Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.

105 trang thiennha21 13/04/2022 18760

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_vi_khuan_lactic_trong_khoang_mieng_co_kha_nan.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp. Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương TS. Nguyễn Hoàng Dũng Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tuấn Anh MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực hiện đề tài: Nguyễn Tuấn Anh Sinh viên trường: Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100148 Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương và TS. Nguyễn Hoàng Dũng, thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án. Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. Ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Hoài Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này. Từ tận đáy con tim, em xin chân thành cám ơn cô Hoài Hương. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng đã mở lòng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới (VSHND). Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám ơn thầy Dũng rất nhiều. Ngoài ra, trên VSHND em còn nhận không ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan . Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luôn bên cạnh và nhắc nhở em rất nhiều những điều cần thiết khi thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu. Em xin cám ơn chị Loan. Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Tuấn Anh ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 10 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 14 1.1. SÂU RĂNG 14 1.1.1. Bệnh học 14 1.1.2. Men răng 20 1.2. VI KHUẨN RĂNG MIỆNG 27 1.2.1. Streptococcus spp. 27 1.2.2. Lactobacillus spp. 29 1.2.3. Vi khuẩn lactic 35 1.3. MÀNG SINH HỌC 36 1.3.1. Sự hình thành 36 1.3.2. Thành phần 38 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học 40 1.3.4. Tính chất của màng sinh học 42 1.3.5. Phân bố 43 1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói chung 45 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 47 1.4.1. Ngoài nước 47 1.4.2. Trong nước 50 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 51 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51 2.2. Vật liệu nghiên cứu 51 iii
Đồ án tốt nghiệp 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị 51 2.2.2. Giống vi khuẩn 51 2.2.3. Hóa chất 51 2.2.4. Các phần mềm sử dụng 54 2.3. Phương pháp nghiên cứu 55 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu 55 2.3.2. Thu mẫu 56 2.3.3. Tăng sinh 58 2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic 59 2.3.5. Bảo quản 59 2.3.6. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh 59 2.3.7. Định danh các chủng BG 60 2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG 64 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 3.1. Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu 65 3.2. Phân lập vi khuẩn Lactic 65 3.3. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh 67 3.4. Định danh 71 3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA 71 3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR 71 3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI. 72 3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn NBG đối với L. fermentum 76 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN 82 4.1. Kết luận 82 4.2. Kiến nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC BẢNG 1 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 7 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS Extracellular polymeric substance DT Decayed teeth FT Filled teeth MT Missing teeth DFMT Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths HA Hydroxyapatite LBS Lactobacillus Selection medium LAB Lactic acid batería MRS deMan, Rogosa and Sharpe LBM Lactobacillus biofilm medium OD600 Opical density at 600 nm BG Biofilm group NBG Non-biofilm group v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Lactobacillus spp. phân lập được từ người lớn mắc bệnh sâu răng 33 Bảng 1.2. Lactobacillus spp. phân lập được từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu răng 34 Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng . 48 Bảng 2.1. Thành phần môi trường LBS (g/l) 52 Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS (g/l) 52 Bảng 2.3. Thành phần môi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. – Lactobacillus biofilm medium (LBM) 52 Bảng 2.4. Thành phần môi trường thử khả năng lên men các nguồn carbohydrates khác nhau (g/l) 53 Bảng 2.5. Mô tả các nghiệm thức (NT) trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học 64 Bảng 3.1. Thông kê khảo sát tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu . 65 Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic phân lập được và hình thái tế bào của chúng 66 Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic 69 Bảng 3.5. So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số loài Lactobacillus có trong kết quả hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. 75 Bảng 3.4. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và 30B2 (%) 76 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng 15 Hình 1.2. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng 16 Hình 1.3. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 17 Hình 1.4. Cấu trúc của răng người 20 Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng 21 Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA 22 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. 22 Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] 23 Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod 24 Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng 24 Hình 1.11. Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod 25 Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn 26 Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- 26 Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp 30 Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng và của người mẹ. 34 Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát tán. 37 Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. 38 Hình 1.18. Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides. 39 Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử 40 Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học 44 vii
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon 44 Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng 47 Hình 2.1. Mô tả phương pháp thu mẫu nước bọt 57 Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. 58 Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch môi trường để tác động lên màng sinh học. 60 Hình 2.4. Mô tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA 62 Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 63 Hình 3.1. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn lactic phân lập được dưới vật kính 100x. 67 Hình 3.2. Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i 68 Hình 3.3. Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ: 70 Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn có kích thước khác nhau. 71 Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA. 72 Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. 73 Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 . 74 Hình 3.8. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 1B. 78 Hình 3.9. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 12R2 78 Hình 3.10. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L. fermentum 30B2 79 viii
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11. Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans 79 Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học. 80 Hình 3.13. Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng NBG. 81 ix
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ răng miệng và sức khoẻ chung. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của loài người sau bệnh ung thư và tim mạch. Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60, các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thông qua nghị quyết, đưa xúc tiến và phòng ngừa bệnh sâu răng vào quy hoạch phòng ngừa và điều trị tổng hợp bệnh mãn tính. Hiện nay, sức khỏe răng miệng là một trong 10 tiêu chuẩn lớn về sức khỏe theo xác định của Tổ chức Y tế Thế giới [1]. Vì vậy, việc chăm sóc, dự phòng bệnh sâu răng là một vấn đề lớn được chính phủ các nước quan tâm. Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp. và sâu răng đã được xác định hơn một thế kỷ qua. Một số nhà khoa học cũng đã khảo sát và nhận thấy rằng mật độ Lactobacillus spp. trong khoan miệng sẽ tăng lên sau giai đoạn đầu của bệnh sâu răng [2]. Sigurjons và cộng sự xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. trong mảng bám răng miệng chiếm tới 62% [3]. Beighton và cộng sự cũng đã tiến hành một cuộc khảo sát răng miệng ở trẻ từ 3 - 4 tuổi, kết quả là tỷ lệ phân lập được Lactobacillus spp. trong trẻ sâu răng là 54%, trong khi ở trẻ không sâu răng chỉ chiếm 7% [4]. Ngoài ra Matee và cộng sự cũng đã nhận định trong kết quả nghiên cứu của họ rằng tỷ lệ Lactobacillus spp. trong miệng trẻ sâu răng cao gấp 100 lần trẻ không sâu răng [5]. Chủ yếu L. fermentum là loài chiếm đa số trong miệng của trẻ lẫn người lớn đang bị sâu răng [6] [7]. Mảng bám răng là một màng sinh học hình thành trong miệng, bao gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau và gắn kết với nhau bởi mạng lưới polysacchrides không tan. Vì khả năng tạo màng sinh học là một yếu tố chính quyết định sự hình thành mảng bám răng, nên các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tìm ra các mối liên hệ giữa Lactobacillus spp. và sự hình thành mảng bám răng miệng. Wilcox và cộng sự đã phát hiện ra được 2/4 chủng L. salivarius và 2/3 chủng L. fermentum của họ có khả năng gắn kết màng sinh học với S. salivarius, S. gordonii, S. crista, S. sanguis (một 10
Đồ án tốt nghiệp số loài trong chi Streptococcus có khả năng gây sâu răng) [8]. Filoche và cộng sự cũng đã phát hiện ra rằng, khả năng hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. khi nuôi cấy đơn lẻ thì rất thấp, nhưng khi đồng nuôi cấy với một số loài Actinomyces thì lại tăng gấp 4 – 20 lần [9]. Năm 2001, Tổ chức lương nông thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Hầu hết các vi khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng trong gần 1 thế kỷ qua [10]. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống. Nhưng bản chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn chưa được thấu hiểu. Để góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới có thể ứng dụng để phòng ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi Lactobacillus, nhóm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các Lactobacillus spp. có trong mảng bám răng miệng. 2. Tình hình nghiên cứu Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. 11
Đồ án tốt nghiệp Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho – mát có thể giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]. Tại Việt Nam, hiện tại chỉ có duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified from streptococcus mutans, [15] [16]. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập các vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình màng sinh học của Lactobacillus spp. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhóm đối tượng - Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic trong răng miệng - Chọn ra các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh có khả năng là tác nhân gây sâu răng. Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus. - Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các Lactobacillus spp. phân lập được 5. Phương pháp nghiên cứu - Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình. Bên cạnh đó ghi nhận tình trạng răng miệng của các đối tượng. 12
Đồ án tốt nghiệp - Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường LBS thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử) và các thử nghiệm sinh hóa (catalase). - Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đó phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng. - Tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lactic nghi ngờ có khả năng gây sâu răng, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. - Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa - Dựa vào hình thái kết hợp với kết quả thử nghiệm sinh hóa trước đó để định danh chính xác các chủng này. - Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn lactic và Lactobacillus spp. trong môi trường LBM trên đĩa giếng 96. Màng sinh học trong các giếng sẽ được nhuộm bằng Crystal violet, và định lượng bằng phương pháp đo mức độ hấp thụ màu tím ở bước sóng 570 nm. 6. Các kết quả đạt được - Từ 60 mẫu thu răng miệng đã chọn lọc ra được 30 chủng vi khuẩn lactic. - Chọn lọc được 3 chủng lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh. - Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài L. fermentum. - Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L. fermentum phân lập được và nấm Candida albicans) 7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 13
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. SÂU RĂNG 1.1.1. Bệnh học 1.1.1.1. Định nghĩa Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương, đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và không hoàn nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng có thể được định nghĩa như sau: - Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [17]. - Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khoáng xen kẽ nhau [18]. 1.1.1.2. Lịch sử Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [19]. Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn. Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán : nếu một người sống đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990). Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần 50% trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ súng răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn 20% [20]. 14
Đồ án tốt nghiệp Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư). 1.1.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [21]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [22]. Hình 1.1. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt. 15
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng. Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, đe dọa đến tính mạng của người bệnh. 1.1.1.4. Nguyên nhân Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [23]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose. 16
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 1.1.1.4.1. Vi khuẩn Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus. Đặc tính để quyết định rằng vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [24]. Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng. Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua việc bú sữa mẹ, hành động móm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [25]. 17
Đồ án tốt nghiệp 1.1.1.4.2. Nguồn carbohydrates Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng. Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide bởi enzyme dextransucranase. n sucrose  (glucose)n + n fructose 1.1.1.4.3. Thời gian Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng. Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH. Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp. 1.1.1.4.4. Răng Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy ra khi pH môi trường đạt 5.5 [26]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [27]. Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [28]. Nguyên nhân có thể là do yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị, bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng, cũng ảnh hưởng đáng kể 18
Đồ án tốt nghiệp đến mật độ khoáng của răng [29] [30]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không phải là nguyên chính gây sâu răng. Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng. 1.1.1.4.5. Yếu tố khác Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm. Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng gây sâu răng [31]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám. 1.1.1.5. Điều trị Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có nha sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mỗ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn. Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng. Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả năng diệt khuẩn [32]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng. Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây, 19
Đồ án tốt nghiệp rau quả còn có nhiều chất sợi (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng đường xylitol thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển. Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian mà men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp. Nếu phải uống soda, cam chanh thì nên dùng ống hút, tránh tráng điều trong miệng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid. Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống sâu răng cũng đang rất được chú trọng. Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11]. Hứa hẹn cho một ứng dụng mới mẻ và đầy tiềm năng của probiotic. 1.1.2. Men răng Men răng là một trong bốn vùng mô chính cấu tạo nên răng ở người và nhiều động vật khác (các vùng mô còn lại là ngà răng, cementum và nướu răng). Men răng có màu trắng, bao quanh toàn bộ thân răng, là tổ chức cứng nhất cơ thể do sự tạo khoáng hóa cao độ. Men răng làm lớp bảo vệ vững chắc cho răng, nhưng vẫn có thể bị suy thoái bởi acid thì thức ăn/nước uống. Hình 1.4. Cấu trúc của răng người 20
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.1. Kết cấu Hình 1.5. Các cấp kết cấu của men răng 1.1.2.1.1. Cột tinh thể hydroxyapatite Hydroxyapatite (HA) là dạng khoáng chất tự nhiên của apatite canxi với công thức hóa học là Ca5(PO4)3(OH), tuy vậy nhưng người ta thường viết dưới dạng - - - Ca10(PO4)6(OH)2. Ion OH trong cấu trúc có thể thay thế bởi nguyên tử F , Cl hoặc 2- CO3 , tạo thành fluorapatite hoặc chlorapatite. HA có tầm quan trọng đáng kể vì ngoài việc cấu tạo nên răng, chúng còn xuất hiện trong các mô khoáng hóa trong khung xương động vật. Trong men răng người, HA chiếm 96% khối lượng, 4% còn lại là chất hữu cơ [33]. 21
Đồ án tốt nghiệp HA kết tinh trong hệ tinh thể lục giác (hình 1.2). Mỗi tinh thể hydroxyapatite là một thành phần cơ bản gồm 18 ion (hình 1.3), hình lục giác dẹp cạnh 0,942 nm tạo góc 120o và 60o, chiều cao (trục c) thẳng góc với trục a và cao 0,688 nm, các đơn vị này liên kết trồng lên nhau tạo thành cột tinh thể hydroxyapatite [34] [35] [36]. Hình 1.6. Mô phỏng cột tinh thể HA Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C. 22
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8. Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] Khoảng trống nhỏ giữa những cột tinh thể là chất hữu cơ có chức năng liên kết. Cột tinh thể HA là đơn vị nhỏ nhất của men răng, có độ lên tới 160 nm và rộng 15- 20 nm. Tâm lục giác của cột là nơi dễ bị acid ăn mòn. Mặt bên và mặt chóp cũng có thể bị phân hủy [38]. 1.1.2.1.2. Rod Khoảng 100 cột tinh thể xếp sát nhau, kết tinh hướng dần về mặt men, tạo thành một khối lăng trụ, gọi là một đơn vị Rod, đường kính khoảng 4-8 µm. Rod chạy khắp vùng men, bắt đầu từ đường nối men ngà đến bề mặt của men. Các Rod bắt đầu phát triển theo hướng vetor gần như vuông góc với mặt ngà, sau đó phát triển theo kiểu lượn sóng đến gần bề mặt ngoài của men răng và lại đi thẳng một lần nữa cho đến hết cho đến hết. Vì thế độ dài các rod lớn hơn rất nhiều so với độ dày men. Men răng được hình thành bởi các Rod song song với nhau, 5 triệu ở răng cửa, 12 triệu ở răng hàm [39]. 23
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod 1.1.2.1.3. Interrod Các cột tinh thể xếp sát nhau nhưng không tụ thành từng trụ như Rod, được xem là vùng phân cách các rod ra, gọi là Interrod. Rod và Interrod tuy có cùng đơn vị cấu thành nhưng hướng tâm trụ thì khác nhau (tức các tinh thể phát triển theo hướng khác nhau), vì thế ở mặt cắt dọc bề mặt men răng ta dễ dàng thấy được sự phân cách giữa vùng Rod và Interrod. Đồng thời sự phân cách này tạo nên hình như một lỗ khóa ở mặt cắt men răng – gọi là lỗ khóa (keyhole). Mỗi cao keyhole cao khoảng 9µm. Trong đó phần thân là Rod và đuôi là Interrod [39]. Hình 1.10. Mặt cắt dọc men răng 24
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.11. Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod. 1.1.2.2. Đặc tính vật lý Đặc tính vật lý của men răng có được là nhờ các thành phần khoáng. Men răng đồng nhất, dễ bị acid ăn mòn, ít bị bám bởi các chất hữu cơ ngoại sinh và bóng sáng. Độ cứng giảm dần từ ngoài vào trong tâm răng. Men răng là màng bán thấm, cho phép một số ion nhất định đi từ trong nước bọt xuyên qua lớp men ngoài hoặc đi từ trong khoang tủy, xuyên qua lớp ngà và tới lớp men trong. Tính thấm của men răng giảm dần theo tuổi, nhưng độ cứng thì ngược lại [39]. 1.1.2.3. Cấu trúc hữu cơ Chất căn bản hữu cơ của men răng chiếm 2 - 4% trọng lượng men răng ở người lớn. Trong đó thành phần protein chiếm 58%, lipid 40%, nước 2%. Amino acid cấu tạo nên protein chủ yếu là: glycine, glutamique, serine và aspartique; phosphoproteine. Thành phần lipide chính là phospholipide và phospholipoprotein [39]. 1.1.2.4. Sự khử khoáng ở men răng Tâm trụ HA nơi dễ diễn ra quá trình khử khoáng nhất vì gốc OH- thường xuyên bị phơi nhiễm với môi trường bên ngoài. Dần dần các Rod và Interrod sẽ bắt đầu rỗng khiến cho cấu trúc men không còn bền vững, dễ bị phá vỡ hơn bởi ngoại lực. Khi bị 25
Đồ án tốt nghiệp khử khoáng, bề mặt men sẽ trở nên xốp hơn vì các lỗ trống được hình thành (hình 1.9). Dù vậy những vẫn có sự tái khoáng diễn ra song song. Sâu răng là khi tốc độ khử khoáng nhanh hơn tốc độ tái khoáng. Hình 1.12. Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn Tâm tinh thể HA (OH-) có thể được thay thế bằng bằng ion Florua (F-), ức chế được quá trình khử khoáng. Florua thường được bổ sung vào các sản phẩm răng miệng như kem đánh răng, nước súc miệng, nước uống. Nồng độ F- tiêu chuẩn để có thể ức chế quá trình khử khoáng là 1000 – 1500 ppm [40]. Sau khi đánh răng hoặc dùng nước súc miệng, ta không nên súc lại bằng nước quá nhiều lần vì - như thế cuốn trôi đi hết Hình 1.13. Cơ chế bảo vệ răng của các ion F các ion F-. 26
Đồ án tốt nghiệp 1.2. VI KHUẨN RĂNG MIỆNG Khoang miệng là không gian có rất nhiều bề mặt tiếp xúc, ở đó mỗi bề mặt sẽ tồn tại một lượng lớn vi sinh vật. Có hơn 700 loài vi khuẩn trong khoang miệng người, nhưng chỉ mới 50% trong số chúng là đã được phân lập [41]. Đa số chúng có khả năng gây nên các bệnh đường miệng, điển hình là sâu răng và nha chu. Tại Mỹ, có ít nhất 35% người lớn trong độ tuổi từ 30 đến 90 mắc bệnh nha chu [42]. Ngoài ra, một số vi khuẩn nguy hiểm hơn còn gây nên các bệnh: viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, viêm phổi, viêm tủy xương, sinh non, sinh thiếu ký, tim mạch [41]. Rất hiếm vi khuẩn răng miệng có tác động tích cực đến sức khỏe của con người. Môi trường dinh dưỡng trong khoang miệng người tương đối đầy đủ để nhiều loại vi sinh vật phát triển [43]. Chúng cư trú trong miệng chủ yếu bằng cách tạo mảng bám trên vỏ mô cứng (men răng) và mô mềm (nướu) trong khoang miệng để tránh bị nuốt vào trong dạ dày. Khả năng bám dính này đặc biệt quan trọng đối với các vi sinh vật đường miệng. Các chi vi khuẩn kị khí tồn tại trong khoang miệng gồm: Actinomyces, Arachnia, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Leptotrichia, Peptococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Selenomonas, Treponema và Veillonella [44]. Ngoài ra còn có sự có mặt của các loại nấm: Candida, Cladosporium, Aspergillus, Fusarium, Glomus, Alternaria, Penicillium và Cryptococcus [45]. 1.2.1. Streptococcus spp. 1.2.1.1. Giới thiệu chung Hệ vi sinh vật trong khoang miệng cực kỳ đa dạng và sự phát triển của tất cả các chúng phụ thuộc rất chặt chẽ vào sự có mặt của những Streptococcus spp. – những loài dễ hình thành màng sinh học nhất. Vì thế vai trò của Streptococcus spp. trong việc gây nên các bệnh răng miệng đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ càng. Mảng bám răng khi vừa mới hình thành ở giai đoạn đầu chiếm tới 80% Streptococcus spp. [46]. Streptococcus spp. trong khoang miệng được chia thành 5 27
Đồ án tốt nghiệp nhóm khác nhau: (1) nhóm Mutans (Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus); (2) nhóm Salivarius (Streptococcus salivarius); (3) nhóm Anginosus (Streptococcus anginosus và Streptococcus intermedius); (4) nhóm Sanguinis (Streptococcus sanguinis và Streptococcus gordonii); (5) nhóm Mitis (Streptococcus mitis và Streptococcus oralis) [47]. Trong đó đáng chú ý đến nhất là Streptococcus mutans, loài này đã được xác minh là tác nhân chính gây sâu răng [48]. 1.2.1.2. Streptococcus mutans – tác nhân chính gây sâu răng Streptococcus mutans là một nguyên nhân chính gây sâu răng, được mô tả lần đầu tiên bởi James Kilian Clarke năm 1924 khi ông đang nghiên cứu về bệnh mục xương. Nhưng mãi đến những năm 1960 thì người ta mới biết tác hại chính của loài này khi bắt đầu nghiên cứu về bệnh sâu răng. S.mutans phân hủy đường và tiết ra dextran ngoại bào làm tăng dộ bám lên răng. Nhờ enzyme dextransucrase thông qua phản ứng: n sucrose  (glucose)n + n fructose Kế đó fructose sẽ được S. mutans chuyển hóa làm nguồn năng lượng, cơ chất để phát triển. Glucose sẽ được chúng polymer hóa thành polysaccharide ngoại bào (dextran) làm tăng độ nhớt. Và sucrose là nguồn đường duy nhất mà S. mutans dùng để tổng hợp dextran. S. mutans còn có khả năng phân hủy dextran thành lại glucose để sử dụng khi điều kiện khắc nghiệt. Người ta cho rằng S.mutans có được gen tạo màng bám dính là từ các vi khuẩn lactic khác, chẳng hạn như Lactobacillus spp. 1.2.1.3. Ổ sinh thái trong khoang miệng Lượng S.mutans có trong miệng người lớn nhiều hơn trẻ em, nhưng trẻ em thì lại dể bị tác động hơn. S.mutans được truyền từ cha mẹ sang trẻ sơ sinh qua đường nước bọt, điển hình nhất là việc móm ăn cho trẻ. S.mutans có tự nhiên trong đường miệng của con người song song với ít nhất 25 loài khác thuộc nhóm streptococci răng miệng. Các vi sinh vật nhóm streptococci này vừa có loài gây hại, vừa có loài vô hại. 28
Đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, nêu gặp điều kiện đặc biệt (sự mất cân bằng sinh thái vi khuẩn) thì chúng có khả năng gây bệnh cơ hội. Nguyên tắc phân loài trong nhóm này còn trong tiến độ thực hiện. Các khu vực khác nhau trong xoang miệng sẽ có các loài khác nhau, để tương ứng với các mặt sinh thái khác nhau. S.mutans có thể chung sống ôn hòa với Streptococcus sobrinus trong khoang miệng, chúng cùng chi và cùng là tác nhân gây sâu răng. Về mặt lâm sàng thì trong các xét nghiệm không cần phân biệt 2 loài này. Do đó, chúng thường được gộp chung lại thành một nhóm gọi là mutans streptococci (số nhiều, không in nghiêng vì chưa phải là tên chính thức). S.mutans là thường gặp nhất trong các rãnh nứt răng hoặc lỗ sâu và chiếm 39% tổng vi sinh vật nhóm streptococci trong khoang miệng. Ở những nơi khác trong khoang miệng chúng chỉ chiếm 2 – 9%. 1.2.2. Lactobacillus spp. 1.2.2.1. Đặc điểm chung 1.2.2.1.1. Hình thái khuẩn lạc, tế bào Lactobacillus spp. là những vi khuẩn gram dương, với kích thước bộ gen khoảng 1.23 đến 4.91 Mb, tỷ lệ GC từ 31.93% đến 57,02% [49]. Tế bào của chúng có hình que dài, mảnh hoặc hình que ngắn uốn cong, tế bào thường liên kết tạo thành chuỗi. Khuẩn lạc của Lactobacillus spp. trên môi trường thạch có đường kính 2 – 5 mm, bề mặt lồi, mịn, lấp lánh, màu trắng đục (trong một số ít trường hợp chúng có màu vàng hoặc đỏ). Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng, Lactobacillus spp. phát triển đều khắp môi trường. Sau khi chết, tế bào của chúng sẽ chìm xuống đáy, tạo thành lớp bột mịn đồng nhất, hiếm khi vón cục hoặc nhớt [50]. 29
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.14. Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp. A, Lactobacillus gasseri; B, Lactobacillus agilis; C, Lactobacillus curvartus; D, Lactobacillus minor; E, Lactobacillus fermentum; F, dạng xoắn của Lactobacillus spp. trong hạt kefir [50]. 1.2.2.1.2. Đặc điểm sinh lý Lactobacillus spp. thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Các loài trong chi không có khả năng di động, không sinh bào tử. Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40oC. Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn có thể chịu được mức pH 5.0 hoặc thấp hơn. Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện 30
Đồ án tốt nghiệp pH môi trường trung tính hoặc kiềm. Vì Lactobacillus spp. có khả năng chịu được môi trường có pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối với những vi khuẩn khác trong cùng một môi trường. Thường được tìm thấy trong các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt, cá, bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ ủ, bột nhào chua, nước, đất, chất thải. Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục nữ, khoang miệng, hệ tiêu hóa ở người và nhiều động vật khác. Đây là những môi trường được cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác. Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩm chính là acid lactic [50]. 1.2.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa Lactobacillus spp. âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm dương tính chỉ xảy ra khi pH môi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố đỏ heme bào môi trường nuôi cấy. Không có khả năng phân giải gelatin, casein. Thử nghiệm Indole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính. Thử nghiệm catalase âm tính. Lactobacillus spp. thường sinh ra mùi đặc trưng khi có mặt trong thực phẩm. Một nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate. Ngoài ra quá trình lên men còn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde. Bên cạnh đó quá trình dị hóa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol, benzaldehyde, và methanethiol. Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men. Lactobacillus spp. thường không có khả năng gây bệnh, ngoài trừ một số ít trường hợp có bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khoáng men răng [50]. Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis, 31
Đồ án tốt nghiệp và L. reuteri. Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus, L. helveticus, và L. sakei [50]. 1.2.2.2. Ổ sinh thái trong khoang miệng Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp. và sâu răng đã được xác định hơn một thế kỷ qua. Lactobacillus spp. được tìm thấy trong miệng của trẻ còn đang bú sữa mẹ nhiều hơn là trẻ bắt đầu bú bình [51]. Sau khi cai sữa và trước khi mọc răng, không dễ dàng để để tìm thấy Lactobacillus spp. trong miệng trẻ [52]. Một khi răng được hình thành, kéo theo sự xuất hiện của nhiều khe hở, rãnh tạo điều kiện thích hợp cho sự neo bám của vi khuẩn. Năm 1944, qua nghiên cứu của Harrison và Opal đã xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. phân lập ra từ mẫu nước bọt được là 93% và mẫu phân là 66% (mẫu được lấy từ trẻ em bị sâu răng). Từ đây họ cũng kết luận rằng, Lactobacillus spp. hiện diện xuyên suốt từ đường miệng cho đến đường ruột. Các nghiên cứu ở trẻ dưới 6 tuổi cũng cho thấy, Lactobacillus spp. hầu như chỉ có mặt trong những đối tượng bị sâu răng [53] [54]. Năm 2010, Yang và cs đã xác định rằng không có sự hiện diện của Lactobacillus spp. trong mẫu mảng bám răng và từ kẽ răng của những trẻ em không bị sâu răng [55]. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng, Lactobacillus spp. cũng không xuất hiện trong khoang miệng của người lớn không bị sâu răng [56]. Tóm lại, sự xuất hiện của Lactobacillus spp. trong khoang miệng trẻ là bắt nguồn từ sữa mẹ. Trẻ em không bị sâu răng thì tỷ lệ Lactobacillus spp. trong khoang miệng ở mức cực tiểu. Sự hiện diện của Lactobacillus spp. trong khoang miệng sẽ quyết định sự hiện diện chúng ở đường ruột. Các loài Lactobacillus chiếm đa số trong cả khoang miệng của người lớn và trẻ em là L. fermentum, L. rhamnosus, L. gasseri, L. casei / paracasei, L. salivarius, L. plantarum. Chiếm tỷ lệ thấp hơn là L. oris và . vaginalis. Và cực hiếm là L. mucosae, L. crispatus, L. ultunesis, L. reuteri, L. gastricus, và L. parabuchneri, nhưng những loài này chỉ xuất hiện với tỷ lệ 20%, nên người ta đưa ra giả định rằng những loài này 32
Đồ án tốt nghiệp chỉ vô tình xâm nhiễm vào khoang miệng thông qua thực phẩm, mà không đóng bất cứ vai trò gì trong việc gây sâu răng. Hầu hết các loài đều tồn tại song song trong một quần thể vi sinh vật. Riêng L. fermentum, L. casei/paracasei, và L. salivarius thì có thể tồn tại độc lập trong khoang miệng của đối tượng đang bị sâu răng nghiêm trọng [57]. Một số loài Lactobacillus được phân lập được sữa mẹ gồm có: L.rhamnosus, L. plantarum và L. fermentum [58]. Bảng 1.1. Lactobacillus spp. phân lập được từ người lớn mắc bệnh sâu răng [57] Ahrne và cs Byun và cs Munson và Chhour và Dal Bello Caufield và Obata và cs (1998) (2004) cs (2004) cs (2005) and Hertel cs (2007) (2014) (2006) Goteborg, Sydney, Úc London, Sydney, Úc Stuttgart, Birmingha Fukuoka, Thụy Điển Anh Đức m, AL, Mỹ Nhật Khoang Mảng bám Lỗ sâu răng Lỗ sâu răng Nước bọt và Nước bọt Nước bọt và miệng và phân của phụ nữ mảng bám ruột già mang thai bị sâu răng L. L. L. L. L. L. salivarius L. salivarius plantarum rhamnosus plantarum rhamnosus rhamnosus L. L. casei L. L. casei L. casei L. gasseri L. gasseri rhamnosus rhamnosus L. casei L. salivarius L. casei L. salivarius L. gasseri L. oris L. paracasei L. salivarius L. gasseri L. gasseri L. gasseri L. paracasei L. vaginalis L. crispatus L. paracasei L. oris L. ultunensis L. vaginalis L. L. vaginalis fermentum L. crispatus L. L. L. fermentum fermentum fermentum L. ultunensis L. vaginalis L. panis L. reuteri 33
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Lactobacillus spp. phân lập được từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu răng [57] Marchant và cs Tanner và cs Teanpaisan và cs Piwat và cs (2010) Yang và cs (2012) (2001) (2011) (2012) New York, NY, London, Anh Songkhla, Thái Boston, MA, Mỹ Songkhla, Thái Mỹ Nước bọt của Nước bọt và lỗ Mảng bám Nước bọt Mảng bám những trẻ có mẹ sâu răng bị sâu răng L. plantarum L. rhamnosus L. gasseri L. rhamnosus L. rhamnosus L. rhamnosus L. mucosae L. fermentum L. casei L. mucosae L. casei L. salivarius L. casei/paracasei L. salivarius L. plantarum L. salivarius L. gasseri L. gasseri L. salivarius L. fermentum L. casei/paracasei L. oris L. casei/paracasei L. buchneri L. oris L. fermentum L. fermentum L. brevis L. fermentum L. vaginalis 1.2.2.3. Lactobacillus fermentum Là một loài trong chi Lactobacillus được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ thịt cũng như rau củ quả, trong khoang miệng và trong sữa mẹ. Chúng có mối quan hệ mật thiết đến bệnh sâu răng ở người [59] [60] [61]. Hình 1.15. Tỷ lệ các Lactobacillus spp. phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng và của người mẹ [62]. 34
Đồ án tốt nghiệp Tuy vậy nhưng một số chủng trong loài đã được xét vào nhóm probiotic và đã được thương mại hóa sản phẩm đó là: Lactobacillus fermentum ME-3, Lactobacillus fermentum PCC, Lactobacillus fermentum CECT5716. Một đặc tính probiotic đáng chú ý của loài này là khả năng tạo màng sinh học bám dính chặt chẽ trên thành ruột không cho các mầm bệnh khác neo bám chung [63]. Lactobacillus fermentum được phân lập trong răng miệng đều có thể tạo màng sinh học, bởi việc sở hữu đoạn gen glucosyltransferases (Gtf) tổng hợp nên glucans (thành phần gắn kết trong màng sinh học) [64]. Aoudia và cộng sự đã phát hiện ra rằng L. fermentum cũng có thể hình thành màng sinh học trên bề mặt không sinh học [65]. L. fermentum có thể gắn kết với chất nhầy của cả bao tử và đường ruột bởi khả năng tổng hợp nên 1 loại protein 32-Mmubp [66]. Ngoài ra, các chủng L. fermentum cón có khả năng cộng sinh với S. gordonii và S. sanguis trong màng sinh học, tăng khả năng sinh màng cho cả cộng đồng vi khuẩn [67]. 1.2.3. Vi khuẩn lactic 1.2.3.1. Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) là nhóm vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, kị khí tùy nghi, hình thái tế bào có cả nhóm cầu khuẩn và trực khuẩn, sản phẩm chính sau quá trình lên men carbohydrate là acid lactic. Người ta phân loại LAB dựa trên hình thái tế bào, kiểu lên men glucose, nhiệt độ tăng trưởng và khả năng lên men các loại carbohydrate khác nhau để phân nhóm LAB. Bốn chi vi khuẩn được công nhận là LAB gồm có: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [68]. 1.2.3.2. Ổ sinh thái trong khoang miệng LAB trong khoang miệng bao gồm một nhóm các loài thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus và Weissella. Nhưng chủ yếu Streptococcus spp. và Lactobacillus spp. là chiếm ưu thế. Lactobacillus spp. được phân lập ra từ khoang miệng nhiều nhất là L. fermentum và L. salivarius [69]. 35
Đồ án tốt nghiệp Vai trò bảo vệ răng miệng của LAB gần đây đang được quan tâm nghiên cứu, chủ yếu nghiêng về hướng tìm ra đặc tính probiotic của LAB. Chúng không gây tác động tiêu cực lên bất cứ vùng mô nào trong khoang miệng, chúng có khả năng tồn tại lâu dài trong khoang miệng với khả năng tạo màng sinh học, bên cạnh đó tổng hợp nên một số chất kháng khuẩn hoặc trực tiếp tranh giành chất dinh dưỡng để ức chế các mầm bệnh khác. Cho đến nay đã có một vài thử nghiệm lâm sàng chứng minh được tiềm năng bảo vệ răng miệng của một số loài gồm L. rhamnosus, L. reuteri, L. casei, và W. cibaria [70]. 1.3. MÀNG SINH HỌC 1.3.1. Sự hình thành Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô tình bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiêm mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán [71]. Khả năng tạo màng sinh học như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường. 36
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.16. Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát tán. A, mạng lưới EPS đóng vai trò bảo vệ hệ vi sinh vật trong nó khỏi các tác nhân bên ngoài như độc tố (kháng sinh), các tế bào nguyên sinh, các bacteriophage. Mạng lưới EPS còn giữ được các chất dinh dưỡng, ổn định nồng độ các phân tử gradient (oxy), chất thải độc hại đối với tế bào (nitric oxide), tính hiệu giữa các tế bào vi khuẩn. B, giai đoạn phân tán tế bào bắt đầu chuyển sang dạng phù du và di chuyển dần ra khỏi màng. Bên cạnh đó còn có sự xuất hiện của các biến thể vi khuẩn, các siêu bacteriophage do các qua trình trao đổi vật chất di truyền phức tạp trong màng sinh học [72]. 37
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.17. Các giai đoạn hình thành màng sinh học. 1.3.2. Thành phần mạng lưới polymer ngoại bào (EPS) EPS là các polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của màng sinh học [73]. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng sinh học [74]. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác. Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS. EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic [75]. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [76]. 38
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.18. Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides. A, mạng lưới chính gồm các thành phần polysaccharides, protein và DNA phân bố giữa các tế bào một cách không đồng nhất, tạo nên các vùng có tính chất vật lý khác nhau. B, các lực tương tác hóa lý và sực dày đặc của polysaccharides quyết định độ ổn định của EPS [77]. EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khóa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS còn có chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn [78]. 39
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.19. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [79] 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học 1.3.3.1. Lông roi, tiêm mao của vi sinh vật Chức năng chính của lông roi trong sự hình thành màng sinh học là giúp cho vi sinh vật di chuyển trong môi trường nước tốt hơn, tạo nên những tương tác ban đầu giữa bề mặt và tế bào. Thí nghiệm của De Flaun, De Weger và cộng sự, đã chứng minh nếu không có lông roi thì khả năng xâm nhiễm của Pseudomonas fluorescens lên rễ cây khoai tây, lúa mì sẽ giảm và làm giảm độ bám dính tế bào của P. aeruginosa và P. fluorescens lên bề mặt polystyrene. Tương tự, nghiên cứu trên các chủng Vibrio cholerae và Escherichia coli đột biến thiếu lông roi đã cho thấy không có sự hình thành màng sinh học như ở các dạng hoang dại của chúng vẫn thực hiện trên bề mặt nhựa polyvinylchloride (PVC) [74]. 1.3.3.2. Sự cảm ứng mật độ tế bào Tín hiệu giữa các tế bào (Quorum sensing) với nhau gần đây đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sự bám dính cũng như quyết định thời điểm bước vào giai đoạn phân tán. Mặc dù phức tạp nhưng màng sinh học này có tổ chức rất cao. 40
Đồ án tốt nghiệp Davies và cộng sự đã xác định được 2 hệ thống tín hiệu ngoại bào khác nhau ở loài P. aeruginosa có liên quan đến sự hình thành màng sinh học, đó là lasR - lasI và rhlR - rhlI. Ở mật độ tế bào đủ lớn, các tín hiệu này đạt đến nồng độ cần thiết để kích hoạt các gen liên quan đến sự hình thành màng sinh học khác nhau. Họ nhận thấy ác dạng đột biến của chúng không thể tạo ra cả 2 tín hiệu thì sẽ hình thành một kiểu tổng hợp màng khác chặt chẽ hơn nhiều so với kiểu gốc [80]. Các tín hiệu tế bào trong màng sinh học của 1 hệ vi khuẩn đa dạng sẽ khác nhiều so với màng sinh học chỉ chứa duy nhất 1 loài hoặc 1 chi vi khuẩn. Những tín hiệu này bao gồm các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn, các phân tử acyl - homoserine lactone, vật chất di truyền như DNA hay RNA, v.v sẽ làm thay đổi trạng thái của các tế bào vi khuẩn lân cận [81]. 1.3.3.3. Tính chất bề mặt giá thể Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào, vì thế các loài thường chỉ hình thành màng sinh học trên một số bề mặt với tính chất nhất định. Characklis và cộng sự đã ghi nhận khả năng neo bám vi sinh vật sẽ tăng khi chúng tiếp xúc với các mặt giá thể có độ nhám [82]. Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ và khả năng neo bám của tế bào lên bề mặt. Ngoài ra, một nghiên cứu cho thấy các vi sinh vật neo bám vào các bề mặt kị nước, không phân cực (Teflon, nhựa) nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt ưa nước (thủy tinh, kim loại) [83]. Bên cạnh đó, diện tích bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của màng sinh học. Theo nguyên tắc, diện tích bề mặt càng lớn càng làm tăng khả năng tiếp xúc với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thể. Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự nhiên (ao hồ, sông ) là thường có một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện cho việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt. 41
Đồ án tốt nghiệp 1.3.3.4. Yếu tố môi trường Các đặc trưng hóa lý của môi trường như nhiệt độ, pH, mức độ dinh dưỡng, nồng độ các ion, đóng một vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ gắn kết của vi sinh vật lên bề mặt. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hình thành màng sinh vật cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước khác nhau Chủ yếu là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước lên khả năng sinh trưởng của vi sinh vật. Fletcher và cộng sự cũng đã thấy rằng nồng độ của một số cation (Na+ , Ca2+, Fe3+) ảnh hưởng đến khả năng bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính. Nghiên cứu của Cowan và cộng sự cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượng gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt [84]. 1.3.4. Tính chất của màng sinh học Màng sinh học có thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trường và phát triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều có thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào những loài có mặt trong đó [85]. Tính kỵ nước có một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn. Vì nếu tế bào có tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [75]. Một số vi khuẩn không có khả năng bám trực tiếp lên một bề mặt nào đó, nhưng lại có khả năng liên kết với mạng lưới cơ chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn không có khả năng di động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [75]. Dù cùng loài nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ có một số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [86]. 42
Đồ án tốt nghiệp Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hòa, pH, thành phần dinh dưỡng trong môi trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [87]. Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh học cung cấp phương tiện trao đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất có nguy cơ độc hại [88]. Các vi khuẩn trong mạng lưới màng sinh học thường bao gồm nhiều quần thể vi khuẩn khác nhau. Chúng là kết quả của mối liên hệ giữa các loài sinh vật đồng trao đổi chất. Mối liên kết chặt chẽ này tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi, loại bỏ và phân phối các sản phẩm trao đổi chất trung gian giữa các loài. 1.3.5. Phân bố 1.3.5.1. Trong tự nhiên Màng sinh học có ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngoài ra màng sinh học còn có thể hình thành trong cả những môi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dòng chảy mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nóng, môi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đông lạnh. Ta có thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học có thể trên các tảng đá, sỏi ở những con sông. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại góp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt rễ) ở cây họ đậu. Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [89]. Màng sinh học còn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mòn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước lạnh/nóng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [90]. Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi 43
Đồ án tốt nghiệp một phần đáng kể, bên cạnh đó còn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh vật biển). Hình 1.20. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học Hình 1.21. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon [91]. 44
Đồ án tốt nghiệp 1.3.5.2. Trong cơ thể sống 1.3.5.2.1. Đường ruột Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột, một trong những môi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa có thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong đường ruột [92]. 1.3.5.2.2. Khoang miệng Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng. Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khô là vi khuẩn, còn lại là các hợp chất polysaccharides và glycoproteins [93]. Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng góp phần thúc đẩy sự hình thành của mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [94]. Và ngoài vai trò như là một chất đệm, nước bọt còn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein. Chế độ ăn uống chỉ đóng một vai trò nhỏ trong việc cung cấp điều cư trú của vi khuẩn [95]. Sự oxy hóa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã góp phần cho lượng oxy trong khoang miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho toàn quần thể vi khuẩn tồn tại. 1.3.6. Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói chung Vi khuẩn probiotic bảo vệ răng miệng thông qua việc cạnh tranh chất dinh dưỡng, các yếu tố tăng trưởng và vị trí neo bám với các vi sinh vật gây bệnh khác. Ngoài ra chúng có thể tiết ra các bacteriocin hoặc các hợp chất kháng khuẩn như acid, H2O2. 45
Đồ án tốt nghiệp Để thực hiện được các khả năng trên thì việc đầu tiên là phải đưa vi khuẩn probiotic vào trong khoang miệng, chủ yếu thông qua việc tiêu thụ các sản phẩm probiotic. Năm 2009, Stamatovavà cộng sự đã chứng minh được rằng các sản phẩm probiotic khi được tiền xử lý với lysozymes sẽ làm tăng khả năng và thời gian neo bám của vi khuẩn probiotic trong răng miệng [96]. Cơ chế neo bám của probiotic dựa vào đặc tính kỵ nước và điện tích trên bề mặt giá thể. Vi khuẩn probiotic có tác động trực tiếp lên các tế bào khác và môi trường xung quanh chúng. Các cơ chế kháng này được chia như sau: - Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác - Kích hoạt và điều chỉnh hệ thống miễn dịch của vật chủ [97] Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng quy nạp phản ứng miễn dịch khoang miệng (the activation of oral immune inductive sites) thông qua ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P3PH - thymidine trong tế bào lách ở chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [98]. - Chúng ức chế vi khuẩn khác thông qua khả năng sinh hydrogen peroxide, bacteriocins, và một số acid hữu cơ, carbon peroxide, diacetyl [99]. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.22. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng [100]. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.4.1. Ngoài nước Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [13]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho – mát có thể giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]. 47
Đồ án tốt nghiệp Hallstrom và cs cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 không góp phần hình thành mảng bám trong khoang miệng [101]. Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1.3. Bảng 1.3. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng (d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , không thay đổi; -, âm tính) [102]. Độ tuổi Tổng Thời Tình – số đối MS gian trạng Tác giả Chủng probiotic tượng trong nghiên sâu nghiên khoang cứu răng cứu miệng Nase và cs, 2001 L. rhamnosus GG 1–6, 7 m   594 Ahola và cs, Lactobacillus spp. 18–35, 3 w  - 2002 74 Nikawa và cs, L. reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40  - 2004 Montalto và cs, Lactobacillus spp. 23–37, 45 d  - 2004 35 Caglar và cs, Bifidobacterium 21–24, 2005 animalis ssp. lactis DN- 2 w  - 21 173010 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730 21–25, 2 w  - 2006 120 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730 21–24, 3 w  - 2007 80 Caglar và cs, Bifidobacterium lactis 20–24, 10 d  - 2008 BB-12 40 Caglar và cs, L. reuteri ATCC 55730, 2009 L. reuteri ATCC PTA 10 d 20, 20  - 5289 48
Đồ án tốt nghiệp Cildir và cs, Bifidobacterium 12–16, 2009 animalis ssp. lactis DN- 2 w  - 24 173010 Stecksen-Blicks L. rhamnosus LB21 1–5, 21 m   và cs, 2009 174 Lexner và cs, L. rhamnosus LB21 12–15, 2 w  - 2010 20 Singh và cs, L. acidophilus La5 12–14, 2011 Bifidobacterium lactis 10 d  - 40 Bb-12 Jindal và cs, L. rhamnosus, 2011 Bifidobacterium 7–14, 14 d  - longum, Saccharomyces 150 cerevisae Marttinen và cs, L. rhamnosus GG, L. 20–30, 2012 reuteri SD2112, L. 2 w  - 13 reuteri PTA 5289 Chuang và cs, L. paracasei GMNL- 33 20–26, 2 w  - 2011 70 Cildir và cs, L. reuteri ATCC PTA 4–12, 2012 5289, L. reuteri DSM 25 d  - 19 17938 Petersson và cs, L. rhamnosus LB21 58–84, 15 m   2011 160 Taipale và cs, Bifidobacterium 2 tháng 2012 animalis BB-12 tuổi đến 15 m   2 tuổi, 106 Juneja và L. rhamnosus hct 70 12-15, 9 w  - Kakade, 2012 40 Sudhir và cs, L. acidophilus 10-12, 3 w  - 2012 40 Năm 2001, Nase và cs chứng minh được rằng L. rhamnosus GG có thể làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ. Đến năm 2007, Hatakka và cs cũng đã xác định được việc sử dụng L. rhamnosus GG ở người lớn tuổi sẽ giảm được tỷ lệ nấm Candida albicans có trong nước bọt [102]. 49
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Trong nước Tại Việt Nam, hiện tại chỉ có duy nhất TS. Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from (Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified from streptococcus mutans, [15] [16]. 50
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian bắt đầu nghiên cứu: ngày 14 tháng 2 năm 2017 đến ngày 20 tháng 7 năm 2017. Địa điểm tiến hành nghiên cứu: Phòng thí nghiệm lầu 7 trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh (475A Điện Biên Phủ, P.25, Q.Bình Thạnh, TP.HCM); Phòng vi sinh ứng dụng lầu 1, Viện Sinh Học Nhiệt Đới (9/621 xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP.HCM) 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm - Tủ lắc điều nhiệt - Bình tách chiết - Tủ ủ - Erlen 250ml - Máy ly tâm - Đía petri - Máy votex - Đĩa nuôi cấy 96 giếng - Máy Elisa - Cân phân tích - Kính hiển vi quang học - Nồi hấp khử trùng Autoclave - Máy PCR (Sprint Thermo Cycler) - Tủ lạnh, tủ lạnh sâu -80oC - Máy điện di. - Tủ sấy 2.2.2. Giống vi khuẩn Chủng nấm Candida albicans được lấy từ bộ sưu tập giống của phòng vi sinh ứng dụng lầu 1 viện Sinh học Nhiệt đới. 2.2.3. Hóa chất 2.2.3.1. Môi trường tăng sinh nuôi cấy 51
Đồ án tốt nghiệp Thành phần môi trường Lactobacillus Selection (LBS) - dùng phân lập, định lượng Lactobacillus spp. từ mẫu phân và khoang miệng. Bảng 2.1. Thành phần môi trường LBS (g/l) Tryptone type I 10.0 Tween 80 1.0 Yeast Extract 5.0 CH3COONa.H2O 25.0 KH2PO4 6.0 MgSO4 0.575 (NH4)3C6H5O7 2.0 MnSO4 0.12 Dextrose 20.0 FeSO4 0.034 Glacial acid acetic 1.32 ml Agar 20.0 pH 5.5 ± 0.2 Thành phần môi trường deMan, Rogosa and Sharpe (MRS) - dùng nuôi cấy mọi loài trong chi Lactobacillus: Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS (g/l) Peptone 10.0 Tween 80 1.0 Yeast Extract 5.0 CH3COONa.H2O 5.0 K2HPO4 6.0 MgSO4 0.1 (NH4)3C6H5O7 2.0 MnSO4 0.05 Dextrose 20.0 Agar 20.0 Meat extract 10.0 pH 6.5 ± 0.2 2.2.3.2. Môi trường thử khả năng kháng sự hình thành màng sinh học Bảng 2.3. Thành phần môi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. – Lactobacillus biofilm medium (LBM) Peptone 5.0 Tween 80 0.5 Yeast Extract 2.5 CH3COONa.H2O 2.5 K2HPO4 3.0 MgSO4 0.05 (NH4)3C6H5O7 1.0 MnSO4 0.025 52
Đồ án tốt nghiệp Dextrose 10.0 CaCl2 0.1 Meat extract 5.0 pH 7.0.2 2.2.3.3. Một số môi trường khác Bảng 2.4. Thành phần môi trường thử khả năng lên men các nguồn carbohydrates khác nhau (g/l) Peptone 10.0 Meat extract 1.0 NaCl 5.0 Carbohydrates 10.0 Bromocresol purple (5.2 vàng – 6.8 tím) 0.17 pH 7.0.2 2.2.3.4. Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử - Đệm CTAB: Tris-Cl 0.2M pH 7.5, NaCl 2M, EDTA 0.05M, CTAB 2% - P:C:I (25:24:1): Polyphenol - Chloroform - Isoamyl alcohol - Isopropanol - Ethanol 70% - 6X Loading dye - TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X - Agarose - Cặp mồi phản ứng PCR: Tên mồi 27F 1492R µg/OD260 28 33 Khối lượng phân 6149 5785 tử (µg/umole) OD260 10.20 10 Nồng độ (µM) 100 100 53
Đồ án tốt nghiệp AGAGTTTGATCCTGG GGTTACCTTGTTACGA Trình tự (5’ – 3’) CTCAG CTT 2.2.4. Các phần mềm sử dụng - Dựng đồ thị, chuyển đổi đơn vị, thống kê, sắp xếp các kết quả số liệu thô bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. - Dùng phần mềm SAS University Edition để xếp hạng các yếu tố theo phương pháp Ducan, xác định độ tin cậy thí nghiệm, độ lệch chuẩn. - Phần mềm sinh học phân tử MEGA 7.0 dùng để đọc kết quả giải trình tự DNA, dựng cây phát sinh loài. 54
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu Thu mẫu nước bọt, mảng bám răng Cấy trang trên môi trường LBS Khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, mịn; trắng sữa/trong suốt Catalase (-) Hình thái Gram Di động Sinh bào tử Coccus/bacillus (+) (-) (-) Giữ giống trong thạch Vi khuẩn lactic nghiêng, glycerol lạnh đông Định lượng khả năng tạo màng sinh học Vi khu ẩn lactic Vi khuẩn lactic không tạo màng tạo màng Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học Đồng nuôi cấy Tách DNA Định lượng khả năng tạo Định lượng màng sinh học màng sinh Phản ứng PCR học. Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học Giải trình tự DNA Định danh 55
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Thu mẫu 2.3.2.1. Dụng cụ thu mẫu Tăm bông vô trùng, ống nghiệm chứa 2ml nước muối sinh lý, eppendorf vô trùng, ống nhổ nước bọt. 2.3.2.2. Điều kiện đối tượng lấy mẫu - Không sử dụng phương pháp tẩy trắng răng cách đây 6 tháng - Không đang điều trị có bệnh liên quan đến răng miệng - Không đang dùng thuốc kháng sinh (do bị cảm hoặc đang điều trị các bệnh nhiễm trùng, viêm) - Không hoạt động mạnh, đánh răng hay dùng bữa trước giờ lấy mẫu 2 tiếng. 2.3.2.3. Khảo sát tình trạng răng miệng đối tượng thu mẫu Dựa trên tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới năm 1997, các đối tượng thu mẫu sẽ được kiểm tra răng miệng để thu về 3 chỉ tiêu: số răng sâu (decayed teeth - DT), số răng thiếu (missing teeth - MT), số răng trám (filled teeth –FT). Tổng ba chỉ số trên sẽ chính là chỉ số sâu răng đại diện (decayed, missing, filled teeth index – DMFT) [103]. 2.3.2.4. Thời gian thu mẫu: - Buổi sáng khi các đối tượng thu mẫu vừa mới tỉnh giấc. 2.3.2.5. Phương pháp lấy mẫu nước bọt, mảng bám Mẫu nước bọt: đặt đầu nhọn ống hút vào eppendorf. Dùng lưỡi và má để dồn tất cả nước bọt trong miệng về phía đầu lưỡi. Ngậm môi chặt vào đầu ống hút rồi từ từ thổi nước bọt vào trong. Lặp lại thao tác 2 – 3 lần, hoặc cho đến khi lượng mẫu đạt 2/3 eppendorf. 56
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Mô tả phương pháp thu mẫu nước bọt 1, ống hút; 2, eppendorf vô trùng Mẫu mảng bám: dùng bông tăm chà phần chân răng và mặt nhai (hàm dưới và hàm trên). Cho đầu tăm bông lấy mẫu ngâm vào nước muối sinh lý đựng trong ống nghiệm. Giữ đứng ống nghiệm và đưa về phòng thí nghiệm, bảo quản lạnh ở 10oC đợi đến khi xét nghiệm. 57
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng. 2.3.3. Tăng sinh 2.3.3.1. Cấy trang mẫu Vortex các mẫu trong 30s rồi pha loãng bằng nước muối sinh lý ra nồng độ 10- 2 . Đối với các mẫu nhìn bằng mắt thường thấy không đục thì không cần pha loãng. Cấy trang các nồng độ pha loãng và cả mẫu chưa pha loãng lên đĩa thạch môi trường chọn lọc LBS. Sau khi ủ các đĩa thạch LBS ở 37oC trong 48h. Chọn 1 - 2 khuẩn lạc đặc trưng, có ít nhất một đặc điểm khác nhau về kích thước hoặc màu sắc. Khuẩn lạc đặc trưng của Lactobacillus spp. tròn lồi, mịn, lấp lánh, màu trắng đục [50]. Tiến hành cấy ria khuẩn lạc đã chọn ra môi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 24h. 58
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4. Chọn lọc vi khuẩn lactic Tiến hành xác định hình thái tế bào, nhuộm Gram, thử catalase, khả năng di động, khả năng sinh bào tử. Chọn ra những chủng cầu/trực khuẩn, Gram dương, catalase âm tính, không có khả năng di động và không sinh bào tử [50]. 2.3.5. Bảo quản Giống thạch nghiêng: Cấy ria giống từ đĩa thạch sang 5 ống giống thạch nghiêng MRS. Ủ ở 37oC trong 24h. Khi thấy đường sinh khối mọc đều dày đặc thì bảo quản ở 10oC để sử dụng cho các khảo sát sau. Thời gian bảo quản 1 – 2 tháng. Giống lạnh đông: hút 500 µl dịch nuôi cấy 24h (môi trường MRS) của các chủng vào trong eppendorf 1.5ml vô trùng. Tiếp tục cho vào 500 µl glycerol 40% (v/v). Votex trong 5 giây. Bảo quản ở -80oC. Thời gian bảo quản 1 – 2 năm. 2.3.6. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh Tăng sinh các chủng vi khuẩn lactic đã được sàng lọc sơ bộ trong môi trường o lỏng MRS ở 37 C trong 24h. Điều chỉnh OD600 của dịch tăng sinh các chủng về gần bằng 0.8. Cấy 5% giống vào ống nghiệm MRS lỏng. Để định lượng màng sinh học tạo thành, xác định màng sinh học hình thành trong đĩa 96 giếng (Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate) đã được thực hiện. Từ mỗi ống nghiệm chứa 5% giống trên, hút ra 200 µl dịch bơm vào 3 giếng nuôi cấy trên đĩa 96 (tương ứng với 3 lần lặp lại). Sau khi ủ đĩa 96 ở 37oC trong 24h, lật ngược đĩa giếng và giũ mạnh để loại bỏ dịch nuôi cấy. Tiến hành rửa trôi các tế bào phù du bằng cách ngâm ngập đĩa 96 trong nước và giũ mạnh nước ra ngoài, thao rửa lặp lại 2 lần. Mang các đĩa 96 sấy ở 80oC trong 15 phút để cố định màng sinh học. Nhuộm màng sinh học hình thành trong giếng bằng 200 µl dung dịch Crystal violet (CV) 0.1% trong 15 phút. Nhẹ nhàng loại bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm ngập đĩa 96 trong nước và lấy khăn thấm hút nước trong giếng ra. Cho các đĩa 96 vào tủ sấy 40oC trong 20 – 30 phút để nước trong giếng bốc hơi hoàn toàn. Tiếp tục, cho vào các giếng 220 µl dung dịch acid acetic 33% để hòa tan màu tím của CV, lắc đĩa 59
Đồ án tốt nghiệp với tốc độ 80 rpm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Chuyển dịch acid acetic này sang một đĩa 96 mới và mang đi đo OD570. Dùng phương pháp trắc nghiệm phân hạng Ducan để chọn ra những chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh nhất. Khuẩn tạo màng sinh học mạnh sẽ được phân vào biofilm group (BG). Những chủng còn lại sẽ được phân vào nhóm non-biofilm group (NBG). Các ống giống cũng sẽ được ủ nghiêng 30o để tăng vùng hình thành màng sinh học. Sau mốc thời gian ủ thì tiến hành đảo 2 - 3 lần, kế đó quan sát đánh giá độ bền của màng sinh học bám trên thành ống để khẳng định khả năng tạo màng. Hình 2.3. Dùng lực chảy của dịch môi trường để tác động lên màng sinh học. 2.3.7. Định danh các chủng BG 2.3.7.1. Tách chiết DNA 2.3.7.1.1. Phá màng tế bào vi khuẩn Hút dịch tăng sinh của các chủng vào từng ống eppendorf riêng lẻ và ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 15 phút. Sau khi đổ bỏ dịch nổi, tiếp tục hút dịch tăng sinh 60
Đồ án tốt nghiệp còn lại vào ống eppendorf cũ và ly tâm. Lặp thao tác này cho đến khi hết 10ml dịch tăng sinh hoặc khối lượng tế bào thu được trong eppendorf khoảng 0.2 gram. Sau khi lượng tế bào đạt yêu cầu thì cho vào eppendorf 1000 µl dung dịch CTAB, lắc mạnh hoặc vortex để đánh tan khối tế bào dưới đáy eppendorf tạo dạng huyền phù. Sau khi ủ các ống eppendorf ở bể điều nhiệt 60oC trong 1 giờ, thì tiến hành ly tâm với tốc độ 13.000 rpm trong 15 phút. Nhẹ nhàng hút 800 µl dịch nổi sang một ống eppendorf mới. 2.3.7.1.2. Loại bỏ protein Bổ sung 800 µl dung dịch Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol – 25:24:1 v/v (P:C:I) vào dịch nổi trong eppendorf lúc nãy. Vortex 5s và để ổn định trong ngăn lạnh đông của tủ lạnh trong 2 phút. Kế đó ly tâm lạnh 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 10 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp sẽ tách thành 3 lớp, cẩn thận hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới, tránh hút phải màng liên pha protein. Lưu ý ghi nhận thể tích dịch nổi hút được của từng mẫu 2.3.7.1.3. Tủa DNA Bổ sung vào dịch nổi mới hút dung dịch Isopropanol với tỷ lệ 1:1 (v/v). Ủ mẫu ở -80oC trong 30 phút. Ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 15 phút., bỏ dịch thu tủa màu trắng đục (tủa DNA). Rửa tủa DNA bằng cách bổ sung vào 1ml dung dịch ethanol 70% , ly tâm lạnh mẫu ở 4oC với tốc độ 14.000 rpm trong 15 phút. Sau khi ly tâm, cho các eppendorf vào tủ sấy để bay hơi hoàn toàn nước và ethanol. Cuối cùng bổ sung khoảng 50 µl nước sinh học phân tử vào tủa DNA, bảo quản mẫu ở nhiệt độ 10oC. Điện di mẫu để kiểm tra sự có mặt của DNA. 61
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Mô tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA 2.3.7.2. Khuếch đại DNA bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR là 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), cặp mồi phổ rộng đặc trưng cho vi khuẩn. Thành phần phản ứng PCR 16S rRNA gồm có: 1 µl 27F và 1 µl 1492R (10 pmol/µl), 12.5 µl nước sinh học phân tử, 9.5 µl master mix (Bioline, Anh) và 1 µl mẫu DNA. Tổng thể tích phản ứng là 25 µl. Thông số của chu trình phản ứng PCR 16S rRNA được thể hiện như trong hình 2.5. 62
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.5. Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 2.3.7.3. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích DNA, sản phẩm PCR trên gel 1% agarose 1 gram bột agarose hòa vào 100ml dung dịch đệm Tris-acetate-EDTA (TAE), gia nhiệt để agarose tan hoàn toàn. Sau khi nhiệt độ gel xuống còn 50-55oC thì tiến hành đổ gel và lắp lược 8 giếng vào khuôn điện di. Khi miếng gel đặc lại hoàn toàn thì cho vào buồng điện di chứa đệm TAE sao cho dung dịch cao hơn mặt gel 3 - 5 mm. Tiến hành trộn sản phẩm ly trích DNA/PCR vào dịch Loading dye (6X) theo tỷ lệ 5 : 1 (v/v, µl). Nạp hỗn hợp vào trong các giếng. Tiến hành điện đi mẫu với điện thế 90 V trong khoảng 20 - 30 phút. Sau khi điện di, miếng gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong 15 phút, rửa lại bằng nước trong 2 phút. Cuối cùng quan sát vệt DNA xuất hiện trên gel dưới ánh sáng UV. 2.3.7.4. Giải trình tự DNA và định danh Mẫu sản phẩm PCR kèm theo mồi xuôi 27F được gửi đến công ty Nam Khoa Biotek để thực hiện giải trình tự một chiều. Kết quả gửi về từ công ty sẽ được đọc bằng phần mềm MEGA 7.0 ( Chọn vùng trình tự ổn định và so sánh với ngân hàng BLAST của NCBI 63
Đồ án tốt nghiệp ( để tìm ra các chủng tương đồng. Kết quả chấp nhận khi mức tương đồng trình tự đạt trên 98%. Dựa vào cây phát sinh loài kết hợp với hình thái, khả năng sinh hóa của các chủng để định danh ở mức cấp loài. 2.3.8. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG Dịch tăng sinh của cả BG và NBG sau 24h sẽ được đưa về cùng mật độ thông qua việc điều chỉnh thông số OD600 gần bằng 0.8. Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactobacillus spp. được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy trong môi trường LBM trên đĩa giếng 96 (như mô tả ở mục 2.3.6.). Cứ mỗi chủng NBG sẽ được thử nghiệm đối kháng với 1 chủng BG với 2 tỷ lệ giống 1BG : 1NBG và 1BG : 2NBG. Mô tả thí nghiệm được trình bày như bảng 2.5. Mỗi ô nghiệm thức cấy 1 chủng BG và 1 chủng NBG trong 200 µl môi trường LBM. Bên cạnh đó nuôi cấy các chủng BG đơn lẽ để làm đối chứng âm. Mọi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Bảng 2.5. Mô tả các nghiệm thức (NT) trong thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học (1x, tỷ lệ cấy giống 2.5%; 2x, tỷ lệ cấy giống 5%) Non-biofilm Tỷ lệ giống NBG Biofilm group group 1x 2x (1x) NBG1 NT11x NT12x BG1 NBG2 NT21x NT22x BG2 NBG3 NT31x NT32x BG3 Khả năng ức chế của NBG lên sự tạo thành màng sinh học của BG được tính theo công thức: ODduel % NBGx ức chế BGx = (1 - )×100 ODsolo Trong đó: ODduel : trung bình kết quả OD570 của 3 giếng đồng nuôi cấy chủng NBGx và BMx ODsolo : trung bình kết quả OD570 của 6 giếng đối chứng âm BGx. 64
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu Trong thí nghiệm này, nhóm thực hiện đồ án đã thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình, độ tuổi từ 8 cho đến 85 tuổi. Trong đó có 16 nữ và 14 nam. Chỉ số DT và DMFT tổng thu được là 1.5 ± 1.7 và 3.6 ± 2.9. So với thống kê năm 2001 của Hiệp hội Quốc tế Răng miệng Việt Nam: chỉ số DT và DMFT toàn quốc lần lượt là 2.1 ± 0.2 và 4.1 ± 2.9 [104], thì kết quả thu được trong lần khảo sát này cũng phản ánh gần đúng tình trạng răng miệng của nước ta. Tỷ lệ dân số Việt Nam bị sâu răng rất cao, từ 75.2% ở lứa tuổi 18 - 34 và tăng lên gần 90% ở lứa tuổi từ 45 trở lên. Chỉ số DT trung bình ở tuổi 18 là 2.8, còn ở tuổi 45 trở lên là 9. Chỉ số MT cũng tăng từ 0.5 ở tuổi 18 lên 6.6 ở tuổi 45 trở lên [105]. Bảng 3.1. Thông kê khảo sát tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu (n = 30; *, giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) DT, số răng sâu; MT, số răng thiếu; FT, số răng tram; DMFT, tổng ba chỉ số DT, MT và FT. Nam (n = 14) Nữ (n = 16) Tổng (n = 30) DT* 1.4 ± 1.7 1.6 ± 1.7 1.5 ± 1.7 MT* 0.4 ± 0.6 0.9 ± 2.1 0.7 ± 1.6 FT* 0.9 ± 1.3 1.8 ± 2.6 1.4 ± 2.1 DMFT* 2.8 ± 1.9 4.3 ± 3.4 3.6 ± 2.9 Tỷ lệ sâu răng (%) 57.1 81.3 70.0 3.2. Phân lập vi khuẩn Lactic Năm 1944, qua nghiên cứu của Harrison và Opal đã xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp. phân lập ra từ mẫu nước bọt được là 93% và mẫu phân là 66% (mẫu được lấy từ trẻ em bị sâu răng). Vì thế khoang miệng là nguồn thu mẫu lý tưởng để phân lập LAB nói chung và Lactobacillus spp. nói riêng. Năm 1951, Rogosa và cộng sự đã thiết lập môi trường Lactobacillus Selection (LBS) làm môi trường chọn lọc để phân lập Lactobacilus spp. trong khoang miệng và khoang ruột [106]. 65
Đồ án tốt nghiệp Từ 30 mẫu mảng bám và 30 mẫu nước bọt thu được, nhóm thực hiện đồ án đã phân lập ra được 42 chủng vi khuẩn răng miệng khác nhau từ môi trường thạch LBS. Các chủng được ký hiệu dựa trên số thứ tự từ 1 đến 30, tương ứng với các đối tượng thu mẫu. Kết hợp với ký tự R và B tương ứng với mẫu mảng bám trên răng và mẫu nước bọt. Để tiết kiệm thời gian cũng như hóa chất thiết bị, thử nghiệm catalase sẽ được tiến hành đầu tiên vì tính đơn giản và cho kết quả nhanh. Những chủng cho kết quả catalase (-) sẽ được chọn để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Kế đến thứ tự cho các thí nghiệm chọn lọc được thực hiện sẽ là: thí nghiệm xác định khả năng di động, phương pháp nhuộm gram và nhuộm bào tử. LAB là nhóm vi khuẩn hình cầu hoặc que, Gram dương, catalase âm tính, không có khả năng di động và không sinh bào tử [50]. Từ 42 chủng ban đầu phân lập từ môi trường thạch, sau chuỗi thí nghiệm trên, tổng số chủng vi khuẩn lactic phân lập được cuối cùng là 30 chủng, đáng chú ý là chỉ có mỗi thử nghiệm catalase là loại đi mất 12 chủng. Bảng 3.2. Danh sách các chủng vi khuẩn lactic phân lập được và hình thái tế bào của chúng (B, trực khuẩn; C, cầu khuẩn) STT Chủng Hình thái tế bào STT Chủng Hình thái tế bào 1 1B B 16 1R2 B 2 5B1 B 17 2R2 B 3 7B2 B 18 4R2 C 4 8B B 19 5R1 B 5 9B1 B 20 7R2 C 6 10B2 C 21 8R B 7 11B2 B 22 12R1 C 8 16B C 23 12R2 B 9 18B2 C 24 20R B 10 21B2 B 25 21R2 B 11 23B1 B 26 23R C 12 23B2 B 27 26R1 B 13 27B2 B 28 26R2 C 14 30B1 B 29 27R C 15 30B2 B 30 30R2 C 66
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.1. Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn lactic phân lập được dưới vật kính 100x. 3.3. Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh Trong thí nghiệm này, nhóm đồ án thực hiện phương pháp xác định màng sinh học hình thành trong đĩa 96 giếng (Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate) để so sánh khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic [107]. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy trong đĩa 96 giếng là khả năng đồng nhất về bề mặt bám dính 67
Đồ án tốt nghiệp của vi khuẩn, hạn chế được tối đa sai số. Bên cạnh đó, phương pháp còn giảm nhỏ quy mô của các nghiệm thức trong thí nghiệm, giúp tiết kiệm được nhiều chi phí và thời gian. Phương pháp này được dùng để xác định khả năng tạo màng sinh học của rất nhiều loại vi sinh vật khác nhau như: Pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Staphylocci, Enterococci, Mycobacteria và một số chi nấm. Phương pháp này dần trở thành phương pháp chung để xác định khả năng tạo màng sinh học và dường như không có giới hạn phạm vi áp dụng [108]. Crystal violet (CV) là thuốc nhuộm cơ bản liên kết với các phân tử trên bề mặt có điện tích âm như polysaccharides và eDNA trong mạng lưới ngoại bào của vi khuẩn [109]. Vừa có khả năng liên kết với vách tế bào và mạng lưới ngoại bào của vi khuẩn nên thuốc nhuộm CV là lựa chọn hàng đầu trong phương pháp nhuộm màng sinh học. Thực hiện theo phương pháp chọn lọc như đã được miêu tả ở mục 2.3.6. Ta chọn ra 3 chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh nhất (được xếp vào hạng a và b theo phương pháp trắc nghiệm phân hạng của Ducan) đó là 1B, 12R2 và 30B2 (bảng 3.3). Bên cạnh đó cả ba chủng này đều là trực khuẩn, nên bước đầu có thể nói rằng đây là 3 chủng Lactobacillus spp. có khả năng tạo màng sinh học đáng chú ý. Hình 3.2. Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i (a, b, i: thứ hạng được đánh giá trong kiểu trắc nghiệm phân hạng của Ducan) 68
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.3. Kết quả định lượng khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic (n = 3, P < 0.05) Trung bình Độ lệch Trung bình Độ lệch Chủng Chủng OD570 chuẩn OD570 chuẩn 1B 3.3a 0.05 1R2 0.33hi 0.09 5B1 0.26i 0.02 2R2 0.49ghi 0.03 7B2 0.45hi 0.2 4R2 1.39cdef 0.13 8B 0.26i 0.06 5R1 0.91efghi 0.05 9B1 1.77c 0.99 7R2 0.27i 0.07 10B2 1.01defgh 0.62 8R2 0.29i 0.1 11B2 1.54cde 0.44 12R1 1.58cde 0.76 16B 0.52ghi 0.24 12R2 3.06a 0.39 18B2 1.58cde 0.03 20R 1.66cd 0.41 21B2 0.25i 0.01 21R2 0.29i 0.05 23B1 0.23i 0.03 23R 0.6ghi 0.12 23B2 0.19i 0.01 26R1 0.79fghi 0.49 27B2 0.83fghi 0.4 26R2 1.16cdefg 0.41 30B1 0.52ghi 0.19 27R 1.38cdef 0.78 30B2 2.49b 0.41 30R2 0.46ghi 0.25 Trên thực tế 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 được chọn vào nhóm BG không phải vì có khả năng tạo màng sinh học, mà là vì có màng sinh học bền vững nhất. Các chủng vi khuẩn lactic được Kubota và công sự phân lập trong hành tây hầu hết đều có khả năng tạo màng sinh học, nhưng mức độ là khác nhau giữ các chủng [126]. Thông qua phương pháp ủ ống giống lỏng nghiêng 30o để quan sát sự hình thành màng sinh học, nhóm thực hiện nhận thấy tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng tạo màng sinh học, nhưng mức độ bền chắc là khác nhau ở mỗi chủng. 69
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3. Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ: A, vừa lấy ra từ tủ ủ – cả 2 chủng 21B2 và 30B2 đều hình thành màng sinh học trên thành ống nghiệm; B, sau khi tác động lực – chủng 30B2 vẫn giữ lại được gần như toàn vẹn cấu trúc màng sinh học. 70
Đồ án tốt nghiệp 3.4. Định danh 3.4.1. Ly trích, thu nhận DNA So sánh với các phương pháp sốc nhiệt thì phương pháp tách DNA bằng CTAB được xem là ổn định hơn [110]. Từ hình 3.4 cho thấy kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA. Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn. Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn có kích thước khác nhau. 3.4.2. Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR Các sản phẩm tách chiết DNA sẽ được làm mẫu để thực hiện phản ứng PCR đoạn gen 16S rRNA bởi cặp mồi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). 16S rRNA là vùng mã hóa các RNA ribosome được xác định là đoạn gen được bảo tồn bền vững nhất ở tất cả các tế bào vi khuẩn. Tuy vậy, đây cũng là vùng gen rất linh họat, dựa vào mức độ, vị trí thay đổi trình tự các nucleotide ở vùng này mà người ta có thể khảo sát di truyền các chủng vi khuẩn [111]. 71
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA. 3.4.3. Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết quả được gửi về dưới dạng file *.ab1. File trình tự được đọc bằng chương trình MEGA 7.0, loại bỏ đi các đoạn DNA nhiễu. Kế đó đưa lên so sánh với ngân hàng dữ liệu gen BLAST của NCBI ( Basic Local Alignment Search Tool, hay BLAST, là một giải thuật để so sánh các chuỗi sinh học, như các chuỗi amino-acid của các protein hay của các chuỗi DNA khác nhau. Hiện BLAST đang được phát triển bởi National Center for Biotechnology Information (NCBI), và được sử dụng miễn phí trên website ( Trong danh sách hiển thị kết quả, chọn ra 1 chủng đại diện cho mỗi loài khác nhau được hiển thị và dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự DNA của chúng. Cây phát sinh loài được dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining [112]. Độ tin cậy của các nhánh (dựa trên một 1000 lần lặp lại) được xác định bằng phương pháp bootstrapping và được hiển thị ở các đoạn phân nhánh [113]. Khoảng cách tiến hóa (evolutionary distances) được tính bằng phương pháp Maximum Composite 72
Đồ án tốt nghiệp Likelihood [114]. Các phương pháp thuật toán trên đều được chạy bằng chương trình MEGA 7.0. Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI. Chủng 1B, 12R2 và 30B2 có mối quan hệ gần nhất với chủng L. fermentum DJ8B (Sequence ID: MF455215.1), với mức độ tin cậy nhánh phát sinh là 100%. Lactobacillus fermentum được phân lập trong răng miệng đều có thể tạo màng sinh học, bởi việc sở hữu đoạn gen glucosyltransferases (Gtf) tổng hợp nên glucans (thành phần gắn kết trong màng sinh học) [64]. Bên cạnh đó, tỷ lệ xuất hiện của các chủng L. fermentum trong miệng trẻ bị sâu răng lên tới 60% [62]. Và theo Carlsson và cộng sự (1975), các chủng L. fermentum chiếm mật độ cao nhất trong khoang miệng ở cả trẻ em và người lớn đang trong giai đoạn bị sâu răng [115]. Vì thế kết quả hiển thị trên cây phát sinh loài không có gì là đáng nghi ngờ khi các chủng 1B, 12R2, 30B2 được phân lập từ khoang miệng. 73
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7. Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L. fermentum YB5 (do X. Zhang và cộng sự phân lập được từ yaourt) [116]. Bên cạnh đó theo mô tả của Beijerinck (1901), tế bào của L. fermentum là que dài 0.5–0.9 μm và dày [50]. Có thể thấy hình thái tế bào của 3 chủng nhóm phân lập được rất giống với hình thái tế bào loài L. fermentum. Kế đó nhóm thực hiện đề tài tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng lên men đường của các chủng 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 và so sánh với các kết quả được ghi nhận từ những báo cáo khoa học khác, nhằm đưa ra kết luận phân loài chặt chẽ hơn. Kết quả khảo sát khả năng lên men đường được trình bày ở bảng 3.7. 74
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số loài Lactobacillus có trong kết quả hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI. Cellobiose Galactose Glucose Mannose Ribose Sorbitol Maltose Mannitol Xylose Arabinose Sorbose - - - - - - - - - - - D D D D D D Glycerol Lactose L L D D D Salicin Starch Sucrose L. paracasei subsp. + + - + - - - + + + + + + + + [117] 96% 63% 90% 76% 67% 77% 94% 96% - + - + + L. curvatus subsp. [118] + + + - - - - - - 62.5% 87.5% 62.5% 62.5% 87.5% - - + L. oris sp. [119] + + + + - + + - + - - - + 80% 80% 60% - - - L. plantarum [50] [120] + + + + + - + - + - + - + 90% 53% 87% + - - + L. fermenturn [50] [119] - + + + - - + - + - - - 77% 78% 73% 77% Chủng 1B - + + + + - - + - - + - - - - + Chủng 12R2 - + + + + - - + - - + - + - - + Chủng 30B2 - + + + + - - + - - + - - - - + 75
Đồ án tốt nghiệp Kết quả khảo sát khả năng lên men đường cũng đúng như mong đợi. Kết hợp các điểm giống nhau về DNA, hình thái tế bào và khả năng lên men các nguồn carbohydrate ta có thể kết luận rằng 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đích thị là loài Lactobacillus fermentum. Từ đó, nhóm thực hiện đồ án đặt tên cho 3 chủng này là L. fermentum 1B, L. fermentum 12R2 và L. fermentum 30B2. Mức tương đồng giữ các chủng cũng được đánh giá dựa trên trình tự DNA bằng phần mềm Sinh học phân tử Unipro UGENE v1.26.3. Bảng 3.5. So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L. fermentum 1B, 12R2 và 30B2 (%) L. fermentum 1B L. fermentum 12R2 L. fermentum 30B2 L. fermentum 1B 100 90 93 L. fermentum 12R2 93 100 94 L. fermentum 30B2 94 92 100 3.5. Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn NBG đối với L. fermentum Sự hình hành màng sinh học sẽ diễn ra nhanh hơn khi hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường thấp [121]. Năm 2011, kết quả nghiên cứu của Michu và cs cũng đã chỉ ra rằng vi khuẩn sẽ hình thành màng sinh học nhiều hơn trong môi trường có hàm lượng đường thấp hơn [122]. Sự có mặt của ion Ca2+ sẽ giúp vi khuẩn hình thành nên hệ màng sinh học bền vững và dày đặc hơn [123]. Vì thế nghiên cứu này sẽ sử dụng môi trường LBM (50% MRS bổ sung Ca2+) để tối ưu khả năng tạo màng sinh học của Lactobacillus spp. như đã được trình bày ở bảng 2.3. Nồng độ ion Ca2+ bổ sung vào môi trường tương tự với nồng độ ion Ca2+ trong nước bọt ở người là 0.9 ± 0.4 mmol/l [124]. Trong tổng cộng trong 30 chủng vi khuẩn lactic phân lập được, tiếp tục chọn ra được 3 chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học trong khoang miệng đó là L. 76
Đồ án tốt nghiệp fermentum 1B, L. fermentum 12R2, L. fermentum 30B2. Với giả thuyết rằng các vi khuẩn NBG sẽ có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của L. fermentum sp., nhóm thực hiện đề tài đã tiếp thực hiện thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của 27 chủng NBG lên 3 chủng L. fermentum. Bên cạnh các tác nhân vi khuẩn gây sâu răng ra, còn có sự góp mặt của một số loài nấm khác, điển hình là Candida albicans. Rozkiewicz và cộng sự đã phân lập được C. albicans từ 62.3% trẻ em bị sâu răng lâm sàng [125]. Nghiên cứu của Samaranayake (1986), Cannon (1995), Sen (1997) và Makihira (2002) đã cho thấy C.albicans có khả năng sinh acid hữu cơ từ quá trình lên men và tiết enzym phân hủy được collagen của ngà răng, do đó C.albicans không những làm mất khoáng mô răng mà còn phá hủy những cấu trúc hữu cơ của ngà răng. Vì vậy trong thí nghiệm này nhóm đồ án cũng thử thêm khả năng ức chế màng sinh học của các chủng NBG lên nấm chủng nấm C. albicans. C. albicans sẽ được xếp vào nhóm BG. Sau khi thực hiện các phương pháp được miêu tả ở mục 2.3.6. Kết quả cho thấy khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của 27 chủng NBG lên 4 chủng BG dao động từ 0 – 72.36%. Từ các kết quả khả năng đối kháng, nhóm thực hiện chọn ra được 10 chủng NBG có khả năng ức chế trên 50% sự hình màng sinh học của tổi thiểu 1 trong các 4 chủng BG. Khả năng ức chế sự hình màng sinh học của 10 chủng NBG này sẽ được chọn ra biểu diễn trên các biểu đồ (hình 3.8 – 3.11). Ngoài ra, nhóm còn đánh giá thêm khả năng tự tạo màng sinh học của 10 chủng NBG này (hình 3.12). 77
Đồ án tốt nghiệp 100 Tỷ lệ 1:1 90 Tỷ lệ 1:2 80 70 60 50 40 30 Tỷ lệ lệ Tỷ khángmàngsinh học (%) 20 10 0 7R2 7B2 8R2 10B2 16B 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 Hình 3.8. Kết quả cho thấy chỉ có mỗi chủng 16B có khả năng kháng màng sinh học của L.fermentum 1B lên tới 72.36 ± 5.76 % ở tỷ lệ 1:1 và 71.44 ± 3.68 % ở tỷ lệ 1:2. 100 Tỷ lệ 1:1 90 Tỷ lệ 1:2 80 70 60 50 40 30 20 Tỷ lệ lệ Tỷ khángmàngsinh học (%) 10 0 7R2 7B2 8R2 10B2 16B 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 Hình 3.9. Nhìn chung ngoại trừ chủng 8R2 và 21R2 vì có độ lệch chuẩn quá cao nên không thể xem là có khả kháng. Chủng 21B2 chỉ xuất hiện khả năng kháng ở tỷ lệ 1:2 (61.04 ± 11.55 %). Tất cả các chủng còn lại đều có khả năng kháng màng sinh học của L. fermentum 12R2, trong đó chủng 26R1 kháng tốt nhất (77.38 ± 6.63 % ở tỷ lệ 1:1 và 78.17 ± 3.28 % ở tỷ lệ 1:2) 78
Đồ án tốt nghiệp 100 Tỷ lệ 1:1 90 Tỷ lệ 1:2 80 70 60 50 40 30 20 Tỷ lệ lệ Tỷ khángmàngsinh học (%) 10 0 7R2 7B2 8R2 10B2 16B 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 Hình 3.10. Khả năng kháng màng sinh học của chủng 7B2 không được công nhận vì độ lệch chuẩn vượt quá tỷ lệ kháng trung bình. Bên cạnh đó khả năng kháng của chủng 16B không đáng tin cậy vì chủng 16B chỉ kháng màng sinh học của L. fermentum 30B2 ở tỷ lệ 1:1, nhưng cũng không thể bác bỏ kết quả này vì sự phát tín hiệu giữa các tế bào vi khuẩn (Quorum sensing) không chỉ tác động lên khả năng hình thành màng sinh học của các loài khác mà còn tác động lên chính bản thân chúng. 100 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 80 60 40 20 Tỷ lệ lệ Tỷ khángmàngsinh học (%) 0 7R2 7B2 8R2 10B2 16B 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 Hình 3.11. Khả năng kháng màng sinh học của chủng 10B2 không được công nhận vì độ lệch chuẩn vượt quá tỷ lệ kháng trung bình. Chủng 8R2 cho khả năng kháng màng sinh học của nấm C. albicans ổn định và cao nhất (35.39 ± 5.68 % ở tỷ lệ 1:1 và 65.83 ± 9.28 % ở tỷ lệ 1:2). Các chủng 21R2, 21B2, 23B1, 23B2 chỉ kháng ở tỷ lệ 1:2. 79
Đồ án tốt nghiệp 4.00 3.50 a a 3.00 b 2.50 2.00 defgh OD OD 570 1.50 fghi 1.00 i ghi i 0.50 i i i i i i 0.00 7R2 7B2 8R2 8B 10B2 16B 21R2 21B2 23B1 23B2 26R1 1B 12R2 30B2 Hình 3.12. Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học (P < 0.05). Chỉ riêng chủng 10B2, 16B và 26R1 là nằm ngoài ngoài xếp hạng i khả năng tạo màng sinh học, dù vậy nhưng khi so với các chủng BG thì cũng vẫn còn rất thấp. Dựa vào các biểu đồ 3.8 – 3.11, ta thấy các vi khuẩn NBG đều có khả năng kháng màng ở cả 2 tỷ lệ cấy giống. Nhưng không thể kết luận được tỷ lệ giống nào cho khả năng kháng màng tốt hơn. Theo Davies và cộng sự, tín hiệu giữa các tế bào (Quorum sensing) đóng vai trò quan trọng trong sự bám dính cũng như quyết định thời điểm bước vào giai đoạn phân tán của các vi khuẩn trong màng sinh học [80]. Vậy nên có thể kết luận mật độ tế bào cũng như các loài có mặt trong môi trường sẽ ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học trên bề mặt môi trường đó. Ở tỷ lệ cấy giống 1:2, chỉ riêng 16B là có khả năng kháng màng sinh học đáng kể ở cả 3 chủng L. fermentum với tỷ lệ kháng 72.36 ± 5.76, 46.36 ± 12.42, 65.39 ± 9.31 % tương ứng với L. fermentum 1B, 12R2, 30B2. Ở tỷ lệ cấy giống 1:2, chủng 21R2, 21B2, 23B2 cũng có khả năng kháng màng sinh học đồng thời L. fermentum 12R2, 30B2 và Candida albicans. Trong đó, chủng 23B1 và 23B2 cũng kháng màng sinh học của L. fermentum 1B nhưng với tỷ lệ kháng không cao (16.53 ± 7.57 % ở 23B1 và 13.7 ± 5.71 % ở 23B2). 80