Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng

105 trang thiennha21 12/04/2022 3860

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_san_xuat_che_pham_nam_paecilomyces_lilacinus_phong_tru.pdf

Nội dung text: Đồ án Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHỊNG TRỪ MỘT SỐ LỒI SÂU HẠI CÂY TRỒNG Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Đỗ Anh Duy MSSV: 1515100003 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHỊNG TRỪ MỘT SỐ LỒI SÂU HẠI CÂY TRỒNG Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Đỗ Anh Duy MSSV: 1515100003 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thơng tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Đỗ Anh Duy
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh – HUTECH đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hồn thành tốt khĩa học 2011 – 2016. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cơ trong khoa Cơng nghệ sinh học, Thực phẩm và Mơi trường đã giảng dạy em trong những năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Hai người đã tận tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Huỳnh Văn Thành, cán bộ phịng thí nghiệm CNSH, Trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM – HUTECH đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em cĩ thể hồn thành tốt đồ án. Em xin cảm ơn KS. Nguyễn Ngọc Phong, cán bộ cơng ty Sitto Việt Nam đã tận tình hỗ trợ, hướng dẫn em trong quá trình thực hiện thí nghiệm thực tế trên vườn hồ tiêu tại tỉnh Bình Phước. Và tơi cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phịng thí nghiệm CNSH, em Đinh Thành Hiếu khĩa 2013 đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng tơi trải qua những khĩ khăn trong quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, con xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình đặc biệt là ba mẹ đã luơn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con cĩ thể hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về nghiên cứu sử dụng nấm cĩ ích phịng trừ sâu hại 3 1.2. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 5 1.2.1. Phân loại khoa học 5 1.2.2. Đặc điểm hình thái 6 1.2.3. Đặc điểm sinh thái 7 1.2.4. Cơ chế tác động lên cơn trùng 10 1.3. Một số kết quả nghiên cứu nấm Paecilomyces sp trừ sâu hại cây trồng 11 1.4. Giới thiệu phương pháp lên men bán rắn tạo chế phẩm nấm 12 1.5. Tổng quan về một số lồi sâu bọ chích hút 13 1.5.1. Tổng quan về rầy nâu 13 1.5.1.1. Hình thái 13 1.5.1.2. Phân bố 14 1.5.1.3. Tập tính sinh sống và quy luật phát sinh gây hại 15 1.5.1.4. Mức độ gây hại 16 1.5.1.5. Biện pháp phịng trừ 20 1.5.2. Tổng quan về rệp sáp 21 1.5.2.1. Hình thái 21 1.5.2.2. Đặc điểm sinh thái 22 1.5.2.3. Triệu chứng và mức độ gây hại 22 1.5.2.4. Biện pháp phịng trừ 24 i
1.5.3. Tổng quan về rệp muội 24 1.5.3.1. Hình thái 24 1.5.3.2. Đặc điểm sinh thái 25 1.5.3.3. Triệu chứng và mức độ gây hại 26 1.5.3.4 . Biện pháp phịng trừ 28 1.5.4. Tổng quan về rệp muội nâu đen Toxoptera sp hại cây hồ tiêu 29 1.5.4.1. Đặc điểm hình thái 29 1.5.4.2. Triệu chứng gây hại 30 1.5.4.3. Biện pháp phịng chống 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32 2.2. Vật liệu 32 2.2.1. Dụng cụ 32 2.2.1. Hĩa chất 32 2.2.2. Chủng nấm Paecilomyces lilacinus 33 2.3. Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1. Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên rệp sáp 34 2.3.1.1. Phân lập 34 2.3.1.1. Tạo dịng thuần 34 2.3.1.2. Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 34 2.3.2. Xác định mơi trường nhân sinh khối tạo chế phẩm. 36 2.3.3. Ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 37 2.3.4. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong điều kiện phịng thí nghiệm 38 2.3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết rầy nâu Nilaparvata lugens Stal của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 39 2.3.4.2. Đánh giá khả năng gây chết rệp sáp Planococcus lilacinus của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 39 2.3.4.3. Đánh giá khả năng gây chết rệp muội Brevicoryne brassaciae của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 40 ii
2.3.5. Đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trừ rệp Toxoptera sp hại cây hồ tiêu 41 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. Phân lập lại chủng nấm Paecilomyces lilacinus từ rệp sáp 43 3.2. Xác định mơi trường nhân sinh khối bào tử nấm Paecilomyces lilacinus 45 3.3. Ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 49 3.4. Khả năng gây chết cơn trùng chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus nhân trên mơi trường gạo tấm. 51 3.4.1. Khả năng gây chết rầy nâu 51 3.4.2. Khả năng gây chết rệp sáp 55 3.4.3. Khả năng gây chết rệp muội 58 3.5. Đánh giá khả năng gây chết rệp muội Texoptera sp hại cây hồ tiêu trong điều kiện vườn trồng 63 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 4.1. Kết luận 67 4.2. Đề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật EC: Emulsifiable Concentrate (thuốc dạng nhũ dầu) WP: Wettable Powder (thuốc dạng bột hịa nước) WG: Wettable Granule (thuốc hạt phân tán trong nước) G: Granule (thuốc dạng bột, khi dùng khơng hịa với nước) iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus trên các loại mơi trường nhân sinh khối 45 Bảng 3.2. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus nhân nuơi trên khay gạo tấm. 48 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của một số loại thuốc BVTV đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus 49 Bảng 3.4. Số rầy nâu chết ở các ngày sau phun thuốc 52 Bảng 3.5. Hiệu lực gây chết rầy nâu 52 Bảng 3.6. Số rệp sáp Planococcus lilacinus chết ở các ngày sau phun thuốc 55 Bảng 3.7. Hiệu lực gây chết rệp sáp Planococcus lilacinus 56 Bảng 3.8. Số rệp muội Brevicoryne brassacicae chết ở các ngày sau phun thuốc 59 Bảng 3.9. Hiệu lực gây chết rệp muội Brevicoryne brassacicae 59 Bảng 3.10. Mật độ rệp ở các cơng thức trước phun thuốc 64 Bảng 3.11. Mật độ rệp ở các cơng thức sau khi phun nấm Paecilomyces lilacinus 64 Bảng 3.12. Hiệu lực gây chết rệp Texoptera sp của nấm Paecilomyces lilacinus 65 v
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp 6 Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus 7 Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces farinosus 8 Hình 1.4. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces varioti 9 Hình 1.5. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 10 Hình 1.6. Vịng đời của rầy nâu Nilaparvata lugens 14 Hình 1.7. Lúa bị rầy nâu tấn cơng 18 Hình 1.8. Triệu chứng bệnh lùn xoắn lá 19 Hình 1.9. Triệu chứng lùn xoắn lá giai đoạn đẻ nhánh 20 Hình 1.11. Rệp sáp Planococcus lilacinus 22 Hình 1.12. Rệp sáp gây hại trên quả mãng cầu 23 Hình 1.13. Rệp muội Brevicoryne brassacicae 25 Hình 1.14. Vịng đời của rệp Brevicoryne brassacicae 26 Hình 1.15. Rệp bám và hút chích dưới mặt lá 27 Hình 1.16. Rau bị hư hại do rệp muội tấn cơng 27 Hình 1.17. Rệp muội Texoptera sp 29 Hình 1.18. Rệp Texoptera sp trên lá cây Hồ tiêu 30 Hình 2.19. Rệp Texoptera sp hút chích trên ngọn cây Hồ tiêu 31 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 33 Hình 2.2. Phịng ẩm 35 vi
Hình 3.1. Khuẩn lạc Paecilomyces lilacinus 43 Hình 3.2. Quan sát sợi nấm dưới kính hiển vi 400x 44 Hình 3.3. Sinh khối nấm nhân nuơi trên mơi trường ngơ mảnh 46 Hình 3.4. Sinh khối nấm nhân nuơi nấm trên mơi trường cám 46 Hình 3.5. Sinh khối nấm nhân nuơi nấm trên mơi trường lúa 47 Hình 3.6. Sinh khối nấm nhân nuơi nấm trên mơi trường gạo tấm 47 Hình 3.7. Nhân nuơi nấm Paecilomyces lilacinus trên khay 48 Hình 3.8. Ảnh hưởng của một số loại thuốc BVTV đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 50 Hình 3.9. Hiệu lực gây chết rầy nâu qua các ngày sau phun thuốc 53 Hình 3.10. Rầy nâu bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 40x 54 Hình 3.11. Rầy nâu bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 100x 54 Hình 3.12. Hiệu lực gây chết rệp sáp các ngày sau phun thuốc 56 Hình 3.13. Rệp sáp Planococcus lilacinus bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 40x 57 Hình 3.14. Rệp sáp Planococcus lilacinus bị nấm ký sinh độ phĩng đại 100x 58 Hình 3.15. Hiệu lực gây chết rệp muội các ngày sau phun thuốc 60 Hình 3.16. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 40x .61 Hình 3.17. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 100x 61 Hình 3.18. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 400x .62 vii
Hình 3.19. Sợi nấm Paecilomyces lilacinus trên cơ thể rệp muội Brevicoryne brassacicae 62 Hình 3.20. Cơng thức đối chứng ngồi vườn hồ tiêu 65 Hình 3.21. Cơng thức phun nấm Paecilomyces lilacinus ngồi vườn hồ tiêu 66 viii
LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nơng nghiệp đĩng vai trị rất quan trọng đối với nền kinh tế nước ta. Trong sản xuất nơng nghiệp, người nơng dân hiện cịn gặp rất nhiều khĩ khăn, trong đĩ vấn đề lớn nhất hiện nay là phịng trừ sâu bệnh gây hại cây trồng. Việc sử dụng rộng rãi các hố chất đã được tổng hợp đã cĩ tác dụng đáng kể trong việc ngăn ngừa sâu bệnh cho cây trồng. Thuốc trừ sâu hĩa học cĩ ưu điểm là diệt trừ nhiều loại sâu hại trên diện tích lớn, vì chúng tác dụng nhanh mà giá thành lại thấp nên trong nhiều năm liền thuốc chiếm vị trí gần như thống lĩnh trong việc bảo vệ cây trồng. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hĩa học khơng hợp lý trong một thời gian dài và khơng đúng cách đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của sâu hại, gây hậu quả nghiêm trọng tới mơi trường và quan trọng hơn hết cịn là vấn đề sức khỏe của con người. Lượng thuốc hĩa học cịn tồn đọng trong nơng sản sẽ gây ra những ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới sức khỏe của người tiêu dùng. Ngồi ra, các sản phẩm làm ra khơng thể xuất khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của nơng dân. Đây cũng là một thách thức lớn cho nơng dân Việt Nam khi ra nhập WTO. Để giảm thiểu tác động xấu của thuốc bảo vệ thực vật đến mơi trường và cộng đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm cĩ nguồn gốc sinh học thay thế dần các thuốc hĩa học đang ngày càng phát triển. Chế phẩm sinh học cĩ nhiều ưu điểm nổi bật và cĩ thể thay thế một phần thuốc hĩa học, do chế phẩm khơng gây độc hại cho người và gia súc, khơng cĩ tác dụng xấu tới mơi trường, khơng tiêu diệt những thiên địch cĩ ích. Trong số các tác nhân đã được nghiên cứu thì nấm Paecilomyces được xem là cĩ triển vọng vì hiệu lực diệt sâu cao, mức độ lây lan trong quần thể rộng và kéo dài lại khơng độc hại với con người và mơi trường, (U.S. Environmental Protection Agency, 2005). 1
Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về lồi nấm cĩ ích này vẫn cịn khá hạn chế. Sản xuất chế phẩm nấm sử dụng trong phịng trừ sâu hại cây trồng cũng lại là vấn đề quan tâm của Cơng nghệ sinh học. Đĩ cũng chính là lý do để em thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces sp để phịng trừ một số lồi sâu hại cây trồng”. 2. Mục đích nghiên cứu Tìm ra mơi trường sản xuất nấm Paecilomyces sp và xác định hiệu quả phịng trừ của chế phẩm trên một số đối tượng sâu hại làm cơ sở cho việc ứng dụng chủng nấm Paecilomyces lilacinus trong phịng trừ sâu hại cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập lại chủng Paecilomyces lilacinus trên rệp. - Xác định mơi trường nhân sinh khối thích hợp để sản xuất bào tử nấm Paecilomyces - Khảo sát ảnh hưởng của một số loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus - Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Paecilomyces trên một số lồi sâu hại trong điều kiện phịng thí nghiệm. - Đánh giá khả năng gây chết rệp muội nâu đen Texopter sp trên vườn hồ tiêu, xã Đakia, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nghiên cứu sử dụng nấm cĩ ích phịng trừ sâu hại Sử dụng nấm cơn trùng làm tác nhân kiểm sốt sinh học đối với các lồi cơn trùng đã được chú ý trên tồn cầu trong nhiều thập kỷ qua. Các thuốc bảo vệ thực vật từ nấm như Beauveria bassiana (Balsamo) (Babu et al, 2001; Sharma, 2004), Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown và Smith (Alter và Vandenberg, 2000; Avery et al, 2004) và Verticillium lecanii (Zimm.) (Butt et al., 2001) đã được sử dụng để kiểm sốt cơn trùng gây hại khác nhau. Các kết quả của Van der Schaaf et al. (1990) và Beerling et al. (1996) cho biết nấm Verticillium lecanii cĩ hiệu quả trong việc kiểm sốt bọ trĩ với tỷ lệ nhiễm 60% trên dưa chuột. Tương tự như vậy, Metarhizium anisopliae cĩ thể làm giảm 72% bọ trĩ trên hoa cúc trong điều kiện nhà kính trong khi Beauveria bassiana cĩ hiệu quả lên đến 47% (Brownbridge et al, 1994; Brownbridge, 1995). Fiedler và Sosnowska (2007) cho biết Paecilomyces lilacinus tỏ ra rất hiệu quả trong việc kiểm sốt các giai đoạn cả trước khi hĩa nhộng và nhộng của bọ trĩ Trong một nghiên cứu khác, Metarhizium chủng V-275 và ERL-700 là cĩ thể gây chết 85,95% bọ trĩ (Ansari et al., 2007). P. lilacinus ban đầu được sử dụng để diệt tuyến trùng (Fiedler và Sosnowska, 2007). Nấm tiết enzyme chitinases và protease phân hủy vỏ trứng của tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002) Cơ chế này cũng giống như tác động của nấm đối với các cơn trùng gây hại như bọ trĩ (Fiedler và Sosnowska, 2007). Ở Việt Nam, đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu sản xuất ứng dụng nấm cĩ ích như nấm trắng Beauveria bassiana, nấm xanh Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride, để phịng trừ một số loại sâu hại quan trọng như rầy nâu hại lúa, sâu hại 3
rau, cây ăn quả và cây cơng nghiệp (Võ Thị Bích Chi,2006; Phạm Thị Thuỳ 2004; Nguyễn Thị Lộc, 2009). Các cơng trình nghiên cứu về nấm ký sinh cơn trùng tại nước ta chủ yếu tập trung vào cơng tác thu thập chủng, phân lập các chủng giống bản địa và phát triển sinh khối tạo chế phẩm sinh học phịng trừ các loại sâu mà bị chính chủng nấm đĩ ký sinh. Từ năm 1996 đến nay, Trung tâm Đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ thực vật đã thu thập, phân lập, tạo thuần và tuyển chọn được 28 chủng (10 chủng Beauveria và 18 chủng Metahizium) trên các loại sâu hại khác nhau tại các tỉnh phía Bắc và phía Nam. Trên sâu hại rau, kết quả thí nghiệm trên cây cải bơng ở Trà Nĩc, Bình Thủy, Cần Thơ cho thấy dịng nấm trắng B. bassiana (OM2 – SOD) và hai dịng nấm xanh M. anisopliae chủng OM1 – R và chủng (OM3 – STO) cĩ hiệu lực trừ sâu tơ đạt tương ứng 75,3, 67,4 và 76,1%. Tỷ lệ bơng cải thương phẩm và năng suất của 3 cơng thức này khơng cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với cơng thức sử dụng thuốc sinh học đặc trị sâu tơ cĩ nguồn gốc Bt (Crymax 35WP). Thí nghiệm trên cây cải xanh tại xã Thới Hạnh, huyện Cờ Đỏ, Cần Thơ cho thấy hai chủng nấm M. anisopliae và B. bassiana cĩ hiệu lực trừ rầy mềm rất cao tương ứng 97,8% và 96,1%, khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê so với cơng thức sử dụng thuốc hĩa học Visher 25 ND 98,5% (Võ Thị Bích Chi, 2006) (dẫn theo Nguyễn Thị Lộc, 2009). Ngồi ra hai chế phẩm Ometar và Biovip cũng cĩ khả năng phịng trừ rầy mềm hại khổ qua 60,4%, phấn trắng, sâu xanh sọc hại dưa leo lần lượt là 83,5% và 61,6% (Nguyễn Thị Lộc, 2009). Trên cây ăn quả, kết quả của mơ hình trình diễn trên cam, quýt, bưởi ở tỉnh Tiền Giang cho thấy, chế phẩm nấm M. anisopliae cĩ hiệu quả cao với rầy mềm hại cam quýt đạt tới 83,3%, cịn đối với rầy chổng cánh hại cam quýt cũng đạt được 70,4%. (Nguyễn Thị Lộc, 2009). 4
1.2. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.2.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Lồi: Paecilomyces lilacinus Chi Paecilomyces do Bainier mơ tả vào 1907, sau đĩ được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều lồi mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 lồi đã mơ tả, đồng thời tổ hợp mới 9 lồi và đề nghị 6 lồi mới, tất cả tập hợp trong 2 nhĩm lồi. Nhĩm lồi thứ nhất là nhĩm lồi Paecilomyces cĩ các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R. Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các lồi ưa nhiệt ơn hịa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, cĩ khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhĩm lồi thứ hai là nhĩm lồi Isarioides gồm các lồi khơng cĩ giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ơn hịa và cĩ khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều lồi trong nhĩm hai này kí sinh gây bệnh cơn trùng (Samson R.A.,1974,2005). Đến năm 2004, dựa trên các kỹ thuật phương tiện hiện đại các lồi trong chi Paecilomyces được Samson R.A. hệ thống lại với 26 lồi. Năm 2005 nhĩm tác giả Liang Z.Q., Y.F., Chu, H.L. và Liu, A. Y. đã tiến hành đề tra và thu thập các nguồn nấm Paecilomyces tại Trung Quốc. Kết quả điều tra thu thập đã phát hiện ra một số lồi mới như Paecilomyces cylindricosporus sp. nov, Paecilomyces gunnii Z. Q. Liang, v.v. Các lồi này được thu thập từ đất và xác cơn trùng bị nấm ký sinh tại vùng cao của tỉnh Hồ Bắc. Cùng với các lồi đã được ghi nhận trước đĩ, nhĩm tác giả đã xây dựng khĩa định loại của 28 lồi trong chi Paecilomyces thu thập tại Trung Quốc. 5
1.2.2. Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp cĩ thể ở dạng thảm nhung, dạng bĩ sợi, cĩ màu trắng, hồng nhạt, màu tím đinh hương (nên cịn được gọi là nấm tím), màu nâu vàng, màu nâu xám, thỉnh thoảng cĩ màu lục nhạt (tùy lồi). Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces spp (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, gốc cuống dạnh bình phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vịng hoặc khơng đồng đều. Bào tử phân sinh đơn bào, khơng màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc cĩ gai (Trần Văn Mão, 2002). 6
Hình 1.2. Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus (Nguồn: 1.2.3. Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp cĩ phổ ký sinh cơn trùng rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ơn đới (Trần Văn Mão, 2002). Chúng cĩ thể dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phịng và ngồi tự nhiên. Một số lồi quan trọng trong phịng trừ sinh học như: Paecilomyces farinosus: gây bệnh nhiều lồi cơn trùng, phân bố rộng rãi nhiều vùng trên thế giới, đã được phân lập từ một số lồi cơn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) ở nước ta (Tạ Kim Chính, 1996). Khuẩn lạc trên mơi trường thạch Malt, nhiệt độ nuơi cấy 27oC, 10 ngày, đường kính 4 – 5 cm, mặt dạng bột, đơi chỗ dạng xếp bơng nhẹ, trắng sau chuyển màu vàng nhạt với các bĩ sợi màu vàng. Giá bào tử trần hầu hết mọc từ các sợi nấm nên nhẵn, khơng màu, 1,0 – 2,5 x 100 - 300µm, mang 1 – 5 nhánh ở đỉnh và phần ngọn. Thể bình ở đỉnh hoặc các nhánh thành cụm. Bảo tử trần hình elip, hình thoi, đơi khi hình hạt chanh, 7
1,0 – 1,8 x 2 – 3µm, nhẵn, khơng màu, thành chuỗi. Trên cơn trùng, P. farinosus cĩ dạng lớp bột màu trắng, trắng vàng (Trần Văn Mão, 2002). Hình 1.3. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces farinosus Paecilomyces varioti: Khuẩn lạc trên mơi trường thạch Malt (nhiệt độ nuơi cấy 27oC, 10 ngày), đường kính 6 – 8 cm, mặt dạng bột, đơi khi xốp bơng hoặc cĩ ít bĩ sợi, màu lục nâu, vàng lục. Giá bào tử trần nhẵn hoặc hơi xù xì, 4 – 7 x 12 – 30µm, mang các nhánh xếp thành vịng hoặc khơng đều. Thể bình 2,5 – 5,0 x 15 – 25µm mọc thành cụm 2 – 7 chiếc hoặc đơn độc, phần gốc hình trụ hoặc gần elip, phần cổ hình trụ dài. Bào tử trần hình gần trụ, hình elip, 2,5 – 4,0 x 3,5 – 5,0µm, nhẵn, khơng màu hoặc màu vàng nhạt thành chuỗi (Trần Văn Mão, 2002). 8
Hình 1.4. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces varioti Paecilomyces lilacinus: Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, cĩ thể phân lập lồi nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong cơn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phịng 27oC. Sợi nấm ban đầu cĩ màu trắng sau đĩ chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 9
Hình 1.5. Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 1.2.4. Cơ chế tác động lên cơn trùng Nấm Paecilomyces sp. cĩ một cơ chế lây nhiễm duy nhất là tấn cơng vào xoang máu thơng qua lớp biểu bì hoặc cĩ thể thơng qua đường miệng cơn trùng. Cơn trùng chết là sự kết hợp từ các yếu tố như tổn thương mơ cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể cơn trùng. Quá trình bám vào cơ thể cơn trùng là một quá trình thụ động với sự giúp đỡ của giĩ và nước (Qian M. H., 2007) Bào tử nấm được phát tán trong tự nhiên, rơi trên thân cơn trùng và dính chặt vào da cơn trùng theo cơ chế bám dính khơng chuyên biệt thơng qua tính kỵ nước của vách tế bào. Lớp kỵ nước này xuất hiện đặc biệt ở giai đoạn bào tử. Độ bám dính của các bào tử trên bề mặt biểu bì là nhờ lớp kỵ nước. Lectins, một loại cacbohydrate glycoprotein được phát hiện trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì của bào tử. Sau 24 giờ, gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm qua vỏ chitin và các lỗ thơng hơi của cơn trùng. Trong quá trình đĩ, sợi nấm tiết ra phức hệ enzyme phân huỷ protein, lipid, chitin của cơn trùng. Các enzyme đĩ là exoproteases, endoproteases, 10
esterases, lipase, chitinases và chitobiases. Trong đĩ, chitinases và endoprotease là hai emzym giữ vai trị quan trọng nhất (Sandhu S.S, 2012). Sau đĩ, sợi nấm phát triển ngay trong cơ thể cơn trùng cho đến khi xuất hiện tế bào nấm đầu tiên. Ở giai đoạn này, lympho của cơn trùng chứa đầy sợi nấm, các hồng cầu bị phá vỡ, dinh dưỡng bị đình trệ. Đồng thời, độc tố nấm tác động vào hệ thần kinh và làm tê liệt hoạt động của cơn trùng. Các ngoại độc tố với bản chất hĩa học là destruxin A (C29H47O7N5) và destruxin B (C30H51O7N5) và overixin (C45H57O9N3), gây hiện tượng tê liệt thần kinh, phá huỷ quá trình hơ hấp, làm cho cơn trùng cĩ những thay đổi về bệnh lý và chết. Sau khi cơn trùng chết, nấm vẫn tiếp tục sinh trưởng phát triển trên xác của vật chủ, vì đây là nguồn cơ chất giàu hữu cơ (Yin Fei, 2010). 1.3. Một số kết quả nghiên cứu nấm Paecilomyces sp trừ sâu hại cây trồng Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các lồi cơn trùng thuộc bộ cánh vảy thường gây dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. cịn được sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya,1993). Nấm Paecilomyces spp. cĩ hiệu quả cao đối với việc phịng trị sâu do cĩ độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với nồng độ 108 bào tử/ml chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết xác sâu sẽ bị khơ lại, sau đĩ nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu tím (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngồi ra, người ta cịn sử dụng nấm Paecilomyces spp. để phịng trừ sâu hại bơng, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp (Trần Văn Mão, 2002). Từ năm 2011 đến nay, nhĩm nghiên cứu Nấm cĩ ích thuộc Trung tâm đấu tranh sinh học, viện BVTV Việt Nam đã thu thập và khởi xướng nghiên cứu nấm Paecilomyces javanicus tại một số tỉnh đồng Bằng Bắc Bộ, đã đánh giá xác định lồi nấm P. javanicus cĩ tiềm năng ký sinh gây chết rầy nâu cao đạt từ 79,1% đến 84,4% trong điều kiện phịng thí nghiệm và nhà lưới sau 10 ngày phun chế phẩm (Trần Văn Huy và cs., 2012). 11
Theo Nguyễn Thị Xuân Hương (2015), Nấm Paecilomyces lilacinus khả năng kí sinh bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii. Hiệu lực gây chết bọ phấn Bemisia tabaci là 89,5%, và rệp Aphis gossypii là 85,34%. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về cơng nghệ sản xuất chế phẩm lồi nấm cĩ ích này vẫn cịn khá hạn chế. 1.4. Giới thiệu phương pháp lên men bán rắn tạo chế phẩm nấm Là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất vì đây là quá trình lên men đơn giản, dễ thành cơng hơn các phương pháp lên men khác. Trong phương pháp này, các loại cơ chất dùng để làm mơi trường cho nấm phát triển là gạo, ngơ mảnh, lúa , cùng với dịch dinh dưỡng để nuơi cấy nấm. Gopalakrishnan et al. (1999) báo cáo rằng lúa miến là ngũ cốc lý tưởng làm mơi trường cho việc sản xuất Paecilomyces farinosus. Bã cà rốt cũng hỗ trợ tốt cho nhân sinh khối nấm P. fumosoroseus, đạt 9,12.108 bào tử / 100g. (K. Sahayaraj và S. Karthick Raja Namasivayam, 2008). Cám gạo là mơi trường phù hợp cho nhân sinh khối các loại nấm. Các loại nấm nuơi trên trên cám gạo cĩ thể được sử dụng hiệu quả cho một khoảng thời gian một tháng cho việc quản lý của cơn trùng (U. Amala et al, 2012). Cĩ một sự suy giảm dần số lượng bào tử của P. lilacinus nuơi trên tất cả mơi trường sau hai mươi tám ngày sau khi cấy (U. Amala et al, 2012). Để cĩ được sản phẩm tạo ra cĩ nhiều bào tử, các điều kiện mơi trường như nhiệt đơ, độ ẩm, pH đĩng vai trị rất quan trọng. Stathers, T.E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho cơng bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định nấm Paecilomyces spp. thích hợp ở nhiệt độ 28oC và ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80-90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Nhiệt độ 15oC lại thích hợp cho sự hình thành bào tử (Trần Văn Mão, 2002). 12
1.5. Tổng quan về một số lồi sâu bọ chích hút 1.5.1. Tổng quan về rầy nâu Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Arthropoda Lớp (class) Insecta Bộ (ordo) Hemiptera Họ (familia) Delphacidae Chi (genus) Nilaparvata Lồi (species) Nilaparvata lugens 1.5.1.1. Hình thái Rầy nâu là lồi cơn trùng cĩ chu kỳ phát triển theo kiểu biến thái khơng hồn tồn, phải trải qua 3 pha phát dục: pha trứng, pha ấu trùng (rầy non) và pha trưởng thành. Hình 1.6. Vịng đời của rầy nâu Nilaparvata lugens 13
Pha trứng: trứng hình trụ dài, cong, một đầu thon, gần giống hình quả chuối, dài 0,89 mm. Trứng mới đẻ màu nâu vàng, sau chuyển màu nâu đen. Trứng đẻ thành ổ, xếp 1 hàng theo kiểu úp thìa, đơi khi xếp hàng đơi. Trứng đẻ trong mơ bẹ lá lúa, hơi nhơ đầu ra ngồi. Phía ngồi các đầu trứng được phủ lớp sáp trong. Vết đẻ trứng chuyển thành màu nâu hơi đỏ. Pha ấu trùng: pha ấu trùng (hay cịn gọi là rầy non) của rầy nâu cĩ 5 tuổi. Các đặc điểm hình thái cơ bản của các tuổi rầy nâu như sau: Rầy non tuổi 1 màu đen xám, cĩ đường thẳng trên lề ngực sau, thân dài 1,1 mm. Rầy non tuổi 2 màu nâu vàng nhạt, lề ngực sau lõm ra phía trước, thân dài 1,5 mm. Rầy non tuổi 3 màu nâu vàng lẫn lộn, cĩ mầm cánh rõ, thân dài 2,0 mm. Rầy non tuổi 4 màu nâu vàng lẫn lộn, mầm cánh sau nhọn, thân dài 2,4 mm. Rầy non tuổi 5 nâu vàng lẫn lộn, mầm cánh trước dài hơn mầm cánh sau, thân dài 3,2 mm. Pha trưởng thành: Pha trưởng thành của rầy nâu cĩ 2 dạng cánh ngắn và cánh dài. 1.5.1.2. Phân bố Phân bố rất rộng, trên thế giới, chúng cĩ mặt ở Trung quốc, Đơng Nam Â, Ấn độ, Triều Tiên, Úc. Trong nước, rầy nâu cĩ mặt ở khắp các vùng trồng lúa nhất là các vùng lúa thâm canh. Chúng cĩ mặt ở vùng đồng bằng, ven biển, trung du cho đến các vùng núi cao như Điện Biên, Mù Căng Chải (Nguyễn Cơng Thuật, 1996). ởViệt Nam, do cách biệt về địa lý mà điểm ranh giới cách biệt là đèo Hải Vân, nơi hướng giĩ tây nam đổi hướng ra biển đơng, ngăn chặn sự lây lan của các quần thể rầy nâu giữa 2 miền đã hình thành nên 2 quần thể rầy nâu ở miền Nam và ở miền Bắc. 14
1.5.1.3. Tập tính sinh sống và quy luật phát sinh gây hại Rầy trưởng thành thường tập trung thành đám ở trên thân cây lúa phía dưới khĩm để hút nhựa. Khi bị khua động thì lẩn trốn bằng cách bị ngang hoặc nhảy sang cây khác, hoặc xuống nước, hoặc bay xa đến chỗ khác. Ban ngày trưởng thành ít hoạt động ở trên lá lúa. Chiều tối bị lên phía trên thân lúa hoặc lá lúa. Khi lúa ở thời kỳ chín, phần dưới của thân lúa đã cứng khơ thì ban ngày chúng tập trung phía trên cây lúa hoặc gần chỗ non mềm của cuống bơng để hút nhựa. Rầy trưởng thành cĩ xu hướng tránh ánh sáng mạnh (trừ rầy trưởng thành dạng cánh ngắn) do đĩ đêm tối trời, lặng giĩ, trời bức, chúng bay vào đèn nhiều nhất là khoảng 20-23 giờ. Tỷ lệ rầy cái và đực biến động và phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và trạng thái của cây lúa. Thời kỳ lúa đẻ nhánh - ngậm sữa, lúc dảnh lúa cịn non mềm thì tỷ lệ rầy cái 70-80 %, cịn khi thân lúa đã cứng (lúc lúa chín) thì tỷ lệ rầy cái và rầy đực tương đương. Sự xuất hiện rầy dạng cánh dài và cánh ngắn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và dinh dưỡng. Nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, thức ăn phong phú thì xuất hiện dạng cánh ngắn nhiều. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, thức ăn khơng thích hợp thì xuất hiện dạng cánh dài nhiều. Rầy dạng cánh ngắn cĩ thời gian sống dài, tỷ lệ cái/đực cao, số lượng trứng cao hơn loại cánh dài. Hơn nữa, rầy cánh ngắn đẻ trứng sớm hơn (vịng đời ngắn hơn) rầy cánh dài. Vì thế, khi rầy cánh ngắn xuất hiện nhiều thì hiện tượng “cháy rầy” dễ xẩy ra. Quá trình phát sinh của rầy như sau: Đầu vụ dạng cánh dài di cư từ lúa chét, cỏ dại, mạ vào ruộng lúa, đại đa số chúng là dạng cánh dài. Gặp lúa đẻ nhánh chúng sinh ra rầy non mà đa số sau này hình thành rầy cánh ngắn. Sự thay đổi tỷ lệ 2 loại hình trong quá trình phát triển của cây lúa nhưsau: Đầu vụ 90-100% cánh dài; Bắt đầu đẻ rộ 5-20% cánh ngắn; Ngậm sữa 70-80% cánh ngắn và tới khi lúa chín tỷ lệ rầy cánh ngắn chỉ cịn 20-25%. Tuy nhiên khi mật độ rầy quá cao mặc dù lúa cịn đang trong giai đoạn đẻ rộ 15
đến chín sữa, tỷ lệ rầy cánh dài cĩ xu thế tăng mạnh, chúng cần phải bay đi tìm nơi cĩ thức ăn thích hợp hơn. Rầy trưởng thành sau khi vũ hố 3 - 5 ngày thì bắt đầu đẻ trứng, thời gian đẻ trứng dài. Mỗi con cái cĩ khả năng đẻ từ 50-600 quả trứng. Chúng thường đẻ trứng vào buổi chiều. Trưởng thành đẻ trứng vào bẹ lá thành từng ổ ở phía dưới của cây lúa hoặc trong mơ thân non, tạo nên những đốm nhỏmàu trắng đục, sau chuyển thành màu hơi nâu. Trứng hình quảchuối, trước khi nở 3-5 ngày phía đầu cĩ điểm mắt màu nâu đỏ. Phía trên, ổ trứng xếp thành hàng đơn, phần dưới ổ trứng các quả trứng xếp thành hàng kép. Mỗi ổ cĩ từ 3 - 48 trứng. Thơng thường 15 - 30 trứng. Ngồi lúa, rầy cũng thích đẻ trứng trên cỏ lồng vực, cĩ khi số lượng rầy trên cỏ lồng vực nhiều hơn trên mạ. Trứng mới đẻ cĩ màu trắng sữa, sau biến thành màu vàng xám. Trứng nở rải rác trong một ngày. Tỷ lệ trứng nở cao trên 90%. Rầy nâu phát sinh gây hại, đầu tiên thành từng vạt giữa ruộng, sau đĩ lan dần ra quanh ruộng. Những ruộng trũng, đất tốt rầy thường phát sinh mạnh. Khi mật độ rầy cao, trong ruộng thường xuất hiện “váng rầy” là váng mỏng lan toả trong ruộng. Do rầy tiết ra chất đường mật nên nấm muội đen phát triển bám vào thân cây lúa. Qui luật phát sinh và mức độ gây hại liên quan nhiều yếu tố sinh cảnh. Thường thường khi nhiệt độ khơng khí cao, ẩm độ cao, lượng mưa nhiều trong một thời gian, sau đĩ trời hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch. Thơng thường nhiệt độ 20 – 30oC và ẩm độ từ 80 - 85% là điều kiện thích hợp cho rầy nâu sinh sống và phát triển. Hàng năm ở miền Bắc, rầy nâu cĩ thể hình thành 7-8 lứa. Trong đĩ cĩ 4 lứa cần được chú ý theo dõi là lứa rầy 2-3 phá hại vào tháng 4 - 5 (đối với vụ chiêm xuân đặc biệt vùng chiêm trũng) và lứa 5-6 phát sinh vào tháng 7 -9. 1.5.1.4. Mức độ gây hại Trong vịng 30 năm qua, rầy nâu luơn luơn là 1 trong các lồi sâu hại quan trọng nhất trên cây lúa. Trong các năm cuối của thập kỷ 70, 80 diện tích bị nhiễm rầy nâu dao 16
động quanh 1,0 triệu ha. Diện tích bị nhiễm nặng thường từ một vài trăm ha đến hàng nghìn ha. Trong các năm 1999, 2000 diện tích bị nhiễm rầy nâu và một phần là rầy lưng trắng cả nước là 570 000 ha, trong đĩ cĩ 34.000 bị nhiễm nặng và cĩ 420 ha bị cháy rầy. Mật độ rầy phổ biến là 1000-4000 con/m2, nơi cao là 5000-10000 con/m2. Năm 2000, ở miền Bắc cĩ 208000 ha bị nhiễm, trong đĩ cĩ 66 000 ha bị nhiễm nặng (Trung tâm BVTV phía Bắc, 2000). Ở miền Nam trong 2 năm 1999, 2000 diện tích nhiễm rầy tương ứng là 340 000 ha và 190 000 ha (HồVăn Chiến và CTV, 2000). Xu thế gây hại của rầy nâu vẫn cĩ chiều hướng tăng cao bởi vì giống lúa nhiễm rầy ngày càng được dùng rộng rãi trên 70% diện tích. Chẳng hạn năm 1999, ở Nam Bộ tỷ lệ giống nhiễm rầy là 70% vào vụ đơng xuân và 100% vào vụ mùa, trong khi đĩ ở miền Bắc các giống nhiễm rầy như C70, VN10, lúa lai, lúa thuần Trung Quốc chiếm từ 70-90% diện tích (Cục BVTV, 2000). Rầy trưởng thành và rầy non dùng miệng chích vào thân cây lúa để hút dịch cây. Bị hại nhẹ các lá dưới cĩ thể bị héo. Bị hại năng chúng gây nên hiện tượng “cháy rầy”, cả ruộng bị khơ héo, màu trắng tái hoặc trắng, năng suất cĩ thể giảm tới 50% hoặc mất trắng. Thơng thường khi bị hại chúng tạo nên các vết hại màu nâu đậm. Nếu bị rầy hại nặng thì phần dưới thân cây lúa cĩ màu nâu đen. Do tổ chức dẫn nhựa cây bị phá hại nghiêm trọng làm cho cây lúa bị khơ héo và chết. Lúa ở thời kỳ làm địng và trổ nếu bị rầy hại nặng thì tác hại càng nghiêm trọng hơn. Rầy cĩ thể hút nhựa ở cuống địng non, đồng thời rầy cái chích rách mơ thân cây để đẻ trứng. 17
Hình 1.7. Lúa bị rầy nâu tấn cơng Các vết thương cơ giới đĩ tạo điều điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập làm cho cây lúa thối nhũn, đổ rạp, gây nên hiện tượng bơng lúa bị lép một nửa hoặc tồn bộ. Hiện tượng cháy rầy đầu tiên mang tính cục bộ một vài m2, nhưng nếu gặp điều kiện thuận lợi vết cháy rầy lan toả rất nhanh lên tới 1 vài ha hoặc cả cánh đồng trong vịng 1-2 tuần. Rầy nâu là mơi giới truyền bệnh Lúa lùn xoắn lá làm cho cây lúa tuy vẫn giữ màu xanh nhưng bị thấp lùn, cĩ những lá bị xoăn nhiều vịng, trổ bơng muộn nhưng khơng thốt, ít hạt và hạt bị lép. 18
Hình 1.8. Triệu chứng bệnh lùn xoắn lá Hình 1.9. Triệu chứng lùn xoắn lá giai đoạn đẻ nhánh 19
Hình 1.10. Triệu chứng lùn xoắn lá giai đoạn trổ bơng 1.5.1.5. Biện pháp phịng trừ Biện pháp canh tác - Sử dụng giống kháng rầy, kể cả các giống kháng cao và các giống kháng vừa - Mật độ cấy hợp lý, bĩn phân cân đối, tránh bĩn quá nhiều đạm. Biện pháp hĩa học Các loại thuốc cĩ thể sử dụng gồm: Regent 800 WG, Admire 50EC, Trebon 10 EC, Applaud 10WP, Oncol 5 G, Actara. Biện pháp sinh học Sử dụng chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus. Trần Văn Huy (2012) cho biết hiệu lực trừ rầy nâu của chế phẩm Paecilomyces javanicus đạt từ 81,3 - 82,8% trong điều kiện nhà lưới. Trên đồng ruộng, hiệu lực của chế phẩm đạt từ 69,1 - 72,8% tại Hà Nội. Chế phẩm khơng gây ảnh hưởng tới mật độ quần thể các lồi thiên địch chính của rầy nâu trên ruộng lúa. 20
1.5.2. Tổng quan về rệp sáp Giới: Động vật Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Homoptera Họ: Pseudococcidae Chi: Planococcus Lồi: Planococcus lilacinus 1.5.2.1. Hình thái Khi nghiên cứu đặc điểm hình thái của rệp, tác giả Kosztarab et al., (1988) mơ tả rệp sáp Planococcus lilacinus cĩ hình ovan, cơ thể phủ đầy bột sáp trắng, phía lưng hơi phồng lên, bụng phẳng, nếu gạt lớp bột sáp ra cơ thể cĩ màu vàng nhạt. Cơ thể tuy được phủ nhiều bột sáp trắng, song vẫn để lại các ngấn đốt cơ thể rất rõ ràng, đặc biệt giữa lưng cĩ vệt rộng, dọc cơ thể khơng phủ sáp hoặc phủ sáp rất ít, đủ để thấy màu vàng nhạt của cơ thể (hình 1, 2, 3). Xung quanh cơ thể cĩ 17 cặp tua sáp ngắn và to, cặp thứ 17 hơi dài hơn các cặp khác. Quan sát mẫu slide dưới kính soi nổi cĩ độ phĩng dại hơn 40 lần, xung quanh cơ thể cĩ 18 cặp cerarii. Mỗi cặp cerarii là vị trí tạo ra tua sáp xung quanh cơ thể, riêng cặp cerarii thứ 18 khơng tạo tua sáp như những tua sáp khác mà chỉ là mẫu sáp nhỏ bị che khuất dưới cặp tua 17. 21
Hình 1.11. Rệp sáp Planococcus lilacinus 1.5.2.2. Đặc điểm sinh thái Nguyễn Thị Thủy và cộng sự (2006) cho biết rệp sáp P. lilacinus hại cà phê tại Đăk Lăk vịng đời ngắn từ 34,19 ngày đến 38,86 ngày, khả năng sinh sản cao, mỗi rệp cái đẻ được từ 144,75 đến 150,4 trứng (trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 27,82oC – 28,76oC và ẩm độ trung bình từ 79,43% - 80,94%). Rệp cĩ thể hồn thành 9-10 lứa trong năm. Theo Lê Đức Khánh (2003) vịng đời của rệp sáp trên cam từ 26-78 ngày. Rệp phát sinh và gây hại quanh năm, nhiều nhất vào mùa hè và mùa thu. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Chắt (1999) cho thấy rệp sáp cà phê đẻ từ 800 - 1000 trứng. Trứng đẻ thành ổ cĩ màng và lớp sáp trắng bao phủ. Giai đoạn trứng kéo dài 3 - 4 ngày, rệp non trải qua ba tuổi kéo dài từ 14 - 24 ngày. Rệp cái sau khi hĩa trưởng thành thường nằm im tại chỗ để chích hút rất ít di chuyển, ấu trùng đực lúc này được bao bọc bằng lớp kén trắng. 1.5.2.3. Triệu chứng và mức độ gây hại Theo Nguyễn Thị Thu Cúc và ctv. (1997), rệp sáp rệp sáp P. lilacinus rất phổ biến trên cây mãng cầu, phát sinh trong suốt năm, gây hại nặng vào tháng 2-4 hàng năm. Rệp 22
sáp chích hút trên lá và quả gây biến dạng lá và quả khơng lớn được. Rệp sáp khơng những chích hút dinh dưỡng của cây trồng làm cho cây bị suy kiệt, chậm phát triển, mà cịn tạo điều kiện cho các loại nấm bồ hĩng sống ký sinh. Do ảnh hưởng của nấm bồ hĩng lá cây, trái cây và cả đọt non bị phủ đen làm ảnh hưởng rất lớn đến khả năng quang hợp (Nguyễn Thị Chắt, 2003). Con cái bám chặt vào những bộ phận non của cây hút nhựa và cĩ khả năng đẻ hàng trăm quả trứng nhỏ li ti ở ngay dưới bụng. Khi mới nở rệp non cĩ chân để phân tán ra xung quanh, sau đĩ chân bị thối hố dần và chúng bám dính ở một chỗ để chích hút nhựa của cây cho đến khi trưởng thành. Khi cây chưa ra hoa kết quả thì rệp thường bu bám ở mặt dưới của lá (chủ yếu là ở những lá cịn non) để hút nhựa và sinh sản. Từ khi cây ra hoa và nhất là từ lúc cây mãng cầu cĩ quả non trở đi thì chúng xuất hiện nhiều trên quả (rệp thường bám ở những chỗ kẽ giữa các mặt của quả mãng cầu, vì ở những chỗ này vỏ của quả mỏng dễ hút nhựa hơn). Nếu mật độ cao, rệp cĩ thể bao phủ cả bề mặt của quả làm cho quả non bị rụng hoặc bị khơ tĩp lại đeo bám trên cây. Nếu bị hại nhẹ quả vẫn phát triển nhưng ăn rất nhạt. Khi chích hút trái mãng cầu, rệp sáp tiết ra chất mật ngọt tạo điều kiện cho nấm bồ hĩng phát triển làm cây sinh trưởng kém. Rệp sáp phấn xuất hiện quanh năm trên các vườn mãng cầu, gây hại nặng vào mùa nắng. Hình 1.12. Rệp sáp gây hại trên quả mãng cầu 23
1.5.2.4. Biện pháp phịng trừ Biện pháp canh tác: Cắt tỉa cành tạo tán thơng thống để tránh độ ẩm cao. Biện pháp sinh học: Bảo vệ và lợi dụng thiên địch tự nhiên như: Bọ rùa, nhện, kiến vàng, bọ cánh cứng. Biện pháp hĩa học: Sử dụng thuốc hĩa học gốc Lân hữu cơ cĩ hiệu quả đối với Rệp Sáp nhưng khơng sử dụng liên tục một loại nhất định, nên sử dụng thuốc phối hợp thuốc hĩa học với Dầu khống (0,5%), tuy nhiên để tránh ảnh hưởng của Dầu khống đối với cây trồng, nồng độ thuốc theo khuyến cáo trên bao bì thuốc khi sử dụng. Dùng Sherpa, Suprathion, Trebon, Confidor 100SL, Actara 25WG, Ecasi 20EC phun nồng độ theo khuyến cáo của nhà sản xuất phun trong 1-2 lần ở thời kỳ lá non. Khi xuất hiện rệp, muốn trị cĩ hiệu quả cần pha thêm vào thuốc một ít xà phịng để phá lớp sáp phủ trên người rệp là để cho thuốc dễ thấm (Cao Văn Chí, 2013). 1.5.3. Tổng quan về rệp muội Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Aphididae Chi: Brevicoryne Lồi: Brevicoryne brassacicae 1.5.3.1. Hình thái Rệp muội cĩ màu xám hoặc xám xanh, đầu và ngực cĩ màu sẫm hơn. Khi trưởng thành cơ thể được phủ một lớp sáp rất mỏng. Rệp cĩ 2 loại hình đĩ là cĩ cánh và loại khơng cánh. Kích thước của chúng vào loại trung bình. Chiều dài trung bình của loại hình khơng cánh vào khoảng 2,10 – 2,50 mm. Loại hình cĩ cánh vào khoảng 2,0 – 2,30 24
mm. Râu đầu của rệp cĩ 6 đốt, chiều dài của râu gần bằng 1/2 chiều dài thân. Ở loại hình khơng cánh, trên đốt râu thứ 3 khơng cĩ lỗ thính giác. Ngược lại ở loại hình rệp cĩ cánh, các lỗ thính giác này nằm rải rác ở trên đốt râu thứ 3 này. Đốt vịi cuối cùng kéo dài tới ổ chậu chân giữa. (Nguyễn Xuân Thành, 2010). Hình 1.13. Rệp muội Brevicoryne brassacicae 1.5.3.2. Đặc điểm sinh thái Rệp thường xuyên sống quần tụ thành một quần thể. Rệp xám phát triển quanh năm khơng cĩ hiện tượng qua đơng hoặc qua hè. Ấu trùng rệp xám cĩ 4 tuổi. Thời gian phát triển của rệp non như sau: - Tuổi 1 từ 1,7 – 2 ngày - Tuổi 2 phát triển 1,6 – 2,3 ngày - Tuổi 3 1,8 – 2,6 ngày - Tuổi 4 phát triển từ 1,7 – 2,8 ngày 25
Hình 1.14. Vịng đời của rệp Brevicoryne brassacicae Trong điều kiện thuận lợi, vịng đời trung bình của một cá thể rệp khoảng 30 ngày. Rệp con sinh ra sẽ phát triển trong khoảng 4 đến 10 ngày để trưởng thành và bắt đầu sinh sản ra các thế hệ mới. Khả năng đẻ của loại hình khơng cánh đạt trung bình từ 24 – 32 con. Đối với loại hình cĩ cánh, sức đẻ ít hơn nhiều, chỉ đạt 5 – 15 ấu trùng. 1.5.3.3. Triệu chứng và mức độ gây hại Rệp chích hút dịch ở tất cả các bộ phận (thân, lá, hoa, quả) trên cây, làm cho cây cịi cọc. Các bộ phận bị châm hút sẽ biến dạng, chuyển màu (quăn lá, úa vàng, bị rụng trái, nếu là bắp cải sẽ khĩ cuộn). Khi cây bị gây hại nặng cĩ thể chết. Trong thời gian cây cịn bé, rệp thường bám mặt dưới lá non chích hút nhựa. Ngồi gây hại trực tiêp, rệp cịn là đối tượng truyền bệnh virus cho rau. Trong trường hợp gặp nhiều điều kiện thức ăn, mơi trường tối ưu, chúng cĩ khả năng gây thiệt hại rất lớn cho rau thập tự. (Nguyễn Xuân Thành, 2010). 26
Hình 1.15. Rệp bám và hút chích dưới mặt lá Hình 1.16. Rau bị hư hại do rệp muội tấn cơng 27
Trong năm rệp xám cĩ 2 đỉnh cao. Thứ nhất xuất hiện vào vụ bắp cải muộn (cuối tháng 2 đầu tháng 3), mật độ gây hại cĩ thể từ 500 – 1500 con/m2. Đỉnh cao thứ 2 xuất hiện và phá hại vào cuối tháng 11 đầu tháng 12 trên bắp cải sớm, cải xanh, Mật độ dao động từ 200 – 1300 con/m2. (Nguyễn Xuân Thành, 2010). Rệp là mối quan tâm nơng nghiệp bởi vì nĩ là một vector của ít nhất 20 loại virus gây bệnh mà cĩ thể gây ra các bệnh ở rau thập tự và cam quýt. 1.5.3.4 . Biện pháp phịng trừ Biện pháp canh tác: Bĩn phân cân đối, tưới nước hợp lý, chăm sĩc cho cây ra lộc tập trung. Thu ngắt các lộc non bị hại nặng. Biện pháp hĩa học: Dùng thuốc Confidor 100SL, Actara 25WG, Ecasi 20EC Anvado 100WP (thuốc cung tên) 100g/16l nước, Suprasite 20ml/10l nước, Sherpa hoặc Trebon với nồng độ theo khuyến cáo của nhà sản xuất phun trong 1-2 lần ở thời kỳ lá non (Cao Văn Chí, 2013). Một nghiên cứu về tính kháng thuốc trừ sâu của rệp trên bắp cải thực hiện tại Pakistan báo cáo rằng rệp cĩ khả năng kháng hĩa chất bao gồm methomyl, emamectin benzoate và pyrethroid (cypermethrin, lambdacyhalothrin, bifenthrin và deltamethrin) và neonicotinoids (imidacloprid, acetamiprid, và thiamethoxam) (Ahmad và Akhtar 2013). Biện pháp sinh học Sử dụng các thiên địch như bọ rùa, kiến, dịi ăn thịt, nhện để tiêu diệt rầy mềm. Lưu ý, thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) khơng hiệu quả trên rệp (Hines và Hutchison 2013, Webb 2010). 28
1.5.4. Tổng quan về rệp muội nâu đen Toxoptera sp hại cây hồ tiêu Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Aphididae Chi: Toxoptera Lồi: Toxopter sp 1.5.4.1. Đặc điểm hình thái Trưởng thành cĩ cánh hoặc khơng cánh. Kích thước của trưởng thành cái (khơng cánh và cĩ cánh) dài khoảng 1,7 – 2,1mm. Giai đoạn ấu trùng cĩ màu nâu. Trưởng thành cái khơng cánh cĩ hình bầu dục nâu đen hoặc nâu đỏ, bĩng. Vịng đời Texoptera kéo dài 7 – 9 ngày, mỗi rệp trưởng thành cái cĩ khả năng đẻ trung bình 41,4 trứng, mỗi ngày đẻ khoảng 5 – 7 trứng. Tuổi thọ của thành trùng cao nhất khoảng 44,2 ngày (Nguyễn Văn Đĩnh, 2012). Hình 1.19. Rệp muội Texoptera sp 29
1.5.4.2. Triệu chứng gây hại Rệp muội nâu đen gây hại ở cả giai đoạn trưởng thành và ấu trùng, chúng chích hút dinh dưỡng từ cây trồng, làm cho cây bị biến dạng, lá non bị cong, cuốn lại. Chúng thường tập trung gây hại trên đọt non, làm đọt khơng phát triển, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, đặc biệt là cây con. Chất thải của rệp muội nâu đen chứa nhiều dinh dưỡng, tạo mơi trường thuận lợi cho nấm bồ hĩng phát triển, làm đen lá và đọt cây, dẫn đến làm giảm khả năng quang hợp, giảm khả năng hơ hấp của cây (Nguyễn Văn Đĩnh, 2012). Hình 1.20. Rệp Texoptera sp trên lá cây Hồ tiêu 30
Hình 2.21. Rệp Texoptera sp hút chích trên ngọn cây Hồ tiêu 1.5.4.3. Biện pháp phịng chống Biện pháp hĩa học: Dùng các loại thuốc cĩ hoạt chất Thiamethoxam, Pymetrozin, Profenofos hay hỗn hợp (Profenofos + Cypermethrin), để kiểm sốt các loại rệp muội. Biện pháp sinh học: sử dụng một số lồi thiên địch như ruồi ăn rệp Allograpta obliqua Say, bọ rùa ăn rệp Coccinela inaequalis Fabricius, ong ký sinh Aphelinus semiflavus ((Nguyễn Văn Đĩnh, 2012) 31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài nghiên cứu sẽ tiến hành từ tháng 3/2016 đến tháng 8/2016 tại phịng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường của trường Đại Học Cơng Nghệ TP HCM 2.2. Vật liệu 2.2.1. Dụng cụ - Hộp nuơi sâu - Bao nhựa, giấy báo - Đĩa petri - Đèn cồn - Panh, chổi lơng bắt sâu Thiết bị - Cân điện tử - Kính hiển vi - Máy xay sinh tố - Các loại cốc thủy tinh - Tủ lạnh - Các loại pipette - Máy ly tâm - Đầu tuýp - Nồi hấp khử trùng - Ống nghiệm - Bếp từ - Bút lơng ghi mẫu - Bơng gịn, khăn giấy - Bể ủ 2.2.1. Hĩa chất - Agar - Mơi trường tổng hợp PDA - Methylene Blue - D-Glucose 32
2.2.2. Chủng nấm Paecilomyces lilacinus Chủng nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường, Đại học Cơng Nghệ TpHCM – HUTECH. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Ống giống Lây nhiễm lại trên rệp Phân lập lại nấm từ rệp bị chết Tăng sinh Giống được hoạt hĩa Nhân giống trên mơi trường PDA Cấy vào ống thạch nghiên giữ giống Lên men tạo chế phầm Chế phẩm Thử hiệu lực trên rệp sáp, rầy nâu, rệp muội Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 33
2.3.1. Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên rệp sáp 2.3.1.1. Phân lập Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuơi trên lá, cuống lá được quấn bằng bơng hút ẩm để giữ lá tươi, khơng bị héo. Phun nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014), lên rệp sáp. Hằng ngày quan sát và thu rệp sáp bị chết. Các cá thể rệp sáp bị chết được cho vào đĩa petri cĩ đặt giấy ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đĩ tiến hành phân lập nấm ký sinh trên mơi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997). 2.3.1.1. Tạo dịng thuần Bước 1: Nấu mơi trường PDA, sau đĩ đem hấp tiệt trùng 121oC (áp suất 1atm), trong thời gian 15 phút, sau đĩ để nguội 50oC và bổ sung kháng sinh Chloramphenicol (1 g/l). Đổ mơi trường ra đĩa đã được hấp vơ trùng và để nguội. Bước 2: Cấy phân lập nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu rệp sáp bị kí sinh, dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đĩ làm nguội và chấm nhẹ vào điểm cĩ bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể bọ và khơng bị nhiễm tạp sau đĩ cấy 3 điểm nhẹ lên bền mặt mơi trường. Để đĩa mơi trường cấy phân lập trong phịng thí nghiệm 2 – 3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa mơi trường khác nhau để làm thuần chủng. 2.3.1.2. Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) a) Quan sát hình thái khuẩn lạc Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mơ tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa mơi trường PDA và được ủ 2 tuần. Quan sát mơ tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của mơi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử trong thời gian nuơi ủ. 34
b) Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phịng ẩm) Phương pháp làm phịng ẩm: Chuẩn bị một đĩa mơi trường PDA và một đĩa petri vơ trùng nuơi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vơ trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa mơi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuơi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces sp. cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đĩ đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vơ trùng cho ướt tồn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 2 – 3 ngày). Hình 2.2. Phịng ẩm Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch cĩ sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phĩng 35
đại 400 lần và mơ tả đặc điểm: Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử 2.3.2. Xác định mơi trường nhân sinh khối tạo chế phẩm. Thí nghiệm xác định mơi trường nhân giống được bố trí với 4 cơng thức tương ứng với 4 loại mơi trường đang được dùng phổ biến hiện nay: CT1: Mơi trường cám gạo CT2: Mơi trường lúa CT3: Mơi trường ngơ mảnh CT4: Mơi trường gạo tấm Mỗi cơng thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một chai mơi trường nhân sinh khối nấm với các thành phần tương ứng các cơng thức thí nghiệm. Thực hiện: Cân 100g mơi trường, phân phối vào chai 500ml, bổ sung vào 60ml nước cĩ kháng sinh chloramphenicol nồng độ 1 g/l. Dùng bơng gịn khơng thấm nước làm nút chai. Hấp tiệt trùng 121oC, 1 atm, 15 phút, để nguội. Mật độ cấy giống ban đầu 1,66x107 CFU/g, lên men ở nhiệt độ phịng, thời gian lên men 14 ngày Chỉ tiêu theo dõi: số lượng bào tử. Xác định số lượng bào tử sau 14 ngày nuơi cấy bằng phương pháp pha lỗng sinh khối và cấy trang trên mơi trường PDA, đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa. 36
2.3.3. Ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bố trí thí nghiệm Cơng thức Hoạt chất Liều sử dụng 1 Plutel 1.8 EC Abamectin 0,9 ml/l 2 Sherpa 25EC Cypermethrin 1,2 ml/l 3 Oshin 20WP Dinotefuran 0,06 g/l 4 Actara 25WG Thiamethoxam 0,06 g/l 5 Đối chứng Khơng bổ sung thuốc Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần một đĩa petri, thực hiện trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ phịng. Tiến hành: – Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và mơi trường nuơi cấy Nguồn nấm Paecilomyces lilacinus: Chủng Paecilomyces lilacinus được nuơi cấy trên mơi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phịng trong 14 ngày. Mơi trường nuơi cấy: Mỗi chai mơi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút sẽ được để nguội đến 50oC rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. – Tiến hành nuơi cấy Đổ đĩa và để nguội cho đến khi mơi trường đơng lại trong đĩa petri rồi dùng que cấy đục lỗ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch cĩ chứa nấm Paecilomyces sp. từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa mơi trường vừa chuẩn bị xong. 37
Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phịng. Chỉ tiêu theo dõi – Đo đường kính tản nấm (cm) ở các ngày sau cấy đến khi tản nấm ở cơng thức đối chứng chạm thành đĩa thì ngừng theo dõi. dd12 – Đường kính trung bình tính theo cơng thức: d (Trong đĩ, d và d là hai 2 1 2 đường chéo tản nấm phân bố) Đường kính khuẩn lạc (cm) và tính phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo cơng thức: I = [(C-T)]/C]x100 Trong đĩ: I: % khuẩn lạc bị ức chế. C: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. T: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Đánh giá cấp độ ảnh hưởng của thuốc theo (Hassan,1989). - Cấp 1: khơng ảnh hưởng ( 90 %) 2.3.4. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm trong điều kiện phịng thí nghiệm Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GƯKÇE và M. Kubilay ER. (2004), các cá thể sâu bọ trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngồi tự nhiên được bỏ các hộp cĩ nắp đậy được đục lỗ. 38
2.3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết rầy nâu Nilaparvata lugens Stal của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Phun thuốc Actara 25WG 0,06g/L Cơng thức 2: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces lilacinus cĩ nồng độ 2,08x108 CFU/ml. Cơng thức 3: Phun nước cất Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần nhắc, mỗi lần là một hộp 20 cá thể rầy nâu nằm trên lá lúa thu được ngồi tự nhiên Chỉ tiêu theo dõi: – Số lượng rầy nâu bị chết – Hiệu lực gây chết (%) được tính theo cơng thức Abbot (1925): Ca-Ta M%=x100 Ca Trong đĩ: Ca là số rầy nâu sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số rầy nâu sống ở cơng thức thí nghiệm sau thí nghiệm 2.3.4.2. Đánh giá khả năng gây chết rệp sáp Planococcus lilacinus của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Phun thuốc Abamectin 1,8EC 1ml/L Cơng thức 2: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces lilacinus cĩ nồng độ 2,08x108 CFU/ml. Cơng thức 3: Phun nước cất 39
Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần nhắc, mỗi lần là một hộp 20 cá thể rệp nằm trên cây lá thu được ngồi tự nhiên Chỉ tiêu theo dõi: – Số lượng rệp sáp bị chết – Hiệu lực gây chết (%) được tính theo cơng thức Abbot (1925): Ca-Ta M%=x100 Ca Trong đĩ: Ca là số rệp sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số rệp sống ở cơng thức thí nghiệm sau thí nghiệm 2.3.4.3. Đánh giá khả năng gây chết rệp muội Brevicoryne brassaciae của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Phun thuốc Abamectin 1,8EC 1ml/L Cơng thức 2: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces lilacinus cĩ nồng độ 2,08x108 CFU/ml. Cơng thức 3: Phun nước cất Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần nhắc, mỗi lần là một hộp 20 cá thể rệp nằm trên lá thu được ngồi tự nhiên Chỉ tiêu theo dõi: – Số lượng rệp muội bị chết – Hiệu lực gây chết (%) được tính theo cơng thức Abbot (1925): Ca-Ta M%= x100 Ca 40
Trong đĩ: Ca là số rệp muội sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số rệp muội sống ở cơng thức thí nghiệm sau thí nghiệm 2.3.5. Đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trừ rệp Toxoptera sp hại cây hồ tiêu Điều tra mức độ gây hại của rệp trên cây hồ tiêu Điều tra theo “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây hồ tiêu” QCVN 01 - 172: 2014/BNNPTNT. Điều tra 10 điểm, mỗi điểm điều tra 1 trụ, trên mỗi trụ điều tra lá non ở 3 tầng tán (tầng gốc, tầng giữa và tầng ngọn), mỗi tầng điều tra 5 lá non ngẫu nhiên. Tính mật độ rệp: Tổng số rệp Mật độ rệp (con / lá non) = Tổng số lá điều tra Đánh giá hiệu lực chế phẩm Paecilomyces lilacinus trên rệp Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên Cơng thức 1 (đối chứng): phun nước Cơng thức 2: phun nấm Paecilomyces lilacinus, nồng độ 2,5x108 CFU/ml Mỗi cơng thức lặp lại 5 lần, mỗi lần nhắc là 1 trụ hồ tiêu Chỉ tiêu theo dõi: mật độ rầy mềm qua 7 ngày phun nấm Hiệu lực gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus được tính theo cơng thức Henderson Tilton (1955) Ta ×Cb Hiệu lực (%) = (1 − ) × 100 Tb ×Ca Trong đĩ: Ta: Số rệp sống ở cơng thức thí nghiệm sau phun Tb: Số rệp sống ở cơng thức thí nghiệm trước phun 41
Ca: Số rệp sống ở cơng thức đối chứng sau phun Cb: Số rệp sống ở cơng thức đối chứng trước phun 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm SAS 9.4 và Excel 2016 để xử lý số liệu cĩ được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong SAS 9.4 (Statistical Analysis System) theo trình tự: - Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu - So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 95%. 42
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập lại chủng nấm Paecilomyces lilacinus từ rệp sáp Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces lilacinus của Phùng Lê Kim Yến (2014), sinh viên tiến hành phun lại trên rệp sáp và theo dõi trong phịng thí nghiệm. Từ những cá thể rệp sáp bị nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và cho những kết quả như sau: Sau 3 ngày nuơi cấy, trên mơi trường PDA đã xuất hiện tản nấm cĩ màu trắng xốp sau sang màu hồng rồi màu hồng tím. Hình 3.1. Khuẩn lạc Paecilomyces lilacinus Quan sát dưới kính hiển vi phĩng đại 400x, sinh viên nhận thấy sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể bình hình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi. 43
Hình 3.2. Quan sát sợi nấm dưới kính hiển vi 400x Điều này trùng khớp với mơ tả của Trần Văn Mão, 2002. Trên những cơ sở trên, cĩ thể khẳng định chủng nấm này là Paecilomyces lilacinus và được dùng cho những thí nghiệm trong đồ án này. 44
3.2. Xác định mơi trường nhân sinh khối bào tử nấm Paecilomyces lilacinus Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của nấm Paecilomyces lilacinus trên các loại mơi trường nhân sinh khối Cơng thức Mật độ bào tử (CFU/g) Log mật độ bào tử CT1: Mơi trường cám gạo 1,38 x 1010 10,14 b CT2: Mơi trường lúa 2,2 x 108 8,35 c CT3: Mơi trường ngơ 1,95 x 1010 10,29 a mảnh CT4: Mơi trường gạo tấm 2,08 x1010 10,32 a LSD0,05 0,05 CV (%) 0.29 Ghi chú: a, b, c, d là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm SAS 9.4. Trong đĩ, các cơng thức cĩ chỉ số giống nhau thì sự sai khác khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95%. Những cơng thức cĩ chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa về mặt xử lí thống kê ở mức 95%. Bảng 3.1, cho thấy, trong 4 loại mơi trường đã thí nghiệm, mơi trường gạo tấm và mơi trường ngơ mảnh là thích hợp nhất cho chủng nấm Paecilomyces lilacinus phát triển. Mật độ bào tử nấm đạt xấp xỉ 2x1010 CFU/g khi nhân nuơi trên mơi trường ngơ mảnh và gạo tấm. Trong điều kiện tương tự, mật độ bào tử chỉ đạt 1,38 x 1010 CFU/g khi nuơi trên mơi trường cấm trấu và đạt thấp nhất khi nuơi trên mơi trường lúa (2.2x108 CFU/g). Mặc dù khơng cĩ sự khác nhau về số lượng bào tử đạt được trên 2 loại mơi trường gạo tấm và ngơ mảnh nhưng về chi phí nguyên liệu, giá thị trường của ngơ mảnh là 11000 đồng/kg, đắt hơn so với gạo tấm là 9000 đồng/kg. Do đĩ, xét về tính kinh tế 45
khi sản xuất ở quy mơ lớn, sử dụng mơi trường gạo tấm sản phẩm sẽ cĩ giá thành giảm hơn đáng kể. Hình 3.3. Sinh khối nấm được nhân nuơi trên mơi trường ngơ mảnh Hình 3.4. Sinh khối nấm được nhân nuơi trên mơi trường cám 46
Hình 3.5. Sinh khối nấm được nhân nuơi trên mơi trường lúa Hình 3.6. Sinh khối nấm được nhân nuơi trên mơi trường gạo tấm 47
Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus trên mơi trường gạo tấm với dụng cụ là các khay kích thước 50x50cm. Mỗi khay là 1 kg gạo tấm ngâm nở, hấp tiệt trùng 121oC, 1 atm, 15 phút. Mật độ cấy giống ban đầu là 2,08x109 CFU/g , lên men ở nhiệt độ phịng, thời gian lên men 14 ngày. Bảng 3.2. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus nhân nuơi trên khay gạo tấm Mật độ bào tử CFU/g Khay 1 2,36 × 1011 Khay 2 2,50 × 1011 Khay 3 2,42 × 1011 Kết quả ở bảng 3.2 và hình cho thấy, nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt trên mơi trường gạo tấm. Sau 14 ngày nuơi cấy, mật độ bào tử đạt từ 2,36 × 1011 đến 2,50 × 1011 CFU/g. Hình 3.7. Nhân nuơi nấm Paecilomyces lilacinus trên khay 48
3.3. Ảnh hưởng của các loại thuốc bảo vệ thực vật đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Các loại thuốc bảo vệ thực vật cĩ nguồn gốc hĩa học lẫn sinh học được sử dụng để diệt trừ sâu bệnh hại cây trồng, trong đĩ nhiều loại thuốc hĩa học được người nơng dân ưu tiên sử dụng do phổ tác dụng rộng và hiệu quả nhanh. Vì vậy, sinh viên thực hiện thí nghiệm này với mục đích đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus trong mơi trường cĩ thuốc BVTV. Từ đĩ cĩ thể sử dụng một cách hiệu quả khi phun nấm kí sinh cơn trùng khi cĩ mặt của thuốc BVTV khác. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của một số loại thuốc BVTV đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus Cơng thức Hoạt chất Tỷ lệ ức chế (%) Cấp độ ức chế 1. Phutel 1,8EC Abamectin 67,27 a 2 2. Sherpa 25EC Cypermethrin 36,67 c 1 3. Oshin 20WP Diotefuran 26,48 d 1 4. Actara 25WP Thiamethoxam 46,59 b 1 LSD0,05 8.85 CV (%) 9.19 49
A B C D E Hình 3.8. Ảnh hưởng của một số loại thuốc BVTV đến sự phát triển của nấm Paecilomyces. A: Đối chứng; B: Sherpa; C: Actara; D: Oshin; E: Phutel Số liệu ở bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 14 ngày sau nuơi cấy, trong 4 loại thuốc đánh giá, Plutel 1.8 EC cĩ ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của chủng nấm, khuẩn lạc nấm bị ức chế 67,29 %, cấp độ ảnh hưởng là cấp 2 (cấp yếu). Sherpa 25 EC, Oshin 20 WP, Actara 25 WG hầu như khơng ảnh hưởng, khuẩn lạc nấm bị ức chế dưới 50%, cấp độ ảnh hưởng là cấp 1, xem như khơng ảnh hưởng. Vì vậy, cĩ thể sử dụng kết hợp nấm Paecilomyces sp với các loại thuốc BVTV cĩ hoạt chất như trên. 50
3.4. Khả năng gây chết cơn trùng chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus nhân trên mơi trường gạo tấm. Theo Phùng Lê Kim Yến (2014) và Nguyễn Thị Xuân Hương (2015), chủng nấm Paecilomyces lilacinus phân lập từ bọ phấn cĩ khả năng diệt được rệp sáp và rệp Aphis gossypii với hiệu lực từ khoảng 85%. Liệu hoạt lực của chủng nấm này cĩ được duy trì sau khi nhân nuơi trên mơi trường nhân tạo hay khơng? Để trả lời cho câu hỏi này, sinh viên tiến hành đánh giá hiệu lực diệt trừ sâu chích hút trong điều kiện phịng thí nghiệm của chế phẩm thơ sau khi nhân nuơi trên mơi trường gạo tấm, Kết quả được trình bày như sau: 3.4.1. Khả năng gây chết rầy nâu Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) được đánh giá là một trong những dịch hại quan trọng nhất trên cây lúa hiện nay khơng chỉ ở Việt Nam mà cịn ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới. Rầy nâu khơng chỉ gây hại trực tiếp bằng cách chích hút dịch cây lúa làm cản trở quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa mà nguy hại hơn, chúng cịn là tác nhân mơi giới lây truyền các loại virus rất nguy hiểm trên cây lúa, trong đĩ hiện nay là virus vàng lùn, lùn xoắn lá. Hiện nay, việc phịng trừ rầy nâu ở Việt Nam chủ yếu là thuốc hĩa học và sử dụng với liều lượng cao, gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng, gây ơ nhiễm mơi trường, mất cân bằng sinh thái. Vì vậy, sinh viên thực hiện thí nghiệm này mục đích tìm ra nấm Paecilomyces cĩ hiệu lực gây chết rầy nâu để cĩ hướng sử dụng cho sản xuất nơng nghiệp, thay thế thuốc BVTV cĩ nguồn gốc hĩa học. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4. 51
Bảng 3.4. Số rầy nâu chết ở các ngày sau phun thuốc Số rầy nâu chết Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1. Actara 4,67 ± 0.58 a 11,67 ± 1.15 a 19,00 ± 1,00 a 2. Nấm Paecilomyces 2,67 ± 0.58 b 9,67 ± 0.58 b 17,67 ± 0,58 a lilacinus 3. Nước cất 0,33 ± 0.58 c 2 ± 1 c 2,67 ± 1 b CV % 22,59 12,12 5,68 LSD0,05 1,15 1,88 1,49 Ghi chú: Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc là 20 cá thể rầy nâu. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Bảng 3.5. Hiệu lực gây chết rầy nâu Hiệu lực gây chết rầy nâu (%) Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày 1. Actara 22,02 a 53,82 a 94,23 a 2. Nấm Paecilomyces 11,84 b 42,58 b 86,60 a lilacinus 3. Nước cất - - - CV % 10,65 5,45 12,29 LSD0,05 3,45 3,2 12,12 Ghi chú: Số liệu hiệu lực (%) được chuyển đổi về arcsin. a, b, c, d là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm SAS 9.4. Trong đĩ, các cơng thức cĩ 52
chỉ số giống nhau thì sự sai khác khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95%. Những cơng thức cĩ chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa về mặt xử lí thống kê ở mức 95%. Hiệu lực gây chết rầy nâu 100.00 94.23 86.60 90.00 80.00 70.00 60.00 53.82 50.00 42.58 40.00 Hiệu lực (%) 30.00 22.02 20.00 11.84 10.00 0.00 3 ngày 5 ngày 7 ngày Actara Nấm Pae Hình 3.9. Hiệu lực gây chết rầy nâu qua các ngày sau phun thuốc Kết quả đánh giá khả năng gây chết rầy nâu của nấm Paecilomyces lilacinus (bảng 3.3 và bảng 3.4) trong phịng thí nghiệm cho thấy: Tỷ lệ ký sinh gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus trên rầy nâu sau 7 ngày là 86,60% so với thuốc hĩa học thường dùng là Actara là 94,23%. Tuy nhiên, sự sai khác về khả năng gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus và thuốc hĩa học khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này chứng tỏ, nấm Paecilomyces lilacinus cĩ hiệu lực diệt trừ rầy nâu tương đương với thuốc hĩa học Actara. Để kiểm tra, sinh viên đã tiến hành soi kính các cá thể bị chết, kết quả cho thấy 100% rầy nâu bị chết ở cơng thức phun nấm đều cĩ sợi nấm bao quanh cơ thể và khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm trên cơ thể bọ phấn là nấm Paecilomyces lilacinus. 53
Hình 3.10. Rầy nâu bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 40x Hình 3.11. Rầy nâu bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 100x 54
3.4.2. Khả năng gây chết rệp sáp Rệp sáp Planococcus lilacinus là cơn trùng chích hút gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là các loại cây ăn quả, ăn lá gây hại trực tiếp đến sự sinh trưởng phát triển của cây trồng. Hiện nay, việc phịng trừ rệp sáp ở Việt Nam chủ yếu là thuốc hĩa học nhưng trên thế giới người ta đã sử dụng nấm Paecilomyces sp để trừ rệp sáp và kết hợp cho cây trồng rất là hiệu quả. Vì vậy, sinh viên thực hiện thí nghiệm này mục đích tìm ra nấm Paecilomyces lilacinus cĩ hiệu lực gây chết rệp sáp để cĩ hướng sử dụng cho sản xuất nơng nghiệp. Bảng 3.6. Số rệp sáp Planococcus lilacinus chết ở các ngày sau phun thuốc Số rệp sáp chết trung bình Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin 5,33 ± 1.15 a 11,67 ± 1.15 a 18,67 ± 1.15 a Nấm Paecilomyces lilacinus 2,67 ± 0.58 b 7,33 ± 0.58 b 17,00 ± 1.00 a Nước cất 0,00 c 0,00 c 0,00 b CV (%) 15,00 11,77 7,42 LSD 1,49 1,45 1,76 Ghi chú: Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc là 20 cá thể rệp sáp. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. 55
Bảng 3.7. Hiệu lực gây chết rệp sáp Planococcus lilacinus Hiệu lực gây chết rệp sáp (%) Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin 26,67 a 58,33 a 93,33 a Nấm Paecilomyces lilacinus 13,33 b 36,67 b 85,00 a CV (%) 15,00 7,48 13,15 LSD0,05 5,29 4,37 12,75 Ghi chú: Số liệu hiệu lực (%) được chuyển đổi về arcsin. a, b, c, d là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm SAS 9.4. Trong đĩ, các cơng thức cĩ chỉ số giống nhau thì sự sai khác khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95%. Những cơng thức cĩ chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa về mặt xử lí thống kê ở mức 95%. Hiệu lực gây chết rệp sáp 100.00 93.33 90.00 85.00 80.00 70.00 58.33 60.00 50.00 36.67 Hiệulực 40.00 26.67 30.00 20.00 13.33 10.00 0.00 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin Nấm Pae Hình 3.12. Hiệu lực gây chết rệp sáp các ngày sau phun thuốc 56
Kết quả đánh giá khả năng ký sinh trên rệp sáp Planococcus lilacinus của nấm Paecilomyces lilacinus (bảng 3.6 và bảng 3.7) trong phịng thí nghiệm cho thấy: Tỷ lệ ký sinh gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus sau 7 ngày là 85,0% so với thuốc hĩa học thường dùng là Abamectin là 93,33%. Tuy nhiên, sự sai khác về khả năng gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus và thuốc hĩa học khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này chứng tỏ, nấm Paecilomyces lilacinus cĩ hiệu lực diệt trừ rệp sáp tương đương với thuốc hĩa học Abamectin. Để kiểm tra, sinh viên đã tiến hành soi kính các cá thể bị chết, kết quả cho thấy 100% rệp sáp ở cơng thức phun nấm bị chết đều cĩ sợi nấm bao quanh cơ thể và khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm trên cơ thể rệp sáp là nấm Paecilomyces lilacinus. Hình 3.13. Rệp sáp Planococcus lilacinus bị nấm ký sinh (độ phĩng đại 40x) 57
Hình 3.14. Rệp sáp Planococcus lilacinus bị nấm ký sinh (độ phĩng đại 100x) 3.4.3. Khả năng gây chết rệp muội Rệp muội thường làm yếu cây trồng bằng cách hút cạn nguồn dinh dưỡng và gây ảnh hưởng nghiêm trọng cho sự phát triển của cây. Chúng tiết ra chất đường mật khơng chỉ làm đĩng khí khẩu của lá mà cịn gĩp phần tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mơ quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất cây trồng. Ngồi gây hại trực tiêp, rệp cịn là đối tượng truyền bệnh virus cho rau. Trong trường hợp gặp nhiều điều kiện thức ăn, mơi trường tối ưu, chúng cĩ khả năng gây thiệt hại rất lớn cho rau thập tự. Vì vật sinh viên thực hiện thí nghiệm này mục đích đánh giá khả năng gây chết rệp muội của nấm Paecilomyces lilacinus phịng trừ sâu hại rau thập tự. 58
Bảng 3.8. Số rệp muội Brevicoryne brassacicae chết ở các ngày sau phun thuốc Số rệp muội chết ở các ngày sau phun Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin 5,33 ± 1,15 a 14,33 ± 1,53 a 18,33 ± 1,15 a Nấm Paecilomyces lilacinus 3,67 ± 1,15 a 10,33 ± 1,53 b 17,33 ± 1,15 a Nước cất 0,00 b 0,33 ± 0,58 c 1,33 ± 1,53 b CV (%) 31,42697 15,49193 10,46752 LSD0,05 1,8836 2,5793 2,5793 Ghi chú: Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc là 20 cá thể rệp muội. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Bảng 3.9. Hiệu lực gây chết rệp muội Brevicoryne brassacicae Hiệu lực (%) gây chết rệp muội Cơng thức 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin 26,67 a 71,67 a 91,67 a Nấm Paecilomyces lilacinus 18,33 a 51,67 b 86,67 a Nước cất - - - CV 17,25 15,47 14,92 LSD0,05 3,45 3,21 12,12 Ghi chú: Số liệu hiệu lực (%) được chuyển đổi về arcsin. a, b, c, d là chỉ số thể hiện sự sai khác khi xử lí số liệu thống kê bằng phần mềm SAS 9.4. Trong đĩ, các cơng thức cĩ chỉ số giống nhau thì sự sai khác khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 95%. Những 59
cơng thức cĩ chỉ số khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa về mặt xử lí thống kê ở mức 95%. Hiệu lực gây chết rệp muội 100.00 91.11 90.00 85.73 80.00 71.05 70.00 60.00 50.79 50.00 40.00 Hiệu lực % 26.67 30.00 18.33 20.00 10.00 0.00 3 ngày 5 ngày 7 ngày Abamectin Nấm Pae Hình 3.15. Hiệu lực gây chết rệp muội các ngày sau phun thuốc Dựa vào số liệu ở bảng 3.8 và 3.9 cho thấy, cũng giống như với rệp sáp và rầy nâu, nấm Paecilomyces lilacinus cũng cĩ khả năng ký sinh gây chết rệp muội. Tỷ lệ ký sinh gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus sau 7 ngày là 86,67% so với thuốc hĩa học thường dùng là Abamectin là 91,67%. Tuy nhiên, sự sai khác về khả năng gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus và thuốc hĩa học khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê. Điều này chứng tỏ, nấm Paecilomyces lilacinus cĩ hiệu lực diệt trừ rệp muội tương đương với thuốc hĩa học Abamectin. Điều này mở ra một triển vọng rất khả quan cho việc sử dụng chủng nấm Paecilomyces lilacinus để phịng trừ rệp muội trên cây trồng. Để kiểm tra, sinh viên đã tiến hành soi kính các cá thể bị chết ở cơng thức phun nấm, kết quả cho thấy 100% rệp muội bị chết đều cĩ sợi nấm bao quanh cơ thể và khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm trên cơ thể bọ phấn là nấm Paecilomyces lilacinus. 60
Hình 3.16. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 40x Hình 3.17. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 100x 61
Hình 3.18. Rệp muội Brevicoryne brassacicae bị nấm ký sinh, độ phĩng đại 400x Hình 3.19. Sợi nấm Paecilomyces lilacinus trên cơ thể rệp muội Brevicoryne brassacicae 62
Như vậy, chế phẩm thơ của chủng nấm Paecilomyces lilacinus cĩ khả năng gây chết rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal), rệp sáp (Planococcus lilacinus) và rệp muội (Brevicoryne brassacicae) với tỷ lệ gây chết cao. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, hiệu lực gây chết các lồi sâu chế hút này đạt tương ứng là 86,6%, 85%, và 86,67% và tương đương với các loại thuốc hố học như Actara và Abamectin. 3.5. Đánh giá khả năng gây chết rệp muội Texoptera sp hại cây hồ tiêu trong điều kiện vườn trồng Rệp muội nâu đen Texoptera sp gây hại ở cả giai đoạn trưởng thành và ấu trùng, chúng chích hút dinh dưỡng từ cây trồng, làm cho cây bị biến dạng, lá non bị cong, cuốn lại, làm đọt khơng phát triển, ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, đặc biệt là cây con. Chất thải của rệp muội nâu đen chứa nhiều dinh dưỡng, tạo mơi trường thuận lợi cho nấm bồ hĩng phát triển, làm đen lá và đọt cây, dẫn đến làm giảm khả năng quang hợp, giảm khả năng hơ hấp của cây. Hiện nay, việc phịng trừ rệp ở Việt Nam chủ yếu là thuốc hĩa học và sử dụng với liều lượng cao, gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng, gây ơ nhiễm mơi trường, mất cân bằng sinh thái. Vì vậy, sinh viên thực hiện thí nghiệm này mục đích đánh giá hiệu lực gây chết rệp muội nâu đen của nấm tím Paecilomyces lilacinus trong điều kiện tự nhiên trên cây hồ tiêu để cĩ hướng giảm sử dụng thuốc BVTV cĩ nguồn gốc hĩa học, thay thế bằng các biện pháp kiểm sốt sinh học, an tồn với sức khỏe con người, thân thiện với mơi trường. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10. 3.11 và 3.12. 63
Bảng 3.10. Mật độ rệp ở các cơng thức trước phun thuốc Mật độ rệp ở cơng thức trước phun Đối chứng Phun nấm Cây 1 73,00 ± 7,90 72,33 ± 8,08 Cây 2 69,73 ± 8,39 73,40 ± 9,61 Cây 3 70,87 ± 9,70 72,53 ± 10,19 Cây 4 70,87 ± 5,54 70,20 ± 8,38 Cây 5 72,80 ± 8,03 69,87 ± 8,50 TB 71,45 ± 8,38 71,67 ± 8,85 Qua bảng 3.10, cĩ thể thấy, mật độ rệp hại xuất hiện khá nhiều trên lá non của cây hồ tiêu, hơn 70 con / lá non, phân bố khá đều ở các cơng thức. Bảng 3.11. Mật độ rệp ở các cơng thức sau khi phun nấm Paecilomyces lilacinus Mật độ rệp ở cơng thức sau phun Đối chứng Phun nấm Cây 1 71,93 ± 6,60 30,67 ± 5,63 Cây 2 72,20 ± 9,60 26,40 ± 6,16 Cây 3 70,80 ± 8,79 33,40 ± 5,94 Cây 4 67,40 ± 8,21 31,53 ± 5,76 Cây 5 73,40 ± 7,86 25,40 ± 7,69 TB 71,15 ± 8,30 29,48 ± 6,83 64
Bảng 3.12. Hiệu lực gây chết rệp Texoptera sp của nấm Paecilomyces lilacinus Mật độ rầy (con / lá) Hiệu lực Cơng thức (%) Trước phun Sau phun 7 ngày Đối chứng 71, 45 ± 8,38 71,15 ± 8,30 Paecilomyces sp 71,67 ± 8,85 29,48 ± 6,83 58,68 Kết quả thử nghiệm hiệu lực của chế phầm Paecilomyces lilacinus trên rầy mềm hại cây hồ tiêu tại tỉnh Bình Phước tháng 8/2016 cho thấy, sau 7 ngày mật độ rầy mềm giảm từ 71,67 con / lá non cịn 29,48 con / lá, hiệu lực đạt 58,68%. Đây là kết quả khả quan đối với chế phẩm sinh học, cĩ ý nghĩa trong việc hạn chế số lượng quần thể sâu rầy hút chích trên cây trồng. Do thời gian làm đề tài cĩ hạn sinh viên chỉ cĩ thể khảo sát trong thời gian là 7 ngày. Hình 3.20. Cơng thức đối chứng ngồi vườn hồ tiêu 65
Hình 3.21. Cơng thức phun nấm Paecilomyces lilacinus ngồi vườn hồ tiêu 66
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã phân lập và khẳng định lại chủng nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh trên rệp sáp. - Mơi trường gạo tấm và mơi trường ngơ mảnh là thích hợp nhất cho nhân giống sản xuất chủng nấm Paecilomyces lilacinus. - Trong các loại thuốc BVTV khảo nghiệm, Plutel 1.8 EC cĩ ảnh hưởng nhẹ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces. Sherpa 25 EC, Oshin 20 WP, Actara 25 WG hầu như khơng ảnh hưởng. - Nấm Paecilomyces lilacinus khả năng kí sinh rầy nâu Nilaparvata lugens Stal, rệp sáp Planococcus lilacinus và rệp muội Brevicoryne brassacicae. Hiệu lực gây chết rầy nâu Nilaparvata lugens Stal là 86,60%, rệp sáp Planococcus lilacinus là 85,00%, và rệp muội Brevicoryne brassacicae là 86,67%. - Trên vườn trồng, chế phẩm nấm tím Paecilomyces lilacinus cĩ khả năng gây chết 58,8% rệp muội nâu đen hại cây hồ tiêu 4.2. Đề nghị - Tiếp tục đánh giá khả năng gây chết của chủng Paecilomyces lilacinus trên các cơn trùng chích hút khác như bọ trĩ, nhện đỏ, bọ xít - Xác định LD50 và LC50 của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trên rệp sáp, rầy nâu và các lồi cơn trùng gây hại khác, xác định liều lượng sử dụng trong cơng tác BVTV sao cho hiệu quả và tiết kiệm. - Phổ biến sản xuất và sử dụng chế phẩm nấm tím Paecilomyces lilacinus trừ rệp hại cây hồ tiêu - Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm nấm trên diện rộng phịng trừ các loại sâu hại hút chích. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Cao Văn Chí (2013). Sổ tay hướng dẫn phịng trừ sâu bệnh hại trên cây ăn quả cĩ múi, Nhà xuất bản Hà Nội [2]. Nguyễn Thị Chắt (2003). Một số đặc điểm hình thái và sinh học của rệp sáp giả cacao Planococcus lilacinus, Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 2/2003 [3]. Nguyễn Thị Thu Cúc, Nguyễn Hữu Tho (2010). Sự gây hại của rệp sáp (Homoptera Pseudococcidae) trên rễ cây cĩ múi (Citrus) vùng Đồng bằng song Cửu Long, Tạp chí Khoa học 2010:13 221-229 [4]. Võ Thị Bích Chi (2006), Tiềm năng phịng trừ sinh học của nấm ký sinh cơn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill và Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok đối với sâu hại họ thập tự tại Đồng bằng sơng Cửu Long. Luận án Thạc sỹ trồng trọt. [5]. Nguyễn Văn Đĩnh, Hà Quang Hùng, Nguyễn Thị Thu Cúc, Phạm Văn Lầm (2012). Cơn trùng và động vật hại nơng nghiệp Việt Nam, Nhà xuất bản Nơng Nghiệp. [6]. Nguyễn Thị Xuân Hương (2015), Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Cơng Nghệ TpHCM – HUTECH. [7]. Trần Văn Huy (2012). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Paecilomyces sp. và khả năng sử dụng trong phịng trừ rầy nâu hại lúa, Luận văn Thạc sĩ Nơng nghiệp, Viện Khoa Học Nơng Nghiệp Việt Nam. [8]. Nguyễn Thị Lộc (2009), “Kết quả ứng dụng chế phẩm sinh học Metarhizum anisopliae và Beauveria bassiana trừ sâu hại cây trồng tại Đồng bằng sơng Cửu Long”, Kỷ yếu hội thảo định hướng phát triển ứng dụng BPSH trong phịng chống dịch hại cây trồng, Sĩc Trăng, tháng 6/2009, Tr. 90- 98. 68
[9]. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003). Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM. [10]. Trần Văn Mão (2002). Sử dụng cơn trùng và vi sinh vật cĩ ích. Tập II: Sử dụng vi sinh vật cĩ ích. Nhà xuất bản Nơng Nghiệp Hà Nội. [11]. Phạm Thị Thùy (2004). Cơng nghệ sinh học trong Bảo Vệ Thực Vật. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh [1]. Alter JA, Vandenberg JJD (2000). Factors that Influencing the Infectivity of Isolates of Paecilomyces fumosoroseus Agains Diamond Back Moth, J. Invertebr Pathol., 78: 31-36. [2]. Avery PB, Faulla J, Simmands MSJ (2004). Effect of Different Photoperiods on the Infectivity and Colonization of Paecilomyces fumosoroseus, J. Insect Sci. 4: 38. [3]. Babu V, Murugan S, Thangaraja P (2001). Laboratory Studies on the Efficacy of Neem and the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana on Spodoptera litura”. Entomology, 56: 56-63. [4]. Brownbridge M (1995). Prospect for mycopathogens in thrips management. In: Parker M, Skinner M, Lewis T (Eds.), Thrips Biology and Management. Plenum Press, New York, pp. 281-295. [5]. Brownbridge M, McLean DL, Skinner M, Parker B (1994). Fungi only a grower could love. Greenhouse Grow, 12: 42-44 [6]. Choi, Y. J., Hwang, H. K. and Lee, W. H. 1999. The production of artificial fruiting body of Paecilomyces japonica. Kor. J.Mycol. 27(2): 87-93. [7]. Crop Protection Compennium (2002). CD of CAB International. [8]. Gokce, A. and Kubilay, E.R. 2005. Pathogenicity of Paecilomyces spp. to the Glasshouse Whitefly, Trialeurodes vaporariorum, with some observations on the Fungal Infection Process. Turkish Journal of Agriculture, 29: 331-339. 69
[9]. Gopalakrishnan C, Anusuya D, Narayanan K (1999) In vitro Production of Conidia of Entomopathogenic Fungus Parcilomyces farinosus, Entomology, 24: 389-392. [10]. Hu Q. B., An X. C., Qian M. H. (2007), “Insecticidal activity influence of destruxins on the pathogenicity of Paecilomyces javanicus against Spodoptera litura”, Journal of Applied Entomology, Volume 131, Issue 4, pages 262-268. [11]. Jiji,T, Praveena, R., Babu, K., and Naseema, A. 2006. Occurence of Paecilomyces lilacinus on melon fly Bactrocera cucurbitae Coq. and its cross infectivity on B. dorsalis (Hendel) and Bhindi leaf roller Sylepta derogate Fb. Abst. Colloq. on Nanoscale Sci. and Arthropod Bioresources, Thiruvananthapuram, 15 P. [12]. K. Sahayaraj and S. Karthick Raja Namasivayam (2008), Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. [13]. K. Sahayaraj and S. Karthick Raja Namasivayam (2008). Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products. [14]. Marti, G.A., Lastra, C.C., Pelizza, S.A., García, J.J. 2006. Isolation of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson (Ascomycota: Hypocreales) from the Chagas disease vector, Triatoma infestans Klug (Hemiptera: Reduviidae) in an endemic area in Argentina. Mycopathologia, 162(5):369-372. [15]. Rambadan S., Jugmohan, H. and Ayub Khan. 2011. Pathogenicity and haemolymph protein changes in Edessa meditabunda F. (Hemiptera: Pentatomidae) infected by Paecilomyces lilacinus. Journal of Biopesticides, 4 (2): 169-175. [16]. Samson R.A., (1974), Paecilomyces and some allied hyphomycetes, Studies in Mycology 6, Centraalbureau voor Schimmel-cultures, Baarn 116pp. [17]. Sandhu S.S, Anil K. Sharma, Vikas Beniwal, Gunjan Goel, Priya Batra, Anil Kumar, Sundeep Jaglan, AK. Sharma, and Sonal Malhotra (2012),“Myco- 70
Biocontrol of Insect Pests: Factors Involved, Mechanism, and Regulation“, Jounrnal of Pathogens, pp. 1-10. [18]. Sung Mi Shim Kyung Rim Lee, Seong Hwan Kim, Kyung Hoan Im, Jung Wan Kim, U Youn Lee, Jae OukShim1, Min Woong Lee1 and Tae Soo Lee (2003).The Optimal Culture Conditions Affecting the Mycelial Growth and Fruiting Body. [19]. U. Amala, T. Jiji and A. Naseema (2012). Mass multiplication of Paeilomyces lilacinus. [20]. U.S. Environmental Protection Agency Office of Pesticide Programs Biopesticides and Pollution Prevention Division (6/7/2005), Paecilomyces lilacinusstrain 251 PC Code 028826) [21]. Wraight, S.P., Carruthers, R.I., Jaronski, S.T., Bradley, C.A., Garza, C.J. and S. GalaniWraight. 2000. Evaluation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus for microbial control of the silver leaf whitefly, Bemisia argentifolii. Biological Control, 17: 203-217. [22]. Yin Fei, Hu Qiong-Bo, Zhong G. Guo- Hua, Hu Mei-Ying (2010), “Effects of destruxins on entomopathogenic fungus Isaria javanicusand the joint toxicity of their mixtures against the iamondback moth, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera Plutellidae)”, Acta entomologica sinica, Volume 53(1), Pages 61- 67. [23]. Zong Qi Liang, Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005). Studies on the genus Paecilomyces in China. 71
PHỤ LỤC A. PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ KET QUA DEM MAT DO BAO TU TREN CAC MOI TRUONG The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Matdobaotu 4 Bap Cam Gao Lua Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 8.19593333 2.73197778 3345.28 F matdobaotu 3 8.19593333 2.73197778 3345.28 <.0001 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.000817 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.0538 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N matdobaotu A 10.31667 3 Gao A 10.29000 3 Bap B 10.14000 3 Cam C 8.34667 3 Lua
MUC DO UC CHE CUA THUOC BVTV LEN SU PHAT TRIEN CUA NAM PAE The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values ucche 4 Abamecti Actacra Oshin Sherpa Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3 951.6696192 317.2232064 55.12 F ucche 3 951.6696192 317.2232064 55.12 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 5.754665 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 4.5167 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N ucche A 55.119 3 Abamecti B 43.039 3 Actacra C 37.257 3 Sherpa D 30.945 3 Oshin
SO RAY NAU CHET SAU 3 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values soraynauchet3N 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 28.22222222 14.11111111 42.33 0.0003 Error 6 2.00000000 0.33333333 Corrected Total 8 30.22222222 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.933824 22.59197 0.577350 2.555556 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F soraynauchet3N 2 28.22222222 14.11111111 42.33 0.0003 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.333333 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.1535 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N soraynauchet3N A 4.6667 3 Actara B 2.6667 3 Pae C 0.3333 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet ray nau sau 3 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc3ngay 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 1185.698600 592.849300 198.69 F hieuluc3ngay 2 1185.698600 592.849300 198.69 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 2.983767 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 3.4511 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc3ngay A 27.960 3 Actara B 20.050 3 Pae C 0.640 3 Nuoccat
SO RAY NAU CHET SAU 5 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values soraynauchet5N 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 156.2222222 78.1111111 87.88 F soraynauchet5N 2 156.2222222 78.1111111 87.88 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.888889 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.8836 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N soraynauchet5N A 11.6667 3 Actara B 9.6667 3 Pae C 2.0000 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet ray nau sau 5 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc5ngay 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 3816.549089 1908.274544 738.41 F hieuluc5ngay 2 3816.549089 1908.274544 738.41 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 2.584311 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 3.2118 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc5ngay A 47.197 3 Actara B 40.730 3 Pae C 0.640 3 Nuoccat ‘
SO RAY NAU CHET SAU 7 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values soraynauchet7N 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 493.5555556 246.7777778 444.20 F soraynauchet7N 2 493.5555556 246.7777778 444.20 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.555556 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.4891 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N soraynauchet7N A 19.0000 3 Actara A 17.6667 3 Pae B 2.6667 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet ray nau sau 7 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc7ngay 3 Actara Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 10825.90216 5412.95108 147.18 F hieuluc7ngay 2 10825.90216 5412.95108 147.18 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 36.77818 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 12.116 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc7ngay A 78.770 3 Actara A 68.597 3 Pae B 0.640 3 Nuoccat
SO REP SAP CHET SAU 3 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorepsapchet3N 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 42.66666667 21.33333333 38.40 0.0004 Error 6 3.33333333 0.55555556 Corrected Total 8 46.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.927536 27.95085 0.745356 2.666667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sorepsapchet3N 2 42.66666667 21.33333333 38.40 0.0004 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.555556 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.4891 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorepsapchet3N A 5.3333 3 Abamecti B 2.6667 3 Pae C 0.0000 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet rep sap sau 3 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc3ngay 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 1443.194822 721.597411 102.92 F The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 7.011022 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 5.2901 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc3ngay A 30.997 3 Abamecti B 21.337 3 Pae C 0.640 3 Nuoccat
SO REP SAP CHET SAU 5 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorepsapchet5N 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 208.6666667 104.3333333 187.80 F sorepsapchet5N 2 208.6666667 104.3333333 187.80 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.555556 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.4891 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorepsapchet5N A 11.6667 3 Abamecti B 7.3333 3 Pae C 0.0000 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet rep sap sau 5 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc5ngay 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 3917.701667 1958.850833 409.03 F hieuluc5ngay 2 3917.701667 1958.850833 409.03 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 4.789022 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 4.3722 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc5ngay A 49.823 3 Abamecti B 37.257 3 Pae C 0.640 3 Nuoccat
SO REP SAP CHET SAU 7 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorepsapchet7N 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 640.2222222 320.1111111 411.57 F sorepsapchet7N 2 640.2222222 320.1111111 411.57 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.777778 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.762 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorepsapchet7N A 18.6667 3 Abamecti A 17.0000 3 Pae B 0.0000 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet rep sap sau 7 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc7ngay 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 10466.74496 5233.37248 128.60 F hieuluc7ngay 2 10466.74496 5233.37248 128.60 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 40.69588 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 12.745 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc7ngay A 77.500 3 Abamecti A 67.403 3 Pae B 0.640 3 Nuoccat
SO REP MUOI CHET SAU 3 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorepmuoichet3N 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 44.66666667 22.33333333 25.12 0.0012 Error 6 5.33333333 0.88888889 Corrected Total 8 50.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.893333 31.42697 0.942809 3.000000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F sorepmuoichet3N 2 44.66666667 22.33333333 25.12 0.0012 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.888889 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.8836 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorepmuoichet3N A 5.3333 3 Abamecti A 3.6667 3 Pae B 0.0000 3 Nuoccat
Hieu luc gay chet rep muoi sau 3 ngay The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values hieuluc3ngay 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 1558.072067 779.036033 72.98 F hieuluc3ngay 2 1558.072067 779.036033 72.98 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 10.67486 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 6.5276 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N hieuluc3ngay A 30.997 3 Abamecti A 25.193 3 Pae B 0.640 3 Nuoccat
SO REP MUOI CHET SAU 5 NGAY The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values sorepmuoichet5N 3 Abamecti Nuoccat Pae Number of Observations Read 9 Number of Observations Used 9 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 312.0000000 156.0000000 93.60 F sorepmuoichet5N 2 312.0000000 156.0000000 93.60 <.0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 1.666667 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 2.5793 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N sorepmuoichet5N A 14.333 3 Abamecti B 10.333 3 Pae C 0.333 3 Nuoccat