Đồ án Nghiên cứu công nghệ thuỷ phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học

75 trang thiennha21 12/04/2022 4110

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu công nghệ thuỷ phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_cong_nghe_thuy_phan_va_len_men_dong_thoi_lu.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu công nghệ thuỷ phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ THUỶ PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI LỤC BÌNH THÀNH CỒN SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Đình Quân Sinh viên thực hiện : Lê Hồng Đức MSSV: 1151110089 Lớp: 11DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hỗ trợ của giảng viên hướng dẫn là TS. Nguyễn Đình Quân. Những kết quả trong quá trình nghiên cứu là trung thực và không sao chép của ai. Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá của các tác giả, cơ quan khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng và chấp nhận mọi kỷ luật từ nhà trường. Sinh viên thực hiện Lê Hồng Đức
LỜI CẢM ƠN Những tháng ngày còn học tại trường, thầy cô đã truyền dạy cho em những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống. Và trong những ngày làm đồ án tốt nghiệp, em được củng cố những kiến thức cũng như những kinh nghiệm trong thời gian làm đồ án. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm – Môi Trường và ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình dạy dỗ, tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập trong suốt 4 năm học tập tại trường. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến thầy TS. Nguyễn Đình Quân đã tận tình hướng dẫn, tạo nhiều điều kiện thuận lợi và đưa ra những lời khuyên chân tình, giúp em hoàn thành tốt đồ án của mình. Em cũng chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tưởng An, chị Vũ Lê Vân Khánh, chị Trần Phước Nhật Uyên, anh Phan Đình Đông đã giúp đỡ em kiến thức chuyên môn cũng như tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp. Em cũng xin chân thành cảm ơn bạn Nguyễn Gia Hân, bạn Nguyễn Thuỳ Dung đã luôn động viên, ủng hộ tinh thần giúp em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp. Và con cũng xin cảm ơn Bố, Mẹ người đã luôn âm thầm ủng hộ, động viên tinh thần cũng như tiếp cho con nghị lực sống để hoàn tốt đồ án tốt nghiệp
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH ẢNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu: 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: 2 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Kết cấu đồ án: 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu về bioethanol 4 1.1.1 Khái niệm Bioethanol 4 1.1.2 Tình hình phát triển của bioethanol trong nước và thế giới 4 1.1.2.1 Trên thế giới: 4 1.1.2.2 Trong nước 7 1.2 Các loại Bioethanol 8 1.2.1 Bioethanol thế hệ thứ nhất 8 1.2.2 Bioethanol thế hệ thứ hai 8 1.2.3 Bioethanol thế hệ thứ ba 9 1.2.4 Ưu điểm và nhược điểm của Bioethanol 10 1.3 Quy trình sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose 12 1.3.1 Sinh khối lignocellulose 12 1.3.2 Cellulose 13 1.3.3 Hemicellulose 13 1.3.4 Lignin 14 1.4 Các bước biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol 14 1.4.1 Quá trình tiền xử lý 14 i
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2 Quá trình thuỷ phân 18 1.4.3 Quá trình lên men 19 1.5 Vi sinh vật sử dụng cho quá trình lên men rượu 21 1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 23 1.6 Lục bình 26 1.6.1 Phân loại khoa học 26 1.6.2 Nguồn gốc 26 1.6.3 Nơi sống 27 1.6.4 Thành phần hoá học 27 1.6.5 Đặc điểm sinh trưởng 28 1.6.6 Hình thức sinh sản 28 1.6.7 Thực trạng sử dụng lục bình ở Việt Nam 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 31 2.1.2 Địa điểm 31 2.2 Nguyên liệu và hoá chất 31 2.2.1 Nguyên liệu 31 2.2.2 Hoá chất 33 2.3 Thiết bị và dụng cụ 34 2.3.1 Dụng cụ 34 2.3.2 Thiết bị 34 2.4 Phương pháp nghiên cứu 37 2.4.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi 37 2.4.2 Phương pháp đo nồng độ glucose, xylose và ethanol bằng sắc ký lỏng hiệu cao năng (HPLC) 40 2.4.3 Phương pháp đo độ ẩm nguyên liệu 42 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy men và xác định chỉ số OD 43 2.5 Bố trí thí nghiệm 46 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm trong đồ án 46 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49 3.1 Thành phần lục bình ban đầu 49 3.2 Qúa trình thuỷ phân và lên men đồng thời 50 3.2.1 Kết quả thời gian lên men 50 3.2.2 Hiệu suất lên men theo thời gian 51 3.3 Thành phần bã lục bình sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời 53 3.4 Thí nghiệm bổ sung 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến Nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 1 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1 Dự án JICA - JST 7 Hình 1. 2 Cấu trúc lignocellulose 12 Hình 1. 3 Cấu trúc không gian của cellulose 13 Hình 1. 4 Nấm men Saccharomyces cerevisiae quan sát dưới kính hiển vi 21 Hình 1. 5 Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 23 Hình 1. 6 Lục Bình 26 Hình 2. 1 Lục bình 31 Hình 2. 2 Cắt, bỏ rễ, rửa lục bình 31 Hình 2. 3 Enzyme Cellulase 32 Hình 2. 4 Bột ngô (CSL) 33 Hình 2. 5 Thiết bị phân tích HPLC 36 Hình 2. 6 Thiết bị quang phổ UV - VIS 39 Hình 2. 7 Thiết bị lọc chân không 39 Hình 2. 8 Thiết bị đánh siêu âm 41 Hình 2. 9 Máy đo độ ẩm 43 Hình 2. 10 Dịch kích hoạt men giống 44 Hình 2. 11 Dịch nấm men sau ly tâm 45 Hình 2. 12 Máy quang phổ kế 45 Hình 2. 13 Sơ đồ thí nghiệm 46 Hình 2. 14 Dụng cụ thuỷ phân và lên men đồng thời 47 Hình 3. 1 Thành phần sơ xợi của lục bình. 49 Hình 3. 2 Nồng độ ethanol và glucose theo thời gian lên men khi sử dụng enzyme với liều lượng là 2 % khối lượng so với khối lượng lục bình khô : (1) Ethanol; (2) Glucose. 50 Hình 3. 3 Hiệu suất lên men ethanol theo thời gian 51 Hình 3. 4 Thành phần bã lục bình sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời 53 Hình 3. 5 So sánh hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian: (1) 3% Enzyme; (2) 2,5% Enzyme; (3) 1,5 % Enzyme; (4) 2% Enzyme. 54 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1 Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô 22 Bảng 1. 2 Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của lục bình . 27 Bảng 1. 3 Thành phần sơ xợi lục bình từ nhiều nguồn khác nhau 29 Bảng 2. 1 Hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm. 33 Bảng 2. 2 Thành phần các chất trong bình phản ứng 48 v
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Quá trình sử dụng xăng dầu đã trở thành mối quan tâm lớn trong vấn đề biến đổi khí hậu toàn cầu do việc sản sinh lượng khí CO2 ngày càng nhiều gây ra hiệu ứng nhà kính. Việc đốt cháy nhiên liệu hóa thạch cũng tạo ra mối quan tâm về nguồn dầu mỏ đang ngày càng cạn kiệt cũng như giá cả nhiên liệu ngày càng tăng, gây ảnh hưởng đến kinh tế toàn cầu. Những mối quan tâm này đã góp phần thúc đẩy quá trình tạo ra một loại năng lượng thay thế có thể đáp ứng được nhu cầu năng lượng lớn của thế giới, trong đó phải kể đến ethanol sinh học. Hiện nay trên thế giới , Brazil và Hoa Kỳ là hai nước dẫn đầu trong việc sử dụng tinh bột, đường từ ngô và cây mía để sản xuất ra ethanol sinh học. Ethanol sinh học này là một loại nhiên liệu sinh học thuộc thế hệ thứ nhất được sản xuất từ tinh bột và đường bằng công nghệ thông thường. Tuy nhiên, việc sản xuất từ ethanol sinh học thuộc thế hệ thứ nhất gây ra những cuộc cạnh tranh về vấn đề lương thực trên thế giới cũng như về vấn đề kinh tế với nhiên liệu hoá thạch. Nhưng ethanol sinh học thế hệ thứ hai có thể giúp giải quyết những vấn đề này và có thể cung cấp một lượng nhiên liệu bền vững, chi phí thấp, đồng thời bảo vệ môi trường sống của con người. Ethanol sinh học thế hệ thứ hai được sản xuất dựa trên các loại cây không ăn được (sinh khối lignocellulose), chúng được biết đến là một nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền và được xem là chất thải ở một số nước. Những nguồn nguyên liệu này bao gồm là những phụ phế phẩm nông nghiệp như: lá, thân cây từ cây ngô, bắp, mía, vỏ trấu, rơm rạ Đây là những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Ngoài những nguồn nguyên liệu kể trên, nguồn lignocellulose có thể được tìm thấy ở chất thải của các ngành công nghiệp và nông nghiệp, ví dụ như vỏ chanh, mùn cưa, bột giấy, chất thải công nghiệp. Chính những ưu điểm được nêu như trên nên việc sản xuất ra ethanol sinh học từ nguồn lignocellulose có ý nghĩa thiết thực và cần thiết. 1
Đồ án tốt nghiệp Ngoài các loại nguyên liệu như mía, bắp để sản xuất ra ethanol. Thực vật thuỷ sinh cũng được coi như là một nguồn năng lượng thay thế đầy hứa hẹn do nguồn nguyên liệu phong phú và dễ trồng. Hơn nữa, chúng có những thuận lợi như cơ thể phát triển trên mặt nước mà không cạnh tranh với hầu hết các loại cây lương thực và rau quả cho đất canh tác. Trong số những loài thực vật thuỷ sinh thì không thể không kể đến nguồn nguyên liệu phong phú là lục bình. Bên cạnh những mặt hạn chế như trở ngại cho giao thông đường thuỷ cũng như gây ô nhiễm môi trường do lục bình ngăn cản dòng chảy, rác thải bị ứ đọng gây ra nhiều dịch bệnh cho những người dân sống xung quanh. Bên cạnh đó, những cuộc nghiên cứu của các nhà khoa học thì lục bình được xem như là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuất ra ethanol. Để khắc phục tình trạng khủng hoảng năng lượng toàn cầu cũng như hạn chế ô nhiễm môi trường, đề tài “ Nghiên cứu công nghệ thuỷ phân và lên men đồng thời lục bình thành cồn sinh học ” được thực hiện nhằm giải quyết những vấn đề thực tiễn như nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn kiệt, giảm lượng khí CO2 và đồng thời giảm thiểu những tác hại cũng như tận dụng được nguồn nguyên liệu lục bình ở các kênh rạch. 2. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời để chuyển hóa cellulose trong nguồn lục bình ban đầu thành ethanol. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu: Để thực hiện mục tiêu được nêu trên, đồ án tập trung nghiên cứu các nhiệm vụ sau: • Nghiên cứu thành phần lục bình trước và sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời. • Khảo sát nồng độ ethanol, nồng độ glucose trong quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời lục bình theo thời gian. 2
Đồ án tốt nghiệp 4. Phương pháp nghiên cứu Đồ án sử dụng những phương pháp nghiên cứu sau đây: • Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi. • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng (HPLC) để đo nồng độ glucose, xylose, ethanol. • Phương pháp đo độ ẩm nguyên liệu. • Phương pháp nuôi cấy men và xác định chỉ số OD. 5. Kết cấu đồ án: Đồ án được chia làm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận. Chương 4: Kết luận và kiến nghị. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về bioethanol 1.1.1 Khái niệm Bioethanol Bioethanol (ethanol sinh học) là ethanol được sản xuất từ các loại nguyên liệu thực vật chứa đường bằng phương pháp lên men vi sinh hoặc từ các loại nguyên liệu chứa tinh bột và cellulose thông qua các phản ứng trung gian thuỷ phân thành đường. Hiện nay, trên thế giới các loại nguyên liệu chứa nhiều tinh bột và đường như mía, ngô được sử dụng phổ biến hơn do chi phí sản xuất thấp. 1.1.2 Tình hình phát triển của bioethanol trong nước và thế giới 1.1.2.1 Trên thế giới: Những năm gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất bioethanol từ sinh khối và thu về được những thành công nhất định, là những tiền đề thuận lợi cho sự phát triển của công nghệ sản xuất bioethanol. Những nước tiên phong trong việc sử dụng xăng sinh học là Brazil và Mỹ. • Brazil Chúng ta không nhiều người biết Brazil đã sử dụng nhiên liệu ethanol làm từ mía đường lần đầu tiên từ cuối những năm 20 và đầu những năm 30 của thế kỷ trước - thuộc hàng sớm nhất thế giới. Nhà máy sản xuất nhiên liệu ethanol đầu tiên đi vào hoạt động từ năm 1927 có tên là Usina Serra Grande Alagoas, bang Alagoas. Chỉ đạo dùng mía đường làm nguyên liệu sản xuất ethanol và bắt buộc phối trộn loại nhiên liệu này vào xăng truyền thống của Chính phủ Brazil bắt nguồn từ việc ở quốc gia này sản xuất đường từ mía đã trở nên quá dư thừa so với nhu cầu. Trong khi đó, các sản phẩm phụ thu từ sản xuất đường mía như ethanol và cồn ethyl thì hoàn toàn có thể xử lý để sản xuất đồ uống có cồn, nhiên liệu ethanol hoặc rượu sử dụng trong công nghiệp hay chất khử trùng [41]. Do chính sách này, từ năm 1933 đến năm 1945, số lượng các nhà máy sản xuất nguyên liệu ethanol ở Brazil đã tăng từ 1 lên đến 54 nhà máy.Và chỉ trong 4
Đồ án tốt nghiệp vòng 4 năm từ 1933-1937, sản lượng ethanol cũng tăng từ 100.000 lít lên 51,5 triệu lít, chiếm 7% nhu cầu sử dụng nhiên liệu trên toàn quốc [41]. Những năm 70, khi cuộc khủng hoảng dầu mỏ thế giới đầu tiên xảy ra dẫn đến tình trạng khan hiếm xăng dầu nghiêm trọng làm tăng chi phí nhập khẩu dầu mỏ tăng gấp đôi. Để đối phó cuộc khủng hoảng dầu mỏ những năm 70, chính phủ Brazil đã bắt đầu thúc đẩy việc sử dụng ethanol sinh học làm nhiên liệu. Chương trình “Pro Alcohol” ra mắt vào năm 1975 là một chương trình quốc gia được chính phủ tài trợ nhằm mục tiêu loại bỏ các loại nhiên liệu được sản xuất từ nhiên liệu hóa thạch như xăng, tăng cường sản xuất cũng như khuyến khích sử dụng ethanol sản xuất từ mía đường [41]. Năm 1979, chiếc Fiat 147 ra đời là chiếc xe đầu tiên trên thế giới chạy bằng nhiên liệu ethanol tinh khiết (E100). Song song đó, các nhà khoa học Brazil được lệnh nghiên cứu phát triển các hợp kim để bảo vệ các bộ phận bên trong của động cơ chạy bằng xăng và bình nhiên liệu khỏi sự ăn mòn của ethanol. Từ 1986-1989, 90% các loại xe mới được bán ở thị trường Brazil đều có thể chạy bằng nhiên liệu ethanol [41]. Nếu tại Brazil, việc sản xuất ethanol sinh học chủ yếu là từ mía thì tại Mỹ thì nguyên liệu sản xuất chính ethanol lại là ngô. • Mỹ Khác xa với Brazil, Mỹ sản xuất ethanol sinh học để đảm bảo vấn đề an ninh lương thực và giảm khí thải. Năm 1970, tại Mỹ xảy ra một sự kiện quan trọng là thông qua Đạo luật Không khí sạch và thành lập Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ (EPA), đơn vị có trách nhiệm điều chỉnh chặt chẽ hơn các tiêu chuẩn khí thải các chất ô nhiễm như dioxit lưu huỳnh (SO2), carbon monoxide (CO2), ozone (O3) và các oxit nitơ. Điều này tạo tiền đề cho phát triển nhiên liệu cháy sạch hơn, cũng như thiết lập các tiêu chuẩn cho các chất phụ gia nhiên liệu [41]. Sau 2 lần biến động bởi lệnh cấm vận dầu mỏ của Ả Rập vào năm 1973- 1974 và cuộc Cách mạng Iran nổ ra năm 1979 làm giá dầu tăng vọt trên thị trường, cùng với sự sụt giảm khai thác dầu mỏ ở trong nước, Mỹ càng bị thôi thúc phải tìm 5
Đồ án tốt nghiệp cách giảm bớt sự phụ thuộc vào dầu mỏ truyền thống không chỉ vì mục tiêu cải thiện chất lượng không khí mà còn vì an ninh năng lượng [41]. Sau khi bắt đầu thử nghiệm sử dụng xăng sinh học E10 (pha trộn với 10% ethanol tùy theo thể tích) vào năm 1976, đến năm 1978, Quốc hội Mỹ đã công nhận những lợi ích của ethanol trong nhiên liệu và bắt đầu áp dụng biện pháp giảm thuế đối với xăng pha ethanol để khuyến khích phát triển thị trường nhiên liệu này [41]. Trong tương lai, các loại nguyên liệu sinh học ở Mỹ sẽ không sản xuất chủ yếu từ ngô nữa mà sẽ được sản xuất từ các nguồn cao cấp hơn vì hiện nay chính phủ Mỹ đã có chính sách hỗ trợ sản xuất nguyên liệu sinh học từ sinh khối hoặc là các loại nguyên liệu khác [41]. • Nhật Bản Tập đoàn Công nghiệp nặng Kawasaki của Nhật Bản đã phát triển công nghệ sản xuất ethanol từ rơm với giá chỉ 40 yên (khoảng 0,45 USD) một lít, ngang với mức chi phí sản xuất loại nhiên liệu sinh học này từ đường mía tại Brazil và các nơi khác. Tập đoàn Kawasaki cho biết công nghệ nói trên có chi phí sản xuất thấp là nhờ chỉ sử dụng nước nóng để phân giải nguyên liệu thô, không phụ thuộc vào axít sulfuric và enzym như phương pháp thông thường. Công ty này đã tiến hành nghiên cứu và thí nghiệm sản xuất ethanol từ năm 2009 tại một nhà máy ở quận Akita của Nhật Bản và hiện đang lên kế hoạch bán các thiết bị sản xuất nhiên liệu sinh học cho xe hơi trên toàn cầu [42]. 6
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2 Trong nước Hình 1. 1 Dự án JICA - JST Dự án “Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phương với công nghiệp chế biến Biomass” (Dự án JICA-JST Biomass) do Trường ĐH Bách khoa TP.HCM phối hợp với Trường ĐH Tokyo (Nhật Bản) thực hiện trong thời gian 5 năm (từ năm 2009 - 9/2014). Dự án hướng đến việc sản xuất xăng sinh học, biogas sạch có nhiệt trị cao từ các phế phẩm nông nghiệp như: Rơm, rạ, trấu, phân bò nhằm bảo vệ môi trường, giảm hiệu ứng nhà kính và góp phần đảm bảo an ninh năng lượng. Năm 2009, dự án đã xây dựng một mô hình thiết bị tại Trường ĐH Bách khoa TP.HCM để nghiên cứu, sản xuất xăng sinh học. Sau gần 5 năm thực hiện, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ và các chất thải có nguồn gốc xenlulo. Tuy nhiên, một trong những khó khăn của dự án là giá thành xăng sinh học sản xuất từ rơm rạ khá cao, do chi phí phân hủy xenlulo trong rơm rạ lớn [28]. Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý phế phẩm nông nghiệp, do TS. Phan Đình Tuấn, trường ĐH Bách khoa TP.HCM phụ trách. Biomass là đề tài của nghiên 7
Đồ án tốt nghiệp cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, trấu nhằm sản xuất Bioethanol (cồn nguyên liệu), tiến tới xây dựng mô hình “Thị trấn Biomass” tại Việt Nam [29]. Vừa qua, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Khắc Chương, Trường ĐH Bách khoa (ĐH Quốc gia TP.HCM), cũng vừa công bố đã nghiên cứu thành công một qui trình công nghệ có thể sản xuất ra những loại hóa chất phục vụ điều chế xăng sinh học từ chính những nguồn nguyên liệu rẻ tiền của VN [30]. Nhà máy sản xuất xăng sinh học (Bioethanol) đầu tiên ở Việt Nam được xây dựng tại tỉnh Quảng Nam do Công ty cổ phần Đồng Xanh làm chủ đầu tư. Công suất của nhà máy 100.000 tấn cồn Ethanol/năm, tương đương 125 triệu lít/năm. Kể từ khi cho ra đời mẻ sản phẩm đầu tiên vào tháng 9/2010, đến nay nhà máy đã đi vào hoạt động và sản xuất được 12.000 tấn Ethanol phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Bên cạnh đó, bã sắn sau khi được dùng sản xuất Ethanol, nhà máy tái chế thành phân vi sinh phục vụ sản xuất cho người dân trên địa bàn với giá thành thấp hơn giá thị trường nhưng chất lượng tương đương [31]. 1.2 Các loại Bioethanol Các sản phẩm nhiêu liệu sinh học đã trải qua nhiều giai đoạn phát triển và có thể chia thành 3 thế hệ, tùy thuộc vào công nghệ và nguyên liệu. 1.2.1 Bioethanol thế hệ thứ nhất Ethanol sinh học thế hệ thứ nhất là ethanol sinh học làm từ đường, tinh bột, bằng cách sử dụng công nghệ thông thường. Các nguyên liệu cơ bản để sản xuất ethanol sinh học thế hệ đầu tiên thường là hạt giống hoặc các loại ngũ cốc như lúa mì, tinh bột được lên men thành ethanol sinh học [35]. 1.2.2 Bioethanol thế hệ thứ hai Bioethanol thế hệ đầu tiên tuy có hiệu quả nhưng có nhiều mặt hạn chế. Bioethanol thế hệ đầu bị hạn chế bởi khả năng mở rộng diện tích đất trồng trọt hiện nay để trồng các loại cây thích hợp là có hạn. Hơn nữa, chúng ta không thể sản xuất 8
Đồ án tốt nghiệp đủ ethanol sinh học mà không đe dọa nguồn cung cấp thực phẩm và đa dạng sinh học và việc phải cạnh tranh về chi phí với nhiên liệu hóa thạch như xăng. Bioethanol thế hệ thứ hai có thể giải quyết những vấn đề được nêu trên và có thể cung cấp một lượng nhiên liệu bền vững, chi phí thấp, và với những lợi ích lớn hơn về môi trường. Ethanol sinh học thế hệ thứ hai được sản xuất dựa trên các loại cây không ăn được (sinh khối lignocellulose), chúng được nghiền sấy rồi lên men thành nhiên liệu sinh học. Các nguyên liệu này có nguồn gốc từ chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, chất thải rắn đô thị, các sản phẩm phụ từ quá trình chế biến thực phẩm hoặc loại cỏ sinh trưởng nhanh như rơm, rạ, bã mía, vỏ trấu, cỏ Bioethanol thế hệ 2 được phân loại dựa trên bản chất quá trình chuyển hóa sinh khối: sinh hóa hoặc nhiệt hóa. Quá trình sinh hóa được dùng để sản xuất ethanol hay butanol thế hệ 2 và các nhiên liệu còn lại được tạo ra cùng với quá trình nhiệt hóa. Một số loại nhiên liệu thế hệ 2 (được tạo ra từ quá trình nhiệt hóa) tương tự như các sản phẩm được sản xuất từ nhiên liệu hóa thạch, ví dụ như: methanol [32]. 1.2.3 Bioethanol thế hệ thứ ba Mặc dù Bioethanol thế hệ thứ hai có những ưu điểm vượt bậc hơn Bioethanol thế hệ thứ nhất. Tuy nhiên, sự cạnh tranh về đất canh tác và nước vẫn còn tồn tại. Do đó, các nhà nghiên cứu tìm kiếm một thế hệ mới - bioethanol thế hệ thứ 3 - của nhiên liệu sinh học dựa trên chất béo chiết xuất từ vi tảo [28]. Vì từ lâu, vi tảo đã được xem là nguồn tiềm năng để sản xuất ethanol sinh học vì sinh khối tảo có chứa hàm lượng dầu cao có thể thay thế dầu mỏ nhưng lại thân thiện với môi trường [34]. Việc dùng tảo để sản xuất ethanol sinh học thay thế dầu mỏ giống như một mũi tên bắn trúng hai đích: vừa tạo ra năng lượng vừa góp phần làm sạch môi trường. Mỗi tế bào tảo là một nhà máy sinh học nhỏ, sử dụng quá trình quang hợp để chuyển hóa CO2 và ánh sáng mặt trời thành năng lượng dự trữ trong tế bào và tạo 9
Đồ án tốt nghiệp ra các sản phẩm thứ cấp có giá trị cao. Hoạt động chuyển đổi của chúng hiệu quả đến mức sinh khối có thể tăng gấp nhiều lần trong một ngày. Ngoài ra, trong quá trình quang hợp, tảo còn sản xuất ra dầu ngay trong tế bào của chúng. Trên cùng một đơn vị diện tích, lượng dầu mà tảo tạo ra nhiều gấp 30 lần lượng dầu từ đậu nành. Đồng thời tảo có thể tăng khả năng sản xuất dầu bằng cách bổ sung khí CO2 trong quá trình nuôi trồng chúng hoặc sử dụng các môi trường giàu chất hữu cơ (như nước thải) để nuôi trồng .Điều này vừa tạo ra ethanol sinh học, vừa làm giảm lượng CO2 cũng như làm sạch môi trường [35]. 1.2.4 Ưu điểm và nhược điểm của Bioethanol Bên cạnh những mặt lợi ích khi phát triển ethanol sinh học, còn có không ít những nguy cơ về môi trường, kinh tế, môi trường. Vấn đề là thúc đẩy những mặt lợi ích của ethanol sinh học và hạn chế những nguy cơ. a) Ưu điểm: • Bioethanol có tính chất trung tính về carbon. Điều này có nghĩa là carbon được thải ra (dưới dạng CO2) trong quá trình đốt cháy để cung cấp năng lượng được cây trồng tái hấp thụ thông qua quá trình quang hợp. Vòng tuần hoàn khép kín này tạo nên sự ổn định hàm lượng CO2 trong khí quyển, vì thế góp phần giảm hiệu ứng nhà kính, cải thiện môi trường [43]. • Có nguồn gốc từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh. • Giảm sự lệ thuộc nguồn dầu mỏ, tham gia cân đối nhiên liệu, giảm lượng xăng dầu nhập ngoại bằng nguồn nhiên liệu cung cấp trong nước, cải thiện cán cân thương mại [43]. • Các phương pháp sản xuất ethanol truyền thống phải sử dụng nhiều nhiệt lượng, thường tạo ra bằng việc đốt nhiên liệu hoá thạch, nhưng các phương pháp mới sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền và ít dùng đến như cỏ, lõi cây, rơm rạ, để sản xuất ethanol bằng phương pháp lên men tự nhiên hoặc vật liệu có thể tự tạo nhiệt lượng [43]. b) Nhược điểm: 10
Đồ án tốt nghiệp Ngoài những ưu điểm được nêu trên, công cuộc phát triển ethanol sinh học cũng phát sinh những nguy cơ ảnh hưởng nhiều mặt về kinh tế, xã hội, môi trường. Những nguy cơ đó có thể được kể đến như sau: [43] • Vấn đề lương thực: Việc sử dụng đất để trồng cây nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học có thể ảnh hưởng đến nguồn cung cấp lương thực hoặc làm tăng giá lương thực, đặc biệt đối với các nước đang phát triển. Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ ) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm. • Ô nhiễm và cạnh tranh nguồn tài nguyên nước: Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan vinhoto, một chất được dùng để bón và tưới khi trồng mía đường cũng có thể gây ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch và làm cho các loài thuỷ sinh không thể tồn tại. • Giảm diện tích đất trồng rừng: Để có đất trồng cây nguyên liệu, người ta có thể tiếp tục phá rừng. Điều này đi ngược lại với mục tiêu cắt giảm khí thải nhà kính mà những nhà phát triển nhiên liệu sinh học vẫn mong muốn. Giảm diện tích rừng cũng đồng nghĩa với tai hoạ từ sự xói mòn đất, gây lũ lụt, giảm lượng gỗ dùng cho xây dựng và các nhu cầu khác của người dân. • Nguy cơ về kinh tế, xã hội: Nền công nghiệp nhiên liệu sinh học không thể chỉ dừng lại ở mức sản xuất nhỏ lẻ, mà không ngừng phát triển. Những người nghèo, không có khả năng tự chủ canh tác phải bán ruộng. Đất đai tập trung vào một số điền chủ lớn. Như vậy, một lớp người sẽ tước mất phương tiện sản xuất, rơi vào tình trạng thất nghiệp, nghèo đói, làm bất ổn đời sống xã hội. Kéo theo đó là tình trạng phân hoá giàu nghèo ngày càng rõ rệt. 11
Đồ án tốt nghiệp • Việc chuyển hóa từ nguyên liệu sinh khối thành bioethanol đòi hỏi trình độ khoa học kỹ thuật cao và đầu tư lớn. 1.3 Quy trình sản xuất bioethanol từ sinh khối lignocellulose 1.3.1 Sinh khối lignocellulose Lignocellulose là một chất hữu cơ tái tạo và là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật. Lignocellulose là nguyên liệu dồi dào có sẵn hầu hết trên Trái đất để sản xuất nhiên liệu sinh học, chủ yếu là ethanol sinh học . Lignocellulose bao gồm các polymer carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin). Các polymer carbohydrate chứa các monomer đường khác nhau ( đường 5 và đường 6 cacbon) và chúng bị bao bọc chặt chẽ bởi lignin. Lignocellulose có trong phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu ở dạng phế phẩm của các vụ mùa, trong sản phẩm phụ của công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, có trong rác thải rắn của thành phố [21]. Trong đó, lục bình được xem như là một dạng vật liệu lignocellulose. Hình 1. 2 Cấu trúc lignocellulose 12
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2 Cellulose Cellulose là một polysaccharide, có công thức tổng quát là (C6H10O5)n. Cellulose có cấu tạo mạch thẳng, bao gồm những đơn vị D - glucopyranose (cellobiose) liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside nghĩa là các vòng Hình 1. 3 Cấu trúc phân tử của cellulose glucopyranose quay ngược nhau một góc 180o. Số monomer đạt được từ 2000- 10000, chiều dài mạch phân tử từ 5,2- 7,7mm. Các mạch phân tử này tập hợp kề cận nhau và nhờ liên kết hydro mà hình thành cấu trúc vi sợi. Ở trạng thái tự nhiên, mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro hình thành hai vùng cấu trúc chính là vùng kết tinh và vùng vô định hình. Có hai dạng liên kết hydro: liên kết hydro liên phân tử giữa các chuỗi và liên kết hydro nội phân tử giữa các đơn vị glucose của cùng một chuỗi. Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [21]. 1.3.3 Hemicellulose Hemicellulose là thành phần chính thứ hai của sinh khối lignocellulose, với hàm lượng lớn sau cellulose. Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Công thức tổng quát của nó là (C5H8O4)n. Hemicellulose chứa cả đường hexose (D-glucose, D-mannose, D- galactose) hoặc đường pentose (D-xylose, Larabinose, D- arabinose), deoxyhexose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4- glucoside [21]. 13
Đồ án tốt nghiệp 1.3.4 Lignin Lignin là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của phenyl, propan, một số chất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin là sản phẩm ngưng tụ chủ yếu của ba loại rượu thơm : coniferyl (guaiacyl propanol), sinapyl (syringyl alcohol) và p-coumaryl (p-hydroxyphenyl propanol) theo tỷ lệ khác nhau tùy loại thực vật [19]. Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kết và loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa các monome là kiểu liên kết aryl-glyxerol-aryl ete. Ngoài ra còn có các kiểu liên kết phenyl-coumaryl, biphenyl [12]. Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lí bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. [23] 1.4 Các bước biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol Để chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol cần trải qua bốn bước sau: • Tiền xử lý. • Quá trình thuỷ phân (hay còn gọi là đường hoá) • Lên men các loại đường monomer thành ethanol. • Tách và tinh chế sản phẩm. Trong các bước trên, ba bước đầu thuộc về phương pháp sinh học còn bước thứ tư chủ yếu thuộc về phương pháp hoá học sẽ không được đề cập trong báo cáo. 1.4.1 Quá trình tiền xử lý Để chuyển hóa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa. Tuy 14
Đồ án tốt nghiệp nhiên, bản chất của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn công của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hóa glucose có thể diễn ra tốt. Việc tiền xử lý này có thể phá vỡ cấu trúc lignin và cấu trúc tinh thể của cellulase. Những tác động này giúp enzyme có thể xâm nhập vào bên trong cấu trúc của cellulose dễ dàng, do đó yêu cầu enzyme sử dụng sẽ giảm, dẫn tới chi phí cũng sẽ giảm [4]. Các phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose bao gồm : - Vật lý (xay, nghiền và nhiệt phân). - Hóa lý (nổ hơi nước, amoniac, CO2). - Hóa chất (kiềm, axit, ozon,H2O2 và dung môi hữu cơ). - Sinh học. - Điện trường. Mỗi phương pháp tiền xử lý đều có ưu/nhược điểm riêng. Việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý nào phù hợp còn tuỳ thuộc vào thành phần cấu tạo sinh khối lignocellulose cũng như sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình tiền xử lý. Ngoài ra còn kể đến thêm yếu tố chi phí cũng ảnh hưởng đến việc lựa chọn phương pháp phù hợp. ❖ Tiền xử lý bằng phương pháp hoá học Các phương pháp thuộc nhóm này sử dụng tác động của hoá chất trong quá trình. Chúng bao gồm các phương pháp chính như sau:  Tiền xử lý bằng acid: Mục đích chủ yếu của các phương pháp tiền xử lý bằng axit là để hòa tan phần lớn hemicellulose của sinh khối và để làm cho phần cellulose có nhiều khả năng tiếp xúc với enzym hơn. Loại tiền xử lý này có thể được tiến hành với axit đặc hay loãng nhưng việc sử dụng axit đặc trong sản xuất ethanol ít được chú ý hơn do sự tạo thành các chất ức chế. Hơn nữa, vấn đề ăn mòn thiết bị và thu hồi axit là những nhược điểm quan trọng khi sử dụng các phương pháp tiền xử lý bằng axit đặc. Chi phí vận hành và bảo dưỡng cao làm giảm sự quan tâm đến việc áp dụng phương pháp tiền xử lý bằng axit đặc ở quy mô thương mại [13]. Phương pháp tiền xử lý bằng acid loãng dường như là phương pháp được lựa chọn hơn cho các ứng 15
Đồ án tốt nghiệp dụng công nghiệp và đã được nghiên cứu để tiền xử lý nhiều loại sinh khối lignocellulose. Nó có thể được tiến hành ở nhiệt độ cao (ví dụ 180 °C) trong khoảng thời gian ngắn, hay ở nhiệt độ thấp hơn (ví dụ 120 °C) trong khoảng thời gian dài hơn (30 - 90 phút). Nó cho thấy ưu thế về hòa tan hemicellulose, chủ yếu là xylan và còn chuyển đổi hemicellulose thành các đường có khả năng lên men. Tuy nhiên, tùy vào nhiệt độ của quy trình mà một số hợp chất thoái biến đường như furfural và HMF (5-hydroxymethyl furfural ) và các hợp chất vòng thơm thoái biến lignin có thể được phát hiện và ảnh hưởng đến chuyển hóa của vi sinh vật trong bước lên men [21]. Tuy nhiên, phương pháp tiền xử lý này phát sinh ít các sản phẩm phụ hơn so với các phương pháp tiền xử lý bằng acid đặc. *Ưu điểm: Thủy phân hemicellulose thành xylose, thay đổi cấu trúc lignin. *Nhược điểm: Chi phí cao, ăn mòn thiết bị, tạo ra các hợp chất ức chế.  Tiền xử lý bằng bằng kiềm Tiền xử lý kiềm liên quan đến việc ứng dụng các giải pháp kiềm như NaOH, KOH, Ca(OH)2 và NH4OH để loại bỏ lignin và một phần của hemicelluloses, làm tăng hiệu quả khả năng tiếp cận của enzyme cellulase. Phương pháp này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1-2 ngày hoặc ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn. So với axit hoặc các chất phản ứng oxy hóa, xử lý bằng kiềm dường như là phương pháp hiệu quả nhất trong việc phá vỡ liên kết este giữa lignin, hemicellulose và cellulose, và tránh sự phân mảnh của hemicellulose polyme [16]. Trong đó, tiền xử lý bằng NaOH hiện nay được áp dụng rộng rãi. NaOH làm phồng nở cấu trúc cellulose cũng như tăng diện tích tiếp xúc của cellulose, làm giảm độ trùng hợp và độ kết tinh của cellulose, là những yếu tố gây ra sự phá vỡ cấu trúc của lignin. NaOH đã được công bố làm gia tăng khả năng phân giải của gỗ cứng từ 14% lên 55% bằng cách giảm hàm lượng lignin từ 24 – 55% xuống còn 20% [11]. 16
Đồ án tốt nghiệp Mặt khác, tiền xử lý bằng Ca(OH)2 cũng được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi vì giá thành rẻ, không đòi hỏi nhiều về thiết bị và độ an toàn cao, có thể thu hồi dễ dàng từ dịch thuỷ phân bằng phản ứng với CO2 [22]. *Ưu điểm: Hiệu quả cao, cellulose và hemicellulose ít bị hoà tan hơn so với phương pháp tiền xử lý bằng axít, ít hình thành các sản phẩm phụ kiềm hãm hoạt động của vi sinh vật. *Nhược điểm: Tiền xử lý tốt với các loại vật liệu phế thải nông nghiệp tuy nhiên khả năng tiền xử lý kém với các loại gỗ cứng. ❖ Tiền xử lý bằng sinh học Tiền xử lý bằng sinh học dùng vi sinh vật, chủ yếu là các loại nấm như nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm. Chúng là những loại nấm có khả năng phân giải lignin, hemicellulose và một phần rất nhỏ cellulose, là phần có tính trơ nhiều hơn so với những thành phần khác. Sự phân giải của lignin bởi nấm mục trắng, phương pháp có hiệu quả nhất khi tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp sinh học, phát huy tác dụng thông qua sự xúc tác của các enzym phân giải lignin như enzyme peoidase và laccase [11]. *Ưu điểm: Phương pháp này không sử dụng thêm hóa chất nào nên thân thiện môi trường, tiêu tốn ít năng lượng, giảm chi phí đầu tư. *Nhược điểm: Thời gian xử lý kéo dài và hiệu quả thủy phân thấp là hạn chế lớn của phương pháp này. ❖ Tiền xử lý bằng phương pháp vật lý Các phương pháp trong nhóm này không sử dụng hoá chất trong quá trình xử lý. Chúng bao gồm các phương pháp như chia nhỏ vật liệu (xay, nghiền), rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Mục đích của tiền xử lí cơ học là làm giảm kích thước hạt và mức độ kết tinh của lignocellulose nhằm gia tăng bề mặt tiếp xúc và giảm mức độ trùng hợp.Việc phân nhỏ kích thước hạt cần đạt của nguyên liệu (10-30 mm sau khi đập vỡ và 0.2-2 mm sau khi nghiền hoặc xay) [23]. Yêu cầu về năng lượng của phương pháp tiền xử 17
Đồ án tốt nghiệp lí này tương đối cao phụ thuộc vào kích thước hạt cuối cùng và các đặc điểm của sinh khối [24]. Trong bài đồ án này, quá trình tiền xử lý được thực hiện bằng phương pháp xay nát. *Ưu điểm: Giảm kích thước vi sợi cellulose, tăng bề mặt tiếp xúc. *Nhược điểm: Tiêu tốn nhiều năng lượng. 1.4.2 Quá trình thuỷ phân Thủy phân là một quá trình hóa học trong đó một phân tử bị phân cắt khi có mặt của phân tử nước. Một phần của phân tử sau khi cắt sẽ tương tác với cation H+ từ phân tử nước, phần khác sẽ liên kết với anion OH- còn lại.[30] Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thuỷ phân thành các đường 5C và 6C (hexoses và pentoses). Do cellulose là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose nên ta quan tâm đến thành phần này. Phương trình phản ứng: (C5H10O5)n + nH2O nC6H12O6 Quá trình thuỷ phân cellulose có thể được thực hiện bởi enzyme thuỷ phân hay axit thuỷ phân. a) Thuỷ phân bằng acid Cuối thế kỷ 19 và đầu thế kỷ 20, quá trình thuỷ phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ. [31] b) Thuỷ phân bằng enzyme cellulase Enzyme cellulase là loại enzyme được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân cellulose. [20] 18
Đồ án tốt nghiệp Sinh khối lignocellulose - một nguồn nguyên liệu thô, ít giá trị, thành bioethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bước đặc biệt là việc sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu. Sản xuất cellulase quan trọng vì để việc thủy phân cellulose có hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose). Hơn nữa, giá thành của enzyme Cellulase khá cao 0.3 - 0.81 dollar/gam. Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase có giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định cao, chịu được pH và nhiệt độ [7]. 1.4.3 Quá trình lên men a) Bản chất của quá trình lên men Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử. Quá trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học. Trong quá trình lên men, các sản phẩm bao gồm như đường 6C (glucose, mannose, galactose) và đường 5C (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành ethanol. Trong số các sản phẩm của quá trình thuỷ phân, glucose là phong phú nhất, theo sau là đường xylose hoặc mannose và một ít các đường khác [25]. Phương trình tóm tắt lên men rượu được tóm tắt như sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q Trong đó, vi sinh vật tiêu biểu cho lên men glucose thành ethanol là Saccharomyces cerevisiae. S.cerevisiae có ưu điểm như phổ biến, tỷ lệ lên men cao và lượng ethanol tạo thành cao. b) Các phương pháp lên men Bioethanol ❖ Phương pháp truyền thống - đường hoá và lên men riêng lẽ (SHF) Phương pháp này sản xuất bioethanol từ tinh bột và đường, sử dụng enzyme α- amylase và gia nhiệt trong dung môi nước để hồ hóa tinh bột. Sau đó dùng glucoamylase để đường hóa. Tiếp theo sử dụng men để lên men đường thành bioethanol, rồi tiến hành chưng cất để sản xuất bioethanol nồng độ cao. [15] 19
Đồ án tốt nghiệp Phương pháp này đã được ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, khi sử dụng lignocellulose làm nguyên liệu sản xuất bioethanol thì có vài nhược điểm liên quan đến sự phức tạp của thành phần của thành tế bào lignocellulose, đòi hỏi cần có biện pháp tiền xử lý thích hợp. [15] Thuận lợi chính của SHF là cả hai quá trình đường hóa và lên men được thực hiện trong điều kiện tối ưu của mỗi quá trình. Nhược điểm chính của quá trình này là tốc độ đường hóa bị ảnh hưởng mạnh bởi sự ức chế sản phẩm cuối đối với enzyme. ❖ Phương pháp thuỷ phân và lên men đồng thời (SSF) Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời (Simultaneous saccharification and fermentation) hay viết tắt là SSF là quá trình tiến hành đồng thời thuỷ phân và lên men trong cùng một thiết bị phản ứng sinh học. So với quá trình thuỷ phân và lên men riêng biệt, quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời có những ưu điểm sau: • Glucose tạo thành trong quá trình thủy phân được tiêu thụ ngay lập tức bởi nấm men vì vậy lượng cellobiose và glucose tích tụ trong hệ thống là rất ít. Điều này sẽ giải quyết vấn đề ức chế enzyme nhờ đó tốc độ tạo glucose sẽ được tăng đáng kể, lượng enzyme cần dùng cũng nhỏ đi [4]. • Số thiết bị cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cũng ít hơn số cần cho phương pháp truyền thống vì cả quá trình thủy phân và lên men được tiến hành trong cùng một thiết bị. Điều này giúp giảm vốn đầu tư [4]. • Việc ethanol tạo thành trong suốt quá trình sẽ làm giảm khả năng phát triển của vi sinh vật cũng như tạp chất, rất có lợi cho các quy trình liên tục [4]. Chính vì những ưu điểm trên mà quá trình thủy phân và lên men đồng thời được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới với các nguồn nguyên liệu khác nhau. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình là 37-380C, nhiệt độ này là sự kết hợp của nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thủy phân (45-500C) và nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của nấm men (300C) [4]. 20
Đồ án tốt nghiệp  Phương pháp đồng đường hóa và đồng lên men (SSCF) Quá trình đường hóa và lên men đồng thời hexoses và pentoses bởi nhiều giống vi sinh vật khác nhau. Phương pháp này có nhiều đặc điểm giống SSF [7]. Ngoài ra, chúng ta còn có các phương pháp như phương pháp chuyển hoá trực tiếp, khí hoá và lên men, lên men, ester hóa và hydro hóa. Trong bài đồ án này, thí nghiệm dùng phương pháp thuỷ phân và lên men đồng thời nguyên liệu lục bình để sản xuất ra bioethanol. 1.5 Vi sinh vật sử dụng cho quá trình lên men rượu Trong lên men rượu, vi sinh vật thường được sử dụng là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Đặc điểm về cấu tạo của nấm men Saccharomyces cerevisiae • Giới : Fungi • Ngành : Ascomycota • Phân ngành : Saccharomycotina • Lớp : Saccharomycetes • Bộ : Saccharomycetables • Họ : Saccharomycetaceae • Chi : Saccharomyces • Loài : Saccharomyces cerevisiae Hình 1. 4 Nấm men Saccharomyces cerevisiae quan sát dưới kính hiển vi. 21
Đồ án tốt nghiệp Saccharomyces có khoảng 40 loài và các loài trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu Chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa Nấm men cấu tạo gồm vỏ tế bào thành phần là carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào chất, tế bào chất và nhân. S. cerevisiae thường có cấu tạo hình elip, đường kính lớn từ 5-10nm và đường kính nhỏ từ 1-7nm, tế bào gia tăng kích thước theo độ tuổi. Thể tích tế bào đơn bội là 29 mm3 và tế bào lưỡng bội là 55 mm3. Các tế bào của nấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao, được sử dụng như là một mô hình hữu ích đại diện cho các tế bào eukarylote [26]. Bảng 1. 1 Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men được lạnh đông khô [27] Thành phần trong cấu trúc Phần trăm khối lương khô Độ ẩm 2-5% Protein 42-46% Carbohydrate 30-37% Acid nucleic 6-8% Lipid 4-5% Chất khoáng 7-8% Quá trình sinh sản của nấm men thường thông qua sinh sản vô tính, phân chia tế bào bất đối xứng (nảy chồi) tế bào con được hình thành giống hệt tế bào mẹ. dưới điều kiện thích hợp tế bào con sẽ phát triển khỏe mạnh như tế bào mẹ. Quá trình này kéo dài đến khi các tế bào bị lão hóa và chất dinh dưỡng bị cạn kiệt, sau đó tế bào chết. Chu trình sinh trưởng của nấm men được nghiên cứu đóng một vai trò quan trọng trong công nghiệp cũng như là đại diện cho tế bào eukaryote. 22
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 5 Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Ứng dụng : Saccharomyces cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn. Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất đuợc sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. 1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men a) Nhiệt độ Mỗi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-32oC. Ở nhiệt độ cao hơn, hoạt tính nấm men giảm. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyde gây ảnh hưởng đến chất lượng cồn thu được và tổn thất bioethanol theo CO2 sẽ tăng. [6] b) pH Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men, chúng có khả năng làm thay đổi diện tích vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này chỉ phụ thuộc vào pH của canh trường. Trong điều kiện lên men bioethanol pH tối ưu cho hoạt động lên men là 4.5-5. Nếu pH thấp nấm men còn hoạt động được và vi 23
Đồ án tốt nghiệp khuẩn bị ức chế. pH cao hơn sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, dễ bị nhiễm khuẩn và tạo ra nhiều sản phẩm phụ hơn dẫn đến hiệu suất lên men thấp. [6] c) Nồng độ dịch lên men Nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lí của nấm men. Kết quả là đường nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất và làm tăng thời gian lên men. Nhưng ngược lại nếu nồng độ đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men [6] d) Nồng độ CO2 trong môi trường CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường, một phần tách lên trên bề mặt môi trường, phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường. CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi. Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí, có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào [6]. e) Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng [3]. f) Vi sinh vật tạp nhiễm Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà còn cho các vi sinh vật khác. Trong nước, trong không khí cũng như trong các nguyên liệu tham gia vào thành phần môi trường luôn chứa một lượng vi sinh vật có hại cho lên men rượu [6]. 24
Đồ án tốt nghiệp Sự xuất hiện của các vi sinh vật sinh acid như các vi khuẩn lactic, các vi khuẩn acetic và đặc biệt là các vi khuẩn butyric thường có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men một cách rõ rệt. • Vi khuẩn lactic: thường là loại vi khuẩn lactic dị hình, chúng sử dụng đường và tạo ra acid lactic. Ngoài ra còn tạo ra một lượng đáng kể các chất khác như ethanol, acid acetic, cacbonic, diacetyl và acetone. Các sản phẩm được tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, độ yếm khí cùng làm cho sản phẩm tạo thành không ổn định. [6] • Vi khuẩn acetic: trong môi trường có nồng độ ethanol thấp chúng phát triển rất tốt và oxy hóa ethanol thành acid acetic. Trong môi trường không có ethanol chúng sẽ oxy hóa đường thành acidgluconic. [6] • Vi khuẩn butyric và các vi sinh vật khác: các vi khuẩn này chỉ phát triển trong dịch chưa lên men. Nhưng trong điều kiện lên men các vi khuẩn này không thể phát triển vì pH tối thích của chúng đều nằm trong môi trường kiềm yếu hay trung tính. [6] Như vậy nhiễm khuẩn trong điều kiện lên men rượu chủ yếu là vi khuẩn lactic. 25
Đồ án tốt nghiệp 1.6 Lục bình 1.6.1 Phân loại khoa học Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (Class): Liliopsida Bộ (ordo): Liliales Họ (familia): Pontederiaceae Chi (genus): Eichhornia Loài (species): E. crassipes 1.6.2 Nguồn gốc Hình 1. 6 Lục Bình 26
Đồ án tốt nghiệp Lục Bình có tên khoa học là Eichhornia crassipes , chúng có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Nam Mỹ nó đã du nhập vào nhiều vùng ôn đới trên thế giới như Trung Mỹ, Bắc Mỹ (califonia, các bang miền Bắc nước Mỹ), Châu Phi, Ấn Độ, Châu Á, Úc, New Zealand. Ở Việt Nam, Lục Bình xâm nhập vào nước ta từ năm 1905 và nhanh chóng lan ra khắp các chỗ có từ tù hãm hoặc nơi nước ngọt chảy chậm như ao, hồ, giếng, mương, ven sông [1] 1.6.3 Nơi sống Lục Bình phát triển nhanh chóng ở những chổ ngập nước như: hồ, suối, sông, mương và các vùng nước tù đọng. Lục bình hấp thu dưỡng chất trực tiếp từ nước và thường được sử dụng làm công cụ xử lý nước thải. Chúng thích hợp và phát triển mạnh mẽ trong nguồn nước giàu dưỡng chất. Lục bình có thể chịu được các thái cực khác nhau về biến động của nguồn dinh dưỡng, độ pH, nhiệt độ và thậm chí có thể phát triển trong nước độc hại, chúng phát triển tốt nhất trong điều kiện nước đọng hoặc di chuyển chậm [44]. 1.6.4 Thành phần hoá học Bảng 1. 2 Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của lục bình [1]. Nước 92.6 Protid 2.9 Glucid 0.9 Xơ 22 Thành phần hoá học (%) Tro 1.4 Calcium 40.8 mg/% Phosphor 0.8 mg/% Caroten 0.66 mg/% Vitamin C 20 mg/% 27
Đồ án tốt nghiệp 1.6.5 Đặc điểm sinh trưởng Lá đơn, lá mọc thành hoa nhị, cuống xốp phồng lên thành phao nổi khi còn non, trưởng thành cuống thon dài. Hoa lưỡng tính không đều, màu xanh tím nhạt, cánh hoa có một đốm vàng. Cây thân cỏ sống lâu năm, nổi trên mặt nước hay bám dưới bùn, rễ dài và rậm. Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường có nhiều hay ít chất màu, sinh sản bằng con đường vô tính. Từ các nách lá, đâm ra những thân bò dài và mỗi đỉnh thân bò cho một cây mới, sớm tách khỏi cây mẹ để trở thành một cá thể độc lập [45]. 1.6.6 Hình thức sinh sản Lục bình sinh sản bằng con đường vô tính, từ các nách lá đâm ra những thân bò, cho ra những cây mới và sớm tách ra cây mẹ để trở thành cá thể độc lập [5]. 1.6.7 Thực trạng sử dụng lục bình ở Việt Nam Từ lâu, lục bình được xem như là nguồn thực phẩm cho người nông dân sử dụng để nuôi các loại gia cầm như heo, gà, trâu, bò hay được sử dụng như một vị thuốc trong dân gian với tác dụng giải độc tiêu sưng, thanh nhiệt.Ngoài ra, lục bình được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực: o Làm sạch nguồn nước và phân huỷ các chất độc gây hại: Lục bình làm sạch nguồn nước, làm giảm bớt ô nhiễm môi trường. Chỉ cần 1/3 ha bèo, mỗi ngày đủ để lọc 2225 tấn nước bị ô nhiễm các chất thải sinh học và các hoá chất [8]. Bèo tây còn loại được các kim loại nặng độc như thuỷ ngân, chì, kền, bạc, vàng [5]. o Sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ: Những thân cây lục bình được phơi khô, sợi dai, mềm mại tạo ra những sản phẩm vừa có độ bền lại vừa êm ái. Sau khi được gia công, lục bình đã tạo ra hàng loạt những mặt hàng phong phú. Từ những chiếc giỏ xách, thùng đựng đồ, đến những sản phẩm nội thất tinh xảo như thảm treo tường, giá gương, bàn ghế, được xuất khẩu sang các nước Châu Âu [5]. 28
Đồ án tốt nghiệp o Tiềm năng ứng dụng sản xuất bioethanol từ lục bình: Trong vài năm trở lại đây, trong những cuộc nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã cho biết lục bình là một nguồn nguyên liệu có khả năng sản xuất ra bioethanol [5]. Bảng 1. 3 Thành phần sơ xợi lục bình từ nhiều nguồn khác nhau [18] Cellulose Hemicellulose lignin 1 18 33,39 26,36 2 17,8 43,4 7,8 3 35 18,3 1,9 4 18,4 49,2 3,55 5 34,19 17,66 12,22 6 32 34 10 Thành phần cellulose và hemicellulose của lục bình được báo cáo bởi các nhà nghiên cứu khác dao động trong khoảng 17,8-34,19% và 17,66-49,2%, còn hàm lượng ligin dao động trong khoảng từ 1,9-26,36%. Điều này cho thấy rằng các thành phần của lục bình thay đổi theo vị trí của môi trường sống [18]. Tuy nhiên, với thành phần chính là cellulose cao, lục bình có thể là một nguồn đường tuyệt vời có thể lên men sản xuất ra cồn [17]. Một số sinh viên công nghệ sinh học ở Surat, Gujarat tại Ấn độ đang nghiên cứu lục bình làm nguyên liệu để sản xuất ethanol [39]. Mặt khác tại Ấn độ, họ làm một tấn lục bình phơi khô (không phải chất khô) cho khoảng 50 lít ethanol và 200 kg chất phế thải dùng làm phân bón [39]. Ngoài ra, những nghiên cứu mới đây của TS. Trịnh Thị Long và cộng sự (2013), lục bình ngoài có tiềm năng sản xuất ra ethanol, chúng còn có tiềm năng sinh khí mêtan. Kết quả nghiên cứu cho thấy cứ một tấn bèo lục bình tươi sẽ cho 3 khoảng 61 kg VS, khi phân hủy kỵ khí sẽ cho khoảng 12m khí CH4 tương ứng với 12 kg dầu, bằng 8,6 kg khí gas hay năng lượng tương đương bằng 120KW hoặc có thể sản xuất được 42 KW điện thương mại [9]. Tóm lại, do thành phần chủ yếu của 29
Đồ án tốt nghiệp lục bình là cellulose nên các nhà khoa học đánh giá đây là một nguồn sinh khối đầy triển vọng cho việc sản xuất ra bioethanol trong tương lai. 30
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ tháng 3/2015 – 6/2015. 2.1.2 Địa điểm Phòng thí nghiệm Năng lượng Sinh học - trường ĐH Bách Khoa TPHCM. 2.2 Nguyên liệu và hoá chất 2.2.1 Nguyên liệu Các nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu là lục bình được thu gom từ các kênh rạch, sông hồ, rửa sạch bỏ rễ, cắt nhỏ và được đem đi xay nát để tiến hành lên men tạo bioethanol. Hình 2. 1 Lục bình Hình 2. 2 Cắt, bỏ rễ, rửa lục bình 31
Đồ án tốt nghiệp a) Enzyme cellulase: Enzyme được sử dụng là Acermomium Cellulase được cung cấp bởi Meiji Seika Co. (Nhật Bản). − Nhiệt độ hoạt động tối ưu : 500C . − pH hoạt động tối ưu : 4,8 . Hình 2. 3 Enzyme Cellulase b) Nấm men Saccharomyces cerevisiae : • Chủng nấm men Ethanol RedTM (Dry yeast, S. serevisiae, Ementics, Pháp). • Nồng độ men để lên men 12 - 15 triệu tế bào/ml. • Nấm men cần được kích hoạt trước khi sử dụng. c) Corn steep liquor (CSL) Đây là chế phẩm được sản xuất từ ngô, có màu vàng tươi, mùi thơm đặc trưng và có tính acid. Là một loại thực phẩm giàu năng lượng, cung cấp protein và khoáng chất cho sinh vật. Thành phần gồm chất béo, chất xơ, silica và acid lactic từ 20 - 25 %. Sản phẩm được nhập khẩu từ Nhật Bản và cần được bảo quản nơi khô ráo, tránh hút ẩm. 32
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 4 Bột ngô (CSL) 2.2.2 Hoá chất Bảng 2. 1 Hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm. Thí nghiệm Hoá Chất Mục Đích Acid H2SO4 98%, d=1,825 g/ml. Thủy phân các hydrolysis thành các dạng dơn giản hơn. CaCO3. Trung hoà. Phân tích sơ sợi Nước qua cột trao đổi ion. D - cellulose, D (+) glucose, D (+) Dựng đường chuẩn. xyclose. Acid H2SO4 98%,d=1,825 g/ml. Dung môi pha động. HPLC Nước qua cột trao đổi ion. Dung môi pha động. 33
Đồ án tốt nghiệp 2.3 Thiết bị và dụng cụ 2.3.1 Dụng cụ - Becher: 500mL, 250mL, 100mL - Erlen: 250mL, 100mL. - Bình lên men 1000mL - Pipet vạch: 25mL, 10mL, 5mL, 1mL - Ống đong: 250mL, 25mL, 1000mL - Ống tiêm và màng lọc sinh học 0,2 µm. - Phiễu nhựa - Cuvet - Đũa thuỷ tinh. - Giá đỡ ống nghiệm - Eppendorf 2.3.2 Thiết bị - Tủ sấy - Tủ ấm - Máy hấp - Cân kỹ thuật 4 số - Máy quang phổ UV- VIS - Máy quang phổ kế - Máy ly tâm - Máy HPLC - Cân đo độ ẩm - Máy đánh siêu âm - Buồng cấy vi sinh - Máy xay 34
Đồ án tốt nghiệp ❖ Thiết bị phân tích HPLC: Đặt tại trung tâm nghiên cứu năng lượng sinh học. Thiết bị gồm các bộ phận :  Đầu dò RID – 10A.  Bơm cao áp LC – 20AD.  Bộ phận tách khí DGU – 20 A3.  Bộ phận lò cột CTO – 20A. Cột sử dụng phân tích là SUGAR SH101, H312039. Thành phần chính của cột là copolymer của styrene divinylbenzene. Kích thước cột: 8mmID × 300mml Pha động có thể sử dụng là nước, acetonitril, ethanol ở dạng đơn chất hoặc là hỗn hợp. Pha động thường hay được sử dụng là H2SO4 0,005N Bộ xử lý và máy in C – R8A Nguyên lý: Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử lần lượt sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tuỳ thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (cùng thuộc một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao. Cột sử dụng là SH101, cột này có thể đo đường, acid hữu cơ, fufural và các dẫn xuất, các aldehyde và rượu. 35
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 5 Thiết bị phân tích HPLC Glucose, ethanol và xylose được xác định nồng độ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha động là dung dịch H2SO4 0,005N. Đo dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn glucose, ethanol và xylose để khảo sát quan hệ chất – thời gian lưu, nồng độ - diện tích peak. Thời gian lưu của các chất: các chất chuẩn được pha chính xác theo nồng độ định trước, đo bằng máy sắc khí hiệu năng cao HPLC để xác định thời gian lưu. Xác định các chất có trong dung dịch mẫu : Căn cứ vào thời gian lưu của từng chất và so sánh với chất chuẩn, có thể kết luận về thành phần, nồng độ các chất có trong dung dịch mẫu. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi Nguyên tắc : Đây là một phương pháp đơn giản để xác định hàm lượng các chất trong lục bình. Phương pháp này sử dụng acid để thủy phân các hydrolysis thành các dạng đơn giản để phân tích, gồm 2 bước : 0 - Bước 1 : sử dụng acid H2SO4 72% hấp nguyên liệu ở 30 C trong 60 phút. 0 - Bước 2 : sử dụng acid H2SO4 4% hấp nguyên liệu ở 121 C trong 60 phút. Nguyên liệu được chia ra 2 phần : - Phần 1 : hòa tan bởi acid. Được đo bới máy HPLC - Phần 2 : không hòa tan bởi acid (tro, chất trích ly, protêin ) có thể xác định được. Hóa chất và dụng cụ sử dụng :  Hóa chất : - Acid (sử dụng 100 ml H2SO4 98% d=1,825g/ml) hòa tan trong 65,9 ml nước qua cột lọc trao đổi ion, tạo thành dung dịch acid H2SO4 72% - CaCO3 - Nước đã qua cột trao đổi ion . - Các chất làm đường chuẩn có độ tinh khiết cao D (+) glucose, D (+) xyclose  Dụng cụ : - Bình có nắp 100ml (3 bình ) - Cốc thủy tinh hình nón 100ml (3 bình) - Pipet các loại - Ống tiêm và màng lọc 0,2 m. Cách tiến hành :  Chuẩn bị mẫu để tiến hành thủy phân : - Cân 300 10 mg cho vào bình có nắp 100ml (3 bình) 37
Đồ án tốt nghiệp - Cho 3 0,01 ml acid H2SO4 72% vào bình và khuấy trộn hoàn toàn. - Đặt bình vào thiết bị điều nhiệt nước ở 300C trong 60 5 phút, luôn được khuấy bởi cá từ. - Lấy 1 bình ra và pha loãng nồng độ acid đến 4% bằng cách cho thêm 84 0,04 ml nước qua thiết bị trao đổi ion, trộn đều để loại bỏ các lớp nồng độ acid trong bình. - Thiết lập đường chuẩn của glucose và xyclose 5000, 3000, 1000 mg/l - Đặt các bình vào nồi hấp 1210C, sau đó chuẩn bị lấy mẫu.  Phân tích mẫu chứa lignin không hòa tan acid : • Cho mẫu vào lò nung ở 6000C trong 4 giờ. • Lấy ra để nguội trong 2 giờ. • Cho vào bình hút ẩm. • Lấy 50 ml mẫu dùng để đo lignin hòa tan bởi acid. • Pha loãng mẫu từ 5 – 10 lần với H2SO4 4%. • Đo mẫu trên máy UV-Vis với bước sóng 240nm.  Phân tích mẫu chứa cacbohydrate - Cho 0,84 g CaCO3 vào 20ml mẫu, lọc qua giấy lọc. - Lọc lại qua màng lọc sinh học 0,2 m. - Đem phân tích bằng HPCL.  Tro được xác định bằng cách xác định khối lượng còn lại sau lọc. 38
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 6 Thiết bị quang phổ UV - VIS Hình 2. 7 Thiết bị lọc chân không Tính toán : AIR = msau lọc – mđầu AIR% = AIR/(mđầu – mẩm) (giả sử mẩm chiếm 3% khối lượng đầu) Ash = msau nung – mđầu Ash% = Ash/(mđầu – mẩm) AIL = msau lọc – msau nung AIL% = AIL/(mđầu – mẩm) ASL% = UVabs × volumefiltrate × Dilution × 100 / (×/(mđầu – mẩm)) Với: UVasb = trung bình mẫu đo tại 240nm volumefiltrate = volume of filtrate (thể tích lọc) Dilution = Dilution factor (độ pha loãng 5 -10 lần)  = 25 (240 nm) Xylose : được phân tích bởi máy HPLC Xyclose % = Cxyclose xVxyclose /(mđầu – mẩm) 39
Đồ án tốt nghiệp Glucose : được phân tích bởi máy HPLC Glucose % = Cglucose xVglucose /(mđầu – mẩm) Kết luận : - Phần trăm glucose chính là phần trăm của cellulose . - Phần trăm xyclose chính là phần trăm của hemicelluloses . - Phần trăm ASL và AIL là phần trăm của lignin, (chất trích ly protein chiếm thành phần không đáng kể). - Phần trăm Ash là phần trăm của tro. 2.4.2 Phương pháp đo nồng độ glucose, xylose và ethanol bằng sắc ký lỏng hiệu cao năng (HPLC) Nguyên lý : Glucose và ethanol được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha động là acid sulfuric 0,005N. Mẫu và chuẩn được chạy ở chế độ : + Nhiệt độ cột : 500C. + Tốc độ pha động: 1ml/phút. Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao. Chuẩn bị :  Chuẩn bị pha động (mobile phase) - Hóa chất gồm acid H2SO4 98 % tinh khiết 267μl - Nước cất 1000 ml. - Lọc nước cất bằng màng lọc cellulose acetate, kích thước lỗ là 20μm. 40
Đồ án tốt nghiệp - Cho 1000ml nước cất đã được lọc vào bình chứa, cho 267 μl H2SO4 98 % vào và khuấy kĩ. - Lọc dung dịch qua màng lọc sinh học, kích thước lỗ 0,2 μm. - Cho vào tủ điều nhiệt để nâng nhiệt độ của dung dịch lên 350C (15 phút). - Cho vào máy siêu âm (để loại bỏ khí trong pha động), hút chân không bình chứa pha động. Thực hiện quá trình này trong 45 – 60 phút đến khi không còn thấy bọt khí trong bình. Hình 2. 8 Thiết bị đánh siêu âm  Chuẩn bị mẫu - Mẫu chuẩn (glucose, ethanol, xyclose), pha theo nồng độ phần trăm xác định. - Mẫu đo (lọc qua màng lọc 0,2 μm)  Khởi động máy : - Kiểm tra lại thể tích pha động trong bình. - Đặt bình chứa pha động vào vị trí, nhúng đầu hút vào bình. 41
Đồ án tốt nghiệp - Bật các công tắc nguồn của đầu dò RID, lò, bơm, máy in. - Đổi hết dung môi cũ còn trong ống, thay bằng dung môi mới. Bằng cách mở van tháo (drain valve) của bơm và nhấn nút purge. Lặp lại bước này 2 – 3 lần. - Đóng van tháo lại. - Đặt tốc độ pha động ở 0,2 ml/phút và bấm nút pump để bắt đầu bơm. - Đặt nhiệt độ cột ở 500C, nhấn nút oven để lò bắt đầu nâng nhiệt độ cột. - Nâng dần tốc độ pha động từ 0,2 → 0,5 → 1,0 ml/phút. - Sau khi đạt đến các thông số mong muốn (nhiệt độ cột là 500C, tốc độ pha động là 1ml/phút) thay đổi đường biểu diễn của đầu dò RI từ “mẫu” (sample) sang dạng đường nền (reference). - Giữ đường biểu diễn ở dạng đường nền trong hơn 30 phút. - Đổi đường đường biểu diễn từ đường nền về lại dạng đường biểu diễn mẫu. - Nếu giá trị balance trên máy không nằm trong khoảng ± 50, nhấn nút balance để cân bằng lại cho đầu dò RI. - Nhấn zero để đưa đường nền về 0 và có thể đo mẫu. 2.4.3 Phương pháp đo độ ẩm nguyên liệu - Lấy mẫu lục bình - Cho mẫu lục bình vào đĩa. - Cho máy chạy, sau 20 phút cho đến khi số hiển thị không thay đổi, đọc độ ẩm mẫu đạt được (%). 42
Đồ án tốt nghiệp Hình 2. 9 Máy đo độ ẩm Nguyên lý : Sử dụng bức xạ nhiệt, sấy khô mẫu đến khối lượng không đổi. % ẩm = m1−m2 × 100 m1 Với m1 : khối lượng mẫu ban đầu, m2 : khối lượng mẫu sau sấy. 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy men và xác định chỉ số OD ❖ Kích hoạt nấm men Saccharomyces cerevisiae (pre-cultivation) Nguyên liệu: - Đường - CSL - Nước lọc trao đổi ion - Chủng nấm men Ethanol RedTM (Dry yeast, S. serevisiae, Ementics, France.) Dụng cụ và thiết bị - Erlen 1000 ml - Giấy bạc 43
Đồ án tốt nghiệp - Cân điện tử - Máy hấp - Tủ cấy vi sinh - Tủ lắc - Máy phân tích quang phổ. ❖ Tiến hành kích hoạt nấm men - Rửa sạch và lau khô erlen 1000ml. - Cân 8,5 g đường và 2,5 g CSL cho vào erlen, sau đó cho thêm 450 ml nước lọc, dùng giấy bạc bọc kín erlen lại. - Cho erlen vào máy hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. Qúa trình này để loi bỏ vi sinh vật lạ và nấm men cạnh tranh với nấm men Yeast. - Sau khi hấp xong, để nguội đến 40oC, lấy erlen ra khỏi tủ hấp. Cân 0,1 g nấm men Yeast cho vào erlen, sau đó cho erlen vào tủ lắc, lắc ở 35oC trong 120 vòng/phút trong 16 - 24h. Qúa trình này là quá trình hiếu khí. Sau đó lấy ra khỏi tủ lắc và đặt vào tủ cấy vi sinh. Hình 2. 10 Dịch kích hoạt men giống 44
Đồ án tốt nghiệp ❖ Kiểm tra mật độ vi sinh. (Đo OD) Kiểm tra OD bằng máy quang phổ kế ở bước sóng là 600 nm. − Mục đích đo OD là để xác định mật độ con Yeast có trong dịch kích hoạt (dịch pre-cul), qua đó xác định thể tích lượng dung dịch kích hoạt cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời. − Pha loãng dịch pre-cul 20 lần bằng cách: dùng pipet hút 1 ml dịch Pre-cul 1 ml cho vào ống nghiệm nhựa, sau đó thêm 19 ml nước lọc vào và lắc đều. − Khởi động máy quang phổ kế, cài đặt bước sóng đo là 600 nm và bấm tổ hợp phím “shift+Abs” để chạy máy. Tráng sạch cuvet rồi cho nước cất vào cuvet, trừ nền bằng cách đặt cuvet vào máy quang phổ, bấm zero. − Tráng cuvet bằng dịch pre-cul, rót đầy cuvet rồi cho vào máy quang phổ kế, bấm “Read” để đo OD. Kết quả OD = 0,3÷0,5 là hợp lý. Hình 2. 11 Dịch nấm men sau ly tâm Hình 2. 12 Máy quang phổ kế − Thể tích dịch pre-cul dùng để lên men được tính theo công thức V(lên men) . 0.5 V(cấy) = (ml) OD . X Trong đó: V(lên men) là thể tích nước dùng cho thủy phân và lên men đồng thời. OD là mật độ nấm men đo được bằng máy đo quang phổ kế. X là số lần pha loãng dịch kích hoạt (pre-cul). (X = 20 lần) 45
Đồ án tốt nghiệp Dùng pipet hút V ml dịch pre-cul cho vào ống nhựa và ly tâm. Quá trình này để loại bỏ dịch đường, dinh dưỡng và nước trong dịch pre-cul. Sau khi ly tâm, ta loại bỏ nước để thu được lượng nấm men cần dùng. 2.5 Bố trí thí nghiệm 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 2,5% CSL, 8,5% Lục bình tươi đường,nước lọc Tiệt trùng Cắt nhỏ, bỏ rễ, rửa o 121 C,20 phút. sạch. Tiệt trùng Phân tích thành 121oC,20 phút. phần sơ xợi Cho 0,1% nấm Xay nát men giống, lắc đều nhiệt 120 vòng, 35oC, 24 giờ Thuỷ phân và lên • Enzyme: 2% men đồng thời • pH: 4,8 Ly tâm 3000 vòng/ (SSF) • ToC: 35oC 5 phút • Lắc 120v/p Lấy mẫu chạy HPLC Hình 2. 13 Sơ đồ thí nghiệm 46
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2 Bố trí thí nghiệm ❖ Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời Nội dung : Khảo sát thời gian lên men. Mục đích quá trình xem thời điểm nào là thời gian lên men tốt nhất của nguyên liệu lục bình. Nồng độ các chất được đo sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 130h,150h,180h. Đo nồng độ glucose, ethanol vẽ đồ thị nồng độ theo thời gian, hiệu suất quá trình theo thời gian từ đó làm cơ sở để nhận xét thời gian lên men nào là tốt nhất. Cố định ban đầu các yếu tố sau: • Nhiệt độ: 35oC • Enzyme: 2%. • pH: 4.8. Tiến hành thí nghiệm: ❖ Rửa sạch bằng nước cất và lau khô các dụng cụ thí nghiệm. ❖ Kiểm tra độ ẩm của lục bình: khởi động máy đo độ ẩm, đặt rơm lên khay chứa mẫu của máy đo sao cho lượng rơm khoảng 0,5 ÷ 0,7 g là hợp lý. Bấm nút “start” để máy tiến hành đo. Độ ẩm của rơm sẽ hiển thị khi máy đo xong. (chú ý không dịch chuyển máy khi đo). Hình 2. 14 Dụng cụ thuỷ phân và lên men đồng thời 47
Đồ án tốt nghiệp Sau khi đo độ ẩm theo mục 2.4.3, ta tiến hành tính toán lượng lục bình và các nguyên liệu cần thiết cho 1 lần lên men. Tổng lượng cơ chất cho vào erlen là 125 g gồm lục bình, dinh dưỡng, lượng nấm men, enzyme, nước (d=1g/ml) được cho theo như trong bảng sau: Bảng 2. 2 Thành phần các chất trong bình phản ứng % khối 3% khối % khối lượng lượng CSL/ lượng Lục bình Bình men/khối khối lượng Enzyme/ Nước (ml) khô (g) lượng lục lục bình khối lượng bình khô. khô lục bình khô 1 5 2 5 2,5 3 2 88 3 5 Thí nghiệm bổ sung: Khảo sát quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời khi dùng lượng enzyme khác. Ta tiến hành khảo sát % khối lượng Enzyme/ khối lượng lục bình khô lần lượt là 1,5 %, 2,5%, 3%. Đo nồng độ glucose, ethanol vẽ đồ thị nồng độ theo thời gian, hiệu suất quá trình theo thời gian từ đó làm cơ sở để nhận xét ảnh hưởng của enzyme đến quá trình. Cố định ban đầu các yếu tố sau: • Nhiệt độ: 35oC • pH: 4.8. 48
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thành phần lục bình ban đầu ❖ Phương pháp phân tích trình bày ở mục 2.4.1 Lục Bình LIGIN CELLULOSE HEMICELLULOSE Tro Thành phần khác 13% 36% 39% 8% 4% Hình 3. 1 Thành phần sơ xợi của lục bình. Từ biểu đồ phân tích thành phần sơ sợi thì thành phần cellulose của lục bình chiếm 40,47 %, thành phần khác chiếm 36 %, lignin chiếm 13 % tro chiếm 8 %, hemicellulose chiếm 4 %. Trong đó, thành phần hemicellulose chiếm thấp (4 %) so với những nghiên cứu của các nhà khoa học khác. Có thể giải thích ở những nguyên nhân như sau: • Mẫu lục bình được lấy từ những môi trường sống khác nhau, ở những vị trí địa lý khác nhau nên thành phần hoá học của lục bình cũng khác nhau. • Mẫu lục bình khi lấy có thân, lá không đồng đều về kích thước (to, nhỏ), về hình dáng (dày, mỏng), về độ tươi (xanh, hơi héo). 49
Đồ án tốt nghiệp Mặc dù kết quả cho thấy hàm lượng hemicellulose thấp. Tuy nhiên, thành phần chính là cellulose lại đạt yêu cầu. 3.2 Qúa trình thuỷ phân và lên men đồng thời 3.2.1 Kết quả thời gian lên men 0,5 0,4 (1) (2) 0,3 0,2 Concentration (wt %) (wt Concentration 0,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (Hour) Hình 3. 2 Nồng độ ethanol và glucose theo thời gian lên men khi sử dụng enzyme với liều lượng là 2 % khối lượng so với khối lượng lục bình khô : (1) Ethanol; (2) Glucose. Ở thời gian đầu, sau khi tiền xử lý nguyên liệu bằng xay nát, cấu trúc xơ xợi của lục bình bị thay đổi tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho quá trình thuỷ phân hoạt động tốt. Khả năng khuếch tán của enzyme cellulase vào cấu trúc xơ xợi dễ dàng, lượng cellulose bị enzyme tấn công tăng lên nên lượng glucose cũng tăng lên trong dung dịch. Lượng glucose đạt được tối đa trong 1 – 2 ngày đầu. Trong khi đó, 50
Đồ án tốt nghiệp ethanol thời gian đầu nồng độ thấp do nấm men đang trong giai đoạn thích nghi với môi trường, lượng glucose chưa bị tiêu thụ mạnh. Từ 24 giờ trở đi, phản ứng lên men bắt đầu, nấm men bắt đầu chuyển hoá lượng glucose từ đó lượng ethanol bắt đầu sinh ra và tăng lên theo thời gian. Lượng ethanol tăng mạnh từ khoảng 96 giờ đến 130 giờ rồi sau đó đạt trạng thái cân bằng từ 150 – 180 giờ. 3.2.2 Hiệu suất lên men theo thời gian 50 40 30 20 Efficiency (%) Efficiency 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (Hour) Hình 3. 3 Hiệu suất lên men ethanol theo thời gian Trong thời gian đầu, do nấm men chưa thích nghi với môi trường nên phản ứng lên men chưa hoạt động tốt. Lượng ethanol hầu như chưa được tạo ra trong thời gian đầu. Trong khi đó, quá trình thuỷ phân hoạt động hiệu quả cho lượng glucose cao. Sau đó, trong 24 giờ tiếp theo, khi nấm men đã thích nghi được với môi trường, phản ứng lên men tạo ethanol diễn ra nhanh do đó hiệu suất quá trình cũng 51
Đồ án tốt nghiệp tăng. Trong hình 3. 3, hiệu suất tăng mạnh từ 96 giờ - 130 giờ sau đó tiếp tục tăng và đạt trạng thái cân bằng ở 150 – 180 giờ. Hiệu suất cuối của quá trình chỉ đạt 45,76 %, không phù hợp với yêu cầu được đặt ra là hiệu suất phải lớn (trên 70 %). Để lý giải, bã sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời được đem đi phân tích thành phần xơ sợi được trình bày ở mục 2.4.1. Sau khi phân tích, bã sau khi thuỷ phân và lên men có hàm lượng cellulose chiếm 23,20 %. Điều này giải thích cho việc hiệu suất chuyển hoá không cao vì còn lượng cellulose chưa bị chuyển hoá hết. Ngoài ra, có thể do sai số trong cách đo, trong cách lấy mẫu và bảo quản mẫu làm hao hụt nồng độ ethanol. Bên cạnh đó, nồng độ ethanol có thể bị giảm đi do bị chuyển hoá thành acid bởi sự hiện diện của những vi sinh vật lạ trong môi trường, dẫn đến hiệu suất quá trình không cao. Tóm lại, trong quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời việc giải bài toán liên quan giữa hiệu suất quá trình và nồng độ ethanol cần đạt được không hề đơn giản. Chúng ta muốn nồng độ ethanol nhiều, hiệu suất cao là điều rất khó, do đó để thõa mãn các điều kiện trên ta phải dựa vào các yếu tố sau : - Lượng lục bình. - Lượng enzyme. - Thời gian tiến hành. 52
Đồ án tốt nghiệp 3.3 Thành phần bã lục bình sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời ❖ Phương pháp phân tích trình bày ở mục 2.4.1 Lục Bình Lignin Cellulose Hemicellulose Tro Thành phần khác 16% 47% 23% 12% 2% Hình 3. 4 Thành phần bã lục bình sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời. Hàm lượng cellulose trong bã sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời có sự thay đổi . Hàm lượng cellulose giảm nhưng vẫn còn cao. Điều này lý giải cho việc hiệu suất chuyển hoá cellulose thấp. Có thể thấy quá trình tiền xử lý vật lý bằng xay nát vật liệu không loại bỏ nhiều lignin, tro và các chất không xác định. Do đây là tiền xử lý cơ học không có sự tác động của hoá chất. Hơn nữa, việc tiền xử lý bằng xay nát chỉ làm giảm kích thước nguyên liệu, cấu trúc chưa bị phá vỡ hoàn toàn nên enzyme cellulase khó có thể tấn công. Điều đó khiến nấm men khó chuyển hoá cellulose thành glucose khiến hiệu suất chuyển hoá thấp. 53
Đồ án tốt nghiệp 3.4 Thí nghiệm bổ sung * Kết quả khảo sát thuỷ phân và lên men đồng thời khi dùng lượng enzyme khác theo thời gian lên 50 1 2 40 3 4 30 Efficiency (%) Efficiency 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (Hour) Hình 3. 5 So sánh hiệu suất của quá trình SSF theo thời gian: (1) 3% Enzyme; (2) 2,5% Enzyme; (3) 1,5 % Enzyme; (4) 2% Enzyme. Nhìn vào hình, hiệu suất chuyển hoá ở tỷ lệ enzyme 3% cao hơn ở hiệu suất ở tỷ lệ enzyme 1,5 % và 2,5 % . Điều đó đồng nghĩa, việc ta sử dụng lượng enzyme càng nhiều thì hiệu suất càng lớn nhưng hiệu suất chỉ nằm trong khoảng 20 % - 25% là tương đối thấp. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển hoá ở lượng enzyme 2% (45,76%) lại chiếm cao hơn ở lượng enzyme 3 % (28,47%). Cho thấy kết quả khảo sát lượng enzyme cần dùng không phù hợp với kết quả ban đầu. Có thể giải thích trong những nguyên nhân sau đây: 54
Đồ án tốt nghiệp Thời gian lấy mẫu đợt sau cho thí nghiệm khảo sát lượng enzyme cho vào được lấy vào mùa mưa. Lục bình mùa mưa nhiều nước nên thành phần cellulose ít hơn nhiều, dẫn đến thí nghiệm cho hiệu suất thấp hơn nhiều. Do thời gian làm đồ án có hạn, nên người làm đề tài không có đủ thời gian để làm thí nghiệm kiểm chứng. Vì thí nghiệm phân tích thành phần sơ xợi phải mất từ 3 – 4 tuần. 55
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận ❖ Kết luận thành phần xơ sợi và thành phần sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời của lục bình Thành phần lục bình - Lục bình chiếm 40,47 % cellulose, có khả năng trở thành một nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol thế hệ thứ hai. Vì thành phần sơ xợi chiếm khoảng 40%, rất tương đồng với nguyên liệu rơm rạ, là thành phần đã được nghiên cứu trong dự án Jica (JSC). - Thành phần sau khi thuỷ phân và lên men đồng thời lượng cellulose còn lại chiếm 23,20%. Điều đó cho thấy quá trình tiền xử lý vật lý bằng xay nát chưa phá vỡ hoàn toàn cấu trúc xơ sợi của lục bình. Kết luận về quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời - Thời gian lên men càng lâu thì hiệu suất quá trình càng tăng nhưng hiệu suất cuối chỉ chiếm 45,76 %. - Khảo sát lượng enzyme cho vào thì lượng enzyme 2 % cho hiệu suất quá trình cao hơn so với những lượng enzyme bổ sung khác. Tuy nhiên, kết quả không phù hợp với kết quả ban đầu. 4.2 Kiến Nghị Quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất có ý nghĩa đối với công nghiệp sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu lignocellulose chung và từ lục bình nói riêng. Những kết quả từ nghiên cứu này cũng đã phần nào chứng minh tính khả thi của quá trình này. Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế. Việc nghiên cứu kỹ hơn quá trình thủy phân và lên men đồng thời là rất có ý nghĩa đối với việc sản xuất bioethanol. Vì thời gian có hạn nên có nhiều quy trình và phương pháp mà đồ án chưa tiến hành thử nghiệm hết, tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau: - Cần tìm phương pháp tiền xử lý thích hợp hơn cho nguyên liệu lục bình. 56
Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành phương pháp thuỷ phân và lên men tách biệt để so sánh quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời. - Nghiên cứu kỹ hơn về quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời để tăng hiệu suất thu hồi ethanol. 57
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Dương Thuý Hoa (2004). Hiệu quả xử lý nước thải sau hầm ủ biogas của lò giết mổ bằng lục bình (Water Hyacinth), Luận án Thạc sĩ chuyên ngành khoa học môi trường, Trường Đại học Cần Thơ. [2] Nguyễn Đức Lượng (2001). Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001. [3] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006. Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2)- Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB ĐHQG TP. Hồ Chí Minh. [4] Trần Diệu Lý (2008). Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ. Luận văn tốt nghiệp đại học, Trường đại học Bách Khoa (ĐHQG TPHCM), Hồ Chí Minh. [5] Phạm Công Minh (2012). Nghiên cứu khả năng chuyển đổi bèo tây thành cồn sinh học, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường đại học khoa học tự nhiên (ĐHQG Hà Nội), Hà Nội. [6] Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thị Thanh Hằng (2007). Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn ethylic. NXB Khoa học và Kỹ thuật. [7] Trần Thị Thu (2011). Khảo sát tiền xử lý lõi bắp bằng enzyme trong sản xuất bioethanol, Luận văn tốt nghiệp đại học, Trường đại học Bách Khoa (ĐHQG TPHCM), Hồ Chí Minh. [8] Tổng Cục Thống Kê, Niên giám thống kê, 2010. [9] TS. Trịnh Thị Long và cộng sự (2012). Tiềm năng sinh khí methan từ cơ chất là bèo lục bình và định hướng sử dụng sinh khối. Trung Tâm Khoa học Công Nghệ Môi trường và Sinh Thái – Viện KHTL miền Nam. Tài liệu tham khảo tiếng Anh [10] Gaspar, M., G. Kalman, and K. Reczey. 2007. Corn fiber as a raw material for hemicellulose and ethanol production. Process Biochem. 42:1135–1139. 58
Đồ án tốt nghiệp [11] ] Kumar, R., Wyman, C.E., 2009a. Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies.Biotechnol. Prog. 25, 302–314. [12] Parveen Kumar, Diane M. Barrett, Michael J. Delwiche, and Pieter Stroeve, 2009. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 48: 3713–3729 [13] Charles E.Wyman. Handbook on Bioethanol: Product and Utilization. Taylor&Francis, 1996. p 119-285. [14] P. Alvira, E. Tomás-Pejó, M. Ballesteros, M.J. Negro (2010). Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review Bioresource Technology 101 4851 –4861. [15] P. Alvira, E. Tomás-Pejó, M. Ballesteros, M.J. Negro (2010). Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review Bioresource Technology 101 4851 –4861. [16] Kumar, P., Barret, D. M., Delwiche, M. J. & Stroeve, P. (2009b). Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Ind. Eng. Chem. Res., 48(8), 3713-3729. [17] Fileto-Pérez et al (2013). Evaluation of Eichhornia crassipes as an Alternative Raw Material for Reducing Sugars Production. A review Bioresource Technology 101 5340 –5348. [18] Sirous Kalhorinia et al (2013). Optimization of acid and enzymatic saccharification of lignocellulosic substrate water hyacinth (EICHHORNIA CRASSIPES), Indian Streams Research Journal, , Volume-3, 2230-7850. [19] Sanchez C: Lignocellulosic residues: biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnol Adv 2009;27:185-194 [20] Parveen Kumar, Diane M. Barrett, Michael J. Delwiche, and Pieter Stroeve. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and 59
Đồ án tốt nghiệp Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48 (8), pp 3713–3729.] [21] Saha, B.C., Iten, L.B., Cotta, M.A., Wu, Y.V., 2005. Dilute acid pretreatment, enzymatic saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem. 40: 3693–3700]. [22] Mosier, N., Wyman, C.E., Dale, B.D., Elander, R.T., Lee, Y.Y., Holtzapple, M., Ladisch,C.M., 2005b. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour. Technol. 96: 673–686. [23] Sun, Y., Cheng, J., 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol. 83: 1 –11 [24] Hendriks, A.T.W.M., Zeeman, G., 2009. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresour. Technol. 100: 10–18 [25] Mani, S., Lope G. Tabil, A. Opoku (2002). “Bioethanol from Agricultural Crop Residues - an overview”. ASAE/CSAE meeting presentation, Canada [26] Keikhosro Krimi, Giti Emtiazi, Mohammad J. Taharzadeh, Ethanol production from dilute-acid pretreated rice straw by simultaneous saccharification and fermentation with mucor indicus, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, Science Direct, Enzyme and microbial Technology 40, 2006. [27] Abreu P, Relva A, Matthew S, Gomes Z, Morais Z (2007). High-performance liquid chromatographic determination of glycalkaloids in potatoes from conventional, integrated and organic crop system. Food Control 18, 40-44. Internet 28] ng&Itemid=528&lang=vi.htm [29] nong-nghiep-xanh-Biomass/20407311/189 [30] [31] ?ItemId=2972 60
Đồ án tốt nghiệp [32] /asset_publisher/6fOl/content/tong-quan-ve-cong-nghe-nhien-lieu-sinh-hoc- overview-of-biofuel [33] &id=7937:to-lam-sch-nc-va-sn-xut-nhien-liu-sinh-hc&catid=154:tin-kt-kh-cn-va- mt. [34] nlsh-the-he-thu-3- nhung-tiem-nang-va-thach-thuc-4168.html. [35] [36] [37] thuc-pham.html [38] [39] for-ethanol. [40] [41] 170645.html. [42] xuat-nhien-lieu-gia-re-tu-rom.aspx. [43] [44] www.ecy.wa.gov. [45] cBinh.htm&char=B 61
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. Một số ký hiệu sử dụng trong luận văn Khối lượng mẫu trước khi sấy m1, g Khối lượng mẫu sau khi sấy m2, g Khối lượng thành phần rắn trong mẫu AIR, g Hàm lượng của thành phần rắn trong mẫu AIR%, % Khối lượng tro trong mẫu Ash, g Hàm lượng tro trong mẫu Ash%, % Khối lượng lignin không hòa tan bởi acid AIL, g Hàm lượng lignin không hòa tan bởi acid AIL%, % Hàm lượng lignin hòa tan bởi acid ASL%, Hàm lượng glucose trong lục bình %Cglucose, % Khối lượng lục bình lên men mrơm, g Khối lượng dung dịch lên men mdd, g Nồng độ ethanol theo lý thuyết %Cethanol(lt), % Nồng độ ethanol thực tế %Cethanol(tt), % Hiệu suất quá trình lên men H, % 1
Đồ án tốt nghiệp Tính hiệu suất của quá trình thủy phân và lên men đồng thời Phản ứng : C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Nồng độ ethanol tính theo lý thuyết: %C 𝑔푙 표푠푒. 푙ụ ì푛ℎ 2.46 %C ethanol (lt) = . 162 % 푒푡ℎ 푛표푙(푡푡) Hiệu suất: H = . 100 % 푒푡ℎ 푛표푙(푙푡) B. Đo dung dịch chuẩn. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ethanol, glucose, xylose để khảo sát quan hệ chất – thời gian lưu, nồng độ – diện tích peak (không trình bày tại đây). Kết quả đo đường chuẩn Glucose xylose Ethanol Nồng độ %, wt 1716390 1887680 667693 0.333333333 1212056 1246847 439993 0.222222222 948103 1087551 338432 0.166666667 Từ đó suy ra các đường chuẩn: − Glucose: Y = 2,174.10-7.X – 0,040155247 − Xylose: Y = 1,983.10-7.X – 0.038323168 − Ethanol: Y = 5,031.10-7.X – 0.001781621 Trong đó: Y là nồng độ, wt%; X là diện tích peak. 2
Đồ án tốt nghiệp C. Kết quả thuỷ phân và lên men đồng thời theo thời gian thời gian diện tích nong độ ethanol (wt Nồng độ glucose Hiệu suất (giờ) peak %) (wt %) (%) 0 0 0 0 0 24 53891 0,025 1,2 2,72 48 235574 0,12 0,2 13,04 72 321367 0,16 0,03 17,39 96 341916 0,17 0,019 18,48 130 748476 0,374 0,009 40,65 150 832248 0,42 0 45,65 180 840573 0,421 0 45,76 D. Kết quả khảo sát tỷ lệ lượng enzyme cho vào theo thời gian lên men 3
Đồ án tốt nghiệp 0,7 0,6 (1) (2) 0,5 0,4 0,3 Concentrationwt) (% 0,2 0,1 0,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (hour) Nồng độ ethanol và glucose theo thời gian lên men: (1) ethanol; (2) glucose khi sử dụng enzyme với liều lượng là 1,5% khối lượng so với khối lượng lục bình khô. 4
Đồ án tốt nghiệp 0,25 0,20 (1) (2) 0,15 0,10 Concentration) wt % ( 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (hour) Nồng độ ethanol và glucose theo thời gian lên men: (1) ethanol; (2) glucose khi sử dụng enzyme với liều lượng là 2,5% khối lượng so với khối lượng lục bình khô. 5
Đồ án tốt nghiệp 0,30 0,25 (1) 0,20 (2) 0,15 0,10 Concentration%) (wt 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Time (hour) Nồng độ ethanol và glucose theo thời gian lên men: (1) ethanol; (2) glucose khi sử dụng enzyme với liều lượng là 3% khối lượng so với khối lượng lục bình khô. E. Kết quả chạy HPLC 6