›

Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro

pdf 87 trang thiennha21 13/04/2022 6030
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_su_anh_huong_cua_salicylic_acid_va_aspirin.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH − − ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P Sinh viên: LÊ NGUYỄN HOÀNG KIM NGÂN MSSV: 1411100072 Lớp: 14DSH01 TP Hồ Chí Minh, năm 2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH − − ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA ACID SALICYLIC, ASPIRIN TRONG TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CÂY LAN THẠCH HỘC THIẾT BÌ (Dendrobium officinale Kimura et Migo) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên: LÊ NGUYỄN TS Đ Ỗ Đ Ă N G G I Á P HOÀNG KIM NGÂN MSSV: 1411100072 Lớp: 14DSH01 TP Hồ Chí Minh, năm 2018
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CÁM ƠN iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH BIỂU ĐỒ vii DANH SÁCH HÌNH viii Chương 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 3 1.3. Nội dung thực hiện 3 1.4. Phương pháp nghiên cứu 3 1.5. Yêu cầu của đề tài 3 1.6. Kết cấu của đề tài 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì 5 2.2. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 13 2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 22 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 3.1. Thời gian và địa điểm 30 iii
  4. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Vật liệu và hoá chất 30 3.3. Điều kiện nuôi cấy 31 3.4. Nội dung nghiên cứu 32 3.5. Phương pháp thu chỉ tiêu theo dõi 40 3.6. Phương pháp xử lý số liệu 42 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1. Kết luận 56 5.2. Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 1 iv
  5. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đồ án tốt nghiệp “Ảnh hưởng của Acid Salicylic và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển cây lan thạch hộc thiết bì trong điều kiện in vitro” là chuyên đề nghiên cứu của em trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy T.S Đỗ Đăng Giáp. Tất cả các số liệu, kết quả trình bày trong đồ án tốt nghiệp là khách quan và không sao chép số liệu của bất kì công trình nghiên cứu nào trước đây. Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường và hội đồng về sự cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân v
  6. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và ban giám hiệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho sinh viên chúng em được học tập, sinh hoạt và nghiên cứu thêm nhiều điều hay và bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, ngành Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức rất quý báu, những kinh nghiệm quý báu về học và làm trong suốt 4 năm học vừa qua. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy T.S Đỗ Đăng Giáp đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã đồng hành và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực hiện Lê Nguyễn Hoàng Kim Ngân vi
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASA Acetylsalicylic acid (Aspirin) BA Benzyladenine BAP 6 – benzylaminopurine cs Cộng sự ĐC Đối chứng IFN – gamma Interferon – gramma g Gram mcg/g Microgram/gram MS Môi trường Murashige – Skoog NAA α - Naphthaleneacetic acid ND Nước dừa NT Nghiệm thức SA Salicylic Acid TLK Trọng lượng khô TLT Trọng lương tươi vii
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1. Bảng thiết bị Bảng 3.2. Bảng dụng cụ Bảng 3.3. Bảng hóa chất Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.1 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.2 Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.1 Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.2 Bảng 4.1. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Bảng 4.2. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Bảng 4.3. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Bảng 4.4. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. viii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên tổng số chồi của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều TLT và TLK của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên tổng hàm lượng Chlorophyll của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan thạch hộc thiết bì Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan thạch hộc thiết bì ix
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Lan thạch hộc thiết bì Hình 2.2. Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì Hình 2.3. Lan thạch hộc thiết bì Hình 2.4. Thân khí sinh của lan thạch hộc Hình 2.5. Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì Hình 2.6. Hoa của lan thạch hộc thiết bì Hình 2.7. a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Salicylic acid Hình 2.8. Sơ đồ các con đường tổng hợp salicylic acid trong cây Hình 2.9. Các ảnh hưởng của SA lên thực vật Hình 2.10. a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin Hình 2.11. Dẫn xuất Aspirin từ Salicylic acid Hình 2.12. Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor. a: mẫu cấy ban đầu. b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận. Hình 3.1. Mẫu nuôi cấy ban đầu Hình 3.2. Mẫu lan thạch hộc sử dụng để tiến hành thí nghiệm SA và ASA Hình 3.3. Lan thạch hộc thiết bì khi sấy khô Hình 4.1. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA (nồng độ lớn) Hình 4.2. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc thiết bì trên môi trường MS + AS (nồng độ lớn) Hình 4.3. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA (nồng độ nhỏ) Hình 4.4. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + AS (nồng độ nhỏ) x
  11. Đồ án tốt nghiệp Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bên cạnh những loài thực vật đa dạng làm nguồn thực phẩm hay làm đồ trang trí thì còn có một số loại thực vật quý được sử dụng với mục đích bồi bổ cơ thể và rất có giá trị dược liệu như sâm ngọc linh, ngải cứu, đông trùng hạ thảo, Thêm vào đó còn có một số loài thực vật không những được trồng làm cây cảnh mà còn có thể dùng để trị đau dạ dày, đau thượng vị, bồi bổ mắt, chống lão hoá, rất hiệu quả, đó là lan thạch hộc thiết bì (Nguyễn Thanh Thuận, 2015). Ngoài ra, lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) còn có nhiêu giá trị dược học như chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, làm các bài thuốc và đặc biệt là chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp (Kowitdamrong, 2013; Chu, 2014). Do có nhiều lợi ích và nơi phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là những vùng núi cao gây nguy hiểm cho người thu hái nên giá cả rất đắt đỏ. Hơn nữa, lan thạch hộc thiết bì khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán và cũng hiện là loài đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “bị đe doạ” (Bậc T) (Sách đỏ Việt Nam năm 2007 – phần thực vật – trang 448), suy giảm nghiêm trọng do chặt phá rừng và thu hái về trồng làm cây cảnh (Gu, 2007). Vì thế, cần phải có biện pháp giúp bảo tồn loài dược liệu quý. Nhiều loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên thường được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt (Kauth, 2005). Với công nghệ nhân giống in vitro hiện nay, hệ số nhân giống từ một quả lan là rất lớn, từ vài ngàn đến một triệu cây con (Trần 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Văn Minh, 2001). Đã có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan Dendrobium sp. bằng phương pháp gieo hạt lan trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (Luan và cs, 2006). Nguyễn Văn Song (2011) cũng có nghiên cứu về việc nhân nhanh in vitro loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng với nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường sacarose + 2,0 mg/l BA. Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp dụng công nghệ nuôi cấy mô nhân giống một số loài lan bản địa làm dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo có nguy cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị Sơn và cs, 2012; 2013; Vũ Ngọc Lan và cs, 2013). Kỹ thuật nuôi cấy mô mở ra hướng mới giúp bảo tồn những loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng như lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo). Phương pháp nuôi cấy mô đem lại giá trị kinh tế cao, tiết kiệm được thời gian chăm sóc, tạo ra cây giống đồng đều về mặt di truyền, sạch bệnh, năng suất cao, chất lượng đảm bảo không bị phụ thuộc vào điều kiện khí hậu bên ngoài nên nuôi cấy mô ngày càng khẳng định tính ưu việt trong việc nhân nhanh cũng như bảo tồn những loài cây quý. Môi trường nuôi cấy thực vật in vitro chủ yếu bao gồm muối khoáng, vitamin, các khoáng chất, nguồn carbon và các chất điều hoà sinh trưởng khác (Bektas và cs, 2013). Và trong các chất điều hoà sinh trưởng thì Salicylic acid và Aspirin có thể giúp tăng nhanh tốc độ sinh trưởng và phát triển của thực vật. Năm 2017, Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai đã có nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chồi in vitro lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) đã tìm ra nồng độ thích hợp của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật an toàn khi sử dụng để kích thích phát triển chồi và cụm chồi của lan thạch hộc thiết bì. Thêm vào đó, từ năm 2015 đến năm 2017, nghiên cứu của Trần Ngọc Ngoạn đã xây dựng và thu được các kết quả khả quan từ mô hình trồng lan thạch hộc thiết bì từ cây nuôi cấy mô tế bào. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp Với mục đích bảo tồn nguồn dược liệu quý và tăng nhanh tốc độ sinh trưởng của lan thạch hộc, đề tài: “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro” nhằm tìm ra nồng độ Salicylic acid và Aspirin thích hợp và an toàn với sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo). 1.2. Mục đích nghiên cứu Với mục đích nhân nhanh với năng suất cao loài lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý và tạo ra nguồn sinh khối lan lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) dồi dào cung cấp rộng rãi cho người sử dụng. Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược. 1.3. Nội dung thực hiện − Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì trên hai dãy nồng độ. − Khảo sát ảnh hưởng của aspirin lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì trên hai dãy nồng độ. − Tìm nồng độ thích hợp nhất của salicylic acid và aspirin tạo ra kết quả tối ưu nhất cho sự tăng trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì in vitro. 1.4. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên một yếu tố. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các số liệu thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm SAS và sử dụng các hàm trong excel. 1.5. Yêu cầu của đề tài 3
  14. Đồ án tốt nghiệp Xác định được công thức tối ưu của môi trường nuôi cấy MS kết hợp salicylic acid và aspirin thích hợp nhất cho cây lan thạch hộc thiết bì in vitro tăng trưởng tốt. 1.6. Kết cấu của đề tài Chương 1: Mở đầu Chương 2: Tổng quan tài liệu Chương 3: Vật liệu và phương pháp Chương 4: Kết quả và thảo luận Chương 5: Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) 2.1.1. Mô tả về lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Chi Dendrobium, bao gồm 1100 loài hoặc nhiều hơn nữa trên thế giới, là một nhóm lớn nhất trong họ Orchidaceae. Có 76 loài thuộc chi Dendrobium ở Trung Quốc, gồm 74 loài và 2 loại, trong đó thân cây được sấy khô của D.officinale được liệt kê trong Dược điển Trung Hoa dưới tên Dendrobii Officinalis Caulis (Tie-pi-shi-hu) như một khoản mục riêng. Theo như thuyết Y khoa Cổ Truyền Trung Hoa, chức năng chính của D.officinale là dưỡng âm và loại bỏ khí hư, “bảo vệ” dạ dày và điều hoá chất lưu. Loài này được sử dụng với mục đích chính là “bảo vệ” dạ dày, điều hoà sản phẩm chất lưu của cơ thể, và xoa dịu các triệu chứng như là khô họng và khô mắt với thị lực mờ trong phòng khám, và được tìm thấy có thể kích thích miễn dịch (Sydney Tang và cs, 2011) và tác dụng kháng u bướu (Kowitdamrong và cs, 2013). Hình 2.1. Lan thạch hộc thiết bì 5
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2. Thân và hoa của lan thạch hộc thiết bì 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố Thạch hộc thiết bì hay còn gọi là thạch hộc rỉ sắt, hắc tiết thảo, thiết bì lan, lí thụ thảo là cây thảo lâu năm thuộc Chi Thạch hộc –Họ Lan, thường sinh trưởng ở các vách đá, khe đá, hoặc phụ sinh trên cây cổ thụ, ở vùng cao núi đá, nhiệt đới, Á nhiệt đới, độ cao từ 800 – 1000m (Chu Chu và cs, 2014). Ở Việt Nam họ Lan có nhiều loài, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam, nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe doạ tuyệt chủng, một số loài nằm trong danh mục Sách đỏ Việt Nam, trong đó có loài lan Thạch hộc tía, phân bố ở vùng trung du miền núi phía Bắc Việt Nam đang được nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng để làm thuốc. 2.1.3. Đặc điểm sinh học 2.1.3.1. Phân loại thực vật Cây lan Thạch hộc thiết bì thuộc: Giới: Plantae (giới Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (ngành Ngọc Lan) 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Lớp: Magnoliopsida (lớp Ngọc Lan) Bộ: Asparagales (bộ Măng Tây) Họ: Orchidaceae (họ Lan) Chi: Dedrobium (chi Lan hoàng thảo) Loài: Dendrobium officinale Kimura et Migo Hình 2.3. Lan thạch hộc thiết bì 2.1.3.1. Đặc điểm của cây trưởng thành Thạch hộc thiết bì hay thạch hộc tía là cây thảo phụ sinh lâu năm, thân mọng nước, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát. Với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía và có giá trị độc đáo về dược phẩm (Chu Chu và cs, 2014). 2.1.3.2. Đặc điểm của thân rễ Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Thân rễ thường có màu xanh và không phủ lông. Số lóng trên thân thay đổi tùy từng cây và dao động trong khoảng từ 3 – 7 lóng (Chu Chu và cs, 2014). 2.1.3.3. Đặc điểm thân khí sinh 7
  18. Đồ án tốt nghiệp Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân từ 3,5 – 8 cm, bán kính thân 0,2 – 0,4 cm. Bề mặt vỏ ngoài vàng – xanh hoặc vàng – vàng (Chu Chu và cs, 2014). Hình 2.4. Thân khí sinh của lan Thạch hộc 2.1.3.4. Đặc điểm của rễ Rễ mọc ra từ các mấu trên thân. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ rễ khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất, thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, thỉnh thoảng có nhiều hơn. Số lượng và khích thước rễ khác nhau cho từng cá thể. Số lượng rễ trong khoảng từ 2 – 9 (Chu Chu và cs, 2014). 2.1.3.5. Lá cây Hình 2.5. Thân và lá của lan thạch hộc thiết bì 8
  19. Đồ án tốt nghiệp Lá hình thuôn dài, mọc so le đều hai bên thân, phía cuống tù, gần như không cuốn, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12 cm, rộng 2 – 3 cm trên có 5 gân dọc (Nguyễn Thanh Thuận, 2015). 2.1.3.6. Đặc điểm hoa, quả Cụm hoa mọc thành chùm 2 – 4 hoa ở sát nách lá, hoa nở khoảng tháng 3 – 4, và kết quả vào khoảng tháng 5 – 6 (Nguyễn Ngọc Thuận, 2015). Hình 2.6. Hoa của lan thạch hộc thiết bì 2.1.4. Giá trị dược liệu của lan thạch hộc thiết bì Theo Dược điển Trung Quốc thì trong D.officinale Kimura et Migo có dendrobium polysaccharides (23%), alkaloids (0,02 – 0,04%), amino – acids (135 mg/g cây khô), nhiều kim loại như Sắt (292 mcg/g), Kẽm (12 mcg/g), Mangan (52 mcg/g), Đồng (3,6 mcg/g). Ngoài ra, thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các chất nhầy, hợp chất amidon. Trong thân cây thạch hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6 – hydroxy – dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N – methyl – dendrobium, 8 – epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng. Thân cây thạch hộc tía có dầu bay hơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%. Trong cổ thư đông y Trung 9
  20. Đồ án tốt nghiệp Quốc cách đây hơn 1000 năm đã xác định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc, tuyết liên, nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh chi, ngọc trai, đông trùng hạ thảo, trong đó thạch hộc tía xếp đầu bảng. Nghiên cứu của Liu, X. F. và cs (2011) cho thấy khi cho chuột uống dịch chiết và các Polysaccharide thô của D.officinale Kimura et Migo giúp cải thiện và tăng cường đáng kể khả năng miễn dịch tế bào và miễn dịch không đặc hiệu ở chuột, tăng sản sinh IFN – gamma ở lách. Nghiên cứu tác dụng của D.officinale Kimura et Migo trên hệ tiêu hoá cho thấy một polysaccharide (Dendronan) có tác dụng tốt, giúp điều hoà hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng các acid béo chuỗi ngắn SCFA, giảm pH ruột kết và thời gian hình thành phân (Zhang, G.Y., và cs, 2015). Ngoài ra, D.officinale Kimura et Migo là một trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau (Yao, C. và cs, 2012). 2.1.5. Giá trị thị trường của lan thạch hộc Trên thị trường, thân cây tươi thạch hộc tía đang có giá bán khoảng 150 USD/kg. Giá trị của nó còn được cổ thư xếp trên nhân sâm, thủ ô, phục linh, tùng dung, linh chi, ngọc trai, đông trùng hạ thảo. 2.1.6. Nhân giống lan thạch hộc thiết bì 2.1.6.1. Nhân giống bằng giao hạt Năm 2014 theo Nguyễn Thị Sơn và cs quả lan sau khi được khử trùng, xẻ lấy hạt cấy vào các môi trường nền: MS (Murashige & Shoog, 1962), VW (Vacin & Went, 1949), Hyponex. Hạt lan mới gieo sẽ rất mịn và có màu vàng chanh. Sau 8 tuần nuôi cấy thu được kết quả các hạt đã nảy chồi 100% trên nền môi trường MS và VW. Hạt gieo 10
  21. Đồ án tốt nghiệp trên nền môi trường VW cho tỷ lệ hạt có màu xanh cao nhất, sau 6 tuần nuôi cấy cho tỷ lệ mẫu phát sinh chồi cao nhất (100%). Hạt được gieo trên nền môi trường H cho tỷ lệ mẫu có màu xanh thấp nhất sau 8 tuần nuôi cấy. Về hình thái, chồi tốt nhất trên môi trường nền VW (đồng đều màu xanh bóng, không bị xốp, không bị mọng nước, chồi phát triển mạnh không bị biến dị), tiếp đến là MS. Vì vậy, môi trường VW + 10g sucrose/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường + 10% ND là môi trường thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt lan D. officinale Kimura et Migo. 2.1.6.2. Nhân nhanh cụm chồi Theo Nguyễn Thị Sơn và cs, môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường là tối ưu cho nhân nhanh cụm chồi loài lan nghiên cứu. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Vũ Ngọc Lan và cs., (2013) khi nhân nhanh cụm chồi lan thuốc D.nobile Lindl. Kết quả nghiên cứu trên lan hài Hằng (P. hangianum Gurss.) khi nhân nhanh chồi cho biết cần bổ sung lượng chuối cao hơn, lên đến 100g chuối/lít môi trường (Hoàng Thị Giang và cs., 2010). 2.1.6.3. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân in vitro mang mắt ngủ Cây lan in vitro thân mang 2 mắt ngủ được đưa vào nuôi cấy trên môi trường nền MS đều tái sinh chồi và cho sinh trưởng mạnh nhất, thể hiện qua chiều cao chồi, đường kính chồi, số chồi và màu sắc lá xanh tốt hơn hẳn trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA + 6g agar/lít môi trường là thích hợp cho việc phát sinh chồi giống lan D. officinale Kimura et Migo. Tương tự với kết quả của Li (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống lan này tại Trung Quốc (Nguyễn Thị Sơn và cs, 2014). 2.1.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh Theo nghiên cứu Nhân giống in vitro lan thạch hộc thiết bì của Nguyễn Thị Sơn và cs năm 2014 môi trường RE + 10 g sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 α – NAA/lít môi trường là tối ưu ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh giống lan D. officinale Kimura et 11
  22. Đồ án tốt nghiệp Migo. Với tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi; chiều dài rễ trung bình là 3,19 cm sau 30 ngày nuôi cấy. 2.1.7. Một số nghiên cứu trên lan thạch hộc thiết bì Dendrobium officinale Nghiên cứu “Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (thạch hộc thiết bì)” của Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thuỷ và cs vào năm 2014 đã chỉ rõ: Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW + 10 g sucrose + 6 g agar + 100 ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100 ml ND + 20 g sucrose + 6 g agar + 60 g chuối chín/lít môi trường. Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20 g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l α – NAA + 6 g agar/lít môi trường. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10 g sucrose + 6 g agar + 0,3 g THT + 0,5 mg/l α – NAA. Nguyễn Thanh Thuận năm 2015 đã nghiên cứu “Giá trị dược liệu của cây lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” đã khẳng định giá trị dược học của loại thảo dược này về khả năng kháng khuẩn, chống oxy hoá, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế tế bào ung thư, điều hoà đường huyết, cải thiện hoạt động của hệ tiêu hoá, ổn định hệ vi sinh đường ruột, Năm 2017, Hanxiao Tang, Tianwen Zhao, Yunjie Sheng, Ting Zheng, Lingzhu Fu và Yongsheg Zhang đã có nghiên cứu về dược tính của lan Thạch hộc – một loại thảo mộc bổ dưỡng trong dược liệu Trung Quốc. Khoảng 190 hợp chất đã được phân lập từ Dendrobium officinale Kimura et Migo trong những thập kỷ qua. Tác dụng dược lý của Dendrobium officinale Kimura et Migo có tác dụng chống ung thư, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ dạ dày loét. Tuy nhiên, còn có các thành phần phân tử nhỏ khác cần nghiên cứu thêm. 2.1.8. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của lan thạch hộc thiết bì Dendrobium officinale 12
  23. Đồ án tốt nghiệp 2.1.8.1. Nhiệt độ Do đặc tính sinh trưởng của lan Thạch hộc là nhiệt đới và á nhiệt đới trên những vùng núi cao hay dưới tán của các cây lớn nên nhiệt độ không khí trung bình sẽ là 12 – 18oC (PGS.TS Phạm Đức Tuân, 2014). 2.1.8.2. Ánh sáng Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của lan Thạch hộc mà không thể bỏ qua đó chính là ánh sáng. Ánh sáng cần phải được đảm bảo để có thể quang hợp và sinh trưởng được. Lan Thạch hộc thuộc giống lan ưa nắng nên không cần cung cấp quá nhiều ánh sáng, chỉ cần một lượng nhỏ và vừa đủ 70%. 2.1.8.3. Độ ẩm không khí Đa số các loại lan đều có thể sống trong môi trường nhiệt đới với độ ẩm không khí đạt từ 70 – 90%, còn riêng lan Thạch hộc sẽ là 60 – 80%. Do đó trong quá trình tiến hành trồng và chăm sóc, cần đảm bảo độ ẩm khoảng 70% để lan có thể sinh trưởng tốt và thuận lợi nhất. 2.1.8.4. Nước Lan khá dễ ngập úng mặc dù chúng là loài ưa ẩm, chính vì vậy trong những ngày mưa nên hạn chế việc tưới nước, điều tiết lượng nước phù hợp để tránh tình trạng ngập úng, thối rễ. Trong giai đoạn mọc rễ, chồi và sinh trưởng, cây lan sẽ cần rất nhiều nước, cần phải đảm bảo đủ nước để cây phát triển khỏe mạnh. 2.1.8.5. Sự thông thoáng Cần đảm bảo thoáng khí, thoáng gió để hạn chế tình trạng bệnh trên cây. Nên tránh việc trồng lan ở nơi có nhiều bụi bẩn, khói, không khí ô nhiễm sẽ cản trở quá trình hô hấp của cây. 2.2. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật 2.2.1. Salicylic acid (SA) 13
  24. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.1. Giới thiệu chung 2.2.1.1.1. Cấu trúc hoá học Công thức hóa học: C7H6O3 Điểm sôi: 211oC Salicylic acid (SA) là một chất giống như hormone đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tăng trưởng và phát triển của thực vật (Raskin, 1992). Trong hai thập kỷ qua, SA đã nhận được nhiều sự chú ý vì sự tham gia của nó vào các cơ chế bảo vệ thực vật dưới áp lực sinh học và phi sinh học. Các cơ chế bảo vệ này bao gồm việc thành lập hệ thống kháng tập nhiễm (systemic acquired resistance-SAR) (Mecroux và cộng sự, 1990), tạo nên protein gây tính kháng bệnh ở cây chủ (pathogenesis- related proteins-PR) (Malamy và cộng sự, 1990) cũng như là tạo ra tính "siêu mẫn cảm" ở thực vật ("hypersensitive response") (Horváth và cộng sự, 2007). Tác dụng bảo vệ của SA đối với các yếu tố stress phi sinh học như kim loại độc (Strobel và Kuc, 1995), stress nhiệt (Dat và cộng sự, 1998), nhiệt độ thấp (Janda và cộng sự, 1999, Mora- Herrera và cộng sự, 2005 ), và oxy hoá gây hại (Strobel và Kuc, 1995; Kusumi và cộng sự, 2006) đã được chứng minh. Hơn nữa, vai trò của SA trong việc tạo ra khả năng chịu mặn đã được nghiên cứu chi tiết ở nhiều loài thực vật. SA đã được báo cáo đã tạo ra khả năng chịu mặn trong cà chua (Stevens và cộng sự, 2006), ngô (Gunes và cộng sự, 2007), cà rốt (Eraslan và cộng sự, 2007) và lúa mỳ (Arfan và cộng sự, 2007). Nó cũng đã được sử dụng để tăng cường tái tạo in vitro ở một số loài thực vật (Quiroz-Figueroa và cộng sự, 2001, Luo và cộng sự, 2001, Hao và cộng sự, 2006). Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào được thực hiện ở các loài Hibiscus, bao gồm Hibiscus acetosella và Hibiscus moscheutos, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới ở phía tây châu Phi (Menzel và Wilson, 1961) và Bắc Mỹ. Salicylic acid là một acid monohydroxybenzoic béo, một loại acid phenolic và một acid beta hydroxy. Acid hữu cơ kết tinh không màu, được sử dụng rộng rãi trong tổng 14
  25. Đồ án tốt nghiệp hợp hữu cơ và có chức năng như một hormone thực vật. Nó có nguồn gốc từ sự trao đổi chất của salicin. Ngoài việc giữ vai trò là một chất chuyển hóa có hoạt tính quan trọng của aspirin (acid acetylsalicylic), mà hoạt động một phần như là một tiền chất của acid salicylic, có lẽ nó được biết đến nhiều nhất vì nó được sử dụng như là một thành phần quan trọng trong các sản phẩm chống mụn trứng cá. (WHO, 2015) Hình a Hình b Hình c Hình 2.7. a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Salicylic acid 15
  26. Đồ án tốt nghiệp (Nguồn: Salicylic acid là một trong những nguyên liệu ban đầu để sản xuất acetylsalicylic acid (aspirin) năm 1897. Salicylic acid là một chất điều chỉnh tăng trưởng nội sinh và có thể điều chỉnh sự phát triển của thực vật in vitro bằng cách ảnh hưởng đến chức năng sinh lý và sinh hóa của chúng (Agami và Mohamed, 2013). Vai trò của salicylic acid trong sự tăng trưởng mô, sự phát triển nhiều chồi, rễ và xơ cứng của cây con có nguồn gốc in vitro đã được quan sát thấy ở Ziziphus spina – Christi (Galal, 2012), Hibiscus acetosella và Hibiscus moscheutos (Sakhanokho và Kelley, 2009) 2.2.1.1.2. Quá trình sinh tổng hợp SA của thực vật Chu trình shikimic acid sinh ra cinnamic acid rồi sau đó biến đổi theo hai cách để tạo thành salicylic acid: − Thông qua isochorismic acid nhờ isochorismate pyruvate lyase (IPL) xúc tác và từ phenylalanine tạo cinnamic nhờ phenylalanie ammonia lyase (PAL) xúc tác. Sau đó SA tổng hợp từ benzoic acid, một dẫn xuất từ cinnamic acid, nhờ benzoic acid 2 – hydroxylase (BA2H) xúc tác. − SA cũng tổng hợp từ cinnamic acid thông qua o – coumaric acid. Enzyme salicylic acid methyl transferase (SAMT) xúc tác tạo methyl salicylate từ salicylic acid, còn enzyme salicylic acid glucosyl transferase (SAGT) xúc tác phản ứng glycosyl – hóa SA tạo dẫn xuất beta – glucoside. Quá trình sinh tổng hợp SA của thực vật được biểu diễn dưới dạng sơ đồ trong hình sau: 16
  27. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.8. Sơ đồ các con đường tổng hợp salicylic acid trong cây 17
  28. Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.2. Ảnh hưởng của SA lên thực vật 2.2.1.2.1. Ảnh hưởng sinh lý Salicylic acid đã cho thấy có ảnh hưởng trên nhiều quá trình của thực vật. Sự trổ hoa, sự phát sinh nhiệt trong những cây sinh nhiệt, và kích thích tính kháng bệnh là những quá trình mà SA có những ảnh hưởng chính. Aspirin (Acetylsalicylic acid) hoạt động giống như SA vì nó được chuyển thành salicylic acid trong dung dịch của nước trong thực vật cũng như hệ thống động vật (Nguyễn Minh Chơn, 2004). 2.2.1.2.2. Ảnh hưởng lên sự trổ hoa Salicylic acid có thể kích thích sự trổ hoa. Có thông tin cho rằng SA đươc xử lý kết hợp với kinetin và IAA thúc đẩy sự tạo mầm hoa cây thuốc lá trong nuôi cấy mô. Tuy nhiên cũng có những kết quả trái ngược về vấn đề này và cho rằng có nhiều hợp chất ảnh hưởng lên sự tạo mầm hoa này không riêng gì SA (Nguyễn Minh Chơn, 2004). 2.2.1.2.3. Mối quan hệ giữa SA và sự phát sinh nhiệt trong cây Sự phát sinh nhiệt trong cây hoa loa kèn được xác định là do SA tác động. SA gây ra sự phát nhiệt để làm bay hơi những hợp chất amin và indole có mùi để hấp dẫn côn trùng đến giúp cho sự thụ phấn. Nhiệt độ xung quanh hoa có thể tăng lên 14oC (Nguyễn Minh Chơn, 2004). 2.2.1.2.4. Mối quan hệ giữa Salicylic acid và tính kháng bệnh trong cây White và cs là những người đầu tiên tiến hành xử lý SA và các dẫn xuất của nó (2,6 dichloroisonicotinic acid (INA), benzothiadiazol S – methyl ester (BTH) để cảm ứng làm tăng tính kháng bệnh virus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá. Cụ thể là xử lý nói trên thường làm tăng sự biểu hiện của các gen kháng virus, vi khuẩn, oomycete và nấm bệnh ở cả cây một và hai lá mầm. SA thường kích thích tạo chất ức chế quá trình sao chép và khả năng xâm nhập của virus. SA kiểm soát phản ứng siêu mẫn cảm HR làm chết tế bào, hàm lượng chất chứa các gốc oxy hoạt động, hoạt hóa phản ứng peroxide hóa lipid tạo các gốc tự do. 18
  29. Đồ án tốt nghiệp Một vài loài cây kháng bệnh giới hạn sự phát triển của vết bệnh thành một vùng nhỏ quanh nơi xâm nhiễm của mầm bệnh lúc đầu với một hoại tử xuất hiện. Tế bào tự chết để bảo vệ được gọi là phản ứng quá nhạy cảm. Hiện tượng này thường đi kèm với sự sản xuất ra một loại protein có trọng lượng phân tử nhỏ. Tính kháng bệnh và sự sản sinh ra protein này có thể được tạo ra do SA hoặc acetylsalicylic acid ngay cả khi không có mầm bệnh xâm nhiễm. Trong quá trình phát triển của những cây siêu nhạy cảm đáp ứng với mầm bệnh, một số lượng lớn SA đã được sinh ra từ cinnamic acid trong vùng phụ cận của vết bệnh hoại tử (Nguyễn Minh Chơn, 2004). 2.2.1.3. Một số nghiên cứu sử dụng SA trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Nghiên cứu: Cải thiện ảnh hưởng của salicylic acid đến cây Táo gai dại Ziziphus spina-christi (L.) của Abdelnasser Galal vào năm 2012 đã chứng minh được khi môi trường nuôi cấy MS đạt được tối ưu khi bổ sung với 0,25 (mg/l) 6 – Benylaminopurine (BAP) và 25 (mg/l) SA. Điều kiện nuôi cấy mô sẹo tối ưu thu được trên môi trường MS bổ sung với 3 (mg/l) 2,4 – Dichlorophenoxyaacetic acid (2,4 – D) và 25 (mg/l) SA, trong khi điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sẹo soma hình thành thu được trên môi trường MS bổ sung với 2,0 (mg/l) 2,4 – Dichlorophenoxyaacetic acid (2,4 – D) và 10 (mg/l) SA. Năm 2013, Ana Cláudia Pacheco và cs đã chứng minh ảnh hưởng tích cực của SA đến sự tăng trưởng và ra hoa của cây cúc vạn thọ (Calendula officinalis L.) và cũng làm tăng tổng hàm lượng flavonoid trong cụm hoa của loài cây này trong nghiên cứu: Những thay đổi do salicylic acid tác động đến sự sinh trưởng, ra hoa và tạo flavonoid của cúc vạn thọ. SA là một chất giống như hormone đã được báo cáo để tăng cường tái tạo in vitro ở một số loài thực vật, bao gồm cà phê arabica (Quiroz-Figueroa và cộng sự, 2001), đậu ván dầu adsurgen (Luo và cộng sự, 2001), và yến mạch nuda (Hao và cộng sự, 2006). Hiệu quả tích cực của SA đối với sự hình thành và tăng trưởng của rễ là mối quan tâm đặc biệt, vì một số báo cáo về các nghiên cứu khả năng chịu mặn in vitro cho thấy 19
  30. Đồ án tốt nghiệp rằng sự hình thành và phát triển của rễ không chỉ bị ảnh hưởng đến muối mà còn tương quan với khả năng chịu mặn ở cả cây trồng (Martinez, 1996; Cano và cộng sự, 1998). Hơn nữa, sử dụng SA ngoại sinh tác động qua rễ đã tạo ra khả năng chống chịu đối với các stress phi sinh học bao gồm khả năng chịu nhôm của cây Muồng ngủ (Cassia tora) (Yang và cộng sự, 2003), chịu cadmium của lúa (Guo và cộng sự, 2007) và chịu mặn của lúa mì (Arfan và cộng sự, 2007). Ngoài ra, các đặc tính kháng nấm của salicylic acid, khi hòa tan vào trong nước làm chậm sự tăng trưởng của nấm mốc làm tắc nghẽn các mô mạch của hoa. Hình 2.9. Các ảnh hưởng của SA lên thực vật 2.2.2. Aspirin (ASA) 2.2.2.1. Giới thiệu chung Công thức hóa học: C9H8O4 Điểm sôi: 140oC 20
  31. Đồ án tốt nghiệp Aspirin, hay acetylsalicylic acid (ASA), là một dẫn xuất của salicylic acid. Khi nghe đến Aspirin chúng ta sẽ nghĩ ngay đến thuốc chống viêm, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Theo như một vài nghiên cứu gần đây chúng ta sẽ bất ngờ khi biết rằng thuốc Aspirin có thể là “thần dược” giúp cho cây cối xanh tốt, aspirin có khả năng chống nấm, chống hạn cho cây và có thể giúp cây tăng trưởng nhanh hơn. Hình a Hình b Hình c Hình 2.10. a) Công thức cấu tạo; b) Cấu trúc không gian; c) Aspirin (Nguồn: Mặc dù aspirin là một điều kỳ diệu khá mới của y học, bản thân aspirin được chiết xuất từ cây liễu và đã được sử dụng như một loại thuốc giảm đau trong ít nhất 6000 năm qua. Theo như How Stuff Works giải thích, không phải cho đến khi các nhà khoa học làm việc với chiết xuất và thanh lọc các thành phần hoạt chất có trong cây liễu, salicin, 21
  32. Đồ án tốt nghiệp thì aspirin mới bắt đầu trở thành thứ mà chúng ta biết ngày hôm nay. Trong đường tiêu hóa của chúng ta, salicin được phân giải thành salicylic acid, một chất giúp giảm đau và viêm nhiễm. Các nhà khoa học Đức đã có thể tổng hợp chất này trên quy mô lớn, nhưng đáng tiếc là lại gặp khó khăn trên niêm mạc dạ dày. Aspirin được tạo ra như là một phiên bản của salicylic acid tổng hợp với độ acid thấp hơn (Nhật ký Công nghệ sinh học). Hình 2.11. Dẫn xuất Aspirin từ Salicylic acid 2.2.2.2. Một số nghiên cứu sử dụng Aspirin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Tại trường Đại học Rhode Island, những người làm vườn đã thử nghiệm nghiền 4 viên aspirin hòa trong 15 lít nước rồi phun vào một phần của vườn rau 3 tuần/1 lần trong suốt mùa vụ. Kết quả thật tuyệt, cuối mùa vụ họ thấy rằng cây trồng tăng trưởng tốt hơn và cho năng suất cao hơn so với nhóm cây không được phun aspirin (Như Quỳnh, 2017 – vtc.vn). Các nhà nghiên cứu từ Kings Park, Western Australia đã phát hiện ra rằng thành phần chính của thuốc aspirin là salicylic acid có vai trò quan trọng trong quá trình thoát hơi nước ở thực vật trong điều kiện khô hạn. Salicylic acid có khả năng bảo vệ hệ thống quang hợp, cho phép thực vật tăng trưởng, mặc dù có tình trạng thiếu nước. Điều này có thể do vai trò của acid salicylic trong việc hỗ trợ quá trình điều chỉnh các lỗ khí khổng ngăn ngừa sự mất nước quá nhiều. Thử nghiệm xử lý với aspirin ở thực vật cho thấy với điều kiện tưới một lít nước trong một tháng, 40% số cây sống sót so với 3% ở những cây không được xử lý. Kết quả của nghiên cứu này rất quan trọng trong các dự án phục hồi thực vật tại Nature Park Thumama, Riyadh. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp 2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1. Định nghĩa Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu từ thực vật hoàn toàn sạch các loại vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Ngô Xuân Bình, 2010). 2.3.1.1. Ưu điểm − Phương pháp nuôi cấy mô có thể tạo ra một số lượng lớn cây từ một cây mẹ ban đầu (hệ số nhân của các loại cây trong khoảng 36 đến 1012), với cơ quan của cây có thể là 0,1 – 1 mm. Trong khi đó, đối với những phương pháp truyền thống thì để tạo ra số lượng cây tương đương thì cần có nhiều cây mẹ hơn và thời gian cũng lâu hơn, kích thước ban đầu có thể là từ 10 – 25 cm. − Thao tác hoàn toàn trong điều kiện vô trùng, cây con sẽ tránh được các tác nhân bất lợi từ môi trường bên ngoài. − Sử dụng vật liệu ban đầu sạch virus có thể tạo ra được rất nhiều cây sạch virus. − Cây nếu như không cần sử dụng ngay có thể bảo quản với số lượng lớn trong một thời gian dài. − Các tế bào thực vật có thể được cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lí. Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô. − Có thể kiểm soát được chất lượng và hiệu suất của sản phầm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật như là chất lượng nguyên liệu thô và đồng nhất giữa các lô sản xuất. − Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào có chất lượng cao hơn so với trong cây hoàn chỉnh (trích Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật). 2.3.1.2. Hạn chế 23
  34. Đồ án tốt nghiệp − Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp. − Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt. − Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình, cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền (trích giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật). 2.3.2. Ứng dụng nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô ra đời và có nhiều ứng dụng khác nhau như vi nhân giống, tạo cây đơn bội, chọn dòng tế bào thực vật (chọn dòng chịu bệnh, chọn dòng chịu stress, nuôi cấy protoplast khắc phục hiện tượng lai xa, chuyển gen thực vật, đặc biệt ứng dụng nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn cũng như chọn dòng có năng suất về hợp chất thứ cấp đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sinh khối thực vật (sinh khối là dạng vật liệu sinh học từ sự sống, hay gần đây là sinh vật sống, đa số là các cây trồng hay vật liệu có nguồn gốc từ thực vật) ( Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chỉ sau 1 thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng sinh khối lớn có hoạt chất cao, thực vật nuôi cấy in vitro vẫn có thể tạo ra sinh khối có hoạt chất cao, nghĩa là thực 24
  35. Đồ án tốt nghiệp vật nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, ). 2.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của thực vật in vitro 2.3.3.1. Nuôi cấy trên môi trường rắn Độ cứng của môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro. Có một số chất có tác dụng làm đông đặc môi trường như agar, agarose, gellan gum. Trong đó agar được sử dụng khá rộng rãi. Agar là một loại polysacharide được thu nhận từ rong biển và được biết đến như là một chất làm đông đặc môi trường trong nuôi cấy mô in vitro. Agar hòa tan trong nước ở nhiệt độ từ 60 – 100oC và đông đặc ở khoảng nhiệt độ 45oC. Agar không phản ứng với các thành phần môi trường cũng như không bị triệt tiêu bởi các hoocmon thực vật và được sử dụng trong khoảng 0,8 – 1%. Ưu điểm của agar khi bổ sung vào môi trường là hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, môi trường chứa agar cũng có một số mặt bất lợi như môi trường bán rắn sẽ hạn chế sự di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó. Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút. Ngoài ra, các độc tố do mô thực vật tiết ra (thường gặp là hiện tượng cây tiết ra phenol) sẽ tập trung quanh nó gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chính mẫu cấy. Môi trường bán rắn chỉ được sử dụng một lần, vì không thể thay đổi thành phần của môi trường để phù hợp với từng thời kỳ phát triển của thực vật vì vậy phải cấy chuyền liên tục. 2.3.3.2. Nuôi cấy lỏng Hệ thống nuôi cấy lỏng ra đời đã đem lại nhiều triển vọng cho nuôi cấy mô. Trong nuôi cấy lỏng có ba loại: hệ thống nuôi cấy lỏng tĩnh, hệ thống nuôi cấy lỏng lắc và hệ thông nuôi cấy bioreactor. 25
  36. Đồ án tốt nghiệp Nuôi cấy lỏng tĩnh: các tế bào được ngập chìm và để tĩnh trong môi trường nuôi cấy, sau thời gian nuôi cấy nhất định thì các tế bào được chuyển qua môi trường khác để có thể đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Ưu điểm của phương pháp này là việc chuẩn bị và sử dụng môi trường khá dễ dàng (Shakti và cộng sự, 2007). Nuôi cấy trong môi trường lỏng cho phép kiểm soát một cách chủ động các thông số lý hóa, là tiền đề cho xây dựng hệ thống tự động, triển khai trong quy mô công nghiệp. Chi phí sản xuất thấp hơn so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động. Do không cần sử dụng chất làm đặc môi trường như agar vì thế sẽ giảm thiểu được nguồn chi phí cũng như nguồn nhân lực trong quá trình sản xuất. Do là môi trường lỏng nên các chất dinh dưỡng sẽ phân bố đều môi trường giúp cây tiếp xúc hoàn toàn với nguồn dinh dưỡng vì thế giảm thời gian nuôi cấy đi đáng kể. Tuy nhiên, trong môi trường lỏng tĩnh sự trao đổi không khí rất hạn chế, điều này sẽ làm cho mẫu cấy chậm phát triển, đôi khi chết (đối với mẫu mô sẹo, protocorm, ). Mẫu cấy trong môi trường lỏng một thời gian sẽ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể (Shakti và cộng sự, 2007). 26
  37. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.12. Quy trình nuôi cấy sinh khối cây lan gấm bằng kỹ thuật bioreactor. a: mẫu cấy ban đầu. b, b1: mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. c, c1: khối lượng sinh khối thu nhận. Nuôi cấy lỏng lắc: các tế bào được ngập chìm trong môi trường và sự thông khí nhờ máy lắc với tốc độ 100 – 150 vòng/phút. Nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc có những ưu điểm sau:các chất dinh dưỡng được khuếch tán trong môi trường với độ đồng đều cao tạo điều kiện cho mẫu hấp thu triệt để. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt cây tiếp xúc với môi trường sẽ làm tăng hiệu quả hấp thu dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng tốt hơn, giảm thời gian nuôi cấy. Do trong môi trường được lắc liên tục nên không có sự hạn chế về trao đổi khí nên cây phát triển tốt hơn môi trường lỏng tĩnh.Nuôi cấy lỏng lắc dễ dàng cho nhân giống với số lượng lớn cũng như tạo ra nhiều sinh khối. Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn. Ngoài ra, nuôi cấy lỏng lắc còn khắc phụ được hiện tượng thủy tinh thể trên môi trường lỏng tĩnh. Hạn chế của phương pháp này là trong quá trình lắc liên tục trong một thời gian có thể tạo ra các bọt khí nhỏ gây giảm nồng độ oxy hòa tan trong môi trường, ngoài ra nuôi cấy lỏng (hoặc lỏng lắc) trong khoảng thời gian sẽ khiến môi trường bay hơi (Shakti và cộng sự, 2007). Vì thế, cần bổ sung hoặc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường khác để đảm bảo sự phát triển của mẫu cấy. 2.3.4. Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của mẫu cấy in vitro Vai trò của môi trường khoáng đến sự phát triển của thực vật trong nuôi cấy mô là không thể phủ nhận. Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định đến sự thành công hay thất bại của mẫu cấy, nó quyết định đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau và sự ảnh hưởng đến từng đối tượng ở những giai đoạn khác nhau cũng khác nhau. Tuy có nhiều loại môi trường khoáng khác nhau nhưng thành phần của một môi trường nuôi cấy chủ yếu gồm những nhóm sau: các chất khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng, ngoài ra 27
  38. Đồ án tốt nghiệp trong môi trường còn có các chất làm đông đặc môi trường như agar hay các chất bổ sung từ nguồn hữu cơ khác. Mỗi nhóm khác nhau thì đóng vai trò khác nhau trong môi trường nuôi cấy: Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô hay tế bào thực vật nuôi cấy cũng không khác biệt nhiều so với việc trồng trong tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp cho cây trồng in vitro bao gồm nitơ, phospho, kali, canxi, Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy như nitơ tạo các liên kết hữu cơ, sinh tổng hợp các amino acid và protein, và làm chất mang một số cation như đồng, mangan vận chuyển qua hệ thống màng. Phospho là một trong những thành phần quan trọng trong môi trường cấy, phospho tham gia vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucletic, tham gia cấu trúc của màng tế bào. Khoáng vi lượng: trước đây, các nguyên tố vi lượng không được nghiên cứu và đưa vào môi trường. Đến những năm gần đây thì các nguyên tố khoáng vi lượng mới được nghiên cứu và đưa vào môi trường. Một số nguyên tố vi lượng như Fe, Cu Bo, Zn, Mn, Clo, Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993). Các nguyên tố này tuy chứa một lượng nhỏ nhưng không thể phủ nhận vai trò quan trọng của các nguyên tố này đối với các hoạt động với enzyme. Sắt tham gia vận chuyển các chất qua màng, ngoài ra sắt đóng vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp chlorophyll, Vitamin: thông thường cây có khả năng tự tổng hợp những vitamin cơ bản cho quá trình phát triển của chúng, tuy nhiên để đảm bảo quá trình phát triển của mẫu cây thì chúng ta cần cung cấp một vài loại vitamin khác (một số loại vitamin thường sử dụng như B1, B2, B6, ). Vitamin rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa bên trong thực vật. Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tùy theo từng giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những 28
  39. Đồ án tốt nghiệp vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1 – 1 mg/L (Trần Văn Minh, 1994). Các chất điều hòa sinh trưởng: là nhóm chất được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển của mẫu cấy. Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng khác nhau là auxin, cytokinin, gibberellin, abscisis acid và ethylen. Mỗi nhóm đều có sự ảnh hưởng riêng đến mẫu cấy.Tùy vào mục đích nghiên cứu mà chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung được bổ sung ở những nồng độ khác nhau. Đường: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nen các chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất carbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô. Đường là nguồn cung cấp carbon chủ yếu và được sử dụng thường xuyên trong hầu hết môi trường trong nuôi cấy mô, kể cả khi nuôi cấy chồi non hoặc tế bào. Khi hấp khử trùng, đường bị phân hủy một phần, thuận lợi cho cây hấp thụ. Có nhiều loại đường khác nhau được sử dụng trong nuôi cấy mô và sự ảnh hưởng của nó cũng khác nhau đến mẫu cấy. Tùy thuộc vào đối tượng và mục đích nghiên cứu có thể lựa chọn loại đường và nồng độ bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994) Nước dừa: Thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, dường, ARN, AND. Đặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là: myo – inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosid của cytokinin. Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nước dừa kích thích sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy. Nước dừa thường được sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980). 29
  40. Đồ án tốt nghiệp Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm Đề tài được thực hiện từ 07/05/2018 – 29/07/2018 tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Nguồn mẫu lan thạch hộc thiết bì Mẫu nuôi cấy ban đầu sử dụng là cây lan thạch hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro có tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới. Hình 3.1. Mẫu nuôi cấy ban đầu 3.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất Bảng 3.1: Bảng thiết bị Máy đo pH Cân phân tích 4 số Tủ cấy vô trùng Máy đo hàm lượng chlorophyll 30
  41. Đồ án tốt nghiệp Máy đo pH Tủ lạnh Nồi hấp autoclave Tủ sấy Bảng 3.2: Bảng dụng cụ Kéo Đèn cồn Dao cấy Ống đong Kẹp dài 25 – 30 cm Chai thủy tinh 500 ml Đĩa cấy Bình xịt cồn Bảng 3.2: Bảng hóa chất Khoáng đa lượng (sigma) Than hoạt tính Khoáng vi lượng (sigma) Aspirin Đường cát trắng Salicylic acid Nước dừa Cồn 96o Agar Cồn 70o 3.3. Điều kiện nuôi cấy Môi trường cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Tùy thuộc từng thí nghiệm sẽ bổ sung các thành phần chất điều hòa sinh trưởng khác nhau, adenin sulfate, L – tyrosin với các nồng độ thay đổi. Môi trường sẽ được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8 sau đó được hấp khử trùng ở 1 atm (121oC) trong 20 phút. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp Môi trường: môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L NAA, nước dừa 10%, pH = 5,8, đường 30 g/L, than hoạt tính 0,5 g/L và agar 8 g/L. 3.4. Nội dung nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiên trong điều kiện phòng thí nghiệm với 16 giờ chiếu sáng trong một ngày, cường độ chiếu sáng là 45 (µmolm-2s-1), nhiệt độ chiếu sáng 25 ± 20C, độ ẩm trung bình là 60 ± 5%. 3.4.1. Thí nghiệm 1.1: : Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo). Mục đích: Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ SA lên sự phát triển của cây lan thạch hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) in vitro sau 4 tuần Cây lan thạch hộc 2 – 3 cm Hình 3.1: Quy trình thực hiện thí nghiệm 1.1 32
  43. Đồ án tốt nghiệp ➢ Cách tiến hành: Cây lan thạch hộc thiết bì in vitro cao 2 cm – 3 cm, được cấy vào bình 500 ml môi trường MS có bổ sung dung dịch Salicylic acid ở những nồng độ khác nhau (0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 3 mg/L). Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình chứa 7 cây, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Bảng 3.3: Bảng bố trí nghiệm ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.1 Nghiệm thức Nồng độ SA (mg/L) S1 1 S2 2 S3 3 ĐC 0 Hình 3.2. Mẫu lan thạch hộc sử dụng để tiến hành thí nghiệm SA và ASA 33
  44. Đồ án tốt nghiệp ➢ Các chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao cây (cm) - Trọng lượng tươi (g) - Trọng lượng khô (g) - Hàm lượng chlorophyll (mg/g).  Kết quả đạt được ở thí nghiệm 1.1 cung cấp cơ sở để tôi tiếp tục thực hiện thí nghiệm 1.2, đó là chọn và khảo sát nồng độ SA bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở khoảng từ 1 – 2 mg/L với độ chia 0,2 mg/L để tìm ra nồng độ thích hợp cho cây lan thạch hộc thiết bì in vitro tăng trưởng tốt nhất. 3.4.2. Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì ➢ Mục đích: Xác định được nồng độ SA thích hợp trong nuôi cấy lan thạch hộc thiết bì in vitro sau 4 tuần. 34
  45. Đồ án tốt nghiệp Cây lan thạch hộc 2 – 3 cm Hình 2. 2: Quy trình thực hiện thí nghiệm 1.2 ➢ Cách tiến hành: Cây lan thạch hộc thiết bì in vitro cao 2 cm – 3 cm, được cấy vào bình 500 ml môi trường MS có bổ sung dung dịch Salicylic acid ở những nồng độ khác nhau (0 mg/L; 1,0 mg/L; 1,2 mg/L; 1,4 mg/L; 1,6 mg/L; 1,8 mg/L; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình chứa 7 cây, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Bảng 2. 4: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của SA sử dụng trong thí nghiệm 1.2 Nghiệm thức Nồng độ SA (mg/L) S1 1,0 S2 1,2 35
  46. Đồ án tốt nghiệp S3 1,4 S4 1,6 S5 1,8 S6 2,0 ĐC 0 ➢ Các chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao cây (cm) - Trọng lượng tươi (g) - Trọng lượng khô (g) - Hàm lượng chlorophyll (mg/g). 3.4.3. Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì ➢ Mục đích: Xác định được ảnh hưởng của ASA lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì in vitro sau 4 tuần. 36
  47. Đồ án tốt nghiệp Cây lan thạch hộc 2 – 3 cm Hình 3.3: Quy trình thực hiện thí nghiệm 2.1 ➢ Cách tiến hành: Cây lan thạch hộc thiết bì in vitro cao 2 cm – 3 cm, được cấy vào bình 500 ml môi trường MS có bổ sung dung dịch ASA ở những nồng độ khác nhau (0 mg/L; 1 mg/L; 2 mg/L; 3 mg/L). Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình chứa 7 cây, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Bảng 3. 5: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.1 Nghiệm thức Nồng độ ASA (mg/L) A1 1 37
  48. Đồ án tốt nghiệp A2 2 A3 3 ĐC 0 ➢ Các chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao cây (cm) - Trọng lượng tươi (g) - Trọng lượng khô (g) - Hàm lượng chlorophyll (mg/g).  Kết quả đạt được ở thí nghiệm 2.1 cung cấp cơ sở để tôi tiếp tục thực hiện thí nghiệm 2.2, đó là chọn và khảo sát nồng độ ASA bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở khoảng từ 1 – 2 mg/L với độ chia 0,2 mg/L để tìm ra nồng độ thích hợp cho cây lan thạch hộc thiết bì in vitro tăng trưởng tốt nhất. 3.4.4. Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên khả năng sinh trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì ➢ Mục đích: Xác định được nồng độ ASA thích hợp trong nuôi cấy lan thạch hộc thiết bì in vitro sau 4 tuần 38
  49. Đồ án tốt nghiệp Cây lan thạch hộc 2 – 3 cm Hình 3.4: Quy trình thực hiện thí nghiệm 2.2 ➢ Cách tiến hành: Cây lan thạch hộc thiết bì in vitro cao 4 cm – 5 cm, được cấy vào bình 500 ml môi trường MS có bổ sung dung dịch ASA ở những nồng độ khác nhau (0 mg/L; 1,0 mg/L; 1,2 mg/L; 1,4 mg/L; 1,6 mg/L; 1,8 mg/L; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình chứa 7 cây, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Ghi nhận kết quả sau 4 tuần nuôi cấy. Bảng 3.6: Bảng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của ASA sử dụng trong thí nghiệm 2.2 Nghiệm thức Nồng độ ASA (mg/L) A1 1,0 A2 1,2 39
  50. Đồ án tốt nghiệp A3 1,4 A4 1,6 A5 1,8 A6 2,0 ĐC 0 ➢ Các chỉ tiêu theo dõi: - Chiều cao cây (cm) - Trọng lượng tươi (g) - Trọng lượng khô (g) - Hàm lượng chlorophyll (mg/g) 3.5. Phương pháp thu chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây - Khối lượng tươi - Khối lượng khô - Lượng Chlorophyll có trong mẫu - Số lượng chồi 3.5.1. Phương pháp xác định chiều cao cây Dùng thước đo từ ngọn cây đến rễ của từng cây trong từng nghiệm thức, sau 4 tuần quan sát. Tiến hành đo, ghi số liệu và so sánh với chiều cao cây của mẫu cấy lúc ban đầu. 3.5.2. Phương pháp xác định khối lượng tươi 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng cân kỹ thuật có hệ số sai số bằng ± 0,0001 (g). Tiến hành cân tổng khối lượng của từng nghiệm thức và ghi số liệu lại để thực hiện phép tính. 3.5.3. Phương pháp xác định khối lượng khô Được xác định bằng cách sấy khô mẫu cấy ở 55 oC trong 48 giờ, cân xác định khối lượng M1. Tiếp tục sấy mẫu ở cùng điều kiện, cân xác định khối lượng M2. Sai số của 2 lần cân liên tiếp là 0,05% xem như khối lượng khô không đổi. Giá trị cân được cuối cùng là khối lượng khô của mẫu. Hình 3.4. Lan Thạch hộc thiết bì khi sấy khô 3.5.4. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll Xác định hàm lượng diệp lục tố: đo hàm lượng diệp lục tố trong mẫu theo phương pháp Aron (1949). Mỗi nghiệm thức lấy ra 3 mẫu, mỗi mẫu cân 25 mg lá, cắt và nghiền 41
  52. Đồ án tốt nghiệp nhuyễn. Cho mẫu lá vào ống nghiệm với 10 ml acetol 80%. Đậy kín ống nghiệm và đặt trong tối ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Sau 72 giờ, tiến hành đo mật độ quang của từng ống nghiệm ở 2 bước sóng là 645 nm (OD645) và 663 nm (OD663) bằng máy đo quang phổ. Công thức tính hàm lượng diệp lục tố a và b: Hàm lượng diệp lục tố (mg/g lá) 10 10 = [(12,7 x OD663) – (2,69 x OD645)] x + [(22,9 x OD645) – (4,68 x OD663)] x Trong đó: A là trọng lượng 25 (g) mẫu lá OD663 là mật độ quang đo ở bước sóng 663 nm OD645 là mật độ quang đo ở bước sóng 645 nm 3.5.5. Phương pháp xác định số lượng chồi Tiến hành đếm tổng số chồi trên cây sau 4 tuần quan sát, ghi lại số liệu để tính toán. 3.6. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm SAS và các hàm trong excel. Số liệu được trình bày bằng biểu đồ. 42
  53. Đồ án tốt nghiệp Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bảng 4.1. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Nghiệm Trọng Trọng Chiều cao Số chồi Hàm lượng thức lượng tươi lượng khô (cm) (cái) chlorophyll (g) (g) (mg/g) S0 0,627b 0,091c 2,67b 8c 0,25b S1 2,447a 0,187a 3,97a 17a 1,79a S2 1,199ab 0,171a 4,00a 13ab 2,21a S3 1,438b 0,136b 3,42b 11bc 0,60b P < 0,05 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. ns: không khác biệt thống kê. Chiều cao 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 (cm) (mg/L) 43
  54. Đồ án tốt nghiệp Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch hộc thiết bì Theo kết quả số liệu ở bảng 4.1, sự phát triển chiều cao của cây lan thạch hộc trong môi trường MS có bổ sung các nồng độ SA khác nhau (1, 2, 3 mg/L) thu được từ các nghiệm thức có sự gia tăng về mặt chiều cao khác nhau rõ rệt so với công thức đối chứng. Kết quả cho thấy SA với nồng độ 2 mg/L trong môi trường nuôi cấy in vitro cho cây có chiều cao cao nhất tương ứng với 4 cm cao hơn 2 lần so với cây được nuôi cấy trên môi trường không có bổ sung SA, tiếp theo là SA với nồng độ 1 mg/L cho cây có chiều cao tương ứng với 3,9 cm và thấp nhất là SA nồng độ 3 mg/L cho cây có chiều cao tương ứng với 3,4 cm. Kết quả thể hiện ở biểu đồ 4.1 thấy rằng nồng độ SA tối ưu cho sự phát triển của cây lan thạch hộc thiết bì là 2 mg/L. Chiều cao của cây lan thạch hộc ở nghiệm thức này tốt hơn so với các nghiệm thức khác và nghiệm thức đối chứng.Sự tăng trưởng và phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô thực vật có thể được cải thiện bằng cách thêm vào môi trường một số chất dinh dưỡng. Theo Abdelnasser Galal và cộng sự (2012), nồng độ của SA có ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của Ziziphus spina – christi. Việc bổ sung SA cải thiện sự tăng trưởng của chồi so với mẫu đối chứng và sản sinh nhiều chồi hơn trong môi trường không có muối. SA thúc đẩy tăng trưởng và chống lại sự ức chế tăng trưởng gây ra bởi các stress phi sinh học (Hibiscus acetosella và cộng sự, 2009). Qua kết quả khảo sát, nồng độ của SA cũng ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của cây lan thạch hộc thiết bì in vitro. 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Tổng số chồi 20 15 10 (cái) 5 0 0 1 2 3 (mg/L) Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên sự hình thành chồi của cây lan thạch hộc thiết bì Kết quả nghiên cứu cho thấy trên môi trường MS có bổ sung SA thì 100% mẫu hình thành cụm chồi và có số chồi trung bình cao hơn trên môi trường không có bổ sung SA ở các nghiệm thức. Môi trường MS có bổ sung SA 1 mg/L mẫu cấy phát triển tốt, cho tỉ lệ phát sinh chồi là cao nhất sau 30 ngày nuôi cấy với số chồi trung bình là 17 chồi. Nghiệm thức còn lại có hệ số nhân chồi thấp hơn tuy nhiên vẫn cao hơn nghiệm thức đối chứng. Tuy nhiên, khi SA tăng cao hơn thì số chồi trên thân giảm, kìm hãm sự kéo dài của chồi và lá dài có màu xanh nhạt. 45
  56. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.1. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA Tổng hàm lượng Chlorophyll 2.50 2.00 1.50 (mg/g) 1.00 0.50 0.00 SA0 SA1 SA2 SA3 (mg/L) Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ lớn) lên tổng hàm lượng Chlorophyll của cây lan thạch hộc thiết bì Chlorophyll là nhóm sắc tố thực vật quan trọng nhất liên quan trực tiếp đến việc chuyển đổi năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học ở cấp độ phân tử. Các sắc tố thực vật này giúp cho sự phát triển của cây trồng thông qua việc hấp thu năng lượng ánh 46
  57. Đồ án tốt nghiệp sáng và được chuyển thành các dạng năng lượng điện tử cho cây trồng sử dụng,do đó hàm lượng chlorophyll là một chỉ tiêu đánh giá về sự tăng trưởng và năng suất ở thực vật. Ờ nghiệm thức được bổ sung SA nồng độ 2 mg/L vào môi trường nuôi cấy thì hàm lượng sắc tố thực vật của cây ở nghiệm thức này không có sự sai khác rõ rệt so với cây được nuôi trên công thức đối chứng (tương ứng với 2,21 mg/g). Chlorophyll là thành phần chính trong quá trình quang hợp vì thế hàm lượng chlorophyll cao rất có lợi cho cây phát triển đặc biệt là khi nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy. Nhưng ở nghiệm thức bổ sung SA nồng độ 3 mg/L SA hàm lượng sắc tố thức vật của cây thấp nhất trong tất cả các nghiệm thức (tương ứng với 0,60 mg/g) dẫn đến việc cây ốm, lá nhỏ và nhạt màu. Trong nghiên cứu này, nồng độ SA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp cho cây lan thạch hộc thiết bì phát triển là 2 mg/L. Bảng 4.2. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ lớn lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Nghiệm Trọng Trọng Chiều cao Số chồi Hàm lượng thức lượng tươi lượng khô (cm) (cái) chlorophyll (g) (g) (mg/g) A0 0,929b 0,068b 2,43b 2c 0,16b A1 2,304a 0,164a 3,63a 8ab 2,31a A2 1,378ab 0,098ab 3,10ab 11a 3,03a A3 0,938b 0,067b 2,80ab 7b 0,23b P < 0,05 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. ns: không khác biệt thống kê TLT TLK 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 (g) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 (mg/L) Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên tổng TLT và TLK của cây lan thạch hộc thiết bì Theo kết quả ở biểu đồ 4.3, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây thu được từ các nghiệm thức cho kết quả ASA nồng độ 1 mg/L có trọng lượng tươi và trọng lượng khô cao nhất lần lượt là 1,840 g và 0,152 g, nặng hơn gần gấp bốn lần cây đối chứng. Ở các nghiệm thức còn lại nồng độ ASA cũng cho năng suất cao hơn đối chứng nhưng không tốt bằng ASA nồng độ 1 mg/L. Nhìn vào biểu đồ 4.3 có thể thấy rằng ASA có ảnh hưởng lớn lên trọng lượng của cây lan thạch hộc và thí nghiệm này cho kết quả trọng lượng cây cao nhất ở ASA nồng độ 1 mg/L. 48
  59. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả khảo sát, nồng độ ASA phù hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy là từ 1 mg/L đến 2 mg/L thì cây lan thạch hộc phát triển tốt nhất và cho chỉ tiêu về trọng lượng cao nhất. Chiều cao 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 (cm) 1.5 1.0 0.5 0.0 AS0 AS1 AS2 AS3 (mg/L) Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ lớn) lên chiều cao của cây lan thạch hộc thiết bì Theo kết quả số liệu ở bảng 4.2, sự phát triển chiều cao của cây lan thạch hộc trong môi trường MS có bổ sung các nồng độ ASA khác nhau (1, 2, 3 mg/L) thu được từ các nghiệm thức có sự gia tăng về mặt chiều cao khác nhau rõ rệt so với công thức đối chứng. Kết quả cho thấy ASA với nồng độ 1 mg/L trong môi trường nuôi cấy in vitro cho cây có chiều cao cao nhất tương ứng với 3,6 cm cao hơn 1,5 lần so với cây được nuôi cấy trên môi trường không có bổ sung ASA, tiếp theo là ASA với nồng độ 2 mg/L cho cây có chiều cao tương ứng với 3,1 cm và thấp nhất là ASA nồng độ 3 mg/L cho cây 49
  60. Đồ án tốt nghiệp có chiều cao tương ứng với 2,8 cm. Kết quả thể hiện ở biểu đồ 4.4 thấy rằng nồng độ ASA tối ưu cho sự phát triển của cây lan thạch hộc là 1 mg/L. Chiều cao của cây lan thạch hộc ở nghiệm thức này tốt hơn so với các nghiệm thức khác và nghiệm thức đối chứng. Hình 4.2. Sự phát triển về chiều cao và trọng lượng của lan thạch hộc thiết bì trên môi trường MS + ASA Bảng 4.3. Bảng khảo sát ảnh hưởng của SA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Nghiệm Trọng Trọng Chiều cao Số chồi Hàm lượng thức lượng tươi lượng khô (cm) (cái) chlorophyll (g) (g) (mg/g) S0 0,581c 0,045c 2,17c 5c 0,38b S1 0,885bc 0,068bc 2,70bc 6ab 0,42b S2 1,655a 0,127a 2,87ab 5c 0,97a S3 1,774a 0,137a 3,27a 9a 0,97a 50
  61. Đồ án tốt nghiệp S4 1,299ab 0,085b 3,07ab 8ab 0,97a S5 1,106bc 0,100ab 2,73ab 5c 0,45b S6 0,874bc 0,067bc 2,57bc 5c 0,47b P < 0,05 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. ns: không khác biệt thống kê 51
  62. Đồ án tốt nghiệp Hình 4.3. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + SA (nồng độ nhỏ) Chiều cao 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 SA0 SA1 SA1,2 SA1,4 SA1,6 SA1,8 SA2 Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của SA (dãy nồng độ nhỏ) lên chiều cao của cây lan thạch hộc thiết bì Theo kết quả số liệu ở bảng 4.3, sự phát triển chiều cao của cây lan thạch hộc trong môi trường MS có bổ sung các nồng độ SA khác nhau thu được từ các nghiệm thức có sự gia tăng về mặt chiều cao khác nhau rõ rệt so với công thức đối chứng. Kết quả cho thấy SA với nồng độ 1,4 mg/L trong môi trường nuôi cấy in vitro cho cây có chiều cao cao nhất tương ứng với 3,3 cm cao hơn 1,5 lần so với cây được nuôi cấy trên môi trường không có bổ sung SA. Kết quả thể hiện ở biểu đồ 4.6 thấy rằng nồng độ SA tối ưu cho sự phát triển của cây lan thạch hộc là 1,4 mg/L. Chiều cao của cây lan thạch hộc ở nghiệm thức này tốt hơn so với các nghiệm thức khác và nghiệm thức đối 52
  63. Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.4. Bảng khảo sát ảnh hưởng của ASA ở nồng độ nhỏ lên cây lan thạch hộc thiết bì sau 4 tuần quan sát. Nghiệm Trọng Trọng Chiều cao Số chồi Hàm lượng thức lượng tươi lượng khô (cm) (cái) chlorophyll (g) (g) (mg/g) A0 0,451c 0,053b 2,07c 5b 0,18c A1 0,702c 0,054b 2,67bc 6b 0,27bc A2 1,451b 0,113ab 3,60a 8a 2,28a A3 2,516a 0,193a 3,50a 6b 0,36b A4 0,867c 0,128ab 3,00ab 5b 0,35b A5 0,757c 0,054b 2,97ab 5b 0,30bc A6 0,718c 0,051b 2,63bc 5b 0,26c P < 0,05 53
  64. Đồ án tốt nghiệp Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. ns: không khác biệt thống kê Tổng số chồi 9 8 7 6 5 (cái) 4 3 2 1 0 AS0 AS1 AS1,2 AS1,4 AS1,6 AS1.8 AS2 (mg/L) Biểu đồ 4.7. Ảnh hưởng của ASA (dãy nồng độ nhỏ) lên tổng số chồi của cây lan thạch hộc thiết bì Trên môi trường có bổ sung ASA, phát triển thân cả về chiều dài lẫn bề rộng tốt nhất trên môi trường MS + ASA 1,2 mg/L, chồi phát triển to khỏe và bộ rễ mọc dài ra. Tuy nhiên, khi ASA tăng cao hơn thì số chồi trên thân giảm, bộ rễ mọc dài và thân cao, ốm, lá ngả sang vàng. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp Kết quả nghiên cứu cho thấy trên môi trường MS có bổ sung ASA thì 80% mẫu hình thành chồi trung bình cao hơn trên môi trường không có bổ sung ASA ở các nghiệm thức. Môi trường MS có bổ sung ASA 1,2 mg/L các mẫu cấy phát triển tốt, cho tỉ lệ phát sinh chồi là cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy với số chồi trung bình là 8 chồi. Nghiệm thức còn lại có hệ số nhân chồi thấp hơn tuy nhiên vẫn cao hơn nghiệm thức đối chứng. Hình 4.4. Sự hình thành và phát triển chồi của lan Thạch hộc trên môi trường MS + ASA (nồng độ nhỏ) 55
  66. Đồ án tốt nghiệp Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của Salicylic acid và Aspirin trong tăng trưởng và phát triển lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) trong điều kiện in vitro, tôi đưa ra được một số kết luận sau: − Kết quả thực nghiệm ở nồng độ lớn và các nghiệm thức khác nhau: đối với cả SA và ASA trong khoảng nồng độ từ 1 – 2 mg/L lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) phát triển tốt hơn các nồng độ còn lạ, cả số lượng chồi, chiều cao, TLT và TLK tăng lên đáng kể cho thấy hiệu quả của SA và ASA trong việc kích thích sinh trưởng và phát triển của lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo). − Kết quả thực nghiệm ở nồng độ nhỏ ở SA và các nghiệm thức khác nhau cho thấy ở khoảng nồng độ 1,4 mg/L lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) có những chuyển biến rõ rệt nhất, số lượng chồi, TLT và TLK tăng cho thấy hiệu quả của SA trong khoảng nồng độ 1,4 mg/L có thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển chồi mới của lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo). − Kết quả thực nghiệm ở nồng độ nhỏ ỏ ASA và các nghiệm thức khác nhau cho thấy ở khoảng nồng độ 1,2 mg/L lan Thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) phát triển dài ra về thân và rễ, số lượng chồi hình thành trên thân cũng nhiều hơn so với mẫu ĐC. 5.2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm hạn chế nên chưa có điều kiện để đi sâu hơn nữa về các vấn đề liên quan đến nghiên cứu này. Để có thể hoàn thiện và nâng cao tính khả thi của nghiên cứu, tôi đề xuất một số kiến nghị sau đây: 56
  67. Đồ án tốt nghiệp − Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên sự tăng sinh khối cây lan thạch hộc thiết bì. − Nghiên cứu so sánh chất kháng khuẩn, kháng nấm tốt nhất trên môi trường nuôi cấy cây lan thạch hộc thiết bì in vitro. − Nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm từ sinh khối cây lan thạch hộc thiết bì. 57
  68. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Minh Chơn (2004). Giáo trình Chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Trường Đại học Cần Thơ – Khoa Nông Nghiệp. 2. Nguyễn Thanh Thuận (2015). Giá trị dược liệu của cây lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale). Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 6 (25) – 2015. 3. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, TrầnThế Mai (2012). Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng Thảo Long nhãn). Tạp chí Khoa học và Phát triển, 10(2): 263 – 271. 4. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2014). Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch hộc thiết bì). Tạp chí Khoa họa và Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1274-1282. 5. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Nhân giống in vtro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl. Tạp chí Khoa học và phát triển 2013, tập 11, số 7: 917-925. 6. Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Lý Anh (2011). Ảnh hưởng của dinh dưỡng qua lá đến quá trình sinh trưởng và phát triển của lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl). Tạp chí Khoa học và Phát triển 2011, Tập 9, số 6 trang 903-911. 7. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001). Vi nhân giống phong lan nhóm Dendrobium trên quy mô công nghiệp, nhân giống in vitro. Tạp chí Khoa học Công nghệ, 1: 9. II. Tài liệu tiếng Anh 8. Abdelnasser Galal (2012). Improving effect of Salicylic Acid on the Multipurpose tree Ziziphus spina – christi (L.) willd tissue culture. American Journal of Plant Sciences, 2012, 3, 947-952. 58
  69. Đồ án tốt nghiệp 9. Ana Cláudia Pacheco, Carolina da Silva Cabral, Érica Sabrina da Silva Fermino and Catariny Cabral Aleman (2013). Salicylic acid-induced changes to growth, flowering and flavonoids production in marigold plants. ISSN 1996-0875 © 2013 Academic Journals. 10. Chu Chu, Huimin Yin, Li Xia, Dongping Cheng, Jizhong Yan and Lin Zhu (2014). Discrimination of Dendrobium officinale and its common adulterants by Combination of normal light and fluorescence microscopy. Molecules 2014, 19, 3718 - 3730; doi: 10.3390/molecules19033718. 11. Jozef Kováčik, Jiří Grúz, Martin Bačkor, Miroslav Strnad, Miroslav Repčák (2008). Salicylic acid – induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. 12. Mohammad Babar Ali, Eun–Joo Hahn and Kee –Yoeup Paek (2007). Methyl Jasmonate and Salicylic Acid induced oxidative stress and accumulation of Phenolics in Panxa ginseng bioreactor root suspension cultures. Molecules 2007, 12, 607-621. 13. Thiago Alves Napoleão, Giuliana Soares, Camilo Elbe Vital, Carla Bastos, Robson Castro, Marcelo Ehlers Loureio, Andrea Giordaro (2017). Methyl jasmonate and salicylic acid are able to modify cell wall but only salicylic acid alters biomass digestibility in the model grass Brachypodium distachyon. Plant Science 263 (2017) 46- 54. 14. S. Govindaraju, P. Indra Arulselvi (2016). Effect of cytokinin combined elicitors (L – phenylalanine, salicylic acid and chitosan) on in vitro propagation, secondary metabolites and molecular characterization of medicinal herb – Coleus aromaticus Benth (L). 15. Hanxiao Tang, Tianwen Zhao, Yunjie Sheng, Ting Zheng, Lingzhu Fu, and Yon gsheng Zhang (2017). Dendrobium officinale Kimura et Migo: A Review on Its Ethnopharmacology, Phytochemistry, Pharmacology, and Industrialization. Hindawi 59
  70. Đồ án tốt nghiệp Evidence – Based Complenetary and Alternative Medicine volume 2017, article ID 7436259, 19 pages. III. Tài liệu trên Internet 16. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây lan. tiet/Cac-yeu-to-anh-huong-den-sinh-truong-cua-cay-lan-2364.html. 17. Tiên dược thạch hộc tía doanh thu 15 tỷ đồng/ha/năm. ha-nam.1198/. 18. Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo Thạch hộc thiết bì. dendrobium.html. 19. Hệ thống tinh kháng tập nhiễm SAR. em.blogspot.com/. 20. Cây Thiết bì Thạch hộc – Dendrobium candidum. candidum.html. 21. Interferon. n/9e41facf. 22. Thạch hộc tía sinh tân dịch, dưỡng thận, bổ khí huyết. hoc-tia.html. 23. Does aspirin help plants grow better? plants-grow-better 24. Are There Effective Natural Alternatives to Aspirin? natural-alternatives-to-aspirin/ 60
  71. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC • Trắc nghiệm phân hạng chiều cao ở môi trường có SA (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.276667 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.9628 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 4.0000 3 SA2 A B A 3.9667 3 SA1 B A B A 3.4200 3 SA3 B B 2.6667 3 SA0 • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi ở môi trường có SA (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.193282 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.8278 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T i
  72. Đồ án tốt nghiệp A 2.4470 3 SA1 B 1.4380 3 SA2 B B 1.1993 3 SA3 B B 0.6267 3 SA0 • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô ở môi trường có SA (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.000273 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.0311 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 0.18733 3 SA2 A A 0.17100 3 SA1 B 0.13567 3 SA3 C 0.09133 3 SA0 • Trắc nghiệm phân hạng hàm lượng chlorophyll ở môi trường có SA (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.166775 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.7689 ii
  73. Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 2.2100 3 SA2 A A 1.7867 3 SA1 B 0.6033 3 SA3 B B 0.2533 3 SA0 • Trắc nghiệm phân hạng tổng số chồi ở môi trường có SA (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 3.25 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 3.3943 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 16.667 3 SA2 A B A 13.333 3 SA1 B B C 10.667 3 SA3 C C 0.2533 3 SA0 • Trắc nghiệm phân hạng chiều cao ở môi trường có AS (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.276667 iii
  74. Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.9904 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 3.6333 3 AS1 A B A 3.1000 3 AS2 B A B A 2.8000 3 AS3 B B 2.4333 3 AS0 • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi ở môi trường có AS (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.39317 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 1.1806 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 2.3043 3 AS1 A B A 1.3783 3 AS2 B B 0.9377 3 AS3 B B 0.9290 3 AS0 • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô ở môi trường có AS (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. iv
  75. Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.001988 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.0839 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 0.16433 3 AS1 A B A 0.09833 3 AS2 B B 0.06833 3 AS3 B B 0.06667 3 AS0 • Trắc nghiệm phân hạng hàm lượng Chlorophyll ở môi trường có AS (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 0.007033 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.1579 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 2.31000 3 AS2 A A 2.28000 3 AS3 B 0.30333 3 AS1 B B 0.16000 3 AS0 • Trắc nghiệm phân hạng tổng số chồi ở môi trường có AS (0 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L) The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N v
  76. Đồ án tốt nghiệp NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise errorrate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 8 Error Mean Square 3.916667 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 3.7263 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 11.333 3 AS1 A B A 8.000 3 AS2 B B 7.000 3 AS3 B C 2.667 3 AS0 vi
  77. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng chiều cao ở môi trường có SA (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi ở môi trường có SA (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) vii
  78. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô ở môi trường có SA (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) viii
  79. Đồ án tốt nghiệp ix
  80. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng hàm lượng chlorophyll ở môi trường có SA (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) • Trắc nghiệm phân hạng tổng số chồi ở môi trường có SA (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) x
  81. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng chiều cao ở môi trường có AS (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) xi
  82. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng tươi ở môi trường có AS (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) xii
  83. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng trọng lượng khô ở môi trường có AS (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) xiii
  84. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng hàm lượng chlorophyll ở môi trường có AS (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) xiv
  85. Đồ án tốt nghiệp • Trắc nghiệm phân hạng tổng số chồi ở môi trường có AS (0 mg/L, 1,0 mg/L, 1,2 mg/L, 1,4 mg/L, 1,6 mg/L, 1,8 mg/L, 2 mg/L) xv
  86. Đồ án tốt nghiệp xvi
  87. Đồ án tốt nghiệp 1