của đầu dò RID, lò, bơm, máy in. Đổi hết dung môi cũ còn trong ống, thay bằng dung môi mới. Bằng cách mở van tháo (drain valve) của bơm và nhấn nút purge. Lặp lại bước này 2 – 3 lần . Đóng van tháo lại. Đặt tốc độ pha động ở 0,2 ml/phút và bấm nút pump để bắt đầu bơm. Đặt nhiệt độ cột ở 60 0C, nhấn nút oven để lò bắt đầu nâng nhiệt độ cột. Nâng dần tốc độ pha động từ 0,2 → 0,5 → 1,0 ml/phút. 1
  76. Đồ án tốt nghiệp Sau khi đạt đến các thông số mong muốn (nhiệt độ cột là 60 0C, tốc độ pha động là 1ml/phút) thay đổi đường biểu diễn của đầu dò RI từ “mẫu” (sample) sang dạng đường nền (reference). Giữ đường biểu diễn ở dạng đường nền trong hơn 30 phút. Đổi đường đường biểu diễn từ đường nền về lại dạng đường biểu diễn mẫu. Nếu giá trị balance trên máy không nằm trong khoảng ±50, nhấn nút balance để cân bằng lại cho đầu dò RI. Nhấn zero để đưa đường nền về 0 và có thể đo mẫu. Dung dịch mẫu và chuẩn trước khi đo cần được lọc kĩ qua màng lọc có kích thước lỗ là 20μm. Đo dung dịch chuẩn. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ethanol, glucose, xylose để khảo sát quan hệ chất – thời gian lưu, nồng độ – diện tích peak (không trình bày tại đây). Kết quả đo đường chuẩn Glucose xylose Ethanol Nồng độ %, wt 1716390 1887680 667693 0.333333333 1212056 1246847 439993 0.222222222 948103 1087551 338432 0.166666667 Từ đó suy ra các đường chuẩn: Glucose: Y = 2,174.10-7.X – 0,040155247 Xylose: Y = 1,983.10-7.X – 0.038323168 Ethanol: Y = 5,031.10-7.X – 0.001781621 Trong đó: Y là nồng độ, wt%; X là diện tích peak. B. Kiểm tra mật độ vi sinh. (Đo OD) Kiểm tra OD bằng máy quang phổ kế ở bước sóng là 600 nm. Mục đích đo OD là để xác định mật độ con Yeast có trong dịch kích hoạt (dịch pre-cul), qua đó xác định thể tích lượng dung dịch kích hoạt cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời. 2
  77. Đồ án tốt nghiệp Pha loãng dịch pre-cul 20 lần bằng cách: dùng pipet hút 1 ml dịch Pre-cul 1 ml cho vào ống nghiệm nhựa, sau đó thêm 19 ml nước lọc vào và lắc đều. Khởi động máy quang phổ kế, cài đặt bước sóng đo là 600 nm và bấm tổ hợp phím “shift+Abs” để chạy máy. Tráng sạch cuvet rồi cho nước cất vào cuvet, trừ nền bằng cách đặt cuvet vào máy quang phổ, bấm zero. Tráng cuvet bằng dịch pre-cul, rót đầy cuvet rồi cho vào máy quang phổ kế, bấm “Read” để đo OD. Kết quả OD = 0,3÷0,5 là hợp lý. Thể tích dịch pre-cul dùng để lên men được tính theo công thức: Vnuoc .0,5 V , ml OD. X Trong đó: Vnước là thể tích nước dùng cho thủy phân và lên men đồng thời. OD là mật độ con Yeast đo được ở trên. X là số lần pha loãng dịch pre-cul (X = 20 lần). Dùng pipet hút V ml dịch pre-cul cho vào ống nhựa và ly tâm. Quá trình này để loại bỏ dịch đường, dinh dưỡng và nước trong dịch pre- cul. Sau khi ly tâm, ta loại bỏ nước để thu được lượng Yeast cần dùng. C. Tính hiệu suất của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Phản ứng : C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Nồng độ ethanol tính theo lý thuyết: %.Cmglucos e rom 2.46 %.Cethanol() lt mdd 162 %C Hiệu suất: H ethanol() tt .100 %Cethanol() lt 3
  78. Đồ án tốt nghiệp D. Một số ký hiệu sử dụng trong luận văn: Hàm lượng ẩm trong mẫu đo %ẩm, % Khối lượng mẫu trước khi sấy m1, g Khối lượng mẫu sau khi sấy m2, g Khối lượng thành phần rắn trong mẫu AIR, g Hàm lượng của thành phần rắn trong mẫu AIR%, % Khối lượng tro trong mẫu Ash, g Hàm lượng tro trong mẫu Ash%, % Khối lượng lignin không hòa tan bởi acid AIL, g Hàm lượng lignin không hòa tan bởi acid AIL%, % Hàm lượng lignin hòa tan bởi acid ASL%, % Nồng độ acid amine hòa tan M, g/l Thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần chuẩn độ với H2O V1, ml Thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần chuẩn độ với mẫu V2, ml Lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần a Hàm lượng glucose trong rơm khô %Cglucose, % Khối lượng rơm khô lên men mrơm, g Khối lượng dung dịch lên men mdd, g Nồng độ ethanol theo lý thuyết %Cethanol(lt), % Nồng độ ethanol thực tế %Cethanol(tt), % Hiệu suất quá trình lên men H, % E. BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Bột ngô chuyên dụng CSL Thủy phân và lên men đồng thời SSF 4