Đồ án Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn

73 trang thiennha21 13/04/2022 5560

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_sang_loc_va_dinh_danh_cac_chung_vi_khuan_quang_hop_co.pdf

Nội dung text: Đồ án Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn

Đồ Án Tốt Nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG HẤP THU MUỐI VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG GIẢM NHIỄM MẶN Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh HVCH. Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Châu Thị Thùy Linh MSSV: 1411100757 Lớp: 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018
Đồ Án Tốt Nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Quốc Khánh và HVCH. Ngô Đức Duy, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tích trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kì nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong đồ án này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Viện Khoa học ứng dụng Hutech và trước Ban Giám Hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Châu Thị Thùy Linh
Đồ Án Tốt Nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ẢNH ii DANH MỤC BẢNG iii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4 3. Mục đích nghiên cứu 6 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 6 5. Phương pháp nghiên cứu 6 6. Các kết quả đạt được 6 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay 8 1.1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam 8 1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn 9 1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay 10 1.2 Các cơ chế khử muối 12 1.2.1 Cơ chế khử muối trong tự nhiên 12 1.2.2 Cơ chế khử muối của thực vật 12 1.2.3 Cơ chế khử muối của động vật 13 1.2.4 Cơ chế khử muối của vi sinh vật 14 1.3 Giới thiệu về nhóm vi khuẩn quang hợp 15 1.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 17 1.4.1 Nguyên tắc 17
Đồ Án Tốt Nghiệp 1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật 17 1.4.3 PCR trong định danh vi sinh vật 18 1.4.4 Xây dựng cây phát sinh loài 21 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 22 2.2.2 Giống vi khuẩn 22 2.2.3 Hóa chất 22 2.2.4 Các phần mềm sử dụng 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 24 2.3.2 Thu mẫu 25 2.3.3 Tăng sinh 27 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp 27 2.3.5 Bảo quản 28 2.3.6 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn 28 2.3.7 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thu mặn 28 2.3.8 Định danh các chủng vi khuẩn 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 3.1 Kết quả tăng sinh của vi khuẩn 32 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn 33 3.3 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn 36 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn 39 3.5 Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ mặn 42 3.6 Định danh 45 3.6.1 Ly trích, thu nhận DNA 44
Đồ Án Tốt Nghiệp 3.6.2 Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR 45 3.6.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 53
Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BIM Basic Isolation Media FO Forward Osmosis GM Glutamate – Malate IC Ion Exchange NSSW Nutrient Supplemented Seawater RO Reverse Osmosis SSI Rhodobacter Sphaeroides i
Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơ chế dung nạp muối trong thực vật: sự hình thành tinh thể trên lá của Avicennia germinans (A) và lá Atriplex (B) 13 Hình 1.2. Giải thích nguyên nhân sự hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng (Halorhodopsin) do tác động của ánh sáng là đặc trưng của Cl-. 14 Hình 2.1. Mô phỏng vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông 25 Hình 2.2. Một góc bản đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên và vị trí lấy mẫu. 26 Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 30 Hình 3.1. Kết quả mẫu RL19 và mẫu RL6 tăng sinh thành công. 32 Hình 3.2. Kết quả phân lập sau 7 ngày trên môi trường thạch BIM của chủng CM24 (hình trái) và kết quả làm thuần của chủng CM24 đang chuyển dần sang đỏ sau 5 – 7 ngày (hình phải). 35 Hình 3.3. Kết quả phân lập trên môi trường thạch BIM của một số chủng vi khuẩn. 35 Hình 3.4. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn quang hợp phân lập được dưới vật kính 100X. 37 Hình 3.5. Chủng RL1 có thể phát triển ở mọi nồng độ muối. Nhưng ở nồng độ muối 20‰ thì sự phát triển vượt trội hơn ở các nồng độ muối khác, giá trị OD660 đạt 0,504 sau 7 ngày khảo sát. 39 Hình 3.6. Chủng RL8.1 phát tốt ở mọi nồng độ nhưng ở nồng độ muối 10, 15, 20‰ có sự phát triển cao hơn hẳn, giá trị OD660 ở nồng độ 10‰ đạt 0,824 sau 7 ngày khảo sát. 39 Hình 3.7. Chủng 34.3 phát triển tốt ở mọi nồng độ, chúng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối 5‰, giá trị OD660 đạt 0,666 sau 4 ngày và ở nồng độ muối 20%, giá trị OD660 đạt 0,658 sau 7 ngày khảo sát. 40 ii
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.8. Chủng 24.1 phát triển tốt ở mọi nồng đồ muối, chúng phát triển ổn định và tốt nhất, ờ nồng độ 5‰ giá trị OD660 đạt 0,868, nồng độ 20% giá trị OD660 đạt 0,585 sau 7 ngày khảo sát. 40 Hình 3.9. Nồng độ muối của các chủng vi khuẩn (‰) sau khi kiểm tra. 43 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. 44 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% 45 Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA trên gel agarose 1% sau khi tinh sạch. 45 iii
Đồ Án Tốt Nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các tính chất của vi khuẩn quang hợp 16 Bảng 1.2 Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA 20 Bảng 3.1. Giá trị pH của các mẫu tăng sinh thành công ở tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau 31 Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn đã phân lập được. 33 Bảng 3.3 Kết quả nhuộm Gram của các chủng. 36 Bảng 3.4 Giá trị OD660nm của các chủng ở độ mặn 20‰ sau 7 ngày. 41 Bảng 3.5. Giá trị OD660 và mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn sau 48 giờ 42 iv
Đồ Án Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Theo báo cáo của Tổ chức Phát triển Nước Thế giới của Liên Hiệp Quốc (The United Nations World Water Development) có khoảng 22% nước dùng cho công nghiệp, 8% nước dùng cho sinh hoạt của con người và 70% nước dùng cho nông nghiệp. Nhưng có tới trên 90% nước dùng cho nông nghiệp phần lớn ở các nước kém phát triển nhất (FAO, 2011a) mà không có các biện pháp sử dụng hiệu quả hay tiết kiệm, bên cạnh đó dự kiến tiêu thụ nước cho nông nghiệp sẽ tăng khoảng 20% toàn cầu vào năm 2050 (WWAP, 2012). Rất nhiều nguyên nhân gây ra sự ô nhiễm nước nông nghiệp ngày càng gia tăng, trong đó ô nhiễm trầm trọng nhất hiện nay là sự xâm nhiễm mặn do biến đổi khí hậu và nước biển dâng. Với số liệu thống kê hiện nay cho thấy rằng, có ba phần tư bề mặt Trái đất được bao phủ bởi nước, hơn 97% lượng nước ở dạng nước mặn không thể sử dụng trực tiếp cho ăn uống hoặc nông nghiệp. Trong 3% nước ngọt còn lại thì chỉ có khoảng 0,5% là có sẵn dưới dạng nước ngọt nhưng không phân bố đều trên toàn thế giới. Thêm vào đó là dân số tăng nhanh, sản xuất nông nghiệp, công nghiệp phát triển ồ ạt và biến đổi khí hậu đã gây ra nhiều vấn đề về môi trường. Một trong những vấn đề môi trường phổ biến nhất xảy ra là xâm nhập mặn vào vùng đất sản xuất nông nghiệp (Freeze và Cherry 1979; Fang 1997; Todd and Mays 2005). Sự xâm nhập từ nước biển là một mối quan tâm toàn cầu nghiêm trọng gặp phải hiện nay tại các vùng lãnh thổ ven biển như Bắc Phi, Trung Đông, Bờ biển Địa Trung Hải, Trung Quốc, Mexico, Đại Tây Dương, Hoa Kỳ và Việt Nam. Trong hàng triệu năm qua, các vi sinh vật – bậc thầy thích ứng, đã sống sót trên trái đất mà không phải sử dụng quá nhiều năng lượng và tài nguyên cũng như không ảnh hưởng đến môi trường sống. Cụ thể, khử muối bằng năng lượng mặt trời thông qua các vi khuẩn quang hợp là một cơ hội có tiềm năng để khai thác mục đích này. Các vi khuẩn 1
Đồ Án Tốt Nghiệp quang hợp đặc biệt có thể sinh ra một lượng sinh khối lớn trong nước lợ, nước biển và được sử dụng như một bộ trao đổi ion thông qua các kênh protein màng. Để giải quyết bài toán làm sao giảm mặn trong đất và nước nông nghiệp là rất quan trọng và cần thiết. Do vậy, việc đầu tiên là phải có bộ sưu tập chủng vi sinh nói chung và chủng vi khuẩn quang hợp nói riêng. Cho nên đồ án này sẽ bước đầu “Sàng lọc, định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng giảm nhiễm mặn”. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Khác với các chất gây ô nhiễm hữu cơ khác, các kim loại nặng nguy hại đa số không thể phá hủy, vì chúng không thể bị suy thoái hóa học hoặc sinh học. Thậm chí tệ hơn là một số kim loại nặng có thể tích tụ dọc theo chuỗi thức ăn và cuối cùng tích lũy trong cơ thể con người D.E. Crowley và cs (1991), M.M. Lasat và cs (1996). Do đó, các nghiên cứu tập trung nhiều vào những năm qua để khắc phục các loại đất bị ô nhiễm, trong đó việc sử dụng thực vật và vi khuẩn để loại bỏ các ion kim loại độc hại đặc biệt có kích thước lớn N.S. Pence và cs (2000), R.K. Mehra và ca (1991) và D.R. Winge và cs (1985). Thông thường nếu một cây có thể tích lũy hơn 1000 mg/kg (hoặc 1000 ppm) Cu, Co, Cr, Ni hoặc Pb, hoặc hơn 10.000 mg/kg (hoặc 10.000 ppm) của Mn hoặc Zn, nó được xem là nhiễm kim loại nặng quá cao S. Loeffler và cs (1989). Vi khuẩn có diện tích bề mặt riêng lớn hơn và hiệu quả hơn để kích hoạt và loại bỏ kim loại nặng. Tuy nhiên, hiện nay hiện tượng nhiễm mặn hay stress muối là một trong những yếu tố nghiêm trọng nhất làm hạn chế năng suất lúa vì nó ảnh hưởng xấu đến số lượng và chất lượng của cây trồng (Sahi et al. 2006). Muối ảnh hưởng đến hầu như tất cả các phần của sinh lý học thực vật ở cả cấp độ thực vật và tế bào thông qua áp suất thẩm thấu và ion (Khalid et al. 2010). Do đó, độ mặn có hại cho tất cả các giai đoạn của cây trồng từ nảy mầm hạt giống, tăng trưởng cây con, phát triển, ra hoa và hoa quả và cuối cùng nó làm giảm sản lượng kinh tế và chất lượng của sản phẩm (Nakhoda et al. 2012). 2
Đồ Án Tốt Nghiệp Chính vì thế, mà những năm gần đây đã và đang có những nghiên cứu tập trung về nhóm vi khuẩn quang dưỡng có khả năng loại bỏ muối như nghiên cứu mới nhất và hiệu quả nhất là công bố của Kei Sasaki và cs (2017), việc ứng dụng vi sinh hấp thu độ mặn, kết quả đạt được từ nghiên cứu này là việc loại bỏ Na từ nước biển bằng cách sử dụng hai chủng vi khuẩn quang hợp Rhodobacter sphaeroides SSI và Rhodovulum sp đều phát triển tốt trong môi trường GM (Glutamate-Malate ) có 3% NaCl. Trong đó chủng Rhodobacter sphaeroides SSI được chứng minh là tăng trưởng tốt, khả năng loại bỏ Na tối đa là 39,3% trong điều kiện có ánh sáng và 36,7% trong điều kiện tối. Còn chủng Rhodovulum sp. được chứng minh là phát triển tốt có tỷ lệ loại bỏ Na tối đa là 64,9% bởi Rhodovulum sp cả hai điều kiện sáng và tối sau hai ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, vấn đề lớn xảy ra là sau khoảng 2 đến 3 ngày nuôi cấy tiếp theo thì hiện tượng Na quay trở lại môi trường do quá trinh chuyển điện tử và trao đổi chất. Còn trong môi trường bổ sung dinh dưỡng khác là môi trường NSSW (Nutrient Supplemented SeaWater) có 5.0g/l Glucose và 2.0g/l Peptone thí nghiệm trong 8 ngày cho thấy rằng. Giai đoạn 4 ngày đầu thì cho thấy chủng Rhodobacter sphaeroides SSI loại bỏ tới 30,3% Na sau 4 ngày nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng và Rhodovulum sp. lên tới 48,9%, trong cả hai trường hợp này hầu như Na được hấp thụ hoàn toàn mà không có trường hợp trả lại môi trường và kết quả tương tự đã được quan sát dưới các điều kiện tối. Giai đoạn 4 ngày tiếp theo thì dịch nuôi cấy được li tâm và tách Rhodovulum sp. tách ra khỏi dịch nuôi, sau đó cấy chủng Rhodobacter sphaeroides SSI vào dịch trên nuôi tiếp trong điều kiện tối thì lượng Na cũng sẽ hấp thu thêm.[13] Nghiên cứu của Panwichian và cs (2010) về tỷ lệ loại bỏ các kim loại nặng và natri từ những chủng vi khuẩn quang dưỡng được phân lập mới từ những ao nuôi tôm nhiễm kim loại nặng ở 3 tỉnh phía Nam của Thailand như tỉnh Nakhon Si Thammarat, Patthalung và Songkhla xung quanh khu vực hồ Basin (Songkhla Lake Basin). Kết quả đa số cho thấy từ 120 chủng được phân lập ở 31 ao nuôi tôm cho thấy việc loại bỏ kim loại nặng như Pb, Cu, Cd, Zn không cao lắm. Tuy nhiên, có được hai chủng NW16 và KMS24 có khả năng làm giảm nhóm kim loại nặng và Na như sau: 39% Pb, 20% Cu, 7% Cd, 5% Zn và 31% 3
Đồ Án Tốt Nghiệp Na từ nước có nồng độ kim loại nặng cao và khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường 3% NaCl có ánh sáng và trong tối. Tuy nhiên, chủng NW16 loại bỏ kim loại nặng tốt hơn chủng KMS24, nhưng ngược lại chủng KMS24 sinh trưởng tốt trong cả hai điều kiện môi trường.[26] Theo khảo sát ứng dụng chủng Rhodopseudomonas palustris TK103, Rhodopseudomonas palustris PP803 và Rhodopseudomonas palustris P1 của Thanawan Kantha và cs (2015), kết quả họ đề xuất sử dụng và phối trộn với rơm và than trấu để làm phân bón cho ruộng lúa với nồng độ gây stress muối khoảng 0,25 % NaCl và làm giảm khí gây hiệu ứng nhà kính như CH4 và CO2 sinh ra từ ruộng lúa. Kết quả cho thấy chủng Rhodopseudomonas palustris PP803 làm cho hạt gạo nẩy mần phát triển tốt như sinh khối và độ dài của rể trong môi trường đất bị stress muối so với mẫu đối chúng là chỉ có nước. Ngoài ra trong mô hình nghiên cứu đồng ruộng dưới điều kiện ánh sáng 10 ngày ước lượng nồng độ tế bào chủng Rhodopseudomonas palustris PP803 dao động từ 6,7 – 6,8 CFU/ ml và làm giảm 100% CH4 và 47% CO2.[25] 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam và khu vực ĐBSCL được thế giới đánh giá là một trong những nơi bị ảnh hưởng của biến đổi khí hậu dẫn tới xâm nhiễm mặn vào trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và sẽ ảnh hưởng to lớn trong tương lai vùng lúa gạo của thế giới. Điều này dẫn đến ảnh hưởng không nhỏ tới an ninh lương thực trong nước và toàn cầu. Tuy nhiên, hiện nay đa số những nghiên cứu thích ứng tới hiện tượng nhiễm mặn là chủ động chọn lọc giống cây trồng, chuyển đổi vật nuôi và thay đổi mục đích sử dụng đất. Trong đó đã có một số kết quả nghiên cứu về lúa và giống cây trồng chịu mặn như nghiên cứu chọn tạo được các giống lúa mới đạt tiêu chuẩn chịu mặn và phẩm chất tốt sau như giống lúa OM5464, OM5166 được công nhận sản xuất thử nghiệm (Trần Thị Cúc Hòa và cs (2000)) Một nghiên cứu khác cũng được tiến hành để kiểm tra khả năng chịu mặn theo phương pháp của IRRI, 1997. Kết quả đánh giá cấp chống chịu mặn của 5 giống lúa sau 16 ngày thử mặn, giống Đốc Phụng, Lúa Sỏi, Nàng Quớt Biển có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, giống Một Bụi Hồng có khả năng chịu 4
Đồ Án Tốt Nghiệp mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰ khi giống chuẩn nhiễm IR28 ở cấp 9 (rất nhiễm). Giống CTUS1 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 20,43%, hàm lượng protein 7,33%. Giống CTUS17 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 12,5‰, hàm lượng amylose là 26,20%, hàm lượng protein là 7,3%. CTUS4 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 (chống chịu trung bình) ở độ mặn 10‰, hàm lượng amylose 18,00%, hàm lượng protein là 9,05%. (Quan Thị Ái Liên 2012). Kết quả công bố của Điêu Thị Mai Hoa và cs Giống lúa OM6976- Saltol có khả năng chịu mặn NaCl 150mM ở mức khá (điểm 3) trong khi giống gốc OM6976 mẫn cảm mặn (điểm 7). Giống lúa OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng ở cả giai đoạn nảy mầm và cây con trong điều kiện mặn tốt hơn hẳn so với giống OM6979. Ở nồng độ muối cao (NaCl 150 mM), dòng lúa mang gen chịu mặn OM6976-Saltol có khả năng sinh trưởng mầm, sinh trưởng cây con tốt hơn hẳn so với giống gốc OM6976 không mang gen Saltol. Theo tiêu chuẩn của IRIR1997, dòng OM6976-Saltol thể hiện khả năng chịu mặn mức khá ở nồng độ NaCl 150 mM. Tuy có nhiều nghiên cứu về giống lúa chịu mặn để thích ứng kịp thời trong sản xuất lúa gạo phù hợp với sự biến đổi khí hậu dẫn đến xâm nhiễm mặn trong vùng đất sản xuất nông nghiệp. Nhưng hiện nay chưa có một công bố khoa học nào liên quan tới quá trình loại muối từ nhóm vi sinh vật nói chung và nhóm vi khuẩn quang dưỡng nói riêng được phân lập và nghiên cứu tại Việt Nam nhằm hướng tới úng dụng trong việc giảm mặn cho những vùng đất và nước bị xâm nhiễm mặn. Chính vì thế, trước tiên, nhóm nghiên cứu bước đầu mong muốn phân lập, sàn lọc để tìm ra những chủng vi khuẩn quang dưỡng phù hợp với điều kiện nhiệt đới của nước ta, cho nên định hướng Đề tài KHCN “Sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn” nhằm góp phần vào định hướng phát triển nông nghiệp bền vững và chủ động ứng phó giải quyết được một phần nào bài toán xâm nhiễm mặn do biến đổi khi hậu ngày càng khóc liệt ở ĐBSCL nói riêng và Việt Nam nói chung. 5
Đồ Án Tốt Nghiệp 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, sàng lọc và định danh các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối và định hướng ứng dụng xử lý giảm mặn 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập một số vi khuẩn quang hợp tại Long An và Cà Mau. Định danh vi khuẩn quang hợp dựa theo hình thái học và sinh học phân tử. Khảo sát khả năng chịu mặn và hấp thu mặn của vi khuẩn quang hợp. 4. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu nước tại xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An, huyện Đức Hòa - Long An và rừng ngập mặn Nhưng Miên, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau. - Phân lập vi khuẩn trên môi trường BIM thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc. - Khảo sát khả năng chịu mặn bằng phương pháp đo OD660nm. - Khảo sát khả năng khử mặn bằng phương pháp màng sinh học. - Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB). - Phương pháp PCR dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. - Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa. - Đề tài sử dụng các phần mềm như ChromasPro 1.5.0.0, Mega5 5.0.1.120, seaview 4.32.0.0. - Ngân hàng gen - Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet. 5. Các kết quả đạt được Từ 63 mẫu thu được từ Long An và Cà Mau phân lập được 44 chủng vi khuẩn. Chọn ra 3 chủng hấp thu mặn cao nhất để gửi định danh. 6. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Đề tài gồm 4 chương Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 6
Đồ Án Tốt Nghiệp Chương 3: Kết quả và biện luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 7
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình xâm nhập mặn ở Việt Nam và các hướng giải quyết hiện nay 1.1.1 Tình hình xâm nhập ở Việt Nam Theo dữ liệu đánh giá trong năm 2015 so với 2016 của Viện Khoa học Thủy lợi Miền Nam (VKHTLMN/2017) cho thấy rằng hiện trạng xâm nhập mặn vùng cửa sông Cửu Long như sau: Khu vực sông Vàm Cỏ: Độ mặn năm 2016 lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,7 - 7,4 g/l, xâm nhập mặn sâu vào đất liền khoảng 90 - 93 km. Khu vực các cửa sông thuộc sông Tiền: Năm 2016 có độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 1,5 - 8,2 g/l, sự xâm mặn vào khoảng 45 - 65km. Khu vực các cửa sông thuộc sông Hậu: Độ mặn lớn nhất nhất so với cùng kỳ năm 2015, cao hơn từ 2,8 - 6,4 g/l, dộ nhiễm mặn sâu vào khoảng 55 - 60 km. Khu vực trên sông Cái Lớn: Độ mặn lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 cao hơn từ 4,8 - 7,6 g/l, chiều sâu xâm nhập mặn lớn nhất khoảng 60-65 km. Trong năm 2017 tại một số trạm điển hình vùng cửa sông Cửu Long như dưới đây: Tại Vàm Kênh, Vàm Giồng và Xuân Hòa trên sông Cửa Tiểu có độ mặn 23,5g/l, 3,6g/l và 0,6g/l thất hơn một chút so với cùng kỳ năm 2016 từ 0,1- 3,9g/L. Tại Bình Đại, Lộc Thuận và Giao Hòa trên sông Cửa Đại có độ mặn 25,6g/l, 14,2g/l và 3,2 g/l thấp hơn so với năm 2016 từ 1,4 - 2,6g/l. Tại Bến Trại, Trà Vinh trên sông Cổ Chiên có độ mặn 25,2g/l, 9,6g/l. Tại An Thuận, Sơn Đốc trên sông Hàm Luông có độ mặn là 29,0g/l, 13,1g/l. Tại Trần Đề, Đại Ngãi trên sông Hậu có độ mặn 20,3g/l và so với cùng kỳ năm 2016 thấp hơn 7,0g/l, 7,2g/l. Đa số độ mặn so với cùng kỳ 2016 điều có giảm chút ít, cũng do một phần năm 2017 lượng mưa trong năm nhiều so với năm 2016 (VKHTLNM 2017). Cho nên dư lượng độ mặn đã để lại trong vùng đất sản xuất nông nghiệp và ăn sâu vào trong đất liền từ các sông như: Sông Vàm Cỏ, sông Tiền, sông Cửa Tiểu, sông Cửa Đại, sông Hàm Luông, sông Cổ Chiên, sông Hậu và sông Cái Lớn đã ảnh hưởng cực kỳ to lớn tới đời sống sinh hoạt của người dân và đặc biệt là vùng sản xuất cây ăn trái và lúa gạo của Việt Nam là rất nghiêm trọng. Bên cạnh đó những kết quả đã công bố cũng như dự báo cho thấy tỷ lệ dân số nông thôn bị ảnh hưởng bởi xâm nhập mặn tăng từ 39.5% tại 8
Đồ Án Tốt Nghiệp thời điểm 2012 lên 41.4, 45.3 và 47.6% vào các năm 2020, 2030 và 2050 ( Đoàn Như Hà, 2014). 1.1.2 Nguyên nhân gây ra xâm nhập mặn Trước tiên, xem sơ lược tiêu chuẩn gọi là nước mặn và một số giải pháp xử lý khử nước mặn thành nước ngọt hiện nay trên thế giới. Nước biển chứa khoảng 35g muối trong một lít (tức 35‰) và theo tiêu chuẩn độ mặn trong nước uống là < 0,25‰. Trong đó nước có độ mặn 0,14‰ thì không ảnh hưởng xấu tới hoa màu. Có vài loại hoa màu chịu đựng được nước có độ mặn 0,36‰. Trên mức này, thực vật thông thường có dấu hiệu suy thoái hay bị chết. Tuy nhiên, có khoảng 3.500 loài thực vật chịu đựng được nước mặn - gọi là nhóm họ halophytes, trong số này thực vật trong rừng ngập mặn, đứng đầu chịu mặn là cây Mấm (Avicennia alba). Lúa thông thường không thể canh tác khi nước có độ mặn quá 4‰. Việc Trái Đất ngày càng nóng lên bởi hàng loạt các khí gây hiệu ứng nhà kính phát sinh từ các hoạt động công nghiệp, giao thông và sinh hoạt của con người (trong đó nguyên nhân đến từ hoạt động của tự nhiên chiếm phần nhỏ (bao gồm hoạt động của núi lửa, cháy rừng ) đã khiến băng ở hai cực và nhiều khu vực khác trên thế giới tan chảy mạnh, gây nên đại nạn nước biển dâng. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đăng tải trên Tạp chí Scientific Reports, biến đổi khí hậu đang khiến mực nước biển dâng trung bình 4mm mỗi năm. Việc nước biển dâng cao tác động trực tiếp đến các quốc gia ven biển. Không chỉ khiến các quốc gia này hứng chịu nhiều cơn bão mạnh, nước biển xâm lấn còn khiến đất ngập mặn trên quy mô lớn. Theo các chuyên gia đánh giá, Việt Nam là quốc gia có mực nước dâng cao hơn mức trung bình toàn cầu. Điều này đồng nghĩa với việc mức độ phì nhiêu của vùng châu thổ lớn nhất nước (ĐBSCL) sẽ giảm dần diện tích. Theo số liệu thống kê của Viện Quy hoạch Thủy lợi miền Nam, hiện tượng sạt lở đã và đang xảy ra ngày một nghiêm trọng ở hai bên bờ sông Tiền và sông Hậu (vùng thượng và hạ châu thổ), nhất là vào khoảng thời gian đầu và cuối mùa mưa lũ, tác động đến đời sống và sản xuất của khoảng 19 triệu dân tại đây. 9
Đồ Án Tốt Nghiệp Cà Mau được xem là một trong những tỉnh chịu tác động nặng nề nhất do biến đổi khí hậu và nước biển dâng. (Có nơi, nước biển cách con lộ ở Cà Mau chỉ vài chục mét). Mỗi năm, biển lấn sâu vào Cà Mau 15m, có khu vực lên đến 50m. Bên cạnh nguyên nhân nước biển dâng cao, thì các hoạt động khai thác tự nhiên (như khai thác cát ở sông và khai thác nước ngầm) một cách tràn lan của con người cũng là những nguyên nhân khiến cho những thách thức mà ĐBSCL đang đối mặt thêm nặng nề. 1.1.3 Các cách khắc phục xâm nhập mặn hiện nay Quyết định số 1397/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về Quy hoạch phát triển thủy lợi ĐBSCL giai đoạn 2012 - 2020 và định hướng đến 2050 trong điều kiện biến đổi khí hậu, nước biển dâng đã đặt mục tiêu đến năm 2050 cần đảm bảo an toàn dân sinh, sản xuất, cơ sở hạ tầng cho khoảng 32 triệu dân và chủ động ứng phó với các tác động của biến đổi khí hậu như nước biển dâng, xâm nhập mặn. Để làm rõ thực trạng xâm nhập mặn và những giải pháp phát triển bền vững nhằm hạn chế xâm nhập mặn tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là những nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất của hiện tượng này. Từ đó có nhiều đề xuất giải pháp để ứng phó với xâm nhập mặn ở ĐBSCL như sau: Thứ 1: Tăng cường quan trắc, giám sát, nâng cao năng lực dự báo mặn. Thứ 2: Tăng cường hợp tác quốc tế với các nước trong hội Mekong và Trung Quốc; phải hợp tác chặt chẽ với các nước trong lưu vực sông Mekong. Thứ 3: Điều chỉnh quy hoạch tổng thể và sản xuất nông nghiệp cho khu vực. Thứ 4: Lựa chọn cây trồng vật nuôi thích nghi với điều kiện khô hạn và môi trường nước mặn, nước lợ. Thứ 5: Kiện toàn hệ thống đê và thành lập nhiều khu tứ giác trước hết cần nhân rộng mô hình thành công ở Tứ giác Long Xuyên và ngọt hoá Gò Công. Thứ 6: Xây dựng và hoàn thiện hệ thống công trình giữ nước ngọt trong đồng bằng đòi hỏi phải xây dựng và hoàn thiện một hệ thống công trình giữ nước ngọt cho toàn đồng bằng. Thứ 7: Xây dựng đập ngầm như đập Ba Lai, trên tất cả các cửa sông ở ĐBSCL có các hạn chế. Thứ 8: Xây dựng hệ thống đê biển, đê sông Đây là một dự án lâu dài, bền vững dọc theo biển Đông và biển Tây để ứng phó với mực nước biển dâng cao. Thứ 9: Quản lý tổng hợp tài nguyên nước khu vực ĐBSCL và lưu vực sông Mekong. 10
Đồ Án Tốt Nghiệp Từ những giải pháp trên đã ít nhiều đem lại hiệu quả ngăn chặn sự nhiễm mặn trong thời gian qua. Tuy nhiên, đa số điều bị động và phục thuộc vào nhiều về yếu tố tự nhiên và điều kiện từ các nước láng giềng như là tích trữ nước, chờ mưa rửa trôi độ mặn và chờ sự kết hợp điều tiết từ Biển Hồ của Campuchia, các đập thủy lợi trên sông Mekong và cả nguồn nước từ thượng nguồn từ Trung Quốc (BKHCN 2016). Nhờ tiến bộ công nghệ trong ngành khử mặn nước biển trong những thập kỷ qua đã đưa ra nhiều giải pháp cho vấn đề này và những nước phát triển mạnh hàng đầu như Israel, Singapo và Mỹ các phương pháp được ứng dụng cho khử mặn từ nước biển như: chưng cất nhanh nhiều tầng (MSF/multistage flash distillation), chưng cất nén hơi (VCD/vapor compression distillation), thẩm thấu ngược (RO/reverse osmosis), thẩm thấu tới (FO/forward osmosis), trao đổi ion (IC/Ion exchange) và điện thẩm tách (ED/electrodialysis) [19]. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm của mình, nhưng hiện nay phương pháp thẩm thấu ngược (RO) được sử dụng nhiều nhất, vì trang thiết bị dễ thực hiện và ít tiêu hao năng lượng nhất. Nhà máy khử mặn Sorek của Israel ở phía bắc Palmachim được dự đoán sẽ cung cấp tới khoảng 228 triệu m³/ năm, nhà máy Hadera (SWRO) là nhà máy khử muối lớn nhất trên thế giới. Chỉ riêng trong năm 2015, hơn 50% lượng nước cho các hộ gia đình, nông nghiệp và công nghiệp của Israel được sản xuất nhân tạo. Dự kiến trong tương lại không xa thì chương trình khử muối của Israel cung cấp khoảng 35% lượng nước uống của Israel và 70% vào năm 2050 [27]. Còn ở Singapore có kế hoạch để đáp ứng 30% nhu cầu nước trong tương lai vào năm 2060, còn hiện tại thì đáp ứng được 25% nhu cầu nước 2017 của Singapore theo thống kế. Các nhà máy như SingSpring, Tuas (2005) cung cấp 13.000m3/ngày, nhà máy Marina East (2020) 130.000 m3/ngày và Jurong (2020) 130.000 m3/ngày [26]. Tuy nhiên, đa số các phương pháp và ứng dụng trong việc sử lý nước mặn thành nước ngọt điều nhằm mục đích phục vụ cho sinh hoạt ăn uống của con người.Vì giá thành xử lý nước rất cao, đó cũng là một vấn đề khó khăn trong việc ứng dụng cho trồng trọt và nông nghiệp. Do vậy, những nghiên cứu về khả năng loại bỏ Na ra khỏi nước mặn từ các nhóm vi sinh vật rất cần được ưu tiên nhiều hơn cho các nghiên cứu hiện nay. Điều này đã mở 11
Đồ Án Tốt Nghiệp ra một hướng đi mới trong việc “biến” nước mặn thành nước ngọt. Do đó đề tài “Phân lập và định danh chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu mặn” được thực hiện. 1.2 Các cơ chế khử muối Ý tưởng sử dụng trực tiếp sinh vật sống như thực vật thủy sinh, tảo, động vật phù du và vi khuẩn để khử mặn nước biển gần đây đã được nghiên cứu như là một lựa chọn hấp dẫn cho hấp thu mặn nước biển. Trong đó, sử dụng màng sinh học để khử muối được xem như là một phương pháp tiếp cận bền vững mới nổi trong quá trình khử sinh học. 1.2.2 Cơ chế khử muối trong tự nhiên Natri và clorua là các ion hòa tan nhiều nhất trong nước và đất mặn [4]. Chúng đóng vai trò sinh lý quan trọng trong hầu hết các sinh vật sống. Tuy nhiên, nồng độ natri cao trong các tế bào có thể dẫn đến tổn thương protein và cản trở sự trao đổi chất [7]. Do đó, các sinh vật sống đã sử dụng các cách khác nhau để cân bằng nồng độ natri [21], trong đó bao gồm: - Sự tắc nghẽn Na+ xâm nhập vào không bào (kháng muối) - Giảm nồng độ Na+ trong không bào (dung nạp muối) qua hệ thống vận chuyển phức tạp qua màng tế bào. 1.2.3 Cơ chế khử muối của thực vật Độ mặn cực cao là một vấn đề nghiêm trọng đối với cây trồng vì nó hạn chế sự hấp thu nước, làm biến tính các enzyme và làm suy giảm cấu tr9úc của đất. Do đó, thực vật dựa vào các cơ chế phức tạp để chống lại các điều kiện mặn [21]. Các cơ chế này thường được phân loại thành tiết muối (ví dụ: Avicennia sp.), tích tụ muối (Atriplex sp.) và loại muối [6, 15]. Cơ chế tiết muối được dựa trên việc xuất muối thông qua các cơ quan bài tiết trong lá cây (Hình 1.1A) [14, 17]. Sự tích lũy muối được quan sát để đảm bảo trên lá của một số chất halophyte (Hình 1.1B) khử muối bằng cách phân chia Na+ và Cl- trong các mô đất. Cơ chế loại trừ muối dựa trên sự tắc nghẽn muối [13] sử dụng các tính năng cụ thể như antiporters. Vi tảo xanh Dunaliella salina là một ví dụ điển hình của các loại cây 12
Đồ Án Tốt Nghiệp không bao gồm muối vì nó có thể tồn tại ở mức cao như 3M NaCl [22] do khả năng ngăn chặn muối cực cao của nó. Khả năng này là do sự hiện diện của một antiporter Na+/H+ trên màng không bào (tonoplast) và H+/ATPase bơm trên màng plasma. Hình 1.1. Cơ chế dung nạp muối trong thực vật: sự hình thành tinh thể trên lá của Avicennia germinans (A) và lá Atriplex (B) 1.2.4 Cơ chế khử muối của động vật Cá biển (ví dụ: Heterodontus portusjacksoni), chim biển (ví dụ: Larus marinus) và một số loài bò sát (ví dụ: Amblyrhynchus cristatus) sử dụng thận và tuyến muối để khử muối [17]. Có rất nhiều ống tiết ở các tuyến muối có đường kính và chiều dài thay đổi tùy thuộc vào sự hấp thu muối của loài này [5]. Tuyến muối cho phép các loài bò sát và chim biển tiết ra một cách hiệu quả độ mặn. Những động vật này sử dụng một loạt các phản ứng phức tạp bao gồm các ion clorua tạo thành một gradient điện, cho phép natri đi qua các điểm nối chặt của các tế bào tiết vào ống dẫn với một lượng nước không đáng kể [9]. 13
Đồ Án Tốt Nghiệp 1.2.5 Cơ chế khử muối của vi sinh vật Hình 1.2. Giải thích nguyên nhân sự hấp thu Na+ thông qua hệ thống bơm ion màng (Halorhodopsin) do tác động của ánh sáng là đặc trưng của Cl-. Cơ chế liên quan tới quá trình hấp thu độ mặn hay còn gọi là hấp thu Na+, có liên quan tới vi sinh vật cơ chế khử muối đối với các sinh vật đơn bào như vi khuẩn, áp lực thẩm thấu cần được kiểm soát khi sống trong điều kiện nước mặn. Do đó, các cơ chế tự nhiên có liên quan nhất trong vi khuẩn halophilic là quá trình điều hòa giữa các kênh Na+ và K+, chủng Halobacillus halophilus, sử dụng điều tiết thích nghi độc đáo với những thay đổi về độ mặn môi trường. Chúng có khả năng tích tụ Cl- nhờ ánh sáng mặt trời kích hoạt làm bơm ion âm Cl- trên màng tế bào mở ra và ion Cl- đi vào trong tế bào chất, từ đó dẫn đến sự chênh lệch điện thế trong màng mang nhiều điện tích âm hơn và ngoài màng mang nhiều điện tích dương hơn xem hình 1.2. Khi điện thế màng chênh lệch trong âm hơn thì lúc ngày kênh ion Na+ sẽ mở ra làm cho quá trình vận chuyển Na+ cũng từ ngoài vào trong màng để cân bằng điện thế màn, sự di chuyển và tích tụ Na+ trong tế bào chất sẽ làm giảm Na+ ngoài màng dẫn đến muối sẽ giảm trong dung dịch, việc giữ Na+ trong màng không cho ra khỏi tế bào để quay lại môi trường sẽ bị được ngăn chặn thông qua sự ức chế sản sinh ATP từ quang hợp. 14
Đồ Án Tốt Nghiệp 1.3 Giới thiệu về nhóm vi khuẩn quang hợp Về mặt phân loại, vi khuẩn quang hợp thuộc ngành vi khuẩn, lớp chân khuẩn, bộ khuẩn ốc hồng. Hiện đã biết vi khuẩn quang hợp của bộ khuẩn này gồm hai bộ phụ, bốn họ, mười chín giống, khoảng 49 loài. Hiện nay, vi khuẩn quang hợp, sử dụng trong nuôi thuỷ sản thông thường phần lớn là một loại vi khuẩn trong họ khuẩn ốc hồng, nhất là khuẩn giả đơn bào hồng ở ao đầm có nhiều. Vi khuẩn quang hợp là loại vi sinh vật trong thuỷ quyển, phân bố rộng rãi ở ruộng nước ao hồ, sông ngòi, hồ, biển và trong đất, đặc biệt là trong đất bùn dưới nước bị vật hữu cơ ô nhiễm số lượng tương đối nhiều. Vi khuẩn quang hợp do sự khác nhau về giống loài, và môi trường mà hình dạng không như nhau, có loại hình que, hình lưỡi liềm, hình tròn, hình cầu Vật bồi dưỡng dịch thể của chúng vì chứa sắc tố khác nhau mà có nhiều màu đỏ, nâu, vàng Ðặc điểm của loại vi khuẩn này là tính thích ứng mạnh, bất kể là trong nước biển hay trong nước ngọt, trong những điều kiện khác nhau có ánh sáng mà không có oxy hoặc tối tăm mà có oxy đều có thể lơị dụng chất hữu cơ (acid béo cấp thấp, amino acid, đường) để phát triển. Trong điều kiện không có oxy, có ánh sáng, có thể lợi dụng các sunfit, phân tử H hoặc vật hữu cơ khác làm thành dioxide carbon CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; trong điều kiện có oxy và tối tăm, chúng có thể lợi dụng vật hữu cơ như acid béo cấp thấp tạo nguồn carbon để tiến hành tác dụng quang hợp. [2] Nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố lục. Chất diệp lục của vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật. VKQH không sử dụng nước là nguồn hidro như thực vật và không tạo sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng sử dụng nguồn hidro là sulfide thiosulfate, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa. Có ba nhóm lớn gồm năm nhóm vi khuẩn quang hợp. Theo đó, vi khuẩn lam khác về cơ bản với bốn nhóm còn lại ở chỗ chúng có sản sinh oxi, bằng cách dùng nước làm chất cho điện tử. Về phần các vi khuẩn tía và vi khuẩn lục thì chúng quang hợp không sản sinh oxi do sử dụng các chất khử như hidro sulfur, lưu huỳnh, hydro và các chất hữu cơ làm 15
Đồ Án Tốt Nghiệp nguồn điện tử để tái tạo NADH và NADPH. Kết quả là chúng không sinh oxi nhưng sinh ra các hạt lưu huỳnh, ở bên trong tế bào (vi khuẩn tía, lưu huỳnh) hoặc bên ngoài tế bào (vi khuẩn lục, lưu huỳnh). Ngoài ra là những khác biệt về các sắc tố quang hợp, nhu cầu dinh dưỡng, quan hệ với oxi [1] Bảng 1.1 Các tính chất của vi khuẩn quang hợp [28] Tính Vi khuẩn lưu huỳnh lục Vi khuẩn không lưu Vi khuẩn lưu huỳnh tía Vi khuẩn không lưu Vi khuẩn lam chất huỳnh lục huỳnh tía Các sắc Bacterioclorophil a và c, Bacterioclorophil a và c Bacterioclorophil a hoặc Bacterioclorophil a hoặc Clorophil a cộng với tố d hoặc e b b các phicobiliprotein quang hợp chính Hình Hệ thống quang hợp là Các clorosom có mặt khi Hệ thống quang hợp Như cột bên trái Các màng được phủ thái của các clorosom, chúng tách vi khuẩn sinh trưởng kị được chứa trong các bằng các phicobilisom các khỏi màng sinh chất khí phức hệ màng hình cầu màng hoặc bản mỏng, phức hệ quang này liên tục với màng hợp sinh chất Chất H, HS, S Hữu cơ và vô cơ: đường, H, HS, S Thường là chất hữu cơ, HO cho aicd amin, acid hữu cơ, các hợp chất lưu huỳnh điện tử H, S khử hoặc H trong quang hợp Sự tích Ngoài tế bào Trong tế bào Đôi khi ngoài tế bào lũy lưu huỳnh Bản Không sinh oxi Không sinh oxi Không sinh oxi Không sinh oxi Sinh oxi (đôi khi chất không sinh oxi tùy của tiện) quang hợp Kiểu Quang dưỡng vô cơ kị khí Thường quang dị dưỡng, Quang tự dưỡng vô cơ, Thường quang dị dưỡng Quang tự dưỡng vô cơ trao đổi bắt buộc đôi khi quang tự dưỡng hiếu khí bắt buộc hữu cơ kị khí, một số hiếu khí chất hoặc hóa dị dưỡng (khi quang tự dưỡng vô cơ chung điều kiện hiếu khí trong tùy tiện (trong bóng tối, bóng tối) hóa dị dưỡng hữu cơ) 16
Đồ Án Tốt Nghiệp Khả Không, một số có bóng Chuyển động trượt Chuyển động nhờ tiên Chuyển động nhờ tiên Không chuyển động năng di khí mao ở đỉnh, một số có mao ở đỉnh hoặc không hoặc chuyển động động chu mao chuyển động; một số có trượt, một số có bóng bóng khí khí. Phần 48 – 58 53 – 55 45- 70 61 – 72 35 – 71 trăm G + C 1.4 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 1.4.1 Nguyên tắc Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease và ribonuclease). 1.4.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng động vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vu cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quy trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp. Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật tự nhiên thường được sử dụng: 17
Đồ Án Tốt Nghiệp - Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao (1.5M NaCl) và ủ mẫu trong 2 – 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammoniumbromide và proteinase K. - Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao. CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có cà hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết. - Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến 65oC. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao. - Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở -65oC trong ba chu kì nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNAt tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. 1.4.3 PCR trong định danh vi sinh vật 1.4.3.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Đây là một kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kỹ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene. PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA 18
Đồ Án Tốt Nghiệp polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [21]. 143.3.2 Ribosome DNA (rDNA) Ribosome DNA (rDNA) là nhóm gene mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. Ribosome DNA được quan tâm đến nghiên cứu vì nó là một gene có nhiều bản sao và đặc biệt là không mã hóa cho một loại protein nào. Các bản sao của gene nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử ribosome DNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật. Ribosome DNA (rDNA) được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gene, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA. 1.4.3.2 Mồi Gene 16S rRNA được sử dụng cho các nghiên cứu phát sinh loài do nó bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn và archaea khác nhau [3]. Carl Woese đi tiên phong trong việc sử dụng rRNA 16S [25]. Một số loài cổ vật nhiệt đới (như Thermoproteales đặt hàng) chứa các intron rRNA 16S nằm trong các khu vực được bảo tồn cao và có thể ảnh hưởng đến quá trình ủ các primer “phổ biến” [11]. Chloroplastic và rRNA ti thể cũng được khuếch đại. 19
Đồ Án Tốt Nghiệp Cặp primer phổ biến nhát được phát minh bởi Weisburg et al và hiện đang được gọi là 27F và 1492R [25]. Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng, amplicon ngắn hơn có thể là cần thiết, ví dụ như cho 454 trình tự hóa học Titanium (500-ish là lý tưởng) cặp primer 27F – 534R phủ V1 đến V3 [27]. Thường 8F được sử dụng thay vì 27F. Hai mồi gần giống nhau, nhưng 27F có M thay vì C, AGAGTTTGATC M TGGCTCAG so với 8F [20]. Bảng 1.2. Các trình tự gene đoạn mồi 16S rRNA Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) 8F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG U1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 928F TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG 336R ACT GCT GCS YCC CGT AGT CT 1100F YAA CGA GCG CAA CCC 337F GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG 907F CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT 785F GGA TTA GAT ACC CTG GTA 805R GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC 533F GTG CCA GCM GCC GCG GTA A 518R GTA TTA CCG CGG CTG CTG G 27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 1492R CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT 1.4.3.4 Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật Hoàng Quốc Khánh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Phạm Thị Lan Thanh thuộc Trường Đại học Lạc Hồng với đề tài “Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng probiotic từ con người”. L. V, K. Hatai và T. Aoki. 2004, “Fusarium incarnatum isolated from black tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease culture in VietNam”. 20
Đồ Án Tốt Nghiệp Nguyễn Thị Thanh Thủy, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên với đề tài “Thiết lập phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Verotoxigenic e.coli (vtec) trong thịt” với phương pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae), các điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong nghiên cứu này có thể được áp dụng để xác định vi khuẩn Verotoxigenic e.coli (VTEC). M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Evensen, P van West và I Skaar 2015, “Saprolegnia diclina IIIA and S.parasitica employ different infection stategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L”. Văn Hồng Cẩm, Phan Thị Thảo, Đặng Thúy Bình với đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn phát sáng gây bệnh trên cá ngựa đen (Hippocampus kuda)”. 1.4.4 Xây dựng cây phát sinh loài Các phương pháp giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gene bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát sinh loài gồm các thành phần như sau: - Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. - Nút giao điểm của các nhánh. - Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại. 21
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian bắt đầu nghiên cứu: ngày 27/02/2018 đến ngày 07/2018 Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, thuộc phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP6, P.Linh Trung, quận Thủ Đức, TP.Hồ Chí Minh. 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm - Máy ly tâm - Erlen 250ml - Máy votex - Đĩa petri - Máy Elisa - Đĩa nuôi cấy 96 giếng - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích - Máy PCR (Sprint Thermo Cycler) - Nồi hấp khử trùng Autoclave - Máy điện di - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu -80oC - Tủ sấy 2.2.2.Giống vi khuẩn Vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn từ ruộng lúa từ xã Nhị Thành, huyện Thủ Thừa, Long An, huyện Đức Hòa - Long An và Liên tiểu khu 167, rừng phòng hộ Nhưng Miên, xã Viên An Đông, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau. 2.2.3 Hóa chất 2.2.3.1 Môi trường tăng sinh và nuôi cấy vi sinh vật ❖ Môi trường BIM (Basic Isolation Media) (NH4)2SO4 1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,2 g NaCl 2 g NaHCO3 5 g Cao nấm men 1,5 g 22
Đồ Án Tốt Nghiệp Glycerol 1,5 g Nước cất 1000 ml Điều chỉnh pH = 7.0 2.2.3.2 Môi trường khảo sát khả năng sinh trưởng ở các độ mặn khác nhau ❖ Môi trường BIM trong đó NaCl được bổ sung để có nồng độ 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40‰. 2.2.3.3 Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử - Đệm CTAB: Tris-Cl 0.2M pH 7.5, NaCl 2M, EDTA 0.05M, CTAB 2%. - P:C:I (25:24:1): Polyphenol – Chloroform – Isoamyl – alcohol. - Isopropanol - Ethanol 70% - 6X Loading dye - TAE (Tris – acetate – EDTA) 1X - Agarose - Cặp mồi phản ứng PCR: Tên mồi 27F 1492R μg/OD260 28 33 Khối lượng phân tử 6149 5785 (μg/umole) OD260 10.20 10 Nồng độ (μM) 100 100 Trình tự (5’ – 3’) AGAGTTTGATCCTGG GGTTACCTTGTTACG CTCAG ACTT 2.2.4 Các phần mềm sử dụng - Dựng đồ thị, chuyển đổi đơn vị, thống kê, sắp xếp các kết quả số liệu thô bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013. - Phần mềm sinh học phân tử MEGA5 dùng để đọc kết quả giải trình tự DNA, dựng cây phát sinh loài 23
Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Thu mẫu nước ruộng/ao nuôi tôm Cấy trang trực tiếp trên Tăng sinh trong môi trường môi trường BIM agar BIM từ 10 – 20 ngày Cấy trang trên môi trường BIM agar Khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, bóng, màu đỏ/hồng/cam/vàng Hình thái: Khảo sát khả năng chịu Gram (-) hình trứng/thẳng/cong mặn Giữ giống trong thạch Vi khuẩn có khả năng nghiêng, chịu mặn cao glycerol lạnh đông Khảo sát khả năng hấp thu mặn Vi khuẩn hấp thụ mặn cao Tách DNA Phản ứng PCR Giải trình tự DNA Định danh 24
Đồ Án Tốt Nghiệp 2.3.2 Thu mẫu 2.3.2.1 Địa điểm thu mẫu Các mẫu nước được thu nhận từ ao ruộng, rừng ngập mặn ở huyện Đức Hòa, thuộc tỉnh Long An và huyện Ngọc Hiển, thuộc tỉnh Cà Mau. Tổng cộng thu được 22 mẫu nước ruộng ở Long An, 41 mẫu nước từ rừng ngập mặn ở Ngọc Hiển, Cà Mau. Các mẫu nước từ ao ruộng thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông, khu vực lấy mẫu chủ yếu ớ ấp 2 và ấp 4, xã Hựu Thạnh. Hình 2.1. Mô phỏng vệ tinh khu vực lấy mẫu, xã Hựu Thạnh thuộc huyện Đức Hòa nằm ở vị trì 10o90’23” vĩ độ Bắc, 106o41’85” Kinh độ Đông Các mẫu từ rừng phòng hộ Nhưng Miên, liên tiểu khu 167 - Viên An Đông, huyện Ngọc Hiển, Cà Mau nằm ở vị trí 8o66’65” vĩ độ Bắc, 105o00’28” Kinh độ Đông. 25
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 2.2. Một góc bản đồ Liên tiểu khu 104 – xã Viên An Đông, rừng phòng hộ Nhưng Miên và vị trí lấy mẫu. 2.3.2.1 Dụng cụ thu mẫu - Thùng xốp chứa mẫu - Bao tay y tế - Ly nhựa - Bao nilon khử trùng 2.3.2.2 Thời gian thu mẫu - Buổi sáng để xác định hướng ánh sáng rọi trực tiếp. 2.3.2.3 Phương pháp lấy mẫu Thu mẫu nước ruộng lúa nơi có ánh sáng mặt trời rọi trực tiếp. Lấy nước và một ít bùn ở mặt nước nông. 2.3.3 Tăng sinh 2.3.3.1 Cấy trang mẫu • Đối với mẫu trực tiếp - Lắc đều mẫu. Hút 1 ml dịch mẫu cho vào eppendorf, tiến hành ly tâm 1000 rpm trong vòng 1 phút. Sau đó, hút 100μl dịch lỏng cho vào đĩa thạch môi trường BIM, tiến hành cấy trang. Đặt các đĩa đã trang ở nơi có ánh sáng. 26
Đồ Án Tốt Nghiệp - Sau 7 – 10 ngày, chọn 1 – 2 khuẩn lạc đặc trưng, có ít nhất một đặc điểm khác nhau về kích thước hoặc màu sắc. Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra môi trường thạch BIM và đặt nơi có ánh sáng. • Đối với mẫu tăng sinh - Lắc đều mẫu. Hút đầy tới vạch ống nghiệm chứa 20ml môi trường BIM. Sau đó, đặt các ống nghiệm ở nơi có ánh sáng trong vòng 10 – 20 ngày. Tiếp theo, pha loãng bằng nước cất ra nồng độ 10-4 và 10-5. Cấy trang các nồng độ pha loãng lên đĩa thạch môi trường BIM. - Sau 7 – 10 ngày, chọn 1 – 2 khuẩn lạc đặc trưng, có ít nhất một đặc điểm khác nhau về kích thước hoặc màu sắc. Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra môi trường thạch BIM và đặt nơi có ánh sáng. 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn quang hợp Tiến hành xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram, khảo sát khả năng chịu mặn. 2.3.5 Bảo quản • Giống thạch nghiêng: Cấy ria giống từ đĩa thạch sang các ống thạch nghiêng BIM. Đặt nơi có ánh sáng. Khi thấy đường sinh khối mọc đều dày đặc thì bảo quản ở 10oC để sử dụng cho các khảo sát sau. Thời gian bảo quản 1 – 2 tháng. • Giống lạnh đông: hút 500μl dịch nuôi cấy 48h (môi trường BIM) của các chủng cho vào eppendorf 1.5ml vô trùng. Tiếp tục cho vào 500μl glycerol 40% (v/v). Vortex trong 5 giây. Bảo quản ở -80oC. Thời gian bảo quản 1 – 2 năm. 2.3.6 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn Nuôi cấy các chủng vi khuẩn đã sàng lọc sơ bộ trong môi trường lỏng BIM có nồng độ NaCl từ 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40 ‰ đặt nơi có ánh sáng. Khả năng tích lũy sinh khối của chủng vi khuẩn được xác định hàng ngày bằng phương pháp đo độ hấp thụ. Từ các ống nghiệm nuôi cấy, hút ra 200 μl dịch bơm vào các giếng nuôi cấy trên đĩa 96. Tiến hành đo OD660. Quan sát trong vòng 8 ngày và lập biểu đồ tăng trưởng. 27
Đồ Án Tốt Nghiệp Nguyên tắc: Khi pha lỏng có nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (opticcal density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng mạnh Vì thế có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu, phổ hấp thụ ánh sáng cực đại của sác tố tế bào được xác định khi quét huyền phù tế bào ở dãy bước sóng từ 220 – 1100 nm bằng máy đo quang phổ. 2.3.7 Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng hấp thụ mặn Bước 1: Nuôi cấy các chủng trong môi trường lỏng BIM, đặt nơi có ánh sáng trong 48h. Bước 2: Hút 1ml dịch nuôi cấy. Tiến hành ly tâm ở 8000 rpm trong 15 phút để thu tế bào vi khuẩn. Bước 3: Tiến hành rửa tế bào vi khuẩn 2 lần với 0.1% dung dịch peptone. Sau đó, cho một lượng tế bào khô này vào trong 50 ml môi trường nước có nồng độ muối 20‰. Bước 4: Tiến hành ủ dịch tế bào ở 30oC và lắc với tốc độ 100 rpm trong vòng 30 phút với cường độ ánh sáng thích hợp. Bước 5: Tiến hành ly tâm 8000 rpm trong 15 phút, thu dịch nổi loại bỏ tế bào để kiểm tra nồng độ muối còn sót lại bằng dụng cụ và đối chứng với nồng độ muối ban đầu. 2.3.8 Định danh các chủng vi khuẩn 2.3.8.1 Tách chiết DNA 2.3.8.1.1 Phá màng tế bào vi khuẩn Hút dịch tăng sinh của các chủng vào từng ống eppendorf riêng lẻ và ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 5 phút. Sau khi đổ bỏ dịch nổi, tiếp tục hút dịch tăng sinh còn lại vào ống eppendorf cũ và ly tâm. Lặp lại thao tác này cho đến khi thu được khối lượng tế bào khoảng 0.2 gram. Sau khi lượng tế bào đạt yêu cầu thì cho vào eppendorf 800 μl dung dịch CTAB, lắc mạnh hoặc vortex để đánh tan khối tế bào dưới đáy eppendorf tạo thành dạng huyền phù. 28
Đồ Án Tốt Nghiệp Sau khi ủ các ống eppendorf ở bể điều nhiệt 60oC trong 1 giờ, thì tiến hành ly tâm với tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút . Nhẹ nhàng hút 600 μl dịch nổi sang ống eppendorf khác. 2.3.8.1.2 Loại bỏ protein Bổ sung 600 μl dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol – 25:24:1 v/v (P:C:I) vào dịch nổi trong eppendorf lúc nãy. Vortex 5 giây và để ổn định trong ngăn đông tủ lạnh trong 2 phút. Kế đó ly tâm lạnh 4oC với tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 lớp, cẩn thận hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới, tránh hút phải màng liên pha protein. Lưu ý ghi nhận thể tích dịch nổi hút được của từng mẫu. 2.3.8.1.3 Tủa DNA Bổ sung vào dịch nổi mới hút dung dịch Isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 (v/v). Ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 13.000 trong 15 phút, bỏ dịch thu tủa màu trắng đục (tủa DNA). Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung 700 μl dung dịch ethanol 70%, ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút. Sau khi ly tâm, cho các eppendorf vào tủ sấy đẻ bay hơi hoàn toàn nước và ethanol. Cuối cùng bổ sung khoảng 30 μl nước sinh học phân tử vào tủa DNA, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 10oC. Điện di mẫu để kiểm tra sự có mặt của DNA. 2.3.8.2 Khuếch tán DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5’- AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3’) và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACG ACTT-3’), cặp mồi phổ rộng đặc trưng cho vi khuẩn. Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm có: 1 μl 27F và 1 μl 1492R (pmol/μl), 12.5 μl nước sinh học phân tử, 9.5 μl master mix (Bioline, Anh) và 1 μl mẫu DNA. Tổng thể tích phản ứng là 25 μl. Thông số của chu trình phản ứng PCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình 2.3 29
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 2.3.8.3 Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩm PCR trên gel 1% agarose Một gram bột agarose hòa vào 100ml dung dịch đệm Tris – acetate – EDTA (TAE), gia nhiệt để agarose tan hoàn toàn. Sau khi nhiệt độ gel xuống còn 50 – 55oC thì tiến hành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuôn điện di. Khi miếng gel đặc lại hoàn toàn thì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 – 5 mm. Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ 5:1 (v/v, μl). Nạp hỗn hợp vào trong các giếng. Tiến hành điện di mẫu với điện thế 90V trong khoảng 20 – 30 phút. Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút. Cuối cùng quan sát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV. 2.3.8.4 Giải trình tự DNA và định danh Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuôi 27F được gửi tới công ty Nam Khoa Biotek để thực hiện giải trình tự một chiều. Kết quả gửi về công ty sẽ được đọc bằng phần mềm MEGA5 ( Chọn vùng trình tự ổn định và so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI ( để tìm ra các chủng tương đồng. Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên 98%. Dựa vào cây phát sinh loài kết hợp hình thái, khả năng sinh hóa của các chủng để định danh ở mức cấp loài. 30
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Từ 63 mẫu ban đầu, nhóm thực hiện đồ án đã phân lập được 44 chủng vi khuẩn môi trường thạch BIM trong đó 13 chủng phân lập từ mẫu ruộng Long An và 31 chủng phân lập từ mẫu ở Cà Mau. Từ 44 chủng, tiến hành sàng lọc sơ bộ các chủng không thuộc nhóm vi khuẩn quang hợp thông qua quan sát đặc điểm hình thái bằng kỹ thuật nhuộm Gram. Sau đó so sánh với đặc điểm hình thái của vi khuẩn quang hợp, hầu hết các vi khuẩn quang hợp bắt Gram (-) và có hình thái đa dạng như hình cầu, oval, que. Sau khi chọn lọc các chủng vi khuẩn có đặc điểm hình thái thích hợp, tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng thông qua các nồng độ muối khác nhau và khả năng hấp thu muối để lựa chọn những chủng vi khuẩn tốt nhất đáp ứng cả hai thí nghiệm trên. Sau các khảo sát trên, nhóm thực hiện đề tài chọn ra 3 chủng trên tổng số 44 chủng ban đầu để tiến hành ly trích DNA , khuếch đại đoạn gene bằng kỹ thuật PCR và tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification (QIAGEN). Bảng 3.1. Giá trị pH của các mẫu tăng sinh thành công ở tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau STT Chủng pH STT Chủng pH 1 RL1 3.70 20 CM18 6.66 2 RL6 5.87 21 CM19 5.43 3 RL7 3.78 22 CM22 6.62 4 RL8 5.17 23 CM23 6.50 5 RL10 6.94 24 CM24 6.60 6 RL13 4.27 25 CM25 6.47 7 RL22 4.05 26 CM26 6.48 8 CM2 6.07 27 CM27 6.47 9 CM4 6.24 28 CM29 6.53 31
Đồ Án Tốt Nghiệp 10 CM6 6.53 29 CM30 6.88 11 CM7 6.46 30 CM31 6.50 12 CM8 6.33 31 CM32 6.65 13 CM9 6.43 32 CM33 6.51 14 CM10 6.32 33 CM34 6.61 15 CM11 6.43 34 CM35 6.67 16 CM12 6.34 35 CM37 6.53 17 CM13 6.52 36 CM38 6.43 18 CM14 6.37 37 CM39 6.63 19 CM17 6.36 38 CM40 6.44 3.1 Kết quả tăng sinh của vi khuẩn Nhóm vi khuẩn quang hợp có sắc tố quang hợp bacterichlorophyl a hoặc b, cùng với các carotenoid khác nhau làm chúng có các màu sắc khác nhau như tím, đỏ, nâu, cam [2]. Vì vậy màu sắc mẫu tăng sinh chuyển dần sang đỏ chứng tỏ có sự phát triển của nhóm vi khuẩn quang hợp. Trường hợp mẫu tăng sinh chuyển sang màu xanh là do sự phát triển mạnh mẽ của nhóm tảo, lấn át sự sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang hợp. Năm 2009, Hunter và cộng sự đã xác định được nhóm vi khuẩn quang hợp có thể hoạt động trong môi trường có pH 3 – 11 nhưng pH tối ưu là khoảng 6 – 7 để chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất.[27] Từ bảng 3.1 cho thấy mẫu nước ruộng ở Long An có pH 3 – 4 đã ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nhóm vi khuẩn quang hợp, chỉ có 7 mẫu chuyển dần sang đỏ sau 20 ngày trong số 22 mẫu thu được, tỉ lệ 31,8%. Trong khi đó, mẫu nước ở Cà Mau có pH 6 – 7, số mẫu tăng sinh chuyển dần sang đỏ lên đến 31 mẫu trong tổng số 41 mẫu thu được, tỉ lệ 75,6% và thời gian để mẫu chuyển màu cũng nhanh hơn ở Long An 10 ngày. 32
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.1. Kết quả tăng sinh mẫu RL19 và mẫu RL6. 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Sau khi phân lập và làm thuần, nhóm thực hiện đề tài thu được 44 chủng. Ở tỉnh Long An phân lập được 13 chủng, ở tỉnh Cà Mau phân lập được 31 chủng. Các mẫu thu về được tiến hành phân lập trực tiếp để tránh trường hợp tảo phát triển và lấn át nhóm vi khuẩn quang hợp. Trong đó có chủng RL3.1, RL4.1, RL5.1, RL5.2, RL11.1, RL14.1, RL14.2, RL19.1, CM12.1b, CM20.1b và CM20.2b được phân lập từ mẫu trực tiếp. Năm 2010, Saijai Panwichian và cộng sự đã tiến hành nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng liên tục từ 5 – 7 ngày [26]. So sánh với thí nghiệm này, nhóm thực hiện nhận thấy rằng các khuẩn lạc được đặt nơi có đầy đủ ánh sáng, khuẩn lạc nuôi cấy sẽ phát triển sau 48 giờ và có hình tròn, màu trắng, trong, kích thước nhỏ. Tuy nhiên phải tiếp tục nuôi cấy từ 5 – 7 ngày thì khuẩn lạc mới chuyển dần sang đỏ, cam hoặc hồng. 33
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn đã phân lập được STT Ký hiệu Nguồn Mô tả khuẩn lạc chủng phân lập 1 RL1.2 RL1 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 2 RL1.4 RL1 Tròn, bóng, lồi, màu cam, rìa trơn 3 RL3.1 RL3 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 4 RL4.1 RL4 Tròn, trắng ngà, lồi, rìa trơn 5 RL5.1 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 6 RL5.2 RL5 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 7 RL8.1 RL8 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 8 RL11.1 RL11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 9 RL10.1 RL10 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 10 RL14.1 RL14 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 11 RL14.2 RL14 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 12 RL19.1 RL19 Tròn, nhẵn, lồi, trắng đục, rìa trơn 13 RL20.1 RL20 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 14 CM6.1 CM6 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 15 CM7.1 CM7 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 16 CM11.1 CM11 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 17 CM12.1b CM12 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn 18 CM12.2 CM12 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 19 CM20.1b CM20b Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 20 CM20.2b CM20b Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 21 CM23.1 CM23 Tròn, bóng, lồi, màu trắng hơi chuyển sang đỏ, rìa trơn 22 CM24.1 CM24 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn 23 CM27.1 CM27 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 24 CM28.1 CM28 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 25 CM30.1 CM30 Tròn, bóng, lồi, hồng nhạt, rìa trơn 34
Đồ Án Tốt Nghiệp 26 CM19.1 CM19 Tròn, lồi, vàng, rìa trơn 27 CM19.2 CM19 Tròn, lồi, trắng đục, rìa trơn 28 CM19.3 CM19 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 29 CM34.1 CM34 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 30 CM34.2 CM34 Tròn, bóng, lồi, ngả vàng, rìa trơn 31 CM34.3 CM34 Tròn, bóng, lồi, đỏ, rìa trơn 32 CM35.1 CM35 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 33 CM37.1 CM37 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 34 CM40.1 CM40 Tròn, bóng, lồi, vàng cam, rìa trơn 35 CM40.2 CM40 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 36 CM9.1 CM9 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 37 CM10.1 CM10 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 38 CM25.1 CM25 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 39 CM39.1 CM39 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 40 CM31.1 CM31 Tròn, bóng, lồi, vàng, rìa trơn 41 CM31.2 CM31 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 42 CM18.1 CM18 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 43 CM33.1 CM33 Tròn, bóng, lồi, trắng đục, rìa trơn 44 CM13.1 CM13 Tròn, bóng, lồi, trắng, rìa trơn 35
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.2. Kết quả phân lập sau 7 ngày trên môi trường thạch BIM của chủng CM24 (hình trái) và kết quả làm thuần của chủng CM24 đang chuyển dần sang đỏ sau 5 – 7 ngày (hình phải). Hình 3.3. Kết quả phân lập trên môi trường thạch BIM của một số chủng vi khuẩn. 3.3 Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn Hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học bằng phương pháp nhuộm Gram. 36
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.3. Kết quả nhuộm Gram của các chủng STT Ký hiệu Hình dạng Gram Ký hiệu Hình dạng Gram chủng chủng STT 1 RL1.2 Oval - 23 CM27.1 Oval - 2 RL1.4 Que, phẩy + 24 CM28.1 Que ngắn, cong - 3 RL3.1 Oval - 25 CM30.1 Oval - 4 RL4.1 Cầu - 26 CM19.1 Que - 5 RL5.1 Oval + 27 CM19.2 Oval - 6 RL5.2 Oval + 28 CM19.3 Que + 7 RL8.1 Cầu - 29 CM34.1 Que - 8 RL10.1 Oval - 30 CM34.2 Oval - 9 RL11 Oval + 31 CM34.3 Oval - 10 RL14.1 Cầu + 32 CM35.1 Que ngắn - 11 RL14.2 Oval + 33 CM37.1 Que dài, cong - 12 RL19.1 Cầu + 34 CM40.1 Oval - 13 RL20.1 Oval + 35 CM40.2 Que ngắn, cong - 14 CM6.1 Que, cong - 36 CM9.1 Que, ngắn - 15 CM7.1 Oval - 37 CM10.1 Oval - 16 CM11.1 Que, cong - 38 CM25.1 Que - 17 CM12.1b Que ngắn, cong - 39 CM39.1 Oval + 18 CM12.2 Que dài, cong - 40 CM31.1 Oval - 19 CM20.1b Que ngắn, cong - 41 CM31.2 Cầu - 20 CM20.2b Oval - 42 CM18.1 Oval + 21 CM23.1 Oval - 43 CM33.1 Que + 22 CM24.1 Oval - 44 CM13.1 Que, cong - 37
Đồ Án Tốt Nghiệp Hình 3.4. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn quang hợp phân lập được dưới vật kính 100X Nhóm vi khuẩn quang hợp thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-) nên nhóm thực hiện đề tài sẽ loại bỏ những chủng Gram (+). Từ 44 chủng ban đầu, có 33 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (-) và 11 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (+). Nhóm vi khuẩn Gram (+) chiếm 25% trên tổng số chủng ban đầu. 38
Đồ Án Tốt Nghiệp Từ 13 chủng phân lập ruộng lúa thuộc tỉnh Long An, có đến 8 chủng vi khuẩn thuộc Gram (+), chỉ có 5 chủng thuộc Gram (-). Đối với mẫu thu từ tỉnh Cà Mau thì chỉ có 4 mẫu Gram (+) trên tổng số 31 chủng. Kết quả trên cho thấy rằng nguồn mẫu thu được từ tỉnh Cà Mau có số lượng vi khuẩn quang hợp tốt và khả năng phát triển cao hơn so với nguồn mẫu từ tỉnh Long An. Sau khi chọn lọc những chủng vi khuẩn Gram (-), nhóm thực hiện đề tài tiếp tuc tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng quan tâm trong môi trường BIM có bổ sung các nồng độ muối khác nhau. 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn Để tiếp tục loại bỏ và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn quang hợp. Nhóm thực hiện đề tài tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng ở các nồng độ muối khác nhau. Các chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường BIM có nồng độ muối từ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40‰. Đặt nơi có ánh sáng và tiến hành đo OD660nm trong vòng 7 ngày. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn thích nghi với hầu hết các độ mặn, chúng có thể sinh trưởng ở tất cả các độ mặn được khảo sát, trong đó ở nồng độ 5 – 25‰ thì các vi khuẩn quang hợp phát triển tốt nhất. Khi nồng độ muối ở mức trên 30‰ thì khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn cũng giảm dần. Kết quả nghiên cứu của Saijai Panwichian và cs vào năm 2010 cho biết rằng trong 100 chủng có thể phát triển tốt (OD660 > 0,5) sau 48 giờ trên môi trường GM ở điều kiện chiếu sáng khoảng 3000 lux thì chỉ có khoảng 21% trong tổng số có thể chịu được mặn ở nồng độ 50‰.[26]. So sánh với kết quả của nhóm nghiên cứu, trong 32 chủng chọn lọc được thì chỉ có 13 chủng có thể phát triển tốt (OD660 > 0,5) ở nồng độ muối 20‰ sau 7 ngày trên môi trường BIM ở điều kiện chiếu sáng. Do chưa đảm bảo mọi điều kiện tối khi khảo sát nên kết quả đạt được chưa hoàn toàn tốt. 39
Đồ Án Tốt Nghiệp 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Độ hấp hấp Độ thụ 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 chùng RL1 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ 30‰ 35‰ 40‰ Hình 3.5. Chủng RL1 có thể phát triển ở mọi nồng độ muối. Nhưng ở nồng độ muối 20‰ thì sự phát triển vượt trội hơn ở các nồng độ muối khác, giá trị OD660 đạt 0,504 sau 7 ngày khảo sát. 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 Độ hấp hấp Độ thụ 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 chủng RL8.1 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ 30‰ 35‰ 40‰ Hình 3.6. Chủng RL8.1 phát tốt ở mọi nồng độ nhưng ở nồng độ muối 10, 15, 20‰ có sự phát triển cao hơn hẳn, giá trị OD660 ở nồng độ 10‰ đạt 0,824 sau 7 ngày khảo sát. 40
Đồ Án Tốt Nghiệp 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 Độ hấp hấp Độ thu 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 chủng CM34.3 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ 30‰ 35‰ 40‰ Hình 3.7. Chủng 34.3 phát triển tốt ở mọi nồng độ, chúng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối 5‰, giá trị OD660 đạt 0,666 sau 4 ngày và ở nồng độ muối 20% , giá trị OD660 đạt 0,658 sau 7 ngày khảo sát 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Độ hấp hấp Độ thụ 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 chủng CM24.1 5‰ 10‰ 15‰ 20‰ 25‰ 30‰ 35‰ 40‰ Hình 3.8. Chủng 24.1 phát triển tốt ở mọi nồng đồ muối, chúng phát triển ổn định và tốt nhất, ờ nồng độ 5‰ giá trị OD660 đạt 0,868, nồng độ 20% giá trị OD660 đạt 0,585 sau 7 ngày khảo sát. 41
Đồ Án Tốt Nghiệp Bảng 3.4. Giá trị OD660nm của các chủng ở độ mặn 20‰ sau 7 ngày. STT Ký hiệu chủng OD660nm STT Ký hiệu chủng OD660nm 1 RL1.2 0.504 18 CM30.1 0.615 2 RL3.1 0.517 19 CM19.1 0.316 3 RL4.1 0.452 20 CM19.2 0.419 4 RL8.1 0.681 21 CM34.1 0.444 5 RL10.1 0.899 22 CM34.2 0.264 7 CM6.1 0.474 23 CM34.3 0.658 8 CM7.1 0.509 24 CM35.1 0.264 9 CM11.1 0.863 25 CM37.1 0.625 10 CM12.1b 0.546 26 CM40.1 0.323 11 CM12.2 0.299 27 CM40.2 0.251 12 CM20.1b 0.314 28 CM9.1 0.324 13 CM20.2b 0.218 29 CM10.1 0.290 14 CM23.1 0.514 30 CM25.1 0.286 15 CM24.1 0.585 31 CM31.1 0.283 16 CM27.1 0.459 32 CM31.2 0.347 17 CM28.1 0.596 33 CM13.1 0.319 Kết quả cho thấy có 13 chủng: RL1.2, RL3.1, RL8.1, RL10.1, CM7.1, CM11.1, CM12.1b, CM23.1, CM24.1, CM28.1, CM30.1, CM34.3, CM37.1 có giá trị OD660 > 0,5. Tiếp tục sử dụng kết quả này để tiến hành thí nghiệm hấp thu muối tiếp theo. 3.5 Kết quả khảo sát hấp thu mặn Để tiếp tục chọn lọc ra các chủng vi khuẩn quang hợp có khả năng hấp thu muối. Nhóm thực hiện đề tài tiến hành nuôi cấy các chủng trong môi trường BIM, đặt nơi có ánh sáng và kiểm tra giá trị OD660 sau 48 giờ. Sau đó hút 10m dịch nuôi cấy, ly tâm 8000 rpm trong 15 phút để thu tế bào vi khuẩn. Rửa tế bào vi khuẩn 2 lần với 0,1% dung dịch peptone. Tiếp theo cho lượng tế bào này vào trong 50ml môi trường nước có nồng độ 42
Đồ Án Tốt Nghiệp muối 20‰ và đem ủ tế bào ở 30oC và lắc với tốc độ 100 rpm trong vòng 30 phút với cường độ ánh sáng thích hợp. Cuối cùng đem ly tâm 8000 rpm trong 15 phút, thu dịch nổi để kiểm tra nồng độ muối còn sót lại bằng dụng cụ. Bảng 3.5. Giá trị OD660 và mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn sau 48 giờ. STT Ký hiệu chủng Độ hấp thụ (OD660) Mật độ tế bào (cfu/ml) = sau 48 giờ 1200 x 106 x OD x độ pha loãng 1 RL1.2 0,132 1,58 x 108 2 RL3.1 0,095 1,14 x 108 3 RL8.1 0,087 1,04 x 108 4 RL10.1 0,153 1,83 x 108 5 CM7.1 0,113 1,34 x 108 6 CM11.1 0,117 1,40 x 108 7 CM12.1b 0,104 1,25 x 108 8 CM23.1 0,134 1,61 x 108 9 CM24.1 0,195 2,34 x 108 10 CM28.1 0,163 1,96 x 108 11 CM30.1 0,089 1,07 x 108 12 CM34.3 0,088 1,06 x 108 CM37.1 0,086 1,03 x 108 43
Đồ Án Tốt Nghiệp 21.12 21.1 21.08 21.06 21.04 21.02 21 20.98 20.96 nồng độ muối (‰) muối độ nồng 20.94 chủng vi khuẩn Hình 3.9. Nồng độ muối của các chủng vi khuẩn (‰) sau khi kiểm tra. Từ hình 3.8 cho thấy rằng so với lượng muối ban đầu 21.1‰ (20gNa/l) thì sự hấp thu mặn của các chủng vi khuẩn chưa có sự thay đổi, chỉ có chủng RL1.2, CM24.1, CM34.3 giảm 0.1‰ (0.09gNa/l) sau 3 ngày quan sát ở điều kiện chiếu sáng liên tục. Năm 2017, Kei Sasaki và cộng sự đã xác định rằng sự tăng trưởng và loại bỏ Na của nhóm vi khuẩn quang hợp trung bình nằm ở khoảng nồng độ NaCl 30‰ (11,80gNa/l). Chủng Rhodobacter Sphaeroides (SSI) có khả năng tăng trưởng tốt ngay cả ở độ mặn cao và loại bỏ 1,80gNa/l (loại bỏ 39,3%) được quan sát sau 3 ngày trong điều kiện chiếu sáng. Trong khi, Rhodovulum sp cho thấy sự tăng trưởng nhanh hơn và giảm Na nhiều hơn. Tỷ lệ loại bỏ Na tối đa là 4,25gNa/l (loại bỏ 64,9%) quan sát sau 1 ngày chiếu sáng. Tuy nhiên, sau một lần tăng trưởng đã trở nên ổn định, nồng độ Na bắt đầu tăng trở lại, cuối cùng trở về gần như ban đầu. So sánh kết quả từ bảng 3.6 và hình 3.8 thấy được rằng phải đảm bảo lượng sinh khối đưa vào, điều kiện chiếu sáng với cường độ thích hợp, liên tục và theo dõi, đo đạc nồng độ muối hàng ngày để đảm bảo thời điểm lượng muối thay đổi chính xác, tránh trường hợp để nồng độ muối tăng trở lại Cuối cùng chỉ còn 3 chủng: RL1.2, CM24.1 và CM34.3 phù hợp để tiến hành định danh. 44
Đồ Án Tốt Nghiệp 3.6 Định danh 3.6.1 Ly trích, thu nhận DNA Từ hình 3.9, cho thấy kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng RL1.2, CM24.1 và CM34.3 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA. RL1.2 CM24.1 CM34.3 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. 3.6.2 Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR Các sản phẩm tách chiết DNA sẽ được làm mẫu để thực hiện phản ứng PCR đoạn gen 16S rRNA bởi cặp mồi 27F (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) và 1492R (5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3’). 16S rRNA là vùng mã hóa các RNA ribosome được xác định là đoạn gen được bảo tồn bền vững nhất ở tất cả các tế bào vi khuẩn. Tuy vậy, đây cũng là vùng gen rất linh hoạt, dựa vào mức độ, vị trí thay đổi trình tự các nucleotide ở vùng này mà người ta có thể khảo sát di truyền các chủng vi khuẩn. 45
Đồ Án Tốt Nghiệp RL 1.2 CM24.1 CM34.3 Hình 3.11. Kết quả nhân bộ gene DNA trên gel agarose 1% Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR, sản phẩm được tinh sạch bằng bộ kit The QIAquick PCR Purification. Cuối cùng sản phẩm được gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa. Hình 3.12. Kết quả nhân bộ gene DNA trên gel agarose 1% sau khi tinh sạch. 3.6.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về dưới dạng file *.ab1. File trình tự được đọc bằng chương trình MEGA 5.0. Kế đó đưa lên so sánh với ngân hàng dữ liệu gen BLAST của NCBI. Basic Local Alignment Search Tool, hay BLAST là một giải thuật để so sánh các chuỗi sinh học, như các chuỗi amino acid của các protein hay của các chuỗi DNA khác nhau. Hiện BLAST đang được phát triển bởi National Center for biotechnology 46
Đồ Án Tốt Nghiệp Information (NCBI), và được sử dụng miễn phí trên website ( Trong danh sách hiển thị kết quả, chọn ra chủng đại diện cho mỗi loài khác nhau được hiển thị và dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự DNA của chúng. Cây phát sinh loài được dựng bằng phương pháp Neighbor – Joining. Độ tin cậy của các nhánh ( dựa trên một 1000 lần lặp lại) được xác định bằng phương pháp bootstrapping và được hiển thị ở các đoạn phân nhánh. Khoảng cách tiến hóa (evolutionary distances) được tính bằng phương pháp Maximum Composite Likelihood. Các phương pháp thuật toán trên đều được chạy bằng chương trình MEGA 5.0. 3.6.4 Trình tự vùng gen của các chủng RL1.2, CM34.3 và CM24.1 Chủng RL1.2 GCTAGTTGTATACCGTGCAGTCGAGCGAGTCTTCGAGACTTAGCGGCGGA CGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCATTTGCTTCGGAATAGCCCCGGG AAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTATGGGGGAAAGATTTATCGGCA AAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCA AGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACA ATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAG GGTTGTAAAGATCTTTCAGGTGGGAAGATAATGACGGTACCACCAGAAGA AGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAG CGTTATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGT CAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGAAACTCCCG ATCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATT CGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGAT ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGT TCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC AAGGTTAAAACTCAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTATATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCCTTGACATG 47
Đồ Án Tốt Nghiệp GGCCGATCGCGGGTTCCAGAAGATGGTTTCCCTTTCAGTTTCGGGCTGGG ATCGCACACAGTTGCCTGGCAATGGCTGGTCCGTCAGCTCGTGTCGTTGA GATGGTTCCGGGTTTAAGTCCGGGCCAACCGAAGCGGCAGCCCGAACGTC CGTTAGGTTGCAGCCAATTTCAAGTTGGCCACTTCTAGGGGAAAACTTGC4 Chủng CM24.1 AAGTCGAAGTCTTCGGACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAA CGTGCCCTTTGCTTCGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGAAT GTGCCCTATGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGAT TAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGT TTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAG CCATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGATCTTTCAGGT GGGAAGATAATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTATTCGGAATTACTGGGC GTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCT CAACCCTGGAACTGCCTTTGAAACTCCCGATCTTGAGGTCGAGAGAGGTG AGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACAC CAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA TGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGAT TAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAAC GCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATGGCGATCGCGGTTCCAGAGATGG TTCCTTCAGTTCGGCTGGATCGCACACAGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTCCGGTTTAAGTCCCGGCAACGAGCGCACCCACG TCCTTAGTGCCCAGCATTCAGCTGGCACTCTAAGGAACTGCGTGATAGCC GAGAAGGAGGTGGATGACGTTCCAGATCCTCATTTGC 48
Đồ Án Tốt Nghiệp Chủng CM34.3 TGGACACATAACAGAGAGCGTCTGAATCGTCGCTTCTGGATGAGCCTGGC GGACGGGTGAATAACACTTGGACGCGGTGCCGTTTGGTGGCATAACTCAT GGAAACTTGGGCTCATACGGTATGTGCCCTTGTGGGGAAGGATTATCGGC ATTGGAGGGGCCGTCGTCTGATGTTCTACTTGGGTAGGTAAAGGCGTCCG AAGGCGACGATCAATATCTGGTCTGAGAGGATGATGCCCGCGTTTGCGAC GGACACAGGGCCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGCGC AATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTA GGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAG AAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTA GCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGCGGACATTTAAG TCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTTGATACTGGG TGTCTTGAGTATGAGAGAGGTGTGTGGAACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTC GTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACACACTGGCTCAT TACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATTGCTAGTTGTCGGGATGCATGCAT TTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCAATCCGCCTGGGGAGTACGGTCG CAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCCTTACCACCTTTTGACAT GCCTGGACCGCCACGGAGACGTGGGCTTTCCCTTTCGGGGACTGGGGACA CAGGTGCTGCATGGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTTGGGTTT AAGGTCCCGCCAACCGAGCGCAACCGTCGGCCAATTAAGTGGCTATTCAT TTCAGTAGGGAACTCTACTGGAACTGGCCTGGTGCCTATAAAGCC 49
Đồ Án Tốt Nghiệp RL1.2 Rhodobacter sp. JA487 82 Rhodobacter johrii Rhodobacter sphaeroides JA914 Rhodobacter sp. KCI-b Rhodobacter sp. CM34.3 CM24.1 1 Hình 3.13. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng RL1.2, CM34.3 và CM24.1 với một số chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo tồn của các chủng NCBI, các đặc điểm hình thái học của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau: Chủng RL1.2 có mối quan hệ gần nhất với Rhodobacter sphaeroides JA914 có mức độ tương đồng là 98%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh hình thái thì chủng RL1.2 là loài Rhodobacter sphaeroides. Chủng CM24.1 có mối quan hệ gần nhất với Rhodobacter sphaeroides JA914 có mức độ tương đồng là 99%. %. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh hình thái thì chủng CM24.1 cũng là loài Rhodobacter sphaeroides. Chủng CM34.3 có mối quan hệ gần nhất với Rhodobacter sp, với mức độ tương đồng là 96%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và so sánh hình thái thì chủng RL34.3 là loài Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter sphaeroides (SSI) thuộc nhóm vi khuẩn quang hợp tía, không lưu huỳnh. Khuẩn lạc của SSI phát triển tốt trên môi trường dị dưỡng và dưới điều kiện chiếu sáng thích hợp. Màu sắc đặc trưng cho các vi khuẩn nhóm này là màu đỏ dưới điều kiện 50
Đồ Án Tốt Nghiệp chiếu sáng hoặc có màu xám hoặc đen khi ủ trong tối hoặc cấy sâu. SSI thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-), hình oval. Dựa vào công bố của Saijai Panwichian và cộng sự (2010), các chủng vi khuẩn tía, không lưu huỳnh được phân lập từ ao, đầm tôm, ở các vùng nước nông [26] và công bố của Kei Sasaki và cộng sự (2017) nói rằng chủng SSI được chứng minh là tăng trưởng tốt, khả năng loại bỏ Na tối đa là 39,3% trong điều kiện chiếu sáng và 36,7% trong điều kiện tối [13]. So sánh với các kết quả đạt được của chủng RL1.2, CM24.1 và CM34.3 cùng với kết quả đặc điểm hình thái thì có thể khẳng định RL1.2, CM24.1 và CM34.3 thuộc chủng Rhodobacter sphaeroides. 51
Đồ Án Tốt Nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đề tài đã tiến hành các thí nghiệm để phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng chịu mặn và hấp thu mặn từ các mẫu nước ở Long An và Cà Mau. Các kết quả đạt được gồm có: - Phân lập được 44 chủng vi khuẩn môi trường thạch BIM trong đó 13 chủng phân lập từ mẫu ruộng Long An và 31 chủng phân lập từ mẫu ở Cà Mau. - Sau khi tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình ảnh nhuộm Gram, có 32 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (-) và 12 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Gram (+). Loại bỏ đi các chủng Gram (+), còn lại 32 chủng. - Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn, hầu hết các chủng vi khuẩn thích nghi được với các nồng độ muối khảo sát nhưng chỉ có 13 chủng có giá trị OD660nm > 0.5 ở nồng độ muối 20‰. Gồm có: RL1.2, RL3.1, RL10.1, CM7.1, CM11.1, CM12.1b, CM23.1, CM24.1, CM28.1, CM30.1, CM34.3 và CM37.1. - Kết quả khảo sát khả năng hấp thụ muối, chỉ còn 3 chủng hấp thụ muối cao nhất, (loại bỏ 1%) là RL1.2, CM24.1, CM34.3 - Tiến hành ly trích DNA, thực hiện phản ứng PCR 3 chủng đều tốt. Từ các kết quả trên cho thấy rằng 3 chủng RL1.2, CM24.1, CM34.3 tuyển chọn được có khả năng thuộc loài Rhodobacter sp và gần nhất là chi Rhodobacter sphaeroides 4.2 Kiến nghị Do lượng thời gian có hạn nên quá trình nghiên cứu vẫn còn một số vấn đề chưa được thục hiện. Cần thực hiện thêm một số khảo sát: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thu mặn nhằm đưa ra môi trường tối ưu nhất, phục vụ cho thử nghiệm hấp thu mặn cũng như các thí nghiệm khác. - Khảo sát thêm khả năng ứng dụng của chủng Rhodobacter sphaeroides trong thực tế. . 52
Đồ Án Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bùi Đoàn Phượng Linh, Hồng Hải Nhi, Hoàng Phương Thảo, Nguyễn Thanh Tú (2014), “Bài giảng Vi khuẩn quang hợp và cố định nito”. Trường đại học Đồng Nai. [2] Mỵ Trần Hương Trà và cộng sự (2015), “Nghiên cứu nhân nuôi và sử dụng vi khuẩn Rhodobacter để xử lý chất hữu cơ và sulfide trong nước”. Trường đại học Sài Gòn. Tài liệu tiếng anh [3] Coenye T, Vandamme P (November 2003). “Intragenomic heterogeneity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes”. FEMS Microbiology Letters. 228 (1): 45 – 9. PMID 14612235.doi:10.1016/S0378 - 1097 (03)00717-1. [4] El-Dessouky, H.T. and H.M. Ettouney, 2002 “Fundamentals of salt water desalination”. Elsevier. [5] Ellis, R.A., C.C. Goertemiller, and D.L. Stetson, 1977 Significance of extensive /`leaky/' cell junctions in the avian salt gland. Nature, 268(5620): p. 555-556. [6] Flowers, T.J. and T.D. Colmer, 2015 Plant salt tolerance: adaptations in halophytes. Annals of botany, 115(3): p. 327-331 [7] Hall, J.E., 2010 “Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology”. Elsevier Health Sciences. [8] Handwerk, Brian (May 6, 2005) Egypt’s “King Tut Curse” Caused by Tomb Toxins_National Geographic. [9] Hildebrandt, J.-P., 2001 Coping with excess salt: adaptive functions of extrarenalosmoregulatory organs in vertebrates. Zoology, 104(3–4): p. 209-220. (19) [10] Hunter, C.N., Daldal, F., Thurnauer, M.C., Beatty, J.Th. (Eds.) (2009). “The Purple 53
Đồ Án Tốt Nghiệp Phototrophic Bacteria” [27] [11] Jaime M. Amezaga, Anna Amtmann*, Catherine A. Biggs, Tom Bond, Catherine J. Gandy, Annegret Honsbein, Esther Karunakaran, Linda Lawton, Mary Ann Madsen, Konstantinos Minas, and Michael R. Templeton (2014) “Biodesalination: A Case Study for Applications of Photosynthetic Bacteria in Water Treatment” (3) [12] Jay ZJ, Inskeep WP (July 2015). “The distribution, diversity, and importance of 16S rRNA gene introns in the order Thermoproteales”. Biology Direct. 10 (35):35. PMC 4496867. PMID 26156036.doi: 10.1186/s13062-015-0065-6. [13] Kei Sasaki, Yuichiro Hosokawa, Kenji Takeno, Ken Sasaki (2017). “Removal of Sodium from Seawater Medium Using Photosynthetic Bacteria”, 6, 133-143. [14] Kim, K., E. Seo, S.-K. Chang, T.J. Park, and S.J. Lee, 2016 Novel water filtration of saline water in the outermost layer of mangrove roots. Scientific Reports, 6: p. 20426. [15] Krishnamurthy, P., P.A. Jyothi-Prakash, L.I.N. Qin, J.I.E. He, Q. Lin, C.-S. Loh, and P.P. Kumar, 2014 Role of root hydrophobic barriers in salt exclusion of a mangrove plant Avicennia officinalis. Plant, Cell & Environment, 37(7): p. 1656-1671. [16] Manousaki, E. and N. Kalogerakis, 2010 Halophytes Present New Opportunities in Phytoremediation of Heavy Metals and Saline Soils. Industrial & Engineering Chemistry Research, 50(2): p. 656-660. (12) [17] Maribel L. Dionisio-Sese!, Satoshi Tobita (2000). “Effects of salinity on sodium content and photosynthetic responses of rice seedlings differing in salt tolerance”, pp. 54- 58. [18] Mitra, A., 2013 Sensitivity of mangrove ecosystem to changing climate. Berlin: Springer. [19] M.M. Lasat, et al., Physiological characterization of root Zn2+ absorption and translocation to shoots in Zn hyperaccumulator and nonaccumulator species of Thlaspi, Plant Physiol. 112 (1996) 1715–1722 54
Đồ Án Tốt Nghiệp [20] Narong Wongkantrakorn, Yukari Sunohara and Hiroshi Matsumoto (2009). “Mechanism of growth amelioration of NaCl-stressed rice (Oryza sativa L.) by d- aminolevulinic acid”, 89–95. [21] Primers, 16S ribosomal DNA – Francois Lutzoni’s Lab. [22] Schmidt-Nielsen, K., 1997 Animal Physiology: Adaptation and Environment. Cambridge University Press. [23] Shabala, S., A. Moreno, Y. Hariadi, A. Mackay, Y. Tian, and J. Bose. Halophytes: what makes them special? Revealing ionic mechanisms of salinity tolerance. in XVIII International Botanical Congress. 2011. [24] Taheri, R. and M. Shariati, 2013 Study of the inhibitory effect of the media culture parameters and cell population to increase the biomass production of Dunaliella tertiolecta. Progress in Biological Sciences, 3(2): p. 123-133. [25] Thanawan Kantha & Duangporn Kantachote & Nikkajit Klongdee, (2015). “Potential of biofertilizers from selected Rhodopseudomonas palustris strains to assist rice (Oryza sativa L. subsp. indica) growth under salt stress and to reduce greenhouse gas emissions”, 65:2109–2118. [26] Saijai Panwichian, Duangporn Kantachote, Banjong Wittayaweerasak, Megharaj Mallavarapu (July 15, 2010). “Isolation of purple nonsulfur bacteria for the removal of heavy metals and sodium from contaminated shrimp ponds”, 0717-3458.[26] [27] Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (January 1991). “16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study”. Journal of Bacteriology. 173 (2): 697 – 703. PMC 207061. PMID 1987160 [28] Woese CR, Fox GE (November 1977). “Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms” Prceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (11): 5088 – 90. Bibcode:1977PNAS 74.5088W.(22) 55
Đồ Án Tốt Nghiệp [29] Desalinated water is planned to meet 30% of Singapore’s future water needs by 2060. Existing (25% of Singapore’s 2017 water demand) [30] Federman, Josef (May 30, 2014). "Israel solves water woes with desalination". Associated Press. Archived from the original on June 2, 2014. Retrieved May 30, 2014./37 Tài liệu internet. [31] [32] Độ_mặn [33] 56
Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC A: Kết quả tăng sinh thành công các mẫu Long An và Cà Mau 1
Đồ Án Tốt Nghiệp 2
Đồ Án Tốt Nghiệp 3
Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC B: Kết quả phân lập các mẫu từ tỉnh Long An và tỉnh Cà Mau. 4
Đồ Án Tốt Nghiệp 5
Đồ Án Tốt Nghiệp 6
Đồ Án Tốt Nghiệp 7
Đồ Án Tốt Nghiệp PHỤ LỤC C: Một số hình ảnh thu mẫu thực tế 8