›

Đồ án So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae gây bệnh bạch hầu

pdf 46 trang thiennha21 13/04/2022 8880
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae gây bệnh bạch hầu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_so_sanh_va_chon_loc_cac_quy_trinh_pcr_phat_hien_vi_khu.pdf

Nội dung text: Đồ án So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae gây bệnh bạch hầu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SO SÁNH VÀ CHỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  3. LỜI CAM ĐOAN Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của THS. Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh) Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ i
  4. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hƣớng và ủng hộ con đƣờng học tập của em. Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời luôn nhiệt tình giúp đỡ em, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ ii
  5. MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii Phần I: MỞ ĐẦU 1 Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu 3 2.1.1 Tác nhân gây bệnh 3 2.1.2 Cơ chế gây bệnh 4 2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới 5 2.1.5 Biện pháp phòng bệnh 8 2.2 Corynebacterium Diphtheriae 10 2.2.1Hình thái và cấu trúc 10 2.2.2Tính chất nuôi cấy 11 2.2.3Đặc điểm sinh hóa 12 Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1Dụng cụ cần thiết 16 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR 21 3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR 22 3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR . 22 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR 23 PHẦN IV: KẾT QUẢ 24 4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: 24 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: 25 4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR 26 4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR 27 4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR 27 iii
  6. 4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR 28 PHẦN V: KẾT LUẬN 31 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHẦN VII: PHỤ LỤC 34 iv
  7. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Elution buffer AL Lysis buffer AW1 Wash buffer 1 AW2 Wash buffer 2 DNA Deoxyribose Nucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Real Time - Polymerase Chain Reaction TBE Tris-Borate EDTA µL Microlitter µM Micromole v
  8. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái) 11 Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 14 Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 15 Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới 15 Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015 16 Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) 18 Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 18 Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) 19 Hình 2.8: Thử nghiệm Elek 21 Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi DT1, DT2 32 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 32 Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 33 Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 33 Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR 34 Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR 35 Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. trong Realtime PCR 35 Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR 36 Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. trong Realtime PCR 36 vi
  9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu 19 Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype 20 Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR 25 Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR 26 Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu 26 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 28 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 28 Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 29 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 29 Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR 30 Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR 30 Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu 37 vii
  10. CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Bệnh bạch hầu do khuẩn C. Diphtheriae gây ra. Biểu hiện lâm sàng thông thƣờng nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả xuất hiện ở nơi nhiễm trùng. Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm cơ tim, viêm dây thần kinh, viêm thận trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao. Trong thế chiến thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm bệnh tăng lên đến 50000 ca [3]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cƣ cao. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000. Nhƣng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phƣớc phát hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15]. Phƣơng pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm tuy nhiên phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật sống cũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu. Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau đến 95% axit amin và nucleotic . Thử nghiệm Elek cũng là một trong những phƣơng pháp phát hiện đƣợc độc tố bạch hầu. Nhƣng vì tình hình bệnh ngày càng ít đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít đƣợc dùng đến hơn [13]. Sự phát triển của sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu, chữa trị cũng nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu. Ƣu điểm của phƣơng pháp PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao. Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị, Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực 1
  11. hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đƣợc bƣớc điện di sản phẩm của PCR chuẩn. Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc đƣợc kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc. Trên cơ sở đó, đề tài “ So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch hầu ” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phƣơng pháp PCR phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. 2
  12. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái) 2.1.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh C. diphtheriae, đƣợc Klebs tìm thấy và Loeffler phân lập. C. diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, không có vỏ, không có lông và không có nha bào, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phƣơng pháp đặt biệt nhƣ Albert hoặc Neisser.Vi khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 12- 18 giờ, vƣợt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo. Dựa trên hình thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu đƣợc chia làm 4 biotype: mitis, intermedius, gravis và belfanti [1]. 3
  13. Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn. Trên các đồ vật, trực khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (đƣợc chất nhày trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống đƣợc vài tuần. Trên đồ vải vi khuẩn sống đƣợc 40-50 ngày,trên cát sống đƣợc đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng sống đƣợc 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1]. Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày. Ở nhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dƣới tác dụng của dung dịch clorua thủy ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1]. 2.1.2 Cơ chế gây bệnh Ngƣời là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu. Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc ngƣời mang vi trùng qua các chất tiết đƣờng hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thƣơng ngoài da có chứa vi trùng gây bệnh, và trong rất ít trƣờng hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ em [4]. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc khả năng xâm nhập vào hệ thống đƣờng hô hấp trên hoặc qua da và khả năng sinh ngoại độc tố bạch hầu. Trong đó khả năng sinh ngoại độc tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh [4]. Tại họng, độc tố vi khuẩn giải phóng gây phản ứng viêm nhiễm dẫn đến hình thành các giả mạc. Các giả mạc bao gồm khối sợi huyết, bạch cầu, hồng cầu, các tế bào biểu mô bị hoại tử ở đƣờng hô hấp và vi khuẩn. Giả mạc có thể ở tại chỗ (amidan, họng, mũi) hoặc lan rộng xuống thanh, khí phế quản gây tắc nghẽn khí đạo, phù nề mô mềm. Màng giả gây bít tắc chính là nguyên nhân thƣờng gây tử vong nhất ở ngƣời lớn và trẻ em. Hiện tƣợng mang vi trùng ở vùng cổ họng là nguồn truyền lây nhiễm quan trọng để duy trì và lan truyền bệnh trong cộng đồng [5]. 4
  14. Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hƣởng lên tất cả toàn tế bào cơ thể nhƣng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và trên thận. Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy cảm [5]. 2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thƣờng xảy ra ở phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông ngƣời dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh và cơ sở vật chất. Môi trƣờng sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho các bệnh về hô hấp phát triển, ngƣời dân đa phần không đƣợc dùng vắc xin. Bệnh cũng thƣờng xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ƣớt dễ dàng cho sự phát triển bạch hầu da [3]. Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết ngƣời hàng đầu trên thế giới. Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ em ở trẻ sơ sinh đã đƣợc loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nƣớc công nghiệp hóa. Ở các nƣớc đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt đƣợc sau khi thực hiện Chƣơng trình Mở rộng Chƣơng trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) vào những năm 1970 [12]. Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở ngƣời nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82%. Ngƣời lớn 40-49 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này chiếm gần một nửa số ngƣời chết. Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga. Tuy nhiên, những nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ em không đƣợc tiêm vắc xin đầy đủ. Tại Moldova, các nƣớc thuộc khu vực Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ ngƣời lớn bị bệnh dao động từ 38% đến 59% [12]. 5
  15. Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở ngƣời lớn. Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch. Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995. Từ năm 1990 đến năm 1998, 1157.000 trƣờng hợp và 5000 trƣờng hợp tử vong đƣợc công bố ở các quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở ngƣời. Ba phần tƣ các trƣờng hợp đƣợc công bố từ Liên bang Nga. Đây là vụ dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng bạch hầu mở rộng [12]. Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca. Năm 1990 dịch xảy ra ở Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về ngƣời. Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15 quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong, nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của ngƣời dân không đƣợc bảo đảm, vắc xin chƣa đƣợc phổ cập rộng rãi [12]. Diphtheria - United States 1940-1980 Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 6
  16. Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 ( . Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới. 7
  17. 2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam Trƣớc khi có chƣơng trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em, thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 [15]. Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai ca dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phƣớc 5 ca đƣợc xác định, 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. 40 30 20 Số ca BH 10 Số ca 0 chết Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015 2.1.5 Biện pháp phòng bệnh Đối với ngƣời nhiễm bệnh: Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ. Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với bệnh càng giảm. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch hầu [3]. Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4 tuổi). Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ an toàn. Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp. Phải dùng 8
  18. huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trƣớc ngày thứ 6). Những ngƣời mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể và sinh hoạt nhƣ bình thƣờng. Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho ngƣời bệnh. Trƣớc đây, ngƣời ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis, sulfamide) nhƣng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn hàng tháng. Hiện nay ngƣời ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt hơn. Chất tyrotrixin không tan trong nƣớc, cho nên thƣờng dùng với nƣớc, trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6]. Phải khử trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rƣỡi.( Ramon, 1944). Đối với ngƣời tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh: Tất cả những ngƣời tiếp xúc với ngƣời bệnh đều phải xét nghiệm 2 lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trƣớc khi dùng thuốc súc miệng. Nếu xét nghiệm có kết quả dƣơng tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đƣa ngƣời vào bệnh viện [6]. Tiêm ngừa phòng bệnh Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ em. Ngày nay ngƣời ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thƣơng hàn, hay là vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà. Trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm 2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân. 9
  19. 2.2 Corynebacterium Diphtheriae Phân loại khoa học Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Actinobacteria Bộ (ordo) Actinomycetales Họ (familia) Corynebacteriaceae Chi (genus) Corynebacterium Loài (species) C. diphtheriae 2.2.1Hình thái và cấu trúc C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không có vỏ, không có nha bào. Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơng C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hình hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nhƣ hình hàng rào. Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm. 10
  20. Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 2.2.2Tính chất nuôi cấy Trực khuẩn Bạch hầu ƣa các môi trƣờng có máu, huyết thanh đông và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trƣờng là 370C vì vậy các môi trƣờng nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên. Trên môi trƣờng thạch máu thƣờng, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan sát đƣợc tan huyết. Môi trƣờng chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trƣờng thạch máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ. Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen. C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trƣờng huyết thanh đông Loffle, ở điều kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn). Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục, đƣờng kính 1-2 mm, dễ tan trong nƣớc muối đẳng trƣơng Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) 11
  21. 2.2.3Đặc điểm sinh hóa Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại đƣờng glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5]. Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu Chủng vi khuẩn Glucose Sacarose Tan hồng cầu cừu C.diptheriae + - +hoặc- C.hoffmanni + + - C.cutis - - - Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype C.diphtheriae Tan máu tế bào Tan máu tế bào Tính chất lên men hồng cầu bò hồng cầu thỏ đƣờng Gravis - + + Intermedius - - - Mitis + + - 2.2.4 Độc tố vi khuẩn C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố, B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào. Sau khi B bám vào tế bào, quá trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein. Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin. Độc tố này đƣợc mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào trong DNA của vi khuẩn. Độc tố là một protein [6]. Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lƣợng phân tử 62kDa. Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +). Nó tác động lên tế bào vật chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố. Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ thể vật chủ thiếu yếu tố sắt. 12
  22. Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố do vậy không có khả năng gây bệnh. Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải. Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5]. Thử nghiệm này dựa trên sự khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trƣờng thạch. Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu đƣợc đặc trong môi trƣờng nuôi cấy. Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đƣờng thẳng vuông góc 90 ° với dải kháng độc. Toxigenic C.diphtheriae đƣợc phát hiện bởi vì độc tố tiết ra từ khu vực tăng trƣởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các dòng precipitin Hình 2.8: Thử nghiệm Elek Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhƣng độc tố gây ra các triệu chứng lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh. Điều trị và phòng bệnh đều phụ thuộc vào việc trung hòa độc tố. Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch hầu, cần dùng kháng độc tố. Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm và nhanh kể trƣớc khi có xét nghiệm [6]. 13
  23. 2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện bệnh bạch hầu Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu. Tuy nhiên, do quá trình bảo quản và vận chuyển số lƣợng vi khuẩn còn sống không phải lúc nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thƣờng nằm dƣới mức giới hạn phát hiện. Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu đang là phƣơng pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch hầu [8]. PCR chuẩn phát hiện đƣợc C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi khuẩn trong bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít. Các nghiên cứu trƣớc đó không đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt đầu đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp này sau khi vận chuyển và lƣu trữ các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng). Ở Indonesia một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng đã đƣợc chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dƣơng tính với C.diphtheriae sau khi chúng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10]. Tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy ngƣời dùng cặp mồi DT1 Fw 5’- CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev 5’- CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc tố. Nhƣng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến 95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân biệt đƣợc 2 chủng vi khuẩn này [14]. So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm PCR thƣờng, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện đƣợc các nồng độ DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn. Với sự xuất hiện của công nghệ khuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phƣơng pháp này đã có thể cải thiện đáng kể hơn phƣơng pháp PCR chuẩn. Mƣời lăm DNA chiết xuất từ các mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, đƣợc lƣu trữ 14
  24. ở -70 ° C kể từ thời điểm thu thập ban đầu (24 đến 36 tháng), đƣợc xác định là dƣơng tính theo PCR chuẩn (bốn là dƣơng tính yếu) Một hoặc cả hai tiểu đơn vị tox khi đƣợc kiểm tra tại thời điểm thu mẫu. Hai năm sau, trong nghiên cứu này, PCR chuẩn đƣợc lặp lại trên 15 chiết xuất này, và gen độc tố đƣợc phát hiện chỉ trong hai mẫu. Khi phân tích bằng Realtime PCR, 13 trong số 15 mẫu dƣơng tính đối với một hoặc cả hai tiểu đơn vị của gen độc tố [8]. Trong phƣơng pháp pha loãng Realtime PCR phát hiện thấy gen độc tố chỉ với 2 CFU nhạy hơn rất nhiều so với 1.500 CFU đƣợc phát hiện bởi PCR chuẩn. Bằng cách này, Realtime PCR có độ nhạy cảm gấp 10 lần so với các kết quả PCR truyền thống đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của Nakao và Popovic [8]. Real time PCR cho phép xác định độc tính trong mẫu bệnh phẩm khi PCR tiêu chuẩn tỏ ra không thích hợp. Realtime PCR có độ nhạy cao hơn, cụ thể, nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Các nghiên cứu trƣơc chỉ ra rằng, mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ DNA nhƣng Realtime PCR có thể phát hiện đƣợc độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là loại bỏ đƣợc bƣớc điện di, chụp hình kết quả điện di và dễ dàng đọc đƣợc kết quả sau khi phản ứng kết thúc. Realtime PCR là sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố. Do đó có thể cung cấp những kiên thức dịch tễ học quan trọng để phát hiện nhanh chóng các trƣờng hợp nhiễm bệnh trong nƣớc và nhập cƣ cũng nhƣ kiểm soát đƣợc tình hình cấp bách của bệnh bạch hầu trên toàn thế giới [8]. 15
  25. CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1Dụng cụ cần thiết - Kính hiển vi điện tử - Máy ly tâm - Máy PCR - Máy điện di - Tủ chụp UV sản phẩm điện di - Máy RT-PCR - Tủ âm 80oC, âm 20oC - Tủ mát - Tủ an toàn sinh học o - Bình ủ CO2, tủ ấm 37 C - Pipet vi lƣợng các loại - Đĩa petri đƣờng kính 90mm 3.1.2 Môi trường, sinh hóa phẩm - Bộ nhuộm Gram - Thuốc nhuộm Albert’A Toludine blue 0.15gr Malachite green 0.20gr Glacial acetic acid 1ml Alcohol (95% ethanol) 2ml 16
  26. - Thuốc nhuộm Albert’B Iodine 2gr Potassium iodide (KI) 3gr Môi trƣờng phân lập: Môi trƣờng Tellurite Canh thang não tim-BHI 200ml Máu cừu đã loại bỏ tơ huyết 20ml Dung dịch Kali tellurite 4% 1.5ml - QIAamp DNA mini Kit - H2O - TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1nM) - Tris-Borate-EDTA buffer, BioReagent - Ethidium Bromide - Gel loading buffer bromophenol - Ladder 100bp - Nƣớc cất pha tiêm - Mutanolysin từ S.globisporus ATCC - Lyzosyme - QIAGEN proteinase K (10mL) Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR [7][11] Tên Trình tự nucleotide (từ 5’-3’) Kích thƣớc sản phẩm Mồi DT1 CGGGGATGGTGCTTCGCG 910bp Mồi DT2 CGCGATTGGAAGCGGGGT Mồi Tox1 ATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTA 248bp Mồi Tox2 GAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAA 17
  27. Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR [9] Tên Trình tự nucleotide (từ 5’-3’) Kích thƣớc sản phẩm Mồi ToxA-R CTTGCTCCATCAACGGTTCA Mồi ToxA-F GGCGTGGTCAAAGTGACGTA 117bp Đầu dò ToxA-Prb FAM-CCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACT- TAMRA 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu - Chủng chứng dƣơng C.diphtheriae phân lập tại Việt Nam - Chủng vi khuẩn xác định độ đặc hiệu. - Mẫu: 40 mẫu ngoáy họng từ các ca có triệu chứng lâm sàng bạch hầu, mẫu ngoáy họng các ca tiếp xúc gần với ca nhiễm bệnh từ đợt dịch Bình Phƣớc năm 2016 Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu. Số TT Tên chủng Nguồn 1 Haemophilus influenzae ATCC 49247 2 Staphylococcus aureus ATCC 25923 3 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 4 Neisseria meningitidis ATCC 35561 5 Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 7 Escherichia coli ATCC 25922 8 Bacillus Subtilis ATCC 11774 9 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49917 10 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 11 Bacillus paralicheniformis ATCC12759 12 Enterobacter cloacae Viện Pasteur TP.HCM 13 Neisseria lactamica ATCC 49142 14 Neisseria meningitidis Viện Pasteur TP.HCM 18
  28. 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách DNA từ mẫu Sơ đồ tách chiếc DNA theo bộ QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN của Đức Rửa.thêm Rửa.thêm Dung 500µl 500µl giải.thêm Dung buffer buffer 200µl buffer dịch AW1 AW2 AE, ủ 5p,25 DNA độ C 100µ buffer Lysis+ Ly tâm Ly tâm Ly tâm 14000 20µl protein K + Ly tâm 8000 8000 rpm/3p. Bỏ 200µL buffer AL + 8000 rpm/60s rpm/60s dịch nổi, ly 260µl Ethanol 99% rpm/60s tâm 14000 rpm/1p Các bƣớc tách chiếc thực hiện theo hƣớng dẫn của WHO 3.2.2 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) phản ứng PCR Cấy khuẩn C.diphtheriae trên đĩa môi trƣờng BA sau 24h lấy khuẩn lạc tăng sinh trong 2mL BHI broth, sau đó hút 1ml dịch tăng sinh ly tâm 10000 vòng /5 phút thu cặn, tiến hành tách DNA theo quy trình ở mục 3.2.1. 1ml dịch tăng sinh còn lại tiến hành pha loãng từ nồng độ 10-1-10-8 CFU/mL. Chọn hai nồng độ là 10-6 và 10-7 hút 100µL dung dịch cấy trải trên đĩa môi trƣờng BA mỗi nồng độ lặp lại trên 2 đĩa, 24h sau đếm số khuẩn lạc thu đƣợc trên mỗi đĩa. Dựa vào nồng độ mồi đƣợc đƣa ra trên các bài báo khoa học trƣớc đây để tìm ra ngƣỡng phát hiện của phản ứng PCR mới thiết lập, quy trình đƣợc kiểm tra trên một dải nồng độ chứng dƣơng vi khuẩn C.diphtheriae nồng độ từ 10-1-10-8CFU/mL thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi nghiệm thức với 2 cặp mồi DT1, DT2 và Tox1, Tox2. 19
  29. Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Master Mix 2X 1X 12.5µL Mồi DT1 10µM 0.4µM 1µL Mồi DT2 10µM 0.4µM 1µL DNA khuôn mẫu 2µL Nƣớc Hút vô cho đủ 25µL Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Master Mix 2X 1X 12.5µL Mồi Tox1 10µM 0.8µM 2µL Mồi Tox2 10µM 0.8µM 2µL MgCl2 1µL DNA khuôn mẫu 2µL Nƣớc Thêm cho đủ 25µL Kĩ thuật PCR khuếch đại các phân đoạn gene của C.diphtheriae đƣợc thực hiện theo trình trình sau: - Lau tủ an toàn sinh học bằng cồn 70%, bật UV trong 30 phút - Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất cần thiết và tiến hành pha trộn hỗn hợp phản ứng theo thành phần định sẵn theo bảng trên, ngoại trừ DNA. - Chia đều các hỗn hợp phản ứng cho các tube . - Chuyển sang các tube phản ứng sang phòng mix DNA và thêm DNA của từng chủng vào các tube đã đƣợc chú thích trƣớc. - Spin down các tube. - Đặt các tube phản ứng vào máy PCR đã cài đặt chu trình nhiệt thích hợp và tiến hành phản ứng khuếch đại gene 20
  30. Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 Chu trình nhiệt 1X 940C trong 2 phút 30X 940C trong 20 giây 620C trong 30 giây 720C trong 30 giây 2X 720C trong 5 phút 100C đến ∞ Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 Chu trình nhiệt 1X 950C trong 2 phút 35X 950C trong 30 giây 550C trong 30 giây 720C trong 1 phút 2X 720C trong 10 phút 100C đến ∞ 3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR Mục đích là để tìm ra nồng độ thích hợp của cặp mồi ToxA-R, ToxA-F nhằm tiết kiệm đƣợc sinh phẩm mà vẫn cho ra đƣợc kết quả tốt nhất. Nghiệm thức đƣợc thực hiện trên 1 dải nồng độ mồi: 0.8µM, 0.6µM, 0.4µM, 0.2µM, 0.1µM, lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ mồi. Theo nghiên cứu của Elizabeth A. Mothershed và cộng sự, nghiên cứu năm 2002 báo cáo rằng những tín hiệu huỳnh quang có giá trị Ct dƣới 35 thì cho kết quả dƣơng tính 21
  31. Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR Chu trình nhiệt 1X 500C trong 2 phút 1X 950C trong 10 phút 45X 950C trong 15 giây 600C trong 1 phút Sau khi kết thúc giai đoạn 600C trong 1 phút, tiến hành đọc kết quả. Bảng 3.9: Thành phần phản ứng của phản ứng Realtime PCR Thành phần phản Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút ứng Master Mix 2X 1X 12.5µL Mồi ToxA-R 10µM 1.2µM 3µL Mồi ToxA-F 10µM 1.2µM 3µL Rox 0.2µl/100µL super mix Probe 1.25µM 0.1µM 2µL DNA khuôn mẫu 2µL Nƣớc Thêm cho đủ 25µL 3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR Sử dụng nồng độ mồi đã chọn ở thí nghiệm 3.2.4, khảo sát qua các nồng độ mẫu dò 0.2 µM, 0.1µM, 0.05µM, lặp lại 2 lần cho mỗi nồng độ. 3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR Tiến hành cấy vi khuẩn C.diphtheriae trên mồi trƣờng BA sau đó thực hiên tách chiết và cấy đếm tƣơng tự ở mục 3.2.2 22
  32. Sau khi tìm ra đƣợc nồng độ mồi thích hợp tiến hành thực hiện thí nghiệm khảo sát độ nhạy của mồi trên dải nồng độ DNA là 10-1- 10 -7, thí nghiệm đƣợc thực hiện với nồng độ mồi 1.2µM 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR Độ đặc hiệu của quy trình PCR mới đƣợc thiết lập sẽ đƣợc kiểm tra bằng các chủng vi khuẩn đƣợc liệt kê ở bảng 3.3 với nồng độ mồi 1.2 µM và nồng độ mẫu dò là 0.1µM Tiến hành áp dụng quy trình PCR, Realtime PCR chạy trên 40 mẫu ngoáy họng có các triệu chứng lâm sàn và các mẫu ngoáy họng tiếp xúc với ca nhiễm bệnh: Quy trình PCR (mồi DT1, DT2): nồng độ mồi 0.4µM. Tiến hành điện di sản phẩm PCR trong 35 phút, điện thế 100V Quy trình PCR (mồi Tox1, Tox2): nồng độ mồi 0.8µM, bổ sung 1µL MgCl2. Tiến hành điện đi sản phẩm PCR trong 30 phút, điện thế 100V Quy trình Realtime PCR (mồi ToxA-R, ToxA-F): nồng độ mồi 1.2µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM 23
  33. CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ 4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: Lad 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 _ . Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi DT1, DT2. Theo hình 4.1: Trong thí nghiệm này sử dụng cặp mồi DT1, DT2 để khảo sát độ nhạy của phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10-1-10-9. Nồng độ 0.4µM mồi phát hiện gen độc tố trong khoảng nồng độ DNA từ 10-4, nghiã là với 2180CFU quy trình PCR có thể phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae. Lad + 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 - Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 Theo hình 4.2: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung thêm -1 -7 MgCl2 để khảo sát độ nhạy phản ứng trên dải nồng độ DNA từ 10 -10 , Ở nồng độ 0.8µM, mồi bắt đƣợc gen độc tố gây bệnh ở ngƣỡng 10-4. Nghĩa là với 2180CFU thì quy tình PCR có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Kết quả trên gel điện di cho thấy trong thành phần phản ứng có bổ sung MgCl2 (hình 4.3) cho kết quả rõ hơn, hình chụp sáng màu hơn so với khi không bổ sung MgCl2 (hình 4.2) 24
  34. Lad + 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 - Hình 4.3:Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: Lad + 1 2 3 4 5 6 Lad + 7 8 9 10 11 12 Lad + 13 14 Hình 4.4 Hình 4.5 Hình 4.6 Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 trong phản ứng PCR. Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitidis Theo hình 4.4, 4.5, 4.6: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi DT1, DT2 và các chủng vi khuẩn khác để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae. 25
  35. Lad + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 _ 14 - Hình 4.7: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm khảo sát độ đặc hiệu của mồi Tox1, Tox2. Lad= thang đo kích thƣớc phân tử; (+) = đối chứng dƣơng; 1= Haemophilus influenza, 2= Staphylococcus aureus; 3= Streptococcus pneumonia; 4= Neisseria meningitides; 5= Neisseria gonorrhoeae;6= Pseudomonas aeruginosa; 7= Escherichia coli; 8= Bacillus Subtilis; 9= Haemophilus paraphrophilus; 10= Staphylococcus epidermidis; 11= Bacillusparalicheniformis; 12= Enterobacter cloacae; 13= Neisseria lactamica; 14= Neisseria meningitides; (-)= đối chứng âm. Theo hình 4.7: Thí nghiệm sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 và các chủng vi khuẩn để khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng. Kết quả cho thấy cặp mồi chỉ gắn đặc hiệu với gen độc tố vi khuẩn C.diphtheriae mà không phát hiện thêm bất kì một chủng vi khuẩn nào khác. 4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR Hình 4.7: Kết quả khảo sát nồng độ mồi Với các nồng độ mồi khác nhau đƣợc khảo sát, 6 nồng độ mồi sau 3 lần lăp lại đều cho tín hiệu vƣợt qua tín hiệu nền, kết quả rõ ràng nên chọ nồng độ. 26
  36. 4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR Với ba lần lặp lại ở 3 nồng độ mẫu dò, cả 3 nồng độ đều cho tín hiệu vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, nên chọn nồng độ thấp nhất 0.1µM để sử dụng trong phản ứng Realtime PCR Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò 4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR Cặp mồi- mẫu dò dùng để kiểm tra độ đặc hiệu cho đối chứng dƣơng C.diphtheriae vƣợt lên cao khỏi tín hiệu nền, trong khi không phát tín hiệu huỳnh quang với các ống chứa DNA của các chủng vi khuẩn đối chiếu. Kết quả này khẳng định độ tin cậy của cặp mồi và mẫu dò này trong phản ứng Realtime PCR chuẩn đoán C.diphtheriae. 1 2 3 Hình 4.9: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. (1) đƣờng biểu diễn đối chứng dƣơng. (2) đƣờng nền, (3) đƣờng biểu diễn những vi khuẩn khác 27
  37. 4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR Thí nghiệm khảo sát độ nhạy trên dãy nồng độ DNA vi khuẩn từ 10-1-10-9, kết quả cho thấy cặp mồi- mẫu dò phát hiện đƣợc vi khuẩn ở ngƣỡng nồng độ 10-5 , đồng nghĩa chỉ với 124 CFU thì quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc vi khuẩn C.diphtheriae. Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ nhạy 1 2 3 4 5 Hình 4.11: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. (1) đƣờng biểu diễn chứng dƣơng. (2) mẫu 16-389CD. (3) mẫu 16-393CD.(4) mẫu 16-386CD.(5) đƣờng nền 28
  38. Bảng 4.1:Kết quả chạy trên 40 mẫu Tên chủng Nuôi cấy PCR1 PCR2 Realtime-PCR (+) (mồi DT)(+) ( mồi Tox)(+) (+) 1 16-373CD 2 16-377CD 3 16-378CD X X X X 4 16-379CD 5 16-380CD 6 16-381CD 7 16-382CD 8 16-383CD 9 16-384CD 10 16-385CD 11 16-386CD X X X X 12 16-387CD 13 16-388CD 14 16-389CD X X X X 15 16-390CD 16 16-391CD 17 16-392CD 18 16-393CD X X 19 16-394CD 20 16-395CD 21 16-396CD 22 16-397CD 23 16-398CD X 24 16-399CD 25 16-400CD 26 16-401CD 27 16-402CD 28 16-403CD 29 16-404CD 30 16-405CD 31 16-406CD 32 16-407CD 33 16-408CD 34 16-409CD 35 16-410CD 36 16-411CD 37 16-412CD 38 16-417CD 39 16-418CD X X 40 16-419CD X X 29
  39. Qua bảng thống kê số liệu kết quả 2 quy trình PCR và Realtime PCR ta thấy đƣợc quy trình PCR1 phát hiện đƣợc 3 mẫu dƣơng tính/ 5 mẫu nuôi cấy dƣơng tính hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình PCR2 phát hiện 5 mẫu dƣơng tính trong đó 2 mẫu 16-393 CD và 16-418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy âm tính, hiệu xuất quy trình này đạt khoảng 60%. Quy trình Realtime PCR phát hiện đƣợc 6 mẫu dƣơng tính trong đó có 2 mẫu là 16-393CD và 16- 418CD phát hiện dƣơng tính trong khi kết quả nuôi cấy là âm tính, hiệu suất quy trình này đạt khoảng 80%. 30
  40. CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN Bài nghiên cứu so sánh ba phƣơng pháp PCR1, PCR2 và Realtime PCR : PCR1 sử dụng cặp mồi DT1, DT2; PCR2 sử dụng cặp mồi Tox1, Tox 2 và Real time PCR sử dụng mồi ToxA-R, ToxA-F. Trong phƣơng pháp PCR2 ở thí nghiệm khảo sát độ nhạy ta thấy đƣợc cặp mồi Tox1, Tox2 cho kết quả rõ ràng và chính xác hơn khi bổ sung MgCl2. Quy trình PCR1, PCR2 đƣợc thiết lập để có độ đặc hiệu tối ƣu và độ nhạy phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-4 nghĩa là với 2180CFU quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh. Quy trình Real time PCR đƣợc khảo sát cho độ đặc hiệu cao ở nồng độ mồi 0.4µM, nồng độ mẫu dò 0.1µM quy trình phát hiện gen độc tố ở nồng độ DNA 10-5. Nghĩa là chỉ với 124CFU thì quy trình phát hiện đƣợc vi khuẩn gây bệnh. Realtime PCR có độ nhạy cao, cho kết quả cụ thể và nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ DNA, Realtime PCR có thể phát hiện ra độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là có thể loại cung cấp thông tin khi phản ứng vừa kết thúc, điều này rất quan trọng trong trƣờng hợp xảy ra sự cố. Realtime PCR cung cấp sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố, do đó có thể rất hữu ích trong việc nghiên cứu, dự đoán và phòng chóng dịch bệnh. Tuy nhiên bài nghiên cứu chƣa thực hiện khảo sát nồng độ mồi cho hai quy trình PCR1, PCR2. Cần phải thực hiện thêm thí nghiệm này để hoàn thiện hơn 2 quy trình này. Trong thí nghiệm pha loãng nồng độ, chỉ thực hiện pha loãng bậc 10 nên tiến hành thêm pha loãng bậc 2 để nâng cao độ chính xác cho quy trình. 31
  41. CHƢƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang 209-214 [2]Dịch tể học các bệnh truyền nhiễm phổ biến, NXB y học, 2012, trang212-214 [3]PGS. TS. Lê Văn Phùng. Vi Khuẩn Y Học. Vụ Khoa học và Đào tạo, 2009, trang 126 [4]PGS.TS Lê Văn Phủng. Vi sinh Y học. Vụ khoa học và đào tạo. 2009, trang 130 [5] Xét nghiệm và chuẩn đoán vi khuẩn, NXB y học, 2012, trang105-107 [6]Vi sinh vật gây nhiễm trùng cơ quan (Sách đào tạo Bác sĩ chuyên khoa I dịch tễ học thực địa), NXB Y học, 2012, trang 12 Tài liệu nƣớc ngoài: [7] DANIEL HAUSER, MICHEL R. POPOFF, MARTINE KIREDJIAN, PATRICE BOQUET AND FRANOIS BIMET. Polymerase Chain Reaction Assay for Diagnosis of Potentially Toxinogenic Corynebacterium diphtheriae Strains: Correlation with ADP-Ribosylation Activity Assay., Journal of Clinical Microbiology OCt. 1993, p. 2720-2723 [8] Espy, M. J., et al. "Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing." Clinical microbiology reviews 19.1 (2006): 165-256. [9] Hiroshi Nakao, Tanja Popovic . Development of a Direct PCR Assay for Detection of the Diphtheria Toxin Gene. Journal of Clinical Microbiology. , July 1997, p. 1651–1655. 0095-1137/97/$04.0010 [10]Kobaidze, Ketevan, et al. "Direct polymerase chain reaction for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains from the Republic of Georgia after prolonged storage." Journal of Infectious Diseases 181.Supplement_1 (2000): S152-S155. [11] Mancini, Fabiola, et al. "Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays." Diagnostic microbiology and infectious disease 73.2 (2012): 111-120. 32
  42. [12] Young, T. Kue. Population health: concepts and methods. Oxford University Press, USA, 2005 [13]Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U. Rapid Detection and Molecular Differentiation of Toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Strains by LightCycler PCR . Journal of Clinical Microbiology. 2011;49(7):2485-2489. doi:10.1128/JCM.00452-11 [14]Sing A, Hogardt M, Bierschenk S, Heesemann J. Detection of Differences in the Nucleotide and Amino Acid Sequences of Diphtheria Toxin from Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans Causing Extrapharyngeal Infections. Journal of Clinical Microbiology. 2003;41(10):4848- 4851. doi:10.1128/JCM.41.10.4848-4851.2003. Tài liệu từ internet [15] 33
  43. CHƢƠNG 7: PHỤ LỤC Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi DT1, DT2 Lad 373 377 378 379 380 381 + _ - 382 383 384 385 386 387 + lad 388 389 390 391 392 393 + - __ - - 394 395 396 397 398 399 + lad + 400 401 402 403 404 405 - Lad 406 407 408 409 410 411 412 + - 34
  44. - 418 419 + lad Kết quả chạy điện di mẫu của phƣơng pháp PCR dùng cặp mồi Tox1, Tox2 lad + 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 - 35
  45. Lad + 412 417 418 419 - Kết quả chạy Realtime PCR trên mẫu: 378 Chứng dương Hình chạy mẫu 16-373CD, 16-377CD, 16-378CD, 16-379CD, 16-380CD, 16- 381CD Chứng dương 389 393 386 Hình chạy mẫu 16-382CD, 16-383CD, 16-384CD, 16-385CD, 16-386CD, 16- 387CD, 16-388CD, 16-389CD, 16-390CD, 16-391CD, 5616-392CD, 16-393CD, 16-394CD 36
  46. Chứng dương Hình chạy mẫu 16-394CD, 16-395CD, 16-396CD, 16-397CD, 16-398CD, 16- 399CD, 16-400CD, 16-401CD, 16-402CD, 16-403CD, 16-404CD Chứng dương 418 419 Hình chạy mẫu 16-405CD, 16-406CD, 16-407CD, 16-408CD, 16-409CD, 16-410CD, 16-418CD, 16-419CD 37