Đồ án Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor

106 trang thiennha21 13/04/2022 8281

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_hoat_tinh_khang_khuan_cua_mot_so_cao_chiet.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ LOẠI CAO CHIẾT VÀ BƯỚC ĐẦU ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOA SỨ VÀNG (PLUMERIA RUBRA F. TRICILOR) Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Đinh Vũ Nghị MSSV: 1311100485 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình. TP. HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện ĐINH VŨ NGHỊ
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để có kiến thức và bài báo cáo tốt nghiệp ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ sinh học trường HUTECH đã giảng dạy những kiến thức cơ bản và bổ ích cho em. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt đến thầy ThS. Phạm Minh Nhựt đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy phụ trách phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn thành tốt quá trình thực hành. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong quá trình thực hiện đồ án này. Em cũng xin cảm ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Lời cuối cùng em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô. Tp Hồ Chí Minh, 27 tháng 07 năm 2016 Sinh viên thực hiện ĐINH VŨ NGHỊ
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng 3 1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi 3 1.1.2 Phân loại 3 1.1.3. Đặc điểm hình thái 4 1.1.4. Phân bố 5 1.1.5. Tác dụng dược lý 5 1.1.6. Công dụng 5 1.1.7. Thành phần hóa học và dược chất 6 1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 7 1.2.1 Khái niệm và phân loại 7 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 7 1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng 8 1.2.3.1. Alkaloid 8 1.2.3.2. Flavonoid 10 1.2.3.3. Tinh dầu 11 1.2.3.4. Saponin 12 1.2.3.5. Tannin 13 i
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam 14 1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 15 1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 15 1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 15 1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella 16 1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 17 1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp. 18 1.3.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 20 1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 20 1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis 21 1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 2.1.1. Địa điểm 25 2.1.2. Thời gian 25 2.2. Vật liệu 25 2.2.1. Vật liệu 25 2.2.2. Chủng vi sinh vật 25 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất 25 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 26 2.2.4.1. Thiết bị 26 2.2.5.2. Dụng cụ 26 2.3. Các phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật 27 2.3.2. Phương pháp tăng sinh 27 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu 28 2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào 28 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu 28 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 29 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học 29 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu 32 2.4. Bố trí thí nghiệm 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng. 36 2.4.3. Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng. 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng 40 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị. 41 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. 44 3.3.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 46 3.3.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 48 3.3.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 50 3.3.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại. 53 3.3.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh 55 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. 59 Kết luận và kiến nghị 62 1. Kết luận 62 2. Kiến nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục 1 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar DMSO: Dimethyl Sulfoxide NA: Non activity DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. 55 Bảng 3.2. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. 59 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hoa Sứ vàng 3 Hình 1.2. Cây Hoa Sứ vàng 4 Hình 1.3. Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid 6 Hình 1.4. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử 16 Hình 1.5. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử. 17 Hình 1.6. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.7. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử. 19 Hình 1.8. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử. 20 Hình 1.9. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử. 22 Hình 1.10. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử 23 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33 Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu cao Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi khác nhau. 34 Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ vàng với các chủng vi khuẩn chỉ thị. 36 Hình 2.4. Quy trình định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng. 38 Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi 40 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. 42 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. 44 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. 46 Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. 49 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. 51 Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn còn lại. 53 vii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài trong tổng số 12.000 loài theo ước tính. Trong số đó, nguồn tài nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Kết quả điều tra nguồn tài nguyên cây thuốc của Viện Dược liệu (2006) cho biết ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc. Trong thời gian qua, nước ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký lưu hành hàng năm. Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế xuất thuốc trong nước là rất lớn. Không những vậy, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng đang được các nước trên thế giới hết sức quan tâm. Cây thuốc được coi là di sản quý báu của dân tộc ta.Từ xa xưa, cây thuốc gắn liền với cuộc sống của các gia đình người Việt và có giá trị lớn trong điều trị bệnh. Tuy chỉ là những cỏ cây gần gũi, thân quen xung quanh con người nhưng chúng được sử dụng tạo ra các bài thuốc rất hữu hiệu. Các loài thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ, độc hại cho người sử dụng và có khả năng dung nạp tốt với cơ thể sống.Hiện nay, hoạt tính kháng khuẩn của cây thuốc ngày càng được nghiên cứu và phát triển nhiều hơn bởi các nhà khoa học đã nhận ra các giá trị to lớn từ cây thuốc mang lại cho việc điều trị bệnh. Trong thời đại mà việc sử dụng thuốc kháng sinh không còn hiệu quả thì thảo dược tự nhiên là câu trả lời đáng tin cậy và dài hạn cho việc ức chế vi sinh vật có hại và nâng cao đề kháng, hỗ trợ tốt cho quá trình điều trị bệnh. Theo một số nghiên cứu, các loại thảo dược điển hình như Trầu Không (Piper betle L.), Sống Đời (Kalanchoe pinnata (Lam). Pers.), Lô hội (Aloe barbadensis), Dâu Tằm (Morus acidosa Griff), Khổ Qua (Momordica charantia L.) đã được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. Chính vì thế mà ngày nay, không chỉ riêng ở Việt Nam mà cả trên thế giới, các nhà 1
Đồ án tốt nghiệp khoa học không ngừng nghiên cứu và tìm hiểu sâu hơn về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của các loài thực vật.Điều này giúp họ sử dụng hiệu quả hơn các nguồn dược liệu sẵn có, đồng thời phát hiện thêm các loại thảo dược mới, quý hiếm, có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh. Plumeria là một loài thực vật khá phổ biến ở Việt Nam. Trong đó, ngoài giá trị làm cảnh trang trí thì nó còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa các bệnh như viêm ruột, lỵ, khó tiêu, nhiễm khuẩn, viêm gan Thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học của Plumeria đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, nhiều hợp chất có hoạt tính tốt đã được công bố. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu về cây này vẫn chưa có tài liệu nào được công bố rộng rãi. Từ những vấn đề trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số cao chiết và bước đầu định tính thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra F. Tricilor)” để thực hiện đồ án tốt nghiệp. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ vàng. - Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong cao chiết. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ 4 dung môi EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 96% và nước. - Xác định thành phần hóa học của cao chiết. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về Hoa Sứ vàng 1.1.1. Nguồn gốc và tên gọi Xuất xứ của hoa sứ từ Trung mỹ và Caribe. Ngày nay hoa sứ được tìm thấy nhiều ở các hải đảo Thái Bình Dương, các quốc gia Nam Á, Ɖông Nam Á, Trung và Nam Mỹ. Hoa sứ là quốc hoa của Lào và của Nicaragua, nơi hoa sứ được gọi là Sacuanjoche. Quốc hiệu Champa mà ta gọi là Chiêm Thành có gốc tiếng Ấn Ɖộ (Hindi) có nghĩa là cây hoa sứ. Tên khoa học của cây hoa sứ là Plumeria rubra thuộc họ Apocynaceae của trúc đào. Chữ Plumeria là tên của nhà thực vật học Pháp Charles Plumier vào thế kỷ XVII. Người Anh gọi hoa sứ là temple tree vì ở Ấn Ɖộ và Sri Lanka cây hoa sứ được trồng quanh các đền Ấn Giáo và chùa Phật Giáo. Nó cũng được trồng trong các nghĩa địa. Ở Sri Lanka nó được xem là sinh mộc. Hoa sứ cũng còn được gọi là frangipani do tên của hầu tước Ý Muzio Frangipani mà ra. Người Ấn Ɖộ gọi hoa sứ là Champa; Lào:Champa; Sri Lanka tức đảo Ceylon: Champey; Indonesia: Kampoja; Trung Hoa: Dai Ji Hua (Ɖại Cát Hoa); Khmer: Champei krahom (hoa sứ đỏ); tiếng Tagalog (Phi Luật Tân): Kalasusi, v.v. 1.1.2 Phân loại Lớp: Dicotyledons Bộ: Gentianales Họ: Apocynaceae (Trúc Đào) Chi: Plumeria Loài: P.rubra Tên khoa học: Plumeria rubra L. tricilor Tên thường gọi: Sứ cùi, cây Đại, Hình 1.1. Hoa Sứ vàng 3
Đồ án tốt nghiệp 1.1.3. Đặc điểm hình thái Cây cao khoảng 2-3m, có khi cao đến 7m. Thân tròn mập, phân cành nhiều nhánh, dài, khẳng khiu, cong, xù xì. Vỏ cây có màu trắng xám với những sẹo lá để lại. Cây có nhựa mủ. Hình 1.2. Cây Hoa Sứ vàng Lá cây Sứ thuôn dài có hình bầu dục, rộng ở giữ và hẹp ở cả 2 đầu. Lá có màu xanh bóng, nhẵn ở mặt trên, lớp lông mịn cùng với gân chính màu trắng và các gân viền ở mép nổi rõ ở mặt dưới lá. Lá xếp sát nhau thành vòng ở ngọn cành, khi rụng để lại sẹo lớn ở cành. Cây Sứ ra những cụm hoa trên cuống chung dài khoảng 30-50cm, phân nhánh ở vòng đỉnh, có nhiều sẹo do hoa rụng. Các hoa có cánh dày, mập, khi còn nụ thì xếp vặn, nở bung thì có màu trắng ở viền của cánh hoa, tâm màu vàng cùng nhị đính trên ống tràng và phía sau cánh hoa có những đường sọc màu hồng. Hoa nở quanh năm và mang mùi thơm thoang thoảng. Cây Sứ có quả mọc choãi thẳng hàng, dài từ 10 – 15cm. Quả chứa các hạt có cánh nhưng ít gặp vì Sứ Đại khó đậu trái. Cây Sứ có tốc độ sinh trưởng nhanh. Đây là cây ưa sáng, phát triển tốt trên đất giàu dinh dưỡng, thoát nước tốt. Cây còn có thể trồng trên đất cát, đất sỏi vì Sứ có khả năng chịu hạn cao. 4
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4. Phân bố Cây được trồng nhiều tại công viên, dọc đường phố, khu đô thị, khu công nghiệp, trồng dọc lối đi, dải phân cách, cảnh quan nhà máy, bệnh viện hay trồng sân vườn Những đình, chùa, lăng miếu hay nghĩa trang cũng sử dụng loại cây này rất nhiều. 1.1.5. Tác dụng dược lý Hoa Sứ có vị ngọt, tính bình, thơm, có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, hòa vị, nhuận tràng, bổ phổi. Có tác dụng hạ huyết áp rất rõ, ở hoa khô có tác dụng mạnh hơn ở hoa tươi. Vỏ cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, tả hạ, tiêu thủng, sát trùng. Lá có tác dụng hành huyết, tiêu viêm. Nhựa có tác dụng tiêu viêm và làm mềm những tổ chức rắn chai chân. (Võ Văn Chi, 2012). 1.1.6. Công dụng Công dụng làm cảnh: Sứ có nhiều loại và màu sắc khác nhau, từ nhứng cây nhỏ được trồng trong chậu đặt ở những vị trí nhỏ hẹp như sân thượng, ban công nhà, cho tới những cây lớn được trồng trong sân vườn, công viên, đình chùa, .đem lại vẻ đẹp hương thơm từ hoa nở quanh năm và bóng mát từ tàn cây rộng. Công dụng làm thuốc: Theo y học cổ truyền, các bộ phận sau của cây hoa sứ có thể dùng làm thuốc như vỏ thân, vỏ rễ, hoa, nụ hoa, lá tươi và nhựa cây, nhưng sử dụng nhiều nhất là hoa. Toàn cây có chứ một loại kháng sinh thực vật là fulvo plumierin, có tác dụng ức chế sự tăng sinh và phát tiển của một số vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Từng bộ phận khác nhau của cây có những công dụng khác nhau: Hoa dùng trong các trường hợp như say nắng; viêm ruột, lỵ; khó tiêu, kém hấp và kém dinh dưỡng ở trẻ em; nhiễm khuẩn, viêm gan; viêm phế khí quản, ho. Người ta còn dùng hoa Sứ làm thuốc chữa bênh ưa chảy máu có kết quả tốt. Ngày dùng 10-15g dạng thuốc sắc. Không dùng cho người suy nhược toàn thân, ỉa chảy và phụ nữ có thai. 5
Đồ án tốt nghiệp Hoa sứ khô là nguyên liệu để làm gối rất tốt, có nhiều tác dụng trị bệnh mất ngủ, ngủ không ngon giấc. Vỏ dùng chữa thủy thủng, tiểu tiện ít hoặc táo bón lâu ngày, viêm chân răng. Ngày dùng 4-8g để nhuận tràng, 8-20g để tẩy, 12-20g ngâm rượu ngậm chữa viêm chân răng. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng vỏ trị ỉa chảy và dùng vỏ rễ để trị bệnh lậu và loét đường sinh dục. Nhựa cũng dùng được như vỏ, còn dùng chữa chai chân, sưng tấy, mụn nhọt dưới dạng nhũ dịch, thường dùng bôi. Ở Ấn Độ, người ta còn dùng như chất gây sung huyết để trị thấp khớp và còn dùng sổ. Lá chữa bong gân, sai khớp, mụn nhọt, thường dùng giã đắp ngoài, không kể liều lượng. Ở Papua Niu Ghinê dịch lá đùng đắp vết thương rắn cắn hoặc dùng nhựa cây đắp vào chỗ đau. Hình 1.3. Công thức hóa học của fulvoplumierin và plumierid 1.1.7. Thành phần hóa học và dược chất Tinh dầu hoa có hàm lượng 0,04-0,07%; trong tinh dầu có geraniol, citroneellal, farnesol, linalol và aldehyd, fulvoplumierin, chất nhựa quercetin, vết kaempferol và cyanidin, diglycosid. Vỏ ngoài chứa fulvoplumierin và plumierid, agoniadin, acid plumieric, acid cerotinic, lupeol. Lá chứa 0,83% plumierid, acid resinic. Nhựa chứ acid plumieric. 6
Đồ án tốt nghiệp Fulvoplumierin có tác dụng ức chế các chủng khác nhau của Mycobacterium tuberculosis ở nồng độ 1 - 5mg/1ml. Plumierid là iridoid glycosid có tác dụng lên vi khuẩn gram âm và gram dương. Nghiên cứu tại Trường Dược Illinois (Chicago), ghi nhận hoạt chất loại iridoid: fulvoplumierin trích từ Sứ có khả năng ức chế men reverse transcriptase của siêu vi HIV-1 nơi người (Journal of Natural Products Số 54 (Jan-Feb)-1991). 1.2. Đại cương về một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.2.1 Khái niệm và phân loại Các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thực vật, có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus. Các hợp chất kháng khuẩn thường có tác dụng khá đặc hiệu lên các loài vi khuẩn khác nhau ở một nồng độ thường là rất nhỏ. Những chất này có thể thuộc nhiều cấu trúc hóa học khác nhau như alkaloid, các hợp chất quinone, flavonoid, tinh dầu v.v Ngày nay người ta chia các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật ra làm 2 nhóm sau: Nhóm bay hơi: gồm những chất do thực vật tiết ra có khả năng khuếch tán vào không khí và có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của virus, vi khuẩn. Nhóm không bay hơi: gồm những chất ở sâu trong các tế bào thực vật, không có khả năng khuếch tán vào không khí. Muốn sử dụng nó, phải dựa vào đặc điểm, tính chất của từng loại kháng sinh thực vật. Thường người ta hay sử dụng chúng dưới các dạng: Giã nát lấy nước cốt, ngâm, sắc hoặc chiết bằng các dung môi thích hợp. 1.2.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary 7
Đồ án tốt nghiệp metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv, 2013). 1.2.3. Một số hợp chất kháng khuẩn trong Hoa Sứ vàng 1.2.3.1. Alkaloid a) Khái niệm về alkaloid Năm 1819, Wilhelm Meissner đề nghị xếp các chất có tính kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và gọi tên là alkaloid. Ông là người đầu tiên đưa ra khái niệm về alkaloid: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật. Theo Polonopski: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. b) Tính chất chung của alkaloid Đặc điểm lý học: Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy nghĩa là trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codein (C18H21NO3), strychnin (C21H22N2O2), quinin (C20H24N2O2), reserpin (C33H40O9N2) Những alkaloid thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spartein (C15H26N2 ). Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy ở nhiệt độ trước khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay hơi được và thường vững bền, không bị phân hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo được bằng hơi nước để lấy ra khỏi dược liệu. Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaixin, piperin 8
Đồ án tốt nghiệp Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng như berberin, palmatin, chelidonin, Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen trái lại các muối alkaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực. Đặc điểm hóa học: Hầu như alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng như base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ đỏ như nicotin, cũng có chất tính base rất yếu như cafein, piperin vài trường hợp ngoại lệ có những alkaloid không có phản ứng kiềm như colchicin, ricinin, theobromin và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu như arecaidin, guvacin. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, cacbonat kiềm, NaOH khi định lượng alkaloid bằng phương pháp đo acid người ta phải căn cứ vào độ kiềm để lựa chọn chỉ thị màu cho thích hợp. Tác dụng với acid, alkaloid cho các muối tương ứng. Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt ) tạo ra muối phức. Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. c. Vai trò của alkaloid Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau. Nhiều alkaloid có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương gây ức chế như morphin, codein, scopolamin, reserpin hoặc gây kích thích như strychnin, cafein, lobelin. Nhiều chất tác dụng lên hệ thần kinh giao cảm gây kích thích: Ephedrin, hordenin, làm liệt giao cảm, ergotamin, yohimbin hoặc kích thích phó giao cảm: pilocarpin, eserin; có chất gây liệt phó giao cảm: hyoscyamin, atropin; có chất phong bế hạch giao cảm: nicotin, spartein, coniin. 9
Đồ án tốt nghiệp Trong số alkaloid có chất gây tê tại chỗ, có chất làm giãn cơ trơn, chống co thắt. Có alkaloid làm tăng huyết áp (ephedrin, hydrastin), có chất làm hạ huyết áp trên tim như ajmalin, quinidin và α-fagarin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim. Có alkaloid diệt ký sinh trùng: Quinin độc đối với ký sinh trùng sốt rét; emetin và conexin độc đối với amip dùng để chữa lỵ. Isopelletierin, arecolin dùng để trị sán. 1.2.3.2. Flavonoid a. Khái niệm chung về flavonoid Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (Flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần chú ý để khỏi nhầm lẫn. b. Tính chất chung của flavonoid Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hoá), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuôc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco- anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi 10
Đồ án tốt nghiệp hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavonoid có nhóm 7hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng. c. Vai trò của flavonoid Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá. Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzyme oxy hoá - khử. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, các bệnh trong nhãn khoa. Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc. Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Flavonoid còn có tác dụng thông tiểu, chống loét chữa đau dạ dày, chống viêm điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị, điều hòa nhịp tim. Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-b-Dgalactopyranosid. 1.2.3.3. Tinh dầu a. Khái niệm về tinh dầu Tinh dầu là một hỗn hợp của nhiều thành phần, thường có mùi thơm, không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, bay hơi được ở nhiệt độ thường và có thể điều chế từ thảo mộc bằng phương pháp cất kéo hơi nước. b. Tính chất chung của tinh dầu Thể chất: Đa số là chất lỏng ở nhiệt độ thường, một số thành phần ở thể rắn: Menthol, borneol, camphor, vanilin, heliotropin. 11
Đồ án tốt nghiệp Màu sắc: Không màu hoặc vàng nhạt. Do hiện tượng oxy hóa màu có thể sẫm lại. Một số có màu đặc biệt: Các hợp chất azulen có màu xanh mực Mùi: Đặc biệt, đa số có mùi thơm dễ chịu, một só có mùi hắc, khó chịu (tinh dầu giun). Vị: cay, một số có vị ngọt: Tinh dầu quế, hồi. Bay hơi được ở nhiệt độ thường. Tỷ trọng: Đa số nhỏ hơn 1. Một số lớn hơn 1: Quế, đinh hương, hương nhu. c. Vai trò của tinh dầu Tinh dầu đóng vai trò quyến rũ côn trùng giúp cho sự thụ phấn của hoa. Một số nghiên cứu khác cho rằng tinh dầu bài tiết ra có nhiệm vụ bảo vệ cây, chống lại sự xâm nhập của nấm và các vi sinh vật khác. Tinh dầu và các dược liệu chứa tinh dầu có một phạm vi sử dụng rất rộng lớn trong đời sống hàng ngày của con người, trong nhiều ngành khác nhau thể hiện qua những tác dụng: Tác dụng trên đường tiêu hoá: Kích thích tiêu hoá, lợi mật, thông mật. Tác dụng kháng khuẩn và diệt khuẩn: Tác dụng trên đường hô hấp như tinh dầu bạch đàn, bạc hà. Tác dụng trên đường tiết niệu như tinh dầu hoa cây Barosma betulina. Một số có tác dụng kích thích thần kinh trung ương: Dược liệu chứa tinh dầu giàu anethol: Đại hồi Một số có tác dụng diệt ký sinh trùng. Rất nhiều tinh dầu có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương, sinh cơ v.v khi sử dụng ngoài da. 1.2.3.4. Saponin a. Khái niệm saponin 12
Đồ án tốt nghiệp Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao. b. Tính chất chung của saponin Saponin có một số tính chất đặc biệt: làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch; làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng; có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b - hydroxysteroid khác. Saponin gây độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. Saponin đa số có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. c. Vai trò của saponin Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn, Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sapogenin steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid. 1.2.3.5. Tannin a. Khái niệm chung về tannin Từ "Tanin" được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những chất có mặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của da sống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền. Do đó, tanin được định nghĩa là những hợp chất 13
Đồ án tốt nghiệp polyphenol có trong thực vật có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn. b. Tính chất chung của tannin Tanin có vị chát, làm săn da, tan được trong nước, kiềm loãng, cồn, glycerin và aceton, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. Kết tủa với gelatin. Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid thì sẽ có tủa. Acid gallic và các pseudotanin khác cũng làm kết tủa gelatin nhưng với dung dịch tương đối đậm đặc. Kết tủa với các alkaloid. Tanin tạo tủa với các alcaloid hoặc một số dẫn chất hữu cơ có chứa nitơ khác như hexamethylen tetramin, dibazol Kết tủa với muối kim loại. Tanin cho tủa với các các muối kim loại nặng như chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt. Phát hiện acid chlorogenic. Dịch chiết có acid chlorogenic khi thêm dung dịch ammoniac rồi để tiếp xúc không khí dần dần sẽ có màu xanh lục. c. Vai trò của tannin Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử. Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo vệ cho cây. Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên ứng dụng làm thuốc săn da. Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc chỗ loét khi nằm lâu. Tanin có thể dùng trong để chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy. Tanin kết tủa với kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ độc đường tiêu hoá. Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm máu, chữa trĩ, rò hậu môn. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới và tại Việt Nam Tình hình nghiên cứu về Hoa Sứ trên thế giới 14
Đồ án tốt nghiệp Năm 2010, Ajay Singh Baghel và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của chiết xuất từ hoa Plumeria rubra L. bằng các loại dung môi nước, ethanol, etyl acetate, chloroform. Năm 2015, Lawal và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học của chiết xuất tinh dầu từ lá Plumeria rubra L. trồng ở Nigeria. Năm 2012, Ramproshad và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất etanol thô của Plumeria rubra cho thấy có hoạt tính chống oxy hoá mạnh và có hoạt tính kháng khuẩn trung bình. Hoạt động giảm đau của Plumeria rubra đã được thử nghiệm bằng mô hình xoắn gây axit axetic ở chuột. Chiết xuất này gây ra sự ức chế đáng kể ở liều 500mg/kg-thể trọng. Chiết xuất thô của Plumeria rubra trong thí nghiệm cho thấy nó có hoạt tính giảm đau mạnh. Năm 2014, Muruganantham và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của chiết xuất ethanol từ Plumeria rubra. Năm 2008, Laila Jarin đã nghiên cứu hoạt động kháng nấm và kháng khuẩn từ chiết xuất tinh dầu của Plumeria rubra. Tình hình nghiên cứu về cây Sứ tại Việt Nam đặc biệt là Hoa Sứ vàng hiện còn chưa có tài liệu và nghiên cứu được công bố rộng rãi. 1.3 Giới thiệu một số nhóm vi sinh vật gây bệnh 1.3.1 Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy 1.3.1.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli a) Đặc điểm Escherichia là trực khuẩn Gram âm hình que, kị khí tùy nghi, không sinh bào tử. Nhiệt độ thích hợp 37oC, pH 7,2 – 7,4. Sống chủ yếu hội sinh trong đường ruột của người và động vật. Chúng được biết đến như là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm trùng đường tiết niệu và các bệnh đường tiêu hóa (Trần Văn Cường, 2009). Đặc điểm sinh hóa của Escherichia: do chúng có phản ứng lên men đường nên dòng Escherichia cụ thể là E. coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, fructose, 15
Đồ án tốt nghiệp glucose, levulose, galactose, xylose, manitol; lên men không chắc chắn các loại đường dulcitol, saccharose và salicin. Ngoài ra chúng còn có một số phản ứng sinh hoá khác như phản ứng Indol và MR dương tính, phản ứng H2S, VP, Urea âm tính (Trần Văn Cường, 2009). Hình 1.4. Hình thái E.coli trên kính hiển vi điện tử b) Khả năng gây bệnh Escherichia sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, vertoxin, neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra (Trần Văn Cường, 2009). 1.3.1.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Salmonella a) Đặc điểm Salmonella là trực khuẩn Gram âm kị khí tùy nghi, hình que, có khả năng di động, kích thước 0.4 – 0.6 x 1 – 3 μm thích hợp phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC, pH 7,2- 7,6 (Trần Văn Cường, 2009). 16
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5. Hình thái Salmonella trên kính hiển vi điện tử. b) Khả năng gây bệnh Salmonella cũng có khả năng sản sinh ra độc tố enterotoxin, ngoài việc phá hủy lớp niêm mạc ruột, độc tố này cũng có tác động gây tiêu chảy, độc tố thẩm xuất chậm (DPF - Delayed Permeability Factor – độc tố không chịu nhiệt) và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF - Rapid Permeability Factor - độc tố chịu nhiệt) (Trần Văn Cường, 2009). 1.3.1.3 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. a) Đặc điểm Vibrio là phẩy khuẩn Gram âm, hình cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh, kỵ khí tùy nghi. Chúng phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng thường và môi trường kiềm (pH >7) Vibrio có thể sống được vài ngày đến 2-3 tuần. Dễ bị diệt bởi nhiệt độ (80°C/5 phút), bởi hoá chất thông thường và môi trường axit. nhiệt độ thích hợp là 37oC, có thể phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8,5- 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) (Triệu Anh Tuấn, 2013). 17
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Hình thái Vibrio trên kính hiển vi điện tử Nhóm Vibrio còn có các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase dương tính (Triệu Anh Tuấn, 2013). b) Khả năng gây bệnh Vibrio cholearae gây bệnh bằng độc tố ruột (choleragen). Đây là nội độc tố có cấu trúc gồm đơn nguyên A (trọng lượng phân tử là 27 000 dalton, mang độc tính cao) và đơn nguyên B có tính kháng nguyên đặc hiệu và một cầu nối A2 có tác dụng kích thích tăng cAMP (Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat). Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng cAMP, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- và nước gây tiêu chảy cấp tính theo (Triệu Anh Tuấn, 2013). 1.4.1.4 Nhóm vi khuẩn Shigella spp. a) Đặc điểm Shigella là trực khuẩn Gram âm mảnh dài 1-3 µm, rộng 0,5-0,6 µm, không có tiên mao, vì vậy không có khả năng di động, không có vỏ không sinh bào tử, Shigella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC (Chang Tran, 2014). 18
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7. Hình thái Shigella trên kính hiển vi điện tử. Trong môi trường lỏng làm đục đều. Trên môi trường đặc SS (Salmonella- Shigella) sau 24h khuẩn lạc có đường kính khoảng 2 mm, tròn lồi mặt nhẵn bờ đều. Shigella lên men glucose không sinh hơi, lên men manitol (trừ Shigella dysenteriae không lên men manitol), hầu hết Shigella không lên men lactose, chỉ có Shigella sonnei lên men lactose nhưng chậm, không sinh H2S, Urease âm tính, phản ứng Indol thay đổi, phản ứng đỏ metyl dương tính, phản ứng VP âm tính, phản ứng citrate âm tính (Chang Tran, 2014). b) Khả năng gây bệnh Các chủng Shigella đều có độc tố ruột (enterotoxin) là ShET-1 và ShET-2 chúng làm thay đổi sự vận chuyển điện giải ở các tế bào niêm mạc đại tràng, gây tăng tiết dịch. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào. Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người, đây là một bệnh truyền nhiễm có thể gây thành các vụ dịch địa phương. Thương tổn đặc hiệu khu trú ở ruột già, trên lâm sàng biểu hiện bằng hội chứng lỵ với các triệu chứng: đau bụng quặn, đi ngoài nhiều lần, phân có nhiều mũi nhầy và thường có máu. Shigella gây bệnh bằng cơ chế 19
Đồ án tốt nghiệp xâm nhập vào tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và nhân lên với số lượng lớn trong tổ chức ruột. Các Shigella đều có nội độc tố. Riêng trực khuẩn Shiga còn có thêm ngoại độc tố bản chất là protein. Nội độc tố Shigella cấu tạo như kháng nguyên thân, có độc tính mạnh nhưng tính kháng nguyên yếu. Tác dụng chính của nội độc tố là gây phản ứng tại ruột. Ngoại độc tố của trực khuẩn Shiga không giống như độc tố ruột của Vibrio cholerae và ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu của ngoại độc tố trực khuẩn Shiga là tác dụng độc đối với tế bào (Chang Tran, 2014). 1.3.2. Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da 1.3.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa a) Đặc điểm Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Đặc điểm hình thái học chung của Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Hình 1.8. Hình thái Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi điện tử. Pseudomonas aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 370C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 – 42oC, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. Trên môi trường đặc: 20
Đồ án tốt nghiệp khuẩn lạc thường to giống như quả trứng ốp (fried eggs), nhẵn, dẹt, trung tâm lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan. Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (β). Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas aeruginosa: không lên men glucose, có khả năng thủy giải gelatin, khử nitrate (+) oxidase (+), sản xuất hydrogensulphide từ thiosulphate, sản xuất 2-keto-D-gluconateacid từ D-gluconate, sử dụng glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol, rhamnose, P-arabinose, trehalose, cellobiose, inositol, sucrose (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011). b) Khả năng gây bệnh Độc tính của Pseudomonas aeruginosa chủ yếu là exotoxin của vi sinh vật bao gồm loài Pseudomonas aeruginosa đuợc biết là gây độc trên ấu trùng của loài muỗi cũng như lòai sâu bọ cánh phấn. Pseudomonas aeruginosa gây chết loài muỗi ở giai đọan ấu trùng, nhộng, và theo nghiên cứu loài này cũng gây độc tố đối với họ nhà bay. Mặc dù phuơng thức hoạt động của độc tố này chưa đuợc hiểu rõ, những loại độc tố như của P. aeruginosa đuợc hấp thụ hấp thụ qua biểu bì của loài côn trùng và họat động trên protein tan huyết. Dịch formulation (VCRC B426) từ sự trao đổi chất của P. aeruginosa tiết ra như là phuơng pháp đuợc sử dụng để chống lại loài muỗi (Nguyễn Thị Như Yến và ctv, 2011). 1.3.2.2 Nhóm vi khuẩn Enterococcus faecalis a) Đặc điểm Enterococcus faecalis là vi khuẩn Gram dương kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-10% CO2 và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, một số phát triển được ở 10 tới 40oC (Dương Văn Sĩ, 2010). 21
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Hình thái Enterococcus faecalis trên kính hiển vi điện tử. Khuẩn lạc có màu hồng tới đỏ đậm khi nuôi cấy trong môi trường azide tetrazolium chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), trên môi trường thạch máu thì khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, có màu hơi xám trong. Có phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng lên men đường glucose, sinh acid làm giảm pH môi trường (Dương Văn Sĩ, 2010). b) Khả năng gây bệnh Viêm họng, viêm hạch có mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim. Gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng. 1.3.2.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus Staphylococcus là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Staphylococcus chủ yếu phân thành 2 nhóm: Staphylococcus có enzyme coagulase: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius Staphylococcus không có enzyme coagulase: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus simulans, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri. a) Đặc điểm 22
Đồ án tốt nghiệp Staphylococcus thuộc loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Staphylococcus có khả năng phát triển được ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 tới 45oC và môi trường có nồng độ muối cao tới 10%. Hình 1.10. Hình thái Staphylococcus trên kính hiển vi điện tử Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau 24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với Staphylococcus aureus) hoặc có màu trắng (đối với các loại Staphylococcus khác). Trên môi trường thạch máu Staphylococcus phát triển nhanh: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng. Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 – 2mm, có màu trắng và thường không gây tan máu, khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng,lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S.aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc (Trần Quang Cảnh, 2012). b) Khả năng gây bệnh Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. Ngoài ra phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất 23
Đồ án tốt nghiệp này, vi khuẩn tạo được một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Tụ cầu còn sản xuất một số enzyme có khả năng phá hủy mô liên kết của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán trong cơ thể, phá hủy hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế bào bạch cầu hạt cũng như đại thực bào, phá hủy lớp thượng bì. Enzyme này gây tổn thương da tạo các bọng nước. Ví dụ điển hình là hội chứng Lyell do tụ cầu. Sáu độc tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt. Các độc tố ruột này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta- lactamase). Enzyme này phá hủy vòng betalactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. 24
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm vi sinh của Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian Thời gian nghiên cứu từ tháng 02/2017 đến tháng 07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu Hoa Sứ vàng (Plumeria rubra) được thu tại công viên dọc đường Hoàng Sa. 2.2.2. Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình nghiên cứu được cung cấp bởi ThS. Phạm Minh Nhựt giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, bao gồm: Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm: E.coli 0208, E.coli O157:H7 và Enterotoxigenic E.coli - ETEC. Nhóm vi khuẩn Shigella spp. gồm: S. boydii, S. flexneri và S. sonnei. Nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm: V. cholerae, V. harveyi, V. alginolyticus và V. parahaemolyticus. Nhóm vi khuẩn Salmonella spp. gồm: S. dublin, S. enteritidis, S. typhi và S. typhimurium. Nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm Lis. innocua và Lis. monocytogenes. Nhóm vi sinh vật gây bệnh khác bao gồm : Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis. 2.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). Ethanol (Việt Nam) 25
Đồ án tốt nghiệp DMSO (Dimethy lsulfoxide) (Trung Quốc) Các loại thuốc thử : Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner, Ninhidrin, NaOH, NaCl, chì acetate, acetic anhydride, gelatin, chloroform, ferric chlodride, H2SO4 đậm đặc. 2.2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.2.4.1. Thiết bị Tủ sấy Bếp từ Máy lọc chân không Tủ hấp autoclave Tủ ủ Máy lắc Bể đều nhiệt Máy chưng nước cất Tủ lạnh 2.2.5.2. Dụng cụ Pipette pasteur Cốc thủy tinh 1000ml Ống nghiệm Cốc thủy tinh 100ml Phễu lọc Đĩa nhựa Giấy lọc Efpendoff Cân phân tích Que trang Kẹp ống nghiệm Dao cấy Micropipette loại 10 – 100 µl Cây đục lỗ Micropipette loại 100 – 1000 µl Đèn cồn Đầu tipe Bông không thấm Bình môi trường 500 ml Bông thấm Chai môi trường 100 ml Parafim 26
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Các phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật Nguyên tắc: Sử dụng các loại dung môi để tách chiết các hợp chất có trong cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học từ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc. Mẫu tươi được rửa sạch loại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô, sau đó xay thành dạng bột. Bột Hoa Sứ sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi trong 24 giờ và lặp lại 3 lần. Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô cách thủy ở nhiệt độ 70oC. Cao chiết thu được sẽ được chia vào trong chai và bảo quản ở nhiệt độ 4oC. 2.3.2. Phương pháp tăng sinh Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Cách tiến hành: Môi trường TSB được sử dụng để làm môi trường tăng sinh. Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút ở 1 atm. Thực hiện thao tác trong điều kiện vô trùng, lấy 100µl sinh khối của chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng micropipet cho vào chai môi trường có 20ml TSB, lắc ở 150 vòng/ phút trong 24 giờ trước khi đưa vào thí nghiệm chính. 2.3.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 5oC) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn 27
Đồ án tốt nghiệp được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -15oC (Nguyễn Lân Dũng và Dương Evaluation of Cameroonian plants towards experimental bone regeneration Văn Hợp, 2007). 2.3.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức MacFahrland): 9 Mật độ = OD600nm x 1,02 x 10 (CFU/ml) 2.3.5. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. 28
Đồ án tốt nghiệp Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết (Phạm Minh Nhựt, 2013). 2.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Nguyên tắc: Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao thuốc bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm). Cách thực hiện: Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa ở mật độ thích hợp cho vào môi trường TSA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó, dùng một ống trụ kim loại có đường kính 6 mm tạo các giếng trên đĩa thạch và nhỏ 100µl dịch cao chiết ở nồng độ khảo sát vào, giữ yên trong vòng 1 giờ để dịch cao chiết có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm) ( Ramakrishnan, 2011). 2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ Hoa Sứ vàng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất. (Lâm Văn Tiến và cộng sự, 2015). Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng. a) Định tính carbohydrate 29
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của CuO. Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch. b) Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ c) Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định d) Định tính cardiac glycoside 30
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm. Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic. e) Định tính flavonoid Thử nghiệm Alkaline reagent: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất. Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím. f) Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1,5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. g) Định tính tannin Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen. 31
Đồ án tốt nghiệp Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng. h) Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành màu nâu đỏ đậm là triterpenoid. j) Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhidrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử ninhidrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím. 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu ghi nhận ở các thí nghiệm được thống kê và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm Statistical Analysis System 9.4 (SAS). Kết quả được thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn) với sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,01. 2.4. Bố trí thí nghiệm 32
Đồ án tốt nghiệp Mẫu Hoa Sứ vàng Xử lý mẫu Tách chiết và thu hồi cao Cao chiết Hoa Sứ vàng của các loại cao khác nhau Đánh giá hiệu suất thu hồi của các loại cao chiết Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Xác định thành phần hóa học của cao chiết Định lượng alkaloid và flavonoid của cao chiết Tổng hợp kết quả thí nghiệm Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hiệu suất thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng. Mẫu Hoa Sứ vàng Xử lý mẫu Ngâm dung môi (1:20) (w/v) Nước Ethanol 50% 70% 96% Lọc tinh Bã Cô cách thủy 70oC Cao chiết Hiệu suất thu hồi Hình 2.2. Quy trình tách chiết và thu cao Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi khác nhau. 34
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Mẫu hoa sứ tươi sau khi thu được rửa sạch và đem đi sấy khô ở 40oC. Sau khi sấy khô mẫu được cắt nhỏ. Tiến hành cân 40 g và ngâm trong 800 ml với các loại dung môi khảo sát tỉ lệ 1 : 20 (w/v) ở nhiệt độ phòng. - Đối với dung môi nước: mẫu được ngâm với lượng lớn nước cất chứa trong erlen thủy tinh. Cách 3 giờ, tiến hành lọc chân không thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm và lọc với lượng nước cất như lần đầu cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70oC để thu nhận cao chiết. - Đối với dung môi ethanol: ngâm mẫu với lượng lớn ethanol (50%, 70%, 96%) trong erlen thủy tinh đậy kín để tránh hiện tượng bay hơi khoảng 48 giờ. Sau đó, tiến hành lọc chân không mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục được ngâm, lọc với lượng dung môi như lần đầu cho đến khi dịch chiết có màu nhạt dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng phương pháp cô cách thủy ở 70oC để thu nhận cao chiết. Tiến hành đánh giá hàm lượng thu hồi cao ở mỗi nghiệm thức bằng công thức: H (%) =(m1 – m2)/m x 100 Trong đó: H: hàm lượng cao thu được (%) m1: khối lượng cốc sau khi cô mẫu (g) m2: khối lượng cốc ban đầu (g) m: khối lượng mẫu ban đầu dùng để ngâm với dung môi (g) Sau khi xác định hàm lượng thu hồi, các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 35
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng. Vi sinh vật chỉ thị Tăng sinh trong Môi trường môi trường TSB TSA Hấp tiệt trùng Lắc nhiệt độ phòng 121oC – 1 atm (18 – 24 giờ) trong 15 phút Đo OD600nm Đổ đĩa Cao chiết Pha loãng về Hút 100 µl Hòa tan với 106 cfu/ml Cấy trang DMSO 1% Đục lỗ (d = 6 mm) Hút 100µl Nồng độ thích hợp Ủ 37oC/24 giờ Đo đường kính vòng kháng khuẩn Hình 2.3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ vàng với các chủng vi khuẩn chỉ thị. 36
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết Hoa Sứ vàng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Tiến hành tăng sinh vi sinh vật chỉ thị trong chai thủy tinh chứa 20 ml môi trường TSB (riêng đối với các chủng Vibrio spp. thì bổ sung thêm 1.5% NaCl). Sau đó, chai được lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18 - 24 giờ. Tiến hành đo quang phổ dịch tăng sinh ở bước sóng 600 nm để xác định mật độ tế bào, sau đó dịch vi khuẩn được pha loãng bằng nước muối sinh lí vô trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha loãng ở mật độ 106 cho vào đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn. Sau đó dùng que trang, trang đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch cho đến khi khô trong điều kiện vô trùng. Dùng que đục đã khử trùng có đường kính d = 6 mm, đục 6 giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang, mỗi giếng cách nhau 2 cm và cách mép đĩa 1cm. Sau đó dùng dao cấy vô trùng lấy phần thạch đã đục ra khỏi đĩa. Cao chiết Hoa Sứ vàng được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 200 mg/ml. Hút 100 μl dịch cao chiết và nhỏ vào các giếng trong đĩa môi trường TSA đã được đục lỗ trước đó. Các đĩa thạch được để yên trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sau đó đem ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ và đọc kết quả. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 37
Đồ án tốt nghiệp 2.4.3. Thí nghiệm 3: Định tính một số thành phần hóa học của các loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng. Cao chiết từ Hoa Sứ vàng Ngâm trong H2SO4 10% Ngâm trong DMSO 1% Lọc Lọc Thử nghiệm Carbohydrate Alkaloid Flavonoid Tannin Saponin Amino acid Phenolic Steroid Cardiac compound glycoside Hình 2.4. Quy trình định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng. Thuyết minh quy trình: Cao chiết Hoa Sứ vàng được chia làm 2 phần Phần thứ nhất: Cao chiết Hoa Sứ vàng được hòa tan trong dung dịch H2SO4 10% trong khoảng 30 phút đến 60 phút. Sau đó tiến hành lọc qua giấy lọc và thu phần dịch trong để tiến hành định tính alkaloid. Phần thứ hai: Cao Hoa Sứ vàng được hòa tan trong dung dịch DMSO 1% cho tan hoàn toàn, sau đó tiến hành pha loãng và lọc dung dịch qua giấy lọc để thu dịch trong. Dịch này đem phân tích, định tính một số thành phần hóa học như carbohydrate, saponin, flavonoid, amino acid, steroids, phenolic, tannin, cardiac glycoside. a) Định tính thành phần carbohydrate 38
Đồ án tốt nghiệp - Thử nghiệm Molisch - Thử nghiệm Fehling - Thử nghiệm Barfoed b) Định tính thành phần saponin - Thử nghiệm Foam (xà phòng) c) Định tính thành phần alkaloid - Thử nghiệm Mayer - Thử nghiệm Dragendorff - Thử nghiệm Hager - Thử nghiệm Wagner d) Định tính thành phần cardiac glycoside - Thử nghiệm Legal - Thử nghiệm Keller Killiani e) Định tính thành phần flavonoid - Thử nghiệm Alkaline - Thử nghiệm Ferric chloride f) Định tính hợp chất phenolic - Thử nghiệm Lead acetate - Thử nghiệm Gelatin g) Định tính thành phần tannin - Thử nghiệm Ferric chloride - Thử nghiệm Lead acetate h) Định tính thành phần steroid - Thử nghiệm Salkowski - Thử nghiệm Libermann Burchard i) Định tính thành phần amino acid - Thử nghiệm Ninhidrin 39
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tách chiết đến hàm lượng thu hồi cao từ Hoa Sứ vàng Bột cây Hoa Sứ vàng sau khi ngâm trong các loại dung môi khảo sát (nước, ethanol 50%, ethanol 70%, ethanol 96%) được lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70oC. Kết thúc quá trình này thu được cao chiết từ các loại dung môi khác nhau và kết quả khảo sát hàm lượng thu hồi cao chiết được trình bày trong hình 3.1. Hình 3.1. Hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ vàng với các loại dung môi Kết quả trên hình 3.1, cho thấy rằng các dung môi tách chiết khác nhau có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng thu hồi cao chiết từ Hoa Sứ Vàng. Tuy cùng quy trình tách chiết nhưng hàm lượng thu hồi cao của các loại dung môi từ Hoa Sứ Vàng không giống nhau và có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Kết quả tách chiết cao từ Hoa Sứ Vàng cho thấy rằng sử dụng dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao cao nhất trong số 4 loại dung môi khảo sát với hàm lượng trung bình là 32,27%. Kế đến là dung môi ethanol 50% và ethanol 70% với hiệu suất trung bình lần lượt là 31,4%, 18,83%. Cuối cùng với hàm lượng thu hồi thấp nhất là 17,13% ứng với dung môi ethanol 96%. Qua kết quả trên có thể thấy rằng để thu được lượng cao cao nhất thì dung môi nước là tối ưu nhất. 40
Đồ án tốt nghiệp Việc lựa chọn các dung môi tách chiết đều là dung môi phân cực vì các dung môi phân cực có thể lôi kéo tốt các hợp chất kháng khuẩn có trong thực vật như flavonoid, alkaloid, glycosides, saponins, tannin, (Ngô Văn Thu, 2011). Sở dĩ chọn dung môi phân cực để tách chiết vì các loại dung môi này phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, giúp tiết kiệm cũng như sẽ an toàn hơn so với các dung môi không phân cực. Với mục tiêu chọn ra dung môi tốt nhất từ 4 loại dung môi khảo sát để tách chiết cao có hoạt tính sinh học tốt nhất, chưa thể khẳng định rằng nước là dung môi tách chiết cao tốt nhất. Để đánh giá dung môi nào phù hợp tách chiết, cần đánh giá thêm về hoạt tính kháng khuẩn của chúng. Do đó, việc tiến hành thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết để tối ưu hóa lựa chọn dung môi tốt nhất đối với mẫu Hoa Sứ vàng. 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng với các loại dung môi tách chiết khác nhau trên các chủng vi khuẩn chỉ thị. Sau khi đánh giá hàm lượng thu hồi cao chiết của các loại dung môi thu được từ Hoa Sứ vàng, thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn được tiến hành và kết quả được thể hiện thông qua đường kính vòng ức chế (mm) đối với các nhóm vi sinh vật chỉ thị bằng phướng pháp khuếch tán giếng thạch được trình bày ở các Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4, Hình 3.5, Hình 3.6, Hình 3.7 và Bảng 3.1. 3.2.1. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli. Tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm Escherichia coli với 4 chủng: E.Coli, ETEC, E.Coli 0208, E.Coli O157:H7. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Hình 3.2. Kết quả trên Hình 3.2 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi ethanol ở nồng độ 200 mg/ml đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 4/4 chủng thuộc nhóm Escherichia coli được khảo sát. Đường kính trung bình vòng kháng của các loại cao EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96% là từ 8,67 mm đến 12 mm. Trong đó ở từng loại cao cho khả năng kháng khuẩn khác nhau, cao EtOH 50% cho khả năng kháng khuẩn đối với chủng E.coli 0208 mạnh nhất với đường kính trung bình 9,8 mm tương đương với kháng sinh ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (p > 0,01), thấp nhất là chủng E.coli (8,83 mm). Ở cao EtOH 70% hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với chủng ETEC với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 12 mm nhưng thấp hơn so với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01), ở chủng E.coli O157:H7 hoạt tính kháng khuẩn của cao thể hiện thấp nhất với đường kính trung 42
Đồ án tốt nghiệp bình 8,67 mm và thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa (P 0,01) còn ở chủng E.coli O157:H7 thì thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Ở cao chiết EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn duy nhất đối với chủng ETEC với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 9,5 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P < 0,01). Ở cao nước và nồng độ 50 mg/ml không có khả năng ức chế. Như vậy, cao chiết ethanol 50%, 70%, 96% từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện khả năng ức chế khá tốt đối với cả 4 chủng của nhóm vi khuẩn E.coli. Kết quả này cho thấy rằng nhóm vi khuẩn E. coli khảo sát khá nhạy cảm với cao chiết ethanol từ Hoa Sứ vàng đặc biệt là EtOH 70% hơn so với các loại cao chiết từ dung môi khác. Trong nghiên cứu của Vijayakumar và ctv (2015) cho thấy khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol 95% ở nồng độ 150 mg/ml từ Carica papaya L. đối với chủng E.coli cho đường kháng khuẩn là 11 mm. Ở cao chiết ethanol 96% nồng độ 200 mg/ml của Hoa Sứ vàng cho khảng năng kháng chủng E.coli với đường kính trung bình 10 mm. Nghiêm cứu của Al-Manhel và Niamah (2015) cho thấy cao chiết ethanol ở nồng độ 100 mg/ml của Ziziphus cho khả năng kháng khuẩn đối với chủng E.coli là 12 43
Đồ án tốt nghiệp mm. Còn đối với cao chiết Hoa Sứ vàng với cao ethanol 96% ở nồng độ 200 mg/ml cho kết quả kháng khuẩn đối với chủng trên là 10 mm. Qua hai so sánh trên có thể thấy cao Hoa Sứ vàng có khả năng kháng khuẩn khá tương đồng với các mẫu ở những báo cáo trên. Điều có thể do ở mỗi loài thực vật có các thành phần hóa học khác nhau và điều kiện tự nhiên ở từng vùng cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp các chất trong cây. 3.2.2. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Thí nghiệm kháng khuẩn đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. gồm 2 chủng: L. innocua và L.monocytogenes. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. được trình bày trong Hình 3.3. Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Listeria spp. Kết quả nghiên cứu ở Hình 3.3 cho thấy cả 3 loại cao chiết Hoa Sứ vàng từ các dung môi ethanol khác nhau ở nồng độ 200 mg/ml đều có khả năng ức chế nhóm vi khuẩn Listeria spp., đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 8,17 đến 12 mm. Xét ở cao EtOH 50% cho khả năng kháng khuẩn với 2 chủng L.innocua và L.monocytogenes tương đương nhau với đường kính trung bình 10 mm nhưng chủng L.innocua tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,05 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01) còn chủng L.monocytogenes khác biệt so với đối chứng ở mức có ý nghĩa (P < 0,01). Đối với cao EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn cao nhất đối với các loại cao thử nghiệm và chỉ có khả năng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml, kháng 44
Đồ án tốt nghiệp mạnh nhất đối với chủng L.innocua với đường kính vòng kháng trung bình 12 mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01). Cũng giống như cao EtOH 70%, cao EtOH 96% chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml, chủng L.innocua bị kháng mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 9,5 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml chỉ có cao EtOH 50% cho khả năng kháng chủng L.innocua với vòng kháng trung bình là 8,67 mm thấp hơn so với đối chứng về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao chiết Hoa Sứ vàng 50 mg/ml và cao nước không thể hiện khả năng kháng khuẩn có nghĩa là hoạt lực rất thấp không đủ khả năng kháng lại các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Ở cao EtOH 70%, có thể thấy rằng các chủng thuộc nhóm Listeria spp. cho khả năng kháng khuẩn cao nhất trong các loại cao chiết với đường kính trung bình là 12 mm và 10,83 mm. Đối với cao EtOH 96% cho kết quả kháng khuẩn thấp nhất so với các loại cao khác và thấp hơn so với đối chứng. Với các nồng độ thử nghiệm thì nồng độ 200 mg/ml cho khả năng kháng tốt nhất còn nồng độ 50 mg/ml không thể hiện tính kháng khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Bayoub (2010) và Emanuel (2011), 2 chủng vi khuẩn L.monocytogenes và L.innocua đều bị ức chế bởi cao chiết ethanol từ Matricaria chamomilla và A-ti- sô (Cynara scolymus) với đường kính vòng ức chế là 15 mm. Đặc biệt trong kết quả thí nghiệm này, cả ba loại cao chiết từ ethanol của Hoa Sứ vàng đều có khả năng ức chế được sự phát triển của L.innocua và L.monocytogenes, đặc biệt là cao EtOH 70% cho đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 12 mm. So với nghiên cứu của Rozman (2009) ở cây Rosmarinus offcinalis L. với nồng độ 160 mg/ml có thể hiện tính kháng khuẩn trên chủng L.monocytogenes với đường kính vòng kháng là 8 mm. Trong khi đó cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml lại có đường kính vòng kháng trung bình trên chủng L.monocytogenes là 10,83 mm. 45
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml và 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Salmonella spp. gồm các chủng: S.enteritidis, S.typhii, S.typhimurium, và S.dublin. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.4. Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Salmonella spp. Dựa vào Hình 3.4, nhận thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml từ các dung môi EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96% đều ức chế với 4 chủng vi khuẩn nhóm Salmonella spp. với đường kính vòng ức chế trung bình từ 8,7 mm đến 11 mm. Đối với cao EtOH 50% cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất thể hiện ở chủng S.enteritidis với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 10,33 mm tương đương cới đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về phương diện thống kê (P > 0,01), thấp nhất là chủng S.typhimurium với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 8,83 mm khác biệt ở mức có ý nghĩa so với đối chứng (P < 0,01). Đối với cao EtOH 70% cho khả 46
Đồ án tốt nghiệp năng kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng S.typhimurium với đường kính trung bình 12 mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01), thấp nhất là chủng S.typhii với đường kính trung bình 10,83 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức khác biệt có ý nghãi về phương diện thống kê (P 0,01), còn đối với chủng S.typhimurium cao chiết thể hiện khả năng kháng khuẩn yếu nhất trong các vi khuẩn thử nghiệm với đường kính trung bình 8,33 mm khác biệt so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml, các loại cao chiết thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 3/4 chủng vi khuẩn trong thí nghiệm với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 7,33 mm đến 8,5 mm. Xét ở cao EtOH 50%, trừ chủng S.enteritidis ở các chủng còn lại cao chiết đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với đường kính trung bình ở cả ba chủng đều là 8,5 mm và thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao EtOH 70% chỉ cho thấy khả năng kháng khuẩn đối với chủng S.typhii với đường kính trung bình 7,33 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức khác biệt có ý nghĩa (P < 0,01). Đối với cao chiết EtOH 96%, chỉ cho khả năng kháng khuẩn với chủng S.typhii với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 8,5 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Riêng với cao chiết nước và các loại cao ở nồng độ 50 mg/ml không có dấu hiệu của sự ức chế đối với nhóm Salmonella spp. Từ kết quả này có thể thấy các loại cao chiết ethanol 50%, 70%, 96% với nồng độ 200 mg/ml có khả năng kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn đặc biệt là cao ethanol ở nồng độ 70%. Qua kết quả trên cũng cho thấy nồng độ 50 mg/ml ở các loại cao chiết cũng không cho khả năng kháng khuẩn có nghĩa là hoạt lực của cao chiết ở 50 mg/ml không đủ mạnh để kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm. So với nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2014) ở cây Plumeria rubra với cao EtOH 96% ở nồng độ 30 mg/ml có thể kháng chủng S.typhii với đường kính vòng 47
Đồ án tốt nghiệp kháng là 10 mm. Còn đối với cao chiết EtOH 70% từ Hoa sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml có đường kính vòng kháng trung bình trên chủng S.typhii là 11,7 mm. Trong nghiên cứu của Doughari và Okafor (2008) cho thấy khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol ở nồng độ 30 mg/ml từ Senna siamae đối với chủng S.typhii cho thấy vòng kháng khuẩn là 8 mm. Mặt khác, cao chiết ethanol 70% ở nồng độ 200 mg/ml của Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với vòng kháng trung bình là 10,83 mm. Qua sự so sánh có thể thấy khả năng kháng khuẩn là khác nhau giữa các loại mẫu điều đó có thể do các chất trong cây khác nhau và điều kiện tự nhiên ở mỗi vùng lãnh thổ cũng một phần do điều kiện và phương pháp nhiên cứu ảnh hưởng đến kết quả. 3.3.4. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn gây bệnh Shigella spp. gồm các chủng: Shi.sonnei, Shi.boydii và Shi.flexneri. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.5. 48
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Shigella spp. Kết quả Hình 3.5 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi đều ức chế được 3 chủng của nhóm vi khuẩn Shigella spp. ở nồng độ 200 mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 8,33 mm đến 12 mm ngoại trừ cao nước không có khả năng kháng. Có thể thấy cao chiết EtOH 50% cho khả năng kháng mạnh nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 9,67 mm nhưng kháng sinh ciprofloxacin lại không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng này sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P 0,01), khả năng kháng thấp nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính trung bình 10,50 mm mặt khác ở chủng này kháng sinh không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Đối với cao EtOH 96% cho khả năng kháng tốt nhất đối với chủng Shi.boydii với đường kính trung bình vòng ức chế là 8,67 mm còn kháng sinh ciprofloxacin không cho khả năng kháng khuẩn (P < 0,01). Ở 49
Đồ án tốt nghiệp nồng độ 100 mg/ml thì chỉ kháng được 2/3 chủng với vòng kháng khuẩn trung bình từ 7,50 mm đến 11 mm. Đối với cao EtOH 70% chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn với chủng Shi.flexneri với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 11 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Đối cới cao EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng Shi.boydii với đường kính trung bình là 7,5 mm. Ở đối chứng chỉ có thể kháng 2/3 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Shigella spp. Ngoài ra cao nước và các loại cao ở nồng độ 50 mg/ml không thể hiện khả năng kháng khuẩn. Qua kết quả thực nghiệm trên cho thấy rằng cao chiết EtOH 70% có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn trong nhóm Shigella spp. hơn là cao chiết từ các loại dung môi khác trong thí nghiệm. Đối với chủng Shi.boydii các loại cao chiết ethanol đều thể hiện khả năng kháng khuẩn ở nồng độ 200 mg/ml còn với nồng độ 100 mg/ml ở cao EtOH 96%, trong khi đó kháng sinh ciprofloxacin ở nồng độ 0,5 mg/ml lại không có khả năng kháng đối với chủng Shi.boydii có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). So sánh với nghiên cứu của Kumari và ctv (2013) về khả năng kháng khuẩn của cây Plumeria alba LINN. cho kết quả kháng khuẩn với chủng Shi.boydii 8 và S.sonnei NK 29 với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 12,5 mm và 11 mm ở nồng độ 1 mg/ml còn đối với chủng Shi.boydii và Shi.sonnei trong thí nghiệm với cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với vòng kháng trung bình lần lượt là 10,5 mm và 11,17 mm. 3.3.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml, 100 mg/ml và 50 mg/ml trên nhóm vi khuẩn Vibrio spp. gồm các chủng: V.cholerae, V.harveyi, V.alginoliticus và V.parahaemolyticus. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.6. 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn Vibrio spp. Kết quả Hình 3.6 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml từ các loại dung môi đều ức chế được 4 chủng của nhóm vi khuẩn Vibrio spp. với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 9,3 mm đến 13 mm. Trong đó, cao chiết EtOH 50% cho khả năng kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng V.alginolyticus với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 10 mm thấp hơn với đối chứng ciprofloxacin (0,08 mg/ml) về mặt thống kê (P 0,01), kháng thấp nhất ở chủng V.harveyi với đường kính trung bình 10,17 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Đối với cao EtOH 96% cho khả năng kháng tốt nhất chủng V.harveyi với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 9,67 mm 51
Đồ án tốt nghiệp thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P 0,01). Đối với cao EtOH 96% thể hiện khả năng kháng 2/3 chủng vi khuẩn thử nghiệm là V.alginolyticus và V.cholerae với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình đều bằng 8,17 mm thấp hơn s với đối chứng ciprofloxacin (0,08 mg/ml) ở mức có ý nghĩa trên phương diện thống kê (P < 0,01). Mặt khác cao nước và các loại cao khác ở nồng độ 50 mg/ml không có hoạt tính kháng khuẩn. Như vậy có thể nhận thấy rằng cao chiết EtOH 50%, EtOH 70% và EtOH 96% đều có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Vibrio spp. ở nồng độ 200 mg/ml, trong khi đó cao chiết EtOH 70% có khả năng ức chế nhóm Vibrio spp. cao hơn so với cao chiết EtOH 50% và EtOH 96% với đường kính vòng ức chế dao động từ 10,2 mm đến 13 mm. Riêng cao chiết nước không có khả năng ức chế được nhóm vi khuẩn Vibrio spp. và ở nồng độ 50 mg/ml cũng không cho thấy khả năng kháng khuẩn ở các loại cao thử nghiệm. So sánh với nghiên cứu của Kurima và ctv (2013) về khả năng kháng khuẩn của cây Plumeria alba LINN. cho kết quả kháng khuẩn với chủng V.cholerae 756 với đường kính vòng kháng khuẩn là 10 mm ở nồng độ 1 mg/ml còn đối với chủng V.cholerae trong thí nghiệm với cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn với vòng kháng trung bình là 10,67 mm. Qua nghiên cứu của Maneemegalai và Naveen (2010), cho thấy khả nắng kháng chủng V.cholerae của hoa Cassia auriculata từ cao chiết ethanol ở nồng độ 100 52
Đồ án tốt nghiệp mg/ml với đường kính vòng kháng khuẩn là 17 mm. Đối với cao chiết Hoa Sứ vàng thì cho vòng kháng 10,67 mm ở EtOH 70% nồng độ 200 mg/ml. 3.3.6. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với nhóm vi khuẩn còn lại. Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của 3 loại cao chiết từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml trên nhóm vi khuẩn còn lại trong thí nghiệm gồm các chủng: P.aeruginosa, S.aureus và E.faecalis. Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Hình 3.7. Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết và đối chứng đối với nhóm vi khuẩn còn lại. Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi ở nồng độ 200 mg/ml đều ức chế 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm với đường kính trung bình từ 8,3 mm đến 11 mm. Trong đó, cao EtOH 50% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất trên chủng E.faecalis với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 9,5 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01), khả năng kháng thấp nhất là ở chủng S.aureus với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 8,33 mm. Đối với cao EtOH 70% cho khả năng kháng khuẩn mạnh nhất ở 53
Đồ án tốt nghiệp 2 chủng S.aureus và E.faecalis với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình ở cả 2 chủng là 11 mm tương đương với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) về mặt thống kê (P > 0,01). Đối với cao EtOH 96% chỉ thể hiện hoạt tính ở 2/3 chủng vi khuẩn thử nghiệm là P.aeruginosa và E.faecalis. Trong đó, ở nồng độ 200 mg/ml cho khả năng kháng khuẩn tốt nhất đối với chủng P.aeruginosa với đường kính trung bình 9,83 mm thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa (P < 0,01). Ở nồng độ 100 mg/ml cao EtOH 50% không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Đối với cao EtOH 70% chỉ thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với chửng E.faecalis với đường kính trung bình là 8,5 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Còn cao EtOH 96% thể hiện hoạt tính ở 2/3 chủng trừ chủng S.aureus trong đó cho khả năng kháng tốt nhất đối với chủng E.faecalis với đường kính trung bình vòng kháng khuẩn là 8,83 mm thấp hơn so với đối chứng ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Mặt khác cao nước và các loại cao ở nồng độ 50 mg/ml không cho thấy khả năng kháng khuẩn. Có thể nhận thấy rằng cao chiết Hoa Sứ vàng EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất cho cả 3 chủng khảo sát với đường kính vòng ức chế trung bình từ 10,7 mm - 11 mm so với các loại cao chiết khác trong thí nghiệm. Ở cao chiết EtOH 50% cho thấy khả năng kháng đối với cả ba chủng vi khuẩn nhưng đường kính vòng ức chế thấp từ 8,3 mm đến 9,5 mm. Ở cao EtOH 96% chỉ kháng được hai chủng là P.aeruginosa và E.faecalis còn đối với chủng S.aureus thì không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Đối với nồng độ 50 mg/ml do hoạt lực yếu nên không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Trong kết quả thi nghiệm của Vijayakumar và ctv (2015) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn ở cao chiết ethanol 95% ở nồng độ 150 mg/ml từ Carica papaya L. với chủng S.aureus là 7 mm. Còn trong cao chiết EtOH 96% ở nồng độ 200 mg/ml của Hoa Sứ vàng không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, nhưng trong cao EtOH 70% ở nồng độ 200 mg/ml thì lại cho khả năng kháng khuẩn là 11 mm. 54
Đồ án tốt nghiệp So sánh với cao chiết ethanol 96% ở nồng độ 30 mg/ml hoa của Plumeria rubra trong nghiên cứu của Muruganantham và ctv (2015) cho thấy khả năng kháng khuẩn đối với chủng E.faecalis với đường kính vòng kháng là 12 mm. Trong đó đối với chủng này cao chiết EtOH 70% của Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml cho vòng kháng khuẩn trung bình 11 mm. Qua đó cho thấy hoạt tính khấng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng thấp hơn so với hai loại cao chiết đã so sánh ở trên. Với kết quả này có thể do các loại cây ở những điều kiện thí nghiệm và điều kiện tự nhiên ở mỗi nơi khác nhau nên ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. 3.3.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết đối với 20 vi khuẩn gây bệnh gây bệnh Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Hoa Sứ vàng từ các loại dung môi khác nhau ở nồng độ 200 mg/ml trên 20 nhóm vi khuẩn gây bệnh, kết quả tổng hợp đo đường kính vòng ức chế của 4 loại cao chiết được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đường kính vòng ức chế (mm) các loại cao chiết khác nhau từ Hoa Sứ vàng đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị. 55
Đồ án tốt nghiệp Vi sinh vật chỉ thị Nồng độ (mg/ml) Cao chiết nước Cao chiết ethanol 50% Cao chiết ethanol 70% Cao chiết ethanol 96% Ciprofloxacin(*) 200 NA 8,83b ± 1,04 9,50b ± 1,50 10,00a ± 1,00 E.coli 13,17a ± 0,29 100 NA NA NA NA 200 NA 9,00c ± 0,50 12,00b ± 1,00 8,83c ± 0,76 ETEC 31,00a ± 0,50 100 NA NA 9,50c ± 0,50 NA 200 NA 9,83ab ± 0,29 11,33ab ± 1,53 8,67b ± 0,58 E.coli 0208 12,33a ± 0,29 100 NA 8,50b ± 0,5 NA NA 200 NA 9,67b ± 0,58 8,67b ± 0,58 10,17b ± 0,76 E.coli O157:H7 13,17a ± 0,29 100 NA 8,50b ± 0,50 NA NA 200 NA 10,00ab ± 0,50 12,00a ± 1,00 9,50b ± 0,50 L.innocua 12,00a ± 0,50 100 NA 8,67b ± 0,58 NA NA 200 NA 10,00b ± 0,50 10,83ab ± 0,76 8,17c ± 0,29 L.monocytogenes 12,17a ± 0,29 100 NA NA NA NA 200 NA 9,67bc ± 0,58 11,00ab ± 1,00 8,67c ± 0,29 S.dublin 12,17a ± 0,76 100 NA 8,5b ± 0,5 NA NA 200 NA 10,33a ± 0,58 11,67a ± 1,53 10,50a ± 0,50 S.enteritidis 13,00a ± 0,50 100 NA 8,5b ± 0,5 NA NA 200 NA 9,33b ± 0,76 10,83ab ± 1,26 10,33ab ± 0,58 S.typhii 12,50a ± 0,50 100 NA 8,50b ± 0,5 7,33b ± 0,29 8,50b ± 0,50 200 NA 8.83b ± 0,29 12,00a ± 1,00 8,33b ± 0,58 S.typhimu 13,17a ± 0,29 100 NA NA NA 7,5 ± 0,5 200 NA 8,83c ± 0,29 11,17b ± 0,16 8,33c ± 0,58 Shi.sonneii 33,00a ± 0,50 100 NA NA NA NA 200 NA 9,67ab ± 0,58 10,50a ± 0,5 8,67b ± 0,58 Shi.boydii NA 100 NA NA NA NA 200 NA 8,83b ± 0,29 12,00a ± 1,00 8,33b ± 0,58 Shi.flexneri 13,17a ± 0,29 100 NA NA 11,00b ± 1,00 NA 200 NA 9,50b ± 0,5 10,67b ± 1,15 9,50b ± 0,50 V.cholerae 13,33a ± 0,58 100 NA NA NA 8,17b ± 0,76 200 NA 9,33b ± 0,58 10,17b ± 0,76 9,67b ± 0,58 V.harveyi 18,00a ± 0,50 100 NA NA NA NA 200 NA 10,00bc ± 0,50 11,00b ± 1,00 9,00c ± 0,50 V.alginolyticus 16,17a ± 0,29 100 NA NA NA 8,17b ± 0,29 200 NA 9,33b ± 0,58 13,00a ± 0,5 9,00b ± 1,00 V.parahaemolyticus 11,33a ± 0,29 100 NA NA 10,50a ± 0,50 NA 200 NA 8,67b ± 0,58 10,67ab ± 1,53 9,83b ± 0,29 P.aeruginosa 12,17a ± 0,58 100 NA NA NA 8,67b ± 0,58 200 NA 8,33b ± 0,29 11,00a ± 1,00 NA S.aureus 12,17a ± 0,29 100 NA NA NA NA E.faecalis 200 NA 9,50b ± 0.87 11,00ab ± 1,00 9,67ab ± 0,58 12,00a ± 0,50 100 NA NA 8,50b ± 0,50 8,83b ± 0,76 (*): Nồng độ ciprofloxacin tương ứng với nhóm Vibrio spp. là 8 µg/ml và đối với các vi sinh vật chỉ thị còn lại là 500 µg/ml. NA: Non activity 56
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào Bảng 3.1 có thể kết luận rằng cao chiết Hoa Sứ vàng sứ vàng từ 4 loại dung môi ở nồng độ 200 mg/ml có phổ hoạt động rộng và hoạt tính kháng khuẩn khác nhau trên 20 chủng vi khuẩn chỉ thị với đường kính vòng úc chế trung bình từ 8,17 mm đến 13 mm. Mặt khác, các loại cao chiết ethanol có khả năng ức chế tốt đối với cả 20 chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó ở cao chiết EtOH 96% không có khả năng kháng chủng S.aureus; còn đối với cao nước không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên 20 chủng vi khuẩn chỉ thị. Đặc biệt cao EtOH 70% thể hiện khả năng kháng khuẩn ở 19/20 chủng vi khuẩn thuộc các nhóm Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio spp. và nhóm gây bệnh cơ hội trên da so với các cao chiết còn lại luôn ở mức cao nhất với đường kính vòng kháng trung bình từ 8,67 mm đến 13 mm. Ở cao chiết EtOH 70% riêng đối với các nhóm vi khuẩn Listeria spp., Salmonella spp. và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da còn đối với nhóm Vibrio spp. thì có chủng V.parahaemolyticus khi so sánh với kháng sinh thì ở nồng độ 200 mg/ml có hoạt tính tương đương với ciprofloxacin (0,5 mg/ml) riêng chủng Vibrio spp. là ciprofloxacin (0,08 mg/ml) không có sự khác biệt về phương diện thống kê với (P > 0,01). Đối với nồng độ 100 mg/ml cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn không đồng dều với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình từ 7,33 mm đến 11 mm. Cụ thể, ở cao chiết EtOH 50% chỉ kháng được 6/20 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Ở cao chiết EtOH 70% thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 5/20 chủng vi khuẩn chỉ thị, đặc biệt kháng mạnh nhất đối với chủng Shi.flexneri với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 11 mm tuy nhiên thấp hơn so với đối chứng ciprofloxacin (0,5 mg/ml) ở mức có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,01). Còn ở cao chiết EtOH 96% cũng chỉ cho khả năng kháng 6/20 chủng vi khuẩn. Xét khả năng kháng khuẩn của cao EtOH 50% và cao EtOH 96% có thể thấy phổ kháng khuẩn rộng lần lượt là 20/20 và 19/20 chủng vi khuẩn chỉ thị với đường kính trung bình của vòng kháng khuẩn lần lượt từ 8,3 mm đến 10,3 mm và từ 8,3 mm đến 10,5 mm. Ở hai loại cao này khả năng kháng khuẩn của cao EtOH 50% cao hơn 57
Đồ án tốt nghiệp cao EtOH 96% nhưng không nhiều. Ở chủng Listeria spp. cao EtOH 70% cho khả năng kháng cao hơn cao EtOH 96% và ngược lại ở chủng vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da cao EtOH 96% cho kết quả tốt hơn. Mặt khác ở cao nước không có khả năng kháng khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Kareem, Akpan và Ojo (2008); nhóm tác giả đã khả sát hoạt tính kháng khuẩn của lá và nhựa cây Calotropis procera với dung môi ethanol ở nồng độ 10 mg/ml trên một số chủng vi khuẩn khảo sát tương tự trong thí nghiệm. Kết quả đường kính vòng ức chế đối với các chủng E.coli, S.aureus, P.aeruginosa lần lượt ở lá là 8,5 mm; 7 mm; 3,5 mm và ở nhựa là 14,1 mm; 12 mm; 7 mm cho thấy hoạt tính khang khuẩn của Calotropis procera cao hơn Hoa Sứ vàng. Theo kết quả nghiên cứu của Igbinosa (2009) đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Jatropha curcas (cây dầu mè) trên các chủng vi sinh vật như E.coli, Pseudomonas với đường kính vòng ức chế tương ứng là 11 mm và 12 mm (đường kính lỗ d = 6 mm). Từ kết quả nghiên cứu trên, so sánh với hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ vàng ở nồng độ 200 mg/ml với chủng ETEC và E. coli có đường kính vòng ức chế là 12 mm và 9,5 mm, với chủng Pseudomonas có đường kính vòng ức chế là 10,7 mm có thể nhận thấy được rằng cao chiết ethanol 70% có hoạt tính kháng khuẩn tương đương cao chiết ethanol từ cây dầu mè. So với kết quả của Trần Phương Thùy (2017) về khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nước và ethanol Hoa Sứ trắng cho thấy phổ kháng rộng và khả năng kháng mạnh ở cả 20 chủng vi sinh vật chỉ thị với đường kính trung bình từ 8,17 mm đến 12,5 mm như trong thí nghiệm đã sử dụng. Còn với mẫu cao chiết Hoa Sứ vàng cho khả năng kháng khuẩn và phổ kháng khá tương đồng với nghiên cứu Hoa Sứ trắng với đường kính kháng khuẩn trung bình từ 8,17mm đến 12 mm. Qua kết quả phân tích, có thể kết luận rằng tách chiết mẫu cây Hoa Sứ vàng bằng dung môi EtOH 70% sẽ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất so với các loại 58
Đồ án tốt nghiệp dung môi tách chiết còn lại. Mặt khác, chúng tôi nhận thấy sử dụng dung môi EtOH 70% để tách chiết cao từ mẫu Hoa Sứ vàng là khá phù hợp vì quá trình tách chiết dễ thực hiện, thiết bị đơn giản và an toàn. Từ thực nghiệm trên, tiến hành khảo sát thành phần hóa học của Hoa Sứ vàng ở cao ethanol 70%. 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hóa học cơ bản của cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. Từ kết quả các thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cao chiết Hoa Sứ vàng từ EtOH 70% có khả năng ức chế các loại vi khuẩn tốt hơn các loại cao chiết khác. Dựa vào cơ sở trên, tiến hành thực hiện các thử nghiệm để xác định sự hiện diện một số thành phần hóa học có khả năng kháng khuẩn trong mẫu cao chiết Hoa Sứ vàng EtOH 70%. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả định tính một số thành phần hóa học của cao chiêt Hoa Sứ vàng từ ethanol 70%. Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả Molisch + Carbohydrate Fehling + Barfoed + Mayer + Dragendorff + Alkaloid Hager + Wagner + Saponin Foam + Legal - Cardiac glycosides Keller Killiani + Alkaline reagent + Flavonoid Ferric chloride + 59
Đồ án tốt nghiệp Lead acetate + Phenolic compound Gelatin + Ferric chloride - Tannins Lead acetate - Salkowski + Steroids Libermann Burchard - Amino acid Ninhidrin - (+) Dương tính (-) Âm tính Dựa vào bảng 3.2, kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp chất có trong hoa bao gồm những hợp chất tự nhiên trong đó có những hợp chất có hoạt tính sinh học như: carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycosides, flavonoid, steroids. Bên cạnh đó, có 3 hợp chất không được phát hiện trong cao chiết Hoa Sứ vàng từ ethanol 70% là phenolic compound, tannins, amino acid. Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết Hoa Sứ vàng nói riêng là do chúng có các thành phần alkaloid, flavonoid, hợp chất phenol, tannin và triterpenoid quyết định. Với thử nghiệm định tính alkaloid, nhận thấy cao chiết từ dung môi ethanol 70% cho phản ứng dương tính, điều này chứng tỏ loại dung môi này có khả năng tách chiết các hợp chất thuộc nhóm alkaloid. Theo nghiên cứu của Cowan (1999), xét cụ thể ở hợp chất alkaloid có thể thấy tồn tại dẫn chất berberine và dẫn chất piperrine có chức năng xen vào thành tế bào hoặc DNA của vi sinh vật phá hủy và tiêu diệt chúng. Còn đối với thử nghiệm hợp chất steroid cho kết quả dương tính với thuốc thử salkowski, giống với kết quả nghiên cứu của Liang và ctv, 2012 công bố tìm được các hợp chất betulinic acid thuộc nhóm triterpenoid và hợp chất stigmasterol thuộc nhóm sterol. Thử nghiệm flavonoid với thuốc thử Ferric chloride giúp nhận biết chalcon trong nhóm chất flavonoid (Đặng Thị Luyến và ctv, 2008) và thử nghiệm với 60
Đồ án tốt nghiệp thuốc thử Alkaline giúp phân biệt nhóm flavon và flavonol (Manpreet Kaur, 2015). Các hợp chất được thử nghiệm có khả năng kháng khuẩn bằng các con đường khác nhau như phá vỡ màng tế bào, liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, khử hoạt tính enzyme và bám dính protein. Sự kháng khuẩn thực vật còn có sự tham gia của tannin và các hợp chất phenol, tuy nhiên kết quả định tính cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ vàng lại không thấy có sự suất hiện của tannin và các hợp chất phenol. Chính vì thế nồng độ ức chế vi khuẩn chỉ thị của cao chiết tương đối cao. Bên cạnh đó, Ramproshad và cộng sự (2012) và Subur Khan (2010) đã chỉ ra có sự xuất hiện của các hợp chất alkaloid, steroid, flavonoid glycoside khi nghiên cứu thành phần hóa học từ cây Plumeria. Qua đó có thể khẳng định sự xuất hiện của các thành phần này trong Hoa Sứ vàng. Tóm lại, với các kết quả khảo sát ban đầu về hoạt tính sinh học của Hoa Sứ vàng, nhận thấy rằng đây là một loại thực vật có hoạt tính sinh học tương đối tốt. Tuy dung môi nước cho hàm lượng thu hồi cao tốt nhất trong 4 dung môi khảo sát nhưng với các thí nghiệm đã thực hiện nhận thấy rằng cao chiết từ EtOH 70% cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn tất cả các dung môi còn lại thể hiện qua khả năng ức chế tốt nhất ở cả 6/6 nhóm vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm, đặc biệt là đối với các nhóm Listeria spp., Salmonella spp. và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da. Trong cao chiết ethanol 70% từ Hoa Sứ vàng có sự hiện diện của rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học carbohydrate, alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, glycoside; những hợp chất này tạo nên hoạt tính kháng khuẩn của Hoa Sứ vàng. 61
Đồ án tốt nghiệp Kết luận và kiến nghị 1. Kết luận - Từ mẫu Hoa Sứ vàng thực hiện tách chiết để thu hồi cao với 4 loại dung môi khác nhau EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 96% và nước trong đó hàm lượng thu hồi cao từ dung môi nước cho kết quả cao nhất là 32,27%. - Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 4 loại cao chiết Hoa Sứ vàng trên 20 chủng gây bệnh tiêu chảy và bệnh cơ hội trên da cho thấy cao chiết Hoa Sứ vàng có phổ hoạt động rộng và có ức chế tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm cho người, đặc biệt là cao chiết từ EtOH 70% luôn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng trung bình từ 8,7mm đến 13mm. - Thử nghiệm xác định thành phần hóa học của cao chiết EtOH 70% từ Hoa Sứ vàng thấy sự hiện diện của các hợp chất carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid và nhóm steroid. 2. Kiến nghị - Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ Hoa Sứ vàng với nhiều vi sinh vật gây bệnh khác. - Đánh giá khả năng trị bệnh của cao chiết từ Hoa Sứ vàng trên mô hình ở động vật để làm cơ sở ứng dụng điều chế thuốc trị bệnh cho người. - Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của Hoa Sứ vàng. 62