Đồ án Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học

92 trang thiennha21 13/04/2022 5660

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_lua_chon_thuc_an_de_nhan_nuoi_sau_khoang_so_luong_lon.pdf

Nội dung text: Đồ án Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỰA CHỌN THỨC ĂN ĐỂ NHÂN NUÔI SÂU KHOANG SỐ LƯỢNG LỚN PHỤC VỤ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn :TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện :Thạch Lai Huône MSSV :1411100043 Lớp :14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỰA CHỌN THỨC ĂN ĐỂ NHÂN NUÔI SÂU KHOANG SỐ LƯỢNG LỚN PHỤC VỤ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn :TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện :Thạch Lai Huône MSSV :1411100043 Lớp :14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nguyên cứu này là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai, bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. TPHCM, Ngày tháng năm Sinh viên thực hiện đồ án
ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Cô TS. Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian học, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất về tinh thần và vật chất trong quá trình nguyên cứu, chỉnh sửa chu đáo nội dung và hình thức luận văn. Đặt biệt, Cô đã tận tâm động viên, lo lắng những lúc em gặp khó khăn trong quá trình hoàn thành đồ án này. Nhân đây, em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô của Khoa Công Nghệ Sinh Học đã cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành và bảo vệ đồ án. Cuối cùng, con xin chân thành biết ơn Ba, Mẹ, Em đã khuyến khích, động viên và chăm lo các công việc gia đình để con hoàn thành đồ án này. TPHCM, Ngày tháng năm Sinh viên thực hiện đồ án
iii TÓM TẮT Việc nhân nuôi sâu khoang trên thức ăn nhân tạo từ sâu tuổi 1 đến trưởng thành được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 270 ± 10 C, ẩm độ 65 ± 5%. Kết quả đã xác định được thành phần thức ăn gồm đậu trắng (200g), đậu nành(10g), tinh bột (30g), men bánh mì (30g), Vitamin E (10ml), Vitamin tổng hợp(10ml), Methyl paraben (2.5g), Ascorbic acid (1.5g), agar (10g), formalin 40% (1ml), nước cất (1000ml) là thích hợp nhất để sản xuất sâu khoang (Spodoptera litura) với các chỉ tiêu trọng lượng sâu 10 ngày tuổi đạt 0.53 g; thời gian phát dục của sâu non là 15,25 ngày; tỷ lệ sâu vào nhộng đạt 91,33%; tỷ lệ nhộng vũ hóa là 92,96%; khả năng đẻ trứng là 6.33 ổ trứng/con cái; giá thành cho một mẻ thức ăn của công thức này là 26.578đ, nuôi được 200 sâu. Từ khóa: Sâu khoang Spodoptera litura, thức ăn nhân tạo sâu non
iv ABSTRACT SELECTION OF ARTIFICIAL DIET FOR MASS REARING OF THE TOBACCO CATERPILLAR, SPODOPTERA LITURA The aim of research is evaluate a artificial diet for mass rearing of Spodoptera littoralis. The result showed that ingredients consisted of cowpea (200g), soybean (10 g), Starch (30g), yeast (30g), vitamin E (10ml), synthetic vitamin(10ml), Ascorbic acid (1.5g), Methyl paraben (2.5g), agar (10g), formalin 40% (1ml), Distilled water (1000ml) was the best for mass rearing of Spodoptera littoralis. This artificial diet successfully supported the growth and development with larval weight (10 days old) was 0.53g, larval period were 15.25 days respectively , the Percentage to Pupation and Adult emergence were 91.33 and 92.96% respectively. The Fecundity was 6.33 egg mass per femalen. The cost of 1 batch of diet was VND 26.578, on which 200 neonate larvae can be reared. Key words: tobacco bollworm Spodoptera litura, artifical diet, caterpillar
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 1 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của đề tài 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU 3 1.1 GIỚI THIỆU VỀ SÂU KHOANG 3 1.1.1 Đặc điểm gây hại 3 1.1.2 Đặc điểm hình thái 4 1.1.3 Đặc tính sinh học 7 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỨC ĂN NHÂN TẠO NHÂN NUÔI SÂU Ở NƯỚC NGOÀI 9 1.2.1 Nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu ở nước ngoài 9 1.2.2Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn thêm đến sự phát triển của trưởng thành. 18 1.3 Tình hình nghiên cứu thức an nhân tạo nhân nuôi sâu khoang Ở Việt Nam 19 1.4 Kỹ thuật nuôi nhân sâu hàng loạt 21 1.4.1 Các biện pháp vệ sinh phòng bệnh khi nuôi nhân sâu 22 1.4.2 Biện pháp chống thoái hóa quần thể sâu nuôi 22 1.4.3 Kỹ thuật nhân nuôi sâu khoang 23
iv 1.5 Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng 24 1.5.1 Đặc điểm hình thái: 24 1.5.2 Cấu trúc NPV 24 1.5.3 Quy trình sản xuất NPV 26 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật Liệu Và Đối Tượng Nguyên Cứu 28 2.1.1 Nguồn sâu làm thí nghiệm 28 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 28 2.2 Nội Dung Nguyên Cứu 29 2.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 29 2.3.1 Xác định công thức thành phần thức ăn nhân tạo để nhân nuôi ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura). 29 2.3.2 Xác định thức ăn thêm để nuôi trưởng thành sâu khoang (Spodoptera litura) 33 2.3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV 34 CHƯƠNG 3 37 KẾT QUẢ NGUYÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1. Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn 37 3.1.1. Trọng lượng sâu tuổi 3 37 3.1.2. Trọng lượng nhộng 39 3.1.3.Thời gian phát dục của sâu non 39 3.1.4. Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang 40 3.1.5.Thời gian sống của trưởng thành 43 3.1.6. Khả năng sinh sản của trưởng thành 43 3.2. Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành 45 3.2.1. Thời gian sống của trưởng thành được cho ăn thêm 45 3.2.2. Khả năng sinh sản của trưởng thành được cho ăn thêm 46
v 3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV 47 3.3.1 Số sâu chết 47 3.3.2 Hiệu lực gây chết 48 3.3.3 Trọng lượng sâu 48 3.3.4 Lượng virus/ sâu 49 3.4 Giá thành nuôi sâu ở các công thức 51 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 4.1. Kết luận 54 4.2. Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh NPV: Virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus). CT1: Công thức 1 CT2: Công thức 2 CT3: Công thức 3 CT4: Công thức 4 CT5: Công thức 5 CT6: Công thức 6 CT7: Công thức 7
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo cải tiến của Shorey và Hale (1965) 10 Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn dùng trong thí nghiệm 31 Bảng 3. 1: Trọng lượng sâu tuổi 3 37 Bảng 3. 2: Trọng lượng nhộng 39 Bảng 3. 3: Thời gian phát dục của sâu non 40 Bảng 3. 4: Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo 41 Bảng 3. 5: Thời gian sống của trưởng thành 43 Bảng 3. 6: Khả năng sinh sản của trưởng thành ở các công thức 44 Bảng 3. 7: Thời gian sống của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm 45 Bảng 3. 8: Khả năng sinh sản của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm 47 Bảng 3. 9: Số sâu chết khi cho ăn thức ăn nhiễm NPV 48 Bảng 3. 10: Trọng lượng của sâu chết sau khi được cho ăn thức ăn nhiễm NPV 49 Bảng 3. 11: Sản lượng virus đạt được khi nhiễm sâu trên các loại thức ăn 50 Bảng 3. 12: Chi phí thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang của các công thức 52 Bảng 3. 13: Chi phí thức ăn nhân tạo nuôi nhộng bằng các công thức 53
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Trưởng thành sâu khoang (EPPO,2015) 4 Hình 1.2 : Trứng sâu khoang (A)Trứng được đẻ thành ổ , (B) Trứng được nhìn dưới kính hiển vi (EPPO,2015) 5 Hình 1.3:Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura(EPPO,2015) 6 Hình 1.4 : Nhộng sâu khoang (EPPO,2015) 6 Hình 1. 5. Vòng đời sâu khoang ( Spodoptera litura) 7 Hình 1.6: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al, 2003) 25 Hình 2.1:Công thức thức ăn nhân tạo và công thức đối chứng (A: công thức 1, B: công thức 2, C: công thức 3,D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu) 32 Hình 2.2: Lây nhiễm vi rút lên thức ăn nhân tạo 35 Hình 3.1: Sâu khoang được nuôi bằng các công thức ( A : công thức 1; B: công thức 2; C: công thức 3; D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu) 38 Hình 3. 2: Biểu đồ tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa cảu sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo 41 Hình 3.3: Trưởng thành chết sau khi sinh sản 43 Hình 3. 5: Ổ trứng sâu khoang (A) sâu khoang mới nở (B) 44 Hình 3. 6: Sâu chết do nhiễm NPV 51
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong xu hướng hội nhập với quốc tế, hiện nay nhu cầu đòi hỏi của sản xuất nông nghiệp hữu cơ là rất lớn, cần thiết phải sản xuất ra các chế phẩm vi sinh trừ sâu, bệnh hại nhằm thay thế thuốc trừ sâu hóa học. Tuy các chế phẩm sinh học trừ sâu, bệnh hại cây trồng ở nước ta mới chỉ đạt một số lượng ở mức khiêm tốn. Nhưng thực tế các chế phẩm sinh học đã mang lại hiệu quả vô cùng to lớn cả về kinh tế, kỹ thuật, xã hội đặc biệt là môi trường, được xã hội công nhận và nhiều nông dân ở các địa phương triển trai ứng dụng. Trong đó, việc kiểm soát sâu khoang bằng thuốc hóa học đã gây nhiều khó khăn vì tính kháng thuốc của sâu rất cao. Sâu khoang, Spodoptera litura Fabriciusn, là loài sâu ăn tạp có phổ ký chủ rộng, gây hại trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt là các loại rau ăn quả và ăn lá. Việc quản lý đối tượng này bằng thuốc trừ sâu ngày một khó khăn do sâu có khả năng kháng thuốc rất cao. Sử dụng thuốc hóa học ngoài việc gây tác động xuất đến môi trường hệ sinh thái, thuốc hóa học còn gây nên tồn lưu trong nông sản. Vì thế, biện pháp sinh học là một trong những giải pháp thích hợp. NPV (Nucleopolyhedrosis ký sinh sâu khoang) là tác nhân sinh học được chứng minh có hiệu quả cao đối với sâu khoang ăn tạp (Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hoài Hương 2015). Việc nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhằm cung cấp một lượng sâu khỏe, đồng đều để phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Chính vì vậy, học viên tiến hành nghiên cứu đề tài “Lựa chọn thức ăn để nhân nuôi sâu khoang Spodoptera litura Fabricius phục vụ sản xuất chế phẩm NPV” 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn. Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành. Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV
2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã xác định được các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của sâu khoang trên các loại thức ăn khác nhau để từ đó đưa ra được loại thức ăn phù hợp để nhân nuôi và lây nhiễm sâu khoang cũng như nồng độ thức ăn thêm để nuôi trưởng thành sâu khoang Spodoptera litura, phục vụ cho sản xuất NPV (Nucleopolyhedrosis virus) trừ sâu khoang hại cây trồng thay thế cho thuốc hóa học, bảo đảm an toàn cho con người, gia súc và hệ thiên dịch, chống ô nhiễm môi trường, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền vững.
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ SÂU KHOANG Tên khoa học: Spodoptera litura Fabricius, thuộc họ: Ngài đêm (Noctuidae), bộ: cánh vảy (Lepidoptera). 1.1.1 Đặc điểm gây hại Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) là loài sâu gây hại nguy hiểm cho nền nông nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương. Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistans, Triều Tiên, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, Bắc Phi, Ai Cập, châu Âu và các nước Đông Nam Á như Lào, Campuchia, Mianma, Malaysia (Nadeem et al.,2008; Shivayogeshwar, 1991; Hill, 1993; Singh and Jalali,1997). Ở Ai Cập, sâu hại bông chính là Spodoptera littoralis(Boisd) và cần áp dụng nhiều loại thuốc trừ sâu (Sorour et al,2011; Shaurub et al, 2014). Ở nước ta sâu khoang có mặt ở hầu hết các tỉnh thành. Sâu khoang là loài đa thực, còn được gọi là sâu ăn tạp gây hại trên tất cả các loại cây trồng, là đối tượng gây hại nặng trên rau, trong đó có nhiều loại rau như: Bắp cải, rau diếp, su hào, xà lách, súp lơ, cà chua, cà bát, đậu đũa, đậu vàng, khoai tây, khoang lang, khoai sọ, rau muống, bầu bí, bông, thuốc lá, lạc, thầu dầu, đậu tương (Gao et al, 2004;Qin et al,2004;Hilll, 1993; Rao et al,1993), (Nguyễn Văn Đỉnh và CTV, 2012). Sâu khoang có thể gây hại trên 200 loại cây trồng (Sigh, Jalali,1997), (Lê Thị Sen và Nguyễn Văn Huỳnh,2004). Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. Sâu non tuổi nhỏ thường gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chóng làm lá cây xơ xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm phẩm chất. Sâu non ưa điều kiện nóng ẩm. Nên ở Việt Nam sâu khoang phát triển quanh năm và phát sinh thành dịch ở nhiểu vùng như Bắc Cạn (năm 2011), sâu tàn phá hết những cánh đồng khoai môn ở Quảng Nam Đà Nẵng ( Theo
4 báo Quảng Nam năm 2013) và gần đây chúng phát sinh sinh thành dịch và gây hại nặng lên cây ớt, đậu, dưa hấu ở các tỉnh miền Trung. Năm 2016, tại thành phố Hồ Chí Minh, sâu khoang xuất hiện và gây hại trên 360ha rau (Báo của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn thành phố Hồ Chí Minh, 2016). Đặc biệt trên cây rau muống nước, sâu khoang là đối tượng dịch hại chính (Chi cục Bảo vệ Thực vật thành phố Hồ Chí Minh). Để trừ sâu khoang hại rau muống nước, nông dân sử dụng và pha trộn nhiều chủng loại thuốc khác nhau ( Theo kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển nông thôn) không những làm tăng chi phí sản xuất mà còn làm tăng tồn dư hóa chất trên cây rau muống, tăng nguy cơ ngộ độc cho người tiêu dùng và làm ô nhiễm môi trường. 1.1.2 Đặc điểm hình thái Trưởng thành có chiều dài thân khoảng 20-25mm, sải cánh rộng từ 35-45mm. Cách trước màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng óng ánh.(EPPO) Hình 1.1 : Trưởng thành sâu khoang (EPPO,2015)
5 Trứng được đẻ thành ổ, bên trên có phủ lớp lông từ cơ thể của trưởng thành cái. Trứng có hình bán cầu, đường kính từ 0,4 - 0,5mm. Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ô nhỏ. Trứng mới nở có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu tro đậm. Ổ trứng có phủ lớp lông màu nâu vàng từ bụng bướm mẹ (EPPO,2015) A B C Hình 1.2 : Trứng sâu khoang (A) Trứng được đẻ thành ổ , (B) Trứng được nhìn dưới kính hiển vi (EPPO,2015) Sâu non mới nở màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to. Sâu non đẩy sức có màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất có khoang đen to nên được gọi là sâu khoang. Sâu có 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hóa nhộng dài 38-50 mm. Sâu làm nhộng trong đất (EPPO,2015).
6 Hình 1.3:Ấu trùng sâu khoang Spodoptera litura(EPPO,2015) Nhộng dài từ 18-20mm, có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được hình thành, sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hoá, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng có thể cử động được. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn.(EPPO,2015) Hình 1.4 : Nhộng sâu khoang (EPPO,2015)
7 1.1.3 Đặc tính sinh học Hình 1. 5. Vòng đời sâu khoang ( Spodoptera litura) Trưởng thành sống từ 5 đến 8 ngày, thời gian trứng kéo dài từ 2 đến 6 ngày, Sâu non có 5 đến 6 tuổi. Thời gian phát dục cùa sâu non là 12-37 ngày, tiền nhộng từ 1 đến 4 ngày, nhộng từ 4 đến 14 ngày và vòng đời của sâu khoang từ 20-64 ngày. Sâu mới nở ăn một phần vỏ trứng và sống tập trung 1-2 ngày. Sâu tuổi 1-2 chỉ ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng, từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá. Ở tuổi lớn sâu không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành, trái non. Trưởng thành sâu khoang thường bay hoạt động về chiều và đêm. Ban ngày,trưởng thành thường đậu ở mặt sau lá hoặc những nơi kín đáo của bụi cây, ngọn cỏ. Trưởng thành bay khỏe, mỗi lần có thể bay xa đến vài chục mét và cao đến 6-7 mét. Trưởng thành ưu các chất mùi chua ngọt và ánh sáng đèn. Trưởng thành cái sau khi vũ hoá một vài giờ có thể giao, sau đó ngài đẻ trứng ngay hoặc vào đêm sau. Trưởng thành đực trong 1-2 đêm có thể giao phối được với 8 con cái. Con cái qua giao phối trong một đêm thì có được số lượng tinh trùng đủ để hình thành trứng thụ
8 tinh trong 7 ngày. Trưởng thành sâu khoang ưa thích đẻ trứng ở nơi tối và đẻ một vài ổ trong một đêm. Con cái không giao phối cũng đẻ trứng nhưng số lượng trứng đẻ ra ít hơn so với số lượng trứng đẻ ra của con cái giao phối. Tần suất giao phối không ảnh hưởng tới thời gian đẻ trứng, sự giao phối nhiều không ảnh hưởng tới tuổi thọ con cái mà kích thích con cái đẻ trứng (On Yang S.C., et al 1991) (Chu Y.I et al 1991). Trưởng thành sâu khoang có khả năng chọn lọc cây ký chủ để đẻ trứng, chúng thích đẻ trứng trên cây thầu dầu hơn là trên cây đậu đũa, bông Nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ của trưởng thành: Ở nhiệt độ cao trưởng thành sống thời gian ít hơn so với trưởng thành sống ở nhiệt độ thấp. Thức ăn cũngả nh hưởng đến tuổi thọ của trưởng thành: Trưởng thành nuôi bằng mật ong 20% sống lâu hơn so với trưởng thành nuôi bằng nước đường 20%. Trưởng thành sâu khoang đẻ trứng thành ổ. Ổ trứng thường được tìm thấy ở mặt dưới lá, phần lớn ở những nơi phân nhánh của gân lá. Sâu non mới nở sống tập trung với nhau, nếu bị khua đông nhẹ sâu có thể bò phân tán ra xung quanh hoặc nhả tơ dong mình rơi xuống. Sâu non khi lớn lên thì có phản ứng đối với ánh sáng rỏ rệt, có nghĩa là sâu có hiện tượng trốn tránh ánh sáng cho nên về ban ngày sâu thường ẩn náu ở những nơi tối như khe nứt nẻ của đất. Trong những ngày trời mưa râm hoặc mưa nhẹ thì ban ngày người ta cũng thấy sâu non bò hoạt động trên cây. Thời gian sinh trưởng và phát dục của sâu non phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và thức ăn. Sâu khoang phát triển đến tuổi 6 thì chui xuống đất làm kén hình bầu dục và nằm yên trong đó hóa nhộng. Đất có hàm lượng nước 20% thích hợp cho sâu hóa nhộng, nếu đất quá khô hoặc quá ướt điều không thuận lợi cho việc hóa nhộng của sâu. Sâu khoang ưa nhiệt độ ấm nóng, độ ẩm cao. Nhiệt độ thích hợp cho các pha phát dục của sâu khoang 270 ± 10 C và độ ẩm thích hợp 65 ± 5%. Đối với sâu nuôi trong phòng thí nghiệm thì ngài thích đẻ trứng trên giấy xù xì hơn là trên giấy trơn nhẵn. Ngài có thể đẻ được trung bình 200 đến 3000 trứng, tùy thuộc vào từng loại thức ăn mà ngài ăn thêm thì ngài đẻ ít hay nhiều trứng.
9 Thiên địch của sâu sâu khoang như các loài ăn mồi (bọ rùa, kiến, bọ xít ăn thịt, bọ cánh cứng), ong kí sinh (Cotesia prodeniae, Telenomus remus), Vi khuẩn BT, virus nhân đa diện (NPV). 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỨC ĂN NHÂN TẠO NHÂN NUÔI SÂU Ở NƯỚC NGOÀI 1.2.1 Nghiên cứu thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu ở nước ngoài Nuôi nhân côn trùng hàng loạt các loại sâu hại họ Ngài đêm (Noctuidae) đã được bắt đầu từ lâu, nhưng chỉ nuôi sâu non bằng lá cây, thân cây và các bộ phận sinh dưỡng của các cây ký chủ như lá cây, hoa, quả bông Các loại thức ăn tự nhiên này được để trong hộp nhựa cùng với sâu non Nhân nuôi côn trùng là một công việc phức tạp, đòi hỏi nhiều chi phí, một trong những chi phí nhiều là chi phí về thức ăn cho việc nuôi nhân côn trùng. Tùy theo từng loại côn trùng nuôi nhân mà tiêu tốn thức ăn khác nhau. Trong những năm 60 của thế kỷ này, sâu non họ Ngài đêm (Noctuidae) được nuôi nhân hàng thức ăn nhân tạo. Môi trường thức ăn nhân tạo ra đời lúc đầu làm giảm bớt công trồng các loại cây thực liệu, giải quyết được việc khan hiếm thức ăn trong những mùa vụ không thích hợp, làm tăng sản lượng sâu nuôi. Tuy nhiên vẫn chưa nuôi được sâu ở quy mô lớn (Harell E. A., et al., 1973). Bottger (1942) là người đầu tiên đã tiến hành nuôi sâu cánh vảy, cụ thể là loài sâu đục thân bắp (Ostrinia nubilalis) bằng thức ăn nhân tạo. Sau đó, sâu hồng Pectinophora gossypiella là loài sâu đa thực đầu tiên được nuôi trên thức ăn nhân tạo có cơ chất chính là lúa mì bởi Vanderant và Reiser (1956). Từ đó, nhiều loại thức ăn nhân tạo đã được phát triển để nuôi nhiều loài sâu bộ cánh vảy khác. Giống như các loài động vật khác, ấu trùng bộ cánh vảy cũng đòi hỏi nguồn protein, carbohydrate, lipid, vitamin, muối khoáng và nước để phát triển. Đối với nguồn protein, nhiều tác giả sử dụng casein, sữa bột, bột đậu nành hay men(yeast) ( Lucas et al, 2016). Nguồn carbohydrate có thể là đường sucrose hoặc nguồn đường khác. Lipid được cung cấp bởi phôi lúa mì (wheat germ), lá phơi khô, dầu bắp. Vitamin được cung cấp dưới dạng hỗn hợp các vitamin hoặc sử dụng men hoặc dịch
10 chiết men. Muối khoáng thường được cung cấp theo thành phần của muối Wesson. Ngoài ra, hầu hết các loài côn trùng đều cần vitamin C và choline (Morton, 1979). Thức ăn phải được chế biến ở dạng đặc mềm thích hợp với kiểu miệng nhai của côn trùng. Lúc đầu, người ta thêm gellatin nhưng không thích hợp cho việc bảo quản và do vậy, người ta đã thay thế bằng agar. Năm 1962, Erma S. Vanderzant đã thí nghiệm nuôi sâu xanh đục quả Helicoverpa armigera bằng thức ăn nhân tạo với thành phần gồm: 3g phôi lúa mì; 3,5g casein; 3,5g sucrose; 1g muối Wesson; 1ml vitamin và inositol; 0,1g cholin chloride; 0,4g ascorbic acid; 2,5g agar và 85ml nước. Để hạn chế các vi sinh vật lây nhiễm, tác giả cho thêm 0,2g potasium sorbate và 0,2g methyl parahydroxy benzoate. Sau đó, khi thức ăn nguội xuống đến 400C, tác giả còn bổ sung thêm vitamin C. Kết quả cho thấy, tỷ lệ hóa trưởng thành lên đến 67 – 88%. Thời gian phát dục của sâu non, nhộng tương ứng là 12 ngày và 9 ngày và vòng đời kéo dài 25 ngày. Năm 1965, Shorey và Hale đã cải tiến hai khẩu phần thức ăn nhân tạo đã được công bố trước đó, bằng cách thay thế agar với tinh bột theo tỷ lệ nhất định từ một thành phần thức ăn nhân tạo chuẩn, nhằm đánh giá sự thay thế agar bằng tinh bột ảnh hưởng như thế nào đến sự sinh trưởng của Spodoptera littoralis. Bảng 1.1: Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo cải tiến của Shorey và Hale (1965) Công Công Thành phần Công thức gốc thức thay thức thay đổi A đổi B Agar ( g) 60,0 20,0 30,0 Tinh bột ( g) 0,0 150,0 150,0 Men bia ( g) 150,0 150,0 150,0 Ascorbic acid ( g) 15,0 15,0 15,0 Methyl p- hydroxyl benzoate ( mg) 9,5 9,5 9,5 Sorbic acid ( g) 5,0 5,0 5,0 Formaldehyde 40% ( ml) 10,0 10,0 10,0 Nước cất ( ml) 2000,0 2000,0 2000,0
11 Kết quả cho thấy rằng, Spodoptera littoralis khi nuôi trên ba loại môi trường cho tỷ lệ khác biệt đáng kể (p-value < 0,05). Trọng lượng sâu trung bình ở công thức gốc là 191,94±104,61 mg và 739,05±274,26 mg, ở công thức thay đổi A là 249,16±99,35 mg và 935,67±283,51 mg, và công thức thay đổi B là 208,93±101,51 mg và 892,97±209,36 mg. Tỷ lệ sâu hóa nhộng ở các công thức lần lượt là: 97,22±3,02 %, 97,03±2,53 %, 98,23±2,73 %. Tỷ lệ nhộng vũ hóa ở công thức gốc đạt 96,14±2,47 %, công thức thay đổi A đạt 97,50±2,61 % công thức thay đổi B đạt 98,04±1,96 %. Thời gian phát dục của sâu ở từng công thức đạt lần lượt là: 14,15; 13,78; 14,15 ngày. Nghiên cứu công thức tạo thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang Spodoptera littoralis(Boisd) được thực hiện bởi các tác giả Gupta et (2006), Sorour M.A et al (2006) hay lựa chọn thức ăn nhân tạo với chi phí thấp để nhân sâu xanh (Elvisa S.et al, 2010). Nhằm hoàn thiện công nghệ nuôi nhân hàng loạt nhiều loại côn trùng, trên thế giới đã có nhiều công trình nguyên cứu về môi trường thức ăn nhân tạo nuôi sâu. Môi trường thức ăn nhân tạo nuôi sâu được chia làm môi trường thức ăn tổng hợp và môi trường thức ăn bán tổng hợp. Lúc đầu người ta sử dụng môi trường thức ăn nhân tạo tổng hợp có từ 30-35 chất để nuôi sâu. Các chất này là những nguồn protein, lipid, glucide, hỗn hợp muối khoáng, các kháng sinh và các vitamin. Về sau người ta cảm thấy thức ăn nhân tạo rất đắt tiền và rất khó tìm kiếm các chất để pha chế nên đã cải tiến thành môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp chì có tối đa 25-30 chất, trong đó nguyên liệu chính lấy từ cây ký chủ đã phơi khô và các nguyên liệu khác có nguồn gốc từ thực vật. Môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp cũng chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng: protein, lipid, glucide, cellulose, hỗn hợp muối khoáng, chất kháng sinh và các vitamin cần thiết cho sự phát triển toàn diện côn trùng nuôi nhân. So với môi trường thức ăn nhân tạo tổng hợp thì môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp rẻ hơn vì thế nó được sử dụng rộng rãi trong nhân nuôi hàng loạt nhiều loại côn trùng. Bên cạnh dùng agar là chất dinh dưỡng và kết dính môi trường, người ta còn thay thế agar bằng những chất khác như gelatine, chất keo có trong tảo biển, casein thủy phân, bột ngũ cốc các loại và các phế thải trong công nghiệp chế biến như bã củ
12 cải đường Môi trường thức ăn nhân tạo bán tổng hợp có chứa các chất có nguồn gốc thực vật như các loại: bột cám, bột mì, bột ngô, lõi ngô, mầm lúa mì, mầm mạch nha và các loại lá cây táo, mơ, mận, đào,bột lá khoai lang, bột cây mía, mầm đậu xanh, men, các loại dầu Sau đó, để giảm hơn nữa giá thành thức ăn người ta đã đơn giản hóa môi trường bằng cách sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên và không những để nuôi nhân côn trùng hại mà còn dùng để nuôi các loại côn trùng ký sinh, ăn thịt. Nhiều tác giả nghiên cứu về thức ăn môi trường nhân tạo nuôi sâu lại cho rằng thay thế phần cây ký chủ được nuôi vào thức ăn nhân tạo tổng hợp hay thức ăn nhân tạo bán tổng hợp sẽ làm cho việc nuôi sâu được thuận lợi hơn. Tuy nhiên không phải bao giờ thay thế cây ký chủ bằng thức ăn nhân tạo cũng làm giảm giá thành mà nhiều khi lại làm tăng giá thành. Thay thế hoàn toàn thức ăn tự nhiên bằng thức ăn nhân tạo không phải bao giờ cũng hợp lý. Trong nhiều trường hợp chỉ thay thế một thành phần hóa học trong môi trường bằng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên rẻ tiền đã làm giảm giá thành môi trường thức ăn nhân tạo xuống hoặc đôi khi thêm một ít thức ăn tự nhiên lại làm tăng khả năng đẻ trứng và sức sống của thế hệ sau. Năm 1970, Dimetry đã đưa ra công thức thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang Spodoptera littoralis với thành phần như sau: 120g đậu Vicia faba; 15g men bia; 1,5g ascorbic acid; 1g sodium benzoate; 0,5g sorbic acid; 1ml formaldehyde 40%; 6g agar; 325ml nước cất. Sau khi nuôi sâu qua 3 thế hệ, tác giả cho biết: thời gian phát triển của giai đoạn ấu trùng, nhộng và khả năng sinh sản là bình thường so với kết quả nuôi trên lá thầu dầu. Ấu trùng và nhộng sống sót là 73%, trung bình số trứng của một bướm cái là 2.045 trứng trong 4 ngày đẻ. Năm 1997, Seth và Sharma đã cải tiến khẩu phần ăn bán tổng hợp để phù hợp cho nhân nuôi số lượng lớn sâu khoang. Sự kết hợp khác nhau giữa các thành phần đều được đánh giá dựa trên khả năng tăng trưởng và phát triển tối ưu của loài sâu này. Các công thức bán tổng hợp bao gồm: đậu cheakpea, lúa mì, mầm lúa mì, đậu tương được trộn với nấm men và các chất phụ gia tổng hợp cùng với agar. Trong đó, đậu
13 cheakpea được sử dụng như là nguồn bổ sung carbohydrate chính. Thành phần thức ăn bán tổng hợp được tác giả đề xuất nuôi Spodoptera litura có thành phần như sau: 93,5g hạt đậu cheakpea; 44g casein; 12,5g muối khoáng; 1,25g cholesterol; 19g men bia; 1,25 methyl-p-hydroxybenzoate; 39g đường; 2g sorbic acid; 6,25ml KOH 4M; 2,5ml dầu bắp; 2,5ml dầu hạt lanh; 5,5ml formaldehyde 10%; 3,53ml sinigrin 1%; 7,5g antibiotic và multivitamin; 1,25g choline chloride; 25g agar; 115ml nước cất. Kết quả nghiên cứu cho biết, sâu khoang nuôi bằng thức ăn này có chỉ số tăng trưởng là 2,61; tương đương với nuôi trên lá thầu dầu và cao hơn 20% so với ăn trên thức ăn có cơ chất chính là đậu tương. So sánh khả năng đẻ của trưởng thành có giai đoạn ấu trùng nuôi trên các cơ chất chính là lúa mì, đậu tương và đậu chicpea so với lá thầu dầu, Seth và Sharma (1979) còn cho biết, số trứng đẻ cao nhất ở bướm có sâu nuôi trên đậu chickpea (tương đương với trưởng thành có sâu ăn lá thầu dầu), tiếp đến là đậu tương và sau cùng là lúa mì. Vì vậy, các tác giả cho rằng, thức ăn nhân tạo có cơ chất chính là đậu chickpea là thích hợp nhất để nuôi sâu khoang Spodoptera litura. Nghiên cứu của R.K. Seth và V.P. Sharma đã cho thấy sự cải tiến trong khẩu phần thức ăn nhân tạo đối với sâu khoang. Tuy nhiên, thành phần nguyên liệu trong thức ăn có chứa nồng độ agar cao, tăng nguy cơ làm đông môi trường. Chính vì vậy trong nghiên cứu vào năm 1998 của Ahmed và cộng sự đã thay thế thành phần nguyên liệu agar bằng bột sắn để khắc phục hạn chế này.
14 Bảng 1.2. Thành phần thức ăn dựa trên môi trường agar và bột sắn của Ấn Độ (Ahmed và cộng sự, 1998). Trọng lượng ( g) các chất ở các môi trường Thành phần Ahmed et al Seth et al (1998) (1979) Agar 0,00 7,10 Bột sắn 60,00 0,00 Bột đậu cheakpea 170,40 170,40 Ascorbic acid 2,00 2,00 Men bia khô 4,70 4,70 Vitamin mixture ( mg) 1,42 1,42 Nước cất 1,70 1,70 Tổng cộng 245,98 193,08 Theo Ahmed và cộng sự (1989), thành phần bột sắn là một lựa chọn thích hợp để nuôi liên tục năm thế hệ Spodoptera litura. Tác giả đã thay 7,1g agar bằng 60g bột sắn, tổng hàm lượng của các thành phần còn lại thay đổi khoảng 20%. Đối với khẩu phần ăn dựa trên tinh bột sắn cho mỗi gram thức ăn mà ấu trùng tiêu thụ, thì hàm lượng protein ít hơn gần 20% so với chế độ ăn dựa trên agar. Sự giảm tương tự cũng xảy ra đối với thành phần lipid, vitamin, nhưng gia tăng thành phần carbohydrate. Hàm lượng nước giảm từ 84% của chế độ ăn agar đến khoảng 80% chế độ ăn bột sắn, là một sự thay đổi quan trọng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của côn trùng. Kết quả cho thấy, không có sự sai khác về sự sinh trưởng và phát triển của sâu khi nuôi trên các công thức thức ăn trên. Nuôi các loài côn trùng hại trong phòng thí nghiệm cũng tiêu tốn một lượng thức ăn đáng kể như: Nuôi sâu xám bắp cải (Mamestra brassicae) tiêu tốn 5-10 kg môi trường thức ăn nhân tạo agar mớỉ nuôi được 1000 sâu(CrapeII B.A., 1981). Để thu được 1000 nhộng sâu xanh (H.armigera) cần phải có 15-20 kg môi trường thức ăn nhân tạo
15 agar hoặc môi trường thức ăn nhân tạo không agar (Mohactbipckhh A.,1991). Môi trường thức ăn nhân tạo không những để nuôi nhân côn trùng hại mà còn để nuôi các loài côn trùng ký sinh, ăn thịt (Xie Zhongneng et al.,1989); (Dai Kai jia et al.,1985). Một trong những khó khăn trong nuôi nhân côn trùng họ Ngài đêm (Noctuidạẹ) là tính ăn thịt lẫn nhau của một số loài ở pha sâu non, sự phát sinh nhiều loại bệnh côn trùng trong khi nuôi nhân. Cho đến nay, nhiều loại côn trùng thuộc họ Ngài đêm (Noctuidae) đã nuôi được bằng thức ăn nhân tạo. Trong một số trường hợp côn trùng nuôi bằng thức ăn nhân tạo có ưu điểm hơn so với nuôi côn trùng bằng thức ăn tự nhiên như: Việc sản xuất chế phẩm NPV từ sâu khoang (Spodoptera littoralis) nuôi bằng thức ăn nhân tạo cho sản lượng chế phẩm nhiều hơn so với việc sản xuất chế phẩm NPV từ sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) nuôi hàng thức ăn tự nhiên (Huang Yaxin, 1995) Tùy theo từng tác giả mà thành phần môi trường thức ăn nhân tạo khác nhau: Lúc đầu thành phần môi trường tương đối phức tạp, sau dần dần đơn giản hơn. Năm 2010, Vikash Kumar và cộng sự đã thay đổi đậu chicpea và một số nguồn dinh dưỡng khác như: bột đậu đỏ, mầm lúa mì, cụ thể như sau: 26g mầm lúa mì; 51,3g bột đậu đỏ; 56g bột đậu chickpea; 31,6g men mì; 15,2g casein; 3,2g L-ascorbic acid; 0,5g cholesterol; 2 viên multivitamin capsules; 1 viên vitamin E capsule; 1ml castor oil; 2ml ABDEC drops; 1,8g methyl-p-hydroxybenzoate; 1,3g sorbic acid; 0,25g streptomycin sulphate; 2ml formaldehyde solution; 16,4g agar; 820ml nước cất. Kết quả cho thấy, sâu nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo này có thể phát triển được 10 thế hệ với khả năng phát triển quần thể cao hơn, khả năng hóa nhộng (89,2%), vũ hóa (97,2%), sống sót (86,6%) và sinh sản (2486,2 trứng) cao hơn so với khi nuôi trên thức ăn tự nhiên là lá thầu dầu (với các chỉ số tương ứng là 80, 75, 60% và 480 trứng). Tuy nhiên, lượng agar trong các thành phần thức ăn nhân tạo kể trên chiếm một tỷ lệ khá cao, điều này dẫn đến giá thành của thức ăn cao. Vì vậy, năm 2011, M.A.Sorour và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu giảm lượng agar bằng việc bổ sung
16 tinh bột để nuôi sâu Spodoptera littoralis. Trên cơ sở công thức thức ăn nuôi sâu khoang Spodoptera littoralis của Shorey và Hale (1965), tác giả đã thay thế 20g agar bằng 150g tinh bột. Kết quả cho thấy, sâu nuôi qua năm thế hệ mà không gặp phải tác dụng phụ nào. Trọng lượng của sâu non, nhộng và ấu trùng cũng như tỷ lệ sâu vào nhộng, tỷ lệ nhộng hóa trưởng thành đều tốt hơn so với công thức ban đầu của Shorey và Hale (1965). Hơn thế nữa, giá thành của nguyên liệu cũng giảm 45.6%. Kết quả này đã đưa ra một công thức mới có tính chất kinh tế đầy tiềm năng trong việc sản xuất môi trường nuôi S. littoralis trên diện rộng. Công thức thức ăn nhân tạo của M.A.Sorour và cộng sự gồm các thành phần như sau: 1000g đậu trắng; 20g agar; 150g tinh bột; 150g men bánh mì; 15g ascobic acid; 9,5g methyl-p-hydroxy benzoate; 5g sorbic acid; 10g formaldehyde 40%; 2000ml nước cất. Người ta đưa vào môi trường thức ăn nhân tạo dung dịch muối Wesson (năm 2010) gồm: 1,55g CaCO3; 0,0029g CuSO4.5H2O; 0,1103g FePO4; 0,0015g MnCl2; 0,675g MgSO4; 0,007g KAI(SO4), 0,9g KCl; 2,325g KH2PO4; 0,0038g KCl; 0.785g NaCl; 0.0043 NaF; 1,12g Ca3(PO4)2. . Các chất hóa học chống khuẩn và các chất kháng sinh để chống, ngăn ngừa các loại vi sinh vật gây bệnh cho sâu và làm ô nhiễm môi trường thức ăn. Những vi sinh vật này ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp đến sâu nhân nuôi. Các vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi trong quá trình nhân nuôi bao gồm vi khuẩn, nấm, vi rút, các loại nguyên sinh động vật. Nhiều khi chúng làm sâu nuôi nhân bị chết hoàn toàn. - Vi khuẩn là những tác nhân thường gây thối rữa môi trường thức ăn nhân tạo. Khi môi trường thức ăn nhân tạo bị nhiễm khuẩn, sâu nhân nuôi ăn phải thức ăn này, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào ruột và sinh sản trong cơ thể sâu nuôi. Những loại vi khuẩn gây bệnh cho sâu nuôi như: Streptococcus spp, Aerobacter spp, Proteus spp, Micrococcus spp - Các loại nấm mốc (Aspergillus, Rhizopus, Pennicilium) và nấm men (Saccharomyces) thường sinh sống trên môi trường thức ăn nhân tạo, trên xác và phân sâu Loài nấm Aspergillus thường gây bẩn thức ăn nhân tạo và cản trở sự phát triển của sâu non.
17 - Vi rút gây bệnh thường gặp trong quá trình nhân nuôi các loài sâu non bộ Cánh vẩy (Lepidoptera). Vi rút bền vững với các điều kiện ngoại cảnh. Chúng tồn tại trong phòng nuôi nhân và lan truyền qua không khí. Vi rút còn lan truyền từ sâu non tuổi nhỏ sang sâu non tuổi lớn, từ trưởng thành qua trứng mà truyền bệnh cho sâu non ở thế hệ kế tiếp.Vi rút gây bệnh cho sâu nuôi nhân tồn tại ở hai dạng : dạng tích cực và dạng tiềm ẩn. Vi rút tiềm ẩn trở thành vi rút tích cực gây bệnh cho sâu nuôi khi sâu nuôi nhân gặp những điều kiện bất lợi như sâu nuôi bị đói, độ ẩm không khí cao, nhiệt độ phòng nhân nuôi quá cao hoặc quá thấp. - Nhiều loài nguyên sinh động vật thường gặp trong quần thể nuôi nhân sâu như: Microsporidia, chúng gây cho sâu nuôi mất khả năng sinh sản và lan truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác. Một trong những con đường lan truyền của vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi là qua thức ăn. Để hạn chế vi sinh vật gây bệnh cho sâu nuôi trong các môi trường thức ăn nhân tạo người ta thường đưa vào các chất hóa học chống khuẩn, chống nấm, tác dụng của chúng như: Parapen, acid sorbic có tác dụng chống nấm mốc, nấm men, vi khuẩn; formalin chống nấm mốc và vi rút NPV. - Acid sorbic có tác dụng trừ nấm. Acid sorbic có hiệu quả cao nhất khi độ chua pH của thức ăn là 6,5. - Methyl-p-hydroxybenzoate (metaben, nipagin) trừ nấm mốc, vi khuẩn thường được sử dụng phổ biến trong hầu hết các loại thức ăn nhân tạo để nuôi các loại côn trùng như: bọ cánh cứng (Poecilus capreus), sâu hại đào màu vàng (Conogethes punctiferalis), sâu đục thân (Chilo partellus), sâu xám (Agrotis ypsilon Hubner), sâu xanh (Heliothis armigera), sâu keo da láng (Spodoptera exigua), sâu khoang (Spodoptera littoralis). Metaben tan ít trong nước vì thế người ta thường hòa tan vào dung dịch cồn sau đó mới trộn vào môi trường thức ăn nhân tạo. - Axit propionic được đưa vào thức ăn nhân tạo để chống nấm như đưa vào thức ăn nhân tạo nuôi dâu tằm (Bombyx mori L), sâu xám hại bắp cải (Mamestra brassicae)
18 - Formalin được đưa vào thức ăn nhân tạo để chống nấm và vi rút gây bệnh cho sâu như đưa vào thức ăn nhân tạo nuôi sâu xanh (Heliothis armigera), sâu tơ (Plutella xylostella L). Ngoài ra, người ta còn đưa vào thức ăn nhân tạo nhiều loại kháng sinh như streptomycin sulfate, dihydrostreptomycin, tetracyclin 1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn thêm đến sự phát triển của trưởng thành. Sự ăn của trưởng thành đóng vai trò quan trọng đến sự phát triển quần thể của hầu hết các loài côn trùng cũng như côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Boggs,1986; Henry & Thomas, 1999). Trên đồng ruộng, hầu hết trưởng thành bộ cánh vảy đều ăn mật hoa. Một số loài ăn thêm mật số dịch lỏng khác như: dịch trái cây, chất bài tiết và cả máu của động vật. Trong khi một số loài không cần ăn gì cả, đặc biệt là trưởng thành cái (Kevan & Bakers, 1984). Sự ăn của trưởng thành ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh sản của côn trùng bộ cánh vảy (Wu & Guo, 1996; Fischer et al., 2004). Có cùng nhận xét này, Hou & Sheng (2000), cho biết, trưởng thành ăn thêm sẽ sống lâu hơn và đẻ nhiều hơn. Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn thêm đến thời gian sống, khả năng sinh sản của trưởng thành của loài Spodoptera exigua (Hübner), Tisdale và Sappington (2001) cho biết, thời gian đẻ, số trứng đẻ của trưởng thành ăn mật ong 10% cao hơn so với ăn nước cất. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của thức ăn nuôi trưởng thành đến khả năng sinh sản của một số loài sâu cánh vảy: Anticarsia gemmatalis Hübner, Heliothis virescens (Fabr.), Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) thuộc họ Noctuidae, Diatraea saccharalis (Fabr.) (Crambidae), Gymnandrosoma aurantianum Lima (Tortricidae) và Stenoma catenifer Walsingham (Họ Elachistidae) Milano et al (2010) cho biết, thời gian sống của trưởng thành của các loài : Anticarsia gemmatalis Hübner, Heliothis virescens (Fabr.), Spodoptera frugiperda thuộc họ Noctuidae khi ăn mật ong 10% loài tăng rõ rệt so rệt so với chỉ ăn nước. Sức sinh sản của A. gemmatalis và H. virescens giảm mạnh khi trưởng thành cái chỉ ăn với nước. Trong khi đó, sức sinh
19 sản của các loài Spodoptera frugiperda, G. aurantianum, D. Saccharalis, S. catenifer không khác nhau khi ăn với nước và mật ong 10%. Tác giả kết luận rằng việc bổ sung carbohydrates không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của các loài này. Nghiên cứu ảnh hưởng của thức ăn đến khả năng sống và đẻ trứng của trưởng thành sâu xanh Helicoverpa armigera, Song et al (2007) đã bố trí thí nghiệm bằng cách cho trưởng thành ăn thêm nước cất, mật ong 10%, dung dịch nước đường 5, 10, 15 và 20%. Kết quả cho biết, thời gian sống và số trứng đẻ ở các công thức có ăn thêm mật ong và nước đường đều cao hơn so với chỉ ăn nước cất. Trong đó, số trứng đẻ và thời gian sống ở công thức ăn mật ong 10% thấp hơn so với các công thức chỉ ăn dung dịch nước đường từ 5-20% và không có sự sai khác về khả năng đẻ trứng và thời gian sống giữa các công thức ăn dung dịch nước đường 5,10,15 và 20%. 1.3 Tình hình nghiên cứu thức an nhân tạo nhân nuôi sâu khoang Ở Việt Nam Ở trong nước, nhiều nơi đã nuôi những loài côn trùng trùng để nguyên cứu đặc tính sinh học, cung cấp nguyên liệu cho thử nghiệm đánh giá hiệu lực của thuốt trừ sâu, đánh giá khả năng ký sinh và bắt mồi của các loài thiên địch ( Hà Hùng, 1985), (Phạm Văn Lầm,1994). Từ năm 1989 đến nay, nuôi sâu hàng thức ân nhân tạo cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm như: Nuôi sân cắn gié (Mythimna unipuncta) bằng môi trường thức ăn bản tổng hợp (Nguyễn Văn Cảm và CI'V, 1989), nuôi sâu xanh (H - armigera), sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius), sâu đục thân ngô bằng môi trường thức ăn bán tổng hợp không agar (Nguyễn Văn Cảm và CTV, 1991; Nguyễn Văn Hoa và CTV ,1994). Kỹ thuật nuôi nhân côn trùng đúng sẽ đảm bảo cho tỷ lệ chết thấp (Hà Hùng, 1985). Từ 1989 - 1990, tại trung tâm Nha Hố - Ninh Thuận (dẫn theo Ngô Trung Sơn, 1998) đã thử nghiệm tìm ra thức ăn nhân tạo phù hợp cho sâu xanh Helicoverpa armigera hại bông với các công thức như sau: - Công thức 1 gồm: 100g đậu trắng; 7g muối khoáng hỗn hợp; 30g men bánh mì; 2g methyl paraben; 1g sorbic acid; 13g agar; 2ml formalin 40%; 7g choline chloride; 2ml multivitamin; 0,5g streptomicine; 3g ascorbic acid; 720ml nước cất.
20 - Công thức 2 gồm: 150g đậu xanh; 2,5g methyl paraben; 1,5g sorbic acid; 12g agar; 12g men bánh mì; 3g casein; 3g ascorbic acid; 2ml formalin 40%; 10ml vitamin stock; 0,5g choline chloride; 750ml nước cất. Kết quả thí nghiệm cho thấy, trong hai công thức thức ăn nhân tạo được đưa vào nuôi sâu xanh, thì công thức 2, có cơ chất chính là đậu xanh nuôi sâu tốt hơn hẳn so với công thức 1, có cơ chất chính là đậu trắng. Tỷ lệ sâu tuổi 1 lớn hơn bình thường đến tuổi 4 ở công thức thức ăn 2 đạt 88,5%, trong khi đó ở công thức 1chỉ đạt 45,3%. Năm 2002, Phạm Văn Thành và các cộng sự đã nuôi sâu tơ và sâu xanh trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng sinh học thuộc trung tâm nghiên cứu và phát triển nông dược của công ty thuốc sát trùng Việt Nam với mục đích thử hiệu lực trừ sâu của một số loại thuốc hóa học. Thành phần MTTANT gồm: 150g bột đậu nành; 15g men rượu; 2g methyl paraben; 1g sorbic acid; 12g agar; 2ml formaline 40%; 0.5g streptomicine; 3g ascorbic acid; 720ml nước cất. Năm 2011, Quách Hải Trí đã thử nghiệm nuôi thành công sâu khoang (Spodoptera litura) trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM với mục đích tìm ra môi trường thức ăn nhân tạo thích hợp để nhân nuôi sâu khoang. Thành phần MTTANT gồm: 150g đậu xanh ngâm; 15g men bánh mì; 2,5g methyl paraben; 1,5g sorbic acid; 3g ascorbic acid; 10ml vitamin tổng hợp; 2 viên vitamin E; 15g casein; 12g agar; 2ml formaline 40%; 800ml nước cất. Kết quả thí nghiệm cho biết: trọng lượng sâu trung bình 666,21 mg/ sâu, tỉ lệ sống và hóa nhộng của sâu là 55,53%, tỉ lệ vũ hóa của nhộng 68,50%, và khoảng 178 trứng/ bướm cái trong một ngày đẻ. Năm 2012, Phạm Thị Thùy Dương đã thử nghiệm nuôi thành công sâu khoang (Spodoptera litura) trên môi trường thức ăn nhân tạo tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM với mục đích tìm ra môi trường thức ăn nhân tạo thích hợp để nhân nuôi sâu khoang. Thành phần môi trường thức ăn nhân tạo gồm: 150g đậu nành hạt ngâm; 15g men bánh mì; 2,5g methyl-
21 paraben; 1,5g sorbic acid; 10ml multivitamin (Vitaral); 3g ascorbic acid; 3g casein; 12g agar; 2ml formaline 40%; 750ml nước cất. Kết quả thí nghiệm cho biết: tỷ lệ sâu sống tuổi 3 đạt 93,33 %, trọng lượng sâu tuổi 4 đạt 688,52 mg/sâu, thời gian phát dục của sâu và nhộng lần lượt 12,17, 8,55 ngày, tỷ lệ sâu phát dục 85,35 %, tỷ lệ nhộng vũ hóa 90,18 %, khả năng đẻ trứng là 448,67 trứng/bướm cái. Tóm lại, việc nuôi nhân hàng loạt côn trùng bằng thức ăn nhân tạo đã được phát triển ở hầu hết các nước trên thế giới và đạt nhiều thành tựu đáng kể. Ở nước ta, đã có một số cơ quan nghiên cứu vấn đề này.Qua đó cho thấy việc nguyên cứu công nghệ nuôi nhân hàng loạt một số loài côn trùng đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước quan tâm. Tuy nhiên, đối vói từng loài sâu, cần có công thức khác nhau. Đặc biệt việc lựa chọn công thức phù hợp rẻ tiền cũng rất quan trọng để giảm giá thành sâu nuôi. 1.4 Kỹ thuật nuôi nhân sâu hàng loạt Tùy theo đặc điểm sinh học của từng loại sâu và mục đích việc nuôi nhân mà có các phương pháp nuôi nhân khác nhau. Nuôi tập thể và nuôi cá thể. Có loại sâu thì nuôi tập thể ở tuổi nhỏ và nuôi cá thể khi sâu ở tuổi lớn. Nuôi cá thể ở độ tuổi lớn được áp dụng đối với những loài sâu có tính ăn thịt lẫn nhau ở giai đoạn sâu non tuổi lớn.
22 1.4.1 Các biện pháp vệ sinh phòng bệnh khi nuôi nhân sâu Một trong những điều kiện để nuôi nhân sâu thành công là phải nắm được các biện pháp phòng bệnh. Trong quá trình nhân nuôi, sâu thường bị nhiều loại bệnh gây ảnh hưởng lớn đến hiệu suất nhân nuôi. Để giảm bớt nguồn bệnh, ngoài việc cho sâu ăn thức ăn có thêm chất kháng sinh, người ta thường áp dụng các biện pháp như chọn giống sâu khỏe, vệ sinh và xử lý ở giai đoạn trứng, nhộng: - Chọn giống sâu khỏe và vệ sinh: chọn các sâu nuôi có khả năng tái sinh sản cao, sức sống tốt, loại bỏ các ổ trứng từ những con cái ốm yếu. Thức ăn tốt , đầy đủ chất cũng là ếy u tố quan trọng làm cho côn trùng sinh trưởng, phát triển tốt. Môi trường dinh dưỡng không cân đối làm cho côn trùng dễ bị bệnh tật. Mỗi loài sâu phải được nuôi trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp. - Để phòng bệnh cho sâu nuôi khỏi bị nhiễm vi khuẩn, vi rút thì ngoài việc cho hóa chất và kháng sinh vào môi trường thức ăn nhân tạo, ngoài ra còn xữ lý trứng nhộng bằng dung dịch formalin nồng độ 10%. - Phòng nhân nuôi được vệ sinh vô trùng, dụng cụ nuôi nhân được vô trùng bằng cách sấy ổn định ở nhiệt độ 150oC trong thời gian 1 giờ. Bên cạnh đó, để phòng bệnh vi rút cho sâu thì áp dụng các biện pháp như sau: 1. Chọn những cặp bố mẹ có sức sống tốt, khả năng tái sinh sản cao bằng cách ghép trưởng thành từng đôi một, những đôi đẻ ít trứng thì loại bỏ 2. Khử trùng trứng bằng dung dịch fomalin 5%, để ráo và xữ lý nhộng cũng bằng dung dịch fomalin 10% ngoài việc cho hóa chất, chất kháng sinh vào môi trường thức ăn nhân tạo (trình bày ở mục 1.2) để phòng cho sâu không bị nhiễm vi khuẩn, vi rút. Hơn nữa, thêm các vitamin E, vitamin tổng hợp để hạn chế vi rút phát triển. 1.4.2 Biện pháp chống thoái hóa quần thể sâu nuôi Khi nuôi nhân côn trùng qua nhiều thế hệ trong phòng thí nghiệm, thường thấy hiện tượng giảm sức sống và khả năng đẻ trứng sẽ dẫn đến tiêu vong quần thể nuôi nhân. Sự giảm sức sống của côn trùng là do nhiều yếu tố chi phối như nội phối làm
23 tích tụ những gen bất lợi hay do sự thay đổi ngẩu nhiên của gen cũng như giảm tính đa dạng gen. Vì vậy thay đổi định kỳ sâu nuôi hay là giao phối định kỳ giữa những cá thể nuôi trong phòng thí nghiệm với những cá thể ngoài tự nhiên. 1.4.3 Kỹ thuật nhân nuôi sâu khoang Phương pháp nuôi cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) nên điều kiện tiện nghi môi trường trong phòng thí nghiệm được kiểm soát chặt chẽ. Sâu được nuôi ở điều kiện nhiệt độ 270 ± 10 C và độ ẩm 65 ± 5%. Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) nuôi trong phòng thí nghiệm được chia làm 4 công đoạn theo 4 pha phát triển của sâu: Sâu non, nhộng, trưởng thành, trứng. Nuôi sâu: Lá thầu dầu được rửa sạch, để ráo rồi cho vào hộp để ủ cho trứng nở. Cho ổ trứng vào lá thầu dầu tươi và để ở nhiệt độ phòng cho sâu nở. Sau đó dùng chổi lông, nhẹ nhàng bắt sâu tuổi 1 và chuyển vào hộp kích thước là (21x12x8) có chứa thức ăn nhân tạo. Mỗi công thức nuôi 20-30 sâu, lặp lại 3 lần. Đậy nắp hộp và nuôi sâu ở nhiệt độ phòng cho đến cuối tuổi 3. Chuyển sâu tuổi 3 sang hộp sạch và bổ sung thức ăn, nuôi cho đến khi sâu hóa nhộng. Thu và nuôi nhộng: nhộng được thu hằng ngày và xử lý trước khi cho vào hộp: Xử lý nhộng: Cho nhộng vào dung dịch formalin 1% và ngâm trong 1 phút để tiêu diệt virus bám bên ngoài vỏ nhộng. Tiếp đến tách nhộng đực và nhộng cái để riêng rẽ và theo dõi. − Nuôi nhộng: Cho nhộng vào hộp nuôi, xung quanh được bọc kín bằng giấy tối màu, bên dưới có lót giấy thấm. Thấm nước miếng bông hút ẩm cho vào hộp để giữ ẩm cho nhộng (hằng ngày thay bông ẩm mới). Giữ hộp nhộng ở nhiệt độ phòng. Sau 7 – 10 ngày nhộng sẽ vũ hóa. Ghép cặp trưởng thành: Tỷ lệ ghép cặp đực : cái là 1 : 1 hoặc 2 : 3 hoặc 3 : 4 tùy theo lượng bướm vũ hóa. Nuôi trưởng thành: Thức ăn cho trưởng thành là mật ong 5%, 10%. Cho thức ăn vào miếng bông hút ẩm rồi đặt vào trên đĩa nhỏ và cho vào hộp nuôi để cung cấp thức ăn cho bướm. Hằng ngày theo dõi để thu nhận trứng và thay thức ăn cho bướm.
24 Xung quanh hộp nuôi có lót giấy để thu nhận trứng. Dùng kéo cắt mảnh giấy có ổ trứng và dán giấy mới và chỗ bị cắt. 1.5 Giới thiệu về virus NPV gây bệnh côn trùng Nuclear polyhedrosis virus (NPV) thuộc họ Baculoviridea là một trong 7 thành viên thuộc nhóm virus ký sinh côn trùng. Virus NPV có dạng hình que, kích thước 330-80nm. Baculovirus thuộc họ Baculoviridae chỉ có 1 chi. Chi này được chia thành các nhóm phụ là virus đa nhiệm nhân (NPV), virus hạt (GV) và Oryctes giống virus (OV). Các hạt virus có 1 lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsid. Hơn nữa NPV có 1 đặt tính là hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào côn trùng với kích thước 0,5-15 nm. 1.5.1 Đặc điểm hình thái: NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi. 1.5.2 Cấu trúc NPV Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside. DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi.
25 Hình 1.6: Cấu trúc của thể vùi (Kalmakoff et al, 2003). Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV - SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid - Multiple Phân tử DNA gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S., 1977). Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử DNA, phân tử DNA có chiều dài gấp 2 - 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977). Cấu tạo deoxyribo nucleo protein (DNP): Theo kết quả nghiên cứu của Bud, H.M et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa DNA và protein, sự kết hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo được 32 nm. DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng. Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai
26 loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985). Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al , 1966). Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định. 1.5.3 Quy trình sản xuất NPV Điểm đặc trưng của virus NPV là chỉ nhân lên ở tế bào sống của ký chủ nên việc sản xuát virus ở quy mô công nghiệp cũng khá là khó khăn. Có 2 phương pháp sản xuất virus NPV: Sản xuất invitro trên tế bào ký chủ và Sản xuất in vivo trên sâu ký chủ. Trong luận văn này, chỉ đề cấp đến quy trình sản xuất invitro trên sâu ký chủ. Quy trình sản xuất chế phẩm NPV invitro trên sâu ký chủ gồm 2 bước chính: Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ và nhiễm virus cho sâu ký chủ. Nhân nuôi số lượng lớn sâu ký chủ: Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngoài đồng trên những cánh đồng không phun thuốc và được nhân nuôi trong phòng. Sâu non sau khi hóa nhộng sẽ được thu nhận, xử lý rồi cho vào trong những hộp chứa có bông ẩm. Tách riêng nhộng đực và nhộng cái để khi nhộng vũ hóa dễ thu nhận và ghép cặp. Sau khi nhộng vũ hóa phải được ghép cặp ngay.
27 Sau khi trưởng thành cái đẻ trứng, trứng phải được thu nhận ngay và để riêng từng ngày. Trứng sâu thường nở vào ban đêm. Để sâu nở ra có thức ăn ngay, người ta thường cho trứng vào hộp thức ăn trước khi nở vài giờ. Sâu ký chủ được nuôi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng và phát triển bình thường. Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm, tấn công của các yếu tố tự nhiên có thể gây chết sâu thông qua nguồn thức ăn tự nhiên. Mặt khác, việc sử dụng thức ăn nhân tạo để nuôi sâu sẽ không phải thay thức ăn hằng ngày, tiết kiệm được công thức và chi phí khác trong quy trình sản xuất. Nhiễm virus cho sâu ký chủ: Sau khi sâu ký chủ đạt đến tuổi 4 là tuổi thích hợp để sản xuất virus. Quá trình sản xuất virus trong sâu ký chủ được bắt đầu từ việc cho sâu ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus (tạm gọi là nhiễm virus cho sâu ký chủ). Có thể tóm tắt quá trình này như sau: Cho dịch virus lên bề mặt thức ăn và dùng chổi lông đã khử trùng trãi đều dịch lên bề mặt thức ăn. Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vòng 24h-48h ở điều kiện nhiệt độ 26oC. Chuyển sâu sang thức ăn mới không nhiễm virus và ủ ở nhiệt độ 26oC, theo dõi hàng ngày cho đến khi sâu bị chết. Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đông lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi đồng nhất và lọc. Sau khi lọc ta li tâm, thêm chất phụ gia và đem đi sấy. Kiểm tra lượng virus sau khi sấy và đóng gói sản phẩm.
28 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật Liệu Và Đối Tượng Nguyên Cứu 2.1.1 Nguồn sâu làm thí nghiệm Nguồn sâu khoang giống được bắt trên các ruộng rau cuối vụ ngừng phun thuốc hóa học. Sâu khoang sau khi thu ngoài tự nhiên về lựa chọn những cá thể có độ tuổi tương đương nhau, chia làm 5 nhóm và nuôi bằng 5 công thức thức ăn (trong đó có 4 công thức thức ăn nhân tạo và một công thức thức ăn là lá thầu dầu) trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sơ đồ 1.1: Nguồn sâu làm thí nghiệm 2.1.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm Những trang thiết bị và dụng cụ nuôi sâu trong phòng thí nghiệm : - Phòng nuôi sâu có trang bị máy điều hòa nhiệt độ - Chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang với thời gian 16 giờ/ngày
29 - Tủ lạnh, tủ ổn định nhiệt để bảo quản thức ăn nhân tạo, bảo quản trứng và bảo quản nhộng. - Đồng hồ đo nhiệt độ và ẩm độ - Những dụng cụ nuôi sâu bao gồm: Đĩa petri để bảo quản trứng, ấp trứng; Hộp đựng thức ăn, hộp nhựa nuôi sâu lớn (21x12x8), hộp nhựa nuôi sâu nhỏ (18x10x6) để nuôi sâu giống, nhộng vũ hóa và để ghép trưởng thành theo từng cặp và nuôi trưởng thành; Vải màn, giấy báo và bông gòn - Cốc thủy tinh, ống đong, máy xay sinh tố. - Tủ sấy dùng để sấy dụng cụ nuôi sâu và nồi hấp tiệt trùng để tiệt trùng các dụng cụ nuôi sâu. - Cân phân tích, kính lúp, kéo, kẹp inox, cọ lông, dao rọc giấy và nhiều dụng cụ khác. - Các nguyên vật liệu để chế biến môi trường thức ăn nhân tạo như đậu trắng, đậu xanh, đậu nành, tinh bột, men bánh mì, Ascorbic acid ,Methyl-paraben ,Sorbic acid, Formaldehyde ,Vitamin tổng hợp ,Vitamin E , Agar và nước cất , mật ong, đường và các hóa chất xử lý để khử trùng và rửa dụng cụ. 2.2 Nội Dung Nguyên Cứu • Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn. • Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành. • Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV. 2.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 2.3.1 Xác định công thức thành phần thức ăn nhân tạo để nhân nuôi ấu trùng sâu khoang (Spodoptera litura). Nguyên cứu môi trường thức ăn nhân tạo một cách kinh tế là một trong những vấn đề cần quan tâm trong sản xuất chế phẩm vi rút NPV trừ sâu khoang. Để giải quyết vấn đề đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu, tìm kiếm các loại nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng, rẻ tiền ở Việt Nam nhằm tạo ra được một số loại thức ăn để thực nghiệm.
30 Trong thành phần thức ăn nhân tạo thường có 6 nhóm chính: đường, đạm, chất xơ, chất kết dính, vitamin, chất chống nấm, chống khuẩn và chống virus. Thức ăn nhân tạo được bảo quản lâu hơn và sâu ăn thức ăn hầu như không để thừa. Loại thức ăn này chịu được nhiệt độ thấp khi bảo quản trong tủ lạnh và dưới tác dụng của nhiệt độ thấp không mất cấu trúc và độ mịn. Độ mịn và cấu trúc của thức ăn cho phép côn trùng không những làm nguồn thức ăn mà còn dùng làm nơi sinh sống như thức ăn thừa và phân sâu dủng nơi hóa nhộng khá tốt cho sâu khi sâu chuyển sang giai đoạn nhộng. Để có cơ sở tạo nguồn thức ăn thích hợp, cân đối, chúng tôi dựa vào kết quả phân tích của Sorour et al (2011) về thành phần cơ bản của các nguyên liệu thực phẩm để chọn ra những khẩu phần để thí nghiệm. Thành phần thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang bao gồm 4 công thức cụ thể như sau: CT1. Công thức của Sour et al (2011) cải tiến có bổ sung vitamin tổng hợp gồm đậu trắng (200g), tinh bột (30g), men bánh mì (30g), ascorbic acid (1.5g), Methyl- paraben (2.5g), đậu nành 10g, vitamin tổng hợp (10ml), formaldehyde (1 ml), agar (10g) và 750ml nước cất. CT2. Thành phần như công thức và có bổ sung 1% vitamine E. CT3. Công thức cải tiến từ Ahmad et al (2015) Bột đậu xanh (200g), Men bánh mì (30g), ascorbic acid (3.5g), methyl-p-hydroxybenzoate(Methy-paraben) (2g), sorbic acid (1g), formaldehyde (2.5ml), agar (10g) và 750ml nước cất, Vitamine E: 1%. CT4. Công thức của Sorour et al (2011): gồm đậu trắng (500g), tinh bột (75g), men bánh mì (75g), ascorbic acid (7.5g), sobic acid (2.5g), Methyl-paraben (4.75g), formaldehyde (5 ml), agar (10g) và 1000ml nước cất.
31 Bảng 2.1: Thành phần công thức thức ăn dùng trong thí nghiệm Thành phần CT1 CT2 CT3 CT4 Đậu xanh (g) - - 200 - Đậu trắng (g) 200 200 - 500 Đậu nành (g) 10 10 - - Tinh bột (g) 30 30 - 75 Men bánh mì (g) 30 30 30 75 Ascorbic acid (g) 1.5 1.5 3.5 7.5 Methyl-paraben (g) 2.5 2.5 2 4.75 Sorbic acid (g) - - 1 2.5 Formaldehyde (ml) 1 1 2.5 5 Vitamin tổng hợp (ml) 10 10 - - Vitamin E (ml) Bổ sung Bổ sung - - 1% 1% Agar (g) 10 10 10 10 Nước cất (ml) 1000 1000 750 1000 Phương pháp pha chế: Đem đậu nghiền nhỏ với nước cất bằng máy nghiền (máy xay sinh tố). Thêm các thành phần nguyên liệu: men bánh mì, methyl-paraben đã hòa tan vào khuấy điều bằng đũa thủy tinh sau đó thêm agar. Agar đã được hòa tan với nước cất rồi để nguội đến nhiệt độ 500C và khuấy đều. Cuối cùng cho vào hỗn hợp ascorbic acid và formalin (formalin nhỏ vào từng giọt) và khuấy đều cẩn thận. Cuối cùng đổ thức ăn vào hộp nhựa, mỗi hộp đổ 80ml (đủ để sâu ăn trong vòng 7 ngày) để nguội và sử dụng. Thức ăn bảo quản trong tủ lạnh được 2-3 tuần. Đối với nghiệm thức sử dụng lá thầu dầu, tiến hành thu hái lá thầu dầu ngoài tự nhiên, rửa lại bằng nước sau đó lau sạch bằng bông đã qua hấp tiệt trùng.
32 A B C D E Hình 2.1:Công thức thức ăn nhân tạo và công thức đối chứng (A: công thức 1, B: công thức 2, C: công thức 3,D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu) Phương pháp thực hiện: Nguồn sâu: Sâu khoang được bắt trên các ruộng rau muống không phun thuốc về nuôi trên lá thầu dầu cho đến khi hóa nhộng. Thu nhận nhộng và tách riêng nhộng đực, nhộng cái rồi cho vào hộp nhựa cho vào các hộp nhựa, để riêng nhộng đực và để theo dỏi ảnh hưởng của phương pháp nuôi, học viên tiến hành nuôi sâu, thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức bao gồm 4 nghiệm thức sử dụng thức ăn nhân tạo được trình bày ở bảng 3 và nghiệm thức đối chứng sử dụng lá thầu dầu. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần là 30 sâu. Chỉ tiêu theo dõi: − Trọng lượng sâu (g/sâu) − Thời gian phát dục của sâu (ngày) − Tỷ lệ sâu vào nhộng (%) − Trọng lượng nhộng (g/nhộng) − Tỷ lệ nhộng vũ hóa (%) − Thời gian trưởng thành sống (ngày) − Số ổ trứng / 1 trưởng thành cái (ổ) − Số trứng/ 1 trưởng thành cái (trứng)
33 2.3.2 Xác định thức ăn thêm để nuôi trưởng thành sâu khoang (Spodoptera litura) Trưởng thành (F1 của sâu bắt trên ruộng rau muống) nuôi trong điều liện phòng thí nghiệm, cho ăn thức ăn nhân tạo đến khi sâu hóa nhộng, vũ hóa, đẻ trứng và nở sâu và tiếp tục cho ăn bằng thức ăn nhân tạo cho đến khi sâu hóa nhộng và vũ hóa thành trưởng thành thì tiến hành thí nghiệm. Để xác định sức đẻ của trưởng thành, học viên cho ngài vũ hóa được nuôi trong hộp nhựa hình trụ, trên miệng bịt kín bằng vải màn, xung quanh thành hộp được che bằng giấy báo tối màu làm nơi đẻ trứng cho trưởng thành cái. Tỷ lệ ghép trưởng thành cặp đực : cái là 1 : 1. Thức ăn cho trưởng thành là nước cất, mật ong 5%, mật ong 10%, mật ong 20%, nước đường 5%, nước đường 10% và nước đường 20%. Cho thức ăn vào miếng bông hút ẩm rồi đặt vào trên đĩa nhỏ sạch và cho vào hộp nuôi để cung cấp thức ăn cho trưởng thành. Hằng ngày theo dõi để thu đếm số lượng trứng và thay thức ăn cho trưởng thành. Xung quanh hộp nuôi có lót giấy để thu nhận trứng. Dùng kéo cắt mảnh giấy có ổ trứng và dán giấy mới và chỗ bị cắt. Cách phân biệt trứng hữu thụ và trứng không thụ tinh như sau: Trứng hữu thụ sau khi đẻ thường thay đổi màu sắc theo thời gian. Như trứng sâu khoang lúc mới đẻ có màu vàng nhạt, mọng nước, sau trứng chuyển màu từ vàng nhạt sang tro đậm và có viền quanh trứng. Ngược lại, trứng không thụ tinh thì không chuyển màu, mất nước và méo mó. Mỗi công thức theo dõi 20 cặp trưởng thành, lặp lại 3 lần. Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức bao gồm 6 nghiệm thức sử dụng thức ăn thêm và nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất. Mỗi nghiệm thức là một cặp đực cái để quan sát, cụ thể như sau: − CT1: Cho ăn thêm bằng nước cất − CT2: Cho ăn thêm bằng mật ong 5% − CT3: Cho ăn thêm bằng mật ong 10% − CT4: Cho ăn thêm bằng mật ong 20% − CT5: Cho ăn thêm bằng nước đường 5%
34 − CT6: Cho ăn thêm bằng mước đường 10% − CT7: Cho ăn thêm bằng nước đường 20% Chỉ tiêu theo dõi − Thời gian trưởng thành sống − Khả năng sính sản của trưởng thành cái ( số ổ trứng, số trứng) 2.3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV Nguồn NPV (Nuclear polyhedrosis virus) tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa Học Ứng Dụng, Đại học Hutech. Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị dịch nhiễm: Dịch NPV có nồng độ 2 x 107 PIB/ml. Chuẩn bị sâu nhiễm: Lấy ổ trứng từ một bướm cái và cho vào lá thầu dầu sạch. Khi sâu nở ra, hằng ngày thay lá cho sâu lớn đến tuổi 4 (9 ngày) và dùng làm thí nghiệm. Chuẩn bị thức ăn: Thức ăn được chuẩn bị theo bảng 1.3 (chỉ sử dụng công thức 1, công thức 2 và công thức 3) nhưng cho không formalin vào thức ăn. Để thức ăn nguội rồi dùng micropipet hút 1ml dịch NPV nồng độ 2x107 PIB/ml cho vào mỗi hộp rồi để khô. Cho sâu vào hộp rồi để ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày chuyển sâu sang hộp thức ăn mới không nhiễm vi rút và theo dõi hàng ngày cho tới khi sâu chết hết hoặc vào nhộng. Đối với công thức nhiễm bằng lá: lá thầu dầu được hái trên đồng đem về phòng thí nghiệm rửa sạch, hong khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó hút 1 ml dịch NPV nồng độ 2x107 PIB/ml phun đều 2 mặt lá để khô và cho sâu vào. Cho sâu ăn trong 2 ngày,sau đó chuyển sang nuôi trên lá sạch và thay lá hằng ngày.
35 Hình 2.2: Lây nhiễm vi rút lên thức ăn nhân tạo Chỉ tiêu theo dõi − Đánh giá được hiệu lực diệt sâu (%) của dịch virus được tính theo công thức Abbott − Theo dõi khối lượng sâu chết (g/sâu) của các công thức − Đánh giá sản lượng virus có trong mỗi sâu (PIB/sâu) − Xác định công thức thức ăn thích hợp để lây nhiễm NPV Phương pháp tính toán Tính toán hiệu lực của chế phẩm trong phòng thí nghiệm theo công thức Abbott (1925). Theo dõi số sâu chết qua từng ngày ở mỗi công thức rồi tính toán theo công thức:
36 푺ố 풔â풖 풔ố풏품 ở 풍ô 풕풉í 풏품풉풊ệ Hiệu lực (%) = ( − ) 퐱 푺ố 풔â풖 풔ố풏품 ở 풍ô đố풊 풉ứ풏품 Xác định sản lượng virus: Sâu chết ở các công thức được thu thập cho vào ống effendorf. Mỗi sâu được cho vào trong 1ml nước cất để cho xác sâu tan rửa ra, sau đó lọc qua vải mouslin 2 lớp. Tiến hành li tâm 2 lần lần thứ nhất 500 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Tiến hành li tâm dịch nổi ở 4000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy cặn lắng và đếm số thể vuì có trong mỗi sâu chết bằng buồng đếm hồng cầu. Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo công thức của A.Mehrvar, R.J.Rabindra, K.Veenakumari and G.B.Narabenchi (2007) 푷푰 / 풍 퐱 푻풉ể 풕í 풉 풉풖풚ề풏 풑풉ù Sản lượng PIB/sâu chết = 푻ổ풏품 풔ố 풔â풖 풉ế풕 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức bao gồm 3 nghiệm thức sử dụng thức ăn nhân tạo và nghiệm thức đối chứng sử lá thầu dầu. Mỗi nghiệm thức thử nghiệm 3 hộp, mỗi hộp 15 sâu.
37 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGUYÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định thức ăn tổng hợp để nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn 3.1.1. Trọng lượng sâu tuổi 3 Bảng 3. 1: Trọng lượng sâu tuổi 3 NGHIỆM THỨC TRỌNG LƯỢNG SÂU (g) Công thức 1 0,17 ± 0,03C Công thức 2 0,53 ± 0,05A Công thức 3 0,40 ± 0,03B Công thức 4 0,11 ± 0,02C Công thức 5 ( LÁ THẦU DẦU) 0,52 ± 0,02A CV (%) 8,50 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,9%. ns: không khác biệt thống kê. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn ảnh hưởng rất rõ đến trọng lượng ấu trùng. Leonardo và Doane (1966) và Miller et al., (1982) cho biết, trong điều kiện phòng thí nghiệm khi sâu được nuôi bằng chế độ thức ăn cân bằng dinh dưỡng sẽ làm tăng trọng lượng và kích thước cá thể của sâu và nhộng. Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về trọng lượng của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo trong phòng thí nghiệm.Trọng lượng sâu khi nuôi trên thức ăn của công thức 2 và công thức lá thầu dầu phát triển tốt hơn hẳn so với khi nuôi trên các công thức còn lại. Sâu được nuôi bằng công thức 2 và công thức lá thầu dầu cho trọng lượng trung bình cao nhất tương ứng với 0,53g và 0,52g. Hai công thức này có khác biệt rõ rệt so với ba công thức còn lại. Trọng lượng sâu ở công thức 3 chỉ đạt 0,40g; ở công thức 1 đạt 0,17g; và thấp nhất là ở công thức 4 tương ứng với 0,11g.
38 Với thành phần thức ăn đã nêu ở bảng 2.1, công thức 2 có cơ chất chính là đậu trắng có bổ sung thêm tinh bột và đậu nành cùng với vitamin tổng hợp và vitamin E, sâu tiêu thụ thức ăn nhiều, phát triển tốt và có trọng lượng cao hơn cả so với những công thức còn lại. Bên cạnh những thành phần thiết yếu khác như công thứ 4, trong công thức 2 còn có bổ sung thêm đậu nành, tinh bột và men bánh mì là nguồn cung cấp protein khác cho sâu. Lee et al., (2008), Shapiro et al., (1981), Popham và Shelby ( 2006) cho biết, thành phần protein có trong đậu nành và hàm lượng ascobic acid có trong thức ăn giúp cho sâu phát triển tốt, tăng trọng lượng và kích thước. A B C D E Hình 3. 1: Sâu khoang được nuôi bằng các công thức (A : công thức 1; B: công thức 2; C: công thức 3; D: công thức 4; E: công thức lá thầu dầu)
39 3.1.2. Trọng lượng nhộng Trọng lượng nhộng là một chỉ tiêu rất quan trọng vì nó đánh giá chất lượng sâu trong nuôi nhân, biểu thị tiềm năng sinh sản của các cá thể trưởng thành cái. Một trong các yếu tố làm cho nhộng có khối lượng lớn là môi trường thức ăn. Bảng 3. 2: Trọng lượng nhộng NGHIỆM THỨC TRỌNG LƯỢNG NHỘNG (g) Công thức 1 0,33 ± 0,04A Công thức 2 0,33 ± 0,01A Công thức 3 0,30 ± 0,02AB Công thức 4 0,26 ± 0,01B Công thức 5 (LÁ THẦU DẦU) 0,26 ± 0,03B CV (%) 7,73 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%. ns: không khác biệt thống kê. Giai đoạn nhộng là giai đoạn quan trọng trong vòng đời của sâu khoang, nếu nhộng khỏe mạnh và đủ dinh dưỡng sẽ hạn chế được tỷ lệ dị tật ở giai đoạn trưởng thành và ngược lại nếu nhộng nhỏ, thiếu dinh dưỡng, thì tỷ lệ dị tật của trưởng thành sẽ rất cao. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.2 cho thấy, trọng lượng nhộng được nuôi bằng các công thức thức ăn nhân tạo ở công thức 1 và công thức 2 đạt giá trị cao nhất tương đương với 0,33g và ở công thức 4 cho trọng lượng nhộng thấp nhất tương đương với 0,27g. So sánh trọng lượng khi nuôi sâu trên thức ăn nhân tạo và nuôi trên lá thầu dầu, kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, trọng lượng nhộng khi nuôi trên thức ăn nhân tạo đều bằng hoặc cao hơn hẳn (công thức 1 và công thức 2) so với khi nuôi bằng lá. 3.1.3. Thời gian phát dục của sâu non Thời gian phát dục cũng là ộm t chỉ tiêu quan trọng biểu hiện chất lượng của môi trường thức ăn. Thức ăn phù hợp, sâu sinh trưởng tốt, thời gian phát dục rút ngắn. Ngược lại, thức ăn không phù hợp, không đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng, sâu sinh
40 trưởng kém, thời gian phát dục kéo dài, gây ảnh hưởng đến tốc độ nhân nuôi sâu khoang và quy trình sản xuất chế phẩm NPV. Thời gian phát dục của sâu khoang khi nuôi trên các môi trường thức ăn được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3. 3: Thời gian phát dục của sâu non NGHIỆM THỨC THỜI GIAN PHÁT DỤC (NGÀY) Công thức 1 20,39 ± 0,45A Công thức 2 15,25 ± 0,23C Công thức 3 16,47 ± 0,65B Công thức 4 19,93 ± 0,32A Công thức 5 ( LÁ THẦU DẦU) 15,10 ± 0,17C CV (%) 2,31 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%. ns: không khác biệt thống kê. Khi sâu khoang được nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo khác nhau thì thời gian phát dục của sâu khoang ở mỗi công thức có sự chênh lệch được thể hiện ở bảng 3.3. Qua khảo sát trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy khi cho sâu ăn bằng công thức 2, sâu non tiêu thụ nhiều thức ăn nên kích thước và trọng lượng tăng nên chúng phải lột bỏ lớp da cũ và thay bằng lớp da mới nhằm phù hợp với sự tăng trọng của cơ thể. Do vậy thời gian phát dục của sâu non nuôi trên CT2 ngắn bằng thời gian phát dục của sâu non được nuôi bằng lá thầu dầu (15 ngày). Còn những công thức khác thì sâu tiêu thụ thức ăn chậm nên không tích trữ đủ năng lượng để lột xác do vậy thời gian phát dục của sâu non bị kéo dài hơn (từ 16-20 ngày). Giữa công thức 1 và công thức 2, chỉ khác nhau là có (CT2) và không có (CT1) Vitamin E nhưng thời gian phát dục của sâu chênh nhau rất nhiều (5 ngày). Điều này cho thấy, đối với sâu khoang, việc bổ sung vitamin E đã giúp cho sâu phát dục nhanh hơn. 3.1.4. Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang
41 Bảng 3. 4: Tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo % SÂU ĐẾN % SÂU VÀO % NHỘNG VŨ NGHIỆM THỨC TUỔI 3 NHỘNG HÓA Công thức 1 70,57 ± 0,02NS 39,21 ± 0,05B 44,44 ± 0,05B Công thức 2 85,01 ± 0,04NS 73,09 ± 0,03A 77,36 ± 0,06A Công thức 3 76,51 ±0,02NS 70,39 ± 0,02A 72,28 ± 0,12A Công thức 4 81,50 ± 0,03NS 41,13 ± 0,08B 36,29 ± 0,06B Công thức 5 ( LÁ 69,90 ± 0,12NS 71,95 ± 0,05A 45,06 ± 0,03B THẦU DẦU) CV (%) 12,33 6,28 15,73 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%. ns: không khác biệt thống kê. Biểu đồ tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa của sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo 120 100 80 % 60 % SÂU ĐẾN TUỔI 3 40 % SÂU VÀO NHỘNG % NHỘNG VŨ HÓA 20 0 CT1 CT2 CT3 CT4 CT LÁ THẦU DẦU Công thức thức ăn nhân tạo Hình 3. 2: Biểu đồ tỷ lệ sâu sống sót, sâu vào nhộng và nhộng vũ hóa cảu sâu khoang khi nuôi trên các công thức thức ăn nhân tạo Sâu khoang tuổi 3 là thích hợp hơn cả để sản xuất NPV. Vì vậy, tỷ lệ sống của sâu khoang tuổi 3 là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá, lựa chọn loại thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn, phục vụ sản xuất NPV sâu khoang. Tuy nhiên, số liệu ở bảng 3.4 cho thấy tỷ lệ sâu vào tuổi 3 giữa các công thức không sai khác nhau.
42 Kết quả theo dõi ở bảng 3.4 còn cho thấy, tỷ lệ sâu vào nhộng ở công thức 2, công thức 3 và công thức nuôi bằng lá thầu dầu đạt tương ứng là 73,09%; 70,39; 71,95% và không có sự sai khác rõ rệt giữa các công thức. Công thức 1 và công thức 4 có tỷ lệ sâu vào nhộng khá nhất tương ứng là 39,21% và 41,13%. Mặc dù tỷ lệ sâu sống đến tuổi 3 ở công thức 1 (70,57%) và công thức 4 (81,50%) cho kết quả không sai khác so với công thức 2, công thức 3 và công thức lá nhưng khi ăn trên công thức 1 và công thức 4, giai đoạn tiền nhộng chết nhiều, tỷ lệ nhộng bị dị tật, nhộng bị thối chiếm tỷ lệ cao. Nguyên nhân sâu chết nhiều ở giai đoạn tiền nhộng là do sâu ăn ít, thức ăn thiếu dinh dưỡng dẫn đến sâu phát triển kém. Có sự khác biệt hoàn rõ rệt về tỷ lệ nhộng vũ hóa thành côngở các công thức, tỷ lệ cao nhất là 77,36 % tương ứng với công thức 2 vì ở giai đoạn sâu non được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng từ nguồn cung cấp protein cho đến nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng nên sâu tiêu thụ thức ăn nhiều, khỏe mạnh, đủ sức để lột xác hóa nhộng và nhộng vũ hóa trưởng thành. Ngược lại, ở công thức 4, tỷ lệ vũ hóa thành công thấp nhất tương ứng với 36,29 %, tương đương với công thức 1 (44,44%) và công thức nuôi sâu bằng lá thầu dầu (45,06%). Mặc dù ở công thức nuôi sâu bằng lá, tỷ lệ sâu vào nhộng khá cao (71,95%) nhưng có lẽ với thức ăn là lá thầu dầu, dinh dưỡng vẫn không tốt bằng so với các công thức nuôi bằng thức ăn nhân tạo có dinh dưỡng đầy đủ (CT2, CT3) nên nhộng nhỏ hơn và khi vũ hóa, bướm không vũ hóa thành công. Mặt khác, khi nuôi bằng lá, phải thay thức ăn và chuyển sâu sang hộp mới hàng ngày nên tác động nhiều đến sâu non, phần nào cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của sâu và cuối cùng là ảnh hưởng đến khả năng vũ hóa của nhộng. Như vậy, sự sinh trưởng, phát triển của sâu thì nhóm sâu được cho ăn bằng công thức 2 với cơ chất chính là đậu trắng bổ sung đậu nành và tinh bột có ưu thế hơn so với công thức 4. Mặt khác việc bổ sung vitamin E ở CT2 cũng giúp cho sâu sinh trưởng,phát triển tốt hơn so với không bổ sung (CT1). So sánh sinh trưởng phát triển của sâu khi nuôi trên thức ăn nhân tạo và nuôi trên lá thầu dầu, kết quả ở các phần trên cho thấy, sâu nuôi bằng thức ăn nhân tạo có thành phần như công thức 2 và công thức 3 cho kết quả tốt hơn so với nuôi bằng lá thầu dầu. Kết quả này cũng tương tự
43 với nghiên cứu của Elangovan và cộng sự (2011) khi nuôi sâu Helicoverpa armigera (Hubner) để sản xuất virus NPV, nhóm tác giả cho biết tỷ lệ vào nhộng và hóa trưởng thành nuôi trên thức ăn tự nhiên thấp hơn hẵn so với nuôi trên thức ăn nhân tạo. Như vậy, thức ăn nhân tạo (bán tổng hợp) có thành phần của công thức 2 (cơ chất chính là đậu trắng có bổ sung tinh bột, đậu nành, vitamin tổng hợp và Vitamin E) cho khả năng sinh trưởng, phát triển, tỷ lệ sâu vào nhộng và vũ hóa cao hơn hẳn so với các công thức 1, công thức 4 và nuôi bằng lá thầu dầu. 3.1.5. Thời gian sống của trưởng thành Bảng 3. 5: Thời gian sống của trưởng thành THỜI GIAN TRƯỞNG THÀNH NGHIỆM THỨC SỐNG (NGÀY) Công thức 1 4,13 ± 1,63AB Công thức 2 4,51 ± 0,43A Công thức 3 4,51 ± 1,27A Công thức 4 2,32 ± 0,81B Công thức 5 (LÁ THẦU DẦU) 3,59 ± 0,49AB CV (%) 27,12 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. ns: không khác biệt thống kê. Số liệu ở bảng 3.5 cho thấy, thời gian sống của trưởng thành ở công thức 2 và công thức 3 là cao nhất (tương ứng với 4,51 ngày và 4,51 ngày) và thấp nhất là ở công thức 4 (tương ứng với 2,32 ngày). Thời gian sống của trưởng thành khi nuôi sâu trên công thức 2 và CT3 có xu hướng cao hơn (sai khác không có ý nghĩa thống kê) so với công thức nuôi bằng lá thầu dầu gần 1 ngày. 3.1.6. Khả năng sinh sản của trưởng thành
44 Bảng 3. 6: Khả năng sinh sản của trưởng thành ở các công thức SỐ Ổ TRỨNG/1 SỐ TRỨNG/1 TRƯỞNG NGHIỆM THỨC TRƯỞNG THÀNH CÁI THÀNH CÁI Công thức 1 3,33 ± 1,53BC 403,0 ± 143,70BC Công thức 2 6,33 ± 1,53A 1917,7 ± 201,63A Công thức 3 4,33 ± 0,58ABC 1071,0 ± 81,22AB Công thức 4 2,33 ± 0,58C 34,0 ± 58,89C Công thức 5 ( LÁ 5,33 ± 0,58AB 1786,7 ± 688,34A THẦU DẦU) CV (%) Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99%. ns: không khác biệt thống kê. Kết quả quan sát cho thấy ngài bắt đầu đẻ trứng vào đêm thứ 2 sau khi vũ hóa. Trưởng thành cái cái đẻ tập trung vào khoảng thời gian từ 2 - 3 ngày đầu và số lượng trứng giảm ở các ngày tiếp theo. Qua khảo sát khi nuôi sâu bằng các công thức thức ăn nhân tạo cho thấy, khả năng sinh sản của trưởng thành ở công thức 2 là cao nhất (tương ứng với 6,33 ổ trứng và 1917,7 trứng/ trưởng thành cái) và khả năng sinh sản của trưởng thành ở công thức 4 là thấp nhất (tương ứng 2,33 ổ trứng và 34 trứng/trưởng thành cái). Số trứng đẻ/trưởng thành cái đạt cao nhất ở công thức 2, tương đương với công thức nuôi sâu bằng lá và không sai khác có ý nghĩa so với nuôi sâu bằng công thức 3. Số trứng đẻ của trưởng thành có sâu ăn trên công thức 2 cao hơn hẳn so với ăn trên công thức 1 một lần nữa khẳng định, việc bổ sung vitamin E vào công thức 2 (so với công thức 1 không có vitamin E) không chỉ làm tăng khả năng sinh trưởng phát triển của pha sâu non mà còn làm tăng khả năng đẻ trứng của trưởng thành. A B
45 Hình 3. 3: Ổ trứng sâu khoang (A) sâu khoang mới nở (B) 3.2. Xác định nồng độ và loại thức ăn thêm phù hợp để nuôi trưởng thành 3.2.1. Thời gian sống của trưởng thành được cho ăn thêm Bảng 3. 7: Thời gian sống của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm Công thức Thời gian sống của trưởng thành cái Nước cất 4,83 ± 0,98 B Mật ong 5% 6,00 ± 0,89 AB Mật ong 10% 7,60 ± 2,07A Mật ong 20% 6,20± 2,68 AB Nước đường 5% 6,17± 1,17AB Nước đường 10% 7,33 ± 1,15 A Nước đường 20% 6,86 ±2,04 AB CV (%) 26,75 Ghi chú:. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa ở α = 0,05 Sự ăn của trưởng thành đóng vai trò quan trọng đến sự phát triển quần thể của hầu hết các loài côn trùng cũng như côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Boggs,1986). Số liệu ở bảng 3.7 cho thấy, việc cho ăn thêm bằng mật ong và nước đường có xu hướng làm tăng khả năng sống của trưởng thành từ 1,1 – 2,8 ngày. Trong đó, ăn thêm bằng nước đường hoặc mật ong 5% và 20% về giá trị tuyệt đối có thể làm tăng khả năng sống của trưởng thành lên khoảng từ 1,1 đến 2 ngày. Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê, giữa công thức cho ăn thêm bằng mật ong hoặc nước đường nồng độ 5% và 20% đều không sai khác có ý nghĩa so với cho ăn bằng nước cất. Trong khi đó, công thức cho
46 ăn bằng mật ong và nước đường 10% lại giúp trưởng thành sống lâu hơn có ý nghĩa thống kê so với ăn bằng nước cất từ 2,5 ngày đến 2,8 ngày. Có lẽ nước đường hoặc mật ong 5%, tuy có giúp trưởng thành sống lâu hơn nhưng do nồng độ thấp nên mức độ tác động chưa đủ. Trong khi đó,với nước đường hoặc mật ong 20%, nồng độ đường trong thức ăn thêm hơi cao cũng không phù hợp với một vài cá thể dẫn đến một số cá thể có xu hướng sống ngắn tương đương hoặc ngắn hơn so với chỉ ăn bằng nước cất. Như vậy, thức ăn thêm phù hợp cho trưởng thành sâu khoang là mật ong hoặc nước đường 10%. Kết quả này tương tự với kết quả của Salmah et al (2012). Theo các tác giả, tuổi thọ của trưởng thành sâu khoang kéo dài hơn khi được cho ăn thêm dịch nước đường 10% hoặc mật ong 10% so với chỉ cho ăn bằng nước cất. - Về khả năng sinh sản Số liệu ở bảng 3.8 cho thấy số ổ trứng đẻ của trưởng thành trong thí nghiệm này dao động từ 6,17 đến 12,67 ổ trứng. Trong đó, công thức ăn thêm bằng nước đường 10% có số ổ trứng/trưởng thành cái cao nhất (12,67 ổ trứng/trưởng thành cái) và khác biệt có ý nghĩa so với công thức chỉ ăn bằng nước cất. Các công thức còn lại như cho ăn bằng mật ong từ 5,10,20% cũng như cho ăn bằng nước đường 5 và 10% đều có số ổ trứng đẻ không sai khác so với đối chứng cho ăn bằng nước cất. Tuy nhiên, kết quả theo dõi cho thấy, ở công thức đối chứng, tuy số ổ trứng không sai khác so với các công thức cho ăn thêm (trừ nước đường 10%) nhưng trưởng thành ăn thêm bằng nước cất đẻ ổ trứng rất nhỏ (biến động từ 35 – 175 trứng/ổ), nhỏ hơn nhiều so với các công thức khác. Chính vì vậy, mặc dù số ổ trứng ở các công thức không sai khác nhau có ý nghĩa nhưng số trứng đẻ lại chênh nhau rất nhiều. (bảng 3.8). Số trứng/trưởng thành cái biến động từ 525 trứng (đối với công thức đối chứng chỉ ăn bằng nước cất) đến 2127 trứng đối với công thức cho ăn thêm bằng nước đường 10%. Các công thức cho trưởng thành ăn thêm bằng mật ong 5% (có số trứng đẻ là 1148 trứng/trưởng thành cái), mật ong 20% (974,60 trứng/ trưởng thành cái) và nước đường 5% (1192,33), tuy có số trứng/trưởng thành cái tăng gần gấp đôi so với đối
47 chứng chỉ ăn bằng nước cất (525 trứng/trưởng thành cái) nhưng do sức đẻ của trưởng thành biến độ nhiều nên mức sai khác không có ý nghĩa. Như vậy, chỉ có công thức cho ăn thêm bằng mật ong 10% và nước đường 10% là có số trứng đẻ của trưởng thành cao nhất, thứ đến là nước đường 20%. Bảng 3. 8: Khả năng sinh sản của trưởng thành trên các công thức cho ăn thêm Công thức Số ổ trứng Số trứng Nước cất 6,17± 4,71B 525,50± 310,80D Mật ong 5% 7,50± 1,64B 1148,17±146,80BCD Mật ong 10% 7,40± 3.65B 1695,00±328,16AB Mật ong 20% 5,00±3,54B 974,60±296,84CD Nước đường 5% 9,67± 2,25AB 1192,33±345,12BCD Nước đường 10% 12,67±5,69A 2127,00±1311,16A Nước đường 20% 8,43± 3,31AB 1320,29±582,84BC CV(%) 44,69 40,34 Ghi chú:. Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa ở α = 0,05 Như vậy, nước đường 10% và mật ong 10% là thức ăn thêm phù hợp nhất để nuôi trưởng thành sâu khoang (Spodoptera litura). Có cùng nhận xét này, Hou & Sheng (2000) cho biết, trưởng thành ăn thêm sẽ sống lâu hơn và đẻ nhiều hơn. Theo như Tisdale và Sappington (2001), thời gian đẻ, số trứng của trưởng thành ăn mật ong 10% cao hơn so với ăn nước cất. Giải thích điều này Barbehenn et al. (1999) cho rằng sự sống và khả năng sinh sản của trưởng thành cái được kéo dài là do nồng độ của carbohydrates trong nước và nồng độ của mật ong trong nước. Năng lượng được cung cấp từ dịch nước đường và mật ong đã giúp cho sự sống và khả năng sinh sản của trưởng thành cái tăng đáng kế (Idris & Grafius 1995). Shaw (1997) cho rằng mật ong là thức ăn thêm phù hợp nhất
48 cho trưởng thành vì mật ong cung cấp đủ nguồn protein, vitamin và đường cho trưởng thành. Nhưng theo tác giả, thời gian sống của trưởng thành được cho ăn thêm dịch nước đường 10% cũng tốt không kém gì so với trưởng thành được cho ăn thêm mật ong 20%. Nghiên cứu của Leatemia et al. (1995) cho biết, dịch nước đường dễ hấp thụ hơn cho hệ tiêu hóa của trưởng thành do đó trưởng thành vẫn đủ năng lượng cho sự sống và sinh sản. 3.3 Xác định khả năng sử dụng thức ăn nhân tạo để sản xuất chế phẩm sinh học NPV Thức ăn cho sâu cũng là một trong những yếu tố quan trọng gây ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất NPV. Thức ăn phù hợp với sâu thì sâu ăn nhiều đưa lượng vi rút vào cơ thể nhiều hơn. Trái lại thức ăn không phù hợp sâu ít ăn lượng vi rút không đủ để gây nhiễm cho sâu dẫn đến hiệu quả sản xuất thấp. Kết quả theo dõi ảnh hưởng của các loại thức ăn đến việc sản xuất NPV được thể hiện lần lượt qua các bảng sau Bảng 3. 9: Số sâu chết khi cho ăn thức ăn nhiễm NPV Nghiệm thức Số sâu chết (con) Hiệu lực gây chết (%) Công thức 1 17,66 ± 0,58NS 70,11 ± 2,89NS Công thức 2 18,66 ± 1,15NS 77,71 ± 5,77NS Công thức 3 19,00 ± 1,00NS 79,55 ± 5,00NS Công thức lá 18,66 ± 0,58NS 75,24 ± 2,89NS thầu dầu CV (%) 4,68 9,78 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với α = 0,01. Số liệu ở bảng 3.9 cho thấy, số sâu chết giữa các công thức tương đương nhau và biến động trong khoảng từ 17 đến 19 sâu. Tương ứng, hiệu lực gây chết sâu của NPV khi nhiễm trên các công thức thức ăn nhân tạo biến động trong khoảng từ 70 đến 79%, không sai khác có ý nghĩa thống kê và cũng đương đương so với đối chứng nhiễm trên lá thầu dầu (75%). Việc nhiễm trên thức ăn nhân tạo, chỉ cần lây nhiễm
49 01 lần và nuôi cho đến khi sâu chết. Trái lại trên công thức nhiễm bằng lá, sau 2 ngày, sâu ăn hết lá có nhiễm virus, sâu phải được chuyển và thay thức ăn hàng ngày. Thức ăn nhân tạo (hoặc thức ăn bán tổng hợp) ngoài các nguồn tinh bột vitamin ra còn bổ sung chất chống nấm và chống vi khuẩn nên hạn chế được các tác nhân lây nhiễm khác ngoài NPV. Trong khi đó, thức ăn tự nhiên (lá thầu dầu) hái ở ngoài đồng, mặc dù được rửa và hong khô nhưng không làm sạch hết được các vi sinh vật lây nhiễm. Vì vậy, việc sâu chết trên lá không chỉ do NPV mà còn có thể do các tác nhân khác. Vì vậy, trong sản xuất sinh khối NPV thì tỷ lệ sâu chết chưa nói lên hết được hiệu quả của việc nhân sinh khối mà phải tính đến lượng NPV nhân lên trong cá thể sâu chết. 3.3.3 Trọng lượng sâu chết Bảng 3. 10: Trọng lượng của sâu chết sau khi được cho ăn thức ăn nhiễm NPV Nghiệm thức Trọng lượng sâu chết (g) Công thức 1 0,17 ± 0.03C Công thức 2 0,53 ± 0.05A Công thức 3 0,44 ± 0.03B Công thức lá thầu dầu 0,52 ± 0.02AB CV (%) 7,54 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với α = 0,01. Dựa vào kết quả ở bảng 3.10, trọng lượng của sâu cao nhất là ở công thức 2 (tương ứng với 0,53g), sau đó đến trọng lượng sâu của công thức lá thầu dầu (tương ứng 0,52 g), tiếp đến là công thức 3 (tương ứng 0,52g) và thấp nhất ở công thức 1 (tương ứng với 0,17g). Như vậy, sâu tiêu thụ thức ăn đã nhiễm NPV nhiều nhất là ở công thức 2 nên sâu chết có kích thước to hơn và sâu ăn ở công thức 1 ít hơn nên sâu chết có trọng lượng sâu thấp nhất. Và xét về thành phần công thức ăn thì công thức 1 và 2 chỉ khác nhau ở chổ công thức 2 có bổ sung thêm 1% vitamin E. Nhưng độ chênh lệch về trọng lượng sâu chết khá cao (tương ứng 0.36 g). Kết quả này một lần nữa
50 khẳng việc bổ sung vitamin E giúp cho sâu phát triển tốt hơn khi sử dụng để sản xuất NPV. 3.3.4 Ảnh hưởng của thức ăn nhân tạo dùng để lây nhiễm sâu đến sản lượng virus. Bảng 3. 11: Sản lượng virus đạt được khi nhiễm sâu trên các loại thức ăn Công thức Sản lượng NPV (PIB/sâu) Log (x+1) mật độ virus 6 C Công thức 1 9,78 x 10 6,85 Công thức 2 1,91 x 109 9,28A 9 AB Công thức 3 1,08 x 10 9,03 8 B Công thức lá thầu dầu 6,01 x 10 8,78 CV (%) 2,58 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với α = 0,05. Theo kết quả khảo sát ở bảng 3.11 cho thấy, sản lượng NPV đạt cao nhất ở công thức 2 (tương ứng với 1,91 x 109 PIB/sâu), tiếp đến là ở công thức 3 ( tương đương 1,08 x 109 PIB/sâu) sau đó là công thức lá thầu dầu (tương đương 6,01 x 108 PIB/sâu) và thấp nhất ở công thức 1 (tương ứng với 9,78 x 106 PIB/sâu). Xét về giá trị tuyệt đối, sản lượng virus ở công thức 2 tăng 76% so với công thức 3 và sản lượng NPV công thức 3 cũng cao hơn sản lượng NPV ở công thức nhiễm bằng lá là 80%. Tuy nhiên, do độ biến động của thí nghiệm khá lớn nên sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê. Lượng virus khi nhân nhiễm trên công thức 2 cao hơn hẳn so với trên công thức lá. Do sâu tiêu thụ thức ăn ở công thức 2 nhiều hơn nên lượng virus đã được đưa vào cùng thức ăn cũng nhiều hơn. Mặt khác, ở công thức 2, sâu ăn nhiều, sinh khối sâu cao nên sự nhân lên của virus cũng cao hơn hẳn so với các công thức còn lại. Trong khi đó, khi nhiễm trên công thức 1, sâu ăn ít hơn, sinh trưởng kém nên lượng virus nhân lên là thấp nhất. Như vậy, sử dụng thức ăn nhân tạo (bán tổng hợp) có thành phần của CT2 để nhân NPV cho sản lượng virus cao hơn so với nhiễm bằng thức ăn tự nhiên là lá thầu dầu.
51 Hình 3. 4: Sâu chết do nhiễm NPV 3.4 Giá thành nuôi sâu ở các công thức Công nghệ nhân nuôi sâu hàng loạt trên môi trường thức ăn nhân tạo là để sản xuất chế phẩm vi rút trừ sâu. Muốn có một chế phẩm tốt, điều trước tiên chế phẩm đó phải có hiệu lực diệt sâu cao và giá thành phù hợp. Nếu chỉ có hiệu lực trừ sâu cao mà giá thành quá cao thì sẽ không được chấp nhận và sử dụng phổ biến rộng rãi được. Thức ăn tự nhiên rất khó đáp cho việc nuôi sâu số lượng lớn, sâu dễ nhiễm các tác nhân khác đồng thời thức ăn tự nhiên là lá rất mau bị hư hỏng, chiếm nhiều diện tích để bảo quản, thời gian bảo quản không được lâu không đáp ứng được yêu cầu sản xuất NPV, sâu phải thay hàng ngày nên giá thành cao. Vì vậy sử dụng thức ăn nhân tạo thay thế thức ăn tự nhiên là rất lý tưởng trong quy trình nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ tạo chế phẩm NPV (Gupta et al, 2005). Bên cạnh các chỉ tiêu về sinh trưởng phát triển của sâu, chi phí thức ăn cũng là chỉ tiêu đáng quan tâm vì nó liên quan đến giá thành của chế phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chi phí thức ăn cho mỗi mẻ cao nhất là ở công thức 4 (48.8500đ) và thấp nhất là công thức 1 (24.278đ). Vanderzant et al., (1962b) cho biết các loại protein có trong hạt đậu là yếu tố quan trọng để nhân nuôi côn trùng vì chúng giúp côn trùng tăng trưởng và phát triển tốt, tăng khả năng sống sót, tăng khả năng lột xác, tăng khả năng tái tạo biểu bì, hỗ trợ quá trình tổng hợp melanine và hoạt động của hệ miễn dịch của côn trùng. Như vậy từ những kết quả thu được, có thể thấy đậu trắng và đậu nành là một nguồn cung cấp protein phù hợp nhất để nuôi sâu khoang số lượng lớn trong điều kiện phòng thí nghiệm.
52 Lượng agar trong các thành phần thức ăn nhân tạo thường chiếm một tỷ lệ khá cao, điều này dẫn đến giá thành của thức ăn cao. Vì vậy, M.A.Sorour đã nghiên cứu giảm lượng agar bằng việc bổ sung tinh bột để nuôi sâu Spodoptera littoralis. Trên cơ sở công thức thức ăn nuôi sâu khoang Spodoptera littoralis của Shorey và Hale (1965), tác giả đã thay thế 20g agar bằng 150g tinh bột. Kết quả, trọng lượng của sâu non, nhộng và ấu trùng cũng như tỷ lệ sâu vào nhộng, tỷ lệ nhộng hóa trưởng thành đều tốt hơn so với công thức chỉ dùng agar. Hơn thế nữa, giá thành của nguyên liệu cũng giảm 45.6%. Khi thay thế agar, casein bằng tinh bột và đậu trắng, đậu nành là những sản phẩm dễ tìm thấy và mua tại Việt Nam, giá thành khá rẻ cho nên công thức thức ăn nhân tạo công thức 2 nuôi sâu khoang sẽ giảm rất nhiều và chúng ta có thể nhân nuôi sâu khoang số lượng lớn phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học. Bảng 3. 12: Chi phí thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang của các công thức Chi phí cho mỗi mẻ thức Chi phi nuôi cho mỗi sâu Công thức ăn (đồng) (đồng) Công thức 1 24.578 102 Công thức 2 26.578 110 Công thức 3 26.470 110 Công thức 4 44.850 186 Ghi chú: Mỗi mẻ thức ăn nuôi được 240 sâu Giá thành mỗi mẻ thức ăn ở công thức 1 thấp nhất nhưng do sâu phát triển kém, khả năng vào nhộng thấp nên giá thành mỗi nhộng ở công thức này là cao nhất (256 đ/nhộng). Công thức 2 và công thức 3 do tỷ lệ sâu vào nhộng cao hơn nên giá thành mỗi nhộng lại thấp nhất (121 – 124 đồng/nhộng) (bảng 3.13)
53 Bảng 3. 13: Chi phí thức ăn nhân tạo nuôi nhộng bằng các công thức Công thức Chi phi nuôi cho mỗi nhộng (vnđ) Công thức 1 256 Công thức 2 121 Công thức 3 124 Công thức 4 431
54 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Trong bốn loại thức ăn nhân tạo khảo sát, thành phần thức ăn của công thức 2 giúp sâu sinh trưởng và sinh sản tốt hơn cả. Công thức này với cơ chất chính là đậu trắng có bổ sung thêm đậu nành, tinh bột và vitamin E cho các kết quả chỉ tiêu sinh trưởng thích hợp cho nhân nuôi sâu khoang số lượng. Trong số các loại thức ăn thêm cho trưởng thành thì dịch nước đường 10% và mật ong 10% là phù hợp và hiệu quả nhất để nuôi trưởng thành. Sử dụng thức ăn nhân tạo có thành phần của công thức 2 (cơ chất chính là đậu trắng có bổ sung thêm đậu nành, tinh bột và vitamin E) để lây nhiễm NPV cho sâu khoang, cho sản lượng virus cao hơn so với sử dụng lá thầu dầu. 4.2. Kiến nghị Khuyến cáo sử dụng công thức 2 (cơ chất chính là đậu trắng) làm thức ăn nhân tạo để nuôi sâu khoang số lượng lớn và sản xuất NPV sâu khoang. Ngoài cải tiến thành phần môi trường thức ăn nhân tạo, cần tiến hành thêm các nghiên cứu về phương pháp nhân nuôi sâu khoang thích hợp nhằm phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm NPV.
55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nước: [1]. Trịnh Thị Xuân, Trương Thanh Xuân Liên và Trần Văn Hai,So sánh thức ăn nhân tạo và lá hành lên sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh sản của sâu xanh da láng [2]. Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), Giáo trình Côn trùng Nông nghiệp, phần B: Côn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. [3]. Nguyễn Đức Khiêm (2006), Giáo trình Côn trùng nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. [4]. Trần Văn Mão (2002), Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích (Tập 2): Sử dụng vi sinh vật có ích, Giáo trình Đại học Lâm Nghiệp, Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. [5]. Ngô Trung Sơn (1998), Nghiên cứu sử dụng HaNPV trong phòng trừ tổng hợp sâu xanh hại bông tại Ninh Thuận. Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. [6]. Phạm Thị Thùy (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. [7]. Quách Hải Trí ( 2011), Chọn lọc môi trường thức ăn nhân tạo nhân nuôi sâu khoang ( Spodoptera litura). Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh [8]. Nguyễn Thị Hai Nguyễn Hoài Hương 2015. Phân lập, đinh danh virus gây chết sau khoang Spodoptera litura (Fabr.) và hiệu lực của chúng. Tạp chí Bảo vệ thực vật số 1 năm 2015 [9]. Chi cục bảo vệ thực vật Tp. Hồ Chí Minh, Sâu khoang ( sâu an tạp), 09/ 2010, [10]. Lê Hữu Việt (2009), Khảo sát hiệu lực của protozoa, khả năng cộng hưởng giữa npv và protozoa, một số loại thuốc trừ sâu đối với sâu ăn tạp Spodoptera litura fab trong điều kiện phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp, trường Đại
56 học Cần Thơ, Cần Thơ, hieu-luc-cua-protozoa-kha-nang-cong-huong-giua-npv-va-protozoa-mot-so- loai-thuoc-tru-sau-doi-voi-sau-an-tap-spodoptera-litura-fab-trong-dieu-kien- phong-thi-nghiem.htm 2. Tài liệu nước ngoài: [11]. EPPO (2015), PM 7/124 (1) Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Spodoptera frugiperda, Spodoptera [12]. Ahmad-Ur-Rahman Saljoqi, Riaz ul Haq, Ehsan-ul-haq, Javed G. Khan, Ghulam Ali, Rearing of Spodoptera litura (Fabricius) on Different Artificial Diets and its Parasitization with Trichogramma chilonis (Ishii) • [13]. SALMAH M., BASRI M.W. & IDRIS A.B.*, (2012) Effects of Honey and Sucrose on Longevity and Fecundity of Apanteles metesae (Nixon), a Major Parasitoid of the Oil Palm Bagworm, Metisa plana (Walker) • [14]. Sorour M.A., O.Khamiss, A.S.Abd El-Wahab, M.A.K.El-Sheikh and S.Abul-Ela( 2011), An Economically Modified Semi-Synthetic Diet for Mass Rearing the Egyptian Cotton Leaf Worm Spodoptera littolaris, Academic Journal of Entomology 4 ( 3), 118- 120. • [15]. Barbehenn, R.V., Reese, J.C. & Hagen, K.S. 1999. The food of insects. In Ecological Entomology, edited by Huffaker, C.B. & Gutierrez, A.P. (2nd Ed.). New York: John Wiley and Sons. • [16]. Elvira Sonia, Noelia Gorria, Delia Munoz, Trevor Williams and Primitivo Caballero( 2010), A Simplified Low-Cost Diet for Rearing Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) and Its Effect on S. Exigua Nucleopolyhedrovirus Production, J. Econ. Entomol. 103(I): 17-24. • [17]. Gupta, G.P., S. Rani, A. Birah and M. Raghuraman, 2005. Improved artificial diet for mass rearing of thetobacco caterpillar, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Int. J. Trop. Insect Sci., 25(1): 55-58. • [18]. Burgess. S.1977, Molecular weight of lepidoptera Baculovirus dans derivation by electron microscopy, 501 – 510.
57 • [19]. CABI. 2009. Crop protection compendium: global module. Commonwealth Agricultural Bureau International, Wallingford, UK. • [20]. Chari, M. S. andS. N. Patel. 1983. Cotton leaf worm Spodoptera litura Fabricius its biology and integrated control measures. Cotton Dev. 13(1): 7–8. • [21]. Elangovan Elamathi ,J. RajaRajaCholan,N. Vijayakumar &A. Ramamourti (2011), Formulation and optimisation of various nuclear polyhedrosis virus isolates and assessment of their insecticidal activity against Helicoverpa armigera (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) larvae • [22]. EPPO/CABI. 1997. Spodoptera littoralis and Spodoptera litura. In: Smith IM, McNamara DG, Scott PR, Holderness M, eds. Quarantine pests for Europe. 2nd edition. Wallingford, UK: CAB International, 518– 525. • [23]. Erma S. Vanderzant, 1962, Wheat-Germ Diets for Insects: Rearing the Boll Weevil and the Salt-Marsh Caterpillar • [24]. Evans, H. F. (1986), “ The biology of Baculovirus” (eds Granados, R. R. and Federici, B. A.), CRC Press, Boca Raton, Fl, vol. II, pp. 89 - 132. [14]. Bud, H. M and M. D. Kelly (1980), “Nuclear polyhedrosis virus DNA infectious”, Micro- biologycal, 3, 103 - 108. • [25]. G. P. Gupta; Sidra Rani; A. Birah; Mahadevan Raghuraman (2005), Improved artificial diet for mass rearing of the tobacco caterpillar, Spodoptera litura (Lepidoptera Noctuidae) • [26]. G.V. Ranga Rao, Ch. Sridhar Kumar, K. Sireesha, and P. Lava Kumar, Role of Nucleopolyhedroviruses (NPVs) in the Management of Lepidopteran Pests in Asia • [27]. H. H. Shorey R. L. Hale, 1965, Mass-Rearing of the Larvae of Nine Noctuid Species on a Simple Artificial Medium • [28]. Hashmat, M. and M. A. Khan. 1977. The effect of temperature on the fecundity and fertility of Spodoptera litura (Fabr.) (Lepidoptera: Noctuidae). J. Anim. Morphol. Physiol. 24(2): 203–210.
58 • [29]. Idris, A.B. & Grafius, E. 1995. Wildflowers as nectar sources for Diadegma insulare (Hymenoptera: Ichneumonidae), a parasitoid of Diamondback moth (Lepidoptera: Yponomeutidae). Environmental Entomology 24: 1726- 1735. • [30]. Leatemia, J.A., Laing, J.E. & Corrigan, J.E. 1995. Effects of adult nutrition on longevity, fecundity and offspring sex ratio of Trichogramma minutum Riley (Hymenoptera: Trichogrammatidae) Canadian Entomologist 127: 245- 254. • [31]. Leonardo, D. E., and C. C. Doane (1966). An artificial diet for gypsy moth Por • thetria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae). Annals of the Entomological Society of America. 59: 462-464. • [32]. M. H. Mansour , Nadia Z. Dimetry, 1972, Effect of Crowding on Larvae and Pupae of the Greasy Cutworm Agrotis ipsilon Hfn. (Lepid.: Noctuidae) • [33]. M. SALMAH, M.W. BASRI & A.B. IDRIS*, (2012) Effects of Honey and Sucrose on Longevity and Fecundity of Apanteles metesae (Nixon), a Major Parasitoid of the Oil Palm Bagworm, Metisa plana (Walker) • [34]. Parasuraman, S. 1983. Larval behaviour of Spodoptera litura (F.) in cotton agr • o-ecosystem. Madras Agric. J. 70(2): 131-134. • [35]. Parasuraman, S. and S. Jayaraj. 1982. Studies on light trap catches of tobacco caterpillar Spodoptera litura (F.). Cotton Dev. 13(1): 15-16. • [36]. Parasuraman, S. and S. Jayaraj. 1983a. Effect of temperature and relative humidity on the development and adult longevity of the polyphagous Spodoptera litura (Fabr.) (Lepidoptera: Noctuidae). Indian J. Agric. Soc. 53(7): 582–584. • [37]. Parasuraman, S. and S. Jayaraj. 1983b. Pupation behaviour of Spodoptera litura (F). Madras Agric. J. 69(12): 830–831. • [38]. Pearson, E. O. 1958. The insect pests of cotton in tropical Africa. Commonwealth Inst. Entomol., London.