›

Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

pdf 102 trang thiennha21 12/04/2022 4210
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_anh_huong_cua_chat_dieu_hoa_sinh_truong_thu.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ CHITOSAN LÊN SỰ TẠO CHỒI LAN CATTLEYA HYBRID WHITE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Gia Lộc MSSV: 1515100012 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Nguyễn Gia Lộc i
  3. LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Nguyễn Gia Lộc ii
  4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích của đề tài 2 3. Nội dung của đề tài 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu 2 5. Kết quả đạt được của đề tài 3 6. Kết cấu của đồ án 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy 4 1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô thực vật 4 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 4 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro 5 1.1.4. Ưu và nhược điểm của quá trình nhân giống 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro 7 1.2. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 9 iii
  5. 1.3. Sự phát sinh hình thái 10 1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các yếu tố ảnh hưởng 11 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng về chitosan 16 1.6. Giới thiệu về cây Cattleya 18 1.6.1. Giới thiệu chung về cây phong lan 18 1.6.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới và ở Việt Nam 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 32 2.1.1. Địa điểm thí nghiệm 32 2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm 32 2.2. Vật liệu 32 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 32 2.2.2. Môi trường nuôi cấy 32 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 33 2.3. Phương pháp 33 2.4. Bố trí thí nghiệm 34 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White 34 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White 44 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên sự tạo chồi Cattleya Hybrid White 35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi 36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu 37 iv
  6. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. 38 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. 45 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy. 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 4.1.Kết luận 58 4.2. Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 1 v
  7. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzyl-aminopurine DNA deoxyribonucleic acid MS Murashige và Skoog (1962) NAA Alpha-naphtalenacetic acid TCN Trước Công Nguyên TP. HCM Thành Phố Hồ Chí Minh 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi
  8. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White 34 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White 35 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White 36 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy 39 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy 46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy 52 vii
  9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hoa lan Cattleya Hybrid White 21 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 42 Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 48 Hình 3.4. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) 54 Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) 55 viii
  10. DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 40 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l) 47 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l) 53 ix
  11. LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, đời sống con người ngày càng được nâng cao, cả về mặt vật chất và tinh thần. Nhu cầu thưởng thức cái đẹp, đặc biệt cái đẹp đến từ thiên nhiên, cỏ cây hoa lá dần đi vào đời sống mỗi người dân. Từ xa xưa, chơi hoa, trồng hoa và thưởng thức hoa đã được coi là một thú vui nghệ thuật độc đáo và thú vị. Ngày nay, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa đang ngày càng được chú tâm và phát triển bởi nó không chỉ bó hẹp trong giá trị thưởng thức mà còn mang lại giá trị kinh tế rất cao. Phong lan là một trong những loài hoa có chất lượng cao, giá trị kinh tế lớn, được nhiều người yêu thích bởi có hoa đẹp, cấu trúc hoa kiêu kỳ, phức tạp. Hơn nữa, màu sắc hoa vô cùng phong phú, hương thơm quyến rũ, thời gian chơi dài. Nhờ quá trình sưu tầm các loài lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các thứ lan mới, số loài hoa lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100 ngàn loài. Vì thế, trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thú chơi lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế. Số người chơi và yêu chuộng hoa lan ngày càng tăng, hay nói cách khác, nhu cầu sử dụng các chủng loại lan đã và đang tăng. Hoa lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 3 kiểu dáng: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo hay bám trên giá thể và cây lan con từ 10 – 15 cm. Được mệnh danh là “hoàng hậu” của các loài lan, Cattleya nổi bật với vẻ đẹp kiêu sa, quý phái không chỉ ở cánh hoa mà ở tất cả các bộ phận của cây, cùng với hương thơm dễ chịu làm mê đắm lòng người. Cattleya có thể sống được ở vùng nóng và vùng ôn đới, đặc biệt đây là giống rất thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam với biên độ rộng. Chính vì thế nó được trồng và phát triển mạnh ở tất cả các nơi, các tỉnh phía Nam, phía Bắc và ngay cả trên vùng Cao Nguyên, tuy nhiên mỗi nơi đều có cách trồng khác nhau. Đối với các nước có nền công nghiệp hoa lan 1
  12. phát triển mạnh như Thái Lan, Hà Lan, Đài Loan và Trung Quốc, lan nói chung và Cattleya nói riêng đều được đầu tư đi sâu nghiên cứu để không chỉ tạo ra giò lan đẹp mà còn có giá cả cạnh tranh. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp cho người sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề bức xúc hiện nay. Để giải quyết vấn đề này người ta áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vì hệ số nhân cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như bố mẹ chọn lọc. Từ một cây mẹ ban đầu ta có thể nhận ra hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân giống được nhanh hơn. Mặt khác, cây con ổn định về di truyền, đồng thời giảm tác hại cho cây giống và đem lại hiệu quả thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây giống và giảm giá thành. Chính vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và chitosan lên sự tăng trƣởng và nhân chồi Cattleya Hybrid White” nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về môi trường nuôi cấy. 2. Mục đích của đề tài Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. Đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường nuôi cấy mô cây lan Cattleya Hybrid White. 3. Nội dung của đề tài Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về môi trường nuôi cấy tăng trưởng lan và lan Cattleya nói riêng. 2
  13. - Là cơ sở cho nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy các loài lan khác nói chung. Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân nhanh giống lan Cattleya Hybrid White ở quy mô lớn, tạo cây con sạch bệnh nhằm cung cấp cho sự đa dạng giống lan tại Việt Nam. 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định được nồng độ BA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. - Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 3
  14. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về phƣơng pháp nuôi cấy 1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô (tissue culture) là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật và các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ. Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật: Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng. Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía, Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla. 4
  15. Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương. Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực. Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô. Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao. Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới. 1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro Nhân nhanh giống, tạo cây con đồng đều về hình thái, đồng nhất về di truyền. Tạo cây trồng sạch bệnh. Sản xuất cây đơn bội. Lai xa. Bảo quản nguồn gene. 5
  16. 1.1.4. Ƣu và nhƣợc điểm của quá trình nhân giống Ưu điểm: Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1 – 10 mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5 – 20 cm. Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài. Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây giống sạch virus. Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, theo ý muốn. Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36 – 1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn. Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự chi phối của điều kiện ngoại cảnh, của thời vụ. Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro. Nhược điểm: Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhưng cây giống tạo ra kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn. Cây giống in vitro được cung cấp nguồn carbohydrate nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão 6
  17. hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện ex vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao thường không ổn định, nghèo dinh dưỡng. Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao. Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống: o Tính bất định về mặt di truyền. o Sự nhiễm mẫu. o Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy. o Hiện tượng thuỷ tinh thể. 1.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài Thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genome qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn Cà chua Lycopersicon esculentum Mill. Chọn cơ quan Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. Tuổi và sinh lý Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều 7
  18. nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già. Mẫu in vitro Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al., (1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng ruộng. Sức sống của mẫu Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những cây bệnh được nhân lên. Điều kiện nuôi cấy o Điều kiện vô trùng Theo Nguyễn Quang Thạch nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn o 76 , để khử trùng. Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy. 8
  19. o Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27oC, nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan. o Cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công Kiên, 2002). o Quang kỳ và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng: ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. Chất lượng ánh sáng: ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro. o Các chất khí: Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây in vitro. O2, CO2 và ethylene là những chất được khảo sát nhiều. CO2 có thể bị giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thông khí, sử dụng bình có bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể cho vi nhân giống hạ giá thành. O2 có giới hạn trong nuôi cấy mô. Ethylene xem như là chất làm giảm sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng thích ethylene. Nâng cao hàm lượng ethylene làm giảm sinh trưởng mô sẹo. 1.2. Ý nghĩa của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học. Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen để tạo các giống cây trồng mới, 9
  20. chúng ta đều cần đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì phương pháp này có những ưu điểm đáng kể: Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn. Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Có thể thực hiện bất kỳ địa điểm nào. Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không đòi hỏi phải có một diện tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao. Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh. Dễ dàng học hỏi và trao đổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế giới. Bảo quản giống dễ dàng bằng cách tạo ra thể phôi hoặc bảo quản lạnh. 1.3. Sự phát sinh hình thái Định nghĩa Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ những thay đổi của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm sự phát sinh chồi bất định, phát sinh rễ bất định, tạo phôi soma, Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trọng các biến đổi hình thái và cấu trúc đó. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái. Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là: Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó. 10
  21. Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật. Trong phương pháp này, nên áp dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh vì mẫu cấy có kích thước nhỏ, rất khó tiến hành nghiên cứu sinh lý học. Trong phát sinh cơ quan, chồi thường được cảm ứng và tăng trưởng trước, rễ được tạo ra sau. Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau đó mới hình thành chồi như trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi được cảm ứng bởi Agrobacterium rhizogenes (James et al., 1988). Với những cây thân gỗ cứng, chồi thường được cảm ứng trực tiếp từ bộ lá. 1.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và các yếu tố ảnh hƣởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế chất dinh dưỡng. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật gây nên tác dụng mạnh mẽ với một lượng vô cùng bé đến trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động như chất kìm hãm. Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật làm việc như chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzyme trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA. Mỗi một chất điều hòa sinh trưởng thực vật đều mang một chức năng riêng, nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất. Tùy mỗi giai đoạn nuôi cấy, giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau, có hai nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberellin và ethylene cũng là nhóm 11
  22. chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2006). Auxin Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Trong muôi cấy mô tế bào thực vật auxin được dung cho sự phân chia tế bào, phân hoá rễ và ức chế sự thành lập chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1999). Auxin có tác dụng kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi, (Vũ Văn Vụ, 1999). Auxin có vai trò thúc đẩy sự sinh trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách tế bào thông qua sự hoạt hoá các enzyme tổng hợp vách và làm giãn nở tế bào (Đặng Phương Trâm, 1997). Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), việc bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết vì chúng rất cần cho phân chia tế bào và quá trình phân biệt hoá tế bào. Auxin được chia thành hai loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichloro phenoxy aceticacid (2,4-D), 1-naphthalene acetic acid (NAA) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1 – 2,0 mg/l vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2006). Theo Lê Võ Thùy Ngân (2011) cho rằng ít có loài thực vật nào có thể ra rễ ngay trong môi trường nhân giống. Nguyên nhân là do cytokinin hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự hình thành rễ vì vậy cần có một môi trường chuyên biệt để cảm ứng sự tạo rễ. Do đó cần phải có auxin để cảm ứng tạo rễ và nhu cầu này sẽ giảm sau khi rễ được khởi tạo. Các loài cây thân gỗ cần auxin ở nồng độ cao hơn cây thân thảo để ra rễ. Một trong các loại auxin có hiệu quả cao nhất trong sự kích thích tạo rễ là NAA. 12
  23. Nếu sử dụng loại auxin mạnh như NAA với nồng độ cao thì có thể có sự tạo mô sẹo từ mẫu cấy. Ngoài ra còn có các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất (chất làm đặc môi trường), ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện môi trường nuôi cấy cũng có thể ảnh hưởng đến sự ra rễ của chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Cytokinin Cytokinin là những hợp chất adenine được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (Nguyễn Minh Chơn, 2010). Kinetin và Benzyl adenine được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây người ta chứng minh là tạo ra tự nhiên ở một vài loại cây. Cytokinin đóng vai trò chính trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2006). BA và kinetin là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. Nồng độ sử dụng 0,1 – 2 mg/l. Tuy nhiên trong trường hợp không bổ sung cytokinin thì sau 10 – 12 ngày cũng cho ra chồi nhưng tỷ lệ rất thấp (Dương Công Kiên, 2007). Ethylene Ethylen là chất điều hòa sinh trưởng thực vật dạng khí. Ethylene có rất nhiều tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò của ethylene đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng dụng rất nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét ứng dụng của ethylene lên sự kéo dài thân, rễ và kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo lông, rễ, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là Thiamine HCl (vitamin Bl), nicotinic acids (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. 13
  24. Carbohydrate Hầu hết môi trường nuôi cấy mô thực vật đều cần bổ sung thêm nguồn carbohydrate bên ngoài. Carbohydrate cần cho việc nuôi cấy tạo mô sẹo (White, 1934; Gautheret, 1955). Sucrose được sử dụng làm nguồn carbohydrate đầu tiên White (1940) và sau đó nhiều nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng hiệu quả. Có nhiều nghiên cứu về nhu cầu carbohydrate đối với phôi non và phôi trưởng thành của thực vật, đặc biệt là ở họ Lan. Verma và Dougall (1977) cho rằng các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự tăng trưởng và phát sinh phôi ở Cà rốt hoang dại. Các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự biến dưỡng ở thực vật. Theo Gleddie và cộng sự, (1983) sucrose là nguồn carbon tốt nhất cho sự phát sinh phôi. Ngoài vai trò là nguồn carbon, các carbohydrate còn có tác dụng như một yếu tố điều hòa sự phát sinh hình thái. Carbohydrate có tác dụng lên sự hình thành diệp lục. Diệp lục trong mô sẹo nuôi cấy có ảnh hưởng lên khả năng phát sinh phôi. Các gen biểu hiện nhanh trong sự biệt hóa của các diệp lục cảm ứng ánh sáng xanh cũng có biểu hiện trong sự phát sinh phôi vô tính ở Chenopodium rubrum và Cà rốt (Aleith và Richter, 1991). Sự hình thành và biểu hiện của các protein trong giai đoạn đầu của quá trình phát sinh phôi vô tính được tìm thấy trong lục lạp của Đậu Hà Lan (Koonen và Jacobson, 1991). Sự kích thích quá trình phát sinh phôi vô tính trong nuôi cấy mô sẹo tế bào noãn ở Citrus trên môi trường chứa lactose có liên quan đến sự hình thành diệp lục trong mô sẹo (Button, 1978). Các chất hữu cơ Nước dừa (CW-coconut) được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thức vật được ghiền tách chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển như cây chà là, chuối, mầm lúa 14
  25. mì Nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trông không cùng nguồn gốc. Than hoạt tính Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0,3% than hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi. Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Ảnh hưởng của pH Là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin. pH của môi trường thường ở 5,5 – 5,8 trước khi khử trùng. Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hoá các enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hoá của tế bào trong mô nuôi cấy. Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 – 5,9. Vì hầu hết trong các môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 – 4,5 trong vòng 24 – 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi (Stewart et al., 1987; Peril, 1994; Ziv và Hadar, 1991; Jay et al., 1994). Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ ammonium của tế bào. Agar Agar là một polysaccharide thu được từ một số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8 – 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào (Collin, 1998; Bhojwani và Razan, 1983). 15
  26. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991; Debergh, 1983; Halquist et al., 1983) bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lý trên mô thực vật. Ngoài agar ra một số hợp chất khác cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như gerlite là một polysaccharide tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas (Kang et al., 1982). 1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng về chitosan Gần đây, chitosan, chất dẫn xuất khử acetyl (deacetylated) của chitin có nguồn gốc từ vách tế bào của nấm, vỏ của các loài giáp xác, biểu bì của côn trùng và một số loài tảo đã được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp như là chất thân thiện với môi trường vì nó dễ dàng phân hủy và không ảnh hưởng sức khỏe con người. Chitosan và các dẫn xuất của nó là đáp ứng tự vệ của thực vật và được sử dụng như là hợp chất tự nhiên để chống lại các bệnh tiền và sau thu hoạch (Uthairatanakij et al., 2007). Thêm vào đó, nhiều báo cáo cho thấy chitosan giúp gia tăng sự sinh trưởng của cây trồng. Mới đây, chitosan được ghi nhận là chất kích thích sinh trưởng ở một số loài thực vật, trong đó có cây lan. Trong nhân giống in vitro, chitosan đã được sử dụng và có hiệu quả cải thiện chất lượng cây con, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho sự thuần dưỡng cây con ở điều kiện in vitro (Nge et al., 2006). Hiệu quả của chitosan lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Dendrobium dưới dạng phun lên cây trồng bên ngoài cũng như bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro đã được báo cáo (Chandrkrachang, 2002; Limpanavech et al. 2003, Nge et al., 2006). Tình hình nguyên cứu chitosan trong kích thích tăng trưởng thực vật: Theo Zubay (2000) thì ngoài 5 nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật đã được xác định và sử dụng là: auxin, gibberellin, cytokinin, ethylene và abscisic thì còn có một nhóm điều hòa sinh trưởng mới là oligosaccharins. 16
  27. Chavagrit (2002), thử nghiệm chitosan chiếu xạ để kích thích sinh trưởng cho Phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20 – 60% so với đối chứng ở nồng độ thích hợp nhất là 50 ppm. Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau cải để tăng năng suất từ 13 – 31%. Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là chitosan oligomer còn khá mới mẻ. Nguyễn Quốc Hiến (1999) có nghiên cứu thu nhận các oligoalginate tách ra từ rong biển để sử dụng trong nông nghiệp. Sau đó, Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà (1999) cũng nghiên cứu chế tạo chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma. Tuy nhiên, phương pháp này còn có nhiều nhược điểm so với phương pháp enzyme là giá thành cao, các phân đoạn oligomer có khối lượng phân tử không tập trung, vì vậy hoạt tính sinh học thường thấp. Lê Quang Luân (2002) cũng nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer được cắt bằng bức xạ gamma trong nuôi cấy mô thực vật. Kết quả cho thấy, chitosan chiếu xạ gamma với liều 100 kGy có hiệu ứng kích thích sinh trưởng của 4 loại cây nuôi cấy mô là: Dâu tây (Fragaria), Limonium latifolium, Eustoma grandiflorum và Chrysanthemum morifolium. Limpanavech (2008), chứng minh rằng chitosan oligomer với mức độ deacetyl hóa 80% đã làm tăng kích thước của lục lạp và bó mạch ở cây hoa lan Dendrobium, nồng độ thích hợp là 10 – 50 ppm. Tác giả cũng chứng minh rằng phun chitosan oligomer làm cho cây ra hoa sớm hơn, số lượng cụm hoa/cây, số hoa/cụm hoa cũng tăng lên so với đối chứng. Nguyễn Anh Dũng (2007), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan, chitosan oligomer đến hàm lượng diệp lục khi phun lên lá Cà phê. Kết quả cho thấy, đối với chitosan thì nồng độ thích hợp là 80 ppm, và 50 ppm với chitosan oligomer. Chibu (2001), nghiên cứu hiệu ứng kích thích sinh trưởng của chitosan 100 kDa trên một số cây trồng và nhiều cách như tưới vào đất, phun lên lá. Kết quả cho thấy lá của các loại cây trồng như Xà lách, Cà chua, Lúa cạn xanh đậm, năng suất tăng mạnh so với đối chứng và nồng độ sử dụng từ 0,1 – 0,5% tùy loại cây trồng. 17
  28. Nguyễn Anh Dũng (2002) cũng nghiên cứu thử nghiệm hiệu lực của chitosan oligomer trên nhiều loại cây trồng trên các thí nghiệm đồng ruộng như trên cây Đậu tương (Nguyễn Anh Dũng, 2002), Đậu lạc (Nguyễn Anh Dũng, 2004), trên cây Lúa Nguyễn Anh Dũng (2006), cây Bông vải (Nguyễn Anh Dũng, 2005, 2007), cây Cà phê (Nguyễn Anh Dũng, 2007). Sarath Chandra (2004), nghiên cứu xử lý hạt và phun lên lá cho cây Kê. Thời gian ngâm hạt là 3 – 9h. Kết quả chitosan làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt Kê và sức sống của cây con cũng như các chỉ tiêu sinh trưởng khác như chiều cao cây, chiều dài hoa, số hạt trên bông và khối lượng 1000 hạt. Uddin (2004), nghiên cứu phun chitosan và một số đường monosaccharide lên hoa Cát tường Lisianthus (Eustoma grandiflorum). Kết quả cho thấy chitosan làm tăng số nụ hoa và tăng hàm lượng anthocyan, nhờ vậy màu sắc của hoa đậm hơn. Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác của Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau cải tăng năng suất từ 13 – 31%. 1.6. Giới thiệu về cây Cattleya 1.6.1. Giới thiệu chung về cây phong lan 1.6.1.1. Nguồn gốc, phân bố, phân loại và giá trị của phong lan Cây hoa lan được biết đến đầu tiên ở phương Đông. Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông (2800 TCN) ở Trung Quốc, loài lan rừng đã được dùng làm thuốc chữa bệnh. Sau đó cùng với vẻ đẹp và hương thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài này đã có mặt ở châu Âu. Tại đây, người ta đã tiến hành nghiên cứu khá công phu và tỉ mỉ. Pharatus (376 – 285 TCN) được coi là cha đẻ của ngành lan học, vì ông là người đầu tiên dùng từ Orchids để chỉ một loài hoa lan củ tròn. Sau đó là Linne (1707 – 1778) và Robiet Bron (1773 – 1858) là những người đầu tiên phân biệt rõ ràng họ lan và các họ thực vật khác. Còn người đặt nền tảng cho môn học về hoa lan là Joanlind (1779 – 1885). Năm 1836 ông công bố tài liệu (Tabuler View of the Tribes of Orchidea) để sắp xếp loài và chi 18
  29. thuộc họ lan. Tên của họ lan do ông đưa ra được dùng đến ngày nay (Trần Hợp, 1990). Ở Việt Nam, dấu vết những nghiên cứu về lan ở buổi đầu không rõ rệt lắm, có lẽ người đầu tiên khảo sát về lan là nhà truyền giáo Bồ Đào Nha Joanisde Loureiro, ông đã mô tả cây lan Việt Nam trong cuốn “Flora decochin chinesis” (1789) (Vũ Thị Phượng, 2005). Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong bộ “Cây cỏ Việt Nam” (quyển II) đã mô tả kèm hình vẽ 289 loài lan gặp ở Việt Nam (Hoàng Xuân Lam, 2006). Năm 1992, Gunnar Seidenfaden người Đan Mạch đã phát hành cuốn “Hoa lan tại Đông Dương” gồm 200 giống và 2000 loài, trong đó có khoảng 136 giống và 720 loài của Việt Nam (Vũ Thị Phượng, 2005). Theo Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có tới 755 loài lan (1993) Trên khắp trái đất, hầu như nơi nào có thực vật là có phong lan nhưng số lượng nhiều ít khác nhau rất lớn liên quan mật thiết đến độ cao. Mỗi loài có một cách phân bố và phát triển rất riêng biệt cho kiểu dáng và kích cỡ các cây lan khác nhau rất nhiều, sự khác biệt đó không chỉ vì xuất xứ từ các lục địa khác nhau mà còn có khi ở ngay trong một vùng địa lý vài kilomet vuông. Về lịch sử phân loại, họ lan đến nay đã được biết khoảng 200 năm. Theo hệ hệ thống phân loại thực vật, cây hoa lan thuộc họ lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp hành (Lilidae), lớp một lá mầm (Monocotyledonae), ngành ngọc lan- thực vật hạt kín (Magnoliophyta). Theo Phạm Hoàng Hộ, Trần Hợp, trước kia, họ phong lan được chia làm 3 họ phụ (Orchidadeae, Cypripedicideae, Apostasiscideae). Gần đây, do phân tích hoa đầy đủ hơn và đi sâu vào đặc tính di truyền, các nhà khoa học đã chia họ phong lan thành 6 họ phụ: Apostasiscideae Orchidadeae Cypripedicideae Epidendroideae Neottioideae Vandoideae 19
  30. Cả 6 họ phụ này đều phổ biến rộng rãi trên trái đất. Họ lan của Việt Nam cũng khá phong phú. Theo thống kê sơ bộ gần đây của giáo sư Leonid và Averyanov thì có khoảng 152 chi và 897 loài. Đây là một thế mạnh tự nhiên, làm cơ sở cho phát triển ngành trồng lan nước nhà. Mặc dù vậy, việc phân loại thực vật nói chung và lan nói riêng là hết sức phức tạp, cho đến nay chưa có các khóa phân loại cho các đơn vị dưới loài, trong khi đó việc làm này lại hết sức quan trọng, nhất là trong công tác chọn giống cây trồng (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1997). Về giá trị của cây phong lan, trước hết phải kể đến giá trị trên phương diện thẩm mỹ và kinh tế. Hoa lan được nhiều người yêu thích, bởi lẽ đây là loài hoa có cấu trúc rất kiêu kỳ và phức tạp, những trạm trổ rất tinh vi. Màu sắc của hoa được pha trộn một cách hài hòa, cân đối, lắm khi lại hiện lên những nét tương phản rõ rệt, hay chìm lắng và mất hút. Khác với các loài ký sinh thông thường có tác động hủy hoại ký chủ, đa số các loài lan có lối sống phụ sinh chỉ xem cây chủ làm giá thể. Vì thế, không phải ngẫu nhiên mà ông cha ta đã dùng cây lan biểu hiện cho người quân tử “Mai, Lan, Cúc, Trúc”, một đạo đức cao quý của dân tộc Việt Nam. Về mặt kinh tế, người ta đã thống kê, ở các nước xuất khẩu hoa lớn như Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan, Úc, Nhật Bản, doanh thu từ lan đạt vài trăm triệu USD/năm. Còn ở Việt Nam, theo các chuyên gia về lan, nghề trồng lan sẽ đem lại một lợi nhuận không nhỏ cho người dân. Theo tính toán của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nếu trồng phong lan cắt cành loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất trồng có thể cho thu nhập 500 triệu – 1 tỷ đồng/năm, cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và một số hoa mầu khác. Ngoài phương diện thẩm mỹ và kinh tế, cây lan còn có nhiều giá trị khác. Với giống Anoectochilus còn gọi là “Jewel Orchids” thì lá được dùng làm rau, một món ăn quen thuộc của người Malaysia và Indonesia. Trong số các loại thuộc giống Blettia, Cattleya, Renanthera, giả hành và lá được dùng làm trà và thuốc. Thổ dân Niu Ghinê dùng Dendrobium utile để dệt làm kiềng đeo tay như một thứ đồ trang sức (Nguyễn Công Nghiệp, 2000) Một số loài trong chi lan Hoàng thảo 20
  31. (Dendrobium) dùng làm thuốc chữa sốt nóng, kém ăn, khô cổ, giảm thị lực, vì chúng chứa nhiều alkaloid có giá trị chữa bệnh (Đỗ Huy Bích, 2004). 1.6.1.2. Đặc điểm thực vật của lan Cattleya Giới : Plantae Ngành : Angiospermae Lớp : Monocots Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae Chi : Cattleya Loài : Cattleya sp. Hình 1.1. Hoa lan Cattleya Hybrid White Lan Cattleya là loài lan cộng sinh nhiệt đới có hoa rực rỡ được trồng và ra hoa đầu tiên trong môi trường nuôi trồng. Năm 1818, người ta đưa về trồng đầu tiên giống Cattleya labiata xuất xứ từ vùng rừng núi Brazil. Người ta đã tìm được trên 70 loài hoa Cattleya rải rác khắp vùng nhiệt đới châu Mỹ và cả một số vùng thuộc Nam Mỹ. Trong chi Cattleya có hai nhóm tách biệt nhau rõ rệt, là nhóm lá đơn (chỉ có một lá) và nhóm lá kép (có hai lá). Tất cả đều thuộc loài có lá xanh quanh năm, chỉ đôi khi rụng bớt đi 1 – 2 lá cũ. Hai nhóm đó được xác định theo hoa của chúng. Nhóm lá đơn được biết đến với vẻ đẹp lấp lánh của các bông hoa lớn, cánh môi rất phát triển, có viền nhăn với màu chủ yếu là trắng đến hồng, vàng đến hồng nhạt và có sắc màu hoa cà. Nhóm lá kép đa số đều có hoa nhỏ với cánh đài và đài hoa màu nhạt, cánh môi nhỏ và ít nhăn hơn. Đa số những cây trong chi Cattleya thường có các giả hành dài hình gậy bầu dục, khi còn nhỏ có các lá cứng xanh đậm che phủ. Nụ hoa mọc ra từ đỉnh các giả hành, thường 21
  32. được che bằng một vỏ bảo vệ, lớp vỏ này sẽ khô đi và bong ra để cho nụ phát triển. Trong khi đa số đều có hoa trên những cành ngắn, loài lai với chi Laelia của Mexico như Laelia ancep có cành dài hơn. Trong đa số các loài lan có hương thơm, mùi hương này sẽ biến mất khi lai với giống khác, nhưng với chi Cattleya, mùi hương này vẫn còn được giữ lại trong hầu hết các giống lai và đặc tính này giúp cho chúng càng trở nên hấp dẫn hơn. 1.6.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của nhóm lan Cattleya Nhiệt độ Cattleya phát triển rất tốt ở không khí mát và ẩm, nhiệt độ lý tưởng cho Cattleya là 21oC vào ban ngày và 16oC vào ban đêm. Dù vậy, lan Cattleya vẫn tăng trưởng và có thể phát triển ở một nhiệt độ cao hơn nhiệt độ lý tưởng 28oC vào ban ngày và 15oC vào ban đêm, đó là nhiệt độ bình thường của các tỉnh phía Nam. Ngoài ra, cây lan Cattleya cũng phát triển tốt ở những vùng khí hậu của mùa đông với nhiệt độ 13oC vào ban ngày và 10oC vào ban đêm, đó là nhiệt độ của các tỉnh phía Bắc (Minh Trí, 2010). Do đó có thể nói rằng, các loài thuộc giống Cattleya có thể trồng và ra hoa khắp nơi ở nước ta tuy nhiên ở vùng lạnh và mát nên trồng loại C, LC, SLC, BLC, BSLC thì sự ra hoa sẽ đều đặn hơn. Ẩm độ và tƣới nƣớc Ẩm độ tương đối của không khí cần thiết cho sự phát triển của cây lan là 40 – 70%. Tưới nước là cần thiết để tăng ẩm độ của vườn lan, tuy nhiên Cattleya là một chi lan có giả hành mập có khả năng dự trữ nước rất lớn. Do đó tưới nước thường xuyên sẽ làm cây yếu, không phát triển và đôi khi làm cây chết do thối rễ. Tưới nước bằng cách nhỏ giọt thường xuyên vào chậu cũng không cho kết quả khả quan. Ở thành phố Hồ Chí Minh, việc tưới nước cho Cattleya là rất cần thiết tuy nhiên với độ che sáng 50% nếu tưới nước nhiều sẽ tạo ra nhiệt độ thấp dưới 25oC làm cây khó ra rễ. Vì vậy đối với Cattleya cần có thời gian khô ráo giữa các lần tưới để kích thích sự mọc rễ của cây ( Minh Trí, 2010). 22
  33. Ở Đà Lạt có sương mù thường xuyên, ẩm độ cao, do đó chỉ tưới nước 1 lần/tuần trong mùa nắng và không tưới trong mùa mưa. Các tỉnh phía Bắc có mùa khô ngắn, còn các tỉnh từ Thừa Thiên Huế đến Bình Thuận có mùa khô quá dài vì thế việc tưới nước phải được vận dụng một cách cụ thể cho từng vùng. Ánh sáng Sự che ánh sáng đối với loài lan thuộc giống Cattleya thay đổi khác nhau tùy loài. Tuy nhiên ở mức độ che 50% cường độ ánh sáng (khoảng 12.000 – 200.000 1m/m2 ) có thể áp dụng cho nhiều loài lan Cattleya cần ánh sáng nhưng không trực tiếp (Segerback, 1983). Trong giàn lan không treo các chậu sát vào nhau, phải có một khoảng cách từ 15 – 20 cm. Khoảng trống giữa những chậu sẽ cho cây nhận đủ ánh sáng và thoáng khí, ngoài ra đây cũng là phương thức ngăn chặn ốc sên có hiệu quả. Tuy nhiên nếu lan được trồng trên cao thì các cây phải được treo sát vào nhau để ngăn chặn bớt gió. Nếu không có giàn che, lan cũng có thể trồng trực tiếp ngoài ánh sáng với điều kiện là các cây được trồng từ nhỏ ở các chậu phải đặt sát vào nhau và tiểu khí hậu nơi đó phải mát và ẩm. Nếu cây lan Cattleya được trồng trong điều kiện ánh sáng tối ưu sẽ cho màu hoa đậm, cánh hoa dày, cứng, không có khuynh hướng lắc lư, hoa to. Ngược lại, trồng ở nơi có ánh sáng yếu cây rất chậm ra hoa, khi ra hoa thường bị gục xuống, màu nhạt. Ánh sáng quá mạnh cây còi cọc, ra hoa bé và hay bị khuyết tật. Đặc biệt Cattleya có một đặc tính lạ là rất nhạy cảm với ánh sáng về ban đêm, dù cường độ rất yếu cũng làm cho cây không ra hoa (Trần Văn Bảo, 2001). Nhu cầu phân bón Các loài lan thuộc giống Cattleya có thể ra hoa bất kỳ mùa nào trong năm với điều kiện các bộ phận sinh trưởng đủ khả năng phát triển thành một giả hành mới, chính vì thế việc bón phân cho lan ngoài mục đích duy trì sự sinh trưởng và phát triển của cây lan là nhằm điều khiển sự ra hoa các loài của giống này (ngoại trừ một số loài rất ít ra hoa theo mùa). Cattleya là thực vật phụ sinh, do đó lá của nó giữ vai trò quan trọng trong việc hấp thụ dưỡng chất, vì thế tưới phân bón bằng phương 23
  34. pháp phun sương lên toàn bộ cây sẽ tốt hơn rất nhiều so với cách tưới thẳng vào các giá thể trong chậu. Phân có thể phun sương bằng hệ thống phun tự động hay bằng bình xịt thuốc sát trùng. Nếu số lượng lan ít thì phương pháp nhúng phân ngập là rất tốt (Nguyễn Công Nghiệp, 2000). Phân được bón là các loại phân vô cơ có tỷ lệ các nguyên tố đa, trung và vi lượng được pha chế sẵn. Theo nguyên tắc khi cây còn nhỏ bón phân có hàm lượng N cao, P và K thấp, còn cây đã trưởng thành chuẩn bị ra hoa bón hạn chế đạm, tăng lượng lân và kali để huy động dinh dưỡng nuôi hoa, giúp hoa to, đẹp và bền. Phân bón được tưới 1 hoặc 2 lần/tuần, với nồng độ một muỗng cà phê (1gam) pha trong 4 lít nước. Có thể dùng phân vô cơ và hữu cơ hỗn hợp loãng sẽ cho kết quả tốt cho sự tăng trưởng. Trước mùa ngừng tăng trưởng một tháng, trong suốt một tháng bón cho lan loại phân 10 : 20 : 30 hoặc 6 : 30 : 30 để tạo một sự cứng cáp cho cây trước khi cây vào mùa nghỉ, trong tháng nghỉ của cây, lúc này ta sẽ ngưng tưới phân hoàn toàn (Soebijanto, 1988). Yêu cầu về giá thể Cấu tạo giá thể là điều kiện quyết định sự phát triển của lan Cattleya, vì thế việc cấu tạo giá thể thay đổi tùy theo vùng và tùy theo mùa trong năm. Với phương pháp trồng trên thân cây sống và thân cây chết thì giá thể chính là lớp vỏ của thân cây được trồng. Khi trồng trong chậu nên chọn loại chậu có kích thước 15 – 20 cm và sử dụng loại giá thể với phần đáy chậu thật thoáng đảm bảo tránh hiện tượng úng nước, còn phần bề mặt chậu kín và khít giúp cây đứng vững, không bị lay chuyển sẽ rất tốt cho cây Cattleya sinh trưởng. Đối với vùng lạnh, cấu tạo giá thể quá thông thoáng sẽ bất lợi cho sự sinh trưởng, vì nhiệt độ lạnh ban đêm sẽ làm cho các đầu rễ khó đi và bộ rễ teo dần, cây phát triển èo uột. một giá thể bít kín sẽ giúp rễ có độ ẩm để phát triển. Mùa nghỉ của lan Cattleya Cattleya là giống lan có mùa nghỉ ở điều kiện khí hậu và thời tiết của Việt Nam, do vậy cần cho cây nghỉ mỗi năm 1 tháng. Ở các tỉnh phía nam mùa nghỉ của 24
  35. Cattleya kéo dài suốt tháng 4, các tỉnh phía Bắc trong tháng 1, các tỉnh từ Bình Thuận đến Thừa Thiên Huế mùa nghỉ bắt đầu trong tháng 8. Trong mùa nghỉ cây không đòi hỏi dinh dưỡng và tưới nước, chỉ duy trì lượng nước tưới 1 lần/ngày, độ che sáng 10% ánh sáng trực xạ để giảm nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp trong mùa nghỉ của lan Cattleya càng thấp càng tốt, khoảng 10oC cho vùng lạnh và 25oC cho vùng nóng (Nguyễn Công Nghiệp, 2000). Thay chậu và nhân giống Cattleya Lan Cattleya trồng và phát triển trong chậu thường xuyên xảy ra hiện tượng thối rễ. Bên cạnh đó chúng phát triển rất nhanh do đó việc thay chậu được coi là khâu quan trọng và được tiến hành thường xuyên cùng với việc nhân giống. Lan Cattleya có thể nhân giống bằng cách tách chiết 3 giả hành một. Sau khi tách chiết cây thường rất yếu và cần đảm bảo thời gian khoảng 2 – 3 năm và tình trạng sức khỏe của cây người ta mới quyết định để cây ra hoa hay không. Nếu cây lan Cattleya thuộc loại giống hiếm quý mà sự tách chiết là cần thiết, có thể chiết hai giả hành một và để nguyên tại chỗ khi nào cây hình thành một giả hành mới và đủ trưởng thành, ta có thể lấy ra và trồng vào một chậu mới. Việc thay chậu tốt nhất nên thực hiện vào đầu mùa mưa giúp cây phát triển mạnh hơn. Tuy vậy, Cattleya có thể thay chậu vào bất kỳ thời gian nào vẫn đảm bảo cây sống với tỷ lệ cao. 1.6.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.6.2.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới Hoa lan (Orchidaceace) là một trong những đỉnh cao của sự tiến hóa của các loài cây có hoa. Hoa lan được con người biết đến từ rất sớm. Ở châu Á, người Trung Quốc biết thưởng thức và chăm sóc hoa lan sớm hơn nhiều so với người châu Âu.Tuy nhiên, để biến hoa lan thành mặt hàng có giá trị xuất khẩu thì người châu Âu mới là những người đi tiên phong. Từ khi con người biết ứng dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật, ngành trồng lan có những bước tiến bộ nhảy vọt. Đầu tiên, 25
  36. phương pháp cộng sinh nấm để gây sự nảy mầm được Noel Bernad thực hiện năm 1904, nhưng cho đến khi phương pháp gieo hạt không cộng sinh trong phòng thí nghiệm được Knudson nghiên cứu năm 1922, ngành trồng lan mới thật sự có những chuyển biến rõ rệt. Sau đó, phương pháp cấy mô lan đa thân đã gây lạc quan cho tất cả các nhà trồng lan trên thế giới (Nguyễn Công Nghiệp, 2002). Phương pháp này có thể nhân giống lan với tốc độ rất cao: 4 triệu cây con/năm, với các vốn ban đầu chỉ là một chồi non, được Morel khám phá. Lúc này, ngành trồng lan có những chuyển biến với nhịp độ chưa từng thấy để đi sâu vào lĩnh vực thương mại (Nguyễn Công Nghiệp, 2000). Ngày nay, với sự tiến bộ vượt bậc của ngành thực vật học, Chính phủ Pháp đỡ đầu giúp kỹ nghệ sản xuất lan với phương pháp phân chia. Nhà sinh vật học George Morel, người hướng dẫn chương trình thí nghiệm meristem với giống khoai tây, đã đưa ra thí nghiệm nuôi cấy meristem cho các giống lan. Kết quả thật bất ngờ, năm 1956, ông dùng một tế bào trên chóp của một chồi lan con mới nhú từ giò lan mẹ đem cấy trên một môi trường nuôi cấy có chất các dinh dưỡng và ông đã tách ra được vô số các cây lan con. Phương pháp này giúp sản xuất ra những cây lan con giữ được đặc tính di truyền của cây lan mẹ, trong lúc đó việc gieo hạt lan lại tạo ra những cây lan con khác với cây mẹ. Áp dụng phương pháp của Morel, Michel Vacherot và Maurice Lecouffe đã tiến hành sản xuất và cho ra đời hàng loạt các cây lan con theo phương pháp này. Ngày nay, ngoài một số các nhà gây giống lan chuyên nghiệp ở khắp Âu, Á, các trại lan ở Mỹ, Châu Phi, Hawaii, Singapore, Thái Lan đã đạt đến mức sản xuất lan kỹ nghệ. Ở Mỹ, nhất là lễ Valentine, Secretary Day và dạ vũ tốt nghiệp Prom, hàng năm tiêu thụ đến 20 triệu lan cài áo (brioche) hoặc bouquet (Widiastoety, 1995). Phong lan dần được xuất khẩu và lưu thông như một ngành thương mại và được phát triển nhanh ra nhiều nước. Ngày nay, các nước phát triển như Pháp, Mỹ, Hà Lan, Thái Lan, Nhật Bản, Đài Loan, Úc, Trung Quốc, đã có nhiều nghiên cứu, sử dụng nhiều thành tựu khác nhau của ưu thế lai, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy 26
  37. mô tế bào, kỹ thuật di truyền, và kết quả là đã tạo ra hàng nghìn giống phong lan, địa lan có màu sắc sặc sỡ, hương thơm quyến rũ đem lại lợi ích kinh tế rất lớn cho những nước này, trung bình 100 – 500 triệu USD/năm. Nhiều nước xuất khẩu hoa lan lớn như Thái Lan, Đài Loan, Hà Lan, Úc, Nhật Bản và Trung Quốc đạt doanh thu vài trăm triệu USD/năm (Phạm Hoàng Hộ, 1992). Thái Lan: nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, với giá lao động thấp, khí hậu tốt, giao thông tốt cho phép Thái Lan sản xuất quanh năm và xuất đi 50 nước trên thế giới. Hiện nay, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, đạt 110 triệu USD trong năm 2003 (Nguyễn Công Nghiệp, 2000). Thái Lan có 18 phòng nuôi cấy mô hoa lan thương mại hoạt động ở Băng Cốc và các vùng phụ cận. Hàng năm nước này sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%, Mokara 5%, còn lại là các loài lan khác. Đài Loan: chú trọng đầu tư nhiều vào nuôi trồng Phalaenopsis và chọn tạo nhiều giống mới, đem lại doanh thu hàng năm trên 9,3 tỷ Đài tệ. Hiện nay đã tạo ra được một số giống lan quý có khả năng cắt hoa và trồng trong chậu (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Trung Quốc: là nước có truyền thống tuyển chọn và tạo các giống lan kiếm. Họ sử dụng các phương pháp lai hữu tính thu quả, sau đó gieo và tuyển chọn các loài hoa đáp ứng được màu sắc, kiểu dáng rồi sử dụng kỹ thuật nhân giống in vitro và in vivo để tạo ra một số lượng lớn các cây, sau đó cho ra hoa đồng loạt tạo ra sản phẩm hàng hóa có giá trị kinh tế cao, giá từ 5 – 10 USD/cành (Phạm Hoàng Hộ, 1992). Ở Singapore, nghề trồng lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm 1987. Nhà nước đã thấy rõ tiềm năng xuất khẩu loại lan này trên thị trường thế giới nên đã mở rộng trang trại trồng hoa lan. Hiện nay Singapore chiếm 12% thị trường kinh doanh phong lan trên thế giới. Nhật Bản: đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây hoa mỗi năm và hiện nay Nhật cũng là khách hàng lớn 27
  38. nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan nước này (Nguyễn Tiến Bân, 1992). 1.6.2.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan ở Việt Nam Trước những năm 1986, nghề trồng hoa của Việt Nam chỉ tập trung ở một vài làng nghề ở Hà Nội, Hải Phòng, TP. HCM, Đà Lạt và một vài tỉnh miền Tây Nam Bộ. Diện tích trồng hoa của Việt Nam theo số liệu thống kê năm 1993 chỉ chiếm 0,02% tổng diện tích đất nông nghiệp (khoảng 1.585 ha). Trong đó diện tích trồng hoa lan chiếm 10%. Trong những năm gần đây, do sự phát triển chung của nền kinh tế, đời sống nhân dân ngày càng được cải thiện từ đó nhu cầu chơi hoa ngày càng phát triển rộng rãi. Thị trường WTO mở cửa kết hợp với chính sách sản xuất theo hướng hàng hoá xuất khẩu của nhà nước đã tác động mạnh mẽ, tích cực đến ngành sản xuất hoa nói chung và hoa lan nói riêng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính: - Sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc dược nhập hội (lan công nghiệp) - Khai thác và nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng). Tuy nhiên các chính sách đầu tư của nhà nước hầu hết chỉ tập trung vào mảng lan cắt cành và sản xuất cây con giống của một số loài lan công nghiệp như Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Vũ Nữ (Oncidium), Hoàng Thảo (Dendrobium). Các dự án ñầu tư phát triển hoa cây cảnh của các tỉnh đều hướng tới sản xuất lan cắt cành, đặc biệt ở các tỉnh phía Nam. Tại hội thảo về hiện trạng và hướng phát triển hoa lan trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh năm 2005, ông Nguyễn Thiện Nhân – Phó Chủ tịch thường trực Thành phố cho biết, với thế mạnh là hoa nhiệt đới, lan cắt cành sẽ trở thành cây chủ lực của thanh phố Hồ Chí Minh trong những năm tới. Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như: Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Sinh học nông nghiệp, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội, trong những năm vừa qua cũng đã tập trung nghiên cứu các phương pháp nhân 28
  39. giống vô tính in vitro và cho ra đời mỗi năm hàng vạn cây con giống hoa lan có giá trị. Viện Nghiên cứu Rau quả đã triển khai dự án “Hoàn thiện quy trình nhân giống và sản xuất một số giống lan Hồ Điệp ở quy mô công nghiệp” và đã có sản phẩm đưa ra thị trường phục vụ người chơi. Hải Phòng xây dựng khu Nông nghiệp công nghệ cao (Mỹ Đức, An Lão) với mục tiêu cụ thể: sản xuất 300.000 cây giống hoa lan bằng công nghệ của Viện Sinh học nông nghiệp trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và của Hiệp hội hoa Thái Lan. Tất cả những chính sách đầu tư trên đã đem lại hiệu quả to lớn thúc đẩy ngành sản xuất lan công nghiệp phát triển và thu được nhiều thành tựu, đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần được xuất ra thị trường quốc tế đem lại nguồn thu ngoại tệ cho quốc gia và thu nhập lớn cho người trồng, người kinh doanh và người đầu tư vào lĩnh vực này. Khác với lan công nghiệp, lan bản địa (lan rừng) lại chỉ phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận. Xã Đông La – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc. Đến nay cả xã đã có 52 hộ trồng lan, trong đó có hơn 30 hộ có diện tích vườn lan từ 500 đến 1000 m2,tập trung nhiều nhất ở thôn Đông Lao và Đồng Nhân với những vườn lan như Huyền Chân, Trường Uyên, Thực Hà, Tiền Hảo, Theo lãnh đạo xã Đông La, nghề trồng lan đã đóng góp đáng kể cho phát triển kinh tế của địa phương, tạo việc làm, tăng thu nhập cho người lao động. Trung bình mỗi năm, trừ chi phí, một hộ trồng lan cũng có lãi hàng trăm triệu đồng, gấp nhiều lần nghề nông nghiệp khác. Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, tuy nhiên quy mô diện tích các vườn lan này khá nhỏ, chỉ từ 300 – 500 m2. Số 29
  40. lượng loài cũng rất ít, phổ biến là các loài Đai Châu, Đuôi Cáo, Hoàng Thảo, Quế Lan Hương và một số loài lan Hài. Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên chủng loại lan ở Việt Nam rất phong phú. Theo các chuyên gia về hoa của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, với khoảng trên 800 loài lan hiện có, khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây sinh trưởng, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực (Nguyễn Xuân Linh, 2002).Tuy nhiên, sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là Đà Lạt và TP.HCM. Hiện nay mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt, TP.HCM, Đồng Nai với diện tích khoảng 50 – 60 ha/một doanh nghiệp. Một vài địa phương khác phong lan chỉ mới trồng ở quy mô gia đình, trên diện tích vài m2, cá biệt mới có vài hộ trồng trên 1 – 2 ha. Theo tính toán, mỗi năm Việt Nam phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa. Chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan và cây cảnh mới đạt 200 – 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa lan, cây cảnh tăng nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1000 cơ sở. Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên 1 triệu cây (Nguyễn Xuân Linh, 2000). Lĩnh vực kinh doanh lan ở Việt Nam còn rất non trẻ, mới thực sự bắt đầu được hơn 10 năm trở lại đây. Theo ông Đồng Văn Khiêm – Giám đốc công ty Phong lan xuất khẩu TP.HCM thì khó khăn lớn nhất là Nhà nước chưa có chính sách phát triển ngành lan, chưa có một văn bản nào để khuyến khích, chính sách thuế không rõ ràng, Bên cạnh đó, việc xuất khẩu lan hiện còn qua ủy thác, không tạo được sự chủ động cho nhà sản xuất. Để có thể đáp ứng nhu cầu nội địa, tiến vào thị trường phong lan thế giới, ngoài việc khắc phục những khó khăn trên, ngành công nghiệp hoa lan của Việt 30
  41. Nam còn phải quan tâm rất nhiều đến vấn đề về tạo giống, công nghệ sản xuất, canh tác, công nghệ sau thu hoạch, đóng gói, kiểm dịch và đầu tư mở rộng cơ sở hạ tầng cho sản xuất loài hoa này (Ngô Quang Vũ, 2002). 31
  42. CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 2.1.1. Địa điểm thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM , 475A Điện Biên Phủ , P.25, Q. Bình Thạnh, TP. HCM. 2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm Đề tài nghiên cứu sẽ tiến hành từ tháng 3/2016 đến tháng 8/2016 tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học thực vật – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các mô sẹo in vitro, của giống phong lan Cattleya Hybire White tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP. HCM. 2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962). Các chất bổ sung bao gồm: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzyl-aminopurine). Chitosan Agar Nguồn carbon: sucrose, glucose, fructose, lactose, manitol, sorbitol. Nước dừa Than hoạt tính 32
  43. 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi riêng với các điều kiện: Nhiệt độ: 25 ± 2oC Cường độ sáng: 2500 – 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Độ ẩm trung bình : 85 – 90% 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu Các thao tác trong phòng cấy Rửa tay kỹ bằng xà phòng, mặc áo blouse, đeo găng tay, khẩu trang trước khi vào phòng cấy. Dùng khăn lau tủ cấy bằng cồn 70o. Bật đèn UVđể khử trùng tủ cấy trong 30 phút, xịt cồn bộ dụng cụ cần cấy và cho vào tủ trước. Sau khi bật UV xong bật quạt khoảng 15 phút và lau tủ cấy lại bằng cồn 70o. Môi trường và chai mẫu phải lau cồn trước khi đưa vào tủ cấy. Khi cấy cần tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ và mẫu cấy. Hạn chế đi lại trong suốt quá trình cấy. Hơ miệng chai cấy thật kỹ trước và sau khi cấy. Dụng cụ sau mỗi lần cấy phải được đốt lại bằng cồn 90o. Hạn chế nói chuyện trong quá trình làm thí nghiệm. Sau khi cấy ghi lại ngày tháng, tên giống, để thuận tiện cho việc theo dõi. Sau khi chấm dứt cấy, cần phải tắt đèn cồn, tắt tủ cấy, làm vệ sinh sạch sẽ. Ngoài ra cần chú ý trong quá trình làm việc, cồn 96o rất dễ cháy do đó phải tuyệt đối thật cẩn thận. 33
  44. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White Mục đích: xác định nồng độ BA thích hợp cho sự tạo chồi của lan Cattleya Hybrid White. Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy trực tiếp vào môi trường MS đặc có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ BA thay đổi tương ứng như ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l) A0 0,0 A1 0,5 A2 1,0 0,5 A3 1,5 A4 2,0 A5 2,5 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White Sau thí nghiệm 1, chúng tôi xác định được nồng độ BA tối ưu cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ NAA kết hợp với nồng độ BA cố định cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White. 34
  45. Mục đích: xác định nồng độ tối ưu của BA và NAA cho sự tạo chồi của lan Cattleya Hybrid White. Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy vào môi trường MS đặc có bổ sung 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1 mg/l BA cố định và nồng độ NAA thay đổi tương ứng với các nghiệm thức khác nhau như ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức NAA (mg/l) BA (mg/l) B0 0,0 B1 0,5 B2 1,0 1 B3 1,5 B4 2,0 B5 2,5 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Sau thí nghiệm 1 và 2, chúng tôi xác định được nồng độ BA, NAA tối ưu cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm ra nồng độ chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định cho sự tăng trưởng chồi Cattleya Hybrid White. Mục đích: xác định nồng độ chitosan thích hợp cho sự hình thành chồi lan Cattleya Hyrid White. 35
  46. Tiến hành: từ mẫu cấy chồi Lan Cattleya Hybrid White được cấy trực tiếp vào môi trường MS đặc có bổ sung agar 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa, 1 mg/l BA cố định, 1,5 mg/l NAA cố định và nồng độ chitosan thay đổi tương ứng với các nghiệm thức khác nhau như ở bảng 2.3. Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố định lên tạo chồi Cattleya Hybrid White Nghiệm thức Chitosan (g/l) BA (mg/l) NAA (mg/l) C0 0 C1 5 C2 10 1 1,5 C3 15 C4 20 C5 25 2.5. Chỉ tiêu theo dõi - Khối lượng tươi (g) - Khối lượng khô (g) - Tỷ lệ sống sót (%) - Số lá (lá/cây) - Đường kính lá (cm) - Chiều dài lá (cm) - Số chồi (chồi/mẫu) - Chiều cao chồi (cm) - Số rễ (rễ/cây) - Chiều dài rễ (cm) 36
  47. 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.1. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 37
  48. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ BA thay đổi tương ứng (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh của nồng độ BA lên khả năng hình thành chồi của lan Cattleya sau 8 tuần nuôi cấy. Theo quan sát chúng tôi nhận được: Sau 4 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 6 và thứ 7, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nỗi bật là khối lượng chồi, số lá, chiều dài lá, số chồi, số rễ, chiều dài rễ. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức A0; A1 và A2. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức A3; A4 và A5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1; hình 3.1; hình 3.2. 38
  49. Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy N Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đƣờng Chiều Chiều Chiều Đặc điểm T độ lƣợng lƣợng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao chồi (mg/l) tƣơi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) (cm) Cây phát triển bình thường, rễ dài, lá A0 0 2,170c 0,307d 6,333c 15,66c 24,667b 0,7667b 1,1bc 2,667b 0,9d to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển tốt, lá to và dài. A1 0,5 3,174b 0,583bc 10,333b 35,67b 23,667b 0,8b 1,4b 2,5b 1,233cd Cây phát triển xanh tốt, chồi A2 1 7,415a 1,762a 13,333a 44,667a 51a 1,2667a 2,133a 2,033b 2,333a nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to nhƣng dày, chồi cao. Cây phát triển không đều, ít chồi và A3 1,5 1,528c 0,347cd 5,667cd 12,333c 13,667c 0,633bc 1,6ab 2,833ab 1,9abc lá, rễ nhiều mà ngắn. Cây phát triển không đều, nhiều A4 2 1,807c 0,428bcd 1,333e 15c 17,332bc 0,7b 0,633c 2,6ab 1,466bcd chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ bc b de c bc c bc a ab A5 2,5 2,364 0,604 3,333 3,333 17 0,3 17 3,367 2,066 và ít, rễ dài, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 39
  50. 55,000 50,000 45,000 40,000 Khối lượng tươi (g) 35,000 Khối lượng khô (g) Số chồi (chồi/mẫu) 30,000 Số lá (lá/cây) 25,000 Số rễ (rễ/mẫu) Đường kính lá (cm) 20,000 Chiều dài lá (cm) Chiều dài rễ (cm) 15,000 10,000 5,000 0,000 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 40
  51. Hình 3.1. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 41
  52. Hình 3.2. Ảnh hƣởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 42
  53. Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, hình 3.1, hình 3.2 sau 8 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Ở nghiệm thức A2 với nồng độ 1 mg/l BA, cây phát triển xanh, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (2,33 > 0,90 cm), chồi được phát triển nhiều A2 (13,333 chồi/mẫu) gấp 2 lần A0 ( 6,333 chồi/mẫu), trọng lượng tươi đạt mức cao nhất trong 6 nghiệm thức, trọng lượng tươi của nghiệm thức A2 (7,41 g) gấp 3,41 lần A0 (2,17). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là A2 (1,7628 g) cao hơn 5,7 lần so với A0 (0,3072 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (44,00 lá/cây), lá to và nhiều, rễ nhiều (51,00 rễ/mẫu), rễ dài (2,033 cm). Tỷ lệ cây phát triển giảm dần ở các nghiệm thức A0, A1, A3, A4, A5. Ở nghiêm thức A0 cây phát triển bình thường, phát triển ổn định ở các chỉ tiêu. Ở nghiệm thức A1 cây phát triển tốt, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (1,233 > 0,90 cm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là (3,174 g) cao hơn 1,46 lần so với A0 (2,17 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức A1 là (0,583 g) lớn hơn 1,89 lần so với A0 (0,307 g). Nhìn chung cây phát triển không đều. Ở nghiệm thức A3 cây phát triển không tốt, khối lượng nhỏ (1,582 g) và số lá ít (12,33 lá/cây). Cây phát triển không đồng đều. Ở nghiệm thức A4 cây phát triển tốt, xanh, nhưng số chồi ít (1,33 chồi/mẫu) và ngắn (1,466 cm). Ở nghiệm thức A5 với nồng độ 2,5 g/l BA ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của chồi cây vì nồng độ BA khá cao có khả năng làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường, gây stress cho cây. Nhìn chung cây phát triển chậm ít chồi (1,33 chồi/mẫu), ít lá (6,67 lá/cây), lá nhỏ, rễ ngắn (5,67 cm). 43
  54. Theo Đàm Sao Mai và cộng sự (2009) khi giải thích về kết quả thí nghiệm của cây Thông đỏ cho rằng trong quá trình sinh tổng hợp protein, BA tác động lên tế bào thực vật không chỉ ở giai đoạn dịch mã mà còn ở giai đoạn sao mã. Sự có mặt của BA ở nồng độ nhất định đã làm tăng quá trình tổng hợp các sinh chất trong tế bào và mô thực vật, dẫn đến tế bào phân chia nhanh hơn do đó chiều cao chồi khi có bổ sung BA sẽ cao hơn so với đối chứng (không bổ sung BA) là điều tất yếu. Song vượt quá ngưỡng kích thích thì BA lại ức chế các quá trình trên, do đó mẫu cấy có chiều cao giảm dần. Điều này cũng giải thích cho kết quả thí nghiệm về cây Cattleya in vitro, so với thời điểm sau 8 tuần nuôi cấy ở nghiệm thức MS + 0,5 mg/l BA có số chồi cao tương đương so với môi trường đối chứng. Nguyên nhân là do ảnh hưởng của BA làm cho chiều cao chồi tăng lên nhiều so với môi trường không bổ sung BA. Bên cạnh đó, Bảng 3.1 cũng cho thấy nồng độ BA càng cao thì số chồi cũng càng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Teixeira và cộng sự (2004) cho rằng trong quá trình nhân chồi cây (Prunus spp.) BA có ảnh hưởng quan trọng đến chiều cao chồi, sử dụng BA nồng độ cao (trên 2 mg/l) ức chế sự phát triển chiều cao của chồi. Sau 8 tuần nuôi cấy thì nghiệm thức BA 5 mg/l cho kết quả thấp nhất trong việc tạo chồi. Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng những chồi này không thể kéo dài. Ngoài ra, qua quá trình thí nghiệm cũng ghi nhận được cụm chồi có sức sống kém ở môi trường bổ sung BA với nồng độ cao nên khả năng tạo chồi thấp. Tóm lại, từ kết quả phân tích các chỉ tiêu cho thấy ở nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức MS bổ sung 1 mg/l BA đạt hiệu quả cao cho sự hình thành số chồi. Trong đó, nghiệm thức BA 1 mg/l cho kết quả tốt nhất. Kết quả trên phù hợp với kết quả thí nghiệm của Đàm Sao Mai và cộng sự (2009) cho rằng nồng độ BA phù hợp cho sự hình thành chồi Thông đỏ trong thí nghiệm này là 1 mg/l. Tương tự với kết quả trên, trong trường hợp cây Populus Tremila L. thì Angeles và cộng sự (2003) đã dùng BA 1 mg/l để tạo chồi là tối ưu (Đàm Sao Mai và cộng sự, 2009). Như vậy, tôi thấy rằng nồng độ BA (A2) tối ưu là 1 mg/l ở nghiệm thức A2 cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Cattleya Hybird White. 44
  55. 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l BA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ NAA thay đổi tương ứng (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh của nồng độ NAA lên khả năng hình thành chồi của lan Cattleya sau 8 tuần nuôi cấy. Theo quan sát chúng tôi nhận được: Sau 4 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 6 và thứ 7, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nỗi bật là khối lượng chồi, số lá, chiều dài lá, số chồi. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức B1; B2 và B3. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức B4 và B5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần thứ 8, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.2; hình 3.3; hình 3.4. 45
  56. Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy N Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đƣờng Chiều Chiều Đặc điểm T độ lƣợng lƣợng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ (mg/l) tƣơi (g) khô (g) (cm) (cm) (cm) Cây phát triển bình thường, lá to B0 0 8,034b 0,423b 48,66b 20,33b 0,00c 0,7667b 0,24d 0,00c nhưng ít chồi và lá. B1 0,5 5,504d 0,331cd 36,33d 15,00c 0,00c 0,8b 0,56bc 0,00c Cây phát triển không tốt, lá ít. Cây phát triển không đều, ít chồi B2 1 6,875c 0,344c 43,33c 19,00b 0,00c 1,2667a 0,65bc 0,00c và lá. Cây phát triển xanh tốt, chồi B3 1,5 9,887a 0,550a 60,00a 27,66a 43,00a 1,33a 1,44a 2,33a nhiều, nhiều lá, nhiều rễ, lá to xanh. Cây phát triển không đều, nhiều B4 2 4,483e 0,137e 29,00e 14,00c 33,00b 0,7b 0,86b 1,20b chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá B5 2,5 4,265e 0,2689d 28,66e 12,00c 0,00c 0,3c 0,36cd 0,00c nhỏ và ít Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 46
  57. 60,000 55,000 50,000 45,000 Khối lượng tươi (g) 40,000 Khối lượng khô (g) 35,000 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/cây) 30,000 Số rễ (rễ/mẫu) 25,000 Đường kính lá (cm) Chiều dài lá (cm) 20,000 Chiều dài rễ (cm) 15,000 10,000 5,000 0,000 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Biểu đồ 3.2. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 47
  58. Hình 3.3. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 48
  59. Hình 3.4. Ảnh hƣởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tƣơng ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/l) 49
  60. Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.3, hình 3.4 sau 8 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức B0 cây phát triển xanh tốt bình thường, chồi và lá xanh. Nghiệm thức B1 cây phát triển thấp hơn so với nghiệm thức B0 trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 5,504 g nhỏ hơn 1,4 lần so với B0 (8,034 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B1 là 0,331 g nhỏ hơn 1,27 lần so với B0 (0,4236 g). Nhìn chung cây phát triển chậm, ít chồi (36,33 chồi/mẫu), ít lá (15,00 lá/cây). Ở nghiệm thức B2 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0 với trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 6,875 g nhỏ hơn 1,1 lần so với B0 (8,034 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là B2 là 0,344 g nhỏ hơn 1,2 lần so với B0 (0,423 g). Nhìn chung cây phát triển không đều, ít lá (19,00 lá/cây). Ở nghiệm thức B3 cây phát triển xanh tốt, chồi cây nhiều, cao hơn so với nghiệm thức B0 với trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 9,887g cao hơn 1,2 lần so với B0 (8,034 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (27,66 lá/cây), lá to, rễ nhiều (43,00 rễ/mẫu), rễ dài (2,3 cm). Ở nghiệm thức B4, B5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ, ít chồi, lá của cây có màu xanh nhạt. Ở bảng 3.2 cho thấy nghiệm thức có số rễ cao nhất là nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/l NAA (43,00 rễ/mẫu) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức có số rễ thấp nhất là nghiệm thức không bổ sung NAA, tuy nhiên nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa với nghiệm thức 1 mg/l NAA. Kết quả nhận được sau 8 tuần khi cấy cũng cho thấy, môi trường có 1,5 mg/l NAA là nghiệm thức cho chiều dài rễ dài nhất (2,33 cm), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Từ kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy môi trường MS có bổ sung NAA ở nồng độ 1,5 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo rễ của lan Cattleya Hybrid White in vitro. Kết quả này cũng tương ứng với kết quả thí nghiệm của Đàm Sao Mai và cộng 50
  61. sự, (2009) trên cây Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) cho rằng khi bổ sung NAA ở nồng độ 1,5 mg/l vào môi trường nuôi cấy sẽ cho sự hình thành rễ tốt nhất, hay kết quả thí nghiệm của Nguyễn Văn Ây và Lê Văn Hòa (2010) trên cây Tre rồng cũng cho thấy bổ sung NAA ở nồng độ 2 – 4 mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo rễ in vitro. Tóm lại, tôi thấy rằng nồng độ NAA (B3) tối ưu là 1,5 mg/l ở nghiệm thức B3 cho sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White in vitro. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy Chồi lan Cattleya được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l BA, 1,5 mg/l NAA, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 20% nước dừa và nồng độ chitosan thay đổi tương ứng (0; 5; 10; 15; 20; 25) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh của nồng độ chitosan lên khả năng hình thành chồi của lan Cattleya sau 8 tuần nuôi cấy. Theo quan sát chúng tôi nhận được: Sau 3 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 6 và thứ 7, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nỗi bật là khối lượng chồi, số lá, chiều dài lá, số chồi, tỷ lệ sống sót. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức C0; C1 và C2. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức C3, C4 và C5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần thứ 6, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt về hình thái. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3; đồ thị 3.3; hình 3.5; hình 3.6. 51
  62. Bảng 3.3. Ảnh hƣởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy N Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Đƣờng Chiều Tỷ lệ Đặc điểm T độ lƣợng lƣợng (chồi/mẫu) (lá/cây) kính lá dài lá sống sót (mg/l) tƣơi (g) khô (g) (cm) (cm) (%) Cây phát triển xanh tốt, lá to xanh, C0 0 7,643a 0,374a 323,66a 152,33a 0,80a 1,43a 100 nhiều chồi, nhiều lá C1 5 1,444d 0,113c 47,66c 28,33cd 0,06c 0,16cd 66 Cây phát triển không tốt, lá nhỏ và ít. Cây phát triển đều, nhiều chồi, lá và mẫu C2 10 3,236b 0,243b 133,00b 63,33b 0,50b 0,80b 95 sống tốt. C3 15 1,919c 0,071c 32,00d 33,66c 0,13c 0,20cd 70 Cây phát triển không đều, chồi ít, ít lá, C4 20 1,246d 0,127c 25,00d 25,00d 0,20c 0,40c 68 Cây phát triển không đều, mẫu chết dần. Cây phát triển chậm, ít chồi, lá và mẫu C5 25 1,338d 0,074c 21,66d 22,00d 0,16c 0,13d 60 chết nhiều Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 52
  63. 350 300 250 Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 200 Số chồi (chồi/mẫu) 150 Số lá (lá/cây) Đường kính lá (cm) 100 Chiều dài lá (cm) 50 0 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Biểu đồ 3.3. Ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tƣơng ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 mg/l) 53
  64. Hình 3.5. Ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tƣơng ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 mg/l) 54
  65. Hình 3.6. Ảnh hƣởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tƣơng ứng với nồng độ chitosan là: 0; 5; 10; 15; 20; 25 mg/l) 55
  66. Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.3, biểu đồ 3.3, hình 3.5, hình 3.6 sau 8 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Ở nghiệm thức C2 với nồng độ 10 mg/l chitosan, cây phát triển xanh, chồi được phát triển nhiều C2 (133 chồi/mẫu) gấp 2,7 lần C1 (47,66 chồi/mẫu), trọng lượng tươi đạt ở mức cao nhất với các nghiệm thức được bổ sung nồng độ chitosan thay đổi ( 5; 10; 15; 20; 25), trọng lượng tươi của nghiệm thức C2 (3,236 g) gấp 2,2 lần C1. Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là C2 (0,243 g) cao hơn 2,1 lần so với C1 (0,113 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (63,33 lá/cây), lá to và nhiều. Tỷ lệ cây phát triển giảm dần ở các nghiệm thức C1, C3, C4, C5. Ở nghiệm thức C0 cây phát triển bình thường, phát triển ổn định ở các chỉ tiêu. Ở nghiệm thức C1 cây phát triển không tốt, lá nhỏ và ít với C1 (28,33 lá/cây) với số chồi (47,66 chồi/mẫu) và tỷ lê sống sót chiếm 66%. Ở nghiệm thức C3 cây phát triển không đều, chồi ít (32,00 chồi/mẫu) và khối lượng khô nhỏ (0,071 g) Ở nghiệm thức C4 cây phát triển không đều với khối lượng nhỏ (1,264 g), số lá (25,00 lá/cây). Ở nghiệm thức C5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức C0. Về mặt hình thái lá nhỏ, ít chồi, lá của cây có màu xanh nhạt và mẫu chết nhiều vì nồng độ chitosan khá cao làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây. Các kết quả đạt được ở trên cho thấy chitosan có hiệu quả lên sự sinh trưởng của cụm chồi lan Cattleya. Cụm chồi có sự gia tăng số chồi, chiều cao chồi và tỷ lệ 56
  67. tạo rễ ở môi trường có bổ sung chitosan, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Nge và cộng sự, (2006) cũng sử dụng chitosan trong nuôi cấy protocorm lan Dendrobium phalaenopsis với sự tái sinh đạt được tối ưu (5 – 7 cây con, trong 12 tuần) ở nồng độ 20 ppm. Theo Uthairatanakij và cộng sự, (2007), mức độ khử acetyl và nồng độ chitosan có hiệu quả khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của lan nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, các nồng độ chitosan xử lý từ 5 – 25 mg/l trong thí nghiệm này cho hiệu quả lên sự sinh trưởng của cụm chồi lan Cattleya khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu trên cây khoai tây (Solanum tuberosumL.) của Asghari Zakaria và cộng sự, (2009) cũng cho kết quả rằng sử dụng chitosan nồng độ 5 và 15 mg/l có hiệu quả giúp gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây con. Barka và cộng sự, (2004) đã ghi nhận môi trường nuôi cấy bổ sung dung dịch chitosan (chitogel) 1,75% giúp gia tăng sinh khối chồi và rễ, sự quang hợp của cây nho nuôi cấy in vitro. Tóm lại thí nghiệm này cho thấy môi trường MS bổ sung chitosan không phù hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya Hybrid White. 57
  68. CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận Sau 8 tuần nuôi cấy chồi lan Cattleya Hybrid White trên môi trường MS có bổ sung 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính. Từ những kết quả thu được chúng tôi đi đến kết luận như sau: Khi nuôi cấy chồi trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính với 1 mg/l BA (A2) thích hợp cho sự phát sinh chồi tạo cây hoàn chỉnh. Khi nuôi cấy chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính với 1,5 mg/l NAA (B3) thích hợp cho sự phát sinh chồi tạo cây hoàn chỉnh. Khi nuôi cấy chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA, 1,5 mg/l NAA, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính với 5, 10, 15, 20, 25 mg/l chitosan không thích hợp cho sự phát sinh chồi tạo cây hoàn chỉnh. Các chồi cây hình thành giúp có số lượng lớn cây trồng, đồng thời giúp nhân nhanh giống trong quá trình giữ mẫu. 4.2. Kiến nghị Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, thiết bị và hóa chất còn hạn chế nên tôi không thể thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn vì vậy chúng tôi có những kiến nghị sau: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có bổ sung các dịch chiết khác nhau như chuối, táo, khoai tây, cà rốt, đến sự hình thành chồi lan Cattleya Hybrid White. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường có bổ sung các dịch chiết khác nhau như đậu nành, đậu phộng, đậu đỏ, đến sự hình thành chồi của lan Cattleya Hybrid White. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất CuSO4, Na2S2O3, AgSO4, đến khả năng tăng trưởng của chồi và tạo cây hoàn chỉnh lan. Nghiên cứu các điều kiện ánh sáng, giá thể khác nhau để hoàn thiện quy trình nhân giống lan Cattleya Hybrid White đưa cây con ra vườn ươm. 58
  69. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu Tiếng Việt [1]. Nguyễn Tiến Bân ,1990, Các cây hạt kín ở Việt Nam, tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái và tài nguyên sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [2]. Trần Văn Bảo, 2001, Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nhà xuất bản Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh. [3]. Bùi Bá Bổng. 1995. Nhân giống cây bằng nuôi cấy mô. Sở khoa học và công nghệ môi trường An Giang. Xí nghiệp in An Giang. [4]. Đỗ Huy Bích, 2004, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật [5]. Nguyễn Minh Chơn. 2010. Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật. NXB Đại Học Cần Thơ. [6]. Phạm Hoàng Hộ, 1992, Cây cỏ miền Nam Việt Nam, quyển 1,2. Bộ Giáo dục, Hà Nội. [7]. Trần Hợp, 1990, Phong lan Việt Nam, tập 1,2. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [8]. Dương Công Kiên. 2007. Hoa hồng kỹ thuật trồng chăm sóc và trang trí. Nhà xuất bản Nông nghiệp. [9]. Hoàng Xuân Lam, 2006, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, đại học Nông nghiệp Hà Nội. [10]. Nguyễn Xuân Linh, Phạm Thị Liên, 1998, Sa Pa nguồn lan rừng quý hiếm, Tạp chí Rau hoa quả số 1/ 1998. [11]. Nguyễn Xuân Linh, 2000, Kỹ thuật trồng hoa, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [12]. Nguyễn Xuân Linh, 2002, Điều tra, thu thập, đánh giá, bảo tồn nguồn gen hoa cây cảnh khu vực miền Bắc Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp. [13]. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên. 2002. Công nghệ tế bào. NXB Đại Học Quốc Gia. TP. Hồ Chí Minh. 59
  70. [14]. Lê Võ Thùy Ngân. 2011. Hiệu quả của BA, TDZ, NAA và AgNO3 trên sự tạo chồi, nhân chồi và sinh trưởng cây Đỗ quyên (Rhododendron sp.) in vitro. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Hoa viên - cây cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Đại Học Cần Thơ. [15]. Nguyễn Công Nghiệp, 2000, Trồng hoa lan, Nhà xuất bản Trẻ. [16]. Vũ Thị Phượng, 2005, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp, đại học Nông nghiệp Hà Nội. [17]. Đặng Phương Trâm. 1997. Nhân giống vô tính cây đu đủ (Carica papaya L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Luận văn thạc sĩ Nông Học. Đại Học Cần Thơ. [18]. Nguyễn Bảo Toàn. 2010. Giáo trình Nuôi cấy mô và tế bào thực vật. NXB Đại Học Cần Thơ. [19]. Nguyễn Nghĩa Thìn, 1997, Cẩm nang nghiên cứu đa dạng sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [20]. Minh Trí, Xuân Giao, 2010, Kỹ thuật trồng hoa lan, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ [21]. Bùi Trang Viêt (2000) Sinh lý thực vật đại cương. Phần II- Phát triển, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [22]. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng và Lê Hồng Điệp. 2006. Công nghệ sinh học tế bào. Nhà xuất bản Giáo dục. [23]. Vũ Văn Vụ. 1999. Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo Dục. Hà Nội. [24]. Ngô Quang Vũ, 2002, Những con số hấp dẫn về thị trường lan cắt cành thế giới, Tạp chí Hoa cảnh tháng 10/ 2002. 2. Tài liệu Tiếng Anh [25]. Asghari-Zakaria R., B. Maleki-Zanjani, E. Sedghi. 2009. Effect of in vitrochitosan application on growth and minituber yield of Solanum tuberosum L. Plant Soil Environ, 55 (6), pp. 252–256. [26]. Dung N. A., Thang N. T. (2004), Effect of oligoglucosamine on the gowtrh and development of peanut (Arachis hypogea L.). In Proceedings of The 6th 60
  71. Asia-Pacific on Chitin, Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D.Hutmacher and L. L. Yong. Singapore, ISBN: 981-05-0904-9. [27]. Hadwiger, Klosterman S.J., Choi, J.J. (2002), The mode of action of chitosan and its oligomers in inducing plant promoters and developing disease resistance in plants, Advances in Chitin Science, Vol 5:. 452-457. [28]. Limpanavech P., Pichyangkura R., Khunwasi C., Chadchawan S., Lotrakul P., Bunjongrat P., Chaidee A., Akaraeakpanya T. 2003. The effects of polymer type, concentration and %DD of bicatalyte modified chitosan on flora production of Dendrobium‘Eiskul’.National chitin-chitosan conference July 17-18, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand, pp. 60-64. [29]. Murashige T. & F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol., 15, pp. 473 – 74 [30]. Nghe K.L.,New N., Suwalee C., Willem F. S. (2006), Chitosan as a growth stimulator in orchid tisse culture, Plant Science. 170, pp.1185-1190 [31]. Segerback, L.B, 1983, Propagation and Phisiology of orchids Horticuturial, Rewiew [32]. Suwalee, Chandrkrachang (2002), Study on utilization of chitinous materials, Advances in Chitin Science, Vol. 5: 458-462. [33]. Soebijanto; Widiastoety,-D; Swanda, 1988, The effect of Atonik on Orchid (Laeliocatteya sp) plants, Buletin- Penelitian- Hortikultura. [34]. Uthairatanakij A., Jaime A. Teixeira da Silva, and K. Obsuwan. 2007. Chitosan for Improving Orchid Production and Quality. Orchid Science and Biotechnology, 1(1), pp. 1-5. [35]. Widiastoety,-D; Bahar,-F.A,1995, The influence of light intensify on the growth of young Dendrobium orchid, Journal- Hortikultura (Indonesia). 3. Tài liệu Internet [36]. 375&dq=Cheng+v%C3%A0+Smith+(1973)+in+vitro&source=bl&ots=s4izJ hJmfY&sig=cI1cW_lHDsKrvBBvPrrwZT8_0Y&hl=vi&sa=X&ved=0ahUK 61
  72. Ewiv8Ou1svOAhWDu48KHfJoCFcQ6AEIGzAA#v=onepage&q=Cheng%2 0v%C3%A0%20Smith%20(1973)%20in%20vitro&f=false [37]. aramillo+v%C3%A0+Summers+(1990)++in+vitro&hl=vi&sa=X&ved=0ah UKEwipj5Xb18vOAhWMpY8KHZV4CMwQ6AEIIjAB#v=onepage&q=Jar amillo%20v%C3%A0%20Summers%20(1990)%20%20in%20vitro&f=false [38]. oligomer-trong-nuoi-cay-mo-khoai-lang-cao-san-nhat-ban-ipomoea-batatas- l 70545/ 62
  73. PHỤ LỤC Phụ lục A: Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần mg/1 NH4NO3 1650 KNO3 1900 Mg2SO4.7H2O 370 Khoáng đa lượng CaCl2.2H2O 440 KH9PO4 170 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6 CUSO .5H O 0,025 4 2 KI 0,83 COC12.6H2O 0,025 Khoáng vi lượng H3PO3 6,2 Na2MoO4.2H2O 0,025 Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Các vitamin và các chất hữu cơ khác Pyridoxine HC1 0,5 Thiamine HC1 0,1 Glycine 2 1
  74. Phụ lục B: Các số liệu được xử lý bằng chương trình phần mềm SAS 9.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tăng trưởng chồi lan Cattleya Hybrid White Trọng lượng tươi The SAS System 1 21:41 Thursday, August 13, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values KHOILUONGTUOI 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 21:41 Thursday, August 13, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 72.51633917 14.50326783 58.85 F KHOILUONGTUOI 5 72.51633917 14.50326783 58.85 <.0001 The SAS System 4 21:41 Thursday, August 13, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.246462 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.8832 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N KHOILUONGTUOI A 7.4157 3 A2 B 3.1743 3 A1 B 2
  75. C B 2.3647 3 A5 C C 2.1700 3 A0 C C 1.8077 3 A4 C C 1.5287 3 A3 Trọng lượng khô The SAS System 1 22:58 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values khoiluongkho 6 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The SAS System 2 22:58 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 4.49891852 0.89978370 43.73 F khoiluongkho 5 4.49891852 0.89978370 43.73 <.0001 The SAS System 4 22:58 Thursday, August 14, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 0.020574 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 0.2552 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N khoiluongkho A 1.7628 3 A2 B 0.6044 3 A5 B 3