›

Đồ án Nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu vỏ quýt và thí nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh E.Coli

pdf 56 trang thiennha21 12/04/2022 5450
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu vỏ quýt và thí nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh E.Coli", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_mot_vai_yeu_to_anh_huong_den_qua_trinh_chun.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dầu vỏ quýt và thí nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh E.Coli

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Tuyết mai MSSV: 1215100009 Lớp: 12HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Tuyết Mai MSSV: 1215100009 Lớp : 12HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  3. BM05/QT04/ĐT Khoa: Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1. Họ và tên sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm 1) Nguyễn Thị Tuyết Mai MSSV: 1215100009 Lớp: 12HSH01 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2. Tên đề tài : NGHIÊN CỨU MỘT VÀI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT TINH DẦU VỎ QUÝT VÀ THÍ NGHIỆM TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH E.COLI 3. Các dữ liệu ban đầu : 4. Các yêu cầu chủ yếu : Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt trên vi khuẩn E.coli bằng phương pháp đục lỗ thạch. 5. Kết quả tối thiểu phải có: 1) Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly. 2) Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly. 3) Xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu. 4) Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ tối nguyên liệu / dung môi P.E 5) Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt trên vi khuẩn E.coli bằng phương pháp đục lỗ thạch. Ngày giao đề tài: ./ / Ngày nộp báo cáo: ./ / TP. HCM, ngày tháng năm . Chủ nhiệm ngành Giảng viên hướng dẫn chính (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) Giảng viên hướng dẫn phụ (Ký và ghi rõ họ tên)
  4. LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan bài đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm và trình bày đồ án tốt nghiệp dưới sự hướng dẫn và chỉnh sửa của giảng viên hướng dẫn. Em xin cam đoan không sao chép đồ án dưới bất kỳ hình thức nào. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 4 tháng 4 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tuyết Mai
  5. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: • Ban giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM, Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. • Giảng viên hướng dẫn đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn và sửa chữa những sai sót cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. • Tập thể lớp 12HSH01 đã gắng bó, giúp đỡ tôi trong suốt 1,5 năm học vừa qua. • Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con học tập, đã yêu thương và động viên con trong những lúc khó khăn và đặc biệt luôn tin tưởng và yêu thương con. TP. HCM, ngày 4 tháng 4 năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Tuyết Mai
  6. MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH .v DANH MỤC BẢNG vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 4 1.1.1. Vị trí phân loại 4 1.1. 2. Đặc điểm thực vật 4 1.1.3. Kỹ thuật canh tác và thu hái của cây quýt 6 1.2. Tình hình trồng và phát triển cây quýt ở nước ta và thế giới 12 1.2.1. Tình hình trồng và phát triển cây quýt ở nước ta 12 1.2.2. Tình hình trồng và phát triển cây quýt trên thế giới 13 1.3. Tìm hiểu chung về tinh dầu .13 1.3.1. Những nét đặc trưng của tinh dầu 13 1.3.2. Tính chất lý hóa của tinh dầu .15 1.4. Một số phương pháp tách chiết tinh dầu 16 i
  7. 1.4.1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 16 1.4.2. Phương pháp ly trích bằng chiếu xạ vi sóng 19 1.5. Đánh giá chất lượng tinh dầu bằng phương pháp hóa lý 22 1.5.1. Xác định chỉ tiêu cảm quan 22 1.5.2. Xác định vị 22 1.5.3. Xác định mùi 22 1.5.4. Xác định chỉ tiêu hóa - lý 22 1.6. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro 27 1.6.1. Mục đích 27 1.6.2. Những yếu tố ảnh hưởng 27 1.6.3. Một số phương pháp thử in vitro 28 1.7. Ứng dụng của tinh dầu vỏ quýt 29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.2. Hóa chất và dụng cụ 31 2.2.1. Hóa chất 31 2.2.2. Dụng cụ 31 2.3. Địa điểm thực hiện thí nghiệm 33 2.4. Nội dung nghiên cứu 33 2.4.1. Thí nghiệm 1 xác định thời gian làm héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trích ly 33 ii
  8. 2.4.2. Thí nghiệm 2 xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu trích ly 33 2.4.3. Thí nghiệm 3 xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu 34 2.4.4. Thí nghiệm 4 xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E đến hàm lượng trích ly tinh dầu 34 2.4.5. Thí nghiệm 5 khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt bằng phương pháp đục lỗ thạch 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Tinh dầu vỏ quýt 36 3.2. Kết quả xác định thời gian làm héo nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trích ly 36 3.3. Kết quả xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu trích ly 37 3.4. Kết quả xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu 38 3.5. Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu / dung môi đến hàm lượng trích ly tinh dầu 39 3.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt bằng phương pháp đục lỗ thạch 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1. Kết luận 41 4.2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤC LỤC 44 iii
  9. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TP.HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh WTO : World trade organization (Tổ chức thương mại quốc tế) NN&PTNT : Nông nghiệp và phát triển nông thôn KHVN : Khoa học Việt Nam KH&CN : Khoa học và Công nghệ CNSH : Công nghệ Sinh học H : Giờ P.E : eter dầu hỏa FAO : Food and Agriculture Organization (tổ chức lương thực và nông nghiệp) ĐBSCL : Đồng Bằng Sông Cửu Long E.coli : Escherichia coli - iv -
  10. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây quýt 4 Hình 1.2. Thân, lá, hoa, vỏ quýt 5 Hình 2.1. Vỏ quýt trước khi xay 31 Hình 2.2. Vỏ quýt đã xay 31 Hình 2.3. Tủ sấy 32 Hình 2.4. Cân phân tích 32 Hình 2.5. Tủ ấm 370C 32 Hình 2.6. Hệ thống chưng cất pháp lôi cuốn hơi nước 33 Hình 2.7. Phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường đặc 35 Hình 3.1. Tinh dầu vỏ quýt 36 Hình 3.2. Biểu đồ xác định thời gian làm héo nguyên liệu 37 Hình 3.3. Biểu đồ xác định thời gian trích ly 38 - v -
  11. DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian làm héo nguyên liệu 36 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian trích ly tinh dầu 37 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly 38 Bảng 3.4. Kết quả tỉ lệ ảnh hưởng của nguyên liệu/dung môi P.E 39 Bảng 3.5. Kích thước vòng vô khuẩn trong 36h 40 - vi -
  12. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung. Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học. Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn hợp chất tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà. Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đã không ngừng phát triển và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể. Trên thế giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của con người. Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ở thực vật phát triển từ những năm 1950. Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất này như các alkaloid, terpenoid, phenolic được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá. Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được. Vỏ các loài cây citrus: cam, chanh, quýt, bưởi từ lâu đã được sử dụng để sản xuất tinh dầu ở các nước công nghiệp trên thới giới như Mỹ, Ý. Tinh dầu citrus có mùi thơm dễ chịu, hàm lượng limonen cao được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm. Trong các nghiên cứu gần đây còn cho thấy limonen còn có tác dụng tán sỏi, phá khối u 2. Tính cấp thiết của đề tài Những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức - 1 -
  13. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y. Tinh dầu hiện nay được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm Tinh dầu làm nguồn hương liệu có nguồn gốc từ cây cỏ thiên nhiên ngày càng được con người đặc biệt chú ý và ưa chuộng. Việt Nam với điều kiện thiên nhiên nhiệt đới rất thuận lợi cho việc hình thành và phát triển các loại thực vật, trong đó các loại cây có chứa tinh dầu đang được khẳng định là dồi dào và độc đáo. Trong đó, giống Citrus họ Rutaceae tuy có tiềm năng lớn song chưa được khai thác, tận dụng, hầu như chỉ mới sử dụng múi, chưa chế biến và tận dụng tinh dầu từ vỏ quả. Xuất phát từ thực tế nói trên nhóm chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu và nghiên cứu một vài yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chưng cất tinh dẩu vỏ quýt và thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên vi khuẩn gây bệnh E.coli. 3. Mục tiêu của đề tài Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt trên vi khuẩn E.coli bằng phương pháp đục lỗ thạch. - 2 -
  14. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 4. Nội dung đồ án Đồ án tốt nghiệp bao gồm các chương như sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp. Chương 3: Kết quả và thảo luận. Chương 4: Kết luận và kiến nghị. - 3 -
  15. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Vị trí phân loại Cây Quýt có tên khoa học là Citrus reticulate. Giới (regnum) : Plantae ((Thực vật) Bộ (ordo) : Sapindales. Họ (familia) : Rutaceae. Chi (genus) : Citrus (cam quýt) Loài (species) : C. reticulate. Vỏ quả phơi khô gọi là trần bì Pericarpium citri deliciosae. Tinh dầu vỏ quả - Oleum Mandarinae. Hình 1.1. Cây quýt. 1.1.2. Đặc điểm thực vật 1.1.2.1. Đặc điểm hình thái cây quýt Rễ: rễ trụ có rễ nhánh rất phát triển. Có nấm (Micorhiza) sống cộng sinh ở lớp biểu bì hút nước cung cấp cho cây, đồng thời cung cấp muối khoáng và lượng nhỏ chất hữu cơ. Do đặc điểm này mà rễ thường tập trung gần lớp đất mặt. Thích hợp với đất có sa cấu sét nhẹ, thoáng khí không bị rã khi gặp mưa. Thân: thuộc loại thân gỗ, dạng bán bụi, cành phân tán mạnh. Thân và cành có gai và rụng khi đạt độ tuổi già nhất định. Cành phát triển theo lối hợp trục, khi cành mọc dài dến một khoảng nhất định thì dừng lại, các mầm bên dưới đỉnh sinh trưởng sẽ mọc ra, các cành thứ cấp này cũng mọc đến một khoảng nhất định thì dừng lại và các mầm bên dưới đỉnh sinh trưởng lại tiếp tục phát triển giống như cũ. Cành được phân thành các loại như cành mang trái, cành mẹ, cành dinh dưỡng, cành vượt. - 4 -
  16. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Lá: quýt thuộc dạng lá đơn, mọc xen, thắc ở giữa chia lá thành cánh lá và phiến lá, lá có cuốn lá, gân lá hình lông chim, lá bóng dày có chứa tinh dầu. Khi già lá co lại, vỏ cây cũng có mùi thơm. Hoa: nhỏ màu trắng, mọc đơn ở kẽ lá, có 6 cánh hoa xếp thành hai vòng, nhị hợp. Bầu có 6 - 10 ngăn. Hoa có mùi thơm hấp dẫn côn trùng. Quả: hình cầu, hai đầu dẹt, khi chín màu vàng cam đỏ, vỏ mọng, nhẵn bóng, hơi lồi lõm dễ bóc, trong có những múi xếp hình nan hoa bánh xe. Khi chín ăn ngọt ngon. Trong múi có chứa nhiều hạt. Hình 1.2. Thân, lá, hoa, vỏ của quýt 1.1.2.2. Phân loại quýt ở nước ta: Quýt có nguồn gốc ở vùng Nam Á, Đông Nam Châu Á, trong đó có Việt Nam. Quýt được trồng khắp nơi trên đất nước ta, mỗi vùng có một giống ngon nổi tiếng. Giống Quýt là loại cây có múi được trồng nhiều nhất ở nước ta, trong đó có Cam sành (ta gọi là cam nhưng các nhà khoa học thế giới xếp vào loại Quýt). Quýt là loại cây dễ trồng và hầu như khắp mọi nơi. Nước ta phân thành nhiều loài quýt (chua, hôi hay ngọt) nhưng vỏ quả đều dùng làm thuốc được. Cây quýt được trồng khắp nơi ở nước ta, nhất là các vùng Nghệ An, Quảng Bình, Hà Tĩnh, Quảng Ninh, Nam Hà, Thái Bình, Phú Thọ, Bắc Giang, Thái Nguyên, Hà Nội, Đồng Tháp Trồng bằng chiết cành hay bằng hạt. - 5 -
  17. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Quýt đường: Tán cây trung bình, trái hơi dẹp hai đầu, vỏ mỏng dễ bóc, múi rời dễ tách, vỏ trái màu vàng xanh, láng, thịt trái màu cam, mềm có nhiều nước, vị ngọt, thơm, trọng lượng trái trung bình 170 g. Quýt tiều: Vỏ màu cam đậm, bề mặt vỏ láng, nổi múi khá rõ. Trái hình cầu, dẹp hai đầu, vỏ rất dễ bóc, thịt trái màu cam đậm, mềm, vị hơi chua hơn quýt đường, khá nhiều nước, ít hạt. Trọng lượng trái trung bình 180 g. Quýt Kinh: là giống Cam sành phổ biến rộng rãi cả nước. Các nhà khoa học thế giới cho rằng Quýt Kinh (Cam sành) là cây lai giữa cam và quýt nên quả có cả đặc tính của cam, quýt. Họ xếp là quýt nhưng ở ta lại gọi là cam. Quýt hồng: là loại cây ăn trái thích nghi với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng khá đặc biệt. Huyện Lai Vung (Đồng Tháp) là vùng chuyên canh cây quýt hồng, hiện toàn huyện có diện tích khoảng 1200 ha nằm trên ba xã là Long Hậu, Tân Phước, Tân Thành. Quýt Hương Cần: nổi tiếng nhờ được trồng trên đất phù sa của sông Bồ, thuộc Giáp Kiền, làng Hương Cần. Người ta thường dùng phương pháp chiết cành để nhân giống giúp cho cây trồng mới phát triển nhanh và không bị thoái hóa giống sau nhiều năm. Quýt rất ngon, ngọt, thơm, được nhiều người ưa thích, là quả tốt để ăn tráng miệng, để làm nước giải khát, làm mứt. 1.1.3. Kỹ thuật canh tác và thu hái của cây quýt 1.1.3.1. Kỹ thuật canh tác a. Chuẩn bị đất: Líp phải rộng 5 m, độ cao cách mặt nước ngầm tối thiểu 80 cm, mương rộng từ 1,5 – 2 m. b. Chuẩn bị giống: Giống được trồng ngoài líp ươm khoảng một năm tuổi. Cây con được trồng bằng hạt hoặc cành chiết. Chọn cây con khoẻ phát triển tốt, có dáng thẳng, chiều cao từ 0,8 - 1,2 m, lá to có đọt non phát triển tốt. Nếu giống trồng bằng hạt thì chọn trái của những cây có tuổi từ 5 năm tuổi trở lên, cây xay trái, trái to, vỏ đẹp, trái có ít múi và múi to. - 6 -
  18. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Nếu giống là nhánh chiết tiêu chuẩn chọn cây lấy cành chiết tương tự như cây lấy hạt. Chọn những nhánh phát triển tốt để chiết. Giống phải đảm bảo tuyệt đối sạch bệnh. Thường xuyên cắt tỉa cành vượt, cành bị sâu bệnh, những cành yếu chậm phát triển. Quản lí sâu vẽ bùa và một số bện khác c. Cách chăm sóc: Các yếu tố ảnh hưởng đến cây quýt Nhiệt độ: Quýt hồng có biên độ nhiệt khá rộng từ 15 – 32oC, ẩm độ cao >70% nhiệt độ không khí ảnh hưởng trực tiếp đến toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Ánh sáng: Quýt hồng hợp với ánh sáng tán xạ, ánh sáng có cường độ 10.000 - 15.000 lux, tương đương với ánh sáng lúc 8 giờ và 16 - 17 giờ vào những ngày quan mây mùa hè. Do đó nên bố trí trồng dày hợp lí nhằm tạo bóng râm cho cây quýt. Nước: Quýt hồng có khả năng chịu ẩm và chịu hạn tốt. Ẩm độ và nước ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình bốc thoát hơi nước của cây, ảnh hưởng đến sinh trưởng và nhất là làm cho vỏ dày, ít thơm, chất lượng kém. Quýt cần nhiều nước nhất là thời kỳ ra hoa kết trái nhưng cũng rất sợ ngập úng. Gió: Quýt hồng vùng Lai Vung chịu ảnh hưởng trực tiếp của gió mùa Tây nam và Đông bắc, vì lúc này cây đang mang trái. Chỉ có gió Tây nam mới gây thiệt hại đến năng suất, gió Đông bắc cộng với nhiêt độ giảm đây là điều kiện thích hợp cho cây quýt hồng phát triển. Vì thế trái chín vào tháng 11 - 12 âm lịch thường có màu đẹp hơn so với trái chín nghịch mùa (những tháng còn lại trong năm). Đất đai: Quýt hồng là cây rất kén đất chỉ có vùng Lai Vung là thích hợp, tại đây đất thông thoáng, thoát nước tốt, hàm lượng hữu cơ cao lớn hơn 3.5%. Đặc biệt là đất không bị rã khi trời mưa gây hồ mặt. Đất phải có tầng canh tác cao hơn 80 cm, pH đất từ 5,5 - 6,5 là thích hợp. Các yếu tố dinh dưỡng: Nhu cầu dinh dưỡng của quýt hồng gồm thành phần đa lượng và thành phần vi lượng. Thành phần đa lượng gồm có: - 7 -
  19. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Đạm (Nitrogen) Đạm là yếu tố có vai trò quyết định đến năng suất và phẩm chất của trái, thúc đẩy quá trình phát triển cành, lá và đọt mới cho cây. Thiếu đạm, lá mất diệp lục màu lá chuyển sang vàng, nhánh mang trái nhỏ, lá bị rụng, trái nhỏ, vỏ trái mỏng, năng suất giảm. Thừa đạm, ảnh hưởng xấu đến chất lượng trái, trái to vỏ dày chậm lên màu. Hai dạng đạm chính được hấp thụ từ đất là: nitrate (NO3-) và amonium (NH4+). Quá trình hấp thu vận chuyển đạm lên cây bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố bao gồm nhiệt độ, đất, rễ, mức sống của cây và mức độ oxy trong đất. Lân (Phosphorus) Lân rất cần cho quá trình phân hoá mầm hoa. Thiếu lân cành lá sinh trưởng kém, lá rụng nhiều, cành lá không phát triển được, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng trái. Trong đất hiện diện ở hai dạng vô cơ và hữu cơ. Kali (Potassium) Kali là phần rất cần thiết cho phẩm chất trái. Cây đủ kali sẽ cho trái to, ngọt, đặc biệt là vỏ trái có khả năng chịu đựng tốt trong việc vận chuyển cũng như trong bảo quản. Giai đoạn nhu cầu dinh dưỡng của cây cũng tăng do đó cần phải tăng lượng phân cho cây. Lượng phân bón cho 1 ha như sau: định kỳ hai tháng bón một lần Phân chuồng 50 kg, NPK 20 kg Giai đoạn kích thích cây ra hoa hoa: Giai đoạn này phải đảm bảo đủ nước và tăng cường thêm lượng phân có bổ sung thêm phân DAP. Lượng phân bón cho 1 ha như sau: Phân chuồng 100 kg, NPK 10 kg, DAP 30 kg. Giai đoạn sau khi đậu trái sau khi đậu trái 45 ngày ngoài nước tưới thì nhu cầu phân như sau phân chuồng 200 kg, NPK 25 kg, DAP 20 kg. Định kỳ 1,5 - 2 tháng bón một lần Ngoài nhu cầu phân và nước giai đoạn này cần chú ý các loại côn trùng gây hại chính như: nhện đỏ, nhện trắng, nhện vàng, sâu vẽ bùa, sâu đục vỏ trái. Phòng trừ bằng cách thường xuyên quan sát phát hiện sớm nếu phát hiện nhện gây hại thì phun một số loại thuốc như Alphamai, Nisuran, Casudan, F94, Octus - 8 -
  20. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai d. Các loại sâu và bệnh thường gặp trên cây quýt: Trong quá trình sinh trưởng và phát triển cây quýt hồng thường gặp một số loài côn trùng, nhện gây hại và các bệnh sau: Côn trùng và nhện gây hại Nhóm nhện (nhện đỏ, nhện trắng, nhện vàng) nhện đỏ (Panonychus citri) là phổ biến và chiếm mật số cao. Nhện tấn công trên lá và trái, chúng chích, cạp, hút nhựa của lá và trái. Trên lá vết cạp, hút để lại những chấm nhỏ li ti trên mặt lá, lá bị hại có thể khô dính lại trên cây trong một thời gian dài sau đó. Trên trái, nhện thường sống tập trung ở cuốn trái, đít trái và phần lõm của vỏ trái. Khi trái còn non nhện chích và hút dịch ở lớp biểu bì làm vỡ tuyến tinh dầu trên vỏ trái, sau đó vỏ trái bị biến màu, các vết thương trên vỏ trái khô dần tạo nên những đóm sần sùi trên vỏ trái hay còn gọi là da cám phòng trị bằng cách phun thuốc hoá học như Comite, Trebon, Pegasus, Bi 58, Phosalone, Kelthane, Zineb nếu có nhện xuất hiện định kỳ 15 - 21 ngày phun một lần. Sâu vẽ bùa (Phyloccnistis citrella): Trứng được đẻ gần gân chính của lá. Sau khi nở, sâu đục lòn dưới mặt lá thành những đường hầm giữa hai mặt lá để ăn lớp tế bào nhu mô diệp lục. Sâu ăn tới đâu thường bài tiết tới đó, vệt phân kéo dài một đường liên tục thành một sợi chỉ dài. Đường đục rộng dần lên theo độ tuổi của sâu. Nếu bị gây hại nặng thì lá quýt có triệu chứng lá bị cong queo lại, kích thước lá giảm rõ rệt, từ đó làm giảm khả năng quang hợp của lá, chồi non ngừng tăng trưởng và có thể trơ trụi không có lá. Sâu vẽ bùa còn là nguyên nhân lan truyền và phát triển bệnh loét do vi khuẩn xathomonas campestris gây nên. Phòng trị bằng cách phun thuốc hoá học như: Confidor, Dầu Oleoestec ngoài tác dụng diệt ấu trùng còn có khả năng diệt trứng. Ngoài ra có thể phòng ngừa bằng cách tỉa cành, bón phân hợp lí, cắt tỉa cùng lúc để chồi ra đồng loạt để hạt chế lây lan sâu vẽ bùa liên tục trong năm. Sâu đục vỏ trái (Prays citri): Sâu tấn công khi trái còn rất nhỏ, vết đục tạo nên những u, sần trên trái. Nếu bị nặng trái sẽ rụng, khi sâu tấn công lúc trái lớn - 9 -
  21. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai để lại u, sần rất to làm mất giá trị thương phẩm của trái, mặc dù chất lượng thịt trái không bị ảnh hưởng. Phòng trị: Theo dõi, phát hiện triệu chứng sâu mới gây hại trên trái khi cây vừa tượng trái. Thu gom những trái đang nhiễm đem chôn để diệt trừ sâu gây hại Nếu thường xuyên bị nhiễm có thể phun thuốc đặc trị khi trái còn non, phun hai lần liên tiếp mỗi lần cách nhau 7 - 10 ngày. Bệnh gây hại Bệnh loét (ghẻ lõm): Vết bệnh lúc đầu nhỏ, hơi úng nước, có màu xanh đậm, xung quanh có màu quần vàng, vết bệnh sau đó lớn dần có màu vàng nhạt và nâu nhạt, mọc nhô lên mặt lá, vỏ trái hoặc vỏ cành. Kích thước vết bệnh từ 1- 5 mm, vết bệnh có hình tròn, bề mặt vết bệnh sần sùi, nhìn kỹ ở giữa vết bệnh có lõm xuống, nhiều vết bệnh liên kết lại tạo thành mảng lớn hình dạng bất định Bệnh thường gây hại cả trên lá, trái và cành. Bệnh thường lây lan và gây hại nặng vào mùa mưa do ẩm độ không khí cao, hoặc do mưa làm văng nguồn bệnh từ lá bệnh sang lá khác. Các vườn trồng dày, bón nhiều đạm, vườn cây con thường bị nhiễm nặng hơn. Phòng trị: Cắt tỉa cành, lá, trái bị bệnh. Thu gom các cành lá, trái bị bệnh rụng đem tiêu hủy, nhất là trước khi tưới nước ra hoa phải đảm bảo vườn sạch bệnh không phun nước tưới lên tán lá vào buổi chiều mát, chỉ tưới vào gốc cây không tưới thừa nước. Tăng cường bón thêm phân kali cho vườn phun ngừa bằng các loại thuốc gốc đồng như Copper Zin 85WP, Coc 85WP, Kocide với liều lượng 20 – 30 g cho bình 8 lít. Phun vào giai đoạn trước khi mùa mưa đến hoặc trước khi tưới nước ra hoa. Phun trị bằng các loại thuốc sau: Kasuran 50WP, NewKasuran 16,6WP, Kasumin 2L, Starner 20WP, Sasa 40WP, Batocide 12WP, Cuprimacin 500 81WP với liều lượng 20 – 30 g cho bình 8 lít thời gian 7 - 10 ngày phun một lần Bệnh vàng lá rụng lá (thối rễ vàng lá chết nhanh): Cây bệnh lá vẫn lớn bình thường, nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngã màu vàng xanh sau đó rụng đi, nhất là khi có gió hoặc ta lắc nhẹ cây. Các lá già rụng trước sau đó - 10 -
  22. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai đến các lá trên, nhìn vào cây thấy gốc trơ trụi chỉ còn lại đọt lá. Lúc đầu bệnh chỉ biểu hiện ở một vài nhánh vàng lá rụng lá, sau đó toàn bộ cây sẽ bị rụng lá. Cây bệnh cho nhiều chồi ngắn nhỏ, nhiều hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn. Đào rễ lên thấy phía cành bị rụng lá rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, rễ bị sọc nâu lan dần vào rễ lớn. Bệnh nặng tất cả các rễ đều bị thối cây chết. Bệnh do nấm Fusarium solani tấn công vào chóp rể làm rễ bị thối. Cây bị ngập úng, xiết nước ra hoa làm rễ suy yếu hoặc do tuyến trùng (Pratylenchus coffea, Radopholus similis, Tylenchulus semipenetrans, Meloidogyne sp.) tương quan với nấm fusarium solani và kết hợp với nấm Penicillium và Aspergiluss (phân hủy gỗ), sẽ làm rễ cây bị bệnh nặng hơn. Phòng trị: thường xuyên thăm vườn theo dõi phát hiện sớm bệnh, cắt bỏ những rễ bị thối. Bón thêm phân lân, kali tăng khả năng đề kháng của rễ đối với bệnh hoặc tưới MKP để phục hồi nhanh hơn. Sử dụng các loại thuốc sau Thiram 85WP, Benomyl 50WP, Ridomil 72WP, Deroral 70WP với liều lượng 30 – 50g cho một bình 8 lít. 1.1.3.2. Thu hái của cây quýt a. Xử lí ra hoa Cách xử lí ra hoa truyền thống đơn giản nhất đó là xiết nước vào khoảng tháng giêng tháng hai âm lịch. Sau khi thu hoạch trái thì tiến hành cắt tỉa đợi khi cành mang hoa phát triển đầy đủ và lá vừa già thì tiếng hành xiết nước (không tưới nước để cây thiết nước và lá sẽ héo đi), khoảng 20 ngày thấy lá sào thì tưới nước trở lại. Cây sẽ tươi lại và sẽ trổ hoa trong thời gian khoảng 15 ngày kể từ khi tưới nước trở lại cho cây. Ngoài biện pháp trên ta có thể xử lí ra hoa nghịch mùa, bằng cách che cao su trên mặt líp không cho nước mưa rơi xuống mặt líp vì thường những tháng này rời vào lúc có mưa, kết hợp với không tưới nước, có thể kết hợp phun GA3 lên lá. Khi đó cây thiếu nước lá sẽ héo đi, sau đó tiến hành tưới nước trở lại cây cũng sẽ ra hoa như kỹ thuật xiết nước vào mùa khô. - 11 -
  23. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Điều kiện quyết định cho kỹ thuật xử lí ra hoa nghịch mùa thành công là không gặp lúc mưa nhiều, lượng nước mưa cung cấp qua lá không đủ cho nhu cầu của cây. b. Thu hoạch trái Khi trái chín có màu hồng nhạt chính là lúc có thể thu hoạch được. Khi thu hoạch phải đảm bảo đúng kỹ thuật tránh cây mất sức và đâm chồi kém vào mùa sau. 1.2. Tình hình trồng và phát triển quýt ở nước ta và thế giới 1.2.1. Tình hình trồng và sản xuất quýt ở nước ta Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp với nhiều loại cây trồng trong đó có các loại cây ăn quả, đặc biệt là các loài cam quýt. Trên phạm vi cả nước, quýt đạt khoảng 87,2 ngàn ha, hàng năm cung cấp khoảng 606,5 ngàn tấn cho thị trường. Trong các vùng trồng cam, quýt ở nước ta, ĐBSCL là vùng trồng lớn nhất, chiếm đến 56% diện tích và 71% sản lượng. Ở ĐBSCL, các tỉnh trồng nhiều cam, quýt là Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Đồng Tháp Cam sành, quýt đường, quýt hồng, cam soàn là những loại trái đặc sản của vùng này. Trong tổng sản lượng cam quýt sản xuất trong nước, đại bộ phận thu hoạch vào các tháng 9 - 12, ngoài trừ các tỉnh ĐBSCL có mùa vụ thu hoạch kéo dài suốt năm nhờ điều kiện khí hậu thời tiết, tuy nhiên phần lớn sản lượng cam quýt của vùng này hiện vẫn cho thu hoạch trong các tháng 9 - 12. Vùng Đông Bắc có diện tích và sản lượng lớn thứ hai sau ĐBSCL, chiếm 15% diện tích và 8% sản lượng cam quýt cả nước. Các tỉnh Bắc Trung Bộ là vùng trồng cam quýt lớn thứ 3 ở nước ta, chiếm 10,7% diện tích và 7,1% sản lượng cam, quýt của cả nước, hai địa phương trồng nhiều là Nghệ An, Hà Tĩnh. Sự xuất hiện của cam, quýt sản xuất của vùng này với đặc điểm là màu sắc vỏ đẹp, hấp dẫn. Vùng Đông Nam Bộ có khoảng 7.300 ha trồng cam, quýt nhưng năng suất thấp và diện tích mới trồng khá lớn nên sản lượng cam, quýt cung cấp cho thị - 12 -
  24. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai trường hiện chỉ đạt khoảng 24,4 ngàn tấn/năm. Đồng Nai là địa phương trồng nhiều cam, quýt nhất, chiếm đến 53% tổng diện tích cam, quýt của vùng này. Mùa vụ thu hoạch cam, quýt chính vụ của các tỉnh miền Đông Nam Bộ tương đối gần với mùa vụ thu hoạch cam, quýt chính vụ ở các tỉnh ĐBSCL. Tuy nhiên, ĐBSCL có lợi thế hơn trong việc cho cam, quýt ra trái nghịch vụ. 1.2.2. Tình hình trồng và phát triển quýt trên thế giới Cam quýt nổi tiếng thế giới hiện nay được trồng phổ biến ở những vùng có khí hậu khá ôn hòa thuộc vùng Á nhiệt đới hoặc vùng khí hậu ôn đới ven biển chịu ảnh hưởng của khí hậu đại dương. Các nước trồng cam quýt nổi tiếng hiện nay đó là: Địa Trung Hải và Châu Âu bao gồm các nước: Tây Ban Nha, Italia, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập, Isaren, Tunisia, Algeria. Vùng Bắc Mỹ bao gồm các nước: Hoa Kỳ, Mexico. Vùng Nam Mỹ bao gồm các nước: Braxin, Venezuela, Argentina, Uruguay. Vùng Châu Á bao gồm các nước: Trung Quốc và Nhật Bản. Các hòn đảo Châu Mỹ bao gồm các nước: Jamaica, CuBa, Cộng hòa Dominica. Theo thống kê của FAO, năm 2000 tổng sản lượng cam quýt trên thế giới là 85 triệu tấn và phần tiêu thụ khoảng 79,3 triệu tấn, tăng trưởng hàng năm 2,85%. Tiêu thụ sẽ tăng lên ở các nước đang phát triển và giảm ở các nước phát triển. Các nước xuất khẩu cam quýt chủ yếu đó là: Tây Ban Nha, Israel, Maroc, Italia. Các giống cam quýt trên thị trường được ưa chuộng là: Washington, Navel, Valenxia Late của Maroc, Samouti của Isarel, Maltaises của Tunisia, và các giống quýt Địa trung hải như: Clemention, quýt Đỏ Danxy và Unshiu được rất nhiều người ưa chuộng. 1.3. Tổng quan về tinh dầu 1.3.1. Những nét đặc trưng của tinh dầu Tinh dầu gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi (chủ yếu là các tecpen và các tritecpenonit), có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc cung cấp nguyên liệu - 13 -
  25. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai tinh dầu. Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3000 loài, trong đó có 150 - 200 loài có ý nghĩa công nghiệp. Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng. Ở nhiệt độ thường hầu hết tinh dầu ở thể lỏng, có khối lượng riêng bé hơn 1 (trừ một vài tinh dầu như quế, đinh hương ), không tan trong nước hoặc tan rất ít, nhưng lại hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như ancol, ete, chất béo Tinh dầu bay hơi với hơi nước, có vị cay và ngọt, nóng bỏng và có tính sát trùng mạnh. Tinh dầu có hai loại: Nguyên chất và tinh dầu hỗn hợp. Tinh dầu nguyên chất: Hoàn toàn không có độc tố không có chất bảo quản hóa học nên rất an toàn cho người sử dụng và mang lại kết quả nhanh khi điều trị. Tinh dầu xuất phát từ nhiều quốc gia. Một trong các nhà cung cấp tinh dầu tại Việt Nam là công ty Tinh Dầu Thiên Nhiên. Tinh dầu không nguyên chất: là tinh dầu được pha trộn với các loại tinh dầu khác nhau. Thành phần hóa học của tinh dầu gồm tecpen và những dẫn xuất chứa oxi của tecpen (như ancol, anđehit, xeton, ete ). Mặc dù có nhiều cấu tử như vậy nhưng thường một vài cấu tử chính có giá trị và có mùi đặc trưng cho tinh dầu đó. Phương pháp phổ biến để tách tinh dầu từ cây cỏ là chưng cất bằng lôi cuốn hơi nước. Nếu các chất trong tinh dầu bị phân hủy bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước thì người ta sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ (ví dụ như ete dầu hỏa, benzen ). Về mặt thực hành tinh dầu có thể xem như “một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có nguồn gốc từ thực vật”, chỉ có một số ít nguồn gốc từ động vật. Tinh dầu được phân bố rộng trong hệ thực vật, đặc biệt tập trung một số họ như họ hoa tán, họ cúc, họ hoa môi, họ long não, họ sim, họ cam, họ gừng Tinh dầu được chiết từ mọi bộ phận của cây như cánh hoa, lá, cành, rễ, vỏ, trái, hạt, vỏ cây Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không ổn định. Hàm lượng tinh dầu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, di truyền, đất trồng, phân bón, thời tiết, ánh sáng, thời điểm thu hoạch. Trong các bộ phận của cây hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau. Cần phải hiểu biết như vậy để xác định thời gian thu hái cho - 14 -
  26. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai hàm lượng tinh dầu nhiều nhất và chất lượng tốt nhất. Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất và không được sử dụng trở lại cho hoạt động sống của cây. 1.3.2. Tính chất lý - hóa của tinh dầu 1.3.2.1. Tính chất vật lý Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp đặc biệt như menthol, camphor là ở thể rắn. Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách thu dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu, như tinh dầu quế có màu nâu sẫm, tinh dầu thymus có màu đỏ. Tinh dầu thường có vị cay và hắc. Tỷ trọng của tinh dầu thường khoảng 0,80 - 0,95, có một số tinh dầu nặng nước như tinh dầu đinh hương, tinh dầu quế. Tỷ trọng thay đổi theo thành phần học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon tecpenic thì tỷ trọng tinh dầu thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao hơn. Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 - 1,56 Chỉ số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc nhân thơm. Nếu trong tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều nối đôi thì chỉ số khúc xạ cao. Chỉ số khúc xạ bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ. Khi đó chỉ số khúc xạ ở những nhiệt độ khác nhau thì cho kết quả khác nhau, nhiệt độ càng lớn thì chỉ số khúc xạ biến thiên theo hướng giảm và ngược lại. Góc quay cực (α)D của tinh dầu thể hiện khả năng hòa tan của tinh dầu trong các loại dung môi, nếu (α)D càng lớn thì có thể hòa tan tốt trong dung môi phân cực. Ngược lại (α)D càng bé thì có thể hòa tan tốt trong dung môi không phân cực. Nhiệt độ ảnh hưởng tới góc quay cực, nhiệt độ khi đo góc quay cực tăng thì góc quay cực cũng tăng theo và ngược lại. - 15 -
  27. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Vì tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định. Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất. Ví dụ, hợp chất tecpen có điểm sôi là 150 - 1600C, hợp chất sesquitecpen có điểm sôi cao hơn khoảng 250 – 280oC, còn các hợp chất polytecpen có điểm sôi trên 300oC. Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn. Khi hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc hà, tinh dầu xá xị 1.3.2.2. Tính chất hóa học của tinh dầu Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, nước, tinh dầu dễ bị oxy hóa và có thể bị nhựa hóa một phần. Ancol trong tinh dầu bị oxy hóa biến thành anđehit, anđehit biến thành axit. Các hợp chất có nối đôi dễ bị oxi hóa hoặc tham gia vào phản ứng cộng hợp. Các hợp chất ceton và anđehit dễ bị ancol hóa tạo nhựa khi có mặt của kiềm. Nhiều thành phần có các nhóm chức khác nhau có thể tham gia các phản ứng hóa học, làm thay đổi tính chất của tinh dầu. 1.4. Một số phương pháp tách chiết tinh dầu 1.4.1. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 1.4.1.1. Nguyên tắc chung Phương pháp lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, hai chất này đều bay hơi. Nếu áp suất của nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất của môi trường, thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước. Phương pháp này có ưu điểm về năng lượng do nhiệt độ sôi của hỗn hợp thấp hơn nhiệt độ sôi của nước (100oC) trong khi nhiệt độ sôi của tinh dầu lớn hơn 100oC ở áp suất khí quyển. Ví dụ, khi chưng cất lôi cuốn tinh dầu thông bằng hơi nước ở áp suất khí quyển, nhiệt độ sôi của dầu thông là 158oC nhưng nhiệt độ sôi của hỗn hợp khoảng 95oC. - 16 -
  28. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Chưng cất lôi cuốn hơi nước không đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp, nhưng có khả năng cất gần như triệt để tinh dầu có trong nguyên liệu. Ngoài ra, phương pháp còn cho phép phân ly các cấu tử có trong tinh dầu thành những phần riêng biệt có độ tinh khiết cao hơn dựa vào sự khác biệt về tính chất bay hơi. 1.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng chính trong quá trình chưng cất a. Sự khuếch tán Khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu. Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi. Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục hòa tan vào lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết. Đồng thời những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước. Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong chưng cất phải sử dụng hơi nước quá nhiệt, chú ý tránh để nguyên liệu bị khô. Nhưng nếu lượng nước sử dụng thừa quá thì cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần dễ tan trong nước. Nguyên liệu được làm vỡ vụn càng nhiều càng tốt, cần cho lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định nào đó để hơi nước có thể đi vào lớp này đồng đều và dễ dàng hơn. b. Sự thủy giải Những cấu phần este trong tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho ra axit và ancol khi đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự chưng cất lôi cuốn hơi nước phải thực hiện trong thời gian càng ngắn càng tốt. c. Nhiệt độ Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi tiến hành chưng cất phải điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp với từng giai đoạn. Sau khi cấu phần dễ bay hơi - 17 -
  29. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai đã lôi cuốn đi hết có thể dùng hơi nước quá nhiệt (trên 100oC) để chưng cất (nên thực hiện việc này ở giai đoạn cuối cùng của chưng cất). Tuy nhiên, hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên ta phải hạn chế thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu. Các yếu tố trên đều có mối liên hệ lẫn nhau khi tăng nhiệt độ thì sự khuếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước cũng sẽ tăng nhưng sự phân hủy tinh dầu cũng sẽ tăng theo. 1.4.1.3. Chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp Một số chất không tan trong nước nhưng dễ bị hơi nước nóng cuốn theo, người ta lợi dụng tính chất này để tách chất ra khỏi hỗn hợp phản ứng. Cách tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp: Cho chất định cất lôi cuốn hơi nước vào bình cất (tối đa bằng 1/3 thể tích của bình). Nối hệ thống bình cất với bình đun hơi nước nóng. Bình nước nóng có nối với ống thủy tinh dài tận đáy để theo dõi áp suất của hệ thống cất. Khi áp suất hệ thống cao thì nước ở ống thủy tinh tăng hoặc phun ra ngoài, lúc đó cần mở khóa 3 thông để thông với áp suất khí quyển. Sau khi lắp xong hệ thống, mở khóa 3 thông để theo dõi áp suất của hệ thống, đun nước sôi ở bình nước. Nước ở bình nước sôi chỉ khoảng 2/3 thể tích bình. Mở nước ở ống sinh hàn để làm lành hơi. Đóng khóa 3 thông để hơi nước sôi qua bình cất. Theo dõi lượng chất cất ra, khi kết thúc ngừng đun, mở khóa 3 thông, lấy chất cất ra. Khi chưng cất cần chú ý chất có thể đóng rắn trong sinh hàn gây tắc ống, dễ nổ nên cần phải thận trong khi sử dụng ống sinh hàn. Những ưu nhược điểm chung của phương pháp chưng cất Ưu điểm Thiết bị khá gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản. Trong quá trình chưng cất, có thể phân chia các cấu tử trong hỗn hợp bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian. Thời gian chưng cất tương đối nhanh, nếu thực hiện gián đoạn chỉ cần 5 - 10 giờ, nếu liên tục thì 1 giờ đến 2 giờ 30 phút. - 18 -
  30. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử tinh dầu chịu được nhiệt độ cao. Nhược điểm Không áp dụng phương pháp chưng cất vào những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất sẽ kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng tụ. Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử dễ bị thủy phân. Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi hoặc không bay hơi trong thành phần của nguyên liệu ban đầu mà những thành phần này rất cần thiết vì chúng có tính chất định hương rất cao như sáp, nhựa thơm Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm nhưng tụ hỗn hợp hơi. Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật (nhiệt độ, áp suất), thời gian chưng cất kéo dài. Nguyên liệu dễ bị cháy, khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thiết bị. 1.4.2. Ly trích bằng chiếu xạ vi sóng 1.4.2.1. Đại cương về vi sóng Vi sóng (micro - onde, microwave) là sóng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng. Sóng điện từ này được đặc trưng bởi: Tần số f, tính bằng Hetz (Hz = cycles/s), là chu kỳ của trường điện từ trong một giây, nằm giữa 300 MHz và 30 GHz. Vận tốc là 300.000 km/giây. Độ dài sóng λ (cm) là đoạn đường đi của vi sóng trong một chu kỳ, liên hệ với tần số theo công thức λ = c/f. Hầu hết các lò vi sóng gia dụng đều sử dụng tần số 2450 MHz, ở tần số này λ = 12,24 cm. 1.4.2.2. Hiện tượng làm nóng Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong chiều của điện trường. Dưới tác động của điện trường một chiều, - 19 -
  31. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai các phân tử lưỡng cực có khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sở của hiện tượng phát nhiệt do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao (2,45 x 109 Hz), điện trường này sẽ gây ra một xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất. Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ. Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng. 1.4.2.3. Tính chất Vi sóng có đặc tính là có thể đi xuyên qua được không khí, gốm sứ, thủy tinh, polimer và phản xạ trên bề mặt các kim loại. Độ xuyên thấu tỉ lệ nghịch với tần số, khi tần số tăng lên thì độ xuyên thấu của vi sóng giảm. Đối với một vật chất có độ ẩm 50% với tần số 2450 MHz có độ xuyên là 10 cm. Ngoài ra, vi sóng có thể lan truyền trong chân không, trong điều kiện áp suất cao Năng lượng của vi sóng rất yếu, không quá 10-6 eV, trong khi năng lượng của một nối cộng hóa trị là 5 eV, do đó bức xạ vi sóng không phải là một bức xạ ion hóa. Có một số công trình đã khẳng định được tính vô hại của vi sóng đối với sinh vật. Chẳng hạn, khi nghiên cứu sự phát triển của enzyme trong điều kiện vi sóng, người ta nhận thấy rằng ảnh hưởng của vi sóng rất giống ảnh hưởng của các gia nhiệt thông thường. Vi sóng cung cấp một kiểu đun nóng không dùng sự truyền nhiệt thông thường. Với kiểu đun nóng bình thường, sức nóng đi từ bề mặt của vật chất lần vào bên trong, còn trong trường hợp sử dụng vi sóng, vi sóng xuyên thấu vật chất - 20 -
  32. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai và làm nóng vật chất ngay từ bên trong. Vi sóng tăng hoạt những phân tử phân cực, đặc biệt là nước. Nước bị đun nóng do hấp thu vi sóng bốc hơi tạo ra áp suất cao tại nơi bị tác dụng, đẩy nước đi từ tâm của vật đun ra đến bề mặt của nó. 1.4.2.4. Ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích). Lưu ý là mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giống nhau do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ. Kết quả này được phản ánh qua thời gian ly trích. Trong sự chưng cất hơi nước, việc ly trích tinh dầu có thể thực hiện trong điều kiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệu chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng). Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục (trường hợp lượng nước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự ly trích chấm dứt. Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất có chứa oxygen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém) nên sự ly trích chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng. 1.5. Đánh giá chất lượng tinh dầu bằng phương pháp hóa lý 1.5.1. Xác định chỉ tiêu cảm quan Xác định dạng bề ngoài và màu sắc của tinh dầu bằng cách quan sát một mẫu tinh dầu có thể tích là 20 ml đựng trong ống nghiệm thủy tinh xem tinh dầu trong hay đục. - 21 -
  33. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 1.5.2. Xác định vị Xác định vị của tinh dầu bằng cách trộn một giọt dầu với 1 g đường kính rồi nếm. 1.5.3. Xác định mùi Xác định mùi của tinh dầu bằng cách nhỏ vài giọt tinh dầu lên một mảnh giấy thấm rồi ngửi cứ 15 phút 1 lần trong khoảng 1 giờ. 1.5.4. Xác định chỉ tiêu lý - hóa 1.5.4.1. Xác định tỷ trọng Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của khối lượng tinh dầu ở 25oC với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở nhiệt độ 25oC. Cách xác định Lấy lọ đo tỷ trọng có ngấn chuẩn thể tích 25 ml hoặc 50 ml đem rữa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng kỹ bằng nước cất rồi tráng lại bằng axeton hay bằng cồn và ete. Đặt lọ và nút đã khô, nguội lên đĩa cân bên phải của một cân phân tích cùng một số quả cân có khối lượng G đủ để cân bằng một bình cố định đã đặt ở đĩa cân bên trái. G xác định chính xác đến 0,001 g. Lấy lọ ra, rót nước cất vào cho đầy quá ngấn chuẩn một chút, chú ý đừng để cho bọt khí bám vào thành lọ. Đặt lọ vào môi trường ổn nhiệt ở 25oC ngập cho đến cổ lọ. Để trong khoảng 20 – 30 phút cho nhiệt độ của nước đạt đến 25oC rồi lấy giấy lọc hay giấy thấm đã cắt thành dãy nhỏ thấm đỡ nước thừa trong lọ vừa đúng đến ngấn chuẩn. Lau khô cổ lọ kể cả phần phía trên ngấn chuẩn rồi đậy nút kín rồi lấy lọ ra khỏi môi trường đều nhiệt. Lau khô bên ngoài lọ và để yên trong khoảng 15 - 20 phút cho nhiệt độ trở lại bình thường. Sau đó đặt lọ lên đĩa cân bên phải cùng với một số lượng quả cân có khối lượng G1 đủ để cân bằng với bì cố định đã đặt ở đĩa cân bên trái. G1 xác định với độ chính xác như đối với G ở trên. Lại lấy lọ ra đổ hết nước đi, vẩy cho khô, tráng lại bằng axeton hay bằng cồn ete rồi làm cho khô như đã chỉ dẫn ở trên. - 22 -
  34. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Qua phễu có cuốn nhỏ (hoặc ống tiêm kéo dài thành phễu) đổ tinh dầu vào lọ cho đầy quá ngấn chuẩn một chút, chú ý đừng để cho tinh dầu dây vào cổ lọ và đừng để bọt khí bám vào thành lọ. Đặt vào môi trường đều nhiệt ở 250C trong khoảng 20 – 30 phút, đều chỉnh tinh dầu cho đến đúng ngấn chuẩn, lấy ra lau khô, đem cân, tất cả đều làm như chỉ dẫn ở trên. Khối lượng các quả cân dung lần này là G2 với độ chính xác như trên. Tính kết quả: G – G2 Tỷ trọng (d) tính bằng công thức: d = G – G1 Trong đó: G: khối lượng của các quả cân ứng với khi cân lọ không, tính bằng gam (g). G1: khối lượng của các quả cân ứng với khi cân lọ có đựng nước cất, tính bằng gam (g). G2: khối lượng của các quả cân ứng với khi cân lọ có đựng tinh dầu, tính bằng gam (g). Sai lệch giữa hai lần xác định liên tiếp không lệch quá 0,001. Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của kết quả hai lần xác định liên tiếp. Nếu không thể xác định tỷ trọng của tinh dầu ở nhiệt độ 25oC thì xác định ở nhiệt độ ghi trong bảng tiêu chuẩn về tinh dầu đó. 1.5.4.2. Xác định chỉ số khúc xạ Xác định chỉ số khúc xạ ở 25oC theo phương pháp đo góc giới hạn bằng khúc xạ kế kiểu Abbe có đèn natri hay bộ phân bổ chính triệt tiêu hiện tượng tán sắc. Cách xác định: Điều chỉnh máy: Cho một dòng nước có nhiệt độ thích hợp chảy qua bộ lăng kính, lấy bông hút nước hay vải mềm tẩm ete hoặc axeton lau sạch mặt lăng kính. Nhỏ hai đến ba giọt nước cất lên mặt lăng kính mờ bên dưới, nhanh tay và nhẹ nhàng nâng lăng kính này lên áp vào lăng kính bên trên rồi khóa lại. Khi - 23 -
  35. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai nhiệt kế chỉ đúng 25oC vặn núm xoay độ lăng kính và vành chia độ cho đến khi số 1,3325 của vành chia độ trùng với vật chuẩn. Nhìn vào thị kính, nếu không có đèn natri mà dùng ánh sáng thường thì sẽ có hiện tượng tán sắc, khi đo vặn núm xoay bộ phân bổ chính nhằm triệt tiêu hiện tượng đó để thấy rõ ranh giới giữa hai miền sáng và tối của thị trường. Rồi xoay thị kính để nhìn thấy thật sắc nét vạch chuẩn chữ thập giữa thị trường. Nếu ranh giới giữa hai miền sáng và tối của thị trường cắt đúng ngay vạch chữ thập thì máy tốt. Nếu cắt chưa đúng dùng chìa khóa riêng kèm theo máy cắm vào trụ vuông nhỏ ở sườn ống ngắm và vặn từ từ đưa ranh giưới giữa hai miền sáng và tối cắt đúng giao điểm của vạch chữ thập. Rút chìa khóa cất đi. Như thế là máy điều chỉnh xong. Đo chỉ số khúc xạ: Mở hộp lăng kính, lấy bông hút nước (hay vải mềm) lau khô mặt lăng kính rồi lại lấy bông hút tẩm ete hoặc axeton lau lại một lần nữa. Rỏ 2 - 3 giọt tinh dầu lên mặt lăng kính mờ bên dưới rồi lắp lăng kính này vào lăng kính bên trên như đã chỉ dẫn. Khi nhiệt kế chỉ đúng 25oC thì nhìn vào thị kính, sữa hiện tượng tán sắc nếu có rồi từ từ vặn núm xoay bộ lăng kính để đưa ranh giới giữa hai miền sáng tối cắt đúng giao điểm của vạch chữ thập. Nhìn sang vành chia độ và đọc chỉ số khúc xạ ở ngang vạch chuẩn. Xác định lại vị trí giữa hai ranh giới sáng và tối và đọc chỉ số ba lần. Lấy giá trị trung bình làm kết quả. Sai số cho phép của kết quả là 0,0002. 1.5.4.3. Xác định góc quay cực Góc quay cực được xác định ở nhiệt độ phòng. Cách tiến hành: Điều chỉnh máy: Đổ nước cất vào đày ống của phân cực kế, chú ý tránh có bọt khí bên trong. Vặn chặt nắp đậy ống. Đặt ống vào máng của phân cực kế đã bật đèn sáng. Nhìn vành thị kính, lúc đó sẽ nhìn thấy những miền sáng không đồng đều nhau. Xoay thị kính cho vừa mắt để nhìn ranh giới giữa các miền cho thật sắc nét. Xoay đĩa chia độ (tức là xoay kính phân tích) cho những miền của - 24 -
  36. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai thị trường đều sáng như nhau. Xem vạch chuẩn trên vành chia độ để xác định sai lệch của điểm 00 so với điểm 0 của du xích. Đo góc quay cực: Lấy ống trong máy ra, tháo nước đi và lau ống cho thật khô. Đổ tinh dầu cho đầy ống và tiếp tục làm như khi điều chỉnh máy. Sau khi đã chia dĩa chia độ cho những miền của thị trường sáng điều nhau xem vạch chuẩn trên vành chia độ và đọc kết quả. Hiệu chỉnh với độ sai lệch của điểm 00 so với điểm 0 của du xích (kết quả khi điều chỉnh máy) để được trị đúng của góc quay cực. 1.5.4.4. Xác định độ hòa tan trong etanol Tỷ trọng của etanol 90% (% theo thể tích) ở 25oC là 0,8098 – 0,8117, etanol 96% là 0,8038 - 0,8063. Cách pha: Muốn pha etanol 90% lấy 937,5 ml etanol 96% rồi pha loãng bằng nước cất cho tới 1 lít, đo tỷ trọng và điều chỉnh. Cách xác định: Ngâm lọ đựng tinh dầu cần thử cho đến khi tinh dầu có nhiệt độ 25oC. Dùng pipet có ống nghiệm hay một ống đo dung tích 20 ml có chia vạch và có nút mài. Nếu không có ống chia vạch có thể dung một bình nón dung tích 50 ml. Từ buret nhỏ dần dần etanol có nồng độ xác định vào ống đựng tinh dầu. Ống này phải ngâm trong nước có nhiệt độ 20oC. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 ml vào đậy nút lại và lấy ống ra lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu rồi lại ngâm vào nước ở 25oC. Tiếp tục nhỏ etanol và làm như trên cho đến khi được một dung dịch trong suốt. Ghi lượng etanol đã dùng. Để đỡ mất thời giờ có thể sử dụng sơ bộ bằng cách cho mỗi lần 0,5 hay 1ml etanol để biết độ hòa tan ở khoảng nào. Sau đó làm lại để xác định độ hòa tan chính xác đến 0,2 ml. Trường hợp nhiệt độ phòng trên 25oC có thể hòa tan một cách bình thường nghĩa là không cần phải ngâm ống sau mỗi lần nhỏ dung môi. Chỉ sau khi dung dịch trở nên trong suốt mới cần ngâm ống vào nước có nhiệt độ thích hợp để - 25 -
  37. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai nhiệt độ của dung dịch trở về 25oC. Nếu không có hiện tượng đục trở lại thì coi là được và ghi thể tích etanol đã dùng. 1.5.4.5. Xác định chỉ số axit Phương pháp xác định dựa trên sự trung hòa axit tự do trong chất thử dung dịch kiềm: RCOOH + KOH RCOOK + H2O Từ lượng kiềm đã dùng, biết khối lượng của phân tử axit, tính ra lượng axit. Hàm lượng axit được biểu thị bằng chỉ số axit nghĩa là lượng mg KOH cần để trung hòa 1 g chất thử hoặc biểu thị bằng phần trăm. Cách tiến hành: Cân chính xác 2 g tinh dầu không lẫn nước cho vào một bình cầu để và phòng hóa dung tích từ 100 – 200 ml có ống làm lạnh bằng không khí dài 1m, đường kính 0,1 cm. Cho vào 10 ml etanol trung tính 96% ở 20oC, nhỏ vào 10 giọt dung dịch phenolphthalein trung tính 0,2 g trong 100 ml etanol. Chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1 N đến xuất hiện màu hồng vững bền trong 30 giây. Tính kết quả: Chỉ số axit (X1) tính theo công thức: V . 5,61 X1 = G Trong đó: V (ml): thể tích dung dịch KOH 0,1 N trong rượu đã dùng để chuẩn độ. G: lượng chất thử đã cân tính bằng gam. 5,61: số mg KOH có trong 1ml dung dịch KOH 0,1 N trong rượu. Hàm lượng axit theo phần trăm (X2) tính bằng công thức: V x M x 100 V x M X2 = = 10 x G x 1000 x b G x 100 x b - 26 -
  38. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Trong đó: M: khối lượng phân tử của axit. b: độ bazơ của axit. G: lượng chất thử đã cân tính bằng gam. 1.6. Tổng quan phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro 1.6.1. Mục đích Thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn In vitro là xác định thuốc nghiên cứu có tác dụng trên vi khuẩn nào và mức độ tác dụng in vitro như thế nào. Có rất nhiều phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro, cũng như có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng góp phần vào sự nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc nghiên cứu. Nếu các yếu tố này thay đổi sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả nghiên cứu. 1.6.2. Những yếu tố ảnh hưởng 1.6.2.1. Điều kiện vô trùng Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn phải tiến hành trong điều kiện vô trùng, tránh đưa vi khuẩn khác vào làm nhiễu kết quả nghiên cứu. Tất cả các dụng cụ dùng trong thí nghiệm, môi trường nuôi cấy, không khí làm việc điều phải tiệt trùng. Mặt khác, trong các môi trường làm việc không được có chất khoáng khuẩn nào có thể gây ra dương tính giả, ngộ nhận là tác dụng do thuốc nghiên cứu, mà thực ra do chất kháng sinh ta đã để lẫn vào. 1.6.2.2. Tính tan của chất thử Đây là vấn đề rất quan trọng. Chất thử phải tan thì kết quả thử mới chính xác. Khi thí nghiệm, hóa chất thử vào trong nước. Nếu chất thử tan hoàn toàn trong nước là tốt nhất. Nếu chất thử không tan trong nước, thì phải hòa tan trong một dung môi đặc biệt như dimethylformamid(DMF), dimethylsulfoxid (DMSO) hoặc polythylenglycol (PEG). Sau đó, dùng nước pha loãng ra. Lúc này, nồng độ chất thử thấp, nên có thể tan được. nếu chất thử không tan, kết quả nghiên cứu sẽ sai. - 27 -
  39. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 1.6.2.3. Môi trường Có nhiều loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Việc lựa chọn môi trường phụ thuộc vào loại vi khuẩn và bản chất của chất khử. Có những trường hợp đòi hỏi những môi trường rất phức tạp. Trong Dược điển Việt Nam 3, có ghi trên 30 loại môi trường khác nhau. 1.6.2.4. Chuẩn bị chủng vi khuẩn Từ ống chủng gốc, cấy trên mặt thạch dinh dưỡng. Sau 24 giờ, tách các khuẩn lạc phát triển trên mặt thạch, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất, rồi cho vào một ống nghiệm để đo độ đục. Thêm nước muối sinh lý để được hỗn dịch vi khuẩn có tỷ lệ số tế bào vi khuẩn thích hợp, còn gọi là số cfu (colony forming unit: đơn vị tạo khuẩn lạc) trong 1 ml, ví dụ 10 triệu cfu/ml. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml bằng cách đo độ đục so với một ống mẫu. Hỗn dịch vi khuẩn đã được chuẩn hóa số lượng vi khuẩn trong 1 ml (số cfu/ml) gọi là canh khuẩn gốc. Các vi khuẩn thử tùy theo yêu cầu của chất thử và điều kiện thử. 1.6.3. Một số phương pháp thử in vitro Kỹ thuật định tính để thăm dò tác dụng trên vi khuẩn. Kỹ thuật dùng môi trường đặc: Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng của thuốc, khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát truển của vi khuẩn và vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh. + Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn bằng kỹ thuật đặc khoanh giấy trên môi trường đặc. + Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn bằng kỹ thuật dùng ống trụ trên môi trường đặc. Kỹ thuật dùng môi trường lỏng: phương pháp này dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của thuốc nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. - 28 -
  40. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai + Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dùng kỹ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng: Xác định nồng độ thấp nhất của thuốc ức chế được sự phát triển của vi khuẩn. + Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dùng kỹ thuật vi định lượng trong môi trường lỏng về nguyên tắc cũng tương tự như phương pháp kỹ thuật hệ nồng độ nhưng phải có dàn máy ELISA. Kỹ thuật sinh ký tự: khi đã xác định được dịch chiếc toàn phần của một dược liệu có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn. Nếu muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu đó có tác dụng thì có thể phân lập ra một số dạng chiết khác nhau rồi đem thử với vi khuần đó. Ta sẽ biết thành phần nào tác dụng và thành phần nào không tác dụng và mức độ tác dụng ra sao. 1.7. Ứng dụng của tinh dầu vỏ quýt Tinh dầu quýt có mùi hương thanh thản, dễ chịu. Dùng vỏ quýt ngâm rượu trong một thời gian, rượu sẽ có mùi thơm dễ chịu hơn. Nếu cho vào ly nước vài miếng vỏ quýt nước sẽ rất thơm ngon. Vỏ cam, quýt, bưởi, quất khô khi đốt lên giúp xua muỗi. Đốt vỏ quýt khô trong phòng thì mùi khó chịu sẽ biến mất. Đông y đánh giá cao Quýt. Quýt vị ngọt chua, tính ấm, giải khát, mát tim , khoan khoái trong lòng, khai uất, trừ đàm, tan khí kết, giải rượu. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm, ăn quýt rất tốt. Vỏ quýt khô gọi là Trần bì. Trần bì tính ấm, có tác dụng làm khoẻ dạ dầy, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vị. Y học đã chứng minh trong vỏ quýt có tinh dầu thơm glucoxit orange, andehit lemon, axit béo có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của dạ dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt với các chứng bệnh chướng bụng, rối loạn tiêu hoá, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm, khó chịu trong lồng ngực. Tinh dầu quýt rất tốt trong việc bảo toàn năng lượng cho cơ thể, nó rất có ích cho trẻ em bị cảm cúm hay cảm lạnh. - 29 -
  41. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Mang đến cho bạn cảm giác an thần và thanh thản. Tinh dầu này rất tốt để massage, xông hơi, tắm và ngửi. Đây là loại tinh dầu tuyệt vời cho vùng mông, hông và đùi, giúp làm giảm các đốm rạn da, đốm da căng, vết sẹo hoặc chữa các chứng hay quên, stress. trấn tĩnh và an thần. Giúp dễ tiêu, chống đầy hơi. Giảm đau và chống khuẩn rất tốt. Tinh dầu quýt có hương thơm ngọt thoáng, trong lành quen thuộc giúp giảm căng thẳng, stress và tạo hưng phấn cho cơ thể. Mùi hương tươi mát, sành điệu và thời trang, có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, tăng cường sức đề kháng của cơ thể. Hương thơm của quýt có khả năng giúp người ngửi có tinh thần tập trung tốt và khi được khuếch tán còn giúp giảm bớt 54% những lỗi thường gặp trong một phòng làm việc như: lơ đãng, mất tập trung, chán nản, tinh thần kém Nó kích thích cho tinh thần bạn sảng khoái hơn. Tinh dầu quýt giúp tẩy chất nhờn ở da, miễn dịch rất tốt. - 30 -
  42. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai CHƯƠNG 2 VẬT LỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vỏ quýt hồng sau khi thu nhận ta lấy 100 g đem sấy ở nhiệt độ 50oC (quýt được mua tại chợ thủ đức). Tinh dầu vỏ quýt được tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước. Vi khuẩn E.coli của phòng thực hành vi sinh trường cung cấp. Hình 2.1. Vỏ quýt trước khi xay. Hình 2.2. Vỏ quýt đã xay. 2.2. Hóa chất và dụng cụ 2.2.1. Hóa chất Na2SO4 rắn, eter dầu hỏa, n – hexan, aceton. 2.2.2. Dụng cụ Dụng cụ Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước. Phễu chiết, bình tam giác, máy xay, và các dụng cụ cơ bản khác. Máy móc Tủ sấy, cân phân tích. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước. - 31 -
  43. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Hình 2.3. Tủ sấy Hình 2.4. Cân phân tích Hình 2.5. Tủ ấm 370C - 32 -
  44. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 2.3. Địa điểm thực hiện thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm Trường đại học công nghệ TPHCM. 2.4. Nội dung nghiên cứu 2.4.1. Thí nghiệm 1: Xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Tiến hành ta cân 100 g vỏ quýt tươi rồi làm héo sấy ở nhiệt độ 50oC và tương ứng với các nghiệm thức là 1 h, 2 h, 3 h, 4 h. Sau khi xử lý héo và xay nhỏ ta tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước với 300 ml nước cất vào bình chưng cất. Mỗi nghiệm thức ta lặp lại 3 lần. Xác định thời gian làm héo thích hợp nhất để thu được tinh dầu nhiều nhất. Hình 2.6. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước. 1 : bình chứa nguyên liệu và nước 2 : hệ thống ngưng tụ 3 : ống sinh hàn 4 : hệ thống nước vào 5 : hệ thống nước ra - 33 -
  45. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 2.4.2. Thí nghiệm 2: Xác định thời gian trích đến hàm lượng tinh dầu trích ly. Tương tự cân 100 g vỏ quýt tươi đem sấy ở nhiệt độ 50oC và tiến hành trích ly ta khảo sát hàm lượng tinh dầu thu được trong khoảng thời gian tương ứng là 1h, 1,5 h, 2 h khi tiến hành chưng cất ta cho thêm 300 ml nước cất vào. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu. Cân 100 g vỏ quýt đem sấy ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút rồi đem xay và tiến hành chiết tinh dầu bằng các dung môi là n – hexan, eter dầu hỏa và aceton. Khảo sát kết quả thu được hàm lượng tinh dầu của dung môi với thể tích của dung môi là 300ml. 2.4.4. Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu / dung môi P.E đến hiệu suất trích ly tinh dầu Qua thí nghiệm trên ta sử dụng dung môi tối ưu nhất để khảo sát tỉ lệ giữa 100g vỏ quýt với dung môi tối ưu (eter dầu hỏa là dung môi tối ưu được sử dụng với 100g vỏ quýt theo tỉ lệ 1 : 2; 1 : 3; 1 : 4 (1 : 2 là 100g/200ml, 1 : 3 là 100g/300ml, 1 : 4 là 100g/400ml). Tiến hành chưng cất trong 2 h nhằm tìm tỉ lệ thích hợp. 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quất bằng phương pháp đục lỗ thạch. 2.4.5.1. Chuẩn bị Môi trường sử dụng môi trường cơ bản cao thịt pepton, nước muối sinh lý, nước cất, giấy lọc, kháng sinh, màng lọc, đệm phosphate. Dụng cụ: đĩa Petri, micropipette, ống nghiệm, đèn cồn, que cấy trang, tủ ấm 37oC, màng lọc, xi lanh, cóc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, ống trụ. Máy móc: tủ ấm 37oC, nồi hấp. Chủng vi khuẩn E.coli đã được tăng sinh và bằng phương pháp đo độ đục chuẩn McFarlan để thu dịch huyền phù với mật độ là 108 vi khuẩn. Từ đó tiến hành pha loãng mật dộ vi khuẩn xuống 107, 106 bằng nước muối sinh lý 0,9%. - 34 -
  46. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Mẫu thử: Tinh dầu sau khi chưng cất sẽ được bảo quản lạnh ở 40C. Dung dịch kháng sinh đối chứng: viên kháng sinh Amoxcillin với hàm lượng 500 mg sẽ được pha bằng 125 ml dung dịch đệm phosphate pH = 6. Dịch kháng sinh sau khi pha sẽ tiến hành lọc qua màng lọc vô trùng. Sau đó hút 0,025ml kháng sinh đã qua vô trùng và tẩm lên trên miếng giấy lọc hình tròn đã hấp khử trùng có đường kính 0,8 cm. Như vậy mỗi miếng giấy lọc này sẽ có hàm lượng kháng sinh tương ứng là 10 μg theo tiêu chuẩn quốc tế. 2.4.5.2. Tiến hành - Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn ở một loại nồng độ. Sau đó tiến hành cấy trang trên môi trường cho đến khi khô bề mặt thạch. - Sử dụng ống đục lỗ và đục 6 lỗ, mỗi lỗ cách nhau đều đặn một khoảng 2cm. - Dùng micropipet chuyển 0.1 ml mẫu tinh dầu vào các lỗ thạch. - Cuối cùng ta đặt miếng giấy lọc tẩm kháng sinh vào giữa đĩa petri. Lưu ý: - Mỗi nồng độ vi khuẩn ta tiến hành lặp lại 3 lần. - Các đĩa tiến hành xong sẽ đem ủ ở 37oC. - Theo dõi sự xuất hiện và kích thước vòng kháng khuẩn trong thời gian 12h, 24 h, 36 h. Hình 2.7. Phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường đặc. - 35 -
  47. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tinh dầu vỏ quýt Tinh dầu vỏ quýt sau khi tiền hành chưng cất và thu được tinh dầu là chất lỏng trong suốt không màu. (hình3.1) Tinh dầu vỏ quýt có mùi thơm đặc trưng dịu, nhẹ nhàng dễ chịu có vị hơi the. Hình 3.1. Tinh dầu vỏ quýt. 3.2. Kết quả xác định thời gian làm héo nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trích ly Qua quá trình chưng cất vỏ quýt được làm héo ở nhiệt độ 50oC trong khoảng thời gian 1 h, 2 h, 3 h, 4 h. Kết quả bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian làm héo nguyên liệu Thời gian 1h 2h 3h 4h làm héo Kết quả 3,2ml 3,5ml 2,8ml 2,4ml số ml tinh dầu - 36 -
  48. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 1h 2h 3h 4h Hình 3.2. Biểu đồ xác định thời gian làm héo nguyên liệu. Biện luận: Ở thời gian 2 h vỏ quýt được làm héo ở nhiệt độ 50oC là tối ưu. Ta thu được lượng tinh dầu cao nhất trong các thí nghiệm với 3,5 ml tinh dầu. Kết quả cho ta thấy nếu thời gian làm héo quá ngắn hay quá lâu cũng ảnh hưởng đến lượng tinh dầu thu được. Nếu quá ngắn thì hàm lượng nước còn nhiều hoặc quá lâu cũng sẽ làm thất thoát bớt tinh dầu. 3.3. Kết quả xác định thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu Tiến hành khảo sát tinh dầu thu được trong khoảng thời gian tương ứng là 1h, 1,5 h, 2 h chưng cất ta cho 300 ml nước cất vào. Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian trích ly tinh dầu Thời gian trích ly 30 phút 1h 1,5h 2h Kết quả 1,7ml 2,5ml 2,8ml 3,3ml tinh dầu (ml) - 37 -
  49. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0.5h 1h 1.5h 2h Hình 3.3. Biểu đồ xác định thời gian trích ly. Biện luận: Thời gian trích ly tinh dầu trong 2 h cho số ml tinh dầu chưng cất được nhiều nhất. Nếu thời gian quá ngắn 0,5 ha hoặc 1h thì ta thu được chưa hết tinh dầu. Ta trích ly khoảng thời gian 2 h ta hầu như thu được hết tinh dầu trong 100 g vỏ. 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất trích ly tinh dầu Dung môi có ảnh hưởng đến sự chưng cất tinh dầu. Để thu được nhiều tinh dầu ta cần lựa chọn được một loại dung môi hợp lý nhất. Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi. Dung môi P.E N - hexan Aceton Kết quả 2,9ml 1,3ml 0,7ml Biện luận: Dựa vào kết quả tinh dầu ta thấy dung môi P.E (Ete dầu hỏa) cho được hàm lượng tinh dầu nhiều nhất so với n – hexan và acetone. Điều này cho thấy dung môi thích hợp nhất để chưng cất loại tinh dầu này là P.E. Dung môi này có dộ phân cực rất thấp nên hoàn toàn có khả năng lôi kéo - 38 -
  50. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai tinh dầu ra khỏi tế bào bới tinh dầu là một hợp chất có tính thân dầu và cũng có độ phân cực thấp. N-hexan và acetone là những môi có độ phân cực hơi thấp và trung bình nên chưa có khả năng ly trích được lượng tinh dầu lớn. 3.5. Kết quả xác định tỉ lệ ảnh hưởng của nguyên liệu/dung môi P.E Sau khi lựa chọn được dung môi thích hợp là P.E thì ta tiến hành thử nghiệm tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi nhằm tìm ra thể tích dung môi hợp lý nhất để ly trích một khối lượng nguyên liệu cụ thể. Bảng 3.4. Kết quả tỉ lệ ảnh hưởng của nguyên liệu/dung môi P.E Tỷ lệ Nguyên liệu/ 1:2 1:3 1:4 Dung môi Kết quả tinh 1,8ml 2,9ml 2,88ml dầu (ml) Biện luận: Vậy với tỉ lệ 1 : 3 ta thấy đó là tỉ lệ ta thu được tinh dầu nhiều trong các tỉ lệ khác. Nếu với tỉ lệ 1 : 2 thỉ hàm lượng dung môi quá ít ta không thu được tinh dầu nhiều với tỉ lệ 1 : 4 thì hàm lượng tinh dầu cũng tương đương với tỉ lệ 1: 3 nhưng sẽ tốn dung môi mà không thu được tinh dầu nhiều hơn. 3.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ quýt bằng phương pháp đục lỗ thạch Tiến hành khảo sát vòng kháng khuẩn trong 24 h đến 36 h ta thấy có xuất hiện vòng vô khuẩn kích thước vòng vô khuẩn của E.coli. - 39 -
  51. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai Bảng 3.5. Kích thước vòng kháng khuẩn trong 36h. E.coli Kích thước 8 7 6 vòng vô khuẩn 10 10 10 12h Chưa rõ Chưa rõ Chưa rõ 24h 1,1cm 2,1cm 2,2cm 36h 0,8cm 1,7cm 1,8cm Biện luận: Sau một ngày theo dõi ta thấy vòng vô khuẩn xuất hiện tốt nhất là trong 24 h với nồng độ vi khuẩn 108 là 0,8 cm, 107 là 2,1 cm và 106 là 2,2 cm. Từ 24 h đến 36 h thời gian càng kéo dài vòng vô khuần càng nhỏ vì lượng tinh dầu bay hơi và vi khuẩn mạnh có thể sống và có khả năng phát triển lại trong khi đó lượng tinh dầu của ta không còn nhiều để kháng mạnh. Vậy ta thấy có xuất hiện vòng vô khuẩn tức là tinh dầu vỏ quýt có khả năng kháng đối với vi khuẩn E.coli. - 40 -
  52. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi tiến hành thí nghiệm nhóm chúng tôi rút ra một số kết luận : Chưng cất lôi cuốn hơi nước: Thời gian làm héo nguyên liệu trong vòng 2h cho hàm lượng tinh dầu tối ưu nhất. Trích ly trong thời gian 2h sẽ cho hàm lượng tinh dầu nhiều nhất. Chưng cất với dung môi dung môi: Dung môi thu được tinh dầu tối ưu nhất là P.E. Tỉ lệ nguyên liệu /dung môi thích hợp nhất là 1 : 3. Vòng kháng khuẩn: Tinh dầu có tính kháng khuẩn có thể kháng E.coli và đường kính vòng kháng khuẩn xuất hiện rõ và mạnh nhất trong vòng 24 h đến 36 h. 4.2. Kiến nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm ngắn, và thiết bị hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm có hạn nên chúng tôi xin đưa ra một số kiến nghị. Còn nhiều loại dung môi chưa khảo sát nhằm nghiên cứu hiệu suất trích ly tinh dầu. Cần tiến hành trích ly bằng phương pháp nhiều phương pháp khác như kết hợp vi sóng và các dung môi để khảo sát hàm lượng tinh dầu. Cần thử nghiệm trên các mô hình thực nghiệm để đánh giá các tác dụng dược lý của tinh dầu vỏ quýt. - 41 -
  53. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt [1]. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Cục Bảo Vệ Thực Vật. 2006. Quản lí dịch hại tổng hợp cây có múi hướng dẫn về sinh thái. Thành Phố Hồ Chí Minh: NXB Nông Nghiệp. [2]. Dương Phước An, Huỳnh Thị Bích Tuyền, Nguyễn Ngọc Khôi, Khảo sát hoạt tính giải lo âu của một số tinh dầu từ vỏ quả cây chi Citrus họ Rutacece. Y Hoc TP. Hồ Chí Minh. [3]. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y dược. [4]. Đỗ Chung Võ cùng cộng sự, Những cây tinh dầu Việt Nam, khai thác, chế biến, ứng dụng, NXB KHKT HN, 1996. [5]. Đường Hồng Dật. 2003. Nghề làm vườn cây ăn quả ba miền.Hà Nội: NXB Nông Nghiệp Hà Nội. [6]. Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, NXB ĐHQG TP. Hồ Chí Minh. [7]. Nguyễn Kim Phi Phụng. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2007. [8]. Nguyễn Minh Hoàng (2006), Khảo sát tinh dầu vỏ trái giống Citrus họ rutaceae. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở, Đại học Mở Tp HCM. [9]. Nguyễn Năng Vinh, Kỹ thuật khai thác và sơ chế tinh dầu, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, năm 1978. [10]. Nguyễn Thị Thu Cúc. 2000. Biện pháp phòng trị côn rùng và nhện gây hại cây ăn trái (Cam, Quýt, Chanh, Bưởi).Cần Thơ: Nhà sách Thành Nghĩa. [11]. Vũ Ngọc Lộ (1996), Những cây tinh dầu Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2. Tài liệu tiếng anh [12]. Cordell G.A, Biodiversity and drug discovery symbiotic relationship, Phytochemistry 55, 2005. - 42 -
  54. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai [13]. George A. Burdock, Fenaroli's handbook of flavor ingredients 5 edition, CRC Press, 2004. [14]. Glen O. brenchbill, An essential Oil guide, Fragrance Books INC, New Jersey, USA, 2009. 3. Tài liệu internet [15]. [16]. [17]. [18]. [19]. ến vỏ cam thành nhiên liệu và chất kháng khuẩn. [20]. - 43 -
  55. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai PHỤC LỤC 1. Môi trường thạch thường TSA (cao thịt pepton cơ bản) Pepton : 10g . NaCl : 5g. Cao thịt : 5g. Thạch : 20g (2% Agar). Nếu đổ đĩa : Sau khi hấp, để nguội 45 - 500C đổ 20ml/đĩa. 2. Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 6,8) Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200ml. a b pH 93,5 6,50 5,6 92,0 8,00 5,8 90,0 10,0 5,9 87,7 12,3 6,0 85,0 15,0 6,1 81,5 18,5 6,2 77,5 22,5 6,3 73,5 26,5 6,4 68,5 31,5 6,5 62,5 37,5 6,6 56,5 53,5 6,7 51,0 49,0 6,8 - 44 -
  56. Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Tuyết Mai 3. Độ đục chuẩn (McFarlan) Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng cách trộn: Dung dịch BaCl2.2H2O 1%: 0,5 ml. Dung dịch H2SO4 1%: 99,5 ml. 4. Môi trường tăng sinh E.coli Môi trường TSB ( Trypticase Soy Broth) Trypticase peptone : 17 g. Phytone peptone : 3 g. NaCl : 5 g. K2HPO4 : 2,5 g. Glucose : 2,5 g. Nước cất đến : 1 lít. Làm nóng và lắc nhẹ để hòa tan, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. - 45 -