›

Đồ án Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16S rDNA trong xác định loài bằng phương pháp DGGE

pdf 95 trang thiennha21 12/04/2022 7390
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16S rDNA trong xác định loài bằng phương pháp DGGE", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_kiem_tra_do_tinh_sach_doan_gene_16s_rdna_trong_xac_din.pdf

Nội dung text: Đồ án Kiểm tra độ tinh sạch đoạn gene 16S rDNA trong xác định loài bằng phương pháp DGGE

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KIỂM TRA ĐỘ TINH SẠCH ĐOẠN GENE 16S rDNA TRONG XÁC ĐỊNH LOÀI BẰNG PHƯƠNG PHÁP DGGE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Hoàng Quốc Khánh CN Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện : Hà Trầm Xuân MSSV: 0851110305 Lớp: 08DSH6 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật 5 1.2. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic 5 1.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong môi trường tự nhiên 5 1.2.2. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch nuôi cấy. 7 1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR 7 1.3.1. Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid. 7 1.3.2. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh vật. 7 1.3.3. Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng. 9 1.3.4. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự. 9 1.3.5. Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truyền. 10 1.4. Phương pháp DGGE và ứng dụng 10 1.5. Định danh nhóm vi khuẩn 12 i
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống 12 1.5.2. Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử. 14 1.6. Xây dựng cây phát sinh loài chủng loài 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1. Địa điểm nghiên cứu 20 2.2. Vật liệu thí nghiệm 20 2.3. Thiết bị và dụng cụ 22 2.4. Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của từng chủng vi khuẩn. 23 2.4.1. Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt. 24 2.4.2. Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA genomic trong mẫu sau khi ly trích. 26 2.4.3. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR. 27 2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng QIAGEN Kit. 28 2.4.5. Quy trình Applied Biosystems 30 2.4.6. Xác định thành phần của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE. 32 2.5. Sử dụng phần mềm tin sinh học 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 37 3.1. Kết quả tăng sinh và kiểm tra hình thái tế bào của 9 chủng vi khuẩn. 37 3.2. Kết quả ly trích DNA genomic bằng nhiệt của 9 chủng vi khuẩn. 42 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. 42 3.4. Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit 43 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn. 44 ii
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài 54 3.7. Kết quả khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE 56 3.8. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN 57 3.9. Kết quả vùng V3 trên gel polyacrylamide của 9 chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE. 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 59 4.1. Kết luận 59 4.2. Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 1 iii
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyl – trimetyl – ammomiumbromide DNA Deoxyribonucleic acid DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid EtBr Ethidium bromide PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulfate RNA Ribonucleic acid TAE Tris – Acetic – EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris – EDTA UV Ultra Violet iv
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn 20 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl 27 Bảng 2.3: Thành phần Big – Dye Reaction mồi xuôi 27F 30 Bảng 2.4: Thành phần Big – Dye Reaction mồi ngược 1492R 30 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của DGGE 32 Bảng 2.6: Nồng độ pha gel polyacrylamide 34 Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn gel polyacrylamide vào hai xilanh 34 Bảng 3.1: Kết quả quan sát hình thái học của 9 chủng vi khuẩn. 37 Bảng 3.2: Kết quả soi dưới kính hiển vi 100X của 9 chủng vi khuẩn 39 v
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn. 23 Sơ đồ 2.2: Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt 25 Sơ đồ 3.3: Kiểm tra DNA genomics sau khi ly trích 26 Sơ đồ 3.4: Quy trình tinh sạch DNA sau khi chạy PCR 29 Sơ đồ 3.5: Quy trình Applied Biosystems 31 vi
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Hệ thống thiết bị chạy DGGE. 36 Hình 3.1: Kết quả tăng sinh của 9 chủng vi khuẩn. Đó là các chủng A, B, C, D, E, F, G, H và K. 41 Hình 3.2: Kết quả thu nhận DNA genomic của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% 42 Hình 3.3: Kết quả thu nhận đoạn gene 16S rDNA khi chạy PCR trên gel agarose 1% 43 Hình 3.4: Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit trên gel agarose 1%. 44 Hình 3.5a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng A 45 Hình 3.5b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng A. 45 Hình 3.6a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng B 46 Hình 3.6b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng B 46 Hình 3.7a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng C 47 Hình 3.7b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng C 47 vii
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.8a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng D 48 Hình 3.8b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng D 48 Hình 3.9a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng E 49 Hình 3.9b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng E. 49 Hình 3.10a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng F. 50 Hình 3.10b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng F. 50 Hình 3.11a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng G. 51 Hình 3.11b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng G. 51 Hình 3.12a: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng H. 52 Hình 3.12b: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng H 52 Hình 3.13a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng K 53 Hình 3.13b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng K 53 viii
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.14: Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của 8 chủng khảo sát (chủng E, F, G, H, K) so với dữ liệu của ngân hàng gene. 55 Hình 3.15: Kết quả khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% 56 Hình 3.16: Kết quả chạy DGGE vùng V3 trên gel acrylamide biến tính 57 ix
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Việc phân lập và định danh vi khuẩn có tầm quan trọng rất lớn trong các nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật như: môi trường, công nghiệp, y tế, nông nghiệp và sinh thái vi sinh vật. Trước đây công tác phân loại vi sinh vật cơ bản dựa vào các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa sinh của vi sinh vật: nhuộm, hình thái tế bào, bào tử, khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng lên men, sinh acid trong môi trường nuôi cấy cũng như các sắc tố được tạo thành v.v Các đặc trưng này phần lớn đã định danh sơ bộ các họ và chi của vi sinh vật. Tuy nhiên, để định danh cụ thể và đạt độ chính xác cao về từng loài vi sinh vật thì cần phải kết hợp với phương pháp sinh học phân tử - một phương pháp định danh nhanh chóng và có độ tin cậy. Mỗi phương pháp có thể cho phép khẳng định tới một mức độ nhất định nào đó của hệ thống phân loại như: đến loài, dưới loài và một vài phương pháp có thể khẳng định đến cấp độ giống hay dòng. Các phương pháp định danh dựa trên nền tảng là DNA đang được sử dụng rộng rãi do độ tin cậy cao, đơn giản và rẻ tiền để xác định và phân loại vi khuẩn. Trong thực tế, sự phân biệt giữa giống và loài được thực hiện theo phương pháp lai DNA-DNA (Wayne and al., 1987). Hiện nay, dựa trên kỹ thuật phân tích trình tự đoạn gen16S rDNA ngày càng phát hiện ra loài mới (Woese.,1987; Stackebrandt và Goebel.,1994). Và một trong các phương pháp thường được dùng để định danh vi khuẩn gọi là kỹ thuật dấu vân tay di truyền Rep- PCR, hay Rep-PCR genomic fingerprinting, kỹ thuật này dựa trên nền tảng của sự khuếch đại DNA. Với kỹ thuật này cho kết quả nhanh chóng, hiệu quả và đạt độ tin cậy cao (Versalovicand et al., 1994; Louws et al., 1996). 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Thế giới Qui trình Rep-PCR genomic fingerprinting do nhóm nghiên cứu của tiến sĩ JR Lupski trường Baylor College of Medicine (Houston, Texas) phát triển và đã được 1
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ứng dụng trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học, xác định và phân loại vi khuẩn, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử của con người và bệnh cây. Và một trong những thành tựu lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử là công trình giải mã trình tự bộ gene người được công bố bản phát thảo vào năm 2000 và hoàn thiện vào năm 2003. Ứng dụng thành công của PCR là đã xác định tính đa dạng tập đoàn vi khuẩn trong quá trình xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở quy mô nhỏ hiện trường của Cộng hòa Liên bang Đức tại trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Helmholtz (GBF). 2.2. Trong nước Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử được quan tâm rất nhiều ở nước ta, thành tựu tiêu biểu nhất là kỹ thuật sinh học phân tử trong chuẩn đoán bất thường phôi thai. Đây được xem là thành tựu mang tính tiên phong trong việc hạn chế trẻ sơ sinh bất thường, góp phần nâng cao chất lượng dân số. Ứng dụng này sử dụng kỹ thuật QF-PCR trong việc chẩn đoán hội chứng Down và các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể,triển khai các chuẩn đoán di truyền cho các bệnh phổ biến khác như bệnh Hemophilia, giải trình tự DNA, chuẩn đoán đột biến gen AZF gây hiếm muộn, chuẩn đoán nhiễm CMV và Rubella thai kỳ. Một số thành công gần đây của kỹ thuật sinh hoc phân tử là ứng dụng PCR với giải trình tự trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mũ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn, xác định một số loài sâm thuộc chi PANAX, trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí, phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản. Và ứng dụng trong xây dựng lý lịch 16S rDNA của các chủng vi khuẩn dung trong kiểm chuẩn, làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn 3. Mục đích nghiên cứu Ly trích và thu nhận DNA genomic từ mẫu vi khuẩn đã phân lập trong quá trình trồng ủ rơm. 2
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR của đoạn gene 16S rNDA dựa trên cặp mồi 27F và 1492R. Trình tự cặp mồi 27F 5‘-GA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3‘, 1492R 5'-GG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3' Tiến hành tinh sạch đoạn gene 16S rDNA và giải mã trình tự đoạn gene này. Kiểm tra độ tinh sạch của đoan gene 16s rDNA bằng phương pháp DGGE trong xác định loài. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Ly trích và thu nhận DNA genomic trực tiếp từ chủng vi khuẩn đã phân lập trong quá trình ủ rơm. Xác định nhóm vi khuẩn bằng phương pháp khuếch đại đoạn gene 16S rDNA, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn xem chúng có thuần hay không. Nếu mẫu không thuần thì khuếch đại vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE, điện di và kiểm tra sản phẩm PCR trên gel acrylamide biến tính. Kiểm tra nồng độ DNA và tiến hành chạy DGGE để cho kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA được chính xác. 5. Phương pháp nghiên cứu Ly trích và thu nhận DNA genomic bằng quy trình nhiệt. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR. Tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit. Giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA bằng quy trình Applied Biosystems Khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE để kiểm tra độ nhiễm DNA. 6. Kết quả nghiên cứu Ly trích và thu nhận DNA genomic của chủng vi khuẩn 3
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xác định được mỗi chủng vi khuẩn dựa vào sự khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. Giải mã trình tự được đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn. Xác định được chủng vi khuẩn của vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE. Kiểm tra được nồng độ DNA và độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA trong quá trình xác định loài. 7. Kết cấu của Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:  Chương 1: Tổng quan.  Chương 2: Vật liệu và phương pháp.  Chương 3: Kết quả và thảo luận.  Chương 4: Kết luận và kiến nghị. 4
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về nhóm vi sinh vật Vi sinh vật (microorganisms) là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thái nhỏ bé nuốn thấy được mà phải dùng dưới kính hiển vi. Vi sinh vật không phải là một nhóm riêng biệt trong sinh giới. Chúng thậm chí thuộc nhiều giới (kingdom) sinh vật khác nhau. Giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau. Chúng có thể có chung những đặc điểm vể kích thước, sinh lí, sinh hóa Khoa học phát triển thì vai trò của vi sinh vật được ứng dụng càng nhiều trong sản xuất và đời sống, nó mang lại hiệu quả lớn. Ví dụ như việc chế vaccine phòng bệnh, sản xuất chất kháng sinh và các dược phẩm quan trọng khác Đặc biệt trong bảo vệ môi trường, người ta đã sử dụng vi sinh vật làm sạch môi trường, xử lý các chất thải độc hại. Sử dụng vi sinh vật trong việc tạo chế phẩm sinh học, phân bón sinh học và thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật không gây độc hại cho môi trường bảo vệ sự cân bằng sinh thái. Trong thiên nhiên ngoài những nhóm vi sinh vật có ích như trên, còn có những nhóm vi sinh vật gây hại. Ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho người, động vật và thực vật, các nhóm vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm, ô nhiễm các nguồn nước, đất, không khí Nếu nắm vững cơ sở sinh học của tất cả các quá trình có lợi hay có hại trên thì sẽ có những biện pháp khoa học để phát huy những mặt có lợi và hạn chế những mặt gây hại của vi sinh vật, đặc biệt trong bảo vệ môi trường xung quanh ta sống. 1.2. Các phương pháp ly trích và thu nhận DNA genomic 1.2.1. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật trong môi trường tự nhiên Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc tập đoàn vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá 5
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thông qua việc xác định bởi tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gene hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. [14] Sự ra đời kỹ thuật dựa trên phân tử nucleic acid đã dẫn đến sự thay đổi lớn trong phát hiện vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Với những kỹ thuật này đã phát hiện một số thay đổi lớn về việc tìm hiểu cấu trúc và sự vận động của các vi sinh vật cộng đồng trong tự nhiên. Mặc dù các phương pháp trong kỹ thuật dựa trên phân tử acid nucleic này đã phá vỡ những hạn chế trong việc chọn lọc và tính chất đặc trưng trong việc ly trích DNA. Sự phục hồi tính đa dạng của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của việc ly trích DNA từ đất (Laurent et al. 2001). Độ tinh khiết của DNA từ đất và compost thường không đạt yêu cầu, đặc biệt trong trường hợp đất giàu hợp chất humic (Courtois et al. 2001). Sự hiện diện của hợp chất humic trong môi trường tự nhiên sẽ cản trở sự phát hiện DNA, đo lường và tinh sạch (Chu et al. 1996). Vì vậy lựa chọn các phương pháp ly trích và tinh sạch là rất quan trọng cho DNA của vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16]  Một số phương pháp trích ly DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên:  Phương pháp SDS (Sodium docetyl sulfate): đây được xem là phương pháp thích hợp nhất cho việc ly trích DNA của vi sinh vật. Đặc biệt là ly trích DNA từ đất vùng rễ nơi mà tập trung nhiều cộng đồng vi sinh vật. Sử dụng phương pháp SDS có thể loại bỏ các hợp chất Humic có trong đất, 1 hợp chất gây cản trở phát hiện DNA. [16]  Phương pháp CTAB (Cety- trimetyl- anmoniumbromide): Đây là phương pháp trong chiết suất acid nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. CTAB là dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. [16]  Phương pháp PVP (polyvinylpolypyrrolidone): Đây là phương pháp tách chiết acid nucleic hiệu quả. Trong thành phần dung dịch đệm ly trích có sử dụng chất PVP, nó đóng vai trò ràng buộc các tạp chất có trong đất và loại bỏ chúng giúp ly trích DNA dễ dàng hơn. [16] 6
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Phương pháp đóng băng và tan băng: Đây là phương pháp dùng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở nhiệt độ -650C trong 3 chu trình nhằm phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên. [16] 1.2.2. Phương pháp ly trích và thu nhận DNA tổng số vi sinh vật từ dịch nuôi cấy Để ly trích DNA tổng số từ dịch nuôi cấy vi sinh vật, có thể áp dụng nhiều quy trình khác nhau, nhưng trong bài báo cáo này sử dụng quy trình ly trích DNA genomic bằng nhiệt. Sau khi ly trích, DNA tổng số được điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 110V trong 45 phút và đo Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch. Phương pháp này sử dụng nhiệt để làm biến tính DNA. Do ở nhiệt độ cao (94- 950C) thì DNA mạch đôi được phân tách thành hai DNA mạch đơn. Điều này này giúp cho việc ly trích DNA đạt hiệu quả cao nhất. 1.3. Các ứng dụng của phương pháp PCR 1.3.1. Ứng dụng phương pháp PCR trong xác định trình tự nucleic acid Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide. Phương pháp này chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước và ứng dụng chủ yếu là nhẳm phát hiện nhanh một đột biến điểm. Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự được khuếch đại bằng phương pháp PCR. Sau đó, hai mạch của phân tử được tách rời nhau. Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi. Phản ứng tổng hợp xảy ra tương tự trong các phương pháp enzyme hay sử dụng dideoxynucleotide. 1.3.2. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình xác định loài vi sinh vật Ngày nay phương pháp PCR ngày càng có nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Hiện nay trong nghiên cứu để xác định loài vi sinh vật thì phương pháp PCR đóng vai trò vô cùng quan trọng vì có độ nhạy rất cao, thao tác cũng rất đơn giản. Phương pháp PCR được xem là bước khởi đầu của 7
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP các nghiên cứu tiếp theo. Chính vì vậy phương pháp này càng được các nhà khoa học sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khoa học. Để xác định loài vi sinh vật thì điều đầu tiên là phải chọn được đại phân tử phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA. Để có thể giải trình tự các đoạn gene mong thi muốn, thì phải khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR. Từ đó người ta nghiên cứu về các trình tự DNA để thiết lập cây phát sinh chủng loại từ các phân tử này. Tiến hành PCR khuếch đại những đoạn gene đặc trưng của các loài vi sinh vật nghiên cứu dựa trên những cặp mồi đặc trưng của từng loài vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có những cặp mồi chuyên biệt để có thể dựa vào đó chúng ta có thể dễ dàng xác định được chúng. Sử dụng phương pháp PCR để xác định giống Lactobacillus được thực hiện thông qua việc sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm: Lac 1 và Lac 2, trình tự các cặp mồi này như sau:  Lac 1: 5’ – AGC AGT AGG GAA TCT TCC A – 3’  Lac 2: 5’ – ATT CCA CCG CTA CAC ATG – 3’ Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA được thực hiện với hai mổi chuyên biệt cho giống Lactobacillus gồm Lac 3 và Lac 4, trình tự các mồi như sau:  Lac 3: 5’ – GGA AAC AGA TGC TAA TAC CG – 3’  Lac 4: 5’ – CAC CGC TAC ACA TGG AG – 3’ Sử dụng phản ứng PCR khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA và đoạn gene ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men. Các cặp mồi được sử dụng khuếch đại đoạn gene D1/D2 26S rDNA, ITS 5,8S rDNA đặc trưng cho nấm men. Trình tự cặp mồi NL và ITS . Cặp NL: NL 4 5’ – GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG – 3’ NL 4 5’ – GGT CCG TGT TTC AAG ACG G – 3’ . Cặp ITS: ITS1 5’ – TCC GTA GGT GAA CCT GCG G – 3’ ITS4 5’ – TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’ 8
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phương pháp PCR là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc xác định loài vi sinh vật. Đối với loài vi sinh vật cũng vậy, người ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại những đoạn gene của vi khuẩn. Kết quả thu được từ những phản ứng PCR là thu nhận những đoạn gene với kích thước như mong muốn. Mỗi loài vi khuẩn đều có những cặp mồi chuyên biệt. Dựa trên những cặp mồi chuyên biệt này kết hợp với những yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR thì việc xác định loài vi khuẩn trở nên đơn giản hơn. Trên thực tế người ta muốn xác định loại vi khuẩn thì không thường thì người ta sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn với những cặp mồi chuyên biệt. 1.3.3. Ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản ứng để sau đó phát hiện chúng, do vậy PCR nay đang trở thành một công cụ chẩn đoán nhạy cảm nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp, để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau. 1.3.4. Ứng dụng phương pháp PCR trong quá trình thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự Nhờ có công cụ PCR trong kỹ thuật giải trình tự gene mà các nhà khoa học có thể hoàn tất được công trình giải mã bộ gene người sớm hơn dự định trên 10 năm và từ kết quả của công trình trình này, nhiều cánh cửa mới của y sinh học đã được mở với vô vàn các ứng dụng đầy triển vọng trong công nghệ dược phẩm protein, trong sinh-tin học (bio-informatic), trong chẩn đoán bệnh bằng các gen-chip. Lý do để nói PCR là đòn bẩy để thúc đẩy nhanh công nghệ giải trình tự là vì nhờ có PCR mà các nhà khoa học đã thay đổi được phản ứng giải trình tự trong phương pháp giải trình tự với hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều và nhạy hơn rất nhiều. Ngoài ra, cũng nhờ có PCR mà các sản phẩm giải trình tự sẽ được nhân bản thành nhiều bản sao 9
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đồng nhất về chiều dài và trình tự, do vậy mà sẽ có được kết quả giải trình tự chính xác hơn. Với PCR kết hợp giải trình tự, nhà nghiên cứu có thể giải trình tự trọn vẹn DNA hay RNA bộ gene của virus gây bệnh có trong mẫu thử mà không cần phải nuôi cấy được virus này vào tế bào bằng cách thiết kế các mồi đặc hiệu cho từng đoạn trên bộ gene mà các đoạn này có trình tự ở hai đầu trùng lắp nhau, rồi dung PCR để khuếch đại các đoạn DNA này lên. Giải trình tự các sản phẩm PCR này, cuối cùng so chuỗi để tìm những trình tự trùng lắp làm cơ sở để lắp ghép nối các đoạn trình tự đã giải được với nhau thành trình tự DNA bộ gene hoàn chỉnh. 1.3.5. Ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truyền Có thể nói PCR là một công cụ duy nhất hữu hiệu trong phát hiện và sàng lọc bệnh di truyền do sự biến gen ở mức độ phân tử mà các phương tiện di truyền tế bào không thể phát hiện được. Không chỉ vậy, PCR còn là một công cụ hữu hiệu để sàng lọc trước sanh các bệnh di truyền qua sự phát hiện các biến đổi gene ở mức độ phân tử về mặt cấu trúc, ví dụ Thalassemia, Duchene hay về số lượng như bệnh lý tam thể 13, 18, 21 trên các mẫu tế bào lấy từ gai nhau, từ dịch ối của sản phụ ngay trong những thời kỳ còn rất sớm của thai kỳ để giúp các nhà điều trị có biện pháp can thiệp như chấm dứt thai kỳ sớm nhờ vậy mà gia đình không phải chịu gánh nặng vì phải sanh những đứa con bị bệnh lý di truyền. Ngoài ra, PCR còn được dung để phát hiện các cá nhân khỏe mạnh nhưng mang gene tiềm ẩn bệnh di truyền, ví dụ bệnh Thalassemia, Duchene để có thể có tham vấn tiền hôn nhân hay trước sanh, nhờ vậy mà sẽ có thể làm giảm đi hay loại trừ một bệnh lý di truyền trong quần thể, giảm được gánh nặng xã hội vì phải đối phó với bệnh lý di truyền này. 1.4. Phương pháp DGGE và các ứng dụng 1.4.1. Phương pháp DGGE 10
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DGGE là một kỹ thuật thường được sử dụng trong sinh học phân tử và đã trở thành một yếu tố phân tích quan trọng trong cộng đồng vi sinh. Phương pháp DGGE là một trong những phương pháp có độ nhạy cao, có thể nhanh chóng cung cấp đầy đủ những đặc tính đặc trưng của sự đa dạng về thành phần của cộng đồng vi sinh. Đồng thời sự thay đổi của cộng đồng vi sinh vật cũng có thể dễ dàng được chứng minh. Để có thể thực hiện được phân tích DGGE, thì nó đòi hỏi một số lượng đáng kể DNA để có thể phát hiện, kèm theo là một chuỗi phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) phải được thực hiện trước khi phân tích. Phân tích DGGE được sử dụng cho việc tách các mảnh DNA sợi đôi giống hệt nhau về chiều dài, nhưng khác nhau về trình tự. Trong thực tế, điều này đề cập đến việc tách các đoạn DNA thông qua việc khuếch đại một đoạn gene mong muốn bằng phương pháp PCR, kỹ thuật khai thác (trong số những yếu tố khác) sự khác biệt trong kết nối ổn định GC (3 liên kết hydro cho mỗi kết nối) trái ngược với kết nối AT (2 liên kết hydro). Một hỗn hợp gồm các đoạn DNA khác nhau của trình tự khác nhau được điện di trong một môi trường acrylamide gel có nồng độ từ thấp tới cao. Đồng thời, trong gel acrylamide các sợi đôi đoạn DNA di chuyển tốt hơn, trong khi các phân tử DNA biến tính lại trở nên ít hiệu quả hơn hoặc không di chuyển trong gel. Nói chung, các đoạn DNA GC sẽ ổn định hơn và vẫn còn sợi đôi cho đến khi đạt đến nồng độ cao hơn nồng độ ban đầu. Như vậy, các đoạn DNA của chuỗi khác nhau có thể được tách trong gel polyacrylamide. 1.4.2. Ứng dụng của phương pháp DGGE trong việc tìm hiểu những đột biến sinh học của quần thể vi sinh vật Để phân tích cấu trúc của tập đoàn vi khuẩn nguyên thủy hay là mẫu môi trường thì kỹ thuật DGGE thường được sử dụng nhằm phân tích đoạn DNA có cùng kích thước nhưng khác nhau về trình tự nucleotide có thể phân tách riêng trong môi trường điện di (Watanabe et al.,2001; Jackson et al., 2000; Heuer et al., 1997). 11
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thêm vào đó phương pháp này còn cho phép phân tích cả những đoạn gene có kích thước nhỏ hơn đoạn 16S rRNA thường được nhân bởi cặp mồi thông dụng (universal primers) (Heuer et al., 1997; Muyzer et al.,1996; Watanabe et al., 2001). Bên cạnh đó, người ta có thể xác định trình tự của cả những vi sinh vật nuôi cấy được và không thể nuôi cấy được trong điều kiện invitro. [6] Ứng dụng trong bài nghiên cứu này là kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn để đưa ra kết luận chính xác và đạt độ tin cậy cao trong xác định chủng, loài. 1.5. Định danh nhóm vi khuẩn Việc phân loại định danh vi khuẩn cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc tính sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn. Đồng thời, phương pháp sinh học phân tử giải trình đoạn gen đặc trưng của vi khuẩn cũng được tiến hành để cho kết quả nhanh chóng và chính xác. 1.5.1. Định danh bằng phương pháp truyền thống 1.5.1.1. Phân biệt bằng thực khuẩn thể Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu. [7] Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ. [7] 1.5.1.2. Phân biệt theo Typ huyết thanh 12
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại. [7] 1.5.1.3. Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin. [7] 1.5.1.4. Phân biệt bằng các định tính sinh lí, sinh hóa Là những chủng vi sinh vật có khả năng sống và phát triển tốt ở nhiệt độ khá cao từ 550C đến 800C. Các chủng vi sinh vật thường thấy có khả năng chịu nhiệt là những chủng có khả năng sinh bào tử, xạ khuẩn Các enzyme và các chất mang của nhóm vi khuẩn này đều được cân bằng ở nhiệt độ khá cao. Hầu hết chúng đều cần nguyên tố lưu huỳnh để phát triển. Vì vậy thường gặp ở những nơi có hàm lượng lưu huỳnh cao và nhiệt độ thích hợp như trong các suối nước nóng, các khu vực gần núi lửa hoạt động hoặc phân ủ, rơm ủ trồng nấm rơm. Tùy thuộc vào cấu trúc màng khác nhau mà vi khuẩn có thể chịu được áp suất thẩm thấu cao hay thấp. Điều này giải thích vì sao có loài sống được trên môi trường có nồng độ đường hay muối cao nhưng có loài thì không tồn tại được trên môi trường đó. Khả năng biến dưỡng của vi khuẩn cũng được dùng để định danh vi khuẩn vì các loài vi khuẩn có khả năng đồng hóa các nguồn carbon, nitơ, khả năng lên men đường, khả năng chuyển hóa sinh citrate, phân giải ure, sinh H2S không giống nhau. 13
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Mỗi loài vi khuẩn đều có nhiều loại enzyme khác nhau. Chủng loại của các enzyme này quyết định các đặc điểm kiểu hình, các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. 1.5.2. Định danh nhóm vi khuẩn bằng sinh học phân tử Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương phap truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng 1.5.2.1. Thước đo tiến hóa Thước đo tiến hóa dùng để đo sự thay đổi về mặt tiến hóa trên các đại phân tử của tế bào. Sự khác nhau vể trình tự các nuleotide haya cid amin của các đại phân tử được tách chiết sẽ cho biết khoảng cách tiến hóa giữa hai sinh vật đó. Số lượng thay đổi này tỷ lệ với số lượng thay đổi do đột biến bền vững trên phân tử DNA. Khi có các đột biến khác nhau trên các quẩn thể khác nhau thì xảy ra hiện tượng tiến hóa sinh học và kết quả dẫn đến là sự đa dạng sinh học. [9] 1.5.2.2. Xác định thước đo tiến hóa thích hợp Muốn xác định mức tiến hóa chính xác giữa các sinh vật thì cần phải chọn một đại phân tử phù hợp để nghiên cứu trình tự của DNA. Đại phân tử này đảm bảo các yêu cầu sau :  Tồn tại ở tất cả các sinh vật.  Có cùng chức năng trong các sinh vật.  Sắp xếp một cách thích hợp trình tự của 2 phân tử để xác định được các vùng trình tự tương đồng và các vùng trình tự không tương đồng.  Trình tự của phân tử được chọn nên thay đổi một cách tỷ lệ với khoảng cách tiến hóa được đo. Trên thực tế khoảng cách phát sinh rộng nhưng tốc độ thay đổi của các trình tự chậm hơn. Một phân tử đã trải qua rất nhiều sự biến đổi về trình tự thì không thể sử dụng làm công cụ xác định quan hệ tiến hóa vì các vùng tương đồng của trình tự có thể biến mất. Có rất nhiều phân tử được đề xuất làm thước đo tiến hóa và cũng có nhều nghiên cứu về trình tự để thiết lập cây phát sinh chủng loài từ các phân tử này. Các 14
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP phân tử được đề xuất bao gồm : Cytochrome, hemoglobin, ferredoxin, gen mã hóa cho một số protein và RNA ribosome. Trong các phân tử này thì pahn6 tử phù hợp nhất là các gen mã hóa cho RNA ribosome – một thành phần quan trọng trong hệ thống dịch mã. [9] 1.5.2.3. RNA ribosome – phân tử dùng làm thước đo tiến hóa RNA ribosome (rRNA) có ở mọi sinh vật và có trình tự bảo tồn. Mức độ tương đồng ở các trình tự rRNA giữa hai cá thể cho biết mối liên hệ về mặt tiến hóa của chúng. Từ các phân tích này có thể xây dựng được cây phát sinh loài và chỉ ra vị trí tiến hóa của các sinh vật với nhau. RNA ribosome chiếm đến 80% tổng số RNA của tế bào. Tùy vào hệ số lắng rRNA được chia thành nhiều loại: ở sinh vật Eukaryote có rRNA 26S, 18S, 5.8S và 5S, còn ở Prokaryote là 23S, 16S và 5S. Ribosome của mọi tế bào bao gồm một tiểu đơn vị nhỏ và tiểu đơn vị lớn. Mỗi tiểu đơn vị có mang protein và rRNA có kích thước khác nhau, chứa một số vùng có trình tự bảo tồn và trình tự biến đổi. RNA ribosome 16S ở Prokaryote và 18S ở Eukaryote được chọn làm thước đo tiến hóa. Riêng đối với nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài. Đoạn mồi được sử dụng để khuếch đại đoạn D1/D2 26S rRNA là cặp mồi NL1 và NL4, còn đoạn ITS 5.8S rRNA thì sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. 1.5.2.4. Giải trình tự đoạn gene đặc trưng Trước khi giải trình tự đoạn gene mong muốn, ta cần phải khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR.  Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống. Hiện nay, PCR đã trở thành kỹ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược 15
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các bệnh đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene Tất cá các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gene (gọi là trình tự DNA mục tiêu). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm ethium bromide và điện di trên gel agarose.  Kĩ thuật giải trình tự Giải trình tự gene là sự xác định rõ trình tự của các base trong DNA. Tuy nhiên không phải tất cả những chuỗi DNA đều là gene (vùng mã hóa), điều này phụ thuộc vào sinh vật lấy mẫu và nguồn DNA mẫu như: trình tự khởi đầu, các trình tự lặp lại, các intron Hai phương pháp cơ bản để giải trình tự DNA.  Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert (phương pháp thủy phân hóa học dùng đoạn DNA mạch đôi): sử dụng các loại hóa chất để cắt DNA tại các vị trí xác định tạo ra một bộ các đoạn chỉ khác nhau bởi một nucleotide. [9] Phương pháp tự phân hóa học dùng mẫu DNA mạch đôi vì thế không yêu cầu tạo dòng DNA trong Phage M13 để tạo ra mạch DNA đơn như là trong phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Trước hết các phân tử DNA được đánh dấu bằng 32P ở một đầu. Sau đó chúng được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lí hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và sau đó cắt phân tử DNA nga tại nucleotide đó. Năm nhóm nucleotide bị tác động là G, A, C, G+A, T+C. Kết 16
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP quả của các xử lí hóa học là hình thành năm tập hợp oligonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng đều chấm dứt cùng một loại nucleotide. Cuối cùng năm phân đoạn trên được đem phân tích trên gel polymerase. Vị trí các oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được phát hiện bằng đầu có đánh dấu phóng xạ. Kết quả được đọc trên bản phóng xạ tự ghi.  Phương pháp giải trình tự Sanger-Coulson (phương pháp này dùng đoạn DNA mạch đơn): dùng enzyme để tổng hợp các đoạn DNA có một đầu mang một nucleotide biến đổi. [9] Phương pháp này được dựa trên sự làm gián đoạn tổng hợp của enzyme polymerase do các nucleotide tương đồng của đoạn DNA bổ sung với mạch khuôn. Mỗi hỗn hợp các đoạn DNA có chiều dài khác nhau được tạo ra phụ thuộc vào nơi mà chúng bị cắt. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những deoxynucleotide trong nhóm 3’OH được thay bằng H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphodiester và do đó làm ngưng quá trình tổng hợp. Trình tự DNA cần xác định phải được tạo dòng trong một vector mạch đơn (phage M13). DNA polymerase sử dụng có thể là đoạn Klenow của DNA polymerase I, Taq polymerase. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu bẳng đồng vị phóng xạ (32P). Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng. Người ta cho vào lần lượt bốn phân đoạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàm lượng rất cao. Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide đó ngừng lại. Tính xác suất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau tương ứng với tất cả các nucleotide cùng loại hiện diện trên trình tự DNA. Sau đó, bốn phản ứng tổng 17
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP hợp sẽ được phân tích trên gel polyacrylamide và kết quả được đọc trên bản phóng xạ điện di.  Giải trình tự những đoạn DNA lớn Cả hai phương pháp Maxam-Gilbert chỉ có thể giải trình tự đoạn trình tự khoảng 400 base một lần. Tuy nhiên, hầu hết những đoạn gene đều có kích thước lớn hơn. Để giải trình tự những đoạn DNA lớn này, nó được cắt (dùng hai hay nhiều enzyme cắt giới hạn) thành những đoạn khác nhau và mỗi đoạn được giải trình tự một cách riêng rẽ bao gồm những trình tự gối đầu lên nhau (mà thường được xác định bởi máy tính). Trình tự dầy đủ của đoạn gene sau đó sẽ được xác định. [9]  Các phương pháp cải biến tử phương pháp Sanger-Coulson Trong thực nghiệm, việc sử dụng các phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức tạp vì phải tạo dòng lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào các vector mạch đơn (phage M13). Do đó, để đơn giản hóa thì ngay từ tạo dòng các vector là các plasmid thế hệ thứ ba. Ở hai bên của đoạn DNA được tạo dòng các plasmid này có mang hai plasmid riêng biệt, mỗi trình tự nẳm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết thì phải tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. [9]  Xác định trình tự bằng máy tự động Trong kĩ thuật này, không đánh giá bằng đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất – các fluochrome. Mỗi loại, dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt lại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, kết quả sẽ được đọc trên máy tính. [9] Tất cả các phương pháp kể trên đều dùng để xác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng. Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xác định trực tiếp trình tự của một đoạn DNA được khuếch đại bằng PCR không qua tạo dòng. 18
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6. Xây dựng cây phát sinh loài chủng loài Các phương pháp để giải trình tự đoạn gene 16S rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay trở nên khá phổ biến và được xây dựng dựa trên sự kết hợp giữa sinh học phân tử với các phân tích trên máy tính. Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST. Máy sẽ cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng chương trình Treeview hoặc ClustalX để xây dựng cây phát sinh chủng loài để tập hợp những thông tin. Hệ thống phát sinh loài là một hệ thống nghiên cứu về các mối quan hệ tiến hóa. Phân tích hệ thống phát sinh loài tức là ước tính ra các mối quan hệ này. Lịch sử tiến hóa được suy ra từ phân tích hệ thống phát sinh loài, được mô tả bởi các nhánh hay sơ đồ dạng cây, mô tả các mối quan hệ thừa hưởng giữa các phân tử (gene) hay vi sinh vật hoặc cả hai. Nguyên tắc cơ bản của cây phát sinh loài là những thành viên của cùng một nhóm sẽ cùng bắt nguồn từ một tổ tiên chung và có mối quan hệ gần gũi với nhau hơn là những thành viên của các nhóm khác. Một cây phát sinh loài sẽ bao gồm các thành phần như sau: Một nhánh ( một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gene bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài. Nút giao điểm của các nhánh. Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gene được sử dụng phổ biến trong dịnh danh phân loại vi khuẩn. 19
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm nghiên cứu  Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 3/2012 đến 7/2012  Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng vi sinh của Viện Sinh Học Nhiệt Đới số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP.6, P. Linh Trung, Quận Thủ Đức, tpHCM. 2.2. Vật liệu thí nghiệm 2.2.1. Vật liệu  Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn phân lập từ compost  Vị trí lấy mẫu: Long An  Thời gian lấy mẫu: năm 2012. Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn Thứ tự Chủng vi khuẩn Ký hiệu lại chủng 1 CLA31 Chủng A 2 CLA54 Chủng B 3 CA3L2 Chủng C 4 CA 14 Chủng D 5 CA 13 Chủng E 6 CA3L3 Chủng F 7 CA3L1* Chủng G 8 CA 11 Chủng H 9 CA3L1 Chủng K  Đặc điểm chung của các mẫu thí nghiệm: - Các loại mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên. - Các loại mẫu lấy đều bình thường. 2.2.2. Hóa chất 2.2.2.1. Hóa chất trong ly trích DNA 20
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Lysis buffer (100 mM Tris_HCl pH= 8; 30 mM sodium EDTA pH= 8; 0.5%SDS). - 2.5M Potassium acetate pH 7.5 - Cloroform/isoamyl alcohol (24:1 v/v). - Isopropanol. - Ethanol 70% lạnh. - Ethanol 90 – 99% lạnh - Nước khử ion vô trùng hoặc đệm TE. 2.2.2.2. Hóa chất trong tinh sạch DNA - Đệm PB. - Đệm PE. - Đệm EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5). - 3M sodium acetate pH 5. - Ethanol 96 - 100% lạnh. - Nước cất 2 lần (pH 7 - 8.5). - Đệm TE. 2.2.2.3. Hóa chất trong điện di DNA - Agarose. - TAE (Tris, Acid Acetic, EDTA). - Ethidium bromide. - Dung dịch nạp mẫu 6X. 2.2.2.4. Hóa chất trong phản ứng PCR - Master mix của hãng Roche:  Taq buffer 10X  MgCl2 25 mM.  dNTPs 20 mM.  Taq polymerase. - Primer:  Primer 27F (50 pmol). 21
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Primer 1492R (50 pmol). - DNA Tamplate - Nước khử ion. 2.2.2.5. Hóa chất trong phản ứng DGGE - Gel polyacrylamide. - TAE. - Thuốc nhuộm xanh SYBR Green. - Chất làm đông tụ gel Temed/PSA. - Dung dịch nạp mẫu. 2.3. Thiết bị và dụng cụ 2.3.1. Thiết bị - Máy đo pH, máy votex, máy khuấy từ. - Bể ổn nhiệt - Tủ sấy Prolabo. - Tủ lạnh - Máy ly tâm loại lớn (dùng cho falcon lớn), máy ly tâm loại nhỏ (dùng tube eppendorf). - Lò viba - Bộ điện di Cole – Parmer 2.3.2. Dụng cụ - Cân phân tích. - Các loại dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt (erlen, bercher, pipet, đũa thủy tinh ). - Các loại pipetman có dung tích từ 2.0µl - 1000µl và các đầu tube tương ứng. - Buồng điện di - Găng tay, khẩu trang và đồ bảo hộ. 22
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4. Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn  Quy trình: Các chủng vi khuẩn đã được phân lập Ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR Tinh sạch đoạn gene 16S rDNA Lấy mẫu sau khi tinh sạch khuếch đại vùng V3 Big – Dye Reaction Tinh sạch vùng V3 Giải trình tự đoạn gene 16S Kiểm tra nồng độ DNA rDNA bằng Applied Biosystems Ứng dụng phương pháp DGGE Xác đ ịnh loài dựa vào cây phân Kết luận độ tinh sạch của đoạn loại loài (phylogenetic tree). gene 16S rDNA trong việc xác định loài Sơ đồ 2.1: Quy trình kiểm tra độ tinh sạch của đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn. 23
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Thuyết minh quy trình Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập thì đem dịch huyền phù ly tâm để thu sinh khối tế bào. Khi đó, lấy sinh khối tế bào đi ly trích để thu nhận DNA genomic. Thu nhận được DNA genomic tiếp tục chạy PCR để khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của mỗi chủng vi khuẩn. Có được kết quả đoạn gene 16S rDNA tiếp tục đem tinh sạch bằng QIAGEN Kit. Sau đó, đem đoạn gene 16S rDNA đã tinh sạch đi giải mã trình tự của mỗi chủng. Nếu chủng vi khuẩn cho kết quả thuần thì từ đó xác định loài dựa trên cây phân loại loài (phylogenetic tree). Còn nếu như kết quả không thuần thì lấy kết quả sau khi tinh sạch đoạn 16S rDNA đem chạy PCR để khuếch đại vùng V3. Lấy kết quả khuếch đại vùng V3 đi tinh sạch lại. Cuối cùng là kiểm tra nồng độ DNA và ứng dụng phương pháp DGGE để kết luận lại một cách chính xác việc mẫu không thuần. 2.4.1. Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt Cho 1.5 ml dịch nuôi cấy vào trong eppendorf, đem ly tâm ở 13000rpm trong 5 phút và thu cặn. Thao tác này được lặp lại 2 lần. Thêm 200µl dịch đệm Lysis (100 mM Tris pH=8, 30 mM EDTA pH=8, 0.5% SDS) Votex cho mẫu tan hoàn toàn trong dung dịch. Đun sôi trong 15 phút Thêm 200µl dung dịch 2.5M Potassium acetate pH 7.5, trộn mẫu thật kĩ bằng votex. 24
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đặt mẫu trong đá lạnh 1 giờ. ổi cùng thể tích chloroform/isoamyl alcohol (24:1 v/v) Ly tâm 13000rpm trong 5 phút. Thu nhận dịch nổi sau ly tâm. Thêm CHCl _ Isoamyl alcohol (24:1) vào một lượng tương đương thể tích 3 mẫu. Ly tâm 13000rpm trong 5 phút, thu nhận dịch nổi. Thêm isopropanol tương đương thể tích mẫu và votex kĩ. Đặt mẫu trong đá lạnh -200C trong 20 phút. Ly tâm 13000rpm trong 16 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu nhận mẫu DNA. Rửa DNA với ethanol 700 và trộn kĩ. Ly tâm 13000rpm trong 4 phút với ethanol 960 Làm khô DNA bẳng tủ sấy 600 Hòa tan DNA trong đệm TE hoặc nước khử ion vô trùng và giữ mẫu ờ -200 đến khi sử dụng. Sơ đồ 2.2: Quy trình ly trích và thu nhận DNA genomic bằng nhiệt 25
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.2. Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA genomic trong mẫu sau khi ly trích Kiểm tra sự xuất hiện của DNA trong mẫu bằng cách chạy điện di trên gel agarose 1%. Thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước 0.5 - 20 kb. Dựa vào đặc tính cấu trúc của DNA tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhuộm Ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào giữa các đoạn base của nucleic acid và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại (UV) 312nm. Quy trình kiểm tra sự xuất hiện DNA trong mẫu sau khi ly trích được trình bày theo sơ đồ 2.3. Chuẩn bị gel agarose 1% (1 g agarose, 100 ml dung dịch TAE 10X). Đun tan hoàn toàn. Tiến hành đổ khuôn (nhiệt độ khoảng 500C – 600C). Chờ gel đông cứng hoàn toàn. Rút lược, để gel vào máy điện di và đổ thêm dung dịch TAE 10X cho ngập bề mặt gel. Trộn 5µl mẫu với 3µl Loading dye 6X, tiến hành bơm mẫu vào giếng. Tiến hành chạy điện di ở điện thế 110V trong 30 – 45 phút. Đọc kết quả trên hộp chiếu đèn UV 312nm. Sơ đồ 3.3: Kiểm tra DNA genomic sau khi ly trích 26
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.3. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của nhóm vi khuẩn bằng phương pháp PCR 2.4.3.1. Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA Phản ứng khuếch đại đoạn gene 16S rDNA được thực hiện với 2 cặp mồi chuyên biệt của nhóm vi khuẩn gồm 27F và 1492R.  Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích là 50µl ở bảng 2.2 Bảng 2.2: Thành phần phàn ứng PCR với tổng thể tích 50 µl Thành phần phản ứng Thể tích Master mix (Buffer 10X, dNTPs 2.0 M, 25µl MgCl2 25 Mm, Taq polymerase) Mồi xuôi 27F (50pmol/µl) 1 µl Mồi ngược 1492R (50pmol/µl) 1 µl DNA Template 1 µl Nước khử ion 22 µl Tổng thể tích 50µl  Chu kỳ phản ứng PCR cho máy luân nhiệt - Giai đoạn 1: 940C trong 10 phút. - Giai đoạn 2:  940C trong 30 giây.  520C trong 45 giây.  720C trong 1 phút 30 giây. Giai đoạn 2 lặp lại 24 chu kỳ - Giai đoạn 3:  940C trong 30 giây.  520C trong 45 giây. 27
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  720C trong 5 phút. - Giai đoạn 4: ổn định ở 40C. Điện di dung dịch đạt được sau phản ứng PCR trên gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm PCR tạo thành. 2.4.3.2. Kiểm tra DNA sau phản ứng PCR - Chuẩn bị bộ điện di. - Chuẩn bị gel agarose 1%. - Đun bằng lò viba cho đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều. Để nguội cho đến khoảng 50 – 600C. - Cho 2µl ethidium bromide 5mg/ml vào trong dung dịch agarose tan chảy. - Nạp mẫu vào trong giếng của gel, chạy điện di khoảng 30 – 45 phút với nguồn điện 110V. - Quan sát kết quả chạy điện di dưới hộp đèn UV 312nm. - Dựa vào mức độ sang của sản phẩm điện di thì có thể ước lượng được nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết. Các mẫu dương tính là các mẫu có vệt sáng. 2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng QIAGEN PCR Purification Kit Trước khi phân tích DGGE đoạn gene được khuếch đại thì phải tinh sạch mẫu nhằm loại bỏ các tạp chất còn lại trong lúc thực hiện phản ứng PCR và các bước thực hiện như sau: 28
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thêm 200 μl Buffer PB vào eppendorf có chứa 40 μl mẫu sau khi chạy PCR theo tỉ lệ (Buffer PB: PCR sample _ 5:1), trộn đều. Bổ sung 10 μl dung dịch sodium acetate 3 M, pH 5.0. Chuyển toàn bộ mẫu sang eppendorf có cột lọc với thể tích 2ml. Ly tâm mẫu ở 13000rpm trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang một eppendorf mới với thể tích 2 ml. Thêm 750µl dung dịch đệm PE. Ly tâm ở 13000rpm trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang eppendorf mới Ly tâm ở 13000rpm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn ethanol có trong đệm PB còn sót lại. Chuyển cột lọc sang eppendorf loại 1.5ml Thêm 50µl đệm EB (10 mM Tris - HCl, pH 8.5) hoặc nước (pH 7 - 8.5) vào giữa của màng lọc. Để tăng nồng độ DNA , bổ sung thêm 30µl elution buffer vào giữa màng lọc và đem ủ 1 phút. . Ly tâm 13000rpm trong 1 phút. Thu nhận DNA sau tinh sạch Sơ đồ 3.4: Quy trình tinh sạch DNA sau khi chạy PCR 29
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.5. Quy trình Applied Biosystems bằng Big Dye Reaction 2.4.5.1. Big - Dye Reaction  Mồi xuôi 27F: Bảng 2.3: Thành phần Big – Dye Reaction mồi xuôi 27F Thành phần phản ứng Thể tích Buffer 5X và Taq polymerase 2 µl Primer 27F (3.2 pmol) 1 µl Big – Dye solution 4 µl DNA Template 10 µl Nước khử ion 3 µl Tổng 20 µl  Mồi ngược 1492R: Bảng 2.4: Thành phần Big – Dye Reaction mồi ngược 1492R Thành phần phản ứng Thể tích Buffer 5X và Taq polymerase 2 µl Primer 1492R (3.2 pmol) 1 µl Big – Dye solution 4 µl DNA Template 10 µl Nước khử ion 3 µl Tổng 20 µl Chu kỳ phản ứng: gồm 30 chu kỳ - Bước 1: 960C trong 20 giây. - Bước 2: 500C trong 20 giây. - Bước 3: 600C trong 4 phút. 30
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.5.2. Quy trình Applied Biosystems Sau khi Big –Dye Reaction được 20µl mẫu cộng thêm 5µl EDTA 125 mM và 60 µl ethanol (100%). Gi ữ mẫu ở -200C trong 15 phút và ly tâm ở 13000rpm trong 30 phút ở 40C. Ly tâm 13000rpm trong 5 giây để loại bỏ lượng ethanol còn sót lại Thêm 85µl ethanol 70% theo tỷ lệ ethanol / mẫu (1:1). Ly tâm 13000rpm trong 15 phút ở 40C. Ly tâm 13000rpm trong 5 giây để loại bỏ ethanol còn sót lại. Làm khô tự nhiên trong 15 phút. Thêm 18µl HiDi (Formamide), votex mẫu. Ly tâm 13000rpm trong 5 giây. Đem giải mã trình tự đoạn gene 16SrDNA. Sơ đồ 3.5: Quy trình Applied Biosystems 31
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.6. Xác định thành phần của mỗi chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE Trước khi phân tích DGGE người thực hiện phải khuếch đại đoạn 16S rDNA. Đoạn gene 16S rDNA có kích thước khoảng 1.600bp. Trên đoạn gene này người thực hiện tiến hành PCR vùng V3 để phân tích DGGE. ( kích thước vùng V3 < 200bp). Phản ứng PCR vùng V3 của DGGE được thực hiện với cặp mồi chuyên biệt của nhóm vi khuẩn là 517R và 357F – GC.  Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của DGGE với tổng thể tích Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn gene 16S rDNA của DGGE. Thành phần phản ứng Thể tích Master mix (Buffer 10X, dNTPs 2.0 25µl mM, MgCl2 25 Mm, Taq polymerase) Mồi xuôi 357F – GC 1 µl Mồi ngược 517R 1 µl DNA Template 0.5 µl Nước khử ion 22.5 µl Tổng thể tích 50µl  Chu kỳ phản ứng PCR vùng V3 thuộc đoạn 16S rDNA của DGGE. - Bước 1: 950C trong 10 phút. - Bước 2: 930C trong 30 giây. - Bước 3: 650C trong 40 giây. - Bước 4: 720C trong 1 phút. 32
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Bước 5: Quay lại bước 2. - Bước 6: 930C trong 30 giây. - Bước 7: 600C trong 40 giây. - Bước 8: 720C trong 1phút. - Bước 9: Quay lại từ 6 đến bước 8, lặp lại 9 lần. - Bước 10: 930C trong 30 giây. - Bước 11: 550C trong 40 giây. - Bước 12: 720C trong 1phút. - Bước 13: Quay lại từ bước 10 tới bước 12, lặp lại 8 lần. - Bước 14: 930C trong 30 giây. - Bước 15: 550C trong 40 giây. - Bước 16: 720C trong 5 phút. - Bước 17: Giữ mẫu ở 40C Ghi nhận kết quả PCR và điện di trên gel agarose 2%.  Phương pháp DGGE - Bước 1: Thiết lập bảng gel : rửa sạch (lau sạch) 2 tấm kính bé và 2 tấm kính lớn. Lau thật sạch bằng ethanol 700 hoặc bằng nước khử ion. - Bước 2: Gắn bảng gel vào giá để giữ. - Bước 3: Kiểm tra giá giữ 2 tấm kính bằng bảng nhựa Biorad. - Bước 4: Chuẩn bị gel (1 gel). 12% PA / 0% UF với thể tích là 4ml. 12% PA / 80% UF với thể tích là 12ml Đưa vào tube 50ml (kí hiệu là A) với tổng thể tích có được là 16ml. 6% PA / 0% UF với thể tích là 9.6ml. 6% PA / 50% UF với thể tích là 6.4ml. Đưa vào tube 50ml (kí hiệu là B) với tổng thể tích có được là 16ml. 33
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Bước 5: Hút 1ml 0% UF / 6% PA vào eppendorf. - Bước 6: Sử dụng phễu lọc để lọc dung dịch A và B trên. Tùy theo màu sắc:  Màu vàng: nồng độ thấp (xilanh1).  Màu xanh: nồng độ cao (xilanh 2). Phễu lọc gồm có ống xylanh và màng lọc Bảng 2.6: Nồng độ pha gel polyacrylamide 0% UF 50% UF 0% UF 80% UF 6% PA 6% PA 12% PA 12% PA 20X TAE 12.5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Acrylamide 30 g 12 g 74 g 24 g Bis – Acrylamide 0.8 g 0.324 g 0.684 g 0.648 g Urea 0 g 42 g 0 g 62.2 g Fomamide 0 ml 40 ml 0 ml 64 ml Total 500 ml 40 ml 0 ml 200 ml Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn gel polyacrylamide vào hai xilanh 0% UF 50% UF 0% UF 80% UF Thể tích 6% PA 6% PA 12% PA 12% PA Xilanh 1 9.6 ml 6.4 ml 16 ml Xilanh 2 4 ml 12 ml 16 ml - Bước 7: Loại khí trong dung dịch bằng nước - Bước 8: Chuẩn bị TEMED và 10% APS:  Thêm 50 µl APS (10%) vào cả A và B.  Sau đó, thêm 10 µl TEMED vào cả A và B. - Bước 9: Lắc đều và hút vào pipton và đưa vào hệ thống phân phối Deliver. - Bước 10: Đợi gel khô. 34
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Bước 11: Chuẩn bị buffer chạy mẫu gồm có:  6 lit nước  60 ml TAE 50X. Đổ vào hệ thống chạy mẫu - Bước 12: Gắn gel vào lốc gắn gel. - Bước 13: Chuẩn bị thêm 1 lít buffer trên.  1 lít nước .  10 ml TAE 10X - Bước 14: Sau đó, gắn gel vào lốc. Thêm ít nước vào trước khi gắn gel nhằm mục đích làm trơn và kín. - Bước 15: Kiểm tra hệ thống gel có thoát nước hay không. - Bước 16: Tiếp tục gắn hệ thống gel vào trong hệ thống Biorad. - Bước 17: Đổ dung dịch đệm TAE vào trong vạch chạy và hệ thống gel. - Bước 18: Điều chỉnh nhiệt ở 650 C. - Bước 19: Bật bơm và beater ( thời gian nhiệt tăng là 1 giờ 3 phút) - Bước 20: Chuẩn bị mẫu  10 µl thuốc nhuộm.  Thể tích DNA tùy theo từng mẫu (5 – 10 µl). Thông thường nồng độ DNA cần chạy cho DGGE trong khoảng 300 – 500 ng/µl. Chạy điện di: Trước khi điện di phải đảm bảo nhiệt độ trong bể là 600C. 35
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.1: Hệ thống thiết bị chạy DGGE 2.5. Sử dụng phần mềm tin sinh học Sử dụng hai phần mềm Edit.seq.exe và MegAlign.exe cùng với hai trang website: và giúp cho quá trình giải mã các nucleotide để xây dựng cây phát sinh loài. 36
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tăng sinh và kiểm tra hình thái tế bào của 9 chủng vi khuẩn Sau khi mẫu compost được phân lập trên môi trường DNS và làm thuần 20 lần thì chọn ra được 9 khuẩn lạc đặc trưng dựa vào hình thái học tế bào được nêu trong bảng 3.1 và 3.2, tiếp tục đem 9 chủng thuần tăng sinh trên môi trường PCS xem hình 3.1. Khi có được dịch nuôi cấy tế bào, cho 3ml dịch vào eppendorf đem ly tâm và thu lắng. Từ đây tiến hành các bước định danh theo phương pháp sinh học phân tử. Bảng 3.1: Kết quả quan sát hình thái học của 9 chủng vi khuẩn. Hình thái tế bào Hình thái khuẩn lạc Gram Mẫu Chủng A Hình tròn đều, có tâm mờ, Dương Hình que, kích thước viền tròn màu trắng đục. trung bình, đầu tròn, Mọc nổi trên bề mặt thạch, tương đối hơi cong và bề mặt trơn láng, bóng. dài Chủng B Hình tròn, có tâm lõm vào Âm Hình que sợi, dài, trong, màu trắng đục, viền mảnh, có hơi uốn cong. tròn đồng nhất. Mọc nổi trên mặt thạch, bề mặt trơn láng, bóng. Chủng C Hình tròn đều, có tâm màu Dương Hình que, cực ngắn, trắng trong ở giữa. Không có đầu vuông. viền, mọc nổi trên mặt thạch, bề mặt khuẩn lạc trơn, bóng. 37
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng D Hình tròn bất định, màu Dương Hình que, thuôn dài, trắng hơi đục viền có răng tương đối nhỏ. cưa, không có tâm, mọc sát bề mặt thạch. Chủng E Hình tròn bất định, màu Âm Hình que, ngắn, đầu trắng đục đồng nhất viền tròn, 2 đầu to đều. răng cưa, có tâm, mọc sát bề mặt thạch. Chủng F Hình tròn bất định, tâm màu Dương Hình que, tương đối trắng đục lan rộng sát viền. ngắn, đầu tròn. Viền răng cưa, trắng trong. Mọc sát mặt thạch, bề mặt khô, bằng phẳng. Chủng G Hình tròn bất định, mọc sát Dương Hình que, tế bào mảnh, mặt thạch. Tâm tròn đều, ngắn. màu trắng đục. Viền răng cưa, trắng trong. Bề mặt khô, gọn. Chủng H Hình tròn, mọc nổi trên mặt Dương Hình que, 2 đầu tròn, thạch, có tâm chính giữa nhô to đều đối xứng, tương cao, màu trắng đục. Bề mặt đối ngắn. trơn bóng. Viền không răng cưa, màu trắng trong. Chủng K Hình tròn bất định, mọc sát Dương Hình que, tế bào mảnh, trên mặt thạch. Bề mặt khô, dài, có xu hướng uốn trắng đục, không có tâm, cong. viền khó xác định. 38
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Một số hình ảnh có được khi soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X của 9 chủng vi khuẩn, kết quả được nêu trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X của 9 chủng vi khuẩn Chủng Hình thái tế bào Hình thái khuẩn lạc Chủng A Chủng B Chủng C Chủng D 39
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng E Chủng F Chủng G Chủng H 40
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng K Khi đã kiểm tra hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của 9 chủng, tiếp theo là tăng sinh chúng trong môi trường PCS xem hình 3.1 để tiếp tục cho công việc định danh. Hình 3.1: Kết quả tăng sinh của 9 chủng vi khuẩn trong môi trường PCS. Đó là các chủng A, B, C, D, E, F, G, H và K được phân lập từ compost Long An Cả 9 chủng đều có hình thái tế bào là hình que và đa phần là trực khuẩn gram dương. Về mặt khuẩn lạc thì các chủng này đều có tâm và có màu trắng sữa. Để cho kết quả quan sát hình thái của 9 chủng vi khuẩn đạt được độ tin cậy cao thì trong bài báo cáo này có sự kết hợp với phương pháp định danh bằng sinh học phân tử. 41
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2. Kết quả ly trích DNA genomic bằng nhiệt của 9 chủng vi khuẩn Trước khi chạy PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA thì tiến hành ly trích để thu nhận DNA genomic bằng nhiệt. Sau khi ly trích và thu nhận được DNA genomic thì tiếp tục chạy điện di trên gel agarose 1%. Kết quả chạy điện di của 9 chủng vi khuẩn xem hình 3.2. Hình 3.2: Kết quả thu nhận DNA genomic của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% Từ hình 3.2 cho thấy bảng gel ở tất cả các giếng đều cho những vệt sáng màu cam. Điều đó chứng tỏ là 9 chủng vi khuẩn đem ly trích đều thu nhận được đoạn DNA genomic rất tốt. Từ kết quả này tiếp tục đem khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR. 3.3. Kết quả khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR Sau khi ly trích và thu nhận được DNA genomic từ 9 chủng vi khuẩn trên thì tiếp tục đem khuếch đại đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp PCR dựa trên cặp mồi là 27F và 1492R, kết quả xem hình 3.4. 42
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.3: Kết quả thu nhận đoạn gene 16S rDNA khi chạy PCR trên gel agarose 1% Tất cả 9 chủng vi khuẩn sau khi khuếch đại đoạn gene 16S rDNA đều cho kết quả tốt do các vệt ở các band đều sáng rõ. Riêng 2 chủng G va H cho band sáng nhất. Điều đó chứng tỏ hai chủng này cho kết quả sau khi khuếch đại đoạn gene16S rDNA khá tốt. Sau khi có được đoạn gene 16S rDNA thì tiếp tục đem tinh sạch chúng. 3.4. Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit Sau khi có được đoạn gene 16S rDNA từ quá trình khuếch đại PCR, từ đó tiến hành đem đoạn gene 16S rDNA đem tinh sạch bằng QIAGEN Kit, kết quả xem hình 3. 4. 43
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.4: Kết quả tinh sạch đoạn gene 16S rDNA bằng QIAGEN Kit trên gel agarose 1% Qua hình 3.4 cho thấy sau quá trình tinh sạch bằng QIAGEN Kit thì tất cả 9 chủng vi khuẩn đều có đoạn gene16S rDNA. Các band ở 9 chủng vi khuẩn đều cho các vệt sáng rõ nhưng không thể kết luận là 9 chủng vi khuẩn này thuần. Do đó, để đảm bảo độ tinh sạch và độ thuần của chúng nên tiếp tục đi giải trình tự 9 chủng vi khuẩn trên. 3.5. Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn Lấy sản phẩm PCR sau khi tinh sạch của 9 chủng vi khuẩn đi giải trình tự đoạn gene 16S rDNA, kết quả sẽ được giải trình tự tại trường đại học Tokyo, Nhật Bản. Dưới đây chỉ là một vài đoạn nhỏ của đoạn gene 16S rDNA của chủng để so sánh các đường peak với nhau. Còn tất cả đoạn gene 16S rDNA đã giải trình tự sẽ được trình bày ở phần phụ lục E. 44
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các peak chèn lên nhau Hình 3.5a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng A. Các peak chèn lên nhau Hình 3.5b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng A. 45
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Không thấy được riêng mỗi peak Hình 3.6a: Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA (đoạn Forward) của chủng B Không thấy được peak và các nucleotide Hình 3.6b: Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA (đoạn Reverse) của chủng B 46
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các peak chèn lên nhau và đường peak không rõ Hình 3.7a: Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng C Đường peak xanh nằm chèn lên đường peak đỏ Hình 3.7b: Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng C 47
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các đường peak thể hiện không rõ Hình 3.8a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng D Các đường peak bị đứt đoạn . Hình 3.8b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng D 48
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đường peak màu đỏ chèn lên đường peak màu xanh Hình 3.9a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng E. Các đường peak không rõ Hình 3.9b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reserve) của chủng E. 49
  60. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các đường peak không rõ ràng Hình 3.10a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng F. Các đường peak nẳm thành một đường thẳng dài Hình 3.10b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng F 50
  61. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các đường peak nằm chèn lên nhau, không rõ ràng các đường Hình 3.11a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng G Các đường peak nằm thành một đường thẳng dài Hình 3.11b: Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng G 51
  62. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các đường peak nằm sai vị trí so với các nucleotide Hình 3.12a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng H Đường peak không rõ ràng Hình 3.12b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng H 52
  63. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các đường peak nằm thành một hàng ngang Hình 3.13a : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Forward) của chủng K Các đường peak nằm thành một hàng ngang Hình 3.13b : Kết quả giải trình tự đoạn 16S rDNA ( đoạn Reverse) của chủng K Từ kết quả giải trình tự gene của 9 chủng này thì có thể đưa ra kết luận sơ bộ 9 chủng vi khuẩn trên không thuần do các đường peak chèn lên nhau, bị đứt hoặc có peak nằm thành một hàng ngang. Riêng chủng B cho kết quả đường peak không rõ nên không giải được trình tự các nucleotide. Để đảm bảo việc kết luận chủng không thuần một cách chính xác và có độ tin cậy cao thì nên tiếp tục lấy một đoạn nhỏ đem khuếch đại là vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA cho phương pháp DGGE. 53
  64. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.6. Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loài Do kết quả giải trình tự của chủng B không cho được thứ tự của các nucleotide, vì thế chỉ lấy kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA của 8 chủng đem phân tích và so sánh các đoạn tương đồng trong ngân hàng dữ liệu gene tại 2 website: và Sau đó tạo cây phát sinh chủng loài với hai phần mềm Edit.seq.exe và MegAlign.exe 54
  65. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.14: Kết quả xây dựng cây phát sinh loài của 8 chủng khảo sát ( chủng A, C, D, E, F, G, H, K) so với dữ liệu của ngân hàng gene. 55
  66. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sau khi biết được toàn bộ chủng đem thử nghiệm đều không thuần thì sẽ không có giai đoạn xây dựng cây phát sinh loài do độ tương đồng của chủng so với ngân hàng gene không có độ tin cậy. Để làm rõ vấn đề này thì bài báo cáo vẫn tiếp hành xây dựng cây phát sinh loài của 8 chủng vi khuẩn trên. Qua hình 3.14 cho thấy độ tương đồng của mỗi chủng so với ngân hàng từ 80 - 99%. Điều đó cho thấy 8 chủng vi khuẩn đem thử nghiệm có độ tương đồng cao nhưng kết quả các đường peak không rõ ràng nên không đưa ra kết luận một cách chính xác. Vì thế, phải tiến hành kiểm tra độ tinh sạch vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA bằng phương pháp DGGE. 3.7. Kết quả khuếch đại vùng V3 cho phương pháp DGGE Lấy sản phẩm sau khi tinh sạch đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng đem khuếch đại vùng V3 dựa trên cặp mồi 517R và 357F - GC, kết quả xem hình 3.15 Hình 3.15: Kết quả khuếch đại vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn trên gel agarose 1% Xem hình 3.15 cho thấy bản gel ở tất cả các giếng đều có vệt sáng rõ, điều đó chứng tỏ tất cả 9 chủng vi khuẩn khi khuếch đại vùng V3 cho kết quả tốt. Vì thế tiếp tục kiểm tra độ tinh sạch theo phương pháp DGGE vùng V3 để đưa ra kết luận chính xác và đạt độ tin cậy cao. 56
  67. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.8. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN Trước khi chạy DGGE vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA thì tiếp hành kiểm tra nồng độ DNA của 9 chủng vi khuẩn trên. 57
  68. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.9. Kết quả vùng V3 trên gel polyacrylamide của 9 chủng vi khuẩn bằng phương pháp DGGE Sau khi kiểm tra nồng độ DNA bằng máy BEKMAN thì tiến hành khuếch đại vùng V3 cho chạy DGGE để đưa ra kết luận một cách chính xác theo hình 3.5. Hình 3.16: Kết quả chạy DGGE vùng V3 trên gel polyacrylamide biến tính Sau khi giải trình tự gene và kết hợp chạy DGGE của 9 chùng vi khuẩn thì có thể đưa ra kết luận một cách chính xác là toàn bộ các chủng vi khuẩn đem thử nghiệm đều không thuần , vì sau khi chạy DGGE thi mỗi một giếng đều có nhiều band (ví dụ như chủng K có tất cà là 5 band của cùng một chủng). Điều đó chứng tỏ các chủng vi khuẩn bị nhiễm hay phân lập không được thuần. 58
  69. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua các thí nghiệm của đề tài, người thực hiện đề tài thu được một số kết quả như sau:  Thu nhận và ly trích được DNA genomic từ 9 chủng vi khuẩn đã được làm thuần bằng phương pháp nhiệt.  Khuếch đại đoạn gene 16S rDNA của 9 chủng vi khuẩn dựa trên cặp mồi 27F và 1492R.  Tinh sạch và giải mã trình tự đoạn gene 16S rDNA sau khi khuếch đại của 9 chủng vi khuẩn.  Hình thành cây phát sinh loài dựa vào trình tự giải mã của 8 chủng (A, C, D, E, F, G, H, K), riêng chủng B không có trình tự nucleotide nên không hình thành cây phát sinh loài. Các chủng được so sánh về độ tương đồng trong GeneBank, mức độ tương đồng của 8 chủng được thể hiện như sau: Chủng A có độ tương đồng với chủng Clostridium thermopalmarium (NR 026112.1) là 87% và có độ tương đồng với chủng Ilyobacter delafieldii (FR733681.1) là 86%. Chủng C có độ tương đồng với chủng Clostridium botulinum (FR773526.1) và chủng Clostridium sporogenes (GU139706.1) là 99%. Chủng D có độ tương đồng với chủng Clostridium sporogenes (GU139706.1) và chủng Bacterium NLAE-zl-P902 (JQ607702.1) là 99%. Chủng E có độ tương đồng với chủng Thermoanaerobacterium thermostercus (FM999998) và chủng Thermoanaerobacterium xylanoliticum LX-11 là 95%. 59
  70. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Chủng F có độ tương đồng với chủng Thermohydrogenium kirishiense (FR749965) và chủng Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (FR870449) là 95%. Chủng G có độ tương đồng với chủng Clostridium botulinum (GU139706) và chủng Bacterium NLAE-zl-P612 (JQ607190) là 80% Chủng H có độ tương đồng với chủng Ilyobacter delafieldii (FR733681) và chủng Clostridium crotonatovorans (AY742899) là 86%. Chủng K có độ tương đồng với chủng Burkholderia lata (JQ831517) là 81%.  Khuếch đại được vùng V3 dựa trên cặp mồi 517R và 357F – GC  Sau khi chạy DGGE cho kết quả mỗi chủng có nhiều band. (xem hình 3.16) Một lần nữa khẳng định 9 chủng (A, B, C, D, E, F, G, H, K) đem thử nghiệm đều không thuần vì tất cả các đường peak không rõ ràng khi giải trình tự và cho nhiều band của cùng một mẫu khi chạy DGGE nên không đạt độ tin cậy và độ chính xác của một chủng phân lập thuần. 4.2. Kiến nghị Do thời gian và điều kiện thực tế đề tài đồ án có hạn nên có một số phần thí nghiệm vẫn chưa thể thực hiện tốt hơn. Vì vậy, một số ý kiến đề nghị như sau:  Thực hiện thêm các quy trình ly trích DNA. So sánh và tìm ra phương pháp tối ưu phù hợp nhất.  Phải tiến hành phân lập, làm thuần và tăng sinh mẫu thật tốt để đưa ra chủng vi khuẩn thuần giúp ích cho quá trình định danh. 60
  71. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Tp.HCM 2. Trịnh Thị Hồng (2007), Giáo trình vi sinh nông nghiệp, Trường đại học Mở Tp.HCM. 3. Hoàng Nguyên (2007) Luận Văn Tốt Nghiệp: Phân Lập Định Danh Một Số Chủng Nấm Men ở Vườn Quốc Gia Nam Cát Tiên, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 4. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 5. Nguyễn Văn Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Thanh Phương, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), Sử dụng phương pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng của vi sinh vật trong các công thức thử nghiệm, Tạp chí công nghệ sinh học , Viện công nghệ sinh học. 7. Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp (2007), Phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử, Tạp chí khoa học. 8. Phạm Thị Lan Thanh (2007) Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học: Phân Lập Định Danh Nghiên Cứu Tiềm Tàng Probiotic Của Vi Khuẩn Lactobacillus Có Nguồn Gốc Từ Người, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 9. Phạm Trần Tố Như (2001) Luận văn tốt Nghiệp: Phân lập và định danh nấm men, tủ sách đại học Khoa Học Tự Nhiên. 10. Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hóa học gỗ và xenluloza, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật. 11. Trần Cẩm Vân (2005), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học quốc gia Hà Nội. 61
  72. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12. Trần Thị Xô (chủ biên), Nguyễn Thị Lan (2005), Cở sở di truyền và công nghệ gen, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 13. Lê Thanh Phương, Hình thái, cấu tạo và các đặc tính cơ bản của vi sinh vật. Tạp chí khoa học. 14. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà xuất bản Y học. TIẾNG ANH 15. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (2002), Short Protocol in Molecular Biology, 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. 16. Cowan D., Meyer Q., Stafford W., Muyanga S., Cameron R. and Wittwer P. (2005), “Metagenomic gene discovery: past, present and future”. Trends in Biotechnology, 23 (6): 321 – 329. 17. Gerstein A.S. (2001), Molecular Biology Problem solve. A Loboratory Guide , Wiley. 18. Ghazanfar S., Azim A., Ghazanfar M. A., Anjum M. I., Begum I (2010). “Metagenomics and its application in soil microbial community studies: Biotechnological prospects”. Journal of Animal & Plant sciences, 6 (2): 611- 622. 19. Lorenz P. and Eck J. (2005), Metagenomics and industrial applications, Nature Reviews Microbiology 3: 510 - 515. 20. JIA Xia, Han Shi-Jie, ZHAO Yong-hua, ZHOU-Yu-mei, (2006) Comparisions of extraction and purification methods of soil microorganism DNA from rhizoshere soil, Journal of Forestry research, 17 (1): 31 – 34. 21. Rickwood D and Hames BD (1984), Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. IRL Press Ltd. Oxford, UK. 22. Harura S, Ueno Y, Igarashi Y, (2006), “Direct comparinson of singlestand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel 62
  73. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragment”, Journal of Microbiological Methods 66: 165 – 169. 23. Streit W. R., Daniel (2010) eds, “Metagenomics Methods and Protocol”, (Methods in Molecular Biology, 668), Humana Press. 24. Yang. Z.H, Xiao - G.M,Zeng-Z.X,.Yu-Y.Liu, (2007) “Comparisions of methods for total community DNA extraction and purification from compost”, Appl Microbiol Biotechnol 74: 918 – 925, Humana Press. 25. Y.H. Percival Zhang, Jiong Hong and Xinhao Ye, (2009), “Cellulase Assay” Chapter 14, In Methods in MB 581, Humana Press. INTERNET 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 63
  74. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Phụ lục A: Trình tự các nucleotide của đoạn gene 16S rDNA của 8 chủng vi khuẩn sau khi giải trình tự Phụ lục B: So sánh trình tự đoạn 16S rDNA của các chủng vi khuẩn đang khảo sát với các chủng trong ngân hàng gene Phụ lục C: Quy trình ly trích và thu nhận DNA tổng số từ dịch vi khuẩn nuôi cấy theo phương pháp CTAB Phụ lục D: Quy trình ly trích và thu nhận DNA tổng số do LaMontagne và cộng sự đã báo cáo (LaMontagne và cộng sự. Năm 2002) Phụ luc E: Kết quả giải trình tự đoạn gene 16S rDNA 1
  75. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục A: Trình tự đoạn 16S rDNA của 5 chủng vi khuẩn sau khi giải trình tự.  Chủng A CGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAAGGCAGCAGTGGGGAAGTATTGCG CAAGTGGTGGGTACACCTTAGATGGCAGCACTGACGCAGTGAGCCGATGCAACGTTCTTGCGGAAT GTAACCCTCATGTTCTTCAGGGCACGATGATGACGGTACCTAAGGCAGGAACGTCTCGTCTAACTA CGTAGCGAGCAGCCGCGGTAATAGTATAGGTGGCAAAGCGTTATCTCGGATTTAACTGGTGCGTAA AGAGTATGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAATTTCGGCGGGGCTTAACAATTGGCGCGGCTT TTGATACTGGATCTGTAGAGTGCGGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGACCATAACTGACGCTGAGATACGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATGTCATTTCTGGGTAGTACACGCGCTTAACGATGTATTGTTGGTGTT GGGGGTTACCACCTTCGGTGCTGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAA GATTAAAACTCACAGGAATTGACAGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGAAGAACCTTATCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCGTAATGGAGGAAGCCCTTCGGG GCAGGAAGAGACGTGGTGCATGGTTGTCGTCATCATCGTGTCGTGAGATGATAGGGTTACGACCCG CAACAAGCTGCAACCCCTCATCCGTTAGTTGCTACCACTTAGGTTGAGCACCTCTGACGAGACTGC CGCCACTTCATCCTGCAAGTAGGATGGCGGATGACGTGCCATCATCCATGACGCGTTATGTATCTA CGGTTACAAGCGTGCTACAATGGTCACGTCATACGA  Chủng C CGTACAAGGAGACTCGGCTATCTGCAGCAGCCGGTATCGTAGTGCGGAGGTTACGATATGTAAAGG GTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGGGCTGCATTCCAAA CTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGGTAGAGAT CACGCAAGAACACCAGTGGCCGAAGGTGCTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGT GGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGG GTATCAACTCCCTCTGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAACCTTACCTGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGG CAAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAA CGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGTAA CCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACACACGGGGCC TCACAATG 2
  76. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Chủng D CGTACAAGGAGACTCGGCTATCTGCAGCAGCCGGTATCGTAGTGCGGAGGTTACGATATGTAAAGG GTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGGGCTGCATTCCAAA CTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGGTAGAGAT CACGCAAGAACACCAGTGGCCGAAGGTGCTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGT GGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGG GTATCAACTCCCTCTGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGAAGAACCTTACCTGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGG CAAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAA CGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGTAA CCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACACACGGGGCC TCACAATG  Chủng E CGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGTGCAATGGGGGAAACCCTGACACAGCGACGCCGCGTGAGT GAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCAATAGTATGGGAAGAAAGAAATGACGGTACCATACGAA AGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTA CTGGGCGTAAAGATGCACGTATGCGGCTAATAAAAGTCAGATGTGAAAAGCTTGGCTGCACCCGA AGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTCAAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATACCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTA GCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAGCAACCAGGTTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACG ATGGATATTAGTTGTGGGTTAGTATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGG CTTGGTTTAATTC  Chủng F CGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGTGCAATGGGGGAAACCCTGACACAGCGACGCCGCGTGAGT GAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCAATAGTATGGGAAGAAAGAAATGACGGTACCATACGAA AGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTA CTGGGCGTAAAGATGCACGTATGCGGCTAATAAAAGTCAGATGTGAAAAGCTTGGCTGCACCCGA AGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTCAAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATACCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTA 3
  77. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAGCAACCAGGTTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACG ATGGATATTAGTTGTGGGTTAGTATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGG GAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGG CTTGGTTTAATTC  Chủng G TCCCACATTTTGACTCTGACACACTCTCCACACTCCTACGGGACGCAATCTGTGGAATATATTGCA CTGTGGGAAACACCCTGACACCACCACGCCGCGTGTGATGATGACGTGTTTTGATAGTGAAGCCCT GTGTTTTTGGGCACTATTATGACTACCCCTGGAGAGGAAGCACGGCTATATATACGTGACCACACC CGGTAATATACATATGTGGAGAGCGTTCTCCGATATTTACTGGGCGTAAAGGGAGTATGTAGGCGA TATTTTAAATGTCAAATGTAATCTCCCGGGGCTAAACTGGGGGCTCGCTTTTAAATCTGATATATC TAGTTGGCAGGAGAAGAGAAACGGAATTCTCATTGTGGAGCGGTAAAATGCGCTTAGATTTGGGAA CCCACCTTGTGGGAAAAGGGGGGTTTTCTGGACTCTATCTGTAGACCTAGAAATCAAAAACCTGGG GGGGCACACCGGTTTAGATACCCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGG TATCAACTCCCTCTGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGA  Chủng H ATGATTTCAGACGTGCTCCCCACTTTGCCGTCACAGTGTAACGCAGGGACAGTTTCTATTTAGAGG GTGTCAACACTTTAATGCTGAGAAACTAAATAGCATAGGGGTTGAGACGTCTTTTCCGAGGAACTA TAACCCTAAAATTTTTCACAGAACCGAGAAAGTGAAGGAACACCCATGGACACAACCGTCTTCTTA TCCCCGAGAAGGGCTTTCTCCCTATTTAAGGATATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTC TTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGACAATTCCCTGTG AGTTTTAATCTTGCGACTGTACTCCCCAGGCGGAATACTTATTGTGTTTGCTGCGGCACCGAGGGG TGGTAATACCCCCTACACATAGTATTCATAGTGTATGGGCGTGTGGTCCCACAGGGTATATATTCT CTGTTTGCTCCCCACGCTTTTGTATGTCAGAGTCAGTTATGGTCTAGAAAGCGGCATTTGCCACTG GTGTTCTTCTTAATCTCTACGCATTTCAGCGCTACACTAAGAATTCCGCTTTCCTCTCGTGCACTC TAGATATCCAGTATCAAATGCAGCGCCCCAGGTTAAGCCCGGGAATTTCACATCTGACTTAAATAT CCGCTTACATACTCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACATACGTATAACCCGTGCT GCTGGCACGTAGATAGCCGTGGTCTTCCTCTTCTGGTACCCGACAATTATCGTCCCAGAAAACAAG AGTTTTTAATACTCCAGAAGACTTTCATCACACAACGCGGCTTTTGCTGCCTCAGAGTTTATCCCC ATATTGCCGCCATTTCCCGCAGTGGCTGCCTCCCGAGAAGAGGTCTGACGGGTTCTCAGTTTCCAA CGTGACCGAATCGGCCTTCACAGG 4
  78. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Chủng K CACGATGAATACTATGTGTCGGGGGTTACCACCCTCTGTGCCGCACAACACACAATATGTATACCC CCTGGGGGAGTACAGTCGCACGATTATAACTCACAGGAGTTGTCAGGGACCCCGCACAAGCAGCCG CAGCATGTGGTTTTATTATCTCAAGCAACGCGCAGAAACCTTATCATCGGACTTGACATCTCCTGT AATTATCTCTTATAGTGGGGGAAGACCCTCCTCGGGCACGAAGAAACACGGGGGTGCCTAGGGTGT TCGCTCACCATCTCTGTTCTCGAGAATGTTGTGGGTTATATTTCTCGAACACAGAGCGCCACCCTT ATGCGTCTTAAGTTCGTACACATATAAGTTGAGACAACTTCTAACAGAACTTGCCGGGCTAACCTG TGCGAAAAGTGAG 5
  79. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục B: So sánh trình tự đoạn 16S rDNA của các chủng vi khuẩn đang khảo sát với các chủng trong ngân hàng gene.  Bacterium NLAE-zl-P612 Query 16 CTGACACACTCTCCACACTCCTACGGGACGCAATC-TGTGGAATATATTGCACTGTGGGA 74 |||| |||| |||| |||||||||||| ||| || ||||||| ||| || ||| Sbjct 269 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGTGGGG 327 Query 75 AACACCCTGACACCACCACGCCGCGTGTGATGATG-ACGTGTTTTGATAGTGAAGCCCTG 133 || |||||||| | | |||||||||| | ||||| | || || ||| || |||||||| Sbjct 328 AACACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGTGGTGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCCTG 385 Query 134 TGTTTTTGGGCACTATTATGACTACCCCTGGAGAGGAAG-CACGGCTATATATACGTGAC 192 | ||| |||| || || ||||| || | ||||||| |||||||| | |||||| | Sbjct 386 TGTTTCTGGGCACGATAATGACGGTACCAGAGGAGGAAGCCACGGCTATATCTACGTGAC 440 Query 193 CA-CA-CC-CGGTAATATACATATGTGGAGAGCGTTCTCCGATATTTACTGGGCGTAAAG 249 || || || |||| | |||| || |||| ||||||| |||| |||||||||||||||| Sbjct 441 CAGCAGCCGCGGTAATATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGAGATTTACTGGGCGTAAAG 496 Query 250 GGAGTATGTAGGC-GATATTTTAAATGTCAAATGTAA-TCTCCCGGGGC-TAAACTGGGG 306 || || |||||| ||| |||||| || | || || || |||||||| ||| |||||| Sbjct 497 GGAGTGCGTAGGCGGATGTTTTAAGTGGGATGTGAAANTCTCCCGGGGCTTAACCTGGGG 554 Query 307 GCTCGCTTTTAAATCTGATATATCTAGTTGGCAGGAGAAGAGAAA-CGGAATTCTCATTG 365 ||| || || || ||| |||||||| ||||||| || |||| |||||||| | | | Sbjct 555 GCTCGCATTCCAAACTGAGATATCTAGAGTGCAGGAGAAGAGAAAGCGGAATTCTCATAG 608 Query 366 TGGAGCGGTAAAATGCGCTTAGA-TTTGGGAA-CCCACCTTGTGGGAAAAGGGGGGTTTT 423 || |||||| ||||||| |||| || |||| |||| || || || || || ||| Sbjct 609 TGTAGCGGTGAAATGCGCTTAGAGATTAGGAAGAACACCTAGTGGGCGAAGGGCGGCTTT 663 Query 424 CTGGACTCTATCTGTAGAC-CT-AGAAATCAAAAACCTgggggggCACACCGGTTTAGAT 481 ||||||| || | | ||| || || | | ||| | | ||| ||| || || |||||| Sbjct 664 CTGGACTGTAACTGTAGACGCTGAGGCATCGAAAGCGTGGGGTAGCAAACAGGATTAGAT 718 Query 482 ACCCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTC 541 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 719 ACCCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCCC 777 6
  80. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 542 TGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 601 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 778 TGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACT 837 Query 602 CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGA 654 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 838 CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAACATGTGGTTTAATTCGA 890  Bacterium NLAE-zl-P902 Query 60 GTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGG 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 471 GTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGG 530 Query 120 GCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGC 179 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 531 GCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGC 590 Query 180 GGTGAAATGCGGTAGAGATCACGCAAGAACACCAGTGGCCGAAGG-TGCTTTCTGGACTG 238 |||||||||| |||||||| | | |||||||||||||| |||||| ||||||||||||| Sbjct 591 GGTGAAATGCGGTAGAGATTACGGAAGAACACCAGTGGCCGAAGGCGGCTTTCTGGACTG 647 Query 239 TAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 298 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 648 TAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 707 Query 299 ACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTGTGCCGCAGTTAA 358 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 708 ACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCCCTGTGCCGCAGTTAA 767 Query 359 CACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACG 418 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 768 CACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACG 827 Query 419 GGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC 478 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 828 GGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC 887 Query 479 TGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGGCAAGGAGACA 538 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 888 TGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGGCAAGGAGACA 947 7
  81. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 539 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAG 598 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 948 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAG 1007 Query 599 CGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGT 658 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1008 CGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGT 1067 Query 659 AACCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACAC 718 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1068 AACCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACAC 1127 Query 719 ACG 721 ||| Sbjct 1128 ACG 1130  Burkholderia lata Query 63 ACCCCCTGGGGGAGTACAGTCGCACGATTATAACTCACAGGAGTTGTCAGGGACCCCGCA 122 ||| ||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| |||||||| || Sbjct 313 ACCGCCTGGGGGAGTACAGTCGCACGATTATAACTCTCAGGAGTTGAGGGGGACCCCGCA 370 Query 123 CAAGCAGCCGCAGCATGTGGTTTTATTATCTCAAGCAACGCGCAGAAACCTTA 175 ||||| | | | ||||| | ||||| ||| | ||| |||| | |||| ||| Sbjct 371 CAAGCGGTGGATGCATGTGGTATTATTATCTCATGCACCGCGAAAAAACCTTA 418  Clostridium thermoamylolyticum Query 1 CGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 227 CGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGAC 286 Query 61 TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGTGCAATGGGGGAAACCCTGACACAGCGACG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 287 TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGTGCAATGGGGGAAACCCTGACACAGCGACG 346 Query 121 CCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCAATAGTATGGGAAGAAAGAAATG 180 ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||| Sbjct 347 CCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCAATAGTATGGGAAGAAAGTAATG 403 8
  82. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 181 ACGGTACCATACGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 404 ACGGTACCATACGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGG 463 Query 241 GCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGATGCACGTATGCGGCTAATAAAAGTCAG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||| || |||| |||||| ||||||||||| Sbjct 464 GCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGATGCGCGTAGGCGGCTAATAAAAGTCAG 521 Query 301 ATGTG-AAAAGCTTGGCTGCACCCGAAGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTC 359 ||||| |||| || |||| || ||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 522 ATGTGAAAAACCTGGGCTGCAACCGAAGGGTATGCATCTGAAATCTAAATAGCTTGAGTC 578 Query 360 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 419 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 579 AAGGAGAGGAGAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAATA 638 Query 420 CCGTTGCCGAAATCGCCTTTCTGGACTTGAACTGTAGCTGAGGTGGGAAAGCGTGGGGAG 479 || || ||||| || || ||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||| Sbjct 639 CCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGACTTGAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG 698 Query 480 CAACCAGG-TTAGGATACCTTGTTATTCCAGAGCGGTAAACGATGGATATTAGTTGTGGG 538 ||| |||| ||| |||||| || || |||| || |||||||||| ||| ||| |||||| Sbjct 699 CAAACAGGATTAGGATACCCTGGTAGTCCAGCGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTGGG 756 Query 539 TTA-GTATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC 597 ||| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 757 TTAGGAATAATCCGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC 816 Query 598 AAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGGCTTGGTT 657 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | |||| Sbjct 817 AAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGGCTTGGTT 873 Query 658 TAATTC 663 |||||| Sbjct 874 TAATTC 879  Clostridium sporogenes Query 16 CTGACACACTCTCCACACTCCTACGGGACGCAATC-TGTGGAATATATTGCACTGTGGGA 74 |||| |||| |||| |||||||||||| ||| || ||||||| ||| || ||| Sbjct 264 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGTGGGG 322 9
  83. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 75 AACACCCTGACACCACCACGCCGCGTGTGATGATG-ACGTGTTTTGATAGTGAAGCCCTG 133 || |||||||| | | |||||||||| | ||||| | || || ||| || |||||||| Sbjct 323 AACACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGTGGTGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCCTG 380 Query 134 TGTTTTTGGGCACTATTATGACTACCCCTGGAGAGGAAG-CACGGCTATATATACGTGAC 192 | ||| |||| || || ||||| || | ||||||| |||||||| | |||||| | Sbjct 381 TGTTTCTGGGCACGATAATGACGGTACCAGAGGAGGAAGCCACGGCTAAATCTACGTGAC 435 Query 193 CA-CA-CC-CGGTAATATACATATGTGGAGAGCGTTCTCCGATATTTACTGGGCGTAAAG 249 || || || |||| | |||| || |||| ||||||| |||| |||||||||||||||| Sbjct 436 CAGCAGCCGCGGTAATATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGAGATTTACTGGGCGTAAAG 491 Query 250 GGAGTATGTAGGC-GATATTTTAAATGTCAAATGTAATCTCCCGGGGCTAAACTGGGGGC 308 || || |||||| ||| ||||| || | || |||| |||||| ||| |||||||| Sbjct 492 GGAGTGCGTAGGCGGATAGTTTAAGTGGGATGTGAAATCTCCCGGGCTTAACCTGGGGGC 548 Query 309 TCGCTTTTAAATCTGATATATCTAGTTGGCAGGAGAAGAGAAA-CGGAATTCTCATTGTG 367 | || || || ||| |||||||| ||||||| || |||| |||||||| | | ||| Sbjct 549 TCGCATTCCAAACTGAGATATCTAGAGTGCAGGAGAAGAGAAAGCGGAATTCTCATAGTG 602 Query 368 GAGCGGTAAAATGCGCTTAGA-TTTGGGAA-CCCACCTTGTGGGAAAAGGGGGGTTTTCT 425 |||||| ||||||| |||| || |||| |||| || || || || || ||||| Sbjct 603 TAGCGGTGAAATGCGCTTAGAGATTAGGAAGAACACCTAGTGGGCGAAGGGCGGCTTTCT 657 Query 426 GGACTCTATCTGTAGAC-CT-AGAAATCAAAAACCTgggggggCACACCGGTTTAGATAC 483 ||||| || | | ||| || || | | ||| | | ||| ||| || || |||||||| Sbjct 658 GGACTGTAACTGTAGACGCTGAGGCATCGAAAGCGTGGGGTAGCAAACAGGATTAGATAC 712 Query 484 CCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTG 543 || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 713 CCGTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTG 771 Query 544 TGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 603 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 772 TGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCA 831 Query 604 AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGA 654 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 832 AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGA 882 10
  84. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Clostridium botulinum Query 60 GTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGG 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 9780 GTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGG 9839 Query 120 GCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGC 179 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 9840 GCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGC 9899 Query 180 GGTGAAATGCGGTAGAGATCACGCAAGAACACCAGTGGCCGAAGG-TGCTTTCTGGACTG 238 |||||||||| |||||||| | | |||||||||||||| |||||| ||||||||||||| Sbjct 9900 GGTGAAATGCGGTAGAGATTACGGAAGAACACCAGTGGCCGAAGGCGGCTTTCTGGACTG 9956 Query 239 TAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 298 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 9957 TAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC 10016 Query 299 ACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCTCTGTGCCGCAGTTAA 358 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 10017 ACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCCCTGTGCCGCAGTTAA 10076 Query 359 CACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACG 418 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10077 CACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACG 10136 Query 419 GGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC 478 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10137 GGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC 10196 Query 479 TGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGGCAAGGAGACA 538 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10197 TGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGGCAAGGAGACA 10256 Query 539 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAG 598 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10257 GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAG 10316 Query 599 CGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGT 658 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10317 CGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGT 10376 11
  85. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 659 AACCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACAC 718 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10377 AACCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACAC 10436 Query 719 ACG 721 ||| Sbjct 10437 ACG 10439  Clostridium thermopalmarium Query 172 ACACCCATGGACACAACC-GTCTTCTTATCCCCGAGAAGGGCTTTCTCCCTATTTAAGGA 230 ||| |||| | ||| ||| |||||| | |||| ||||||||| || || | ||| | Sbjct 1008 ACAACCATGGACACCACCTGTCTTCCTAGCCCCGAGAAGGGCTTCCTCCCTATTTACGAG 957 Query 231 TATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCAC 290 || | |||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||| | ||| ||||||| Sbjct 956 TAATTCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAAATTAAACCAC 899 Query 291 ATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGACAATTCCCTGTGAGTTTTAATCTTGCGACTGT 350 |||||||||||||||||||| ||||| ||||| ||| ||||||||||||||||||| || Sbjct 898 GTGCTCCGCTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGT 840 Query 351 ACTCCCCAGGCGGAATACTTATTGTGTTTGCTGCGGCACCGAGGGGTGGTAATACCCCCT 410 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 839 ACTCCCCAGGCGGAATACTTATTGCGTTTGCTGCGGCACCGAGGGGTGGTAATACCCCCG 781 Query 411 ACACATAGTATTCATAGTGTATGGGCGTGTGGTCCCACAGGGTATATATTCTCTGTTTGC 470 |||| |||||||||| || || ||| |||| | |||||||| || || |||||||| Sbjct 780 ACACCTAGTATTCATCGTTTATCGGCGTGTGGACTACCAGGGTATCTAATCTCTGTTTGC 725 Query 471 TCCCCACGCTTTTGTATGTCAGAGTCAGTTATGGTCTAGAAAGCGGCATTTGCCACTGGT 530 |||||||||||| |||| |||| ||||||||||||| ||||||| || || ||||||||| Sbjct 724 TCCCCACGCTTTCGTATCTCAGCGTCAGTTATGGTCCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGT 665 Query 531 GTTCTTCTTAATCTCTACGCATTTCAGCGCTACACTAAGAATTCCGCTTTCCTCTCGTGC 590 ||||||| |||||||||||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||| | Sbjct 664 GTTCTTCCTAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCCAC 605 Query 591 ACTCTAGATATCCAGTATCAAATGCAGCGCCCCAGGTTAAGCCCGGGAATTTCACATCTG 650 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 604 ACTCTAGATATCCAGTATCAAATGCAGCGCCCCAGGTTAAGCCCGGGAATTTCACATCTG 546 12
  86. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 651 ACTTAAATATCCGCTTACATACTCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACAT 710 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 545 ACTTAAATATCCGCCTACATACTCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACCT 486 Query 711 ACGTATAACC-CGTGCTGCTGGCACGTAGATAGCCGTGGTCTTCCTCTTCTGGTACCCGA 769 |||||| ||| || ||||||||||||||| ||||||||| ||||||| | |||||| | Sbjct 485 ACGTATTACCGCGTGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGTCTTCCTCCTTAGGTACCCGT 429 Query 770 CAATTATCGTCCCAGAAAACAAGAGTTTTTAATACTCCAGAAGACTTTCATCACACAACG 829 || |||||||||| || ||| ||| ||| | | ||| |||||| |||||| | || || Sbjct 428 CAATTATCGTCCCTAAAGACAAGAGCTTTTACAACTCCAGAAGACCTTCATCGCTCAACG 375 Query 830 CGGCTTTTGCTGCCTCAGAGTTTATCCCCATATTGCCGCCAT-TTCCCGCAGTGGCTGCC 888 |||| || ||||| |||| |||| |||||| | || || || ||||| || || ||||| Sbjct 374 CGGCGTTTGCTGCGTCAGGGTTTCTCCCCATATTGCCGCAATATTCCCGCACTGGCTGCC 322 Query 889 TCCCG-AGAAGAGGTCTG-ACGGGTTCTCAGTTTCCAACGTGACCGA 933 ||||| || ||| |||| || | |||||||| |||| ||| |||| Sbjct 321 TCCCGTAGAAGAGGTCTGGACCGTGTCTCAGTTTCCAATGTGGCCGA 279  Clostridium crotonatovorans Query 232 ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTATGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTAGAAATAAAACCACA 291 ||| |||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||| | ||| |||||||| Sbjct 946 ATTGCAGGAGATGTCAAGTCTAGGTAAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAAATTAAACCACA 890 Query 292 TGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGACAATTCCCTGTGAGTTTTAATCTTGCGACTGTA 351 |||||||||||||||||||| ||||| ||||| ||| ||||||||||||||||||| ||| Sbjct 889 TGCTCCGCTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTA 831 Query 352 CTCCCCAGGCGGAATACTTATTGTGTTTGCTGCGGCACCGAGGGGTGGTAATACCC-CCT 410 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||| ||||| || Sbjct 830 CTCCCCAGGCGGAATACTTATTGCGTTTGCTGCGGCACCGAGAGGTGGTAATACCCTCCG 775 Query 411 ACACATAGTATTCATAGTGTATGGGCGTGTGGTCCCACAGGGTATATATTCTCTGTTTGC 470 |||| |||||||||| || || ||| |||| | |||||||| || || |||||||| Sbjct 774 ACACCTAGTATTCATCGTTTATCGGCGTGTGGACTACCAGGGTATCTAATCTCTGTTTGC 719 Query 471 TCCCCACGCTTTTGTATGTCAGAGTCAGTTATGGTCTAGAAAGCGGCATTTGCCACTGGT 530 |||||||||||| |||| |||| |||||||| |||| |||||| || || ||||||||| Sbjct 718 TCCCCACGCTTTCGTATCTCAGCGTCAGTTACGGTCCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGT 659 13
  87. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 531 GTTCTTCTTAATCTCTACGCATTTCAGCGCTACACTAAGAATTCCGCTTTCCTCTCGTGC 590 ||||||| |||||||||||||||||| |||||||||| ||||||| |||||||||| || Sbjct 658 GTTCTTCCTAATCTCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCACTTTCCTCTCCCGC 599 Query 591 ACTCTAGATATCCAGTATCAAATGCAGCGCCCCAGGTTAAGCCCGGGAATTTCACATCTG 650 |||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 598 ACTCTAGATACCCAGTATCAAATGCAGCGTCCCAGGTTAAGCCCGGGAATTTCACATCTG 540 Query 651 ACTTAAATATCCGCTTACATACTCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACAT 710 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 539 ACTTAAATATCCGCCTACATACTCTTTACGCCCAGTAAATCCGGACAACGCTTGCCACCT 480 Query 711 ACGTATAACC-CGTGCTGCTGGCACGTAGATAGCCGTGGTCTTCCTCTTCTGGTACCCGA 769 |||||| ||| || ||||||||||||||| ||||||||| ||||||| | ||||||| | Sbjct 479 ACGTATTACCGCGTGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGTCTTCCTCCTTTGGTACCCGT 423 Query 770 CAATTATCGTCCCAGAAAACAAGAGTTTTTAATACTCCAGAAGACTTTCATCACACAACG 829 || ||||||||||| || ||| ||||||| | | ||| |||||| |||||||| || || Sbjct 422 CAATTATCGTCCCAAAAGACAAGAGTTTTTACAACTCCAGAAGACCTTCATCACTCAACG 369 Query 830 CGGCTTTTGCTGCCTCAGAGTTTATCCCCATATTGCCGCCAT-TTCCCGCAGTGGCTGCC 888 |||| || ||||| |||| |||| |||||| | || || || ||||| || || ||||| Sbjct 368 CGGCGTTTGCTGCGTCAGGGTTTCTCCCCATATTGCCGCAATATTCCCGCACTGGCTGCC 316 Query 889 TCCCG-AGAAGAGGTCTG-ACGGGTTCTCAGTTTCCAACGTGACCGA 933 ||||| || ||| |||| || | |||||||| |||| ||| |||| Sbjct 315 TCCCGTAGAAGAGGTCTGGACCGTGTCTCAGTTTCCAATGTGGCCGA 273  Clostridium thermobutyricum Query 1 CGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAAGGCAGCAGTGGGGAAGT 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| | Sbjct 294 CGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAAGGCAGCAGTGGGGAAGT 351 Query 61 ATTGCGCAAGTGGTGGGTACACCTTAGATGGCAGCACTGACGCAGTGAGCCGATGCAACG 120 ||||||||| ||| ||| | ||| | || |||||| | ||| ||||| |||| || | Sbjct 352 ATTGCGCAAGTGGTGGG-AAACCCTAGATCGCAGCAACGCCGCAGTGAGCTGATGCAACG 402 Query 121 TTCTTGCGGAATGTAACCCTCATGTTCTTCAGGGCACGATGATGACGGTACCTAAGGCAG 180 |||| |||| ||||| ||| || |||| |||| ||||| |||||||||||||||| || Sbjct 403 GTCTTGCGGATTGTAAAGCTCATGTTCTTTAGGGCACGATAATGACGGTACCTAAGGCAG 457 14
  88. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Query 181 GAACGTCTCGTCTAACTACGTAGCGAGCAGCCGCGGTAATAGTATAGGTGGCAAAGCGTT 240 ||| | | || |||||||||| || |||||||||||||||| |||||||| ||||||| Sbjct 458 GAACGCCACGGCTAACTACGTAGCCAGCAGCCGCGGTAATAGCGTAGGTGGCAAAGCGTT 513 Query 241 ATCTCGGATTTAACTGGTGCGTAAAGAGTATGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAAT 300 || ||||||| ||||| | |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| Sbjct 514 GTCTCGGATTTAACTGGTGTGTAAAGAGTATGTAGGCGGATATTTAAGTCAGATGTGAAA 570 Query 301 TTCGGCGGGGCTTAACAATTGGCGCGGCTTTTGATACTGGATCTGTAGAGTGCGGGAGAG 360 ||| | ||||||||| | ||||| || ||||||||||||| | ||||||| ||||||| Sbjct 571 TTCGGCCGGGCTTAACACTGGGCGCTGCATTTGATACTGGATATCTAGAGTGTGGGAGAG 627 Query 361 GAAAGTGGTATTTCTAGTGTAGCGGTGAGATGGGTAGAGACTGGGAAGTACTACTGA-TG 419 || || || ||| ||||||||||||||| ||| ||||||| | ||||| | || | | || Sbjct 628 GACAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGTAATACTCAGTG 685 Query 420 G-TAAGGGGGCTGTATGGACCATGT-A-TGTCATCGAGATTGGAAAGCGTGCTGAGCAAT 476 | |||| | || | |||| | ||| | || || ||| ||||||||| |||||| Sbjct 686 GCGAAGGCGCCTTTCTGGACCATGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA 743 Query 477 CTGGATGTCATTTCTGGGTAGTACACGCGCTTAACGATGTATTGTTGGTGTTGGGGGTTA 536 | |||| || | |||||| ||||| | ||||||| | | ||||| |||||||| Sbjct 744 CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCNGTAAACGATGAACACTAGGTGTCGGGGGTTA 803 Query 537 CCACCTTCGGTGCTGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA 596 ||||| ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 804 CCACCCTCGGTGCCGCAGCAAACGCAATAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA 863 Query 597 TTAAAACTCACAGGAATTGACAGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCG 656 |||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 864 TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCG 923 Query 657 AAGCAACGCGAAGAACCTTATCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCGTAATGGAGGAA 716 |||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 924 AAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCGTAATGGAGGAA 983 Query 717 GCCCTTCGGGGCAGGAAGAGAC-G-TGGTGCATGGTTGTCGTCATCATCGTGTCGTGAGA 774 || ||||||||||||| |||| | ||||||||||||||||||| | ||||||||||||| Sbjct 984 GCCCTTCGGGGCAGGAAGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCATCGTGTCGTGAGA 1039 Query 775 TGATAGGGTTACGACCCGCAACAAGCTGCAACCCCTCATCCGTTAGTTGCTACCACTTAG 834 || | |||||| | |||||||| ||| ||||||| | || |||||||||||||| ||| Sbjct 1040 TGTTAGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCTGCAACCCTTCATTCGTTAGTTGCTACCACTTAA 1094 15