›

Đồ án Phân lập và định danh vùng gen ITS của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại TP. Hồ Chí Minh

pdf 64 trang thiennha21 12/04/2022 6810
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và định danh vùng gen ITS của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại TP. Hồ Chí Minh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfphan_lap_va_dinh_danh_vung_gen_its_cua_nam_men_nhiem_benh_tr.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và định danh vùng gen ITS của nấm men nhiễm bệnh trên da chó nuôi tại TP. Hồ Chí Minh

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VÙNG GEN ITS CỦA NẤM MEN NHIỄM BỆNH TRÊN DA CHÓ NUÔI TẠI TP. HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM- MÔI TRƯỜNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Ts. Hoàng Quốc Khánh Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Huỳnh Long Thủ MSSV: 1051110154 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Huỳnh Long Thủ, là sinh viên đại học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa 2010, tại trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan: ✓ Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện. ✓ Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở các nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong Luận văn tốt nghiệp của mình. SINH VIÊN Huỳnh Long Thủ
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tình hình nuôi chó 4 1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới 4 1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam 5 1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da 6 1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó 6 1.2.2. Bệnh ngoài da của người 7 1.3. Các tác nhân gây bệnh 7 1.3.1. Vi khuẩn 7 1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp 7 1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra 7 1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người 8 1.3.2. Nấm men 8 1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó 8 1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra 8 1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người 9 1.3.3. Nấm sợi 9 1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp. 9 1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra 9 1.4. Tổng quan về nấm men 10 1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men 10 1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men 10 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 1.4.3. Sinh sản của nấm men 11 1.4.4. Nấm men gây bệnh 12 1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh 12 1.6. Định danh nấm men 13 1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống 14 1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái 14 1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái 14 1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử 15 1.6.2.1 Đoạn gen rDNA 15 1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1. Vật liệu và thiết bị 19 2.1.1. Dụng cụ 19 2.1.2. Thiết bị 19 2.1.3. Vật liệu 19 2.1.3.1. Nguồn phân lập 19 2.1.3.2. Hóa chất 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh 21 2.2.2. Quan sát hình thái nấm men 22 2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men 22 2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả 23 2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men 24 2.2.3.1. Tách chiết DNA 24 2.2.3.2. Điện di 24 2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 25 2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men 29 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 33 3.1. Kết quả hình thái học nấm men 33 3.1.1 Kết quả khuẩn lạc 33 3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng 34 3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản 35 3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty 35 3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men 36 3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men 36 3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men 36 3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng gen NCBI và thiết lập cây phân loài 37 3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men 37 3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng cây phân loài 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 4.1. Kết luận 43 4.2. Đề nghị 43 Tài liệu tham khảo 45 iii
  6. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Bp Base Pair DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid PCR Polymerase Chain Reatio PDA Potato Dextrose Agar TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet iv
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Bảng Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993 13 Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) 17 Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc 33 Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng 34 Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men 35 Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty 35 Hình ảnh Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS 17 Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men 36 Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR . .37 Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2 37 Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các chủng nấm men phân lập( M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong ngân hàng gen 39 v
  8. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chó là người bạn thân thiết của con người, con người tiếp xúc với chó gần như là mọi lúc, dù là trực tiếp hay gián tiếp. Chính vì thế mà việc lây nhiễm những căn bệnh nguy hiểm của chó sang người là một vấn đề đáng quan tâm. Hiện nay, khi nhu cầu sở hữu một con chó làm thú cưng của con người ngày càng cao, về đa dạng, chủng loài và số lượng ngày càng nhiều, cùng với điều kiện nuôi đa dạng cho nên có nhiều hơn căn bệnh xuất hiện trên chó và có khả năng lây lan sang người. Trong các căn bệnh dễ lây lan sang người thì các căn bệnh ngoài da trên chó là những bệnh dễ tấn công sang người nhất. Vì chỉ cần thông qua tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp, và trong một điều kiện thích hợp thì con người cũng bị lây nhiễm. Có nhiều tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó, trong đó nấm men cũng là một tác nhân quan trọng có thể gây nên những hậu quả nghiêm trọng cho chó và cả con người. Vì thế để xác định được các loài nấm men đó thì trong khóa luận này sẽ tiến hành phân lập và bước đầu định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên vùng gen ITS rDNA nhằm xác định một số chủng nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh. 2. Mục đích nghiên cứu ✓ Cung cấp những thông tin chính xác về một số chủng nấm men nhiễm bệnh da trên chó cũng như khả năng lây lan của chúng sang con người, nhằm tăng khả năng điều trị và phòng ngừa lây lan khi chó bị nhiễm những loại nấm men trên. 1
  9. Đồ án tốt nghiệp ✓ Tạo nguồn giống nấm men thuần cho những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh học của các loài nấm men đã định danh được. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ✓ Phân lập được một số nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh. ✓ Định danh nấm men bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên việc giải trình tự đoạn gen ITS rDNA của nấm men. ✓ Bước đầu xác định khả năng gây bệnh của các loài nấm men đã định danh dựa trên các nghiên cứu trên thế giới. 4. Phương pháp nghiên cứu ✓ Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men để định danh nấm men. ✓ Các tài liệu phục vụ nghiên cứu được tham khảo từ các nghiên cứu, các bài báo khoa học, các luận văn khoa học được sưu tầm trên internet. ✓ Đề tài có sử dụng các phần mềm: BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 ✓ Ngân hàng gen 5. Các kết quả đạt được Sau quá trình nghiên cứu đề tài đã phân lập và định danh được 4 loài nấm men, dựa trên các nghiên cứu trên thế giới thì bước đầu nhận định cả 4 loài nấm men này đều có khả năng gây bệnh nguy hiểm trên chó và cả con người. 6. Kết cấu đề tài Đề tài gồm 4 chương 2
  10. Đồ án tốt nghiệp Chương 1: Tổng quan tài liệu Trình bày những thông tin liên quan đến chó, nấm men và các thông tin về phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng trong định danh nấm men. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Trình bày toàn bộ những nguyên vật liệu, địa điểm, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu và toàn bộ các quy trình, thao tác thực hiện các phương pháp nghiên cứu. Chương 3: Kết quả và biện luận Trình bày những kết quả chi tiết của toàn bộ quá trình thực hiện nhiên cứu. Chương 4: Kết luận và đề nghị Tổng kết lại những kết quả nghiên cứu đã đạt được và đưa ra những đề nghị liên quan nhằm hoàn thiện đề tài. 3
  11. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi chó Ngay từ thời tiền sử, khi loài người còn phải sống bằng các phương thức săn bắt, hái lượm, sống trong hang động. Khi tìm ra lửa, con người đã biết chế biến thức ăn đầu tiên bằng phương pháp nướng thịt thú rừng và sản phẩm thừa là xương động vật, đó là món khoái khẩu của chó rừng, một loài động vật có khứu giác rất phát triển. Đó chính là nguyên nhân khiến loài người và loài chó "tiếp cận" với nhau và cùng chung sống. Chó nhờ vào bản năng tự nhiên rất thính tai, thính mũi, có thể tìm ra được dấu vết cũng như khả năng nhìn trong bóng đêm rõ hơn con người, rất tỉnh ngủ, có trí thông minh và dễ huấn luyện.Vì thế con người đã sớm biết sử dụng chó để bảo vệ cho mình. Chó lại là một giống vật có tình nghĩa nhất khi so sánh với các con vật khác đã sống gần gũi với con người như trâu, bò, ngựa v.v 1.1.1. Thống kê về số lượng chó trên thế giới Số lượng chó được con người nuôi trên thế giới là một con số thống kê rất khó để đạt độ chính xác cao, vì ở một số quốc gia đặc biệt các quốc gia ở châu Á và châu Phi thì chó được nuôi một cách tự do, có nghĩa là không có bất cứ một hệ thống quản lý nào nhằm quản lý và kiểm soát số lượng chó của người dân. Tuy nhiên trong một nỗ lực nghiên cứu thị trường, nhằm đánh giá tiềm năng của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm vật nuôi của Mỹ, đã đưa ra được một số thống kê sơ bộ về số lượng chó trên thế giới. Theo đó Mỹ là quốc gia đứng đầu về số lượng chó mà người dân họ sở hữu, với 42,5 triệu hộ gia đình ở Mỹ nuôi một hoặc nhiều con chó và tổng số chó trong cả nước là 73 triệu con. Canada có 6 triệu con chó. [1] Các nước Tây Âu cũng sở hữu 43 triệu con trong đó: đứng đầu là Pháp 8,8 triệu con chó, cả Ý và Balan có 7,5 triệu, Anh có 6,8 triệu. Ở Đông Âu, Nga hiện có 12 triệu 4
  12. Đồ án tốt nghiệp con chó trong khi Ukraina cũng có 5,1 triệu con chó. Ở Nam Mỹ thì Brazil với 30 triệu con, Argentina 6,5 triệu con, Columbia 5 triệu con. [1] Ở châu Á và châu Úc thì việc thống kê số lượng chó gặp nhiều khó khăn khi việc đăng ký sở hữu chó là một điều không cần thiết ở nhiều quốc gia trên châu lục này. Nhưng theo ước tính Trung Quốc có khoảng 110 triệu con chó, Ấn Độ có khoảng 32 triệu con, Úc khoảng 4 triệu con. Các con số trên là chưa tính tới số lượng chó sống tự do và đi hoang. Tuy nhiên, Nhật Bản lại là quốc gia thuộc châu Á quản lý chặt chẽ nhất số lượng chó nuôi của người dân theo ước tính là khoảng 9,5 triệu con. [1] Ở châu Phi, theo những thống kê của tổ chức Y tế thế giới về số lượng chó nhằm kiểm soát bệnh dại trên người đang gia tăng, thì có khoảng 78 triệu con chó trên toàn châu lục và trong số đó có tới 70 triệu con là chó hoang vô chủ. [1] 1.1.2. Tình hình nuôi chó ở Việt Nam Ở Việt Nam, việc nuôi chó mèo và chim cảnh trong gia đình đã có từ lâu đời. Hầu như trong mỗi gia đình nào của người dân nước ta cũng đều nuôi chó và mèo, với chức năng chính là bảo vệ, diệt chuột Ngày nay, khi nền kinh tế đã tương đối phát triển, nghề nuôi chim, thú cảnh trong nhà càng phát triển, nhất là ở các thành phố lớn. Gần đây, ở nước ta việc sử dụng chó nghiệp vụ vào công tác an ninh quốc phòng đã và đang phát triển theo nhu cầu bảo vệ các xí nghiệp, cơ quan, cơ sở nông nghiệp, kho tàng và mục tiêu quân sự. Số người yêu thích chó nghiệp vụ và chó làm cảnh ngày một tăng. Vì vậy số lượng chó béc giê và các giống chó cảnh châu Âu trong các gia đình, nhất là ở thành phố lớn ngày càng tăng. Việc chăn nuôi chó nghiệp vụ tập trung ở các trường huấn luyện nghiệp vụ và chó cảnh trong các gia đình, trong những năm qua gặp rất nhiều khó khăn, khó khăn nhất là dịch bệnh làm chó chết. Vì vậy số lượng chó nghiệp vụ và chó cảnh tăng lên rất chậm. 5
  13. Đồ án tốt nghiệp Nước ta có 2 trung tâm chăn nuôi giống chó nghiệp vụ thuần là giống chó của Nga và Đức. Bên cạnh đó, có một số địa phương chú ý phát triển giống chó nghiệp vụ lai có chất lượng tốt. Ngày 19-01-2009, Bộ Nội vụ đã ban hành quyết định số 71 QĐ/BNV về việc thành lập Hiệp hội nuôi chó giống Việt Nam (Vietnam kennel Association-VKA). Về việc quản lý số lượng chó thì ở Việt Nam gần đây cũng đã đưa ra một quyết định, trong đó quy định chủ sở hữu chó phải đến UBND để đăng ký và được cấp số (Quyết định số 2891/QĐ-BNN-TY ngày 14/11/2012 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn về phê duyệt kế hoạch khống chế và loại trừ bệnh dại năm 2012) [32]. Tuy nhiên cũng như một số nước ở châu Á thì người dân vẫn có tâm lý rất thoải mái trong việc nuôi và sở hữu chó và thường không quan tấm tới các điều lệ về việc nuôi và sở hữu chó. 1.2. Tổng quan về bệnh ngoài da 1.2.1. Bệnh ngoài da trên chó Chó là vật nuôi rất gần gũi với con người và được cho là trung thành nhất với con người. Tuy nhiên nếu việc chăm sóc người bạn này không tốt thì chúng rất dễ mắc bệnh. Cũng giống con người, chó rất dễ mắc một số bệnh về đường tiêu hóa dẫn đến các triệu chứng như tiêu chảy, chán ăn, tụt cân. Chó cũng dễ mắc các bệnh về hô hấp với các triệu chứng tương tự con người như sổ mũi, nghẹt mũi khó thở. Và chó cũng thường xuyên mắc các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đế nội tạng như gan, phổi, tim hay các bệnh về xương khớp v.v . Trong các căn bệnh thường gặp ở chó có thể nói căn bệnh đáng lo ngại nhất đối với con người là các căn bệnh ngoài da ở chó. Vì con người thường xuyên gần gũi và tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với chó nên việc một con chó bị bệnh ngoài da là một điều đáng lo ngại vì tính chất lây lan của các căn bệnh đó. 6
  14. Đồ án tốt nghiệp Các bệnh ngoài da tuy ít ảnh hưởng đến tính mạng của chó nhưng chúng lại gây ra những tổn thương nghiêm trọng trên cơ thể chó và có nguy cơ ảnh hưởng đến con người. Các triệu chứng thường thấy cục bộ ở các vùng da như: rụng lông, đỏ tấy có chảy nước dịch hoặc dịch mủ màu vàng, da dầy hóa bì, loét sùi. Con vật khó chịu, ngứa ngáy hay gãi, kêu rên, thần kinh không ổn định, lở loét ở vùng cổ, chân, kẻ móng, mũi, mặt, tai. Có mùi hôi tanh khó chịu. 1.2.2. Bệnh ngoài da của người Là những bệnh thường gặp do nhiều tác nhân gây ra, bệnh thường chỉ gây thương tổn trên da và rất ít gây nguy hiểm đến tính mạng. Một số bệnh thường gặp là: ghẻ, nấm cạn, nhiễm trùng da thông thường, mụn trứng cá, chàm, vẩy nến, luput đỏ, bệnh lao da. 1.3. Các tác nhân gây bệnh 1.3.1. Vi khuẩn 1.3.1.1. Một số nhóm vi khuẩn gây bệnh ngoài da thường gặp Các tác nhân gây bệnh ngoài da trên chó thường thuộc các nhóm: Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus , Escherichia, Pseudomonas, Proteus. 1.3.1.2. Các biểu hiện do nhóm vi khuẩn gây ra Các nhóm vi khuẩn trên thường gây nên các triệu chứng về viêm bề mặt da của chó. Trong điều kiện bình thường da chó luôn có cơ chế để vô hiệu hóa các vi khuẩn cũng như các yêu tố vi sinh vật gây bệnh khác. Nhưng trong trường hợp da bị tổn thương do va chạm cơ học tạo chỗ hở trên bề mặt da làm thay đổi điều kiện sinh lý trên 7
  15. Đồ án tốt nghiệp bề mặt da, lúc đó các vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng xâm nhập, gây bệnh trên da chó và có một số biểu hiện của viêm da do vi khuẩn như sau: Viêm da mủ bề mặt: là những dấu hiệu trên bề mặt đặc trưng bởi vết loét và xói mòn, bao gồm viêm da ẩm cấp tính (viêm da chấn thương) và viêm da nếp gấp (hăm da). [33] Viêm da mủ cạn: bao gồm những phần trên bề mặt của nang lông và biểu bì kể cả bệnh chốc lở (viêm da mủ trên chó con) và viêm nang lông do vi khuẩn bề mặt (mụn mủ với phần lông lồi ra). [33] Viêm da mủ sâu: bao gồm những phần dưới của nang lông và chân bì kể cả viêm nang lông sâu, mụn nhọt và viêm mô tế bào, như viêm mủ mũi, mụn trên chó, viêm bì móng. [33] 1.3.1.3. Khả năng lây lan sang người Các loại vi khuẩn trên thường có khả năng lây lan từ chó sang người. Và một điều đáng quan tâm là những tổn thương do chúng gây ra khi lây lan sang người còn nguy hiểm hơn trên chó như staphylococcus aureus gây các bệnh mụn nhọt ngoài da, viêm phổi, áp xe phổi, nhiễm khuẩn huyết. Bệnh rất nặng, rất dễ gây tử vong. Các vi khuẩn như Proteus vulgaris có khả năng gây nên các bệnh trên đường tiểu như viêm cầu thận, sỏi thận cấp, viêm bàng quang , v.v 1.3.2. Nấm men 1.3.2.1. Các loài nấm men thường gây bệnh trên da chó Các loài nấm men Melasezia vàCandida là 2 loài được xác định thường xuyên nhất trong các trường hợp chó bị bệnh ngoài da. [2] 1.3.2.2. Các biểu hiện bệnh do nhóm nấm men gây ra 8
  16. Đồ án tốt nghiệp Bệnh biểu hiện đặc trưng bởi những vẩy trắng, hay màng giả trên niêm mạc miệng hay lưỡi, đôi khi lan cả đến môi, bệnh tích thường nổi lên với sự sung huyết ở xung quanh và bên ngoài còn ở dưới thì loét, những bệnh tích này có thể lan tràn đến hầu hoặc thực quản. 1.3.2.3. Khả năng lây lan sang người Loài nấm men Candida có thể lây lan sang người thông qua tiếp xúc gián tiếp hay trực tiếp. Khi lây sang người chúng có khả năng gây ra các tổn hại giống như ở chó. Ngoài ra chúng còn có khả năng gây tổn thương cho cơ quan sinh dục của người. Đặc biệt khi gây bệnh trên cơ thể người bị suy giảm miễn dịch (người bị nhiễm HIV, đang điều trị ung thư, cấy gép tủy) thì chúng trở thành nguyên nhân gây tử vong hàng đầu bởi những thương tổn lan toàn thân mà chúng gây ra. 1.3.3. Nấm sợi 1.3.3.1. Một số nhóm nấm mốc gây bệnh thường gặp. Các nhóm nấm mốc gây bệnh ngoài da thường được phân lập trên da và lông chó là: Aspergillus, Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton.[3] 1.3.3.2. Bệnh và các biểu hiện bệnh do các nhóm nấm mốc gây ra Chúng thường gây bệnh ở hốc mũi của chó. Chó bị nhiễm khi bị thương hoặc hít phải dị vật. Khi bị nhiễm nấm này sẽ sinh trưởng và sinh ra độc tố phá hủy lớp niêm mạc trong mũi, hình thành khối u sưng phòng, kèm theo các triệu chứng như viêm mũi, viêm xoang. Nếu bệnh kéo dài sẽ dẫn đến tử vong do gây tổn thương lên não [4]. Các nhóm nấm này gây rụng từng mảng lông, gãy sợi lông, nhất là vùng mặt, tai, ngứa ngáy 9
  17. Đồ án tốt nghiệp khó chịu, hay dùng móng gãi tai. Bệnh diễn biến chậm, lâu ngày gây viêm da bội nhiễm, viêm thận, nhiễm trùng máu và tử vong. 1.4. Tổng quan về nấm men Nấm men là vi sinh vật nhân thực, là một phần trong giới nấm với hơn 1500 loài đã được phát hiện. Tuy nhiên, theo ước tính thì con số đó chỉ chiếm 1% trong giới nấm đang tồn tại trên trái đất[5]. Đa số nấm men là đơn bào và một số loài còn có khả năng hình thành các chuỗi liên kết đa bào được gọi là khuẩn ty thật và khuẩn ty giả [6]. Nấm men có kích lớn hơn rất nhiều so sới các cộng đồng vi sinh khác. Nấm men có thể có lợi hoặc gây bệnh cho con người, chúng có mặt ở khắp mọi nơi và hiện diện nhiều nhất ở những nơi giàu nguồn đường như trái cây, một số loài còn được tìm thấy trong đất, trên cơ thể động vật, côn trùng. [7] 1.4.1. Hình thái của tế bào nấm men Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn. Kích thước khoảng từ 2.5µm-10µm, do đó có thể quan sát rõ được dưới kính hiển vi quang học. Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình tròn, hình ô van, hình elip, hình thoi, hình chai, hình quả lê Tuy nhiên hình dạng nấm men hầu như không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. Saccharomyces cerevisiace có hình bầu dục khi nuôi ở môi trường giàu dinh dưỡng, còn nuôi trong điều kiện yếm khí thì nó có hình tròn, và ngược lại khi nuôi trong môi trường có oxy thì tế bào có hình thon dài. 1.4.2. Dinh dưỡng và sinh trưởng của nấm men Nấm men là nhóm vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ. Chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như là nguồn năng lượng duy nhất và không cần ánh sáng để phát triển. Những loại đường mà nấm men dễ sử dụng nhất là các đường đơn như glucose, fructose, hoặc 10
  18. Đồ án tốt nghiệp các đường đôi như saccharose, maltose, một vài loài còn có khả năng sử dụng các đường pentose, rượu và các hợp chất acid hữu cơ. [8] Hô hấp nấm men là hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi. Không giống như vi khuẩn nấm men không thể phát triển trong môi trường kỵ khí bắt buộc [8]. Nấm men sinh trưởng tốt trong môi trường trung tính hoặc hơi chua. Một số chủng nấm men có thể sinh trưởng ở độ cồn lên đến 10-11%. Các loài nấm men khác nhau thì có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng khác nhau, có những loài có thể sống ở -2oC cũng có những loài có thể đạt ngưỡng 45oC. Chủng Leucosporidium frigidum phát triển ở -2 đến 20°C, Saccharomyces telluris ở 5- 35°C, và Candida slooffi tại 28-45°C [9]. Các tế bào có thể tồn tại trong điều kiện đông lạnh nhất định, với khả năng giảm theo thời gian. Trong phòng thí nghiệm nấm men được nuôi cấy và phát triển tốt trên các môi trường giàu nguồn đường như: Potato Dextrose Agar (PDA), Yeast Peptone Dextrose Agar(YPD), Sabouraud Agar 1.4.3. Sinh sản của nấm men Nấm men giống như tất cả các loại nấm, có thể sinh sản vô tính và hữu tính. Nhưng hình thức phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi [10]. Nhân của tế bào mẹ chia tách thành một nhân con (nhân hoàn chỉnh) và di chuyển đến tế bào con. Chồi tiếp tục phát triển cho đến khi nó tách ra từ tế bào mẹ, tạo thành một tế bào mới [11]. Các tế bào còn được tạo ra qua hình thức sinh sản này thường nhỏ hơn tế bào mẹ. Cũng có một số loài nấm men sinh sản bằng hình thức phân bào và tạo ra hai tế bào con gần bằng nhau về kích thước. [10] Trong điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng các tế bào đơn bội sẽ chết, tuy nhiên trong cùng điều kiện đó, các tế bào lưỡng bội có thể sống sót nhờ tiếp hợp với nhau (sinh sản hữu tính) tạo thành hợp tử và các hợp tử phân chia thành các bào tử nằm 11
  19. Đồ án tốt nghiệp trong nang sau đó sẽ được phát tán ra ngoài khi nang chín. Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao. 1.4.4. Nấm men gây bệnh Một số loài nấm men là tác nhân gây bệnh cơ hội có thể gây nhiễm trùng ở những người bị tổn thương hệ thống miễn dịch. Cryptococcus neoformans và Cryptococcus gattii là tác nhân gây bệnh quan trọng của suy giảm miễn dịch người. Chúng là nguyên nhân gây ra hơn 600.000 ca tử vong cho những người đang điều trị HIV/AIDS [12]. Các tế bào được bao quanh bởi các nang khuẩn polysaccharide giúp chúng tránh bị phát hiện và tấn công bởi các tế bào bạch cầu. [13] Các nấm men thuộc chi Candida là một nhóm các tác nhân gây bệnh cơ hội thường gây ra các tác động bệnh lý lên miệng hoặc cơ quan sinh dục. Candida được tìm thấy như một vi sinh vật hội sinh sống trong các vùng nhầy và ẩm ướt trên cơ thể người và động vật máu nóng. Khi xâm nhập vào niêm mạc các tế bào nấm men nảy mầm gây kích ứng và biến đổi các mô gây nên các triệu chứng bệnh lý. 1.5. Những nghiên cứu trên thế giới về nấm men gây bệnh Trong thế kỷ thứ năm trước Công nguyên, Hippocrates đã mô tả bệnh tưa miệng [14] và chính vì vậy ông được coi là người đầu tiên mô tả một triệu chứng nhiễm trùng nấm men. Đến năm 1839 nhờ sự xuất hiện của kính hiển vi và những nghiên cứu của Langenbeck và sau đó là Berg Gruby đã chứng minh Candida albicans là một tác nhân nấm men gây bệnh và ảnh hưởng đến tính mạng. Chúng là nấm men điểm hình được phân lập từ bệnh phẩm của những người bị bệnh. [15] Đến những năm 1960 với sự ra đời của các phương pháp điều trị ung thư, các biện pháp điều trị kháng sinh, đã vô tình làm bùng phát và tăng nguy cơ nhiễm trùng 12
  20. Đồ án tốt nghiệp nấm men nghiêm trọng. (Candida được chứng minh là ra các triệu chứng nhiểm trùng ở những người suy giảm miễn dịch). [16] Bảng 1.1 Phát hiện về nấm men gây bệnh từ năm 1989 đến 1993. Năm Các chủng phát hiện 1989 Malassezia vàTrichosporon là nấm bệnh cơ hội ngày càng được phát hiện nhiều hơn. [17] 1989 C. tropicalis, Malassezia spp, Hansenulaspp,T. beigelii. [18] 1989 Phổ của nấm men kết hợp với ung thư có nhiều sự thay đổi bao gồm T. beigelii, Saccharomyces spp, Torulopsis pintolopesii, Pichiafarinosa, và Rhodotorula spp. [19] 1992 Các báo cáo về Saccharomyce,Hansenula, Rhodotorula và Malassezia spp. Và C. glabrata. [20] 1993 Kết quả theo dõi từ năm 1980-1990 số ca nhiễm nấm C. albicans tăng từ (52%-60%), các loài khác giảm (21%-16%). [21] 1993 So sánh kết quả phân lập 15 tháng (1991-1992) với cùng kỳ (1987-1988) C. glabrata tăng gấp đôi, C. krusei tăng nhẹ; Tỷ lệ C. guilliermondii, C. lipolytica, và C. kefyrtăng. [22] 1.6. Định danh nấm men Có hai phương pháp để định danh nấm men là phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử. Hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất là sử dụng sinh học phân tử vì những ưu điểm như nhanh chóng, chính xác và hiệu quả cao. 13
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.6.1. Định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống 1.6.1.1. Quan sát các đặc điểm hình thái Tuy nấm men có kích thước lớn hơn vi khuẩn rất nhiều nhưng vẫn rất nhỏ so với khả năng quan sát của con người, việc quan sát nấm men phải được thực hiện bằng kính hiển vi ở độ phóng đại từ vài trăm đến 1000 lần. Các đặc điểm cần chú ý khi quan sát hình thái nấm men gồm: quan sát tế bào, quan sát các dạng bào tử, quan sát khuẩn ty thật, khuẩn ty giả, quan sát nhân tế bào. 1.6.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh lí, sinh thái Để có thể định danh nấm men bằng phương pháp truyền thống người ta phải tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và sinh lý rất phức tạp và tốn thời gian: - Lên men 13 loại đường. - Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio Mérieux SA, Marchy-l’Étoile ) - Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit ID 32C). - Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine. - Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid. - Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, 35oC, 37oC và 42oC. 14
  22. Đồ án tốt nghiệp - Tạo thành tinh bột. - Sản sinh acid từ glucose. - Thủy phân Urê. - Phân giải Arbutin. - Phân giải lipid. - Năng lực sản sinh sắc tố. - Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza. - Hóa lỏng gelatin. -Phản ứng với Diazonium Blue B. - Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%. 1.6.2. Định danh nấm men bằng sinh học phân tử Định danh nấm men bằng sinh học phân tử chủ yếu dựa trên sự phát triển của những kỹ thuật gen hiện đại và có độ chính xác cao. Đó là những kỹ thuật hiện đại có sự kết hợp của nhiều ngành khoa học như sinh học, hóa học, tin học và cơ khí tự động. Để định danh một loài nào đó thì người ta phải tiến hành các phản ứng như PCR và kỹ thuật giải trình tự, sau đó xử lý số liệu với ngân hàng gen. 1.6.2.1 Đoạn gen rDNA Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là 15
  23. Đồ án tốt nghiệp một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật. [23] Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA . [24] Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.[25] ❖ Primer Các primer vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5.8S và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Primer ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8 S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe và S. cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28S của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 có trình tự giống với rDNA 18 S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25bp. [24] 16
  24. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Internal transcribed spacer region (ITS region, including the 5.8S gene) ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG 1773-1791 White et al. 1990 G (18S) ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA 1735-1756 Gardes & Bruns GTA A (18S) 1993 ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT 53-34 White et al. 1990 GC ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA 34-53 White et al. 1990 GC ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT 57-38 (25S) White et al. 1990 GC ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG 194-172 (25S) Gardes & Bruns TCC AG 1993 ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC 1749-1770 White et al. 1990 AAG G (18S) 5.8S CGC TGC GTT CTT CAT CG 54-38 Vilgalys lab 5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GCG 37-54 Vilgalys lab Hình 1.1 Bảng đồ primer ITS Chỉ định dùng cho PCR: ITS1 hoặc ITS5, ITS1-F và ITS4 hoặc LR15, ITS4-B 1.6.2.2. Nhân gen và Kỹ thuật giải trình tự trong định danh loài ❖ Nhân gen (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật lai DNA đã được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu xác định typ của nhiều đối tượng vi sinh vật. Nguồn DNA đích đôi khi chỉ có số lượng ít trừ khi tiến hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong một số trường hợp việc nuôi cấy không thể thực hiện 17
  25. Đồ án tốt nghiệp được với nhiều loài vi sinh vật hay virút hoặc trong các trường hợp khác cần thời gian dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ DNA cho các kỹ thuật lai hay định typ. Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm tăng nguồn DNA đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân gene PCR. [30] Việc nhân DNA cho phép làm tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc nhiều hơn nữa đối với đoạn DNA hay ARN nghiên cứu. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn DNA khuyếch đại theo cách này. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR. Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu. Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của sản phẩm PCR. Việc xác định được sai khác của chuỗi DNA sẽ cho phép xác định và định typ chính xác nhất các đối tượng vi sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác định trình tự DNA còn cho phép xác định mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ học của các chủng vi sinh vật. [30] ❖ Kỹ thuật giải trình tự Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gen nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gen bảo tồn được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau. [30] 18
  26. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu và thiết bị Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm trường đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới 2.1.1. Dụng cụ Ống nghiệm Que cấy Đĩa petri Cân phân tích Becher Máy chụp hình Pipet, Pipetman, Đầu tip Ống đong Erlen Tăm bông dài Lame, Lamelle Eppendorf 2.1.2. Thiết bị Kính hiển vi Nikon eclipse 80i Bộ nguồn điện di EC105 Tủ lạnh, Tủ lạnh -20oc Bể điện di IBI QS- 710 Máy vortex Hộp đèn soi UV Uvintec, BioRad UV CCD Camera Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Lò viba Nồi hấp khử trùng Máy PCR sprint thermo Cycler 2.1.3. Vật liệu 2.1.3.1. Nguồn phân lập 19
  27. Đồ án tốt nghiệp Các chủng nấm men được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu nhận từ các phòng khám thú y trên địa bàn thành phố: Quận 9, Quận 2, Quận Bình Thạnh, Quận Thủ Đức 2.1.3.2. Hóa chất Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 20% Dextrose 2% Agar 2% pH 5.6 H2O 1000ml Dầu soi kính ❖ Các hóa chất định danh: Lysis (100mM tris-pH 8.0, 30mM EDTA-pH 8.0, 0.5%SDS) Potassium acetate pH 7.5 CHCl3_Isoamyl alchol (24:1) Isopropanol Etanol 70%, Etanol 99% 6X LB Double dye TAE 1X Agarose 20
  28. Đồ án tốt nghiệp Ethidium bromide ❖ Các hóa chất PCR Nước khử ion Master Mix : 2x My taq Mix Mồi xuôi ITS1 :TCCGTAGGTGAACCTGCGG Mồi ngược ITS4 :TCCTCCGCTTATTGATATGC Thang DNA 1kb 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập nấm men gây bệnh Vì yêu cầu phải phân lập nấm men gây bệnh ngoài da trên chó nên các mẫu nấm men sẽ được thu thập và phân lập từ các mẫu bệnh phẩm trên da chó. Có nhiều phương pháp phân lập nấm men trong đó người ta có thể dùng các chất chống mốc cũng như kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm mốc và chỉ thu nhận nấm men. Tuy nhiên, khi sử dụng các chất này cần lưu ý đến liều lượng vì nó có khả năng ức chế cả nấm men phát triển. Khi thực hiện đề tài này vì đảm bảo tính liên tục và các hướng khác của đề tài nên những mẫu vi khuẩn và nấm sợi cũng sẽ được lưu trữ để phục vụ công tác nghiên cứu sau này nên không sử dụng các chất ức chế trên. Môi trường được sử dụng để phân lập là PDA. Các bước phân lập nấm men ❖ Chuẩn bị dụng cụ môi trường ✓ Chuẩn bị môi trường ✓ Chuẩn bị tăm bông trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 21
  29. Đồ án tốt nghiệp ✓ Chuẩn bị đĩa petri và ống nghiệm thạch nghiên ✓ Chuẩn bị kéo, kẹp vô trùng Các dụng cụ trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. ❖ Phân lập Mẫu sau khi thu về sẽ được cấy trải đều bằng tăm bông lên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị trước, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày. ❖ Làm thuần ✓ Sau 2 ngày ủ dùng que cấy, thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc riêng lẻ có đặc trưng khác với các khuẩn lạc còn lại ria trên đĩa petri khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn dòng. ✓ Lặp lại việc tách dòng nhiều lần để có được giống thuần. ✓ Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiên trong ngăn mát tủ lạnh. 2.2.2. Quan sát hình thái nấm men Vì trong khóa luận này sử dụng phương pháp sinh học phân tử để định danh nấm men, nên việc quan sát hình thái nấm men đóng vai trò phân loại nấm men với vi khuẩn và nấm sợi. 2.2.2.1. Quan sát tế bào nấm men Tế bào nấm men có rất nhiều hình dạng giống như vi khuẩn song kích thước lại lớn hơn rất nhiều so với vi khuẩn, nên ta dễ dàng phân loại được nấm men và vi khuẩn qua kính hiển vi. Cách tiến hành 22
  30. Đồ án tốt nghiệp ✓ Nuôi tế bào nấm men trong môi trường khoai tây lỏng ở nhiệt độ phòng từ 1-2 ngày. ✓ Làm tiêu bản sống và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. ✓ Ta cũng có thể làm tiêu bản nhuộm đơn bằng Fuchsin để quan sát tế bào nấm men rõ hơn. ✓ Thu nhận những mẫu tế bào có kích thước lớn, to tròn, hoặc thon dài. 2.2.2.2. Quan sát khuẩn ty thật khuẩn ty giả Ở một số loài nấm men, chồi trưởng thành không tách ra khỏi tế bào mẹ mà tạo thành một chuỗi tế bào được gọi là khuẩn ty giả. Cấu tạo của khuẩn ty giả rất đơn giản, bao gồm các tế bào có kích thước và hình dạng tương tự nhau hay chúng chỉ khác nhau do sự kéo dài của tế bào. Tế bào cuối cùng luôn ngắn hơn tế bào kế nó. Khuẩn ty thật thì có thể thấy rõ các vách ngăn giữa các tế bào, còn khuẩn ty giả thì không. Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng. Vì vậy ta sử dụng phương pháp phòng ẩm để nuôi tế bào nấm men. Cách tiến hành: ✓ Trước hết ta chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và hai thanh đũa xếp hình chử “v” bên trên. Đem hấp khử trùng cùng với một ống môi trường PDA và một bình nước cất. ✓ Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng khoảng 2/3 lame để môi trường đông tự nhiên. ✓ Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm men theo dấu “#” rồi đậy lamelle lại. ✓ Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm điều giấy thấm. ✓ Đậy nắm đĩa lại và gói đĩa cẩn thận và ủ ở nhiệt độ phòng trong một tuần. 23
  31. Đồ án tốt nghiệp ✓ Quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X. 2.2.3. Sử dụng sinh học phân tử định danh nấm men 2.2.3.1. Tách chiết DNA Trước khi PCR ta phải tiến hành giải phóng và tinh sạch DNA nấm men khỏi tế bào để có mẫu DNA trần và hàm lượng cao. Các bước tiến hành ✓ Lấy một ít sinh khối nấm men từ khuẩn lạc nấm men nuôi cấy trên đĩa petri hòa vào 200µl dung dịch lysis buffer chứa trong eppendorf 1.5ml, sau đó vortex nhẹ. ✓ Đun trên nước sôi 15 phút. ✓ Thêm vào 200µl dung dịch potassium acetate 2.5 M, pH7.5, sau đó cho vào ngăn đá tủ lạnh trong 1 giờ. ✓ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút tại 4oC, sau đó thu dịch nổi. ✓ Thêm một thể tích CHCl3-isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích phần dịch nổi thu được sau đó đem ly tâm như trên và thu dịch nổi bên trên màng phân cắt. ✓ Có thể lặp lại bước trên để tăng độ tinh sạch. ✓ Thêm vào một thể tích isopropanol lạnh tương đương thể tích dịch nổi thu được ở bước trên và để vào tủ lạnh -20oC trong 20 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút 4oC, và thu hồi tủa. ✓ Rửa tủa DNA với 100µl etanol 70%và 200µl etanol 99% lắc nhẹ rồi đem ly tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, 4oC. ✓ Bỏ phần dịch và để khô tủa tự nhiên. ✓ Hòa tan tủa trong 35-50µl nước cất tinh khiết hoặc TE buffer bảo quản -20oC. 2.2.3.2. Điện di 24
  32. Đồ án tốt nghiệp Điện di là một bước quan trọng nhằm kiểm tra kết quả ly trích DNA dựa trên sự di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường trong nền agarose. Cách tiến hành ✓ Chuẩn bị bảng gel agarose 1% (pha 1mg agarose và định mức 100ml TAE X1 buffer, đun tan). ✓ Chuẩn bị bể điện di chứa đây đệm TAE X1 sao cho bảng gel chìm hẳn trong đệm. ✓ Hút 5µl dịch DNA trộn vào 3µl Double dye. ✓ Nạp mẫu vào các giếng và mở nguồn chạy với hiệu điện thế 110V trong 45 phút. ✓ Cho bảng gel vào dung dịch Ethidium Bromide nhuộm trong 20 phút. Quan sát bằng buồn uv. 2.2.3.3. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR do Karl Mullis và công sự phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen. [31] Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm men. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương 25
  33. Đồ án tốt nghiệp pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose. ❖ Các thành phần của phản ứng PCR. ✓ DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại. ✓ Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’ và 3’ của vùng DNA cần được khuếch đại. ✓ DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70OC) dùng để tổng hợp đoạn DNA của vùng cần khuếch đại. ✓ Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng hợp DNA. ✓ Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và bến vững của polymerase. ✓ Cation hóa trị 2 (Mg2+ hay Mn2+): thông thường Mg2+ được sử dụng, nhưng Mn2+ có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên, nồng độ Mn2+ cao gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA. ✓ Cation hóa trị 1: K+.[34] Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ Thermus acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase [35]. Taq polymerase hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm của Taq polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA dẫn đến những đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Một số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ Archaea có cơ chế đọc và sửa 26
  34. Đồ án tốt nghiệp sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần lớn những đột biến xảy ra trong quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme này có hoạt tính tổng hợp DNA thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự tổng hợp DNA. ❖ Chu trình phản ứng Thông thường, PCR kéo dài 20- 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao gồm 3 bước: ✓ Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến nhiệt độ 94-96oC, nhiệt độ này được giữ 1-9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục tiêu và mồi bị biến tính [36] , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn. Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94-980C khoảng 20-30 giây. ✓ Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20-40 giây. ✓ Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70-74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC. Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử 27
  35. Đồ án tốt nghiệp dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5-15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn. Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR. Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312nm). Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase Vì vậy, cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả. ❖ Trong khóa luận này PCR dùng để khuếch đại đoạn gen ITS rDNA của nấm men. Thành phần phản ứng Mater mix 6.5µl ITS1-F 0.1µl ITS4-R 0.1µl DNA 1µl H2O 17.3µl Tổng 25 µl ❖ Chu trình phản ứng PCR Bước 1: Biến tính DNA, 94oC trong 5 phút Bước 2: 35 chu kỳ 94oC trong 1 phút 55oC trong 1 phút 28
  36. Đồ án tốt nghiệp 72oC trong 2 phút Bước 3: Kết thúc, 72oC trong 10 phút Bước 4: Bảo quản 4oC ❖ Kiểm tra kết quả PCR Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR, các bước thực hiện giống bước 2.2.3.2 trên nhưng bổ sung thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích thước từ 500bp- 10000bp. 2.2.3.4. Giải trình tự và định danh mẫu nấm men Giải trình tự gen là sự xác định rõ trình tự của các base trong DNA. Tuy nhiên không phải tất cả những chuỗi DNA đều là gen (vùng mã hóa), điều này phụ thuộc vào sinh vật lấy mẫu và nguồn DNA mẫu như: trình tự khởi đầu, các trình tự lặp lại, các intron. Hai phương pháp cơ bản để giải trình tự DNA. [30] ✓ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp thủy phân hóa học dùng đoạn DNA mạch đôi): sử dụng các loại hóa chất để cắt DNA tại các vị trí xác định tạo ra một bộ các đoạn chỉ khác nhau bởi một nucleotide. ✓ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp này dùng đoạn DNA mạch đơn): dùng enzyme để tổng hợp các đoạn DNA có một đầu mang một nucleotide biến đổi. Việc phân tích các đoạn này được tiến hành giống nhau trong cả hai phương pháp, gồm điện di trên gel và đọc kết quả trên bản phóng xạ tự ghi. Ngày nay, phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson là phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn. Một vài sự thay đổi đã được phát triển và nó đã được tự động hóa cho sự giải trình tự nhiều đoạn gen có kích thước lớn. ❖ Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp hóa học) 29
  37. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp tự phân hóa học dùng mẫu DNA mạch đôi vì thế không yêu cầu tạo dòng DNA trong Phage M13 để tạo ra mạch DNA đơn như là trong phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Trước hết các phân tử DNA được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó chúng được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử DNA ngay tại nucleotide. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết quả của các xử lí hóa học là hình thành năm tập hợp oligonucleotide, các oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt cùng một loạinucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn trên được đem phân tích trên gel polyacrylamide. Vị trí các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện bằng đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ ghi. ❖ Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp enzyme) [30] Phương pháp này được dựa trên sự làm gián đoạn tổng hợp enzyme polymerase do các nucleotide tương đồng của đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Một hỗn hợp các đoạn DNA có chiều dài khác nhau được tạo ra phụ thuộc vào nơi mà chúng bị cắt. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide trong đó nhóm 3’OH được thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester và do đó làm ngưng quá trình tổng hợp. Trình tự DNA cần xác định phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn (phage M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I, Taq polymerase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ (32P). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn 30
  38. Đồ án tốt nghiệp phân đoạn riêng. Người ta cho vào lần lượt bốn phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất nhỏ. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại. Tính xác xuất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau tương ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên trình tự DNA. Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được phân tích trên gel Polyacrylamide và kết quả được đọc trên bản phóng xạ điện di. ❖ Giải trình tự những đoạn DNA lớn [30] Cả hai phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert và Sanger-Coulson chỉ có thể giải trình tự cho đoạn trình tự khoảng 400 base một lần. Tuy nhiên, hầu hết những đoạn gen đều có kích thước lớn hơn. Để giải trình tự những đoạn DNA lớn này, nó được cắt (dùng hai hay nhiều enzyme cắt giới hạn) thành những đoạn khác nhau và mỗi đoạn được giải trình tự một cách riêng rẽ bao gồm những trình tự gối đầu lên nhau (mà thường được xác định bởi máy tính). Trình tự đầy đủ của đoạn gen sau đó sẽ được xác định. ❖ Các phương pháp cải biên từ phương phápSanger-Coulson [30] Trong thực nghiệm, việc sử dụng các phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức tạp vì phải tạo dòng lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào vector mạch đơn (phage M13). Do đó để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng các vector là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên đoạn DNA được tạo dòng các plasmid riêng biệt, mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp xảy ra theo nguyên tắc đã nêu ở phần trên. 31
  39. Đồ án tốt nghiệp Vì điều kiện trang thiết bị không cho phép nên các sản phẩm PCR sẽ được gửi đi giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa. Địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam. Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài. BioEdit 7.2.5.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen 32
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả hình thái học nấm men 3.1.1 Kết quả khuẩn lạc Bảng 3.1 Hình ảnh kết quả hình thái khuẩn lạc Mẫu Giống chó Vị trí nhiễm Khuẩn lạc M9-1 M9-5 M11-1 M23-2 33
  41. Đồ án tốt nghiệp ✓ Mẫu nấm men M9-1 và M9-5 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 9 thu được tại phòng khám thú y ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống Rock được nuôi trong nhà. Vị trí bị nhiễm là vùng đầu với triệu chứng lâm sàng là rụng lông, da sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc cho thấy mẫu nấm men M9-1 có màu đỏ đặc trưng, khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn bóng. Còn mẫu nấm men M9-5 cùng được phân lập từ mẫu bệnh phẩm trên nhưng có khuẩn lạc màu trắng, hình tròn, bề mặt nhăn nheo, có rìa sợi tơ xung quanh. ✓ Mẫu nấm men M11-1 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 11 thu nhận được tại phòng khám ở quận Thủ Đức. Giống chó bị nhiễm là giống chó xù Bắc Hà được nuôi thả tự do. Vị trí bị nhiễm là hai chân với các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng là rụng lông, loét, ửng đỏ. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu nấm men M11-1 có màu trắng kem, hình tròn, bề mặt trơn bóng. ✓ Mẫu nấm men M23-2 được phân lập từ mẫu bệnh phẩm thứ 23 thu nhận được tại phòng khám ở quận Bình Thạnh. Giống chó bị nhiễm là giống Pug được nuôi trong nhà. Vị trí bị nhiễm là chân với các triệu chứng lâm sàng là rụng lông, chai sần. Kết quả quan sát khuẩn lạc của mẫu nấm men M23-2 có màu trắng, tròn, bề mặt trơn. 3.1.2. Kết quả hình ảnh tế bào sinh dưỡng Bảng 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng M9-1 M9-5 M11-1 M23-2 34
  42. Đồ án tốt nghiệp Kết quả quan sát tế bào sinh dưỡng của nấm men bằng phương pháp nhuộm sống cho kết quả như sau. Mẫu nấm men M9-1 có tế bào hình tròn, mẫu M9-5 cũng có tế bào hình tròn, mẫu M11-1 có tế bào hình elip mẫu M23-2 có tế bào hình elip thon dài. 3.1.3. Kết quả quan sát tế bào sinh sản Bảng 3.3 Hình ảnh tế bào sinh sản của nấm men. M9-1 M9-5 M11-1 M23-2 Dựa trên hình ảnh quan sát thì các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1, M23-2 đều có khả năng sinh sản bằng hình thức nảy chồi. 3.1.4. Kết quả quan sát khuẩn ty Bảng 3.4 Hình ảnh quan sát khuẩn ty M9-1 M9-5 M11-1 M23-2 35
  43. Đồ án tốt nghiệp Kết quả quan sát sự hình thành khuẩn ty cho thấy cả 4 mẫu nấm men phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm gồm M9-1, M9-5, M11-1, và M23-2 điều có thể quan sát rõ sự hình thành khuẩn ty. 3.2. Kết quả li trích, thu nhận và nhân bản đoạn gen ITS rDNA của nấm men 3.2.1. Kết quả ly trích và thu nhận bộ gen của nấm men M23-2 M11-1 M9-5 M9-1 Hình 3.1 Kết quả kiểm tra ly trích bộ gen của 4 mẫu nấm men Kết quả ly trích bộ gen của nấm men cho thấy cả 4 mẫu nấm men điều cho kết quả tốt để dùng cho phản ứng PCR. 3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men Trước khi giải trình tự đoạn gen ITS rDNA của các mẫu nấm men phân lập được thì sản phẩm ly trích bộ gen của các mẫu nấm men trên được sẽ được chạy phản ứng PCR với cặp mồi ITS1-F và ITS4-R nhằm nhân bản đoạn gen ITS rDNA. Đoạn gen ITS rDNA có kích thước từ 500-600 bp. Sau khi PCR thì sản phẩm thu được được thể hiện trên 2 bảng gel ở hình 3.2 và 3.3 36
  44. Đồ án tốt nghiệp M9-5 M23-2 M9-1 M11-1 Thang Mẫu M23-2 ở các thể tích khác nhau Hình 3.2 Kết quả sản phẩm PCR Hình 3.3 Kết quả sản phẩm PCR M23-2 Hình 3.2 cho thấy các giếng M9-5, M9-1, M11-1 đều có các vạch nằm tương đương ở vị trí khoảng 500-600 bp. Riêng mẫu M23-2 không có vạch xuất hiện và được chạy PCR lại với các thể tích tham gia phản ứng khác nhau và cũng cho kết quả tốt để giải trình tự. Sản phẩm PCR sẽ được gửi đi công ty Nam Khoa để giải trình tự. 3.3. Kết quả so sánh vùng gen bảo tồn ITS rDNA của nấm men trên ngân hàng gen NCBI và thiết lập cây phân loài 3.3.1. Kết quả Giải trình tự vùng gen ITS rDNA của 4 mẫu nấm men Mẫu M9-1: TCTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAAACGGATTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGA ATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACT CTCGCAAGAGAGCGAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATAA AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGA GTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTT ACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCG CTGAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTTA AGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA 37
  45. Đồ án tốt nghiệp Mẫu M9-5: CTTGGTCAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACGCAAGTCGAGTATTTT TACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCG CATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCAGCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTC CTAATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTTTGACATTAATGT CTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTAATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGAC TCTGGCCTAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGTCGGAGGAAA Mẫu M11-1: AAATTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACAGTATTCTTTT GCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGC CTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTA ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT ATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGC CTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTG CTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTT GAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCA GGTAGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA Mẫu M23-2: TCTTCATCCACCTCGTGCTCATGGTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACAAGG GGAAGGATCATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAGTCGTAA TGACCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATT TTTACAGAAATAAAATGAACAACTTTCTTCAAGATATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCTGCTCCGAGAAGAAA GCAGGGAAAACGCAAATAAAATTTGCCCCGCAGATTTTACGAATCATGGAAGATTCATCGTAGCCGGCGCCCT CTGGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGTAATGAGGGATAGT CTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCCGAAAAGTATCGGCGACGTTAGTTTTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGT ATTAGGTTTATCCAATTCGGGTATGGCATGACGTGGAAGTGATGGTAACGATGAGTTCGTCGATTCATCATCAT TCACATTAAGACCTCAACTTGAGCATCAGATTCCTTTTTCACTTAATCTTAACATTACACTGAGGAAATGAATGA ATAGTGCTCTTTTTGCTTCCATGAACTTGCACTTGAGCTGAAGTT 38
  46. Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA trên ngân hàng gen NCBI và xây dựng cây phân loài Hình 3.4 Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự vùng gen ITS rDNA của các chủng nấm men phân lập (M9-1, M9-5, M11-1, M23-2) và các loài nấm men trong ngân hàng gen Dựa trên kết quả so sánh trình tự DNA với ngân hàng gen (các kết quả so sánh được thể hiện trong phụ lục) và các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào ta được các kết quả sau: 39
  47. Đồ án tốt nghiệp Mẫu M9-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Rhodotorula mucilaginosa JX174412.1 với mức độ gen tương đồng là 100%. ✓ Các nghiên cứu về nấm men Rhodotorula mucilaginosa Nấm men Rhodotorula mucilaginosa (tên cũ Rhodotorula rubra). ❖ Một số đặc điểm khuẩn lạc, tế bào Là một nấm men mà khuẩn lạc có màu đỏ, hồng hoặc cam. Màu sắc đặc biệt này là do các sắc tố của nấm men tạo ra nhằm ngăn cản một vài bước sóng nhất định có khả năng gây tổn hại cho tế bào. Hình thái dưới kính hiển vi là hình cầu nảy chồi. Kích thước tế bào 2,5 µ-6,5 µ x 6,5 µ-14,0 µ. [26] ❖ Khả năng gây bệnh Nhiễm trùng huyết, viêm nội nhãn, nhiễm trùng ống thông, viêm phúc mạc, viêm màng não chủ yếu ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Sản xuất một số chất gây dị ứng và có khả năng liên quan đến bệnh dị ứng. [26] Dựa trên kết quả so sánh trình tự gen và so sánh đặc điểm hình thái thì mẫu M9-1 chính là loài Rhodotorula mucilaginosa. Và dựa trên các nghiên cứu lâm sàng về khả năng gây bệnh của chủng trên thì Rhodotorula mucilaginosa là loài nấm men nguy hiểm có thể gây nên các bệnh nghiêm trọng khi bị nhiễm sang người. Mẫu M9-5 có mối quan hệ gần nhất với loài Trichosporon asahii AB369919.1 với mức độ gen tương đồng là 99%, hay Malassezia globosa JQ088275.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. ✓ Các nghiên cứu về nấm men Trichosporon asahii Nấm men Trichosporon asahii (tên củ là Trichosporon beigelii). ❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào 40
  48. Đồ án tốt nghiệp Nấm men Trichosporon asahii có khuẩn lạc màu trắng hơi vàng, bề mặt nhăn, có rìa sợi nấm bao quanh. Tế bào hình bầu dục nảy chồi kích thước 3,5µm-7µm x 3,5µm14µm. [28] ❖ Khả năng gây bệnh Nấm men Trichosporon beigelii là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật da bình thường, và được phân phối rộng rãi trong tự nhiên. T.beigelii thường xuyên tham gia trong một loạt các nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Nhiễm trùng phổ biến thường xuyên nhất liên quan đến bệnh bạch cầu, cấy ghép nội tạng, đa u tủy, thiếu máu bất sản, ung thư và AIDS. Sự nhiễm trùng thường được lan ra và phổ biến rộng rãi, với các tổn thương xảy ra trong gan, lá lách, phổi và đường tiêu hóa. [29] Mẫu M11-1 có mối quan hệ gần nhất với loài Meyerozyma guilliermondii KC119207.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Và mẫu M23-2 có mối quan hệ gần nhất với Pichia guilliermondii DQ249193.1 với mức tương đồng 79%. ✓ Các nghiên cứu về Meyerozyma guilliermondii Nấm men Meyerozyma guilliermondii còn có tên gọi khác Candida guilliermondii hay Pichia guilliermondii. ❖ Một số đặc điểm về khuẩn lạc, tế bào Khuẩn lạc Pichia guilliermondii có màu trắng đến vàng kem, mịn, hình tròn, bề mặt trơn nhẵn. Tế bào hình cầu, nảy chồi và có khả năng hình thành khuẩn ty. Kích thước tế bào 2,0µm -4,0 µm x 3,0 µm -6,5 µm. ❖ Khả năng gây bệnh Candida guilliermondii đã được phân lập từ nhiều ca nhiễm bệnh, chủ yếu là da. Nhưng rất hiếm khi được phát hiện trên các ca viêm da toàn thân. Tuy nhiên, các 41
  49. Đồ án tốt nghiệp nghiên cứu phát hiện rằng Candida guilliermondii có khả năng kháng lại các thuốc kháng nấm. [30] Dựa trên các kết quả phân lập, quan sát hình thái, định danh và những thông tin về các loài nấm men có mối quan hệ gần nhất với các mẫu nấm men M9-1, M9-5, M11-1, M23-2 có thể đưa ra nhận định là cả 4 mẫu nấm men phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm bệnh ngoài da trên chó đều có mối quan hệ tương đồng và gần gũi với những loài nấm men có khả năng gây bệnh trên da động vật và con người. 42
  50. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi tiến hành phân lập và định danh vùng gen ITS của 4 mẫu nấm men nhiễm bệnh da trên chó nuôi ở thành phố Hồ Chí Minh đã cho một số kết luận sau. Mẫu M9-1 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài Rhodotorula mucilaginosa với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 100%. Mẫu M9-5 được phân lập từ giống chó Rock nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài Trichosporon asahii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 99%. Mẫu M11-1 được phân lập từ giống chó xù Bắc Hà nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài Meyerozyma guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 99%. Mẫu M23-2 được phân lập từ giống chó Pug nuôi tại quận Thủ Đức có khả năng là loài Pichia guilliermondii với mức tương đồng của vùng gen ITS rDNA là 79%. Dựa trên các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới thì cả 4 chủng nấm men trên điều có khả năng gây bệnh cho người và chó với mức độ khác nhau, đặc biệt là với những người bị suy giảm miễn dịch. Trong đó, loài Meyerozyma guilliermondii tuy rất hiếm khi được phát hiện trong các ca viêm da toàn thân nhưng lại có khả năng kháng thuốc kháng nấm. Các chủng còn lại điều được phát hiện là tác nhân gây nên những thương tổn nặng nề không chỉ trên da mà còn ở các cơ quan nội tạng khác. 4.2. Đề nghị Qua quá trình nghiên cứu và tìm hiểu các thông tin từ các nghiên cứu trên thế giới về các loài nấm men đã định danh được thì các nấm men gây bệnh trên chó có thể lây lan sang người. Đặc biệt là với những người suy giảm miễn dịch. Vì vậy đối với những người đang điều trị ung thư, bị nhiễm HIV hoặc những căn bệnh có liên quan đến hệ 43
  51. Đồ án tốt nghiệp miễn dịch làm suy giảm miễn dịch thì không nên tiếp xúc với chó hay các vật nuôi khác. Do thời gian và điều kiện thực hiện bài luận văn có hạn nên có nhiều phần không thể thực hiện nên chúng tôi có một số đề nghị: ✓ Khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng nấm men phân lập được. ✓ Khảo sát sự nhạy cảm của các chủng đối với các thuốc kháng nấm. 44
  52. Đồ án tốt nghiệp Tài liệu tham khảo ❖ Tài liệu tiếng Việt [3] Lý Thị Liên Khai và Huỳnh Trần Phúc Hậu. Khảo sát sự lưu hành của một số nấm gây bệnh trên da, lông chó tại tỉnh Sóc Trăng và thử nghiệm thuốc điều trị. Trường Đại học Cần Thơ. Tạp chí Khoa học 2012:22c 47-56. [6] Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương. Nấm Men 11/07/2006. ❖ Tài liệu tiếng Anh [1] The world wide population of dogs is astonishingly large.Published on September 19, 2012 by Stanley Coren, Ph.D., F.R.S.C. in Canine Corner. [2] Ernest E. Ward, Jr., DVM. 2014. What causes “seborrhea” (dog dandruff and cat dandruff)?. [4] Walker K, Skelton H, Smith K. (2002). "Cutaneous lesions showing giant yeast forms of Blastomyces dermatitidis". Journal of Cutaneous Pathology (10): 616–618. [5] Kurtzman CP, Fell JW. (2006). "Yeast Systematics and Phylogeny—Implications of Molecular Identification Methods for Studies in Ecology". Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, The Yeast Handbook. [7] Suh SO, McHugh JV, Pollock DD, Blackwell M. (2005)."The beetle gut: a hyperdiverse source of novel yeasts". Mycological Research 109 (3): 261–265. [8] Barnett JA. (1975). "The entry of D-ribose into some yeasts of the genus Pichia". Journal of General Microbiology 90 (1): 1–12. [9] Arthur H, Watson K. (1976). "Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and thermophilic yeasts". Journal of Bacteriology 128: 56–68. 45
  53. Đồ án tốt nghiệp [10] Balasubramanian MK, Bi E, Glotzer M. (2004). "Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells". Current Biology 14: R806–818. [11] Yeong FM. (2005). "Severing all ties between mother and daughter: cell separation in budding yeast". Molecular Microbiology 55 (5): 1325–1331. [12] Cogliati M. (2013). "Global molecular epidemiology ofCryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii: An atlas of the molecular types". Scientifica 2013: 675213. [13] O' Meara TR, Alspaugh JA. (2012). "The Cryptococcus neoformans capsule: A sword and a shield". Clinical Microbiology Reviews 25 (3): 387–408. [14] Ainsworth, G. C. 1986. History of medical and veterinary mycology, p.43–47. Cambridge University Press, Cambridge. [15] G. C. Ainsworth, History of medical and veterinary mycology, p. 1986. 43–47. Cambridge University Press, Cambridge. [16] M.G. Rinaldi,BiologyandpathogenicityofCandidaspecies,p.1–20. In G. P. Bodey (ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New York.1993. [17] Rinaldi,M.G.1993.Biology and pathogeni city of Candida species, p.1–20.In G. P. Bodey (ed.), Candidiasis: pathogenesis, diagnosis and treatment. Raven Press, New York. [18] Anaissie, E., and G. P. Bodey. 1989. Nosocomial fungal infections: old problems and new challenges. Infect. Dis. Clin. North Am. 3:867–882. 46
  54. Đồ án tốt nghiệp [19] Anaissie, E., G. P. Bodey, H. Kantarjian, J. Ro, S. E. Vartivarian, R. Hopfer, J.Hoy, and K.Rolston. 1989. New spectrum of fungal infections in patients with cancer. Rev. Infect. Dis. 11:369–378. [20] Samonis,G.,andD.Bafaloukos.1992.Fungal infections in cancer patients: an escalating problem. In Vivo 6:183–194. [21] Beck-Sague´, C. M., W. R. Jarvis, and the National Nosocomial Infections Surveillance System. 1993. Secular trends in the epidemiology of nosoco-mial fungal infections in the United States, 1980–1990. J. Infect. Dis. 167: 1247–1251. [22] Borg von-Zepelin, M., H. Eiffert, M. Kann, and R. Ru¨chel. 1993. Changes in the spectrum of fungal isolates: results from clinical specimens gathered in 1987/1988 compared with those in 1991/1992 in the University Hospital, Go¨ttingen, Germany. Mycoses 36:247–253. [23] Y Van de Peer, J Jansen, P De Rijk, and R De Wachter. 1996. Database on the structure of small ribosomal subunit RNA. Nucleic Acids Res. Jan 1, 1997; 25(1): 111– 116. [24] White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J., 1989 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis M, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego, California: Academic Press Inc. p 315–322. [25] Bruns TD, Szaro TM., 1992 Rate and mode differences between nuclear and mitochondrial small-subunit rRNA genes in mushrooms. Mol Biol Evol 9: 836 -855. [26] David Ellis ,The University of Adelaide,“Rhodotorula rubra”, Mycology Online, 2014. 47
  55. Đồ án tốt nghiệp [27] McPartland JM, Goff JP. (1991). "Neotypification of Trichosporon beigelii: morphological, pathological and taxonomic considerations".Mycotaxon 41: 173–178. [28] David Ellis. 2005. Trichosporon beigelii. The University of Adelaide Australia. [29] Cuenca-Estrella, M., L. Rodero, G. Garcia-Effron, and J. L. Rodriguez Tudela. 2002. Antifungal susceptibilities of Candida spp. isolated from blood in Spain and Argentina, 1996-1999. J. Antimicrob. Chemother. [34] Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.; Slesarev, A. I. (2004). "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications☆". Trends in Biotechnology 22 (5): 253–260. [35] Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol 127 (3): 1550–1557. [36] Sharkey, D. J.; Scalice, E. R.; Christy, K. G.; Atwood, S. M.; Daiss, J. L. (1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology 12 (5): 506–509. ❖ Tài liệu mạng [30] tu.htm [31] [32] tin-khong-82093.aspx [33] 48
  56. Đồ án tốt nghiệp 49
  57. Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu 1 B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen NCBI 2 Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA 2 Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. 3 Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. 4 Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. 6 i
  58. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. Hình ảnh các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu Máy li tâm lạnh MIKRO 220R Hộp đèn soi UV Uvintec Nguồn EC105 và Bể điện di IBI QS- 710 Máy PCR sprint thermo Cycler Kính hiển vi Nikon eclipse 80i BioRad UV CCD Camera 1
  59. Đồ án tốt nghiệp B. Kết quả so sánh trình tự ITS rDNA của 4 mẫu nấm men với ngân hàng gen NCBI Kết quả so sánh M9-1 với Rhodotorula mucilaginosa KDLYL10 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1114 bits(603) 0.0 603/603(100%) 0/603(0%) Plus/Plus Query 1 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 5 CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAATATAGGACGTCCAACTTAACTTGGAGT 64 Query 61 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 65 CCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCACTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC 124 Query 121 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 125 GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTAAATTTTATAACAAAATA 184 Query 181 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 185 AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT 244 Query 241 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 245 AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCC 304 Query 301 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 305 ATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCT 364 Query 361 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 365 TAATGATTGAAGAGGTGTTTGGTTTCTGAGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGTTC 424 2
  60. Đồ án tốt nghiệp Query 421 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 425 GTAATGCATTAGCATCCGCAATCGAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCT 484 Query 481 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 485 GAGGAATTCTAGTCTTCGGACTAGAGCCGGGTTGGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAAT 544 Query 541 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 545 GTCTACATTTTAAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATAT 604 Query 601 CAA 603 ||| Sbjct 605 CAA 607 Kết quả so sánh M9-5 với Trichosporon asahii trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1005 bits(544) 0.0 560/567(99%) 4/567(0%) Plus/Plus Query 15 GGAAGTAAAAGTCGTAACATTCGTTTTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 74 ||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 GGAAGTAAAAGTCGTAACA-AGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGTGAT 59 Query 75 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 134 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60 TGCCTTTATAGGCTTATAACTATATCCACTTACACCTGTGAACTGTTCTACTACTTGACG 119 Query 135 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 194 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 CAAGTCGAGTATTTTTACAAACAATGTGTAATGAACGTCGTTTTATTATAACAAAATAAA 179 Query 195 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 254 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 ACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAA 239 3
  61. Đồ án tốt nghiệp Query 255 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 314 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 240 GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAGCTTGCGCTCTCT 299 Query 315 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 374 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 300 GGTATTCCGGAGAGCATGCCTGTTTCAGTGTCATGAAATCTCAACCACTAGGGTTTCCTA 359 Query 375 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 434 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 360 ATGGATTGGATTTGGGCGTCTGCGATTTCTGATCGCTCGCCTTAAAAGAGTTAGCAAGTT 419 Query 435 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 494 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 420 TGACATTAATGTCTGGTGTAATAAGTTTCACTGGGTCCATTGTGTTGAAGCGTGCTTCTA 479 Query 495 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCT-AAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 553 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 480 ATCGTCCGCAAGGACAATTACTTTGACTCTGGCCTGAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGA 539 Query 554 ACTTAAGCATATCAA-AAGTCGGAGGA 579 ||||||||||||||| ||| ||||||| Sbjct 540 ACTTAAGCATATCAATAAG-CGGAGGA 565 Kết quả so sánh M11-1 với Meyerozyma guilliermondii KAML05 trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. Score Expect Identities Gaps Strand 1149 bits(622) 0.0 633/638(99%) 2/638(0%) Plus/Plus Query 4 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 63 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 47 TTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAC 106 Query 64 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 123 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 4
  62. Đồ án tốt nghiệp Sbjct 107 AGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTG 166 Query 124 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 183 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 167 ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAAC 226 Query 184 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAACTTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 243 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 227 ACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAA 286 Query 244 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 303 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 287 CGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAAT 346 Query 304 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 363 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 347 TGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGA 406 Query 364 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 423 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 407 GGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATA 466 Query 424 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 483 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 467 CTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGC 526 Query 484 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 543 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 527 TGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTC 586 Query 544 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTA-GAA 602 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 587 TGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA 646 Query 603 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA 640 ||||||||||||||||||||||||| | || ||||||| Sbjct 647 TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGC-GGAGGAA 683 5
  63. Đồ án tốt nghiệp Kết quả so sánh M23-2 với Pichia guilliermondii WM 02.91trên trình tự đoạn gen ITS 5.8S rDNA. Score Expect Identities Gaps Strand 342 bits(185) 3e-90 416/527(79%) 17/527(3%) Plus/Plus Query 24 GTCATCTAGAGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAACAAGGGGAAGGAT 82 ||||| ||||| ||||||||||||||||||||||| |||||||||||| | |||||||| Sbjct 15 GTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGAT 74 Query 83 CATTACAGAAGTTTTTAGCCAGCCATTAACTGCGCGGCGAAAAACCCCGACTTCACTGAG 142 |||||||| | | ||| |||||| ||||||||||||||||||||| || ||| | | Sbjct 75 CATTACAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACC-TTAC-ACACAGTG 132 Query 143 TCGTAATGA-CCATTCCTCTTGCTTTGGTACGGCCTAGAGATAGGTTGGCCCACAGGTTT 201 || | ||| || ||||||||||||| |||||||||||||||||| ||| |||||| Sbjct 133 TCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTT 192 Query 202 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGAAA-TAAAATGAACAACTT-TCTTCAAGA-T 258 ||||||||||||||||||||||||||||| | | |||| || | ||||||| | | Sbjct 193 AACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACT 252 Query 259 ATCAACAACTGGATCCAAGGGTTCT-GCTCCGA-GAAGAAAGCAGGGAAAACGCAAATAA 316 |||||||| ||||| |||||| || ||| |||||| |||| |||| || | ||| Sbjct 253 TTCAACAAC-GGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-GCGA-TAA 309 Query 317 AATTTGCCCCGCAGATTTTAC-GAATCATGGAAGATTC-ATCGTAGCCGGCGCCCTCT 372 ||| || ||||||||| ||||||| ||| || | || | ||||||||| Sbjct 310 GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCT 369 Query 373 GGTATTCCGGCGGGCATTCCCCTTTGAGCGTCATTTCCCCATCAAACCCCCGGGTTTGGT 432 |||||||| | |||||| || ||||||||||||||| | ||||||||||||||||||| Sbjct 370 GGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGT 429 Query 433 AATGAGGGATAGTCTTAGTCGGACTAGTCGTTTGCC-GAAAAGTATCGGCGACGTTAGTT 491 | |||| |||| ||||||||||||||| ||||||| ||||||||| ||| | |||| 6
  64. Đồ án tốt nghiệp Sbjct 430 ATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTA 489 Query 492 TTGGATAGGAAGGTCGATCTGTAAATGTATTAGGTTTATCCAATTCG 538 | ||||| ||||| || | |||||||||||||||||||| ||| Sbjct 490 CTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCG 536 7