Đồ án Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú

73 trang thiennha21 12/04/2022 4010

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_khu_khoang_trong_thu_nhan_chitin_bang_len_m.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHỬ KHOÁNG TRONG THU NHẬN CHITIN BẰNG LÊN MEN LACTIC TỪ VỎ ĐẦU TÔM SÚ Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Ngọc Thu MSSV: 0851110242 Lớp: 08DSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2012.
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Với hiện trạng các nhà máy sản xuất thuỷ sản, đặc biệt là tôm lột vỏ, đã thải ra môi trường hàng tấn vỏ tôm như là nguồn chất thải đã gây ô nhiễm môi trường trầm trọng. Hơn thế nữa, vỏ tôm là một nguồn tài nguyên quý nếu ta biết cách sử dụng. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tái sủ dụng vỏ tôm như làm thức ăn gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin, carotenoid. Các hợp chất này có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Vì vậy, em nhận thấy vấn đề thu nhận chitin từ vỏ tôm là việc vô cùng quan trọng hiện nay. Nó vừa giúp cải thiện môi trường mà còn đem lại một nguồn lợi vô cùng lớn cho con người. Tuy nhiên, các quy trình sản xuất chitin trước đây thường dùng công nghệ hoá học, vì vậy nó không những không góp phần bảo vệ môi trường mà còn gây hại thêm bởi một lượng lớn các chất hoá học với nồng độ cao thải ra ngoài môi trường trong quá trình chế biến. Trước thực tiễn trên, em nhận thấy cần phải nghiên cứu thêm về các quy trình thu nhận chitin bằng phương pháp sinh học để tránh các thiệt hại cho môi trường đồng thời thu về nguồn lợi quý từ chitin. Do đó, em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú”. 2. Tình hình nghiên cứu Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn. 3. Mục đích nghiên cứu Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic với chủng L. acidophilus. Acid lactic sinh ra trong quá trình lên men sẽ loại các ion khoáng trong nguyên liệu vỏ tôm như: Ca2+, Mg2+, đồng thời các vi khuẩn lactic sẽ phân huỷ một phần protein trong vỏ tôm. 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Tìm ra tỉ lệ nước và đường D – glucose thích hợp cho quá trình lên men. So sánh phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và bằng sinh học. 5. Phương pháp nghiên cứu a. Phương pháp luận Trước khi thực hiện đề tài này, em đã được biết qua rất nhiều các ứng dụng của chitin – chitosan được ứng dụng trong cuộc sống và đã tham khảo nhiều quy trình thu nhận chitin của các tác giả trong và ngoài nước. Em nhận thấy quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic vừa an toàn đối với môi trường vửa dễ dàng áp dụng vào cuộc sống. Vì vậy em đã chọn vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, một chủng vi khuẩn sản sinh nhiều vi khuẩn lactic vừa thân thiện với con người để lên men vỏ tôm thu nhận chitin. b. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu. 6. Các kết quả đạt được của đề tài Xác định tỉ lệ nước:vỏ tôm và tỉ lệ đường:vỏ tôm thích hợp cho quy trình lên men, từ đó hoàn thiện đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin với Lactobacillus acidophilus. 7. Kết cấu của ĐATN Đồ án gồm có 4 chương: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và biện luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Lactobacillus 1.1.1. Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus 1.1.1.1. Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillilales Họ: Lactobacillaceae Chi: Lactobacillus Loài:Lactobacillus acidophilus. Vi khuẩn này được mô tả lần đầu tiên do công của một bác sĩ là Bruno Oppler và một nhà nghiên cứu dạ dày ruột là Ismar Isidor Boas. Tên gọi Lactobacillus acidophilus bắt nguồn từ lacto có nghĩa là sữa, bacillus chỉ hình dáng giống cây gậy và acidophilus nghĩa là một “acid đằm thắm” (acid loving). L. acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử. Nó có khả năng lên men cả hiếu khí lẫn kỵ khí. Trong trường hợp lên men đồng hình, glucose được sử dụng để tạo acid lactic, hoặc tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2 trong trường hợp lên men dị hình. 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.1.2. Hình thái L. acidophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6 - 0,9 µm, dài 1,5 – 6 µm, lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 42 oC. Trong tự nhiên, chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng chuyển động. Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose. Không lên men được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose. a. b. c. Hình 1.1. Hình thái L. acidophilus a. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus nằm nghiêng b. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus c. Hình thái tế bào L. acidophilus khi nhuộm Gram 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa L. acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 45 oC nhưng tối ưu là 35 – 40 oC. Tính chịu acid của nó từ 0,3 - 1,9 % chuẩn độ acid, với pH tối ưu từ 5,5 - 6. Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như: áp lực oxygen thấp, có thể lên men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, ộm t số vitamin và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển. L. acidophilus phát triển ở pH thấp < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí. L. acidophilus sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi trường phong phú đường. Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men trong L. acidophilus tạo ra năng lượng là 2 ATPs. Ngoài glucose, L. acidophilus còn sử dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose cho sự lên men. 1.1.1.4. Đặc điểm sinh thái. L. acidophilus được biết như một loài có vai trò probiotic. Sự bám dính và khả năng liên kết với nhau tạo thành một tập đoàn của vi khuẩn lactic là cơ chế hữu hiệu để hạn chế vi khuẩn có hại. Khi vi khuẩn lactic vào trong cơ thể, định cư ở đường ruột, chúng cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với vi sinh vật có hại, làm hạn chế số lượng tế bào vi sinh vật có hại trong đường ruột. L. acidophilus có khả năng sinh tổng hợp một số chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen peroxide, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại. Ngoài ra, L. acidophilus còn có vai trò như một chất bổ trợ cho những người không chịu được lactose. Chúng tập hợp ở đường tiêu hóa, góp phần chuyển hóa và phân giải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột. 1.1.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của L. acidophilus Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47 % 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lactobacillus của sản phẩm A và 70 % của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E. coli. Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus, L. casei vàL. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli. Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976). Các chủng Lactobacillus có ở đường ruột của người và ộm t số động vật thí nghiệm khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995). Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không ẫ m n cảm với các hoạt động xúc tác. Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp, Salmonelle spp, E.coli và Staphylococcus spp vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn khác. Hoạt tính kháng vi sinh vật nhờ cơ chế biểu diễn trên hình 1.2 (Cotter et al., 2005). Trong đó Bacteriocin class I (đại diện: Nisin của Lactococcus lactics) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; Bacteriocin class II (đại diện: Sakacin của Lactobacillus sakei) là các peptid lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh trên lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin) – protein bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích. 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.2. Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin. Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm). Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952; Dahiafa và Speck, 1968; Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972; Adams và Hall, 1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan. Khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh ở chủng L. acidophilus rất quan trọng trong đề tài này. Vì phải lên men trong môi trường vỏ tôm chứa nhiều dinh dưỡng, nếu L. acidophilus có khả năng đối kháng cao sẽ ức chế các VSV cây mùi hôi thối trong quá trình lên men, đồng thời ngăn các VSV có thể gây hại cho sức khoẻ con người. 1.2. Tổng quan về tôm sú và nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam 1.2.1. Vị trí phân loại Tôm sú được định loại là: Ngành: Arthropoda 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius Giống: Penaeus Loài: monodon Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius 1.2.2. Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Án Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía đông Tahiti, phía nam châu Úc và phía tây châu Phi (Racek, 1955; Holthuis và Rosa, 1965; Motoh, 1981, 1985). Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30 oE đến 155 oE, từ vĩ độ 35 oN đến 35 oN xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaysia, Philippines và Việt Nam. Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và vùng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành, chúng di chuyển xa bờ vì thích sống ở vùng nước sâu hơn. 1.2.3. Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), năm 2011, cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ, với sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71 % về diện tích và 5,48 % về sản lượng so với năm 2010. Trong đó, diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81 % năm 2010. Riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long, tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chân trắng), chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước. Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam cho biết, tổng giá trị xuất khẩu tôm của Việt Nam trong năm 2011 đạt 2.396 tỷ USD, tăng 13,7 % so với năm 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2010 và đã vượt qua mốc 2 tỷ USD. Trong đó, xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị, xuất khẩu tôm chân trắng đạt 704 triệu USD, chiếm 29,3 % tỷ trọng, 12 % còn ạl i là tôm các loại khác. Về thị trường xuất khẩu, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn và các thị trường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và châu Âu. Năm 2010, giá trị xuất khẩu tôm sang 3 thị trường này chiếm hơn 71 % tổng sản lượng xuất khẩu tôm cả nước. Sang năm 2011, tỷ trọng này còn 66 %. Trong khi đó, xuất khẩu sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh, xuất khẩu tôm sang Nga tăng 124 % so với năm 2010. Xuất khẩu tôm sang Hàn Quốc tăng 23 %, sang các nước Đông Nam Á tăng 54,7 %. Năm 2011, tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam. Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là các mặt hàng tôm sú sống, tươi hoặc đông lạnh. 1.2.4. Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú Tôm tươi được chế biến lạnh đông dưới nhiều dạng như sau: Tôm nguyên con còn đầu và còn vỏ. Tôm bỏ đầu: tôm bỏ đầu và còn vỏ. Tôm bỏ đuôi: tôm bỏ đầu, bỏ ruột và bóc một phần vỏ. Tôm xẻ lưng, bóc vỏ đến đốt áp chót. Tôm cánh bướm, bóc vỏ đến đốt áp chót, cắt dọc theo chiều dài sống lưng, xẻ banh ra. Tôm có 4 đốt đầu được bóc vỏ và cắt theo chiều dài. Tôm bóc noãn: tôm bỏ đầu, bỏ vỏ và bỏ ruột. Tôm bóc noãn. Tôm bóc noãn, xẻ lưng. Tôm bóc noãn không nguyên vẹn. Tôm bóc noãn và cắt cánh bướm: tôm boc noãn được cắt dọc theo chiều dài đến đốt cuối cùng. 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tôm bóc noãn có 4 đốt đầu tiên được cắt theo chiều dài. 1.2.5. Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay Trong các quy trình sản xuất tôm lột vỏ, một lượng lớn vỏ tôm bị thải ra ngoài, gây ô nhiễm môi trường, đồng thời trong vỏ tôm thải vẫn còn rất nhiều hợp chất có thể thu nhận lại. Các protein, khoáng chất, vi lượng trong vỏ tôm thải có thể chế biến thành thức ăn gia súc, gia cầm. Ngoài ra, các hợp chất quý như carotenoid, chitin thu nhận từ vỏ tôm có rất nhiều ứng dụng trong y học, công nghiệp và nông nghiệp. Đầu vỏ tôm, phụ phẩm trong ngành chế biến thuỷ hải sản, đã được nhiều tác giả nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn gia súc, có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của đầu và vỏ tôm. Theo Vũ Duy Giảng (1995), bột đầu tôm được chế biến từ đầu, càng, vỏ tôm là nguồn protein động vật rất tốt cho gia súc, gia cầm. Giá trị dinh dưỡng của bột đầu tôm thấp hơn bột cá và bột máu. Bột đầu tôm có 33 – 34 % protein, trong đó có 4 – 5 % lysin và 2,7 % methionin. Theo Dương Xuân Tuyển, đầu vỏ tôm tươi đem hấp cách thuỷ có chứa chất khô là 26,40 % và protein thô khoảng 11,38 %, trong khi protein thô trong vỏ đầu tôm muối chua là 11,20 %. Chất xơ trong đầu vỏ tôm khá cao và biến động tuỳ theo thành phần đầu vỏ tôm, hàm lượng thay đổi từ 3,3 – 6,0 %. Canxi, phospho là thành phần khá quan trọng trong đầu vỏ tôm. Đầu vỏ tôm tươi đem hấp chứa 3,68 % canxi và 0,22 % phospho, tro và đầu vỏ tôm ủ chua có hàm lượng canxi 2,15 % và phospho 0,44 %. Bột đầu vỏ tôm sấy khô chứa 5,2 % canxi và 0,9 % phospho (Dương Xuân Tuyển, 1992). Đầu vỏ tôm tươi ít được sử dụng nuôi heo nhưng được sử dụng khá phổ biến như nguồn thức ăn bổ sung đạm trong chăn nuôi vịt đẻ. Vỏ đầu tôm tươi đem hấp được Dương Xuân Tuyển (1992) sử dụng đến 46 % và lúa là nguồn thức ăn năng lượng chính nuôi vịt đẻ CV super M tại trại Vigova, cho năng suất trứng 160 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP quả/năm so với tiêu chuẩn của Anh về năng suất trứng đối với giống vịt bố mẹ 170 quả/năm. Một vài tác giả cũng đã sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo thịt. Lê Văn Liễn, Nguyễn Thiện (1995), dùng 5 % đầu vỏ tôm ủ chua thay thế bột cá trong khẩu phần thức ăn nuôi heo thịt cho kết quả tăng trọng và tiêu tốn thức ăn tương đương khẩu phần có 10 % bột cá. (Theo Nguyễn Thị Thu Vân – 1997). Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn chưa tận dụng hết các hợp chất trong vỏ tôm như chitin hay carotenoid. Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu trên toàn thế giới về việc thu nhận chitin trong vỏ tôm nhằm tránh lãng phí nguồn tài nguyên này. 1.3. Tổng quan về chitin – chitosan 1.3.1. Cấu trúc chitin - chitosan Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823, Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có ặm t của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có ạd ng công thức giống như cellulose. Chitin là polysaccharide phổ biến thứ 2 trên đất sau cellulose, được tìm thấy trong xương người cũng như trong các bộ phận của động vật không xương sống. Nó là sự kết hợp giữa liên kết β (1→4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose (N – acetylglucosamine). Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9 % là N (Black và Schwartz, 1950). Nó có cấu trúc giống hệt cellulose vì có gốc acetamide (-NH-CO- CH3) ở vị trí C2. Một dẫn xuất khác của chitin, chitosan là 1 polymer tuyến tính α (1 → 4) 2 – annino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.3. Công thứ cấu tạo của chitin 1.3.2. Tính chất hoá học của chitin - chitosan Chitin là 1 polysaccharide chứa nitơ, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước và acid yếu, chỉ tan trong một số dung môi, bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid. Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa các ạm ch và trong ạm ch với nhau. Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2, có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin. Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạo thành chitosan. a. b. Hình 1.3. Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b) 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phản ứng của chitosan linh hoạt hơn so với cellulose nhờ nhóm -NH2, có thể liên kết với chất béo. Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính chitosan. Tính chất chung của chitin và chitosan: chuỗi polymer bền, các nhóm amin phản ứng, có nhóm hydroxyl phản ứng tồn tại, và giữ nhiều ion thu kim loại chuyển đổi. Thuộc tính sinh học của chitosan: a. Thíchứ ng sinh học: chuỗi polymer tự nhiên, có thể phân hủy sinh học, an toàn và không độc. b. Có phản ứng liên kết. c. Tái ạt o các phản ứng keo liên kết. d. Tăng hệ hình thành chất osteoblast chịu trách nhiệm cho xương hình thành. e. Cầm máu. f. Diệt nấm, vi khuẩn, virus. g. Diệt tinh trùng. h. Ngừa sưng tấy. i. Chống các tác nhân gây dị ứng. j. Ngừa chotesterol, ngừa tăng huyết áp. k. Tăng khả năng tái tạo xương. l. Ức chế sự đau đến hệ thần kinh trương ương. m. Bổ trợ miễn dịch. 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.3. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay 1.3.3.1. Các quy trình sản xuất cổ điển Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về sản xuất chitin – chitosan bằng phương pháp hoá học, nhưng nhìn chung phải thực hiện qua các bước sau: Khử protein → Khử khoáng → Khử màu → Loại gốc acetyl. Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu: Quy trình sản xuất chitin từ tôm sông nước ngọt của Mayer và Lee, đại học Louisiana, Hoa Kỳ (1989). Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh (1998). Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang. Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước như Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp, Thái Lan 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ví dụ: Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc Anh (1998) Nguyên liệu NaOH 5 % Ngâm trong NaOH to = 100 oC Khử protein τ = 4 h Rửa trung tính HCl 0,275 N Ngâm trong HCl to phòng τ = 1 h Khử khoáng Rửa trung tính to phòng Ngâm trong HCl τ=24h Rửa trung tính Tẩy bằng NaOCl hoặc H2O2 NaOH 35 - 50 % Khử màu NRấuử atrong trun gN taOHính to = 80 – 140 oC Khử gốc acetyl τ = 0,5 – 10 h Rửa Chitintrung t ính Sấy khô Chitosan Nhận xét: Đây là quy trình tổng hợp từ cá quy trình sản xuất trước đó. Sản phẩm chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại bỏ sạch trong quá trình tẩy màu. Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong chitin thấp. 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hoá chất nồng độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thành sản xuất, đồng thời nếu quá trình xử lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường. 1.3.3.2. Quy trình sản xuất chitin hiện đại Hiện nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người quan tâm. Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm môi trường đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Thay vì sử dụng các hoá chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại nhiều thành công trong vấn đề này. Nguyên liệu Làm sạch Nghiền nhỏ < 5 mm NaCl 2 % Trộn đều Sucrose 15 % H2O 1:1(w/v) Lên men Giống 5 %w/v 72 h, to = 32 oC Ly tâm 4000 rpm, 10 m Dịch lên men Bã lên men Sấy 48 oC, 16 – 18 h Chitin thô 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1.4. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar,viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010. Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho các vi sinh vật gây hôi thối phát triển. Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân huỷ một phần protein còn lại trong nguyên liệu. Ngoài ra, có thể sử dụng các enzyme thuỷ phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn. 1.3.4. Ứng dụng của chitin – chitosan 1.3.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và bảo vệ thực vật.  Mỹ phẩm Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng mỹ phẩm như là aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo tính nhớt khi được trung hòa acid. Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt hơn. Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm rất tốt. Chitosan cũng có thể hấp thụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng liên kết chung với gốc amino của chitosan. Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực mỹ phẩm bao gồm: -Tóc: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc, thuốc xịt tóc, nước dưỡng tóc. -Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt, mascara, sơn móng tay, sữa dưỡng ẩm -Chăm sóc răng: kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su, ngoài ra còn được áp ụd ng như một chất độn nha khoa. 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Xử lý nước Do tích chất polycationic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhân kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn. Weltroswki et al, sử dụng chitosan N_benzyl dẫn xuất sulphonat như các chất hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid. Năm 1999, Bhavani và dutta sử dụng chúng như chất hấp phụ loại bổ màu từ nước thải xưởng nhuộm. Ngoài ra, chitosan còn dùng để loại khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng, asen, plutoniun, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyd, kể cả dầu mỏ và dầu khí.  Công nghiệp giấy Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin – chitosan được sử dụng trong ngành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm.  Công nghiệp dệt Dẫn xuất chitosan được sử dụng để chống tĩnh điện, chống bám bẩn. Ngoài ra chitin có thể sử dụng trong quá trình in ấn hoàn thiện sản phẩm. Chitosan có khả năng xử lý màu nhuộm trong nước thải.  Chế biến thực phẩm Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độc đối động vật máu nóng của nó. Các hạt tinh thể chitin siêu nhỏ (MLL) có tính chất nhũ hóa, làm dày và tạo gell cho thực phẩm. Nó còn được sử dụng như chất xơ trong thực phẩm nướng. Việc sử dụng MLL giải quyết các vấn để như màu sắc, mùi vị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ. Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi khuẩn, kháng nấm và cản trở sự hoạt động của enzyme.  Nhiếp ảnh Trong nhiếp ảnh màu, Chitosan đã được sử dụng như một tác nhân cố định màu thuốc nhuộm acid trong gelatin và hổ trợ khuyết tán.  Sắc ký phân cách 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chitosan và chitin là một chất hỗ trợ hữu ích cho sự phân ly trong sắc ký do có sự hiện diện của các nhóm tự do – NH2, - OH chính và – OH thứ cấp . Rhee et al đã sử dụng chitin và chitosan làm vật liệu hấp thụ pha rắn trong khai thác phenol và chloirophenol bằng sắc khí lỏng hiện năng cao HPLC . Ngoài ra có thể sử dụng chitosan trong sắc khí lỏng phân tích nucleic acid.  Pin dạng rắn.  Chitin cho các ứng dụng đèn LED và NLO. 1.3.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp  Xử lý hạt Hạt giống xử lý bằng chitin trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độ tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi khuẩn gây bệnh và nấm mốc.  Chất mang trong sản xuất phân bón Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất điều hoà tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan được sử dụng như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vào trong đất. Chitosan bị phân huỷ sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự phogs thích các chất. Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi sử dụng chitosan làm chất mang.  Bảo quản nông sản Trong bảo quản nông sản, chitosan không những phát huy khả năng kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp điều chỉnh môi trường bên trong rau củ thông qua kiểm soát quá trình trao đổi khí giữa rau quả và môi trường. Ở Nhật, dung dịch chitosan được phun lên táo và cam nhằm kháng nấm và vi khuẩn gây hư hỏng. André Bégin cũng đề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan. Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng để làm bao bảo vệ chống sương giá. 1.3.4.3. Ứng dụng y sinh học 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo vì có ộđ thấm phù hợp và độ bền cao.  Mô nhân tạo Chitosan và ộm t số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một số ứng dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép. Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương, ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp. Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốc độ chữa lành ếv t thương nhanh hơn bình thường.  Điều trị bỏng Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinh học. Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịch nước của chitosan acetate. Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxy tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy. Ngoài ra, lớp màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các enzyme trong cơ thể nên không cần phải phẫu thuật loại bỏ.  Da nhân tạo Do nhiều tính chất như: tạo màng, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệt khuẩn, làm mau lành vết thương hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sản xuất da nhân tạo phục vụ cho y học.  Nhãn khoa Sử dụng làm kính áp tròng do có đặc tính quang học rõ rang, ổn định cơ học , có độ thấm khí, có thể điều chỉnh quang, có thể thấm ướt, và có khả năng tương thích với hệ miễm dịch, Ngoài ra khả năng kháng khuẫn và dễ chữa lành vết thương cũng giúp íchấ r t nhiều trong trường hợp này  Màng bao thuốc Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc. 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 2.1.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 1/05/2012 đến ngày 20/07/2012. 2.1.3. Giống vi sinh vật Giống L. acidophilus được sử dụng trong các thí nghiệm được lấy từ dược phẩm ANTIBIO. Đây là một dạng chế phẩm sinh học dạng bột, chứa 109 CFU/g (theo như khuyến cáo của nhà sản xuất). 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ 2.1.4.1. Nguyên liệu và hoá chất  Nguyên liệu Nguyên liệu chính của đề tài này là vỏ tôm thu thập từ các chợ Bàn Cờ và Bà Chiểu. Quá trình chuẩn bị vỏ tôm được trình bày trong sơ đồ hình 2.1. Vỏ tôm Rửa sơ Xay nhuyễn ≤ 2 mm Tiến hành thí nghiệm Bảo quản ở -4 oC Hình 2.1. Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vỏ tôm sau khi thu nhận được bảo quản trong thùng lạnh từ chợ về đến phòng thí nghiệm, rửa sơ, loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ sau đó được xay nhuyễn (≤2 mm) và bảo quản lạnh -4 oC. Quá trình này cần làm nhanh để tránh vỏ tôm bị hư hỏng. Nếu vỏ tôm có hiện tượng hỏng như có mùi hôi thối hay tăng pH, cần chỉnh pH về 6 – 6,5 trước khi thực hiện lên men với L. acidophilus.  Hoá chất Môi trường MRS Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS Thành phần môi trường MRS (1 l) Peptone: 10 g Meat extract : 10 g Yeast extract: 5 g K2HPO4 : 2 g Triammonium citrate: 2 g Glucose : 20 g Tween 80: 1 ml Natri acetate : 5 g MgSO4.7H2O : 0,58 g MnSO2.4H2O: 0,25 g (Agar: 15 %) Hoá chất dùng cho lên men vỏ tôm: D – glucose. NaCl. NaNO2. Xác định hàm lượng Nitơ tổng số: 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP H2SO4 đậm đặc. NaOH 45 %. H2SO4 0,1 N chuẩn. NaOH 0,1 N chuẩn. Thuốc thử Tashiro. Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4:CuSO4 (3:1). Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Bradford: Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml nước cất, lắc đều cho tan, giữ ở 20 0C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,01 mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford: - Coomassie Brilliant Blue: 0,001 g. - Ethanl tuyệt đối 4,7 g. - Acid phosphoric 85%: 8,5 g. Phẩm màu Coomassie Brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85 % và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Xác định hàm lượng N amin theo phương pháp chuẩn độ formol: Dung dịch NaOH 0,05 N. Dung dịch phenolphtalein 0,1% trong etanol 90%. Dung dịch formaldehyde trung hòa 30 %: Lấy 50 ml dung dịch formaldehyde 30 % cho thêm vài giọt phenolphtalein và chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu phớt hồng. Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men: NaOH 0,1 N. Thuốc thử phenolphtalein. Thí nghiệm xác định lượng đường khử có trong dịch lên men: 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thuốc thử DNS. 2.1.4.2. Thiết bị Tủ cấy vi sinh (Brlad France). Tủ ủ (Memmert Germany). Máy chạy Kjeldahl. Tủ lạnh Toshiba. Kính hiển vi quang học (Olympus). Autolave (Huxky Đài Loan). Máy đo quang (Hach-Germany). Máy ly tâm (Tuttligen Germany). Máy đo pH (Hach-Germany). Cân phân tích (Orbital Germany). Bếp từ (Billy – England). Máy nước cất (Branstead USA). 2.1.4.3. Dụng cụ Ống nghiệm không nắp và có ắn p. Đĩa petri. Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 1000ml. Erlen 100ml, 250ml, 500ml. Ống đong 50ml, 100ml, 500ml. Pipet thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml. Ống ly tâm eppendorf. Que cấy, que gắp, que trang. Đũa thủy tinh. Giá ỡđ ống nghiệm, rổ nhựa. 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bông thấm nước, bông không thấm nước. Bao nilong hấp, bao nilon kích thước 5x7 cm, dây thun, giấy gói. 2.2 Phương pháp luận 2.2.1. Mục đích Nghiên cứu quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin bằng phương pháp lên men với L. acidophilus. 2.2.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm. Các yếu tố cần phân tích trong mục tiêu này: 1. Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm. 2. Xác định hàm lượng N - tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl. 3. Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn độ formol. 4. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w). Các yếu tố cần phân tích: 1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N. 2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford. 3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thuỷ phân protein. 4. Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men. 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %, 30 % và 35 %. Các yếu tố cần phân tích: 1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N. 2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford. 3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mức độ thuỷ phân protein. 4. Xác định hàm lượng N - tổng có trong dịch sau lên men. 5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS). Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương. Đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm. Xác định Xác định Xác định Xác định độ ẩm ban hàm lượng hàm lượng hàm lượng đầu và hàm N – tổng N – amin N - protein lượng có trong có trong hoà tan có khoáng của vỏ tôm. vỏ tôm. trong vỏ vỏ tôm. tôm. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA. Xác định Xác định Xác định Xác định lượng acid hàm lượng hàm lượng hàm lượng lactic sinh N- protein N - amin N - tổng ra trong hoà tan có trong có trong quá trình trong dịch dịch lên dịch sau lên men. lên men. men. lên men. Tìm được tỉ lệ nước thích hợp cho quá trình lên men. 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng LA. Xác định Xác định Xác định Xác định Xác định lượng acid hàm hàm hàm lượng lactic sinh lượng N - lượng N - lượng N - đường ra trong protein amin có tổng có khử còn quá trình hoà tan trong trong vỏ lại sau lên men. trong dịch lên tôm. quá trình dịch lên men. lên men. men. Tìm được tỉ lệ đường thích hợp cho quá trình lên men. Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương. Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của toàn bộ đồ án. 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm. Tiến hành: vỏ tôm đã qua xử lý được thêm vào 20 ml nước cất, sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, lặp lại 2 lần. Phần dịch sau hai lần ly tâm được trộn lẫn và định mức tới 50 ml gọi là dịch D1, rắn sau ly tâm gọi là R1. Vỏ tôm đã xử lý (10g) 20 ml nước cất Khuấy trộn Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Rắn sau ly tâm Thu dịch 20 ml nước cất Khuấy trộn Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Rắn R1 Thu dịch Định mức 50 ml Dịch D1 Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt của nội dung 1. Các yêu cầu của nội dung nghiên cứu 1 được thực hiện theo sơ đồ hình 2.2: 1. Xác định độ ẩm ban đầu và hàm lượng khoáng của vỏ tôm. 2. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong vỏ tôm bằng phương pháp Kjeldahl. 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Xác định hàm lượng N - amin có trong vỏ tôm theo phương pháp chuẩn độ formol. 4. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong vỏ tôm bằng phương pháp Bradford. Các phương pháp thực hiện được trình bày ở phần phương pháp tiến hành. 2.3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện quy trình lên men với các tỉ lệ nước 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1 và 2,5:1 (v:w).  Chuẩn bị: Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông. Giống L. acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1 g vào 100 ml nước cất, khuất đều (10 8CFU/ml).  Tiến hành: Cho vào bao nilon các thành phần sau: Bột vỏ tôm: 10 g. Đường D – glucose: 1,5 g. NaCl: 0,2 g. Nước:đầu tôm với các tỉ lệ thí nghiệm (v:w): 0,5:1; 1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1. Giống L. acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml. Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 24, 48, 60, 72 giờ, đem dịch lên men đi ly tâm 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly tâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch. Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộn đều và định mức đến 50 ml (dịch D2), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng nước (cặn R2). 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 10 g vỏ tôm đã xử lý Đư ờng D - glucose: 1,5 g. NaCl: 0,2 g. Nư ớc: với các tỉ lệ thí Khuấy trộn nghiệm. Gi ống L. acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml. Lên men yếm khí (nhiệt độ phòng, ở các thời gian 24, 48, 72, 96 giờ) Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Rắn sau ly tâm Thu dịch 20 ml nước cất Khuấy trộn Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Rắn R2 Thu dịch Định mức 50 ml Dịch D2 Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của nội dung nghiên cứu 2. Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian = 120 nghiệm thức. Các yếu tố cần xác định trong phần thí nghiệm này: 1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N. 2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford. 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mứ độ thuỷ phân protein. 4. Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men. Dựa vào kết quả của các thí nghiệm trên, ta tìm ra tỉ lệ nước thích hợp nhất cho quá trình lên men. 2.3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. Thực hiện lên men với các tỉ lệ đường 15 %, 20 %, 25 %, 30 % và 35 %.  Chuẩn bị: Vỏ tôm đã xử lý và bảo quản ở -4 oC được đem rã đông. Giống L. acidophilus được hoạt hoá bằng cách cho gói ANTIBIO 1g vào 100ml nước cất, khuất đều (108CFU/ml).  Tiến hành: Thực hiện thí nghiệm như hình 2.4, nhưng khác phần nguyên liệu và thời gian lên men. Cho vào bao nilon các thành phần sau: Bột vỏ tôm: 10 g. Đường D – glucose với các tỉ lệ thí nghiệm: 1,5 g; 2 g; 2,5 g; 3 g; 3,5 g. NaCl: 0,2 g. Nước:đầu tôm với tỉ lệ (v:w): 2,5:1. Giống L. acidophilus đã hoạt hoá: 1 ml. Trộn đều các thành phần trên, sau đó cột chặt bằng thun để tạo điều kiện kị khí và đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 48, 60, 72, 96 giờ, lấy các bao nilon đi ly tâm 4000 vòng trong 10 phút, thu dịch, sau đó cho thêm 20 ml nước cất vào, trộn đều và ly tâm thêm 4000 vòng trong 10 phút thu dịch. Cả 2 phần dịch sau ly tâm được trộn 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đều và định mức đến 50 ml (dịch D3), phần cặn sau đó được rửa nhiều lần bằng nước (cặn R3). Tổng số nghiệm thức cần thực hiện: 1 giống x 5 tỉ lệ x 3 lặp lại x 4 thời gian = 120 nghiệm thức. Các yếu tố thí nghiệm: 1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N. 2. Xác định hàm lượng N protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường bằng phương pháp Bradford. 3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường theo phương pháp chuẩn độ formol để đánh giá mứ độ thuỷ phân protein. 4. Xác định hàm lượng tổng nitơ có trong dịch sau lên men. 5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp acid dinitro – salisylic (DNS). Từ các kết quả đạt được, ta tính toán được tỉ lệ đường nào thích hợp nhất cho quá trình lên men. 2.3.4. Nội dung 4: so sánh phương pháp khử protein và khoáng bằng phương pháp lên men lactic với phương pháp hoá học. Khử khoáng và khử protein được thể hiện bằng tỉ lệ phần trăm như mô tả của Rao và cộng sự (2000): [ × ] − [ × 푅] % = 푅 × 100 [ × ] [푃 × ] − [푃 × 푅] % 푃 = 푅 × 100 [푃 × ] Với: %DM: tỉ lệ phần trăm khử khoáng. %DP: tỉ lệ phần trăm khử protein. PO và PR: nồng độ protein trước và sau lên men. 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP AO và AR: % tro trong mẫu trước và sau lên men. O và R: khối lượng mẫu trước và sau lên men. Từ công thức trên ta tính được hiệu suất khử khoáng và khử protein của cả hai phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và sinh học. 2.3.4.1. So sánh hiệu suất khử khoáng của quy trình thí nghiệm với quy trình phương pháp hoá học. Phương pháp lên men lactic Từ các nội dung nghiên cứu 2 và 3, ta tìm ra được tỉ lệ nước : vỏ đầu tôm và tỉ lệ đường thích hợp cho quá trình lên men, dùng nghiệm thức đã chọn để xác định khoáng trong mẫu còn lại nhằm so sánh hiệu suất với quá trình khử khoáng của phương pháp hoá học. Phương pháp hoá học 10 g Vỏ tôm đã được xử lý HCl 0,25 M tỉ lệ 1:40 w:v Lắc 2 giờ ở nhiệt độ phòng Lọc Thu cặn Xác định hàm lượng khoáng Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.1. Cân 10 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm HCl 0,25 M với tỉ lệ 1:40 w:v. Lắc ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ, lọc chân không và thu cặn. Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng khoáng (cách xác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành). 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.4.2. So sánh hiệu suất xử lý protein của quy trình thí nghiệm với quy trình từ phương pháp hoá học. Phương pháp lên men lactic Tương tự như khi so sánh hiệu suất khử khoáng, dùng nghiệm thức này để định lượng N tổng số nhằm so sánh hiệu suất với quá trình xử lý protein của phương pháp hoá học. Phương pháp hoá học Cân 20 g vỏ tôm đã qua xử lý vào bình tam giác 1 l, cho thêm NaOH 1 M với tỉ lệ 15 mg/l. Ủ ở 70 oC trong 24 giờ, lọc chân không và thu cặn. Phần cặn sau đó được đem đi xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (cách xác định được trình bày ở phần phương pháp tiến hành). 20 g Vỏ tôm đã được xử lý NaOH 1 M với tỉ lệ 15mg/l Ủ 70 oC trong 24 giờ Lọc Thu cặn Xác định hàm lượng N tổng số. Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.2. 2.4 Phương pháp tiến hành 2.4.1. Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích Tiến hành Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0) Cân mẫu Rx chính xác đến 0,001 g, cho vào cốc trên (m1) 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Để cốc có chứa mẫu Rx vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 ºC ± 2 ºC thời gian 3 giờ. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến 0,001 g (m2). Lập lại thao tác trên nhưng ỗm i lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 2 mg hoặc 4 mg tuỳ theo khối lượng của phần mẫu thử. Tính toán Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau: Độ ẩm (%)=([m1 – m2] * 100)/(m1 – mo) Trong đó: mo : khối lượng cốc không (g) m1 : khối lượng cốc và ẫm u trước khi sấy (g) m2 : khối lượng cốc và ẫm u sau khi sấy (g) 2.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu phân tích Tiến hành Cho chén nung vào tủ sấy trong 2 giờ. Sau đó lấy chén ra và làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0,001 g (mo). Cân khoảng 2 g mẫu Rx ở trạng thái khô không khí và cho vào chén nung đã biết khối lượng với độ chính xác 0,001 g. Cho chén và mẫu vào tủ sấy, sấy ở 105 oC trong 2 – 3 giờ để cho nước có trong mẫu bay đi hết, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung và nung ở nhiệt độ 500 – 550 ºC trong 2 giờ. Lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng m2. Kết quả Hàm lượng tro thô của mẫu Rx được tính bằng % theo công thức: X = ([m2 – m0] *100) /m1 Trong đó: 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP X : hàm lượng tro thô của mẫu (%). m2: khối lượng chén và ẫm u sau khi nung (g). m0 : khối lượng chén (g). m1 : khối lượng mẫu thử trước khi nung (g). 2.4.3. Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men Độ acid được xác định bằng cách trung hòa với NaOH, sử dụng thuốc thử phenolphtalein Tiến hành Cho 30 ml dịch Dx vào bình tam giác, thêm 3 giọt phenolphtalein. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi dịch chuyển sang màu hồng tím. Kết quả % Khối lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức: %g acid lactic = VNaOH/30*50/10*0.1/1000*90*100 Trong đó: VNaOH: thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ được. 30: số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ. 50: tổng số ml dịch Dx. 0,1: nồng độ NaOH dùng chuẩn độ. 1000: hệ số chuyển đổi ra g. 90: mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx. 2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch sau lên Tiến hành Cho vào bình 10 ml dung dịch Dx, 15 giọt chit thị hỗn hợp, chỉnh độ pH bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi màu xanh xuất hiện. 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cho thêm 5 ml formol trung tính, lúc này dung dịch có màu vàng rơm. Chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi xuất hiện màu tím. Mẫu trắng: thực hiện như trên, thay 10 ml Dx bằng 10 ml nước cất. Tính kết quả (푛 −푛 )×0,007×50×1000 푖푛 = 1 2 10×10 Trong đó: N amin: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg/g). n1: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu thí nghiệm. n2: số ml NaOH 0,05 N để chuẩn độ mẫu trắng. 0,007: số g N amin tương ứng với 1ml NaOH 0,05N. 50: số ml dung dịch mẫu Dx ban đầu. 1000: hệ số chuyển đổi mg ra g. 10: số ml dung dịch Dx đem chuẩn độ. 10: số g nguyên liệu ban đầu. 2.4.5. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch sau lên men bằng phương pháp Bradford Nguyên tắc Các protein khi phản ứng xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. Tiến hành Lập đồ thị chuẩn Để dung dịch albumin có nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Số ống ĐC 1 2 3 4 5 Nồng độ albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 Vml albumin 0 1 1 1 1 1 Vml H2O 1 0 0 0 0 0 Coomassie(ml) 2 2 2 2 2 2 Mẫu thí nghiệm: hút 0,1ml dịch Dx và 5ml thuốc thử Coomassie. Ủ mẫu 20 phút và đo OD ở bước sóng 595nm. Kết quả Từ kết quả đo OD vẽ ra đồ thị đường chuẩn albumin dạng y = ax + b Hàm lượng N protein (mg/g) =([y-b]/a)*50/10/6,25 Trong đó: y là kết quả OD của mẫu thí nghiệm a và b là hai hằng số trong đường chuẩn albumin. 50: số ml dịch Dx. 10: số g nguyên liệu ban đầu. 6,25: hệ số chuyển đổi từ protein hoà tan sang N protein. 2.4.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số có trong vỏ tôm sau khi lên men Tiến hành Vô cơ hóa mẫu Cân 0,2 g mẫu bột vỏ tôm cần xác định N tổng, cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5 ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxy hóa). Cho thêm vào 0,2 g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. Cất đạm Chuyển 25 ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50 ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 20 ml NaOH 45 % cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh láạ m (thêm 5 ml NaOH 45 % nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh láạ m ). Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20 ml H2SO4 0,1 N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 45 %. Sau khi cất đạm 20 – 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ không đổi màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. Chuẩn độ Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.,1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh láạ m , ghi nhận thể tích NaOH 0,1N sử dụng. Tính kết quả: Khối lượng nitơ tổng số có trong mẫu được tính theo công thức: N (g) = [{1,42 * (V1-V2)*100/a}*4/1000]*10/100 Trong đó: V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng. V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ. 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP a: số g nguyên liệu đem vô cơ hoá mẫu. 1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ. 2.4.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men Hàm lượng N tổng trong dịch sau lên men (mg/g) được tính bằng công thức N tổng trong dịch (mg/g) = N protein (mg/g) + N amin (mg/g) 2.4.8. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp DNS Tiến hành Lập phương trình đường chuẩn D – glucose: Cân 1 g D – glucose tinh khiết 99 % pha loãng với nước cất đến 100 ml (dung dịch 1) Bảng 2.3. Phương pháp lập đường chuẩn DNS Ống nghiệm ĐC’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ Dung dịch 1 (ml) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Nước cất (ml) 10 9,9 9,7 9,5 9,3 9,1 Lấy 1 ml từ 7 ống nghiệm trên (dung dịch 2) cho vào 7 ống ủ mẫu Ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Dung dịch 2 (ml) 1 1 1 1 1 1 Thuốc thử DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 Đậy nắp các ống nghiệm ĐC, 1, 2, 3, 4, 5 lại, đun cách thuỷ 5 phút, để nguội và đo ở bước sóng 540mm. Từ kết quả OD, vẽ đồ thị đường chuẩn D – glucose. 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mẫu thí nghiệm: Pha loãng dịch Dx tỉ lệ n lần, lấy 1ml dịch đã pha loãng với 3 ml thuốc thử DNS đun cách thuỷ 5 phút, để nguội và đo ở bước sóng 540 mm. Chú ý pha loãng sao cho kết quả OD của mẫu thí nghiệm nằm trong khoảng đường chuẩn D – glucose. Kết quả Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được X (mg/ml) đường khử trong dung dịch Dx pha lõang, nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc. Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X*n*V/m Trong đó: X: lượng đường khử trong dung dịch Dx pha lõang (mg/ml). V: thể tích dịch Dx (ml) m: khối lượng mẫu ban đầu (g) n: hệ số pha loãng. 42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Nội dung 1: xác định thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ đầu tôm. Để thuận tiện cho các tính toán về sau và xác định hiệu suất quá trình lên men, việc xác định các thành phần hoá học trong vỏ tôm là điều rất cần thiết. Bảng 3.1. Thành phần hoá học của vỏ tôm Thành phần Nguyên liệu vỏ tôm (% khối lượng tươi) Ẩm độ 77,43 ± 8,31 Khoáng 6,41 ± 0,22 N tổng số 4,07 ± 0,06 N amin (dịch trích ly) 0,037 ± 0,018 N protein (dịch trích ly) 0,059 ± 0,018 Theo Black và Schwartz (1950), chitin chứa 6,9 % là N trong thành phần, từ các thành phần trên, có thể suy ra % khối lượng chitin trong mẫu. Trong vỏ tôm, N tồn tại ở hai dạng: vô cơ và hữu cơ. Có thể nói, N vô cơ chủ yếu trong vỏ tôm là N của chitin, vậy nên, N chitin = N tổng số – N hữu cơ. Mặt khác, N hữu cơ trong vỏ tôm sau quá trình ly tâm có thể tính bằng công thức: N tổng trong dung dịch = N protein +N amin. Từ đó, ta suy ra được % Chitin trong mẫu được tính bằng công thức: % chitin = (% N tổng số – [% N protein + % N amin]) x 6,9 = 27,42 % So với các nghiên cứu trước đây trên thế giới (trung bình 27%), %chitin trong bài báo cáo này không có thay đổi gì đáng kể. 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus Trong vỏ tôm tồn tại nhiều ion kim loại nhưng nhiều nhất là Ca2+ và Mg2+. Vì vậy, quá trình khử khoáng trong vỏ tôm nhằm thu nhận chitin chủ yếu là loại bỏ hai ion này. Ca2+ và Mg2+ đều có khả năng tạo thành muối tan trong HCl và các acid hữu cơ như acid lactic. Tỉ lệ nước rất quan trọng đối với quá trình lên men lactic vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới lượng acid lactic sinh ra trong phản ứng. Trong quy trình lên men vỏ đầu tôm thu chitin, vấn đề này lại càng quan trọng hơn, vì lượng acid sinh ra ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình khử khoáng nhằm thu nhận chitin. 3.2.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước Trong quá trình lên men, từ 24 giờ đầu tiên, kết quả đã cho thấy có sự lên men ở tất cả các tỉ lệ nước. pH của dịch lên men giảm từ 7 xuống còn khoảng 4 và giữ nguyên ở các thời gian tiếp theo. Lượng acid sinh ra qua các thời gian có sự tăng lên rõ rệt. % Khối lượng acid lactic tổng hợp trong quá trình lên men với các tỉ lệ nước:nguyên liệu 4.00 3.50 3.00 0,5 : 1 % acid lactic 2.50 2.00 1 : 1 1.50 1,5 : 1 1.00 2 : 1 0.50 0.00 2,5 : 1 24 48 72 96 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.1. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ nước sau các thời gian lên men. 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Theo kết quả ở hình 3.1, % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ đều có sự khác biệt với sai khác có ý nghĩa thống kê với p – value ≤ 0,05. Ở tỉ lệ nước 2,5:1 v:w có thể cho thấy lượng acid lactic nhiều hơn hẳn so với các tỉ lệ nước khác và các thời gian khác. Tuy nhiên, ở các thời gian và tỉ lệ nước này, người làm đề tài chưa tìm ra được đỉnh của quá trình sinh acid lactic là tại thời điểm nào. Vì vậy, nên kéo dài thời gian lên men thêm để có thể xác định chính xác thời gian sinh mà quá trình lên men sinh acid lactic nhiều nhất. 3.2.2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford. HÀM LƯỢNG N-PROTEIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚC KHÁC NHAU 6.00 5.00 HÀM LƯỢNG 4.00 0,5 : 1 N-PROTEIN 3.00 1 : 1 (mg/g) 2.00 1,5 : 1 1.00 2 : 1 0.00 2,5 : 1 0 24 48 72 96 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.2. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. Trong quá trình lên men lactic, L. acidophilus đã phân huỷ một phần protein trong dịch lên men thành N amin. Điều này lý giải cho việc hàm lượng N protein giảm dần qua các thời gian một cách rõ rệt. Ở các tỉ lệ nước, tỉ lệ 2,5:1 v:w cho thấy hàm lượng N protein giảm rõ rệt nhất và khác biệt với các tỉ lệ nước khác với mức ý nghĩa thống kê p – value ≤ 0,05. 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước Hàm lượng N - amin của có trong dịch sau các thời gian lên men được trình bày ở hình 3.4. HÀM LƯỢNG N-AMIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚC KHÁC NHAU 4.50 4.00 3.50 3.00 0,5 : 1 HÀM LƯỢNG 2.50 N-AMIN (mg/g) 1 : 1 2.00 1.50 1,5 : 1 1.00 2 : 1 0.50 2,5 : 1 0.00 0 24 48 72 96 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.3. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. Qua các thời gian, lượng N - amin trong dịch lên men tăng lên đáng kể. Điều này cho thấy có sự phân giải protein trong vỏ tôm nguyên liệu thành các N - amin. Sự sai khác giữa các thời gian lên men cũng như các tỉ lệ nước đều mang ý nghĩa thống kê với p –value ≤ 0,05 nhưng không khác biệt rõ ràng ở các tỉ lệ nước, cụ thể là có sự tương đồng ở hai tỉ lệ 2,5:1 và 2:1 (v:w). Nhìn vào đồ thị và số liệu, có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1 v:w và thời gian 96 giờ, hàm lượng N - amin đạt cực đại. Tuy nhiên, sự khác biệt về hàm lượng N - amin ở các tỉ lệ nước là không đáng kể cũng như chưa thất được đỉnh của quá trình phân giải protein. Người thực hiện đề tài nên kéo dài thời gian lên men để tìm ra thời gian thích hợp nhất cho quá trình này. 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men Tổng N có trong dung dịch sau lên men tức tà N của protein thịt tôm được hòa tan vào dịch lên men lactic. Giá trị này bao gồm N - protein hòa tan, N - amin có nguồn gốc từ protein thủy phân, nhưng giá trị này không bao gồm được phần N đã bị vi khuẩn đồng hóa. Do đó giá trị này được sử dụng để tham khảo, là bằng chứng của protein thịt tôm hòa tan vào dịch lên men có thể giảm nếu tốc độ đồng hóa của vi khuẩn cao hơn tốc độ hòa tan và thủy phân. HÀM LƯỢNG N TỔNG SỐ TRONG DUNG DỊCH (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ NƯỚC KHÁC NHAU 8.00 7.00 0,5 : 1 HÀM LƯỢNG 6.00 N tổng (mg/g) 5.00 1 : 1 4.00 1,5 : 1 3.00 2 : 1 2.00 1.00 2,5 : 1 0.00 0 24 48 72 96 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.4. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. Dựa vào hình trên, ta có thể thấy ở tỉ lệ nước 2,5:1, hàm lượng tổng N không khác biệt nhiều khi so sánh giữa các ỉt lệ nước. Điều này hợp lý vì protein hòa tan từ trong thịt đầu tôm vào nước có thể tồn tại dưới dạng protein hay dạng thủy phân của chúng. Tóm lại, dựa vào các kết quả thu được ở nội dung nghiên cứu 2, người thực hiện đề tài đã lựa chọn tỉ lệ nước 2,5:1 v:w vì nhận thấy rằng ở tỉ lệ nước này, khả năng sinh acid lactic là lớn nhất, các kết quả N - protein thấp hơn, N - amin cao hơn so với các tỉ lệ còn lại. 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đồng thời, các khoảng thời gian lên men ở các thí nghiệm trên chưa cho biết được thời gian có lượng acid lactic là lớn nhất, người thực hiện đề tài đã kéo dài thời gian lên men lactic vỏ đầu tôm và tiến hành lấy mẫu khảo sát ở 48, 72, 96 và 120 giờ để tìm ra thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên men. 3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. Đường là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men lactic. Đề tài này sử dụng nguồn đường D – glucose vì đây là nguồn đường dễ sử dụng nhất cho VSV. Việc xác định hàm lượng đường trong quá trình lên men rất quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới cá quá trình sinh tổng hợp của VSV. Nếu L. acidophilus đủ cơ chất để hoạt động, quá trình lên men sẽ đạt cực đại về lượng acid sinh ra, đồng thời các enzyme hoạt động cũng mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên, nếu chọn hàm lượng đường quá cao sẽ ức chế VSV phát triển, nếu quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho VSV sống, cả hai vấn đề này đều ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình lên men. 3.3.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường Trong quá trình lên men, pH của dịch lên men luôn ở khoảng 4 đến 4,5. Tuy nhiên, ở mốc thời gian 120 giờ, pH đã tăng lên khoảng từ 4,8 đến 5. Điều này chứng tỏ đến thời gian này xuất hiện một quá trình khác đan xen, có thể là do hoạt động của các enzyme decarboxylase do vi khuẩn lactic sinh ra, làm xuất hiện các bioamine, dẫn đến tăng pH. Hiện tượng này cũng thừơng xuất hiện ở thực phẩm lên men. Để kéo dài thời gian lên men lactic và giữ pH ổn định lâu dài ở 4 - 4,5, cần tuyển chọn những chủng không có hoạt lực amino acid decarboxylase. 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP % Khối lượng acid lactic tổng hợp trong quá trình lên men với các tỉ lệ đường 7.00 6.00 5.00 15 % 4.00 20 % acid lactic % 3.00 25 % 2.00 30 % 1.00 0.00 48 72 96 120 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.5. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường khác nhau Nhìn vào đồ thị trên, ta có thể nhận thấy mốc thời gian 96 giờ cho kết quả % khối lượng acid lactic tốt nhất và đạt đỉnh của quá trình sinh acid lactic ở tỉ lệ đường 35 %. Nhưng theo các số liệu đạt được, sự sai khác giữa hai tỉ lệ 25 và 30 % là không đáng kể. 3.3.2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường Cơ chất đường có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình sinh trưởng của L. acidophilus, từ đó gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình phân huỷ protein trong vỏ tôm, vì nếu VSV không phát triển tốt sẽ không sinh nhiều enzyme protease, enzyme chính trong quá trình khử protein. 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HÀM LƯỢNG N - PROTEIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC NHAU 6.00 5.00 15% 4.00 20% HÀM LƯỢNG N-PROTEIN 3.00 25% (mg/g) 2.00 30% 35% 1.00 0.00 0 48 72 96 120 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.6. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. Nhìn vào đồ thị, có thể thấy rõ sự giảm mạnh của hàm lượng N - protein qua các thời gian. Tuy nhiên, sự suy giảm hàm lượng N - protein trong dung dịch gần như đồng đều ở tất cả các tỉ lệ nước và các sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê do p – value >0,05. Với kết quả này, người thực hiện đề tài không thể xác định với tỉ lệ nước nào thì cho kết quả hàm lượng N protein giảm nhiều nhất, hay nói cách khác, không có sự khác biệt về khả năng phân huỷ protein của L. acidophilus ở các tỉ lệ nước khác nhau. 3.3.3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường. Kết quả trên đã cho thấy, với thời gian 96 giờ, hàm lượng N - amin đạt cực đại. Tuy nhiên, khác biệt về sự ảnh hưởng của tỉ lệ đường đến hàm lượng N - amin là chỉ có ý nghĩa thống kê (p – value ≤ 0,05) để phân biệt tỉ lệ đường 15 %, 20 % với 25-30 % và 35 %, nhưng không có khác biệt giữa 25 và 30 % đường bổ sung. 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Điều này phù hợp với kết quả theo dõi ảnh hưởng của tỉ lệ đường lên % acid lactic tạo thành. Hàm lượng N - amin phản ảnh hoạt tính thủy phân protein của vi khẩun lactic trong lên men lactic do đó phải tương đồng với cường độ lên men. Trong khi đó hàm lượng N - protein không phản ánh nhiều lắm hoạt động thủy phân, nhưng tổng số N - protein và N - amin lạ là bằng chứng của sự khử protein ra khỏi vỏ đầu tôm. HÀM LƯỢNG N - AMIN (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC NHAU 4.50 4.00 3.50 15 3.00 % 20 2.50 % HÀM LƯỢNG 25 N-AMIN (mg/g) 2.00 % 30 1.50 % 1.00 0.50 0.00 0 48 72 96 120 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.7. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. 3.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch lên men Hàm lượng N tổng trong dịch D3 được tính như thí nghiệm trên. 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HÀM LƯỢNG NITƠ TỔNG TRONG DUNG DỊCH (mg/g) SAU CÁC THỜI GIAN LÊN MEN VỚI CÁC TỈ LỆ ĐƯỜNG KHÁC NHAU 8.00 7.00 HÀM LƯỢNG 6.00 15% NITƠ (mg/g) 5.00 4.00 20% 3.00 25% 2.00 30% 1.00 35% 0.00 0 48 72 96 120 THỜI GIAN (GiỜ) Hình 3.8. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. Qua kết quả trên (hình 3.9), có thể thấy trừ ở tỉ lệ 35% D – glucose bổ sung, hàm lượng N tổng giảm tương đương nhau với sai khác không mang ý nghĩa thống kê. Việc N - tổng số giảm như đã nói ở trên có thể do bị vi khuẩn sử dụng tiếp tục sự dụng, tuy nhiên chưa có bằng chứng rõ ràng. 3.3.5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men Lượng đường tồn dư cũng là một thông số sử dụng để kiểm soát quá trình lên men. Lượng đường bổ sung làm cơ chất cho quá trình lên men không nên tồn dư sau lên men dễ dẫn đến làm cơ chất cho những vi sinh vật khác. Bảng 3.2 cho thấy với tỉ lệ đường bổ sung 15, 20, lên men lactic tiêu thụ cạn kiệt đường, bổ sung 25 %, đường tồn dư rất ít chỉ còn 10 mg/g nguyên liệu và hết sau 120 h, trong khi với 30, 35% đường bổ sung thì lượng đường tồn dư tương đương nhau, tồn dư 35 mg/g nguyên liệu sau 96 giờ và 10 mg/g nguyên liệu sau 120 giờ. 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng đường khử (mg/g) trong dịch sau lên men % D-glucose Giờ 15% 20% 25% 30% 35% 0 228,0 250,6 280,7 319,0 358,2 48 19,9 26,4 39,4 94,4 95,5 72 9,8 10,8 31,0 69,2 86,3 96 0,0 0,0 9,6 34,2 38,8 120 0,0 0,0 0,0 9,6 9,8 Dựa vào bảng số liệu trên, ta có thể rằng lên men lactic cho % lactic acid cực đại ở 96 giờ nhưng sau đó vẫn tiếp tục sử dụng đường và nguồn Nitơ trong dịch lên men. Liệu đây có phải là tạp nhiễm hay không điều này còn cẩn được làm rõ nhằm tối ưu hóa các thông số của quá trình sau này. Tóm lại, dựa vào các thí nghiệm trên, người thực hiện đề tài đã rút ra các kết luận sau đây: Về tỉ lệ nước, tỉ lệ nước 2,5:1 v:w đã cho các kết quả về % khối lượng acid lactic và khả năng phân huỷ protein tốt hơn so với các tỉ lệ nước khác. Có thể nói đay là tỉ lệ nước tối ưu cho quá trình lên men Về tỉ lệ D – glucose, ở tỉ lệ 25 – 30 % và 96 giờ, kết quả đã cho thấy đây là đỉnh của quá trình sản sinh acid lactic, điều kiện cho quá trình phân huỷ Canxi trong vỏ tôm nhằm thu chitin. Ngoài ra, các kết quả về khả năng phân huỷ protein của L. acidophilus ở tỉ lệ này cũng rất tốt. Vì các lý do trên, người thực hiện đề tài đã chọn ra được quy trình lên men được cho là tối ưu nhất để tiến hành lên men thu chitin từ vỏ tôm bằng L. acidophilus như sau: 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyên liệu: Đầu vỏ tôm sú, bổ sung đường 25 – 30 %, bổ sung muối 2 %, tỉ lệ nước/nguyên liệu = 2,5:1, tỉ lệ cấy giống 1 % so với nguyên liệu tươi, tương đương 108 cfu/ml. Thời gian lên men lactic 96 giờ, sau đó thu hồi chitin bằng cách ly tâm rửa thu hồi bã sấy khô. 3.4. Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương Ứng dụng công nghệ sinh học trong vấn đề xử 1ý chất thải rắn cũng như tái sử dụng chất thải biến chúng thành các sản phẩm có giá trị chỉ có thể đi vào thực tế được khi các quá trình sinh học này có hiệu quả tương đương các quá trình hóa học. Khử khoáng bằng phương pháp hóa học được thực hiện ở nhiệt độ phòng với HCl 0,25 M trong 2 giờ và khử protein bằng NaOH 1 M ở 70 oC trong 24 giờ. So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương theo công thức của Rao và cộng sự (2000). Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic và quá trình hóahọc sử dụng HCl được trình bày trên bảng 3.3. Với quy mô nhỏ phòng thí nghiêm có thể thấy hai quá trình khử khoáng hóa học và sinh học là tương đương và khử khoáng hầu như triệt để. Bảng 3.3. Hiệu quả khử khoáng Quy % khoáng KL mẫu % khoáng KL mẫu HS khử trình đầu ban đầu, g sau sau, g khoáng, % PPHH 6,41 10 0,028 6,95 99,7 PPSH 6,41 10 0,015 6,11 99,9 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khác với quá trình khử khoáng, quá trình khử protein sinh học tỏ ra còn thua xa quá trình khử protein hóa học, mới đạt 30 % so với 73 % của quá trình sinh học (Bảng 3.3) Bảng 3.4. Hiệu quả khử protein Quy % N tổng KL mẫu % N tổng KL mẫu HS khử trình số đầu ban đầu, g số sau sau, g protein, % PPHH 4,07 20,00 2,27 9,79 72,7 PPSH 4,07 10,00 5,02 5,70 29,9 Quá trình lên men lactic chủ yếu là để khử khoáng, tận dụng enzyme protease của vi khuẩn lactic để khử protein, nhưng enzyme protease của vi khuẩn lactic thường yếu hơn rất nhiều vi sinh vật khác. Muốn tăng hiệu quả cần nghiên cứu bổ sung chế phẩm protease thương mại hoặc sử dụng các vi sinh vật sinh protease tiềm năng như nhiều nghiên cứu sử dụng Bacillus spp. Từ các kết quả trên đây chúng tôi đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất chitin như sau: 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đường D – glucose: 25-30 % Vỏ tôm đã nghiền <2 mm NaCl: 2 % Nư ớc: vỏ tôm = 2,5:1 (v:w) Trộn đều Gi ống LA đã hoạt hoá: 10 % (108 cfu/ml) Lên men yếm khí (nhiệt độ phòng, 96 giờ) Ly tâm 4000 vòng/phút, 10 phút Rắn sau ly tâm Bỏ dịch Rửa trung tính Khử protein Chitin thô Hình 3.7. Quy trình đề xuất thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng L. acidophilus 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đầu vỏ tôm sú ẩm độ (77,43 ± 8,31) %, khoáng (6,41 ± 0,22) %, N tổng số (theo Kjeldahl) (4,07 ± 0,06) % được ước tính chứa 27,42 % chitin. Quá trình lên men lactic đầu vỏ tôm sử dụng Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm ANTIBIO đạt tỉ lệ acid lactic cao nhất sau 96 giờ khi tỉ lệ nước/nguyên liệu là 2.5:1 và ỉt lệ đường D-glucose bổ sung là 25 – 30 % so với nguyên liệu tươi. Đồng thời, hàm lượng khoáng giảm từ 0,64 đến 0,015 % và khối lượng mẫu giảm 38,9 %, dẫn đến hiệu quả khử khoáng là 99,9 %. Hiệu suất khử khoáng củ phương pháp này tương đương với hiệu suất khử khoáng bằng phương pháp hóa học sử dụng HCl 0,25 M ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ với tỉ lệ 40:1 (thể tích/khối lượng). Cũng trong điều kiện này hàm lượng N protein trong dịch ly tâm sau lên men lactic giảm 72,4 %, nhưng N - amin tăng 62,8 %. Hiệu suất khử protein là 29,9 %, thấp hơn rất nhiều so với cao hơn hiệu suất khử protein bằng phương pháp hóa học là 72,3 % khi sử dụng NaOH 1 M ở nhiệt độ 70 oC trong 24 giờ với tỉ lệ 15:1 (thể tích/khối lượng). Từ đó đề xuất được quy trình khử khoáng từ vỏ đầu tôm sú bằng phương pháp lên men lactic với các thông số kỹ thuật như sau: - Tỉ lệ nứơc/nguyên liệu xay nhuyễn là 2.5:1 v:w. - Tỉ lệ đường bổ sung là 25 – 30 %. - Tỉ lệ cấy giống L. acidophilus là 10 % (108cfu/ml). - Thời gian lên men lactic là 96 giờ. 4.2. Kiến nghị Ngoài L. acidophilus, cần nghiên cứu thêm các giống vi khuẩn lên men lactic khác để chọn ra chủng có hiệu suất cao hơn. Có thể bổ sung thêm các enzyme phân huỷ protein hoặc các chủng VSV khác vào để thu được hiệu suất phân huỷ protein tốt hơn. 57
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có thể nghiên cứu để VSV lên men từ các loại đường khác rẻ hơn, như mật rỉ đường, để giảm giá thành sản suất. Ngoài ra, trong đề tài này chỉ chú trọng phần chitin trong vỏ tôm mà không quan tâm đến một hợp chất cũng không kém phần quan trọng: caroteniod. Nếu trong quá trình lên men ta có thể trích ly cả hợp chất này sẽ thu về một khoảng lợi nhuận không nhỏ cho nhà sản xuất. 58
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu là sách: [1] Nguyễn Văn Mùi (2007), Thực hành hoá sinh học, NXB đại học quốc gia Hà Nội. [2] Phạm Văn Tình (2005), Kỹ thuật nuôi tôm sú, NXB nông nghiệp. Tài liệu là bài báo trong tạp chí: [3] S. Bautista-Ban˜osa, A.N. Herna´ ndez-Lauzardo, M.G. Vela´ zquez- del Valle, M. Herna´ ndez-Lo´ pez , E. Ait Barka, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson (2005). Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities, USA. [4] Luis A. Cira, Sergio Huerta, George M. Hall, Keiko Shirai (2001). Pilot scale lactic acid fermentation of shrimp wastes for chitin recovery, a Departamento de Biotecnologia, Univ ersidad Autonoma Metropolitana, Mexico, D.F. Av . San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina C.P. 09340 Mexicob Department of Chemical Engineering, Loughborough University, UK. [5] Hermann Ehrlich, Petros G. Koutsoukos , Konstantinos D. Demadis , Oleg S. Pokrovsky. Part II. Decalcification, Principles of demineralization: Modern strategies for the isolation of organic frameworks, Micron 4D, 2009, Germany. [6] Maria Hayes. Chapter 4: Chitin, Chitosan and their Derivatives from Marine Rest Raw Materials: Potential Food and Pharmaceutical Applications, , Chitin, Chitosan and Chitooligosaccharides, Ireland. [7] Nicole Krueziger Keppy, Michael W. Allen, Ph.D. The Biuret Method for the Determination of Total Protein Using an Evolution Array 8-Position Cell Changer, Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, USA. [8] Pradip Kumua Dutta, Joydeep Dutta, VS Tripathi (2004). Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications, Department of Chemistry, Motilal Nehru National Institute of Technology, Allahabad 211 004. [9] A. Khanafari, R. Marandi, Sh. Sanatei (2007). Recovery of chitin and chitosan from shrimp waste by chemical and microbial methods, Department of 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Microbiological Sciences, Islamic Azad University, North of Tehran branch, Iran, Department of Environmental Engineering, Islamic Azad University, North of Tehran branch, Iran. [10] Bhaskar Narayan, Suresh Puthanveetil Velappan, Sakhare Patiram Zituji, Sachindra Nakkerike (2009). Yield and chemical composition of fractions from fermented shrimp biowaste, India. [11] Kandra Prameela, Ch. Murali Mohan, P.V. Smitha, K.P.J. Hemalatha (2010). Bioremediation of shrimp biowaste by using natural probiotic for chitin and carotenoid production an alternative method to hazardous chemical method, Department of Biotechnology, GITAM Institute of Technology, Rushikonda, GITAM University, Visakhapatnam 530 045, India. Department of Biochemistry, College of Science and Technology, Andhra University, Visakhapatnam 530 045, India. [12] Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền (2010). Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại, Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội, Viện Chăn nuôi. [13] Ths. Thạch Thanh, Ks. Tăng Minh Khoa, Ks. Phạm Văn Quyết, Ts. Nguyễn Văn Hòa, (2005). Nghiên cứu ứng dụng nước biển nhân tạo trong sản xuất giống tôm sú P( enaeus monodon) qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ Tài liệu là luận văn, luận án [14] Đặng Tiến Đông (2010). Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm, Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh. [15] Bùi Đức Tài (2008), Thiế kế kỹ thuật thiết bị sản xuất chitin năng suất 0,5 tấn/mẻ, khoa cơ khí, trường đại học Nha Trang, Nha Trang. [16] Trần Thị Hoài Thanh (2007), Khảo sát qui trình sản xuất một số sản phẩm tôm đông lạnh tại công ty TNHH thực phẩm Amanda. Đề xuất biện pháp nâng cao chất lượng và tận dụng phế liệu. 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP [17] Đỗ Như Ý (2011), khảo sát quy trình chế biến tôm sú đông lạnh tại công ty cổ phần đầu tư thương mại thủy sản INCOMFISH, trường ĐH Hùng Vương, thành phố Hồ Chí Minh. 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đây là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM. Tất cả các kết quả và số liệu là trung thực, hoàn toàn không sao chép và chưa được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Ngày 1 tháng 8 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Thu i
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Môi Trường và Công nghệ Sinh học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức cơ bản trong suốt 4 năm Đại học. Con xin cảm ơn mẹ ba đã nuôi dạy con khôn lớn, luôn ủng hộ, động viên, tạo mọi điều kiện cho con yên tâm học tập. Em xin gởi lời cám ơn chân thành nhất đến Cô TS Nguyễn Hoài Hương đã tận tình quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Em cảm ơn Thầy Nguyễn Văn Thành, Thầy Nguyễn Trung Dũng đã tạo điều kiện cho em tiến hành thực nghiệm nội dung của đồ án này. Cám ơn các bạn khoá 08 và 09DSH đã luôn động viên, ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ em từ trước tới nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2012 Nguyễn thị Ngọc Thu ii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về Lactobacillus 3 1.1.1. Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus 3 1.1.1.1. Phân loại 3 1.1.1.2. Hình thái 4 1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa 5 1.1.1.4. Đặc điểm sinh thái. 5 1.1.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của L. acidophilus 5 1.2. Tổng quan về tôm sú và nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam 7 1.2.1. Vị trí phân loại 7 1.2.2. Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới 8 1.2.3. Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam 8 1.2.4. Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú 9 iii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.5. Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay 10 1.3. Tổng quan về chitin – chitosan 11 1.3.1. Cấu trúc chitin - chitosan 11 1.3.2. Tính chất hoá học của chitin - chitosan 12 1.3.3. Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay 14 1.3.3.1. Các quy trình sản xuất cổ điển 14 1.3.3.2. Quy trình sản xuất chitin hiện đại 16 1.3.4. Ứng dụng của chitin – chitosan 17 1.3.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp 17 1.3.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp 19 1.3.4.3. Ứng dụng y sinh học 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 21 2.1.2. Thời gian thực hiện 21 2.1.3. Giống vi sinh vật 21 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ 21 2.1.4.1. Nguyên liệu và hoá chất 21 2.1.4.2. Thiết bị 24 iv
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.1.4.3. Dụng cụ 24 2.2 Phương pháp luận 25 2.2.1. Mục đích 25 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1. Nội dung 1: xác định các thông số về thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ tôm. 29 2.3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. 30 2.3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. 32 2.3.4. Nội dung 4: so sánh phương pháp khử protein và khoáng bằng phương pháp lên men lactic với phương pháp hoá học. 33 2.3.4.1. So sánh hiệu suất khử khoáng của quy trình thí nghiệm với quy trình phương pháp hoá học. 34 2.3.4.2. So sánh hiệu suất xử lý protein của quy trình thí nghiệm với quy trình từ phương pháp hoá học. 35 2.4 Phương pháp tiến hành 35 2.4.1. Xác định độ ẩm của mẫu cần phân tích 35 2.4.2. Xác định hàm lượng khoáng trong mẫu phân tích 36 2.4.3. Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men 37 2.4.4. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch sau lên 37 v
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.5. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch sau lên men bằng phương pháp Bradford 38 2.4.6. Xác định hàm lượng nitơ tổng số có trong vỏ tôm sau khi lên men 39 2.4.7. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men 41 2.4.8. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men bằng phương pháp DNS 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43 3.1. Nội dung 1: xác định thành phần hoá học của nguyên liệu vỏ đầu tôm. 43 3.2. Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus 44 3.2.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước 44 3.2.2. Xác định hàm lượng protein hoà tan trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước bằng phương pháp Bradford. 45 3.2.3. Xác định hàm lượng nitơ amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ nước 46 3.2.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch sau khi lên men 47 3.3. Nội dung 3: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L. acidophilus. 48 3.3.1. Xác định lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường 48 vi
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3.2. Xác định hàm lượng N - protein hoà tan có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường 49 3.3.3. Xác định hàm lượng N - amin có trong dịch lên men sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường. 50 3.3.4. Xác định hàm lượng nitơ tổng có trong dịch lên men 51 3.3.5. Xác định lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men 52 3.4. Nội dung 4: So sánh hiệu quả khử khoáng và khử protein bằng phương pháp lên men lactic với các quá trình hóa học tương đương 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1. Kết luận 57 4.2. Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 vii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNS: acid dinitro – salisylic HS: hiệu suất KL: khối lượng N: Nitơ NXB: nhà xuất bản PPHH: phương pháp hoá học PPSH: phương pháp sinh học VSV: vi sinh vật viii
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Bảng 2.3. Phương pháp lập đường chuẩn DNS Bảng 3.1. Thành phần hoá học của vỏ tôm Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng đường khử (mg/g) trong dịch sau lên men Bảng 3.3. Hiệu quả khử khoáng Bảng 3.4. Hiệu quả khử protein ix
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình thái L. acidophilus Hình 1.2. Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin. Hình 1.3. Công thứ cấu tạo của chitin Hình 1.3. Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b) Hình 1.4. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar,viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010. Hình 2.1. Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của toàn bộ đồ án. Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt của nội dung 1. Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm của nội dung nghiên cứu 2. Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.1. Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thiết kế thí nghiệm 4.2. Hình 3.1. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra ở các tỉ lệ nước sau các thời gian lên men. Hình 3.2. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. Hình 3.3. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. Hình 3.4. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ nước khác nhau. x
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.5. Kết quả % khối lượng acid lactic sinh ra sau các thời gian lên men ở các tỉ lệ đường khác nhau Hình 3.6. Kết quả hàm lượng N - protein ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. Hình 3.7. Kết quả hàm lượng N - amin ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. Hình 3.8. Kết quả hàm lượng N tổng ở các thời gian của các tỉ lệ đường khác nhau. xi