Đồ án Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa paradisiaca)

86 trang thiennha21 12/04/2022 6960

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa paradisiaca)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_qua_trinh_len_men_bioethanol_su_dung_nguyen_l.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát quá trình lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối (musa paradisiaca)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN BIOETHANOL SỬ DỤNG NGUYÊN LIỆU VỎ CHUỐI (MUSA PARADISIACA) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. LÊ THỊ KIM PHỤNG Th.S TRẦN THỊ TƯỞNG AN Sinh viên thực hiện : CHÂU NHẬT HUY MSSV: 1051110086 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐƯỢC THỰC HIỆN TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của ThS. Trần Thị Tưởng An. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong đồ án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình. Trường đại học Công nghệ TP.HCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có). TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện Châu Nhật Huy
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu tại Phòng nghiên cứu Năng lượng sinh học tại trường ĐH Bách Khoa TP.HCM, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và quan tâm của quý thầy cô. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc. Ngoài ra, chúng em cũng cảm ơn đến các anh chị là cán bộ phòng thí nghiệm năng lượng sinh họcđã giúp đỡ, hướng dẫn, và giải đáp những thắc mắc trong quá trình thực tập. Xin trân trọng cảm ơn: • Th.S Trần Thị Tưởng An , Bộ môn Quá Trình & Thiết Bị, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa, TP. Hồ Chí Minh. Xin cảm ơn cô là người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện cũng như giúp đỡ, hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện đề tài này . • TS Nguyễn Đình Quân – cảm ơn thầy đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện và giải đáp một số thắc mắc giúp tôi. • Chị Trần Phước Nhật Uyên, Chị Vũ Lê Vân Khánh, Anh Phan Đình Đông, anh Hải, anh Thiên và Chú Nguyễn Văn Khanh– đã sẵn sàng giải đáp, trao đổi các thắc mắc trong quá trình thực tập tại xưởng. Cũng xin cám ơn các bạn sinh viên đến từ các trường ĐH Bách Khoa, Tôn Đức Thắng và ĐH Lạc Hồng, trong thời gian thực hiện các bạn đã giúp đỡ nhiệt tình. Một lần nữa xin chân thành cám ơn quý thầy cô và các bạn! Sinh viên thực hiện Châu Nhật Huy
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Bioethanol 4 1.1.1. Giới thiệu chung về bioethanol 4 1.1.2. Phân loại bioethanol 6 1.1.2.1. Bioethanol thế hệ thứ nhất 6 1.1.2.2. Bioethanol thế hệ thứ hai 6 1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba 7 1.1.3. Nguồn nguyên liệu cho sản xuất 7 1.1.3.1. Sucrose 7 1.1.3.2. Tinh bột 8 1.1.3.3. Lignocellulose 8 1.1.3.4. Cellulose 9 1.1.3.5. Hemicellulose 10 1.1.3.6. Lignin 10 1.1.4. Ưu và nhược điểm của bioethanol 10 1.1.4.1. Ưu điểm 11 1.1.4.2. Nhược điểm 11 1.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam 12 i
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5.1. Trên thế giới 12 1.1.5.2. Tại Việt Nam 14 1.1.6. Các công trình nghiên cứu sản xuất bioethanol 16 1.1.6.1. Trên thế giới 16 1.1.6.2. Ở Việt Nam 18 1.1.7Các phương pháp sản xuất bioethanol 20 1.1.7.1. Khái niệm cơ bản 20 1.1.7.2. Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocelluloses 21 1.1.7.3. Quá trình và các phương pháp tiền xử lý 21 1.1.7.4. Quá trình thủy phân 25 1.1.7.1. Quá trình lên men 26 1.1.7.5. So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp SSF và SHF 29 1.1.7.6. Quá trình chưng cất và tinh chế 30 1.2.Nguyên liệu 32 1.2.1. Giới thiệu về chuối 32 1.2.2 Diện tích và sản lượng chuối ở Việt Nam 32 1.23. Tình hình sản xuất chuối trên thế giới 33 1.3. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất ethanol 34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 35 2.2. Đối tượng nghiên cứu 35 2.3. Vật liệu nghiên cứu 35 2.3.1. Nguyên vật liệu 35 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 35 ii
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Tiến hành thí nghiệm 35 2.4.1Lên men riêng (SHF) 32 2.4.1.1. Thí nghiệm 1: Tiền xử lý 34 2.4.1.2. Thí nghiệm 2: Thuỷ phân 34 2.4.1.3. Thí nghiệm 3: Lên men 36 2.4.2. Thuỷ phân và Lên men đồng thời (Simultaneous saccharification and fermemtation, SSF) 37 2.5.Bố trí thí nghiệm 38 2.6. Các phương pháp phân tích 40 2.6.1. Phương pháp hóa lý 40 2.6.1.1. Phương pháp xác định độ ẩm 40 2.6.1.2. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS . 40 2.6.1.3. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng Anthrone 41 2.6.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 41 2.6.1.5. Xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan 43 2.6.2. Phương pháp vi sinh 43 2.6.2.1. Phương pháp nuôi cấy nấm men 43 2.6.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Kết quả khảo sát các phương pháp thuỷ phân 46 3.1.1. Thuỷ phân bằng H2SO4 47 3.1.2. Thuỷ phân bằng Cellulase 48 3.2 Kết quả khảo sát các phương pháp lên men 48 3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian lên men SHF 48 iii
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SHF 52 3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH trong lên men SHF 54 3.2.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống nấm men trong lên men SHF 56 3.2.5. Kết quả khảo sát thời gian lên men SSF 57 3.2.6. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SSF 60 3.2.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH trong lên men SSF 61 3.3. Kết quả đo hoạt tính enzyme 62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC A.Cách xây dựng đường chuẩn định lượng đường khử (glucose) PHỤ LỤC B.Cách xây dựng đường chuẩn định lượng cellulose PHỤ LỤC C.Quy trình nhân giống nấm men PHỤ LỤC D.Bảng số liệu kết quả iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chính của linocellulose 8 Hình 1.2. Chuỗi mạch thẳng của cellulose 10 Hình 1.3. Chuối musha paradisiaca 16 Hình 2.1. Quy trình lên men SHF 32 Hình 2.2. Quy trình lên men SSF 37 Hình 3.1. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 1 ngày 47 Hình 3.2. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 2 ngày 47 Hình 3.3. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 3 ngày 48 Hình 3.4. Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng H2SO4 48 Hình 3.5. Sự thay đổi độ cồn theo thời gian trong lên men SHF 49 Hình 3.6. Sự thay đổi độ Brix theo thời gian trong lên men SHF 50 Hình 3.7. Sự thay đổi hàm lượng glucose theo thời gian trong lên men SHF 51 Hình 3.8. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo nhiệt độ trong lên men SHF 53 Hình 3.9. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo nhiệt độ trong lên men SHF 53 Hình 3.10. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo pH trong lên men SHF 54 Hình 3.11. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo pH trong lên men SHF 55 Hình 3.12. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo tỉ lệ giống trong lên men SHF 56 Hình 3.13. Sự thay đổi hàm lượng glucose và cellulose theo tỉ lệ giống trong lên men SHF 56 Hình 3.14. Sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo thời gian trong lên men SSF 57 Hình 3.16. Sự thay đổi hàm lượng glucose theo thời gian trong lên men SSF 58 v
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.16. Sự thay đổi độ cồn và brix theo nhiệt độ trong lên men SSF 60 Hình 3.17. Sự thay đổi độ cồn và Brix theo pH trong lên men SSF 60 vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT SSF Thuỷ phân và lên men đồng thời SHF Thuỷ phân và lên men riêng biệt SSCF Đồng đường hoá và đồng lên men vii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1.Sản lượng ethanol theo khu vực 13 Bảng 2.2.Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam 14 Bảng 2.3.Diện tích trồng chuối theo các vùng 31 Bảng 2.4.Sản lượng trồng chuối theo vùng 32 Bảng 2.5.Thành phần hóa học của chuối 33 viii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Đã từ rất lâu, dầu mỏ luôn giữ một vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế của mỗi quốc gia. Hơn 90% lượng dầu mỏ khai thác được phục vụ cho nhu cầu năng lượng như xăng nhiên liệu, nhiên liệu phản lực, diesel, nhiên liệu đốt lò Có thể nói dầu mỏ là nền tảng của sự tăng trưởng và phát triển kinh tế của bất kì một quốc gia nào. Trong những năm gần đây, với sự leo thang của giá xăng dầu gây nhiều tác động tiêu cực đến nền kinh tế thế giới. Vì vậy việc tìm kiếm những nguồn năng lượng sạch, có khả năng tái tạo để thay thế một phần xăng dầu trở thành một vấn đề cấp thiết và được nhiều quốc gia quan tâm. Một trong những hướng đi hiệu quả là sử dụng ethanol để pha vào xăng vừa làm tăng chỉ số octane, vừa làm giảm ô nhiễm môi trường nên xăng pha cồn ngày càng trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Hơn nữa, nước ta là một nước nông nghiệp có nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol là rất phong phú. Việt Nam sở hữu hai đồng bằng rộng lớn là đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng Sông Cửu Long. Đây là vùng nguyên liệu lí tưởng, là tiền đề cho sự ra đời của nhà máy sản xuất ethanol từ cellulose. Ngày nay, thế giới đang đứng trước nguy cơ khủng hoảng năng lượng trầm trọng. Như chúng đã biết, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm 60-80% nguồn năng lượng thế giới. Theo dự báo của các nhà khoa học trên thế giới, với tốc độ tiêu thụ như hiện nay và trừ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ bị cạn kiệt trong vòng 40- 50 năm nữa. Để ổn định và đảm bảo an ninh năng lượng đáp ứng cho nhu cầu con người cũng như các ngành công nghiệp, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm ra những nguồn nhiên liệu mới, trong đó nghiên cứu phát triển nhiên liệu sinh học có nguồn gốc từ sinh khối động, thực vật là một hướng đi có thể tạo ra nguồn nhiên liệu thay thế phần nào nguồn nhiên liệu hoá thạch đang cạn kiệt, đảm bảo an ninh năng lượng cho từng quốc gia. Sử dụng nhiên liệu sinh học mang lại các lợi ích như giảm thiểu ô nhiễm môi trường vì nguyên liệu sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học không chứa các hợp chất thơm, hàm lượng lưu huỳnh thấp, không chứa chất độc hại, mặt khác nhiên liệu sinh học khi thải vào đất có tốc độ phân hủy sinh học cao nhanh hơn gấp 4 lần so với nhiên liệu dầu mỏ và do đó giảm được rất nhiều tình trạng ô nhiễm nước ngầm. Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo. Bioethanol tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng thích nghi như nguồn nhiên liệu mới cho tương lai. Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động do tinh bột là nguồn lương thực của con người. Nếu sử dụng lương thực để sản xuất bioethanol sẽ 1
Đồ án tốt nghiệp làm cho giá của lương thực tăng cao. Như vậy, sẽ làm bất bình ổn giá của lương thực, tác động xấu đến thị trường lương thực trong nước. Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản xuất bằng con đường hóa học. Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40 – 75% tổng chi phí của sản xuất ethanol. Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu là yêu cầu cho việc sản xuất bioethanol. Như các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của ngành nông nghiệp: rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ cam chanh, phụ phẩm trái cây Với những lí do như trên, đề tài này là bước đi hỗ trợ việc sản xuất ethanol phục vụ cho nhu cầu năng lượng ngày càng tang ở nước ta. 2. Mục đích nghiên cứu của đề tài Đề tài được thực hiện nhằm khảo sát và qua đó rút ra được điều kiện tối ưu của các phương pháp lên men bioethanol sử dụng nguyên liệu vỏ chuối. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài tập trung vào những nghiên cứu: 3.1. Khảo sát và so sánh kết quả thuỷ phân vỏ chuối bằng enzyme và H2SO4. 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men SHF như: thời gian, nhiệt độ, pH và tỉ lệ giống. 3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men SSF như: thời gian, nhiệt độ và pH. 3.4. Thực hiện thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme. 4. Phương pháp nghiên cứu Đề tài sử dụng các phương pháp và phần mềm: 5.1. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS. 5.2. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng thuốc thử Anthrone. 5.3. Phương pháp xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan. 5.4. Phương pháp nuôi cấy nấm men. 5.5. Phương pháp đếm khuẩn lạc. 5.6. Phần mềm Statgraphics Centurion XV. 2
Đồ án tốt nghiệp 5. Các kết quả đạt được của đề tài 5.1. Kết quả thuỷ phân bằng cellulase nồng độ 5% trong 1 ngày là tối ưu nhất. 5.2. Phương pháp SHF 5.2.1. Khảo sát thời gian cho kết quả lên men trong 18 giờ đạt độ cồn cao nhất 4.8%. 5.2.2. Khảo sát nhiệt độ cho kết quả lên men ở 370C là tối ưu nhất. 5.2.3. Khảo sát pH cho kết quả lên men ở pH 5 là thích hợp nhất. 5.2.4. Khảo sát tỉ lệ giống cho kết quả lên men với tỉ lệ giống 5% là thích hợp và tiết kiệm nhất. 53. Phương pháp SSF 5.3.1. Khảo sát thời gian cho kết quả lên men trong 38 giờ đạt độ cồn cao nhất 5.1%. 5.3.2. Khảo sát nhiệt độ cho kết quả lên men ở 370C là tối ưu nhất. 5.3.3. Khảo sát pH cho kết quả lên men ở pH 5 là thích hợp nhất. 6. Kết cấu của đồ án Đồ án gồm 4 chương: Chương 1. Tổng quan tài liệu. Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Chương 3. Kết quả và thảo luận. Chương 4. Kết luận và kiến nghị. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bioethanol 1.1.1. Giới thiệu chung về bioethanol Bioethanol là rượu ethanol sinh học thu được từ quá trình lên men vi sinh các loại nguyên liệu chứa đường hoặc từ tinh bột, cellulose nhờ vào phản ứng trung gian thủy phân thành đường của vi sinh. Bioethanol được tổng hợp thông qua quá trình sinh học, vi sinh sử dụng nguồn nguyên liệu đường làm thức ăn để thực hiện hô hấp kỵ khí và thải ra ethanol và khí CO2. Trong khi đó, ethanol có nguồn gốc dầu mỏ thì được tổng hợp thông qua quá trình hóa học, không có mặt tham gia của cơ thể sống trong quá trình tạo ethanol. Đặc tính của ethanol [4] Công thức phân tử: C2H5OH Khối lượng phân tử: 46.07 g/mol Trạng thái: lỏng, không màu (từ -117 oC – 78 oC) Tỉ trọng: 0.789 kg/l Điểm sôi: 78.5 oC Điểm đông đặc: -1170C Giới hạn nổ: dưới 3.5% v/v; trên 19% v/v Áp suất hơi: 38 oC, 50mmHg pKa: 15.9 Độ nhớt: 1.200 mPa.s (20 oC) Bioethanol có thể sử dụng để tạo ra ethanol khối gel để sử dụng làm năng lượng nấu ăn ( sử dụng trong nhà bếp), làm nhiên liệu phát điện, sử dụng làm dung môi trong chiết suất dược liệu. Ethanol tuyệt đối được ứng dụng để làm phụ gia khi thêm vào ETBE, polyethylenterephtalate trong sản xuất bao bì và chai nhựa, pha vào xăng để tăng chỉ số octane của xăng. 4
Đồ án tốt nghiệp Bioethanol là nguồn năng lượng tái tạo và không đóng góp vào việc làm tăng hiệu ứng nhà kính. Nếu như ta đốt cháy các sinh khối sẽ sinh ra CO2 thì tác động xấu tới môi trường mà không có hiệu quả kinh tế. Các nguồn sinh khối có nguồn gốc thực vật, được tổng hợp thông qua quá trình tổng hợp quang học. Tổng hợp bioethanol từ nguồn sinh khối là chuyển nguồn năng lượng tổng hợp quang học thành nguồn năng lượng có giá trị và nhiều ứng trong thực tế. Sinh khối thực vật không phải thực phẩm là nguồn nguyên liệu thuộc “thế hệ thứ hai” được sử dụng để chuyển hóa thành bioethanol với sự kết hợp công nghệ hóa học hiện đại và công nghệ sinh học, đó là nguồn phụ phẩm của ngành nông nghiệp như rơm rạ, vỏcacao . Với sự phát triển của ngành sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối thực vật sẽ thúc đẩy các hộ nông dân trồng trọt tăng diện tích cây trồng cung cấp nguồn lương thực cho con người và tận dụng sinh khối. Như vậy, sẽ tạo ra diện tích cây xanh nhiều hơn giúp cân bằng hệ sinh thái, giảm hiện tượng hiệu ứng nhà kính. 1.1.2. Phân loại bioethanol 1.1.2.1.Bioethanol thế hệ thứ nhất Ethanol sinh học thếhệ thứ nhất là ethanol sinh học làm từđường, tinh bột, bằng cách sửdụng công nghệ thông thường.Các nguyên liệu cơ bản để sản xuất ethanol sinh học thếhệđầu tiên thường là hạt giống hoặc các loại ngũ cốc như lúa mì, tinh bột được lên men thành ethanol sinh học. 1.1.2.2. Bioethanol thế hệ thứ hai Quy trình sản xuất ethanol sinh học thế hệ đầu tiên có ích, nhưng hạn chế: không thể sản xuất đủ ethanol sinh học mà không đe dọa nguồn cung cấp thực phẩm và đa dạng sinh học và việc phải cạnh tranh về chi phí với nhiên liệu hóa thạch như xăng. Ethanol sinh học thế hệ thứ hai có thể giúp giải quyết những vấn đề này và có thể cung cấp một lượng nhiên liệu bền vững,chi phí thấp, và với những lợi ích lớn hơn về môi trường. Ethanol sinh học thế hệ thứ hai được sản xuất bằng cách lên men thực vật có nguồn gốc đường để sản xuất ethanol,bằng cách sử dụng một quá trình tương tự như 5
Đồ án tốt nghiệp được sử dụng trong bia và rượu.Điều này đòi hỏi việc sử dụng cây trồng như mía, ngô, lúa gạo, lúa mì, và củ cải đường. Ethanol sinh học cũng có thể sản xuất từ phụ phẩm của các loại cây trồng hiện nay, như thân cây, rơm rạ, lá và trấu cũng như các loại cây trồng khác mà không được sử dụng cho các mục đích thực phẩm (không phải cây lương thực), như cỏ, jatropha và ngũ cốc v.v 1.1.2.3. Bioethanol thế hệ thứ ba Sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung (dầu thực vật, biodiesel, bioethanol, biogas, biomethanol, biobutanol và nhiên liệu sinh học khác), ethanol sinh học nói riêng từ tảo.Trong số các đặc điểm hấp dẫn nhiên liệu từ tảo: không ảnh hưởng đến nguồn nước ngọt, có thể được sản xuất bằng cách sử dụng biển và nước thải, được phân hủy và tương đối vô hại cho môi trường.Trong quá trình quang hợp, tảo và các sinh vật khác sử dụng carbon dioxide và ánh sáng mặt trời và chuyển nó thành oxy và nhiên liệu sinh học. 1.1.3. Nguồn nguyên liệu cho sản xuất Công nghệ chiếm ưu thế hiện nay trong sản xuất bioethanol là chuyển hoá sinh khối thành ethanol thông qua lên men rượu rồi chưng cất. Quá trình lên men rượu này là quá trình chuyển hoá sinh hoá học, sinh khối sẽ được vi khuẩn hoặc nấm men phân huỷ. Phương pháp lên men có thể áp dụng đối với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. 1.1.3.1Sucrose Đường mía, ở dạng dịch ép hoặc rỉ đường, là nguồn nguyên liệu quan trọng nhất ở các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới để sản xuất bioethanol. Ở các nước Châu Âu, đường từ củ cải đường được sử dụng. Bên cạnh đó, cây lúa miến ngọt cũng là nguồn nguyên liệu thô triển vọng, phần than có thể được chiết tách tạo ra dịch trích chứa nồng độ sucrose cao, hạt của nó chứa lượng lớn tinh bột, phần bã là nguồn lignocelluloses quan trọng. Quá trình chuyển hoá sucrose thành ethanol dễ hơn so với tinh bột và sinh khối lognocellulose vì không cần qua quá trình tiền xử lý, tế bào nấm men có thể thuỷ phân 6
Đồ án tốt nghiệp disaccharide, thêm vào đó là điều kiện lý tưởng của dịch đường và rỉ đường cho quá trình lên men. Đánh giá hiệu quả kinh tế của Maiorella và cs (1984) thì chi phí nguyên liệu lên đến 70% chi phí sản xuất bioethanol nếu sử dụng rỉ đường làm nguyên liệu. 1.1.3.2. Tinh bột Tinh bột là một polysaccharide carbohydrate chứa hỗn hợp amylose và amylopectin. Chúng đều là các polymer carbohydrate phức tạp của glucose. Để chuyển hoá tối đa lượng tinh bột thành đường, tạo điều kiện lên men rượu, bột nhão được nấu và cho thuỷ phân bằng enzyme hoặc acid loãng. Quá trình lên men được thực hiện khi có mặt một số chủng men rượu. Để thuận lợi cho quá trình lên men, pH của dịch thuỷ phân cần điều chỉnh ở mức 4,8 – 5. Bioethanol sinh ra trong quá trình lên men sẽ hoà tan trong nước. Nhờ hàng loạt các bước chưng cất để loại nước, nồng độ bioethanol sẽ được tăng cao tối đa. Đối với các loại hạt, năng suất ethanol thu được vào khoảng 2.800 lít/ha, tức khoảng 3 tấn nguyên liệu hạt sẽ thu được 1 tấn bioethanol. 1.1.3.3. Lignocellulose Hình 1.1.Cấu trúc chính của linocellulose Lignocellulose là một chất hữu cơ tái tạo và là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật.Lignocellulose bao gồm ba thành phần chính: cellulose, hemicellulose và lignin.Ngoài ra, có một số thành phần khác như protein, pectin, và 7
Đồ án tốt nghiệp tro.Tỉ lệ giữa các thành phần là khác nhau tùy thuộc vào nguồn lignocellulose.Ngoài ra, tỉ lệ đó còn phụ thuôc vào tuổi, giai đoạn tăngtrưởng, điều kiện sinh trưởng. Các thành phần cấu tạo nên lignincellulose (lignin, cellulose, hemicellulose) là các đối tượng khó bị phân hủy.Tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khichúng liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa tạo thành một thể cấu trúcchặt chẽ và phức tạp.Các vi sợi cellulose, lignin, hemicellulose được sắp xếp theo những quy tắc nhất định để hình thành nên cấu trúc vi sợi.Với cấu trúc nhiều lớp, gồm nhiều thànhphần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignocellulose có độ bền vật lý cao, rấtkhó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme.Hơn nữa để phân hủy bất cứ thànhphần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thànhphần khác.Ví dụ như, để phân giải lignocellulose thì cần đồng thời tác động của lignin, cellulose và hemicellulose. Nhưng do cả ba điều có tính chất hóa học khácnhau nên cơ chế tác động và điều kiện tiến hành cũng khác nhau. 1.1.3.4. Cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose. Các glucose này liên kết với nhau bằngliên kết α-1, 4 glucoside. Cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các gốcglucose trong cellulose thường lệch một góc 1800và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình. Hình 1.2.Chuỗi mạch thẳng của cellulose trong không gian Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50.000 – 2.500.000 dalton.Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút “Van der waals” và “liên kết hydro”. Các phân tử celluose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm.Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibri ).Và hemicellulose và lignin bao xung quanh các vi sợi đó. 8
Đồ án tốt nghiệp 1.1.3.5. Hemicellulose Hemicellulose là thành phần chính thứ hai của sinh khối lignocellulose, với hàm lượng lớn sau cellulose.Hemicellulose là một polymer không đồng nhất (hỗn tạp), được cấu tạo từ các loại đường khác nhau như pentoses (bao gồm xylose vàarabinose), hexose (chủ yếu là mannose, ngoài ra còn có glucose và galactose) vàthậm chí cả từ acid uronic của chúng (ví dụ như 4-omethylglucuronic, d-glucuronic,và d- galactouronic axít). Người ta gọi tên cụ thể một loại hemicellulose dựa theotên một loại đường nào đó chiếm tỷ lượng lớn trong thành phần của hemicellulose.Ví dụ như xylan-loại hemicellulose dễ gặp nhất trong thiên nhiên.Xylan là một hemicellulose mà thành phần chủ yếu của nó là xylose, mannose, trong đó xylose chiếm tỷ lượng lớn nhất.Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%).Ở những cây lá kim thường chứa ít xylan. Phân tử lượng của hemicellulose nhỏ hơn phân tử lượng của cellulose rất nhiều.Hemicellulose thường được cấu tạo từ 150 gốc đường.Các gốc đường này được nối với nhau bằng các liên kết β-1,4; β-1,3; β-1,6 glucoside.Chúng thường là những mạch ngắn, phân nhánh. Trong tế bào thực vật, hemicellulose thường nằm xen kẽ giữa các bó sợi cellulose tạo nên một dạng cấu trúc bền vững. 1.1.3.6. Lignin Lignin là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ởnhững mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thấm nướcqua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Khác với cellulose và hemicellulose, lignin hình thành từ các dẫn xuất của phenyl, propan, một sốchất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin làsản phẩm ngưng tụ chủ yếu của ba loại rượu thơm:coniferyl (guaiacyl propanol),sinapyl (syringyl alcohol) và p-coumaryl (p-hydroxyphenyl propanol) theo tỷ lệkhác nhau tùy loại thực vật. Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kếtvà loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa cácmonome là kiểu liên kết aryl-glyxerol-aryl ete.Ngoài ra còn có các kiểu liên kết phenyl- coumaryl, biphenyl. 9
Đồ án tốt nghiệp Lignin hoạt động như một rào cản, cản trở sự thủy phân cellulose, hemicellulose thành đường và các hợp chất hữu cơ khác để có thể biến đổi thành nhiên liệu, bằng cách liên kết chặt chẽ với cả hemicellulose và cellulose. 1.1.4. Ưu và nhược điểm của bioethanol 1.1.4.1. Ưu điểm: Ethanol sinh học được biết đến với rất nhiều lợi thế: là một trong những biện pháp kìm hãm hiện tượng nóng lên toàn cầu; giúp các quốc gia chủ động, không bị lệ thuộc vào vấn đề nhập khẩu nhiên liệu, đặc biệt đối với những quốc gia không có nguồn dầu mỏ và than đá;kiềm chế sự gia tăng giá xăng dầu, ổn định tình hình năng lượng cho thế giới;tạo thêm công ăn việc làm cho người dân; và cũng không đòi hỏi phải có những thiết bị và công nghệ đắt tiền. Về mặt kĩ thuật thì cồn nguyên chất khi cháy dưới điều kiện lý tưởng, theo lý thuyết thì chỉ có CO2 và H2O, nhưng thực tế thì CO cũng được sinh ra, tuy nhiên lượng CO thường thấp hơn đối với xăng. Nguyên nhân ethanol có chứa 6% oxygen theo thể tích cho phép động cơ tự đốt cháy nhiên liệu hoàn toàn, kết quả là làm giảm sự ô nhiễm khí CO. Ethanol là nguồn nhiên liệu có khả năng tái sinh vì được sản xuất từ cây nông nghiệp thu hoạch hàng năm, sử dụng năng lượng mặt trời là chính.Ethanol có nguồn gốc thực vật nên CO2 sinh ra khi đốt được cây cối hấp thụ lại tạo nên sự cân bằng về lượng CO2, do đó không gây nên hiệu ứng nhà kính. Công suất lớn hơn có thể đạt được ở ethanol nhiên liệu do tỉ số nén của xăng dầu là 8:1còn của ethanol là 12:1.Số liệu thực nghiệm chỉ ra rằng ethanol nhiên liệu có thể tạo ra công suất lớn hơn 20% so với xăng dầu (Pimentel, 1980).Ethanol có chỉ số octan là 113, cao hơn so với khoảng 83- 95 của xăng.Chỉ số này cao đồng nghĩa với việc hạn chế được hiện tượng tự phát nổ, xảy ra trước khi đánh lửa, sẽ làm hại động cơ.Mặt khác, ethanol không chứa các chất khác độc hại như chì. 1.1.4.2. Nhược điểm: Bên cạnh các ưu điểm đã biết, công cuộc phát triển ethanol sinh học cũng chứa đựng không ít nhược điểm về mặt kĩ thuật cũng như nguy cơ vềmôi trường, kinh tếvà xã hội.Nếu không được quản lý và kiểm soát tốt, các tác dụng xấu sẽ xảy ra, thậm chí có thể lớn tới mức lấn át cả những mặt tích cực do nhiên liệu sinh học mang lại.Nguy 10
Đồ án tốt nghiệp cơ sẽ càng rõ hơn theo quy mô ngày càng tăng của nền công nghiệp nhiên liệu sinh học. Những nhược điểm và nguy cơ chính trong quá trình phát triển Bioethanol cần phải kể đến là: Về mặt kỹ thuật: Bioethanol là một nhiên liệu kém hiệu quả hơn xăng, chỉ chứa năng lượng bằng 70% so với xăng.Mặt khác, để sử dụng được xăng có nồng độ ethanol cao, một số xe cần phải cải biến. Vấn đề lương thực: Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ ) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm. Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước: Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực. Giảm diện tích rừng: Để có đất trồng cây nguyên liệu, người ta có thể tiếp tục phá rừng.Giảm diện tích rừng cũng đồng nghĩa với tai hoạ từ sự xói mòn đất, giảm lượng gỗ dùng cho xây dựng và các nhu cầu khác của người dân. Nguy cơ từ sự độc canh: Trồng duy nhất một loại cây trong một thời gian dài trên cùng diện tích đất sẽ làm đất đai trở nên cằn cỗi và không thể tiếp tục canh tác được. Nguy cơ từ sự biến đổi gen cây nguyên liệu: Gây tác động xấu tới các loài vi sinh vật sống nhờ vào thực vật và có thể gây nên sự mất cân bằng sinh thái. Nguy cơ do khai thác nhiên liệu sinh học từ rác thải nông nghiệp và một số loài thực vật khác: Ngoài mía đường, đậu tương, cọ, nhiên liệu sinh học còn có thểđược sản xuất từ rác thải nông nghiệp khác và cỏ.Tuy nhiên, rác thải nông nghiệp và cỏ cũng có vai trò riêng đối với môi trường, không thể khai thác một cách không tính toán. 11
Đồ án tốt nghiệp Nguy cơ về kinh tế xã hội: Những người nghèo, không có khảnăng tựchủcanh tác phải bán ruộng.Đất đai tập trung vào một sốđiền chủlớn.Như vậy, một lớp người sẽtước mất phương tiện sản xuất, rơi vào tình trạng thất nghiệp, nghèo đói, làm bất ổn đời sống xã hội.Kéo theo đó là tình trạng phân hoá giàu nghèo ngày càng rõ rệt. 1.1.5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và ViệtNam 1.1.5.1. Tình hình sản xuất trên thế giới Theo báo cáo F.O. Licht thì bioethanol được sử dụng làm nhiên liệu đốt trong từ năm 1860 do nhà khoa học Nicolas August Otto (Đức) khám phá. Vào những năm 20 của thế kỷ 20, Henry Ford đã thiết kế ra động cơ xe ô tô chạy bằng ethanol đầu tiên trên thế giới.[17] Đến sau 1930 thì Mỹ, Brazil, Anh, Pháp, Đức, Ý, Thuỵ Điển đã bắt đầu sử dụng Bio-Ethanol thay thế xăng. Nhưng trào lưu này thực sự bùng nổ vào những năm 1970 khi nguồn nhiên liệu chính là dầu mỏ bị khủng hoảng nguồn cung. Cũng theo báo cáo trên thì 47 % bioethanol nhiên liệu trên thế giới được sản xuất từ mía đường, 53% là từ cây có chứa tinh bột (bắp, sắn lát và lúa mì). Sản lượng bioethanol sản xuất năm 2008 khoảng 65.7 tỷ lít. Nhu cầu Bio-Ethanol nhiên liệu trên toàn thế giới vào năm 2015 sẽ cao gấp hơn 2 lần sản lượng năm 2006 (100 tỷ lít). Trước đó, Brazil là quốc gia đứng đầu về sản xuất và tiêu thụ bioethanol. Đến năm 2006, Mỹ vượt qua Brazil và trở thành nước sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất thế giới. Các quốc gia sản xuất bioethanol lớn như Braxil, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và Pháp chiếm 84% sản lượng bioethanol nhiên liệu của toàn thế giới trong năm 2005. Brazil là nước đi đầu trên thế giới trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu từ mật rỉ đường trong năm 2004 và đến năm 2008, Brazil đã sản xuất được 30 tỷ lít, chiếm 34 % sản lượng bioethanol toàn thế giới. Trong giai đoạn 2012 – 2013, Brazil sẽ đạt được 37 tỷ lít/năm từ 728 tỷ rỉ đường. Ở Brazil, tỉ lệ bioethanol pha trộn với xăng hóa thạch là 20% và 25% tương ứng với loại xăng E20 và E25. Nhóm các nước nhập khẩu bioethanol nhiên liệu từ Brazil là Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thụy Điển và Hà Lan. 12
Đồ án tốt nghiệp Năm 2007, Mỹ đã vượt qua Brazil trở thành quốc gia lớn nhất thế giới về sản xuất bioethanol nhiên liệu từ nguồn nguyên liệu là ngô, chiếm 44 % sản lượng toàn thế giới. Theo chương trình phát triển năng lượng quốc gia, Mỹ sẽ sản xuất 150 tỷ lít bioethanol vào năm 2030. Năm 2010, sản lượng bioethanol của EU là 341.250.000 lít chiếm 8% sản lượng thế giới. Trong đó, Pháp là quốc gia sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất châu Âu (114 triệu lít, chiếm 33 %), Tây Ban Nha 47.8 triệu lít ( chiếm 14 %) và Đức 44.4 triệu lít ( chiếm 13 %). Trung Quốc là nước sản xuất bioethanol lớn nhất khu vực Châu Á, đứng thứ ba trên thế giới, sản xuất ethanol từ ngô. Năm 2005, tổng sản lượng bioethanol của quốc gia này xấp xỉ 3.8 tỷ lít (trong đó 1.3 tỷ lít là bioethanol nhiên liệu), chiếm gần 8 % sản lượng toàn thế giới. Các quốc gia khác đã có những thành tựu đáng kể trong việc sản xuất bioethanol đó là Ấn Độ, Thái Lan và một số quốc gia khác: Ấn Độ là quốc gia đứng thứ 2 ở châu Á về sản xuất bioethanol sau Trung Quốc, chiếm 4% sản lượng ethanol toàn cầu. Năm 2005 sản lượng bioethanol của Ấn Độ là 1.7 tỷ lít, trong đó 200 triệu lít là bioethanol nhiên liệu. Thái Lan là quốc gia Đông Nam Á đi tiên phong trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu. Năm 2007, Thái Lan có 9 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu với tổng công suất gần 400 triệu lít/năm, trong khi đó chỉ có duy nhất nhà máy Thai Nguan sản xuất bioethanol từ sắn lát. Dự kiến đến năm 2011, Thái Lan sẽ sản xuất khoảng 1 tỷ lít bioethanol nhiên liệu. Bàng 2.1.Sản lượng ethanol theo khu vực (Đơn vị: triệu lít)[1] 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Châu Âu 1.627 1.958 3.945 4.851 6.015 8.812 Châu Phi 71 101 154 168 170 213 Châu Mỹ 60.913 65.144 76.890 79.311 81.192 85.133 13
Đồ án tốt nghiệp Châu Á- Thái 2.832 3.189 4.721 5.828 7,144 8.903 Bình Dương Thế giới 65.762 74.921 85.933 89.294 95.450 96.132 Nguồn: Dr.Chirstoph Berg F.o.Litch, World fuel ethanol analysis 1.1.5.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam bioethanol được sử dụng một phần trong công nghiệp, thực phẩm, thức uống và phần lớn được dùng làm nhiên liệu sinh học. Tính đến tháng 4/2012, có 13 dự án sản xuất ethanol nhiên liệu, 5 nhà máy đã đi vào hoạt động với công suất thiết kế 490 triệu lít/năm. Hiện nay một phần xăng được sử dụng ở các thành phố lớn ở nước ta đều được pha bioethanol để được sản phẩm xăng sinh học E5. Đây là cơ hội tốt cho Việt Nam góp phần vào nỗ lực cải thiện đời sống nông thôn, xóa đói giảm nghèo và thu hẹp khoảng cách đời sống giữa nông thôn và thành thị. Cho nên cần có một chính sách và quy hoạch quốc gia nhằm vừa hỗ trợ phát triển ngành sản xuất các loại nhiên liệu sinh học vừa tạo thêm việc làm ở nông thôn, tăng gia lợi tức nông dân và bảo đảm an ninh năng lượng trong nước. Thế nhưng việc đưa xăng E5 ra thị trường còn nhiều trở ngại, lượng tiêu thụ trong thời gian qua ở mức rất thấp. Để có thể duy trì hoạt động, các doanh nghiệp sản xuất ethanol Việt Nam đang phải tìm đường xuất khẩu. Bảng 2.2. Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam.[3] Công suất – Nguyên liệu Tên nhà máy Chủ đầu tư đầu vào Nhà máy Ethanol Đại Lộc 100 triệu lít/năm – Sắn Công ty Đồng Xanh – Quảng Nam Nhà máy Ethanol Cư Dút – 50 triệu lít/năm –Rỉ đường Công ty Đại Việt Đắc Nông Nhà máy Ethanol Tam 100 triệu lít/năm – Sắn, Công ty PVB thuộc PV 14
Đồ án tốt nghiệp Nông – Phú Thọ mía OIL Nhà máy Ethanol Dung 100 triệu lít/năm – Sắn Nhà máy liên doanh Bình Quất Sơn thuộc Petrovietnam Nhà máy Ethanol Bình 100 triệu lít/năm – Sắn Liên doanh ITOCHU Nhật Phước Bản và PV OIL 1.1.6 Các công trình nghiên cứu sản xuất bioethanol 1.1.6.1. Trên thế giới Trong những thập niên gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về quá trình sản xuất bioethanol từ biomass ở rất nhiều nơi trên thế giới và đã thu được những thành công nhất định, tạo cơ sở khoa học cần thiết cho việc chuyển giao công nghệ sản xuất bioethanol vào quy mô công nghiệp, để phục vụ nhu cầu năng lượng cho thế giới. Năm 2008, B.C. Akin-Osanaiye, H.C. Nzelibe and A.S. Agbaji, đã báo cáo đề tài “Sản xuất ethanol từ phụ phẩm của trái đu đủ”. Sau quá trình trích ly enzyme papain để sản xuất các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa thức ăn giàu protein ở người thì những phần còn lại sẽ được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae trong thời gian 72 giờ, nhiệt độ 300C. Kết quả đạt độ cồn từ 2.82 – 6.60% theo thể tích. Năm 2009, Simone Brethauer, Charles E. Wyman đã báo cáo nghiên cứu “Tổng quan: Phương pháp thủy phân và lên men liên tục cho sản xuất ethanol từ nguyên liệu cellulose”. Năm 2011, Hossain, A. B. M. S.1, Ahmed, S. A, Ahmed M. Alshammari, Faris M. A. Adnan, Annuar, M. S. M., Hadeel Mustafa1 and Norah Hammad, đã báo cáo nghiên cứu “ Sản xuất nhiên liệu bioethanol từ phụ phẩm vỏ chuối để quản lý chất thải và phát triển nguồn năng lượng bền vững”. Đề tài đã tiến hành thủy phân nguyên liệu bằng sự kết hợp giữa cellulase và pectinase. Kết quả lên men bằng Saccharomyces cerevisiae cho độ cồn từ 4.1 tới 7.1% bioethanol.[22] 15
Đồ án tốt nghiệp Năm 2011, Kulanthaivel Senthilguru, Tanya Susan George, Narasinganallur Sankaranarayanan Vasanthi và Kilavan Packiam Kannan, đã báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài “ Sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose phụ phẩm”. Đề tài tiến hành tiền xử lý nguyên liệu để tăng hiệu quả thủy phân của enzyme trong giai đoạn thủy phân cellulose tạo ra đường. Đồng thời kết hợp với sử dụng loài nấm Phoma Sp. Kết quả thu được 2.4% (v/w) cho 100 gram nguyên liệu lignocellulose. Năm 2011, Razif Harun, Michael K. Danquah đã báo cáo nghiên cứu “Ảnh hưởng của acid trong giai đoạn tiền xử lý sinh khối từ vi tảo cho sản xuất ethanol sinh học”. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol sinh học thu được cao nhất là 7.2 g/L khi bước tiền xử lý được thực hiện với 15 g/L vi tảo ở 140 oC sử dụng 1 % (v/v) acid sulfuric trong 30 phút. Về sản lượng ethanol, tối đa khoảng 52% khối lượng (g ethanol/ g tảo) thu được bằng cách sử dụng 10 g/L vi tảo và 3 % (v/v) acid sulfuric ở 160 oC trong 15 phút. Phân tích thống kê cho thấy trong số các thông số khảo sát thì nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sử dụng acid trong tiền xử lý vi tảo để sản xuất ethanol sinh học. Năm 2012, Aloia Romaní, Gil Garrote, Juan Carlos Parajó đã báo cáo nghiên cứu “Sản xuất ethanol sinh học từ gỗ bạch đàn globulus tự phân bằng phương pháp đường hóa và lên men đồng thời”. Kết quả tạo ra được 291 L ethanol/1000 kg gỗ khô từ cellulose trong đó chủ yếu chứa phần lớn là lignin. Năm 2012, María Boluda-Aguilar, Antonio López-Gómez, đã báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài “Quá trình sản xuất bioethanol từ quá trình lên men vỏ cam chanh được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi nước”. Trong vỏ cam chanh có chứa nhiều D – limonene (0.8 – 1.6%) là chất ức chế hoạt động của nấm men. Nên đề tài áp dụng phương pháp nổ hơi nước vỏ cam chanh để giảm hàm lượng D – limonene xuống còn 0.05%. Sau quá trình lên men, lượng cồn thu được 60 lít/1000 kg vỏ cam chanh tươi. Tại Rio de Janeriro (Brazil), Elba P.S Bon và Maria Antoniete Ferrara đã tiến hành nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ sinh khối bằng cách thủy phân bởi enzyme. Đặc biệt gần đây tại Sao Paulo ( Brazil), nhóm nghiên cứu gồm Marcia A. Ribeiro, Vanessa M. Cardoso, Manoel N. Mori, Jaime Finguerut, Celia M. A. Galvao 16
Đồ án tốt nghiệp và Celina L. Duarte đã tiến hành nghiên cứu tận dụng nguồn bã mía để sản xuất bioethanol dùng phương pháp tiền xử lí bằng chiếu xạ điện tử. - Tối ưu hoá các thông số của quá trình lên men để sản xuất ethanol từ chất thải Kinnow và vỏ chuối bằng đường hoá đồng thời và quá trình lên men của Naresh Sharma, K.L. Kalra, Harinder Singh Oberoi và Sunil Bansal thuộc trường Đại học Punjab Agricultural, Ludhiana, Ấn Độ. Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá vai trò của các thông số trong quá trình lên men như nồng độ nấm men, nhiệt độ, thời gian ủ và thời gian khuấy trong việc sản xuất bioethanol từ vỏ chuối và bã Kinnow. Nghiên cứu cho kết quả tối ưu trong việc lên men sản xuất bioethanol ở 300C, nồng độ nấm men 6%, ủ trong 48 giờ kết hợp khuấy trong 24 giờ cho kết quả tốt nhất. - Nghiên cứu tối ưu hoá sản xuất ethanol từ vỏ chuối bằng thuỷ phân và lên men đồng thời của trường Đại học Kansas, Manhattan, Hoa Kỳ. Nghiên cứu cho kết quả tối ưu về thời gian và nhiệt độ của quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời là 370C trong vòng 35 giờ cho nồng độ ethanol 28.2g/l và lượng ethanol sản xuất được là 2.3g/l/h là kết quả tối ưu nhất từ vỏ chuối.[18] - Công trình nghiên cứu của bà Kadambini Gaur thuộc trường Đại học Deemed về “tối ưu hoá sản xuất ethanol bằng lên men” vào tháng 6 năm 2006. Nghiên cứu sử dụng nguyên liệu mía đường. Kết quả thu được ở 300C, pH 6.0 và nồng độ đường 20% là tối ưu cho quá trình lên men. 1.1.6.2.Ở Việt Nam Năm 2008, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” của tác giả Trần Diệu Lý bằng cách sử dụng rơm rạ cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc. Sau đó được tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulase hoặc thủy phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và Saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra. Kết quả cho thấy rằng, quá trình thủy phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11 % bã rắn, 5 % enzyme, 50 0C và pH 4.8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55.08 g/l và hiệu suất đạt 81 %. Quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11 % bã rắn, 5 % enzyme, 23.6 triệu tế bào nấm men/ml, 500C và pH 4.8. Quá trình này thu được 30.86 g/l ethanol 17
Đồ án tốt nghiệp tương ứng hiệu suất là 86.61 %. Kết quả này cho thấy quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ. Năm 2011, Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng, đã báo cáo kết quả đề tài “ Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lông cứng (Cladophora Socialis Kutzing) ứng dụng trong sản xuất cồn”. Với hàm lượng carbohydrate cao nên rất thuận lợi để thủy phân tạo ra một lượng đường lớn cung cấp cho nấm men sinh ra lượng cồn cao. Khi lên men 200 ml dịch đường sau quá trình thủy bằng Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện 300C trong 72 giờ, thu được 50 ml dịch bay hơi đầu tiên từ quá trình chưng cất đạt độ cồn 5%. Cladophora Socialis Kutzing dễ dàng bị thủy phân và lên men tạo ethanol hứa hẹn là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất bioethanol Tháng 6, 2010, KS.Phạm Hải Triều thuộc Đại học Cần Thơ báo cáo đề tài :” Nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ bã mía” cho thấy ảnh hưởng của các yếu tố: thời gian, tỉ lệ cơ chất, tỉ lệ enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình tổng hợp bioethanol. Nguyên liệu được cắt nhỏ và tiền xử lý bằng NaOH để phá vỡ cấu trúc lignin và một phần hemicellulose. Sau đó tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulose, lên men bằng Saccharomyces cerevisiae. Kết quả thu được cho thấy quá trình thủy phân diễn ra tốt nhất ở điều kiện:10% bã rắn, 8% enzyme, 55oC và pH 4,8, tương ứng thu được nồng độ glucose là 7,76% thời gian thủy phân là 21 giờ. Sau khi tiếp tục lên men trong 21 giờ thu được 3,93% ethanol với hiệu suất là 88,8%. Quá trình lên men tạo ethanol diễn ra tốt nhất ở điều kiện: 11% bã rắn, 9% enzyme, 2,5% nấm men, 40oC , pH là 4,8, tương ứng với nồng độ ethanol thu được là 3,63% và hiệu suất chuyển hóa là 82,77%. Năm 2010, Tiến sĩ Lê Như Hậu, trưởng phòng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên biển, thuộc viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang giới thiệu kết quả nghiên cứu về đề tài :” Tiềm năng rong biển cho sản xuất cồn sinh học ở Việt Nam”. Thống kê cho thấy số liệu đo đạt khảo sát thực tế về diện tích phân bố rong biển của Viet Nam có thể đạt diện tích 79126,32 ha và sản lượng thu hoạch được là 69703,26 tấn khô. Rong biển có hàm lượng carbonhydrat cao, phù hợp với quá trình lên men để sản xuất ethanol. Vì vậy. có thể sản xuất ethanol nhiên liệu sinh học từ rong biển. Kết quả nghiên cứu cho thấy bức tranh toàn cảnh về tiềm năng rong biển làm nguyên liệu 18
Đồ án tốt nghiệp sản xuất bioethanol, góp phần vào chiến lược cho sự phát triển năng lượng bền vững tại Việt Nam. Năm 2009, Trường Đại học Bách Khoa TPHCM phối hợp với trường Đại học Tokyo( Nhật Bản) thực hiện dự án” Kết hợp bền vững nền nông nghiệp địa phương với công nghiệp chế biến biomass”(Dự án JICA-JST Biomass). Dự án JICA-JST do cơ quan hợp tác quốc tế Nhật Bản (JICA) và Bộ Khoa học Công nghệ Nhật Bản (JST) tài trợ với tổng chi phí gần 150 đồng thực hiện trong thời gian 5 năm (2009 – 2014). Dự án hướng đến việc sản xuất xăng sinh học, biogas sạch có nhiệt trị cao từ các phế phẩm công nghiệp như: Rơm, rạ, trấu, phân bò, nhằm bảo vệ môi trường, giảm hiệu ứng nhà kính và góp phần đảm bảo năng lượng. Năm 2009, dự án đã xây dựng một mô hình thiết bị tại Trường Đại học Bách Khoa TPHCM để nghiên cứu sản xuất bioethanol. Sau gần 5 năm thực hiện, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ và các chất thải có nguồn gốc cellulose. Tuy nhiên, một trong những khó khan cua dự án là giá thành xăng sinh học sản xuất từ rơm rạ là khá cao, chi phí phân hủy cellulose là khá lớn. TS. Lê Thị Kim Phụng – Điều phối viên của dự án cho biết, biogas từ nguồn phân bò rất khó thực hiện nhưng dự án đã triển khai thành công ở xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TPHCM. Kỹ thuật làm sạch và làm giàu khí metan trong biogas đã được phát triển và ứng dụng trên quy mô nhỏ. Cụ thể, dự án đã xây dựng được một xưởng thực nghiệm sử dụng dây chuyền khép kín sản xuất thành công biogas sạch có nhiệt trị cao, dung làm nhiên liệu cho động cơ và sản xuất công nghiệp. Qua dây chuyền này, những phế phẩm nông nghiệp như: Rơm rạ, trấu, phân bò sẽ được tạo thành nhiên liệu khí có thể sử dụng như để chạy máy phát điện, máy kéo, máy cày, Như vậy sản xuất nông nghiệp tạo thành một vòng khép kín: Sauk hi thu hoạch, chất thải nông nghiệp lại biến thành năng lượng và năng lượng này quay trở lại phụ vụ đời sống và sản xuất. 1.1.7. Các phương pháp sản xuất bioethanol Sản xuất ethanol bằng phương pháp hóa học rất tốn nhiều chi phí cho thiết bị, nguyên liệu và năng lượng. Nên để có hiệu quả kinh tế cao và đồng thời bảo vệ môi 19
Đồ án tốt nghiệp trường thì phải chọn phương pháp tổng hợp ethanol bằng con đường sinh học để thu được bioethanol. 1.1.7.1. Khái niệm cơ bản Nguyên liệu sản xuất biothenol gồm ba thành phần chính là cellulose, hemicellulose và lignin. Công nghiệ chuyển đổi nguyên liệu này thành ethanol đã được phát triển trên hai nền tảng có thể được gọi là nền tảng đường và nền tảng khí. Trong nền tảng đường, cellulose và hemicellulose đầu tiên được chuyển đổi thành đường lên men, sau đó được lên men đẻ sản xuất bioethanol. Những phân tử đuường lên men gồm glucose, xylose, galactose và manose. Có thể sử dụng các acid và enzyme để thủy phân cellulose và hemicellulose để tạo ra các loại đường (Drapcho et al, 2008). Trong nền tảng khí tổng hợp, nhiên liệu sinh học là đối tượng thông qua một quá trình được gọi là khí hóa. Trong quá trình này, sinh khối được đun nóng với không khí có oxy hoặc chỉ có một phần 3 oxy bình thường để đốt cháy hoàn toàn, sau đó chuyển đổi thành sản phẩm khí trong đó có chủ yếu là carbon monoxide và hydro. Khí được gọi là khí tổng hợp có thể lên men vi sinh vật cụ thể hoặc chuyển đổi xúc tác để sản xuất bioethanol. Trong nền tảng đường, chỉ có các phân tử carbohydrat được sử dụng để sản xuất bioethanol, trong khi ở nền tảng khi tổng hợp, tất cả ba thành phần của nhiên liệu sinh học được chuyển đổi thành bioethanol (Drapcho et al, 2008) 1.1.7.2. Sản xuất bioethanol từ nguyên liệu lignocelluloses: Về nguyên tắc, quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường. Bao gồm bốn bước cơ bản: • Tiền xử lý nguyên liệu: giúp cho quá trình thủy phân cellulose thành đường có hiệu quả hơn. • Thủy phân nguyên liệu: sử dụng hệ enzyme thủy phân cellulase- pectinase • Lên men: sử dụng Saccharomyces cerevisiae. 20
Đồ án tốt nghiệp • Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau. 1.1.7.3. Quá trình tiền xử lí và các phương pháp tiền xử lý Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin và hemicellulose. Trong đó, cellulose là thành phần quan trọng được sử dụng trong chuyển hóa sinh khối thực vật thành bioethanol. Nhưng cellulose rất khó bị phân hủy vì phân tử của nó rất lớn, liên kết giữa các monomer rất bền vững, phân tử có độ kết tinh cao và nó liên kết chặt chẽ với lignin và hemicellulose. Nên cần phải có phương pháp tiền xử lý thích hợp nhất để phân hủy phân tử cellulose. Cellulose và hemicellulose được bảo vệ bởi lớp lignin dày đặc chống lại thủy phân của enzym.Vì vậy, cần thiết phải có một bước tiền xử lý để phá vỡ lignin để lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được dễ dàng. Tiền xử lý nhằm mục đích giảm kết tinh của cellulose, tăng diện tích bề mặt sinh khối, loại bỏ hemicellulose, và phá vỡ lignin. Tiền xử lý làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với các enzyme để chuyển đổi polyme carbohydrate thành đường lên men có thể đạt được nhanh hơn và với sản lượng lớn hơn. Tiền xử lý bao gồm các phương pháp hóa học, vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng. Tiền xử lý đã được xem là một trong những bước quan trọng xử lý các bước trong việc chuyển đổi đường cellulose để lên men. Tiền xử lý vật lý Tiền xử lý vật lý sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và kích thước của lỗ chân long, giảm tinh thể và mức độ trùng hợp của cellulose. Thường được sử dụng vật lý trị liệu để làm suy giảm dư lượng lignocellulosic bao gồm hấp, mài và xay xát, chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất. - Nghiền và xay: Thông thường nghiền và xay là những bước đầu tiên của tiền xử lý của bất kỳ sinh khối nào làm giảm kích thước hạt, mặc dù sự kết hợp của phương pháp mài với phương pháp tiền xử lý khác đã được thử. Ở một mức độ nào đó nó làm giảm sự kết tinh của sinh khối. Để nghiền rơm rạ ướt dùng đĩa phay tốt hơn so với bóng phay cả về 21
Đồ án tốt nghiệp thu hồi glucose cũng như tiết kiệm năng lượng (Hideno et al, 2009). Phát triển trong lĩnh vực này cung cấp một số thiết bị tiền xử lý cho phép đường hóa enzyme, ví dụ như bóng phay, phay lăn, phay đĩa ướt, và chúng đã được sử dụng dựa trên sinh khối nguyên liệu. - Xử lý vi sóng: Chiếu xạ vi sóng đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực vì hiệu quả sưởi ấm cao và hoạt động dễ dàng. Chiếu xạ vi sóng có thể thay đổi cấu trúc siêu cellulose (Xiong et al, 2000) làm suy giảm lignin và hemicelluloses trong vật liệu lignocellulose, và làm tăng tính nhạy cảm enzyme trong vật liệu lignocellulose (Azuma et al, 1984). Chế phẩm enzim dùng thủy phân rơm rạ có thể được tăng cường bởi tiền xử lý lò vi sóng khi có mặt của nước (Azuma et al, 1984;. Ooshima et al, 1984) hoặc trong môi trường glycerine với số lượng ít hơn nước (Kitchaiya et al, 2003.). Tiền xử lý hóa học Enzyme có thể không có hiệu quả chuyển đổi lignocelluloses các loại đường lên men mà không có tiền xử lý hóa học. Các hóa chất quan trọng nhất cho tiền xử lý rơm rạ bao gồm kiềm và ammoniac. - Tiền xử lý kiềm: Tiền xử lý kiềm liên quan đến việc ứng dụng các giải pháp kiềm như NaOH hoặc KOH để loại bỏ lignin và một phần của hemicelluloses, và hiệu quả làm tăng khả năng tiếp cận các men tiêu hóa cellulose. Tiền xử lý kiềm có thể gây ra một sự gia tăng mạnh về sản lượng đường hóa. Tiền xử lý có thể được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nhưng với một thời gian tương đối dài và nồng độ cao của các bước cơ sở. So với axit hoặc các chất phản ứng oxy hóa, xử lý bằng kiềm dường như là phương pháp hiệu quả nhất trong việc phá vỡ liên kết este giữa lignin, hemicellulose và cellulose, và tránh sự phân mảnh của hemicellulose polyme (Gaspar et al, 2007) do đó tạo điều kiện thuận lợi cho thủy phân enzym. - Tiền xử lý Ammoniac: 22
Đồ án tốt nghiệp Là một tiền xử lý thuốc thử ammonia có số lượng đặc tính mong muốn.Nó là một thuốc thử hiệu quả đối với nguyên liệu lignocellulose. Nó có tính chọn lọc cao cho các phản ứng với lignin hơn so với carbohydrate. Biến động cao của nó làm cho nó dễ dàng để phục hồi và tái sử dụng. Đây là một hóa chất không gây ô nhiễm môi trường và không ăn mòn. Một trong các phản ứng được biết đến dung dịch nước amoniac với lignin là phân cắt liên kết của C-O- lignin cũng như liên kết ether và ester trong lignin carbohydrate phức tạp (Kim và Lee, 2007). Một dòng chảy thông qua quá trình gọi là Amoniac Recycle thấm (ARP) được phát triển để xử lý trước. Trong quá trình này, ammonia được bơm qua một lớp sinh khối duy trì ở 1700C. Bởi quá trình này có thể đạt được lên đến gần như 85% năng suất lý thuyết của glucose trong quá trình thủy phân enzyme (Drapcho et al, 2008). - Tiền xử lý Acid: Tiền xử lí với tác nhân oxy hóa liên quan đến việc bổ sung thêm một hợp chất oxy hóa. Tiền xử lý này loại bỏ hemicellulose và lignin tăng khả năng tiếp cận của cellulose. Trong quá trình tiền xử lý oxy hóa nhiều phản ứng có thể xảy ra, như thay thế electrophilic, chuyển của chuỗi bên, sự phân tách của ether aryl alkyl liên kết hoặc chia tách oxy hóa của hạt nhân thơm (Hon và Shiraishi, 2001). Báo cáo có sử dụng mỗi axit axetic cho các tiền xử lý rơm (Taniguchi et al, 1982; Toyama và Ogawa, 1975). Biến đổi về lượng trong thành phần của xử lý rơm, tinh thể của rơm xử lý và cellulose chiết xuất, và sự nhạy cảm của rơm khi xử lý bằng acid acetic cho kết quả mỗi phương pháp xử lý bằng acid acetic gây ra sự cố ít hoặc không có tinh thể cấu trúc của cellulose . Mức độ enzyme hòa tan tương đối còn lại là 42% sau khi xử lý với axit axetic 20%. - Tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ: Tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ tăng cường khả năng tiêu hoá enzyme chủ yếu là để loại bỏ lignin và hemicellulose thu được phần còn lại giàu cellulose, có thể được thủy phân bằng enzym ở mức cao và gần như đạt sản lượng glucose theo lý thuyết. Hemicellulose và lignin có thể được thu hồi đồng thời để sản xuất sản phẩm có giá trị cao. Sự thay đổi của tinh thể cellulose trong dung môi hữu cơ tiền xử lý rõ ràng 23
Đồ án tốt nghiệp không được nêu ra, nhưng nó có được nhắc đến rằng cellulose trong dung môi hữu cơ phụ thuộc nhiều vào các loại dung môi hữu cơ, nồng độ dung môi và nhiệt độ (Mantanis et al, 1994, 1995). Lần đầu tiên nó được dùng trong làm giấy, nhưng gần đây nó cũng đã được xem xét tiền xử lý lignocellulose nguyên liệu cho sản xuất ethanol. Có một số nhược điểm cố hữu để tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ. Hiện nay tiền xử lý bằng dung môi hữu cơ là đắt tiền hơn so với các quá trình tiền xử lý khác nhưng ứng dụng tách và tái chế dung môi có thể làm giảm chi phí hoạt động của quá trình. Nó cũng đòi hỏi các điều kiện nghiêm ngặt kiểm soát do sự biến động của dung môi hữu cơ. Loại bỏ dung môi từ xử lý trước cellulose thường là cần thiết vì các dung môi có thể ức chế enzyme thủy phân và lên men hoặc tiêu hóa thủy phân (Xuebing et al., 2009). Dung môi hữu cơ thường được sử dụng cho tiền xử lý là dung môi có điểm sôi thấp như ethanol, methanol và cồn với điểm sôi cao như ethylene glycol, glycerol, tetrahydrofurfuryl rượu và các hợp chất chất hữu cơ như dimethylsulfoxide, ete, xeton, và phenol (Thring et al, 1990.). Tiền xử lý sinh học Tiền xử lý sinh học cung cấp một số khái niệm quan trọng lợi thế như hóa chất thấp và sử dụng năng lượng, nhưng không tìm thấy được hệ thống điều khiển đầy đủ và nhanh chóng. Hóa chất tiền xử lý có những nhược điểm nghiêm trọng trong yêu cầu sử dụng cho các thiết bị chuyên ngành chống ăn mòn, mở rộng giặt, và xử lý thích hợp chất thải hóa học. Tiền xử lý sinh học là một phương pháp an toàn và thân thiện với môi trường do lignin loại bỏ từ lignocellulose. Các vi sinh vật đầy hứa hẹn nhất trong tiền xử lý sinh học là nấm trắng thối thuộc về lớp Basidiomycetes (Taniguchi et al, 2005). . Patel et al. (2007) đã làm một nghiên cứu sơ bộ về tiền xử lý vi sinh vật và lên men các chất thải nông nghiệp như rơm. Một sự kết hợp của năm loại nấm khác nhau: Aspergillus niger, Asp.awamori, Trichoderma reesei, Phenerochaete chrysosporium, Pleurotus sajor-caju, thu được từ sàng lọc được sử dụng cho tiền xử lý và Saccharomyces cereviseae (NCIM 3095) đã được sử dụng để thực hiện quá trình lên men. Tiền xử lý với A. niger và A. Asp.awamori và lên men sau đó mang lại sản lượng ethanol cao nhất (2,2 g L-1). 24
Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.4. Quá trình thủy phân Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đường đơn (hexoses và pentoses). Ở đây, quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose. Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với acid. Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furfuran và các hợp chất vô cơ. Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng cellulase. Vì cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose. Nguồn thu cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật (nấm, vi khuẩn). Nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất của lignocellulose, đường monomeric và những sản phẩm khác, ví dụ như kích thước hạt, nồng độ acid, nhiệt độ và thời gian phản ứng, cũng như độ dài của các đại phân tử, mức độ trùng hợp của cellulose, cấu hình của chuỗi cellulose, sự kết hợp của cellulose với các cấu trúc khác bảo vệ polyme trong thành tế bào thực vật như lignin, pectin, hemicellulose, protein, và các yếu tố khoáng chất. Hiệu suất thuỷ phân của nhiên liệu sinh học lignocellulosic gia tăng khi có sự kết hợp của các enzyme như cellulase, xylanases và pectinaza nhiều hơn là chỉ dùng cellulase (Zhong et al, 2009) nhưng chi phí của quá trình tăng mạnh mặc dù có những quan điểm sinh học rất hấp dẫn. Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T. emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào. Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50 oC và pH ~ 5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme. 25
Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.5. Quá trình lên men Hiện nay có 1 số phương pháp lên men được chú trọng như sau: • SHF (Separate hydrolysis and fermention): đây là phương pháp lên men truyền thống, thủy phân và lên men riêng biệt. • SSF (Simulneous saccharification and fermention): đây là phương pháp cải tiến thủy phân và lên men đồng thời. • SSCF (Simultaneous saccharification and fermentation): đồng đường hóa và đồng lên men, đây là phương pháp đang được nghiên cứu nhiều. Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành ethanol. Trong số các sản phẩm của quá trình thủy phân, glucose là phong phú nhất, theo sau là đường xylose hoặc mannose và một ít các đường khác. S. cerevisiae có ưu điểm như phổ biến, tỷ lệ lên men cao và lượng ethanol tạo thành cao. Vì vậy, S. cerevisiae là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho quá trình lên men sinh khối lignocellulose thành ethanol. Tuy nhiên, S. cerevisiae không có khả năng lên men xylose thành ethanol được. Để quá trình biến đổi sinh khối lignocellulose có khả thi về kinh tế, nó cần thiết lựa chọn những sinh vật có khả năng lên men cả glucose và xylose. Ngoài xylose, S. cerevisiae không có khả năng lên men arabinose, trừ khi cải tiến chúng. Do đó, S. cerevisiae tái tổ hợp chứa gen có khả năng lên men xylose đã được thiết kế với gen chuyển hóa arabinose từ những vi sinh vật khác. S.cerevisiae tái tổ hợp gần đây nhất (TMB 3400) đã cho thấy lên men thành công cả ba loại đường glucose, xylose và arabinose. Trong quá trình lên men sinh khối lignocellulose, hoạt tính của S. cerevisiae giảm xuống nếu có sự hiện diện của các hợp chất ức chế bao gồm các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất fufural, phenol và các hợp chất vô cơ. Các hợp chất này được sinh ra trong quá trình tiền xử lý và cũng có thể từ quá trình thủy phân lignocellulose. Vì vậy, cần phải loại bỏ các hợp chất ức chế có trong môi trường trước khi tiến hành lên men, mà điều đó sẽ làm tăng chi phí của quá trình công nghệ cũng 26
Đồ án tốt nghiệp đồng thời làm mất mát lượng đường cần thiết cho quá trình lên men. Điều thú vị, S. cerevisiae là một trong những vi sinh vật ít nhạy cảm với các chất ức chế của quá trình thủy phân lignocellulose. Hai bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol (thủy phân và lên men) có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF). Trong phương pháp thủy phân và lên men độc lập (SHF), các sản phẩm thủy phân sẽ được lên men để sản xuất ethanol trong một quá trình riêng. Ưu điểm của phương pháp này là cả hai quá trình có thể được tối ưu hóa riêng, không phụ thuộc vào nhau (ví dụ như nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân là 45-50 oC, trong khi đó quá trình lên men là 30 oC). Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose. Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém (phải bổ sung thêm một lượng lớn enzyme). Trong phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF), thì các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành ethanol ngay nhờ vi sinh vật. Do đó, việc bổ sung một lượng lớn enzyme là không cần thiết và điều này sẽ làm giảm chi phí sản xuất ethanol. Nhưng, nhược điểm của SSF là cần phải chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gần với điều kiện tối ưu của mỗi quá trình riêng. SSF là được ưa chuộng hơn vì chi phí thấp (Wyman, 1994) và năng suất ethanol cao hơn so với SHF bằng cách giảm thiểu sự ức chế sản phẩm. Một trong những hạn chế của quá trình này là sự khác biệt về nhiệt độ tối ưu của các enzym thủy phân và vi sinh vật lên men. Hầu hết các kết quả báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho thủy phân enzym ở 40-50 0C, nhưng các vi sinh vật có năng suất và sản lượng ethanol tốt thường không chịu đựng được nhiệt độ cao này. Vấn đề này có thể tránh được bằng cách áp dụng các vi sinh vật chịu nhiệt như Saccharomyces cerevisiae (Golias et al, 2002;. Spindler et al, 1988). Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: a) Nhiệt độ. Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ để phát triển tối ưu. Đối với nấm men, nhiệt độ tối ưu ở khoảng 28-32oC, ở nhiệt độ cao hơn, hoạt tính của chúng giảm nhanh. Mặt 27
Đồ án tốt nghiệp khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tao nhiều các sản phẩm phụ không cần như ester, aldehyde gây tổn thất lượng ethanol tạo thành. b) pH. Nồng độ ion H+ trong môi trường lên men ảnh hưởng mạnh đến hoạt động của nấm men, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấm chất dinh dưỡng trong quá trình lên men. Mỗi vi sinh vât chỉ có thể hoạt động tốt ở một trạng thái, trạng thái này phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường. c) Thời gian. Thời gian là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của như khối lượng sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ, chủng nấm men, Thời gian lên men bắt đầu từ lúc cấy nấm men vào môi trường lên men và thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và mục đích lên men mà ta tiến hành. d) Nồng độ CO2 trong môi trường. CO2 hình thành trong quá trình lên men từ đường. Một phần tồn tại trong môi trường, một phần tách lên bề mặt môi truồng và phần còn lại tao thành một lớp ngăn giữa không khí và môi trường. Lượng CO2 tích tụ trong môi trường sẽ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men nhưng không làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi. Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài , dẫn đến ức chế quá trình lên men. e) Hàm lượng giống nấm men. Nấm men là nhân tố tối quan trọng trong quá trình lên men, chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO2. Mỗi loại nấm men có khả năng lên men khác nhau, ở những điều kiện khác nhau thì khả năng lên men và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. 28
Đồ án tốt nghiệp 1.1.7.5. So sánh ưu điểm và nhược điểm của phương pháp SSF và SHF - SHF ( Separate hydrolysis and fermention) Ưu điểm: - Vì 2 quá trình thủy phân và lên men là riêng biệt nên dễ kiểm soát. Nhược điểm: - Tốn thời gian hơn so với SSF. - Tạo nhiều sản phẩm phụ sau thủy phân. - SSF (Simulneous saccharification and fermention) Ưu điểm: - Hạn chế tạo các sản phẩm phụ - Chi phí thực hiện thấp hơn - Năng suất cao hơn Nhược điểm: -Nhiệt độ để quá trình thủy phân đạt tối ưu (45-50cC) không thích hợp với nhiệt độ của các loài nấm men (35-40oC). Để khắc phục vấn đề này cần nghiên cứu tìm ra các giống vi sinh vật chịu nhiệt tốt hơn. 1.1.7.6. Quá trình chưng cất và tinh chế Chưng cất là phương pháp tách ethanol ra khỏi hỗn hợp cấu tử trong dịch sau lên men. Do ethanol tạo hỗn hợp đẳng phí với nước nên sản phẩm thu được hỗn hợp gồm cồn và nước. Để thu cồn tuyệt đối người có thể dùng các phương pháp sau: • Chưng trích ly • Chưng phân tử. • Hấp phụ rây phân tử • Dùng Na2SO4, CaSO4, CaCO3, CuSO4 khan để hấp phụ nước. 29
Đồ án tốt nghiệp • Thẩm thấu qua màng lọc. • Bốc hơi thẩm thấu và rây phân tử • Chưng cất và thẩm thấu qua màng 1.2. Nguyên liệu 1.2.1 Giới thiêu về chuối Musa Paradisiaca Tên khoa học: Musa Paradisiaca Giới: Plane Ngành: Magnoliophy Phân lớp: Zingiberiadae Bộ: Zingiberales Họ: Musaceae Chi: Musa Hình 1.3. Chuối sứ Musa Parradisiaca Chuối thuộc họ Musaceae. Chuối là loại trái cây quen thuộc và gắn bó với người Việt Nam, là loại cây ăn quả chứa nhiều giá trị dinh dưỡng và chữa bệnh thiết thực. Theo phân tích của khoa học thì ruột chuối chứa nhiều tinh bột, chất đạm, chất 30
Đồ án tốt nghiệp xơ, vimin và khoáng chất đặc biệt là kali. Vỏ chuối chiếm khoảng 30% khối lượng chứa đường, tinh bột, cellulose, pectin, Chuối có nhiều loại: chuối già, chuối xiêm, chuối sứ, chuối cơm, chuối sáp, chuối mật, chuối tiêu . Nếu đặt tên khoa học thì có đến hàng trăm giống chuối. hầu hết chuối ăn quả đều thuộc loài musa paradisiaca L với 11 loại khác nhau bởi hình dạng, màu sắc và vị của thịt quả. 1.2.2. Diện tích và sản lượng chuối ở Việt Nam Chuối sứ được trồng phổ biến ở nhiều nơi, chuối sứ không kén đất, chịu được hạn, úng, đất xấu và chịu rét khá hơn chuối tiêu. Do đó chuối sứ thường được trồng ở các vùng trung du, miền núi, cây mọc khỏe, cao to, lá dài rộng, cuống lá có phấn trắng. trái to, ngắn, mập, vỏ mỏng, khi chín có màu vàng tươi, vị ngọt, kém thơm. Một buồng nặng khoảng 15-20 kg. Khả năng vận chuyển bảo quản kém. Ở nước chuối là loại cây lương thực có diện tích và sản lượng cao. Tuy nhiên diện tích trồng chuối lại không tập trung. Do đặc điểm là loại cây ngắn ngày, nhiều công dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trong các vườn cây ăn trái và hộ gia đình. Một số tỉnh miền trung và miền nam có diện tích trồng chuối khá lớn (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau có diện tích từ 3000 ha đến gần 8000 ha) trong khi đó các tỉnh miền bắc có diện tích trồng chuối lớn nhất như: Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ chưa đạt đến 3000 ha. Bảng 2.3. Diện tích trồng chuối theo các vùng (đơn vị: ha)[4] Năm Năm Năm Năm Vùng Năm 2005 2004 2005 2007 2008 Đồng bằng sông 17900 18100 17456 17407 16400 Hồng Đông Bắc bộ 8900 6300 9021 8849 8700 Tây Bắc bộ 2300 2200 2376 2668 2600 31
Đồ án tốt nghiệp Bắc Trung bộ 15400 15500 15876 16029 16400 Duyên hải Nam 10200 10500 10642 10713 11400 Trung bộ Tây Nguyên 2900 3400 3492 3630 3700 Đông Nam bộ 12100 12300 12689 12653 12800 Đồng bằng sông 31600 27700 27706 30142 31303 Cửu Long (nguồn: luận văn nghiên cứu sản xuất nectar chuối) Bảng 2.4. Sản lượng trồng chuối theo vùng (Đơn vị: tấn)[4] Vùng Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010 Năm 2011 Đồng bằng sông 359500 342700 426161 352181 403500 Hồng Đông Bắc bộ 95900 65200 100575 98517 96600 Tây Bắc bộ 19300 25400 27285 30691 30600 Bắc Trung bộ 80800 98300 102966 205666 110800 Duyên hải Nam 66000 103500 99636 99504 111800 Trung bộ Tây Nguyên 33900 41400 44262 53027 58300 Đông Nam bộ 114800 146400 150717 165596 175800 Đồng bằng sông 310200 274800 330203 351629 366900 Cửu Long 32
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3 Tình hình sản xuất chuối trên thế giới Theo số liệu của FAO hàng năm toàn thế giới sản xuất trên 88 triệutấn chuối. Chuối được trồng chủ yếu ở các nước đang phát triển trên thế giới. Khoảng 98% sản lượng chuối được trồng ở các nước đang phát triển và xuất khẩu tới các nước đang phát triển. Năm 2004 tổng cộng có 130 nước xuất khẩu chuối. mười nước sản xuất chính chiếm đến 75% sản lượng thế giới. Trong đó Ấn Độ, Ecuador, Brazil và Trung Quốc chiếm 1 nửa của toàn thế giới. Vỏ chuối chiếm 20-30% khối lượng trái nên ở Việt Nam trung bình mỗi năm có tới ~ 350.000 tấn vỏ phế phẩm. Trên thế giới lượng vỏ chuối thải ra hàng năm ~ 24 triệu tấn. Để giải quyết vấn đề môi trường các nước phải cấp chi phí cho việc xử lí rác thải. Tuy nhiên, nếu lượng rác thải được tận dụng vào mục đích hợp lí khác thì vừa giữ vệ sinh môi trường, vừa đỡ tốn kém, vừa tạo thêm sản phẩm có thêm thu nhập. Và hiện nay xu hướng cho vấn đề này chính là lên men sản xuất ethanol sinh học. Bảng 2.5. Thành phần hóa học của chuối[6] Chỉ tiêu Vỏ chuối Đường 1,61-1,97% Chất béo (%) - Protein (%) 1,40-1,45 Pectin (%) - Lignin (%) - Cellulose (%) 4,5-4,6 Hemicellulose (%) - 1.3. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất ethanol Năm 1883, Hansen viết về đề tài lựa chọn chủng nấm men. Ông mô tả các tế bào nấm men đơn lẻ có thể phân tách thành từng khuẩn lạc riêng rẽ bằng cách pha loãng và nuôi cấy trên đĩa thạch, các tế bào nấm men được nuôi cấy thuần khiết này được nhân lên ở quy mô lớn nhờ kỹ thuật vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy nấm men thuần khiết của Hansen giúp ta chọn tạo, phân lặp được dòng nấm men đáp ứng yêu cầu sản xuất ethanol công nghiệp: 33
Đồ án tốt nghiệp 1. Tốc độ lên men nhanh 2. Sử dụng nguồn đường có hiệu quả, tạo độ cồn cao. 3. Có khả năng chịu được cồn ở nồng độ cao. 4. Khả năng chịu nhiệt, tính chịu acid, làm việc ở pH thấp. 5. Lên men tốt nhiều loại đường khác nhau như đường xylose. 6. Sử dụng tốt nguồn nitơ hữu cơ. 7. Đặc tính duy truyền ổn định cao. 34
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: 15/02/2014 – 28/06/2014. Địa điểm: PTN Nhiên liệu sinh học & sinh hoá - trường ĐH Bách Khoa TPHCM. 2.2 Đối tượng nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu trên đối tượng là vỏ chuối khô. 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Nguyên liệu Enzyme: cellulose Viscozyme của hang Brenntag. Giống vi sinh vật : Saccharomyces cerevisae. Các hóa chất có nguồn gốc Trung Quốc. Môi trường nuôi cấy nấm men : SDA và SDB. 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: - Autoclave - Máy ly tâm - Máy xay - Tủ hấp - Máy khuấy từ - Cồn kế - Tủ lạnh - Tủ sấy - Brix kế - Máy quang phổ - Nồi đun - pH kế - Cân - Tủ ủ Dụng cụ: - Ống nghiệm - Đĩa petri - pipet, micropipette - Cuvet - Becher - Eppendorf - Ống đong - Bình định mức - Que cấy 2.4.Tiến hành thí nghiệm Đề tài này tập trung khảo sát quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao. Quá trình khảo sát được thực hiện song song 2 phương pháp: lên men đồng thời (SSF) và lên men truyền thống (SHF) để so sánh từ đó chọn ra phương pháp tối ưu nhất. 35
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1Lên men riêng (SHF): Vỏ chuối Tiền xử lý H2SO4 - Enzyme Thủy phân - H2SO4, nhiệt độ Lên men Nấm men Hình 2.1. Quy trình SHF Quy trình lên men gồm có 3 giai đoạn chính: • Tiền xử lý nguyên liệu: Lớp vỏ cứng của cacao có chứa hầu hết các loại glucide, trong đó tỉ lệ cellulose và đường chiếm khá cao. Do đặc điểm cấu tạo của vỏ quả cacao có chứa các lignocellulose, trong đó có các phân tử lignin là vỏ bao bọc bên ngoài các mạch cellulose, hemicellulose nên việc xâm nhập của enzyme vào bên trong mạch phân tử rất khó khăn. Trong thành phần của vỏ quả có mặt của các phân tử lignin, là polymer vô định hình trong phân tử có các nhóm – OH, – OCH3, là các cầu nối chính để liên kết các mạch cellulose lại với nhau nên làm cho vỏ quả trở nên dai và cứng. Do đó, để thực hiện quá trình thủy phân có hiệu quả cần phải loại bỏ các liên kết giữa lignin và cellulose, giúp cho các tác nhân thủy phân như acid dễ dàng tác động vào mạch cellulose và bẻ gãy liên kết giữa các monomer thành các phân tử đường. Để loại bỏ liên kết có thể sử dụng các phương pháp: nhiệt độ cao, acid, nổ hơi nước, sinh học, điện trường. Vỏ cacao được thu gom về sẽ được cắt nhỏ khoảng 3 – 4 cm để thuận tiện trong quá trình sấy khô nguyên liệu.Vỏ cacao được sấy khô sẽ được xay nhuyễn thành bột 36
Đồ án tốt nghiệp mịn nhằm tăng diện tích tiếp xúc với tác nhân thủy phân giúp quá trình thủy phân diễn ra nhanh và đạt hiệu quả cao nhất. Quá trình tiền xử lý phải đáp ứng những yêu cầu: - Nâng cao được hiệu quả của quá trình thủy phân tiếp theo. - Hạn chế sự mất mát Hydrocarbon. - Tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ làm ức chế quá trình thủy phân và quá trình lên men tiếp theo. - Tiết kiệm được chi phí. • Thủy phân nguyên liệu: Cellulose có trong nguyên liệu vỏ cacao là hợp chất cao phân tử gồm rất nhiều mắt xích β - D - glucose ghép lại và rất bền vững.Vì thế phải dùng các tác nhân thủy phân để phân cắt cellulose thành các mạch đường ngắn như oligosaccharide, cellobiose và cuối cùng là glucose để nấm men dễ dàng sử dụng và chuyển hóa đường thành ethanol.Có nhiều phương pháp thủy phân nhưng thường được sử dụng là dùng acid H2SO4 hoặc thủy phân bằng enzyme. Hiện nay phương pháp dùng enzyme được sử dụng nhiều nhất vì đạt hiệu quả cao, ít độc hại và an toàn hơn. Đề tài tiến hành khảo sát phương pháp thủy phân bằng cellulase 1%, 3 %, 5 % ở 50oC, pH = 5 trong 1, 2, 3 ngày. Đồng thời tiến hành khảo sát quá trình thủy phân bằng H2SO4 để tìm ra điều kiện thuỷ phân tối ưu nhất cho quá trình lên men. Nguyên liệu sau khi thủy phân được đem hấp khử trùng (1atm, 10 phút, 121 oC) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng được bổ sung nấm men có mật độ 108 CFU/ml tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng.Sau lên men thu dịch cồn. • Lên men: Nguyên liệu sau khi thủy phân được đem hấp khử trùng (1atm, 10 phút, 121 oC) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng được bổ sung nấm men có mật độ 109 CFU/ml tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng.Sau lên men thu dịch cồn. 37
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2. Lên men đồng thời Vỏ chuối Tiền xử lý H SO 2 4 Nấm men Thủy phân & lên enzyme men đồng thời Hình 2.2. Quy trình SSF Nguyên liệu sau khi tiền xử lí sẽ được trung hoà pH, mang hấp khử trùng (1210C, 1 atm, 20 phút) để tiêu diệt vi sinh vật tránh gây nhiễm trong quá trình lên men. Cuối cùng được bổ sung enzyme và nấm men tiến hành thủy phân và lên men đồng thời. Sau lên men thu dịch cồn. Nấm men sử dụng trong thủy phân và lên men đồng thời là nấm men chịu 0 nhiệt (Top~38 C) để thích hợp với nhiệt độ tối thích của enzyme thủy phân. 2.5 Bố trí thí nghiệm 2.5.1 Thí nghiệm 1 : tiền xử lý Tiền xử lý bằng hóa chất là Acid H2SO4 2% trong thời gian 2 ngày. Tỉ lệ nguyên liệu : Acid là 1:10. 2.5.2 Thí nghiệm 2 : thủy phân nguyên liệu Thủy phân bằng là H2SO4 2% trong các khoảng thời gian Thời 15 30 60 120 gian(phút) Glucose Cellulose 38
Đồ án tốt nghiệp Thủy phân bằng enzyme cellulose trong các khoảng thời gian và nồng độ khác nhau Lượng đường (mg/ml) Nồng độ cellulase Thời gian (ngày) 1% 1 3% 2 5% 3 7% Tiến hành so sánh giữa các nghiệm thức nhằm tìm ra phương pháp thủy phân tối ưu về thời gian, enzyme. 2.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát thời gian lên men Khảo sát thời gian lên men thích hợp, tiến hành trong 48 giờ, mỗi nghiệm thức cách nhau 2 giờ. Chọn nhiệt độ lên men là 37oC, pH~5. Xác định các chỉ tiêu: độ cồn(%), độ Brix(%), đường khử(mg/ml). 2.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát nhiệt độ lên men: -Khảo sát nhiệt độ lên men ở các nhiệt độ 35oC, 37oC và 39oC: . Thời gian tối ưu đã khảo sát ở thí nghiệm 3. . pH trong khoảng gần 5 . Dịch nấm men 5% (4.108tb/mL) - Thành lập nghiệm thức : Nghiệm thức Nhiệt độ (0C) 1 35 2 37 3 40 2.5.5. Thí nghiệm 5: khảo sát pH của quá trình lên men: - Khảo sát pH ở các mốc 4,5 – 5 – 5,5. . Thời gian tối ưu đã khảo sát. . Dịch nấm men 5% (4.108tb/mL). . Nhiệt độ len men đã khảo sát. 39
Đồ án tốt nghiệp - Thành lập nghiệm thức : Nghiệm thức pH 1 4 2 5 3 6 2.5.6. Thí nghiệm 6: khảo sát hàm lượng dịch nấm men: - Khảo sát hàm lượng dịch nấm men ở các nồng độ 2,5%; 5%; 7,5% .Thời gian tối ưu đã khảo sát. . pH tối ưu đã khảo sát. . Nhiệt độ tối ưu đã khảo sát. - Thành lập các nghiệm thức Nghiệm thức Tỉ lệ giống (%) 1 2,5 2 5 3 7,5 - Tiến hành : ở mỗi bình lên men mang đi ly tâm 4000 vòng/phút trong thời gian 5 phút . Thu dịch sau đó tiến hành pha loãng . Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để xác định số tế bào khuẩn lạc còn lại sau quá trình lên men. 2.6. Các phương pháp phân tích 2.6.1. Phương pháp hóa lý 2.6.1.1Phương pháp xác định độ ẩm Nguyên tắc: dùng nhiệt nóng của tủ sấy làm bay hết nước trong mẫu. Tiến hành: - Cân m1(g) mẫu. - Cho mãu vào cốc, cân khối lượng cốc chứa mẫu (m2) o - Sấy khô cốc ở 150 C đến khối lượng không đổi. - Cân chính xác khối lượng cốc sau khi sấy (m3) 40
Đồ án tốt nghiệp Cách tính hàm lượng ẩm : W = (m3 –m2)/m1.100% 2.6.1.2. Phương pháp xác định đường khử bằng phương pháp DNS: Nguyên tắc : dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử tạo màu đỏ cam khi đun nóng với hỗn hợp phản ứng. Cường độ màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử được đo bằng máy đo quang phổ với bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử, sẽ tính được hàm lượng đường trong mẫu. Tiến hành : - Hút 1ml dịch mẫu và 1ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không. - Thêm 3ml thuốc thử DNS. - Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 15 phút. - Làm nguội nhanh, đo ở bước song 540nm. - Dựa vào đường chuẩn để tính ra nồng độ đường trong mẫu. 2.6.1.3. Phương pháp xác định lượng cellulose bằng thuốc thử Anthrone: Nguyên tắc: dựa trên phản ứng tạo màu giữa Anthrone với cellulose có trong dịch mẫu tạo màu xanh lá đến xanh đen phụ thuộc vào nồng độ cellulose trong mẫu. Tiến hành: - Hút 0,5 ml dịch mẫu và 0,5 ml nước cất vào ống nghiệm để làm mẫu không. - Thêm 5ml dd Anthrone vào ống nghiệm. - Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 5 phút. - làm nguội, đo ở bước sóng 630nm. - Dựa vào đường chuẩn để tính được nồng độ cellulose có trong mẫu. 2.6.1.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme: Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme: Ống 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 glucose(mg/ml) Ml dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 41
Đồ án tốt nghiệp (1mg/ml) Ml dd CMC1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS- 2 2 2 2 2 2 2 lactose Ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều, đun sôi cách thủy 15’. Làm nguội. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethuy cellulose (CMCase): - Ống nghiệm 1: Hút 1ml dd đệm Na-acetac 50Mm, pH5 cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dd DNS-lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1ml dd CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Đun sôi cách thủy 15’, để nguội. Đặt độ hấp thụ ở bước song 540nm là 0. - Ống nghiệm 2: phản ứng enzyme Hút 1ml dd enzyme cho vào ống nghiệm để ở 40oC/5’. Đồng thời để chai chứa dd CMC 1% vào tủ 40cC/5’. Thêm 1ml dd CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng 40oC trong 10’ Thêm 2ml dd DNS-lactose,lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đun sôi cách thủy 15’, để nguội rồi đo. - Ống nghiệm 3 : không có phản ứng enzyme Hút 1ml dd enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5-10’ để bất hoạt enzyme Thêm 2ml dd DNS-lactose và lắc đều Thêm 1ml dd CMC 1% chứa dd enzyme và lắc đều. Đun sôi cách thủy 15’, để nguội rồi đo OD. Định lượng đơn vị hoạt tính: 1 đơn vị CMCase là lượng enzyme sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1umol/phút cơ chất dưới các điều kiện phản ứng. Tính kết quả - Giá trị hệ số glucose trung bình (F): 42
Đồ án tốt nghiệp F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 + + 0,6/AG0,6)/6 - Hoạt tính enzyme: CMCase (IU/g) = (AT – AB) x F x(1000/180) x (1/10 phút) x (1/1ml) x (1/C) Trong đó: F : Hệ số glucose (mg/ml). AG: Độ hấp thu OD của dd glucose chuẩn. AR: Độ hấp thu của dd có phản ứng enzyme ( ống TN). AB: Độ hấp thu của dd không có phản ứng enzyme ( ống ĐC). 1000: chuyển mg thành µg. 180; trọng lượng phân tử glucose, đổi từ µg sang µmol. 10 phút: thời gian phản ứng. 1: Thể tích enzyme (ml) C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml). 2.6.1.5. Xác định pH, độ rượu và tổng số chất khô hòa tan: - Dùng pH kế xác định độ pH. - Dùng Brix kế xác định nồng độ chất rắn hòa tan. - Dùng cồn kế xác định độ cồn. 2.6.2. Phương pháp vi sinh 2.6.2.1. Phương pháp nuôi cấy nấm men: Chuẩn bị môi trường SDA có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường SDA có bổ sung thạch với hàm 43
Đồ án tốt nghiệp lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này. Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, đề tài tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn: • Giai đoạn 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, cấy sinh khối vào erlen chứa 20ml dịch môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28 – 30 oC) trong 24 giờ. • Giai đoạn 2: lấy 10 ml dịch môi trường SDA cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong erlen đã nuôi giống (giai đoạn 1) vào erlen và nuôi ở điều kiện 30 oC, 24 giờ. Giống nấm men sau khi nhân giống đạt đủ sinh khối sẽ được dùng trong lên men bioethanol. Trước khi giống này được sử dụng cho đợt lên men sau thì cần hoạt hóa trước 8 – 24 giờ trong môi trường mới để nấm men phát triển sinh khối và có hoạt lực trở lại. 2.6.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc: Nguyên tắc: xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch , xác định số tế bào sống để phục vụ cho quá trình lên men cũng nhu xác định số tế bào còn lại sau quá trình lên men. Tiến hành: - Pha loãng mẫu: chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml dd nước muối sinh lý và micropipette đã hấp khử trùng , tiến hành pha loãng mẫu ở các hệ số pha loãng như : 10-1, 10-2, 10-3,10-4, chọn 3 nồng độ pha loãng thích hợp. - Cấy mẫu: Dùng 0,1 micropipet hút 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa thạch, sử dụng que cấy trang để trang đều các tế bào lên bề mặt đĩa thạch. Tiến hành trên các độ pha loãng khác nhau sẽ cấy trang lên các đĩa thạch . - Đặt các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong thời gian 48 giờ. - Tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1ml dd mẫu. - Mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch mẫu theo số liệu đã tiến hành trên thí nghiệm pha loãng được tính theo công thức: 44
Đồ án tốt nghiệp A(cfu/ml) = B x C/V B: số khuẩn lạc trung bình mỗi đĩa ở 1 độ pha loãng. C: Độ pha loãng. V: dung tích huyền phù ở mỗi đĩa (0,1ml) 45
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát các phương pháp thủy phân Để thực hiện quá trình thủy phân có hiệu quả cần phải loại bỏ các liên kết giữa lignin và cellulose, giúp cho các tác nhân thủy phân như acid dễ dàng tác động vào mạch cellulose và bẻ gãy liên kết giữa các monomer thành các phân tử đường đơn. Vỏ chuối được thu gom về sẽ được cắt nhỏ khoảng 1 – 2 cm để thuận tiện trong quá trình sấy khô nguyên liệu.Vỏ cacao được sấy khô sẽ được xay nhuyễn thành bột mịn nhằm tăng diện tích tiếp xúc với tác nhân thủy phân giúp quá trình thủy phân diễn ra nhanh và đạt hiệu quả cao nhất. 3.1.1. Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân bằng H2SO4 2% Nguyên liệu sau khi tiền xử lý tiến hành thuỷ phân bằng H2SO42%, sau đó so sánh với thí nghiệm thuỷ phân bằng cellulase nhằm tìm ra phương pháp thuỷ phân tối ưu nhất. 50 45 39.98 39.54 38.88 40 36.1 35 30 25 Glucose mg/ml 20 Cellulose 15 9.23 10 8.65 7.58 7.76 5 0 15 30 60 120 Thời gian (phút) Hình 3.1. So sánh đường khử khi thủy phân bằng bằng H2SO4 2% Khi thủy phân bằng H2SO4, lượng glucose ở khoảng thời gian 30 phút là thấp nhất (7,8mg/ml) và cao nhất ở thời gian 120 phút ( 9mg/ml). Và ngược lại , hàm lượng cellulose sau khi thủy phân 15 phút bằng H2SO4 là cao nhất (40,03mg/ml) và sau khi thủy phân 120 phút cho kết quả thấp nhất. Đây là điều hiển nhiên bởi quá trình thủy phân sẽ cắt các mạch của cellulose để cuối cùng tạo thành glucose, vì vậy lượng cellulose sẽ giảm xuống và glucose tăng lên theo thời gian. Tuy nhiên, nếu xét trên 46
Đồ án tốt nghiệp tổng thời gian và nguyên liệu được thủy phân bằng H2SO4thì hiệu quả thủy phân chưa cao nên đề nghị tiếp tục thủy phân phân bằng H2SO4 thêm ở các khoảng thời gian 150 và 180 phút để khảo sát xem lượng đường khử sau thủy phân có tiếp tục tăng và có sự chênh lệch đáng kể không. 3.1.2. Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân bằng enzyme cellulase Cellulose có trong nguyên liệu vỏ chuối là hợp chất cao phân tử gồm rất nhiều mắt xích β - D - glucose ghép lại và rất bền vững. Vì thế phải dùng các tác nhân thủy phân để phân cắt cellulose thành các mạch đường ngắn như oligosaccharide, cellobiose và cuối cùng là glucose để nấm men dễ dàng sử dụng và chuyển hóa đường thành ethanol. 40 35 33.79 30.81 30.03 29.18 30 25 20 mg/ml Glucose 15 Cellulose 12.22 12.84 11.2 9.55 10 5 0 1% 3% 5% 7% Nồng độ enzyme (%) Hình 3.2.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 1 ngày 47
Đồ án tốt nghiệp 40 35 32.11 29.88 30 28.22 28.88 25 20 mg/ml Glucose 15 13.85 Cellulose 11.92 11.95 9.38 10 5 0 1% 3% 5% 7% Nồng độ enzyme (%) Hình 3.3.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 2 ngày 35 31.88 29.09 30 28.12 26.88 25 20 mg/ml Glucose 15 13.54 12.14 10.01 10.48 Cellulose 10 5 0 1% 3% 5% 7% Nồng độ eznyme (%) Hình 3.4.Hàm lượng glucose và cellulose thuỷ phân bằng cellulase 3 ngày Sau quá trình thủy phân bằng enzyme cellulose, lượng glucose thấp nhất là 8,7mg/ml sau thời gian 1 ngày với nồng độ enzyme là 1% .Và lượng glucose đạt giá trị cao nhất là 13,87 mg/ml ở khoảng thời gian 2 ngày với nồng độ enzyme là 7%. Ngược lại với nghiệm thức thủy phân 1 ngày , 1% enzyme thấy rằng lượng cellulose là cao nhất và thấp nhất ở mốc thời gian 3 ngày với nồng độ enzyme 5%.Tuy nhiên , nếu 48
Đồ án tốt nghiệp phân tích số liệu rõ sẽ thấy lượng đường khử sinh ra ở các nồng độ 5%,7% là ko có sự chênh lệch lớn (P-value <0,05) , cũng như thời gian thủy phân là 1,2,3 ngày. Vì vậy để tạo hiệu quả kinh tế và tiết kiệm thời gian thực hiện thì nên chọn nghiệm thức thủy phân bằng cellulose nồng độ 5% trong thời gian 1 ngày là hợp lý nhất. Kết quả: nếu so sánh giữa 2 phương pháp thủy phân , thấy rằng thủy phân bằng H2SO4 cho lượng đường khử thấp hơn nhiều so với thủy phân bằng enzyme. Lượng đường cao nhất khi thủy phân bằng H2SO4 là 7,23 ± 0,22 mg/ml , so với lượng đường cao nhất của quá trình thủy phân bằng enzyme cellulose 5% là 13,82 ± 2,98 mg/ml. Như vậy lượng đường sau khi thủy phân bằng cellulose hơn 3,2 lần so với thủy phân bằng H2SO4. 3.2. Kết quả khảo sát các phương pháp lên men: 3.2.1 Kết quả khảo sát thời gian lên men SHF: Thời gian lên men là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men bioethanol, Thời gian của quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường trong dịch lên men, tỉ lệ nấm men Nếu thời gian lên men quá ngắn, quá trình lên men chưa xảy ra hoàn toàn, đường sót sẽ còn nhiều trong dịch lên men và độ cồn tạo ra thấp, và nếu thời gian lên men quá dài , lượng ethanol sẽ bị oxy hóa thành acid acetic gây ức chế lại quá trình lên men.Vì vậy, việc xác định thời gian lên men có ý nghĩa quan trọng để mang lạu hiệu quả kinh tế. 49
Đồ án tốt nghiệp Độ cồn 6 5 4 % 3 Độ cồn 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Thời gian ( giờ) Hình 3.5.Sự thay đổi độ cồn theo thời gian lên men Trước khi lên men độ cồn trong dịch là 0% và tăng lên rất nhanh thành 3,2% chỉ sau 4 giờ lên men và vẫn tăng dần với tốc độ chậm lại. Sau 20 giờ kể từ thời điểm cho nấm men vào, độ cồn đạt ngưỡng cao nhất là 4,9%.Từ 20 giờ đến 28 giờ , độ cồn vẫn duy trì khá ổn định và bắt đầu có dấu hiệu xuống thấp.Kể từ 32 giờ trở đi, độ cồn trong dịch giảm dần theo thời gian và chỉ còn 3,1% ở thời điểm 48 giờ. 10 % 9 Độ Brix 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Thời gian (giờ) Hình 3.6. Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men 50
Đồ án tốt nghiệp Trước quá trình lên men ghi nhận độ Brix của dịch là 9% và trong 8 giờ đầu của quán trình lên men , độ Brix tăng dần và đạt cao nhất là 9,4% ở mốc 8 giờ. Và kể từ sau đó hàm lượng chất tan trong dịch bắt đầu giảm xuống dần theo thời gian lên men và giảm khá nhanh từ khoảng thời gian 8 giờ đến 20 giờ. Sau 20 giờ, độ Brix vẫn giảm nhưng với tốc độ chậm hơn và đạt mức thấp nhất là 6,2% ở 48 giờ. 35 30 25 20 Glucose mg/ml 15 Cellulose 10 5 0 2h 0h 4h 6h 8h 12h 30h 48h 10h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 26h 28h 32h 34h 36h 38h 40h 42h 44h 46h Thời gian (giờ) Hình 3.7. Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian lên men Kết quả: Trong 2 giờ đầu tiên độ cồn tăng nhanh từ 0 lên 3,3. Sau đó trở đi độ cồn tăng chậm dần và sau 20 giờ độ cồn đạt cao nhất (4,8%), sau đó độ cồn giảm xuống do lượng cồn cũng như lượng acid sinh ra đã bắt đầu ức chế khả năng lên men. Tổng số chất rắn hòa tan giảm dần theo thời gian lên men. Ở 8 giờ đầu, nấm men sử dụng đường và chất trong môi trường chưa nhiều nên độ Brix không có dấu hiệu giảm xuống. Kể từ sau 8 giờ, độ Brix bắt đầu giảm xuống khá nhanh do nấm men đã bắt đầu hoạt động mạnh. Sau 40 giờ , độ Brix giảm ít và gần như ko giảm về sau do nấm men đã suy yếu và quá trình lên men bị ức chế. Trong quá trình lên men, lượng đường khử tất nhiên sẽ giảm dần theo thời gian. Ở 8 giờ đầu tiên lượng đường khử giảm khá nhanh sau đó giảm chậm dần cho đến thời 51
Đồ án tốt nghiệp điểm đạt độ cồn cao nhất là 20 giờ do nấm men bị lượng ethanol và acid sinh ra gây ức chế quá trình lên men. Đường lúc này được nấm men sử dụng để duy trì sự sống là chủ yếu. Sau 34 giờ lượng đường không thay đổi nhiều do sinh khối nấm men đã giảm . Trong khoảng 20 giờ đầu của quá trình lên men , mật độ tế bào nấm men tăng mạnh trong dịch lên men và đạt số lượng cao nhất là 141 triệu tế bào/ml. Ở giai đoạn này nấm men phát triển mạnh, thích nghi tốt với môi trường làm cho quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ.Theo khảo sát , nấm men sau 10 giờ đã bắt đầu thích nghi và tăng sinh khối chuẩn bị cho quá trình lên men thực sự diễn ra và đến 20 giờ là cao nhất. Sau khoảng thời gian đó mật độ nấm men vẫn duy trì và có xu hướng giảm dần, có thể nói là nấm men lúc này đang vào pha ổn định. Từ 28 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm nhanh do bước vào giai đoạn suy vong do môi trường tích tụ acid gây ức chế nấm men. 3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ lên men SHF: 40 35 30.11 30.01 30 28.19 25 20 Glucose mg/ml 15 Cellulose 10 5.12 3.87 4.88 5 0 35oC 37oC 39oC Nhiệt độ Hình 3.8. Khảo sát lượng đường khử theo nhiệt độ Khảo sát ở mốc thời gian tối ưu là 20 giờ thấy rằng hàm lượng glucose và cellulose trong dịch mẫu đạt thấp nhất ở nhiệt độ 37oC (4,1 mg/ml và 28,3 mg/ml). 52
Đồ án tốt nghiệp Lượng cellulose và glucose đạt cao nhất (30,03mg/ml và 4,9mg/ml) ở nhiệt độ 35OC. Vậy nên có thể kết luận ở nhiệt độ 37oC thì quá trình lên men diễn ra là tốt nhất và lượng đường khử được sử dụng là nhiều hơn cả. 9 8 7.8 8 7.5 7 6 4.8 4.8 5 4.6 (%) Độ cồn 4 Độ Brix 3 2 1 0 35oC 37oC 39oC Nhiệt độ Hình 3.9. khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nhiệt độ Ở thời điểm khảo sát 20 giờ thấy rằng ở 37oC đạt độ cồn cao nhất là 4,8% và thấp nhất là 4,5% ở 35oC. Nhiệt độ hoạt động tối ưu theo tài liệu vi sinh đại cương của thầy Nguyễn Lân Dũng (2006) nằm trong khoảng 35 – 40oC tuy nhiên trong thí nghiệm này còn khảo sát đến cả yếu tố khác là đường khử và độ Brix. Vậy nên chọn nghiệm thức lên men ở nhiệt độ 37oC là hợp lý nhất. 3.2.3 Kết quả khảo sát pH quá trình lên men SHF: Độ pH hay nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu các chất dinh dưỡng, sản phẩm lên men qua thành tế bào của nấm men, hoạt động của enzyme. Do đó, pH của môi trường lên men sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới kết quả lên men. 53
Đồ án tốt nghiệp 40 35 33.41 29.11 30 27.19 25 20 Glucose mg/ml 15 Cellulose 10 7.82 4.87 5.11 5 0 pH4,5 pH5 pH 5,5 pH Hình 3.10. Khảo sát lượng đường khử theo pH Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC , lượng glucose ở mức cao nhất (6,8mg/ml) ở mức pH khảo sát là 4,5 và cellulose đạt cao nhất (33,7mg/ml) ở pH 5,5.Điều này thấy rằng ở 2 mức pH 4,5 và 5,5 lượng đường khử vẫn còn cao và có thể suy ra rằng hiệu suất của quá trình lên men là chưa đạt tối ưu. Vậy nên thực hiện quá trình lên men ở pH 5 là hiệu quả hơn cả mặc dù lượng glucose trong dịch lên men tuy không thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại nhưng lượng cellulose còn lại có sự giảm xuống đáng kể (29,19mg/ml) 10 9.2 9 8 7.8 8 7 6 4.8 (%) 5 4 3.8 Độ cồn 4 3 Độ Brix 2 1 0 pH 4,5 pH 5 pH 5,5 pH Hình 3.11.Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo pH 54
Đồ án tốt nghiệp Khảo sát ở mốc thời gian và nhiệt độ đã tối ưu ở 20 giờ và 37oC ở khoảng pH 5 cho độ cồn cao nhất (4,8%) và chênh lệch khá lớn so với khoảng pH 4,5 và 5,5. Càng cách xa pH 4,5 và 5,5 nấm men càng hoạt động yếu dần nên độ cồn càng thấp và hàm lượng cellulose còn càng cao. Vậy nên ta chọn nghiệm thức này để tiến hành những thí nghiệm về sau. 3.2.4. Kết quả khảo sát hàm lượng dịch nấm men SHF: 10 8.8 9 7.8 8 7.2 7 6 4.8 4.9 (%) 5 4.4 Độ cồn 4 Độ Brix 3 2 1 0 2,5% 5% 7,5% Hàm lượng dịch nấm men (%) Hình 3.12. Khảo sát sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo nồng độ nấm men Có thể thấy ở nồng độ 5% giống đạt độ cồn cao nhất là 4,8% cao hơn so với tỉ lệ giống 2,5% nhưng khi tăng tỉ lệ giống lên 7,5% thì độ cồn cũng có tăng lên nhưng độ cồn không thay đổi nữa vì nấm men đã bị nồng độ cồn cao ức. Vậy nên chọn hàm lượng nấm men 5% là tốt nhất. 55
Đồ án tốt nghiệp 45 40 35.13 35 30 28.19 27.93 25 Glucose (mg/ml) 20 Cellulose 15 10 7.82 4.87 4.38 5 0 2,5% 5% 7,5% Hàm lượng dịch nấm men (%) Hình 3.13. Khảo sát lượng đường khử theo nồng độ nấm men Ở nghiệm thức 2,5% tỉ lệ giống có mức cellulose và glucose là cao nhất (35,12 mg/ml và 7,8 mg/ml) cho thấy quá trình lên men vẫn còn ở hiệu suất thấp. Ở nghiệm thức còn lại sau khi đã bổ sung nấm men lên thành 5% và 7,5% thấy cả 2 loại đường đều có xu hướng giảm (22mg/ml cellulose và 3,8 mg/ml glucose) ở mức tỉ lệ giống là 7,5%. Có thể khẳng định mật độ nấm men cũng có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, bằng chứng là khi bổ sung nấm men thì thấy lượng đường khử dã giảm xuống. Tuy nhiên ta nên chọn nghiệm thức có tỉ lệ giống là 5% để đảm bảo tính kinh tế khi thực hiện cũng như lượng đường khử còn lại trong dịch cũng không có sự chênh lệch mang tính ý nghĩa so với mức 7,5% . 3.3.1 Kết quả khảo sát thời gian lên men SSF: 56
Đồ án tốt nghiệp 14 12 10 8 Độ Brix (%) 6 Độ cồn (%) 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Thời gian ( giờ) Hình 3.14. Sự thay đổi độ cồn và độ Brix theo thời gian lên men SSF Trước khi lên men , trong dịch không có lượng cồn nào được sinh ra và độ Brix đạt gần như là cao nhất (9,7%).Sau 12 giờ bắt đầu quá trình lên men, lượng cồn bắt đầu tăng với tốc độ khá nhanh và đạt 2,5% ở thời gian 12 giờ. Bên cạnh đó Độ Brix cũng bắt đầu giảm mạnh từ 10,1% xuống còn 8,3% trong 6 giờ. Có thể nói quá trình lên men lúc này đã bắt đầu diễn ra dù chưa đạt đến đỉnh điểm. Kể từ 12 giờ đến 40 giờ, lượng cồn trong dung dịchdù ko đạt được tốc độ tăng cao như 12 giờ đầu nhưng vẫn tăng lên rất đều đặn và đã đạt được độ cồn cao nhất là 5,1% sau 38 giờ lên men. Trong khoảng thời gian này, nồng độ cơ chất hòa tan trong dung dịch có xu hướng duy trì ổn định và có dấu hiệu đi xuống. Kể từ 38 giờ , độ cồn duy tiếp tục duy trì như vậy trong những giờ tiếp theo và giảm dần còn 3,4% ở 48 giờ. Độ Brix cũng bắt đầu giảm với tốc độ nhanh hơn so với khoảng thời gian đầu. Và đây cũng là giai đoạn đánh dấu quá trình lên men bắt đầu đi vào pha “suy vong”. 57
Đồ án tốt nghiệp 35 30 25 20 Glucose (mg/ml) 15 Cellulose 10 5 0 0h 2h 4h 6h 8h 26h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 28h 30h 32h 34h 36h 38h 40h 42h 44h 46h 48h Thời gian (giờ) Hình 3.15. Sự thay đổi lượng đường theo thời gian lên men SSF Trước quá trình lên men, lượng đường khử đạt mức cao nhất (31 mg/ml cellulose và 10,2 mg/ml glucose) và sau quá trình lên men trong 48 giờ chỉ còn lại 11,2 mg/ml cellulose và 0,31 mg/ml glucose. Điều này cho thấy quá trình lên men đạt hiệu suất khá cao và lượng glucose tiến rất sát về 0. Quan sát vào biểu đồ thấy rằng trong quá trình lên men trong 14 giờ đầu lượng đường khử hầu như là không thay đổi nhiều so với trước lên men dù có giảm xuống . Không những vậy còn thấy có những khoảng thời gian lượng đường có sự tăng lên do quá trình thủy phân lúc này vẫn còn đang diễn ra mạnh và quá trình lên men được xem là chưa thực sự diễn ra. Kể từ sau 20 giờ, lượng đường trong dịch lên men bắt đầu giảm xuống rõ rệt, lượng cellulose( từ 33,5 mg/ml giảm còn 14,7 mg/ml) trong 14 giờ và glucose ( 4,8 mg/ml giảm còn 0,31 mg/ml) ở mốc thời gian 48 giờ. Đây là mốc thời gian qua trọng đánh dấu quá trình lên men đã thực sự bắt đầu. Trong khoảng 10 giờ đầu của quá trình lên men đồng thời, mật độ tế bào nấm men tăng mạnh đây là giai đoạn tế bào nấm men thích nghi và bắt đầu sử dụng được chất dinh dưỡng trong môi trường để tăng sinh khối. Ở giai đoạn này , độ cồn thu được 58
Đồ án tốt nghiệp cũng tăng mạnh (1,8% lên 2,5% chỉ trong 2 giờ), tuy nhiên lượng cồn thu được vẫn chưa phải là cao nhất. Tương tự độ Brix cũng tăng dần ở khoảng thời gian 6 giờ là 10,1%. Bên cạnh đó có thể thấy lượng glucose sinh ra có xui hướng tăng dần là nồng độ cellulose giảm dần. Có thể nói rằng quá trình lên men lúc này chưa thực sự bắt đầu do tốc độ lên men của nấm men trong giai đoạn này còn yếu do tăng sinh chưa đủ . Theo khảo sát, khoảng thời gian sau 22 giờ là thời điểm nấm men bắt đầu hoạt động mạnh, cụ thể là độ cồn tăng nhanh đạt cao nhất là 5,1% ở mốc 38 giờ (mỗi 2 giờ tăng khoảng 0,2%). Song song đó nồng độ glucose và cellulose cũng giảm dần và độ Brix cũng giảm mạnh (giảm 3% trong 12 giờ). Mật độ tế bào nấm men lúc này là khá ổn định tuy nhiên cũng bắt đầu giảm dần.Vậy nên đây chính là thời điểm đánh dấu quá trình lên men đã thực sự bắt đầu. Bắt đầu từ 38 giờ trở đi, mật độ nấm men giảm dần và bước vào giai đoạn suy vong. Độ cồn bắt đầu giảm xuống còn 3,6% ở 48 giờ có thê do cồn đã khuếch tán ra ngoài môi trường, độ Brix dao động trong khoảng 6,8 – 7,6 và có xu hướng giảm dần. Lúc này lượng glucose và cellulose cũng giảm xuống. Chất dinh dưỡng trong môi trường lúc này đã gần như không còn đảm bảo cho quá trình lên men cũng như sự tích lũy các chất gây ức chế như CO2, acid, aldehyde Và lượng glucose trong quá trình thủy phân để sau đó lên men được sử dụng triệt để hơn so với lên men SHF (lượng glucose tiến về 0 gần hơn).Như vậy thời gian tối ưu để lên men SSF là 38 giờ, đạt độ cồn là 5,1%. Nếu so sánh với thời gian lên men SHF thì thời gian để lên men SSF đạt độ cồn cao nhất sẽ mất nhiều thời gian hơn mặc dù lượng cồn cao nhất thu được nhỉnh hơn dù không đáng kể. 59
Đồ án tốt nghiệp 3.3.2. Khảo sát nhiệt độ lên men SSF: 10 9.1 9 8 8 8 7 6 4.8 5.1 (%) 5 4.4 Độ cồn 4 Độ Brix 3 2 1 0 35oC 37oC 39oC Nhiệt độ Hình 3.16. Sư thay đổi độ cồn và độ brix theo nhiệt độ lên men SSF Kết quả cho thấy ở 37oC thu được độ cồn cao nhất nhưng độ cồn cũng chênh lệch không nhiều và tạo ra lượng ethanol cũng gần như nhau. Tuy nhiên xét thêm độ Brix cũng như lượng glucose tạo thành có xu hướng tăng dần thì ta nên chọn nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men SSF là 37oC. 3.3.3. Khảo sát pH lên men SSF: 10 9.1 8.8 9 8 8 7 6 5.1 4.7 4.8 (%) 5 Độ cồn 4 Độ brix 3 2 1 0 pH4,5 pH5 ph5,5 pH Hình 3.17. Sự thay đổi độ cồn và độ brix theo pH trong lên men SSF Khảo sát ở 3 mức pH, nhiệt độ 37oC, tỉ lệ nấm men 5%, cellulose 5%, đo ở 38 giờ cho thấy ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân và lên men đồng thời. pH từ 60
Đồ án tốt nghiệp 4,5 đến 5 đạt độ cồn cực đại là 5,1% nhưng tăng lên pH 5,5 thì độ cồn lại giảm xuống chỉ còn 4,5%. Bên cạnh đó pH 5 theo ta biết cũng là pH tối ưu cho cellulase hoạt động trong quá trình thủy phân. Vậy nên khẳng định pH 5 là tối ưu để thực hiện quá trình lên men SSF. 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme Độ hấp thụ OD của dd có phản ứng enzyme sau thủy phân Nồng độ enzyme 3% 5% 7% OD 540nm 0,869 0,851 0,906 Áp dụng vào công thức tính toán , ta xác định được hoạt tính CMCase của enzyme này là 38,15(IU/g) 61
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1.1 Quá trình tiền xử lý Từ các khảo sát về các phương pháp tiền xử lý nguyên liệu trước đã rút ra điểm tối ưu cho quá trình tiền xử lý vỏ chuối khô: - Nồng độ H2SO4 : 2% - Thời gian ngâm: 2 ngày - Tỉ lệ Acid : nguyên liệu = 10:1 - Nhiệt độ phòng 4.1.2 Quá trình thủy phân Kết quả rút ra từ khảo sát: - Nồng độ enzyme cellulose : 5% - Thời gian thủy phân : 1 ngày - Nhiệt độ : 50oC - pH 5.0 4.1.3 Quá trình lên men SHF - Thời gian lên men : 20 giờ - Nhiệt độ : 37oC - pH 5.0 - Tỉ lệ giống : 5% 4.1.4 Quá trình lên men SSF - nồng độ enzyme cellulose : 5% - Thời gian : 38 giờ - Nhiệt độ 37oC - pH 5.0 - Tỉ lệ giống : 5% 62