›

Đồ án Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp

pdf 123 trang thiennha21 13/04/2022 4440
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_kha_nang_ung_dung_dich_nuoi_cay_vi_khuan_lact.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp

  1. Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN LACTOBACILLUS sp. L5 VÀO BẢO QUẢN VÀ XỬ LÍ HẠT BẮP Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : NGUYỄN XUÂN VIỆT MSSV: 1311100880 Lớp: 13DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2017.
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Nguyễn Xuân Việt i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghê Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho chúng em trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương và cô Nguyễn Thị Hai đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ em có cơ hội được thực hành, vận dụng những kiến thức đã học vào công việc thực tế và hoàn thành luận văn với kết quả tốt nhất. Cuối cùng xin cảm ơn các bạn làm luận văn ở phòng thí nghiệm đã chia sẻ những kinh nghiệm, giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian hơn 3 tháng. Bước đầu đi vào thực tế, tìm hiểu về lĩnh vực bảo quản hạt nông sản bằng chất bảo quản có nguồn gốc sinh học, tuy nhiên kiến thức của em còn hạn chế. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để em có kiến thức và kỹ năng tốt hơn cho công việc trong tương lai. Tp Hồ Chí Minh, 6/2017 Nguyễn Xuân Việt ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài: 1 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2 2.1. Ngoài nước 2 2.2. Trong nước 3 3. Mục đích nghiên cứu 3 4. Mục tiêu nghiên cứu 3 5. Nội dung nghiên cứu 3 6. Phương pháp nghiên cứu 4 6.1. Phương pháp luận 4 6.2. Phương pháp xử lí số liệu 4 7. Kết quả đạt được 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 6 1.1 Tổng quan về nấm 6 1.1.1. Giới thiệu chung 6 1.1.2. Phân loại nấm 6 1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc. 7 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 20 1.2.1. Đặc điểm chung 20 1.2.1.1. Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 20 1.2.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 20 1.2.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic 22 iii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB 24 1.2.2.1. Bacteriocin 24 1.2.1.2. Phân loại bacteriocin 25 1.2.3. Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng 27 1.2.3.1. Khả năng kháng nấm của LAB 27 1.2.3.2. Ứng dụng của vi khuẩn LAB 29 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Địa điểm nghiên cứu: 30 2.2. Thời gian thực hiện: 30 2.3. Vật liệu nghiên cứu 30 2.3.1. Vật liệu: 30 2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng: 30 2.3.2.1. Hoá chất: 30 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy: 31 2.4. Thiết bị và dụng cụ: 31 2.4.1. Thiết bị: 31 2.4.2. Dụng cụ: 31 2.5. Phương pháp luận: 32 2.5.1 Mục tiêu đồ án: 32 2.5.2 Nội dung: 32 2.6. Phương pháp nghiên cứu: 33 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu: 33 2.6.2. Khảo sát hình thái vi khuẩn 34 2.6.2.1. Nhuộm Gram 35 2.6.2.2. Nhuộm bào tử 36 2.6.2.3. Thử nghiệm di động 37 2.6.2.4. Thử nghiệm Catalase 38 iv
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.5. Hàm lượng acid tổng 38 2.6.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường 39 2.6.2.7. Thử nghiệm Protease 39 2.6.2.8. Thử nghiệm Chitinase: 40 2.6.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5. 40 2.6.3.1. Định tính khả năng sinh IAA 40 2.6.3.2. Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy 40 2.6.4. Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: 41 2.6.5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp.: 43 2.6.6. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp45 2.6.7. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng Lactobacillus sp. L5 với Fusarium sp.: 46 2.6.8. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với sự nảy mầm của hạt. 49 2.6.9. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp. L5 có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt. 52 2.3.9. Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp 55 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 57 3.1. Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp. L5 57 3.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar 57 3.1.2. Hình thái tế bào 58 3.1.3. Thử nghiệm Catalase 59 3.1.4. Khả năng di động 59 3.1.5. Hàm lượng acid tổng 61 3.1.6. Khả năng lên men đường 61 3.1.7. Thử nghiệm Chitinase 62 3.1.8. Thử nghiệm Protease 63 v
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 64 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp.: 67 3.4. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau gia nhiệt. 69 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với sự phát triển của hạt bắp. 72 3.5.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới thời gian nảy mầm . 72 3.5.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. 74 3.5.3. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều cao. 76 3.5.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều dài rễ 80 3.5.5. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới sinh khối tươi. 84 3.6. Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt. 89 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 4.1. Kết luận 95 4.2. Kiến nghị 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 vi
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật KĐKTH: Không đun, không trung hoà KĐTH: Không đun, trung hoà KTHCN: Không trung hoà, cảm nhiễm KTHKCN: Không trung hoà, không cảm nhiễm LAB: Lactic acid bacteria MRS: Man De Rogosa and Sharpe NT: Nghiệm thức PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth THCN: Trung hoà, cảm nhiễm THKCN: Trung hoà, không cảm nhiễm VSV: Vi sinh vật vii
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loại nấm và độc tố của chúng 17 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động. 23 Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men. 28 Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 61 Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 62 Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA. 64 Bảng 3.4: Đường kính phát triển của chủng nấm mốc Fusarium sp. 66 Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp. của Lactobacillus sp. L5. 68 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp. 69 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm. 72 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm. 74 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7. 76 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày 80 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày. 84 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày 86 Bảng 3. 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ở các nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp. 89 viii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified 13 Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan sát dưới kín hiển vi (phải). 57 Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm Gram. 58 Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm bào tử. 58 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong nước cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. 59 Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp. L5 60 Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 62 Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp. L5 62 Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp. L5 63 Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC. 64 Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (μg/ml) 65 Hình 3.11: Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Fusarium sp. trên môi trường MRS Agar cải tiến và PDA sau 3 ngày. 66 Hình 3.12: Hình thái sợi nấm và bảo tử nấm mốc Fusarium sp. dưới kính hiển vi 67 Hình 3.13: Khả năng ức chế nấm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với nấm mốc Fusarium sp. 68 Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 lên khả năng kháng Fusarium sp 70 Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp. L5 sau khi gia nhiệt. 71 Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với thời gian nảy mầm của hạt bắp 73 ix
  11. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. 75 Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp 77 Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày. 78 Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày. 78 Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày 79 Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày 79 Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày. 81 Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày. 82 Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày. 82 Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày. 83 Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày. 83 Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày. 85 Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày 87 Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 90 x
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Các loại hạt nói chung và hạt nông sản nói riêng là một phần quan trọng trong quá trình tồn tại và phát triển của loài ngoài người. Cho nên con người ngày nay luôn tìm các tăng sản lượng hạt nông sản lên tối đa trên cùng một đơn vị diện tích. Tuy nhiên chỉ tăng sản lượng hạt nông sản phục vụ cho mục đích cuối cùng vẫn chưa đủ. Sau khi thu hoạch hạt vẫn rất dễ bị tổn thương trong quá trình bảo quản và chế biến, nó ảnh hưởng nhiều đến giữ giống cho mùa vụ sau hay ảnh hưởng tới chất lượng và giá trị của nông sản. Vì vậy ngoài nghiên cứu để nâng cao sản lượng thu hoạch chúng ta cần tiến hành song song quá trình nghiên cứu bảo quản và khả năng nảy mầm của nông sản sau thu hoạch. Để làm được điều đó là một công việc không dễ dàng. Công nghệ bảo quản hạt nông sản có nhiều phương pháp khác nhau nhưng cơ bản có 3 phương pháp đó là vật lý, hoá học và sinh học. Nhưng ngày nay người ta càng ngày càng chú trọng đến phương pháp bảo quản bằng sinh học do có nhưng ưu điểm vượt trội của nó như an toàn với người sử dụng, không ảnh hưởng đến cảm quan màu sắc, mùi vị của nông sản sau thu hoạch. Các hợp chất sinh ra từ vi khuẩn lactic ngày càng được chú trọng trong bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sinh hợp chất kháng các vi sinh vật có hại. Việc chú trọng bảo quản thực phẩm tươi sống như thịt cá trứng sữa, rau của quả là tối cần thiết nhưng việc bảo quản các loại hạt nông sản cũng rất quan trọng trong cuộc sống con người. Hạt bắp là một trong 5 loại hạt ngũ cốc quan trọng của nước ta. Do chúng ta chỉ tập trung vào số lượng nên chất lượng chưa thực sự tốt dẫn đến khả năng xuất khẩu của hạt bắp không cao. Hạt bắp rất dễ bị nhiễm các loại nấm như Aspergillus spp. làm mốc hạt, hay nấm Fusarium spp. làm thối thân thối bắp hay nấm Helminthosporium spp. gây bệnh đốm lá trên cây bắp. Trong đó loài Fusarium spp. không chỉ gây hại cho hạt 1
  13. Đồ án tốt nghiệp bắp ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm do chúng sinh độc tố như Zearelenone, Vomitoxin mà còn ảnh hưởng tới khả năng hô hấp của con người và động vật khi sử dụng bắp nhiễm Fusarium spp. Cùng với khả năng kháng các loài nấm bệnh của các chủng lactic trên hạt đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trong và ngoài nước. Nước ta có các sản phẩm lên men truyền thống và công nghiệp khi sử dụng các chủng vi khuẩn lactic được chứng minh thực tế là an toàn với người sử dụng nên người thực hiện thấy đây là vấn đề cấp thiết nên đã thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 vào bảo quản và xử lí hạt bắp”. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1. Ngoài nước Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm khác nhau như: “Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in vitro và trong nấu mạch nha lúa mạch” của A. Laitila (2002). Năm 2004, Cassandra De Muynck nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm”. Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005. R Munoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010. Ghisian và cs (2005) đã nghiên cứu sự sản xuất Fumonissin từ các loài Fusarium phân lập từ ngũ cốc tươi ở Iran. Kết quả phân lập được 3619 chủng Fusarium verticilloides và Fusarium proliferatum từ 92 mẫu ngũ cốc mới thu hoạch tại 4 vùng địa lí khác nhau của Iran, đồng thời cũng xác định được hàm lượng Fumonissin mà chúng tạo ra trên môi trường ngũ cốc. 2
  14. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Trong nước Hiện tại nước ta cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu vi khuẩn kháng nấm bệnh trên các loại cây và hạt khác nhau tiêu biểu như: Chế phẩm Bimix của trung tâm công nghệ sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh xử lí mùi hôi trong chăn nuôi khi kết hợp xử dụng sản phẩm sau lên men của 3 chủng Bacillus subtillis, Streptomycess sp, Saccharomycess cerevisiae. Sản sinh enzyme ngoại bào để ức chế nấm mốc gây bệnh. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm có nguồn gốc sinh học để bảo quản và khả năng nảy mầm của hạt bắp khỏi nấm bệnh gây hại từ vi khuẩn lactic. 4. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả năng bảo quản hạt của dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản và sự phát triển của hạt bắp. 5. Nội dung nghiên cứu Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và các chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy ở sau khi đun ở các nhiệt độ, pH khác nhau của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 với các chủng nấm Fusarium sp 3
  15. Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng của hạt bắp. Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp. 6. Phương pháp nghiên cứu 6.1. Phương pháp luận Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng hạt ngũ cốc và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm hạt. Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là dịch nuôi cấy, sẽ sử dụng trức tiếp để ứng dụng trong bảo quản hạt bắp đã cảm nhiễm nấm mốc. Sau đó thử nghiệm khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 6.2. Phương pháp xử lí số liệu Phần mềm Excel 2016. Phần mềm thống kê SAS 9.4. 7. Kết quả đạt được Xác định khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đối với chủng Fusarium sp. Xác định được khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy được đun ở các nhiệt độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút, trung hoà pH = 6 và không trung hoà. Xác định được ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ở các mức nhiệt độ và các độ pH đối với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 4
  16. Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 kích thích sinh trưởng của hạt bắp. Ứng dụng trong bảo quản hạt bắp, thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp. 5
  17. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Nấm (Fungi, Mycota) là một giới trong số năm giới theo hệ thống phân loại của R. H. Whittaker (1996). Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta), là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology), là một ngành khoa học độc lập với vi sinh vật. Tuy nhiên có một số nhóm nấm (nấm men, nấm mốc) do kích thước nhỏ bé và muốn nghiên cứu phải sử dụng các phương pháp vi sinh vật học nên được coi là đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật học. Nấm có nhiều đặc điểm giống với thực vật nhưng khác với thực vật ở chổ không có sắc tố quang hợp và cơ thể ít phân hóa về mặt hình thái. Nấm tồn tại và phân bố khắp trng tự nhiên như đất, nước, rễ thân lá quả hạt cây. Chúng có khả năng sinh độc tố có hại cho con người, động vật và thực vật. Tuy nhiên chúng lại có vai trò rất quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự nhiên có chứa cellulose, protein, lipid, kitin, pectin, đảm bảo chu trình khép kín trong tự nhiên. 1.1.2. Phân loại nấm Dựa theo tổ chức hình thái, nấm được chia thành 4 lớp chính: Lớp Phycomycetes (lớp nấm tảo): Sợi không có vách ngăn ngăn, bào tử gồm 2 lớp phụ: Oomycetes (nấm noãn) và Zygomycetes (nấm tiếp hợp). Lớp Ascomycetes (lớp nấm túi): Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng túi bào tử, sinh sản hữu tính theo kiểu tạo túi (namg) và túi bào tử (ascospore). Lớp Basidiomycetes (lớp nấm đảm): Sinh sản hữu tính theo kiểu tạo đảm bào tử (basidiospore). Gập ở các nấm có tai nấm: Nấm rơm, nấm hương. 6
  18. Đồ án tốt nghiệp Lớp Deuteromycetes (lớp nấm bất toàn): Không có khả năng sinh sản hữu tính và có 3 bộ. 1.1.3. Một số độc tố và tác hại của độc tố nấm mốc. Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) cho biết: Trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loài ảnh hưởng đến sức khỏe con người, khoảng 15 loài gây ung thư. Trong một thời gian dài, người ta ít chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm bị mốc. Nhưng vào năm 1960, hơn 100000 con gà tây ở Anh đã bị chết một cách rất khó hiểu. Sau đó, người ta đã phát hiện ra nguyên nhân là những con gà này đã ăn bột lạc nhiễm Aspergillus flavus, chính nấm mốc này đã tạo ra những độc tố nguy hiểm. Nhờ phát hiện này người ta đã khẳng định rằng con người cũng có thể bị bệnh nếu ăn phải những hạt mốc, kể cả với lương rất nhỏ. Một số độc tố thường gặp như sau:  Aflatoxin, Ochratoxins do Aspercillus spp. Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 1200oC, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1. Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn. 7
  19. Đồ án tốt nghiệp Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết: Aflatoxine liên quan tới các bệnh khác nhau ở gia súc, vật nuôi trong nhà cũng như con người; là loại độc tố nấm mốc được nghiên cứu rộng và sâu nhất trên toàn thế giới. Cần lưu ý rằng aflatoxin có thể sinh ra trong ngũ cốc ngay cả trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và sau thu hoạch nếu ngũ cốc không được bảo quản đúng cách hay được sinh ra trong thức ăn chăn nuôi trước khi được sử dụng. Nói chung, khi aflatoxin sinh ra, khó có thể làm gì để loại bỏ chúng khỏi ngũ cốc hay thức ăn chăn nuôi. Các loại độc tố này có cấu tạo hoá học rất ổn định và không bị phá huỷ bởi nhiệt, ánh sáng, axit, xử lý kiềm, hay kéo dài thời gian lưu trữ. Khi người và động vật ăn phải thực phẩm chứa độc tố nấm mốc Aflatoxin có thể gây đến ngộ độc cấp tính hoặc mãn tính. Ngộ độc cấp tính: Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Theo Phạm Duy Tường (2009) cho biết: Khi ăn phải lượng Aflatoxin lớn sẽ gây ngộ độc cấp tính và gây tử vong. Thông thường mổ ra thấy gan to, màu sắc nhợt nhạt, có hoại tử nhu mô gan và chảy máu Theo Bộ môn Dược lý – Vệ sinh an toàn thực phẩm (2011), cho biết: Biểu hiện ngộ độc aflatoxine lâm sàng ở người đã được thống kê khắp nơi trên thế giới. Triệu chứng đặc trưng là nôn ọe, đau bụng, phù phổi, hôn mê và chết do phù não và chất béo cuộn vào gan, thận và tim. 8
  20. Đồ án tốt nghiệp Ngộ độc mãn tính: Hiện nay, một loạt các nghiên cứu trên người cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1. Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính. Ochratoxins Ochratoxins là chất dẫn xuất isocoumarin. Nó chủ yếu được sinh ra từ nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum, nhưng cũng có khi từ loại nấm mốc khác. Độc tố này xuất hiện trong quá trình lưu kho khi nấm mốc nhiễm vào ngũ cốc và đỗ, đặc biệt ở thời tiết lạnh và ôn đới. Độc tố được sản sinh mạnh nhất và nhiều nhất ở 20 - 25oC. Trong số các ochratoxin, ochratoxin A(OTA) có độc tính mạnh nhất. Cơ quan nghiên cứu ung thư đã phân chia OTA thành nhóm 2B carinogen. Trong chăn nuôi, thương tổn do nhiễm độc ochratoxin A xuất hiện chủ yếu ở gia cầm và heo. Tuy nhiên tất cả các gia súc phòng thí nghiệm đã qua thử nghiệm đều rất dễ bị thương tổn khi ăn thức ăn có độc tố ochratoxins. Khi tiêu thụ thức ăn chứa khoảng vài trăm ppb độc tố ochratoxins A dẫn tới chuyển hóa thức ăn kém, tỷ lệ tăng trưởng giảm và phát triển kém, kèm theo là giảm sức đề kháng chống lại các vi khuẩn và virus. 9
  21. Đồ án tốt nghiệp Độc tính: Độc tố này chủ yếu gây bệnh cho đông vật nhất là lợn và các loài dạ dày đơn. Đặc điểm nổi bật khi nhiễm độc tố này là tiêu thụ nước tăng và đi tiểu nhiều do sự tổn thương thận. Khi mổ thấy thận thường to và màu xám với bề mặt vỏ thận không nhẵn nhụi và xơ vỏ thận. Không ảnh hưởng tới loài nhai lại.  Phương pháp hạn chế Aflatoxin Theo Phạm Duy Tường (2009) cho biết biện pháp phòng chống ngộ độc do độc tố của Aflatoxine và Ochratoxins như sau: Trong bảo quản thực phẩm: phải đảm bảo yêu cầu vệ sinh trong bảo quản, bảo quản nơi khô, thoáng mát, trước khi bảo quản phải phơi khô, giữ nguyên vỏ, để nấm mốc không thể phát triển và sinh ra độc tố. Quá trình chế biến: Khi làm tương, xì dầu phải phải chọn thực phẩm tốt và phải chọn mốc đúng chủng loại. Kiểm tra và giám sát chặt chẽ thức ăn cho người và vật nuôi. Xử lý nghiêm túc theo các quy định và luật vệ sinh an toàn thực phẩm. Nghiên cứu, áp dụng các biện pháp xử lý, chế biến thực phẩm để giảm thiểu hàm lượng Aflatoxine và Ochratoxins trong thực phẩm. Độc tố do Fusarium spp. gây ra: Fumonisins Fumonisins nhóm bao gồm 6 loại độc tố khác nhau, (FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2). Chúng được sản sinh từ Fusarium moniliforme, Fusarium proliferratum và 10
  22. Đồ án tốt nghiệp Fusarium sp, đặc biệt khi khí hậu ẩm và ôn hòa. Fumonisins được thấy chủ yếu trong ngô và các sản phẩm từ ngô, do vậy đây là vấn đề khó khăn trên toàn thế giới. Fumosin B1 là độc tố nhiều nhất và phổ biến nhất trong nhóm.  Độc tính Fumonisins B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất, gây nên một số triệu chứng như: Gây não bạch cầu hoặc tổn hại gan. Ung thư gan. Ung thư thực quản ở người và tổn thương gan, thận, tim, phổi, thậm chí ức chế sinh trưởng và gây chết. Ngoài ra, người còn bị bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm: Bệnh bạch hầu do nhiễm độc thực phẩm phát hiện ở những người đã ăn phải hạt ngũ cốc nhiễm mốc hoặc các chế phẩm từ hạt ngũ cốc tích trữ qua mùa đông ở ngoài đồng. Độc tố này thường gây tử vong và được gọi bằng nhiều tên khác nhau: Bệnh thiếu máu không tái tạo, bệnh bạch cầu chảy máu, bệnh mất bạch cầu hạt, viêm họng nhiễm trùng, bệnh độc tố thực phẩm, bệnh độc tố gây suy tủy. Zeatalenone Zeatalenone( ZON) là sản phẩm duy nhất của loài nấm mốc Fusarium phát triển trong điều kiện độ ẩm cao( ví dụ Fusarium roseum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum). Nó có tác dụng tương tự hoocmone động dục giống cái và gây ra động dục giả (hiện tượng tương tự động dục). Lợn được coi là loài gia súc nhạy cảm nhất. 11
  23. Đồ án tốt nghiệp  Phương pháp loại trừ: Do Fumonisin và Zeatalenone bền nhiệt chỉ bị phá hủy khi tác động nhiệt độ >2000oC. Các biện pháp thủy phân không làm giảm mà ngược lại làm tăng cường độc tính. Biện pháp hiệu quả nhất là phân loại và lựa chọn nguyên liệu. Trichothecenes Trichothecenes thuộc nhóm 150 hợp chất có cấu trúc tương tự được sản sinh chủ yếu từ Fusarium spp, một loại nấm mốc phân bố rộng rãi trong các loại ngũ cốc trên thế giới. Do đặc tính hóa học và sự hình thành nấm mốc, chúng có thể được phân chia làm 4 nhóm căn bản với các loại A và B ảnh hưởng tiêu cực đối với chăn nuôi gia súc. Trichothecenes loại A (sản sinh chủ yếu từ Fusanum sporotrichioides) bao gồm các loại độc tố khác nhau T-2 toxin, HT-2 toxin, neosolaniol (NEO) và diacetoxyscirpenol (DAS). Trichothecenes loại B( sản sinh chủ yếu từ Fusariltm culmorum và F .graminearum) gồm các loại deoxymvalenol và 3-acetyl cùng với 15 chất dẫn xuất của nó. Độc tính: - T- 2 toxin ức chế sự tổng hợp protein và làm suy yếu sự hoàn thiện của tế bào máu trong tủy xương và ngăn chặn hệ miễn dịch. Rối loạn chức năng ribosom, ức chế sự tổng hợp protein ở ty thể. Gây nên thương tổn cho tuyến nhày của dạ dày và ruột dẫn tới hậu quả là xuất huyết diện rộng và viêm toàn bộ niêm mạc dạ dày. 12
  24. Đồ án tốt nghiệp Nếu ăn phải lượng lớn độc tố trong thực phẩm sẽ gây nôn ọe, bỏ ăn. Hình 1.1: Cấu trúc hoá học của Trichothecennes và Detoxified  Phương pháp hạn chế ngộ độc do Trichothecenes: Trichothecenes rất với các tác động môi trường và bền với nhiệt, không bị phân giải ở nhiệt độ dưới 2300oC, độc tố này bền vững trong không khí và ánh sáng hàng tuần lễ. Có thể xử lý hoàn toàn Trichothecenes ở 6000oC trong 10 phút trong dung dịch NaOH. Trichothecenes có thể dễ dàng loại bỏ phần lớn bằng nước. Trichothecenes mất hoạt tính khi kết hợp với một số tác nhân như bentonit và đất sét trắng. Trichothecenes bị vô hoạt trong dung dịch NaHSO3 3- 5%. 13
  25. Đồ án tốt nghiệp Do trong đề tài sử dụng nấm chủng nấm Fusarium spp. nên sẽ mô tả khá đầy đủ về chủng nấm này: Đặc điểm của nấm Fusarium spp. Fusarium spp. là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc kí sinh trên nhiều loại hạt rễ thân cây trồng khác nhau, Chúng cạnh tranh dinh dưỡng, phát triển tơ nấm phủ kín mô mạch trong thân cây hay tiết độc tố vào mạch dẫn khiến ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt hay làm héo rũ cây. Phân loại : Nấm Fusarium spp. thuộc: Nghành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Họ: Tuberaulariaceae Bộ: Moniliales Chi: Fusarium Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây như héo do tắc mạch, thối rễ, thân và bắp, thối cổ rễ cây con. Một số loài gây bệnh cũng sản sinh độc tố nấm lẫn tạp trong hạt ngũ cốc. Fusarium spp. là một loại nấm gặp phố biến trong đất đôi khi là ở hạt và thân cây trồng và cũng gặp trên các vật liệu cellulose. Nhiệt độ phát triển thích hợp của Fusarium spp. là 25 – 30oC. 14
  26. Đồ án tốt nghiệp Nấm Fusarium cũng như các loại nấm khác phát triển khá mạnh trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25oC. Mặt trên của tản nấm có thể màu trắng, vàng, cam đỏ tím. Mặt dưới tản nấm có thể không màu, vàng nhạt hạy nâu. Các nghiên cứu về Fusarium bắt đầu từ năm 1809 nhưng việc xác định số lượng loài lại gặp rất nhiều khó khắn do số lượng loài rất lớn. Có khoảng hơn 70 loài và hơn 55 giống theo Gerlach và Nirenberg (1982). Độc tố của nấm: Một số nhóm độc tố quan trọng do nấm Fusarium sản sinh ra là Fumonisins (Fumonisin B1, Fumonisin B2, Fumonisin B3). Trong kết quả nghiên cứu của các tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001b); Nelson PE. Desjardins AE, plattner RD (1993) chúng đã được chứng minh là có khả năng gây bệnh Equine leucoencephalomalacia cho ngựa, ung thư gan ở chuột, và hội chứng sưng phổi ở lợn. Một số nghiên cứu dịch tễ học của nhóm tác giả Marasas WFO, Nelson PE, Toussoun TA (1984) cũng phát hiện ra rằng Fumonisins có liên quan đến bệnh ung thư thực quản ở người. Một số loại độc tố như: Fusaric acid, 5-(butyl)-2-pyridinecarboxylic acid là một trong những độc tố phổ biến nhất do một số loài nấm Fusarium sản sinh ra như: Fusarium verticiloides (Sacc.) Nirenberg, Fusarium subglutinans (Matsush) Nirenberg, Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum (Matsush) Nirenberg. Fusaric acid có tác động hóa học rất lớn đối với hệ thần kinh và có thể ảnh hưởng đến hệ sinh sản, sự sinh trưởng và các hoạt động của động vật. Một loại độc tố khác là moniliformin là loại độc tố có tính độc rất cao do một số loài nấm Fusarium sản sinh ra như Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum, Fusarium semitectum, Fusarium subglutinans. Độc tố này có thể tìm thấy trong tự 15
  27. Đồ án tốt nghiệp nhiên, thấy cả trong thức ăn và trên cả các sản phẩm dùng làm thức ăn gia. Kết quả nghiên cứu khác của nhóm tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001) cho thấy độc tố Deoxynivalenol được sản sinh ra từ một số loài nấm gây hại trên ngũ cốc như: Fusarium graminearum và Fusarium culmorum và một số loài khác, là một loại độc tố có ảnh hưởng mạnh nhất khi tiếp xúc với cơ thể con người. Zearalenon là một loại độc tố khác của nấm Fusarium có thể gây ra hiện tượng vô sinh cho động vật đã được phát hiện trên nhiều cây trồng nông nghiệp. Zearalenon do các loài nấm F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti và F. crookwellens sản sinh ra. Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới khoảng 8 - 10 tấn/ha. Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng. Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau: Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất. Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung. Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất. Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm. Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại 16
  28. Đồ án tốt nghiệp thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất. Tác dụng của chế phẩm sinh học tác động từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu. Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường. Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng. Bảng 1.1: Một số loại nấm và độc tố của chúng Các loại độc tố Loài nấm Độc tố nấm nấm mốc chính A. flavus A. parasiticus Aflatoxin A. nomius (B 1, B 2, G 1, G 2) A. pseudotamarii Ochratoxin A. ochraceus Aspergillus spp. (Ochratoxin A) A. clavatus Patulin A. terreus A. flavus Axit Cyclopiazonic (CPA) A. ben C. purpurea Một Penitrem Claviceps spp. C. fusiformis Ergot alkaloids: C. paspali Clavines (Argroclavine) C. africana Axit lysergic 17
  29. Đồ án tốt nghiệp Amids lysergic acid (Ergin) Ergopeptines (Ergotamine, Ergovaline) F. verticillioides (Syn. F. Fumonisin (B 1, B 2, B 3) moniliforme) Axit fusaric F. proliferatum Loại A Trichothecenes F. graminearum T-2 toxin, HT-2 độc tố, F. avenaceum F. culmorum diacetoxyscirpenol Fusarium spp. F. poae Loại B Trichothecenes F. equiseti Nivalenol F. crookwellense F. acuminatum deoxynivalenol F. sambucinum fusarenon-X F. sporotrichioides F. graminearum Zearalenone F. culmorum F. sporotrichioides P. verrucosum Ochratoxin Penicillium spp. P. viridicatum (Ochratoxin A) 18
  30. Đồ án tốt nghiệp P. citrinum Citrinin P. verrucosum Roquefortine P. roqueforti PR độc tố Một Pentirem P. cyclopium Axit Cyclopiazonic (CPA) P. camemberti Một Pentirem P. expansum P. claviforme Patulin P. roquefortii Cây roi nhỏ độc tố cao: N. coenophialum Ergot alkaloids, lolines, Neotyphodium spp. peramine (Trước đây là Acremonium) Cây roi nhỏ độc tố cao: Lolitrems, peramine, ergot N. lolii alkaloid (ergovaline) Pithomyces spp. P. chartarum Sporidesmin 19
  31. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.2.1. Đặc điểm chung 1.2.1.1. Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, không hình thành bào tử, không có khả năng di động, hình que hoặc hình cầu. Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất với pH 5,5 – 5,8 và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, vitamin, khoang, acid béo và carbonhydrate. LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm lên men như sữa chua, pho mát, . Ngoài ra chúng còn sản sinh ra một số hợp chất thú cấp có tính kháng khuẩn như bateriocin, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm bằng cách ứng chế sư phát triển của vi khuẩn có hại. Các giống LAB thường gặp chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Camobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 – 1,5 μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào vi khuẩn lactic từ 1 – 8μm. Chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay nhóm với nhau. 1.2.1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau: Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). 20
  32. Đồ án tốt nghiệp Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone soy, Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 21
  33. Đồ án tốt nghiệp Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 1.2.1.3. Phân loại vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm dựa vào khả năng lên men: Lên men đồng hình: Sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi phân tử glucose theo con đường EmBden – Meyerhof – Parnas thành 2 phân tử pyruvate. Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi một phân tử glucose theo con đường Embden–Meyerhof–Parnas thành hai phân tử pyruvate. Cân bằng oxy hoá khử nội bào được duy trì trong suốt quá trình oxi hoá NADH, đồng thời với sự khử pyruvate thành acid lactic. Quá trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi glucose được tiêu thụ. Đại diện cho kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus và Lactobacillus nhóm I. Lên men dị hinh: Sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic và CO2. LAB lên men dị hình phân giải glucose theo con đường pentose phosphate. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6-phosphogluconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose–5– phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hoá thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl–CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với từ quá trình dị hoá một phân tử glucose. Các 22
  34. Đồ án tốt nghiệp LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và Lactobacillus spp. nhóm III. Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động. Sản phẩm chuyển hoá Phương thức hoạt động Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl, 1.Carbon dioxide giảm tính thấm của màng 2. Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine 3. Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào. Nó 4. Acid lactic gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor. Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp 5. Bacteriocin protein và DNA. 23
  35. Đồ án tốt nghiệp 1.2.2. Khả sinh sinh các hợp chất kháng khuẩn của các chủng LAB 1.2.2.1. Bacteriocin Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với chúng. Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gene (Klaenhamme, 1993). Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra để chống lại vi khuẩn khác, vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin (TS. Vũ Thị Lâm An, 2013). Bacteriocin được sinh ra ở cả vi khuẩn Gram dương và âm, nhưng bacteriocin từ vi khuẩn lactic được nghiên cứu nhiều nhất do tính hiệu quả, mức độ an toàn và khả năng ứng dụng làm chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên trong công nghiệp thực phẩm. Bacteriocin không phải thuốc kháng sinh; do chúng là các peptide được tổng hợp bởi ribosome vi khuẩn, không phải chất chuyển hóa thứ cấp nên nhanh chóng bị phân cắt bởi protease trong hệ thống tiêu hóa của người. Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic. 24
  36. Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.2. Phân loại bacteriocin Hiện nay, đã có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Bacteriocin được phân loại với nhiều tiêu chí khác nhau như họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và trình tự amino acide. Bacteriocin được chia làm 4 nhóm, trong đó nhóm 1 và nhóm 2 rất phong phú, có tiềm năng thương mại lớn. 4 nhóm gồm: Nhóm 1: (Lantibiotic) là những phân tử nhỏ (<5kDa). Lantibiotic chứa những amino acid hiếm. (Ví dụ: lanthionine và 3 – methyllanthionine) và một số amino acid khử nước. Lantibiotic có thể được chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu trúc và chức năng: • Lớp 1a: Là những phân tử peptide tích điện dương, dài 34 amino acid. Những peptide này chủ yếu hoạt động phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích. Có thể chia lantibiotic thành 2 phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự peptide dẫn (leader peptide). • Lớp 1b: Là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 amino acid. Hoạt động của chúng chủ yếu là phá vỡ chức năng của các enzyme. Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hoá. Nhóm 2: Là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, khong chứa lanthionine và bền nhiệt. Bacteriocin nhóm 2 có phổ kháng khuẩn hẹp. Lớp 2 có thể chia thành 3 phân lớp: 25
  37. Đồ án tốt nghiệp • Lớp 2a: Bacteriocin lớp này rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn (YGNGVXC) ở đầu N và hoạt tính kháng Listeria. • Lớp 2b: Những bacteriocin này cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh. Trong hầu hết các trường hợp, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin, nhưng hoạt tính sẽ cao khi có sự hiện diện của peptide thứ hai. • Lớp 2c: Bacteriocin phụ thuộc nhân tố sec. Phân tử bacteriocin lớp 2c được được đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố sec. Bacteriocin lớp 2a có tiềm năng ứng dụng trong quy mô công nghiệp do khả năng kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các Bacteriocin nhóm 1 (Nisin), do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng mà không tiêu diệt các chủng khơi động. Pediocin PA – 1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất trong số các bacteriocin lớp 2a. Nhóm 3: Bacteriocin lớp 3 là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt. Lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của bacteriocin. Bacteriocin nhóm 3 được thu nhân từ một số giống Lactobacillus. Chỉ một vài bacteriocin thuộc lớp này được định danh (ví dụ: Helveticin, helveticin V). (Parada J. L. và cs, 2007). Nhóm 4: Là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein con có thêm thành phần lipid và carbonhydrate. Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch. Bacteriocin nhóm 4 là kết quả của sự tương tác tính kỵ nước và tích điện 26
  38. Đồ án tốt nghiệp dương của bacteriocin với các phân tử khác trong dịch thô. Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein. (Klaenhammer 1988, 1993).  Ứng dụng bacteriocin Ủ thực phẩm với giống bảo vệ (thường là vi khuẩn lactic – LAB: Lactic acide bacteria) để tạo bacteriocin. Trong trường hợp này, khả năng LAB sinh trưởng và tạo bacteriocin trong sản phẩm là quyết định. Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm. Sử dụng bán thành phẩm lên men trước đó với một chủng sinh bacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm. Một lựa chọn mới hiện nay trên cơ sở dạng thứ hai là dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm. 1.2.3. Khả năng kháng nấm của LAB và ứng dụng 1.2.3.1. Khả năng kháng nấm của LAB Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu. Hoạt động kháng nấm của L. coryniformis ổn định khi bị ở nhiệt độ cao và độ pH 3 – 4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L. plantarum và L. sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng 27
  39. Đồ án tốt nghiệp nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.). Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men. Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllacticacid Lactobacillus plantarum 21B 3-phenyllacticacid 3-hydroxydecanoicacid Lactobacillus plantarum 3- hydroxydodecanoicacid MILAB14 3- hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis –dodecenoicacid Cyclo(Gly-Leu) Lactobacillus plantarum Methylhydantoin VTTE-78076 Mevalonolactone Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formicand Lactibacillus n- valeric acid. sanfranciscensis CB1 Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác 28
  40. Đồ án tốt nghiệp định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl. 1.2.3.2. Ứng dụng của vi khuẩn LAB Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium spp., chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm. 29
  41. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ 16/05/2016 đến 07/08/2016. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu: Giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp. L5 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Chủng Fusarium sp. được lấy từ Trung tâm Ươm tạo, Khu Nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh. 2.3.2. Hoá chất và môi trường sử dụng: 2.3.2.1. Hoá chất: Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS Broth, MRS cải tiến và PDA. Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Bromophenol blue (BPB), thuốc thử Phenolphthalein. NaOH 0,1N, NaOH 2N). Cồn 96°, 70°. Nước cất. Carbenzym 500FL với nồng độ 0,15%. 30
  42. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường MRS Broth, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic. Môi trường PDA để nuôi cấy các chủng nấm mốc. 2.4. Thiết bị và dụng cụ: 2.4.1. Thiết bị: Tủ cấy vi sinh Tủ ủ Tủ lạnh -20oC, -5oC Tủ sấy Máy đo quang phổ Autoclave Cân phân tích Bếp từ Nhiệt kế Máy nước cất Bể điều nhiệt 2.4.2. Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri nhựa và thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh. Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, micropipet 100 – 1000μl. 31
  43. Đồ án tốt nghiệp Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, dao mổ, eppendorf 1ml. Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống nghiệm. 2.5. Phương pháp luận: 2.5.1 Mục tiêu đồ án: Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp và ảnh hưởng của djch nuôi cấy đôi với khả năng nảy mầm của hạt bắp. 2.5.2 Nội dung: Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và chủng Fusarium .sp. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 và chủng Fusarium .sp. Khả sát khả năng sinh IAA có trong dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sau gia nhiệt ở mức nhiệt độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút. Khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt sau khi ngâm hạt trong dịch nuôi cấy ở thời điểm 30 phút sau cảm nghiễm nấm Fusarium sp. khi gia nhiệt ở các nhiệt độ độ 65oC, 80oC, 100oC trong 15 phút và không gia nhiệt. Ứng dụng dịch nuôi cấy của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt bắp và khả năng nảy mầm của hạt sau thu hoạch. 32
  44. Đồ án tốt nghiệp 2.6. Phương pháp nghiên cứu: 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu: Chủng vi khuẩn lactic Chủng nấm mốc Khảo sát đặc điểm hình thái, Khảo sát khả năng phát triển sinh hoá, sinh IAA Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp giữa chủng vi khuẩn lactic và chủng nấm mốc Khảo sát khả năng đối kháng nấm của dịch vi khuẩn sau khi gia nhiệt Khảo sát khả năng đối kháng Khảo sát khả năng đối kháng nấm của dịch vi khuẩn sau khi nấm của dịch vi khuẩn sau khi gia nhiệt 15 phút ở các mốc gia nhiệt 15 phút ở các mốc nhiệt 100oC, 80oC và 65oC điều nhiệt 100oC, 80oC và 65oC chỉnh pH = 6 không điều chỉnh pH Ứng dụng dịch nuôi cấy vi khuẩn để bảo quản và thúc đẩy quá trình nảy mầm của hạt bắp 33
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2. Khảo sát hình thái vi khuẩn Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường Khảo sát khả năng sinh IAA MRS Broth Ủ 37oC, 24 giờ Cấy chuyền qua môi trường MRS Agar Quan sát hình thái khuẩn lạc Khảo sát đặc điểm hình thái Nhuộm Gram và đặc điểm nuôi cấy Nhuộm bào tử Khả năng lên men đường Thử nghiệm Catalase Acid tổng Thử nghiệm enzyme Khẳng định ngoại bào giống thuần 34
  46. Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khẳng định tính thuần của chủng vi khuẩn lactic, thực hiện một số phản ứng sinh hoá và khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần của chúng và hoạt hoá lại chủng vi khuẩn cho các thí nghiệm về sau. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được tăng sinh lại trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy. 2.6.2.1. Nhuộm Gram Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hay Gram âm. Tiến hành: Dựa theo phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ. Chuẩn bị vết bôi: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng dung dịch Violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. 35
  47. Đồ án tốt nghiệp Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safarin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: Dùng vật kính x100 nhỏ dầu quan sát. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng. 2.6.2.2. Nhuộm bào tử Mục đích: Vì vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không sinh bào tử và do tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu khác nhau. Phương pháp này nhằm loại bỏ các vi khuẩn sinh bào tử như Bacillus spp. hay Clostridium spp. Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton. Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc mẫu nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1 – 2 giọt cồn 96o . Đốt cháy khoảng 10 giây và dập tắt ngay. Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thuỷ tinh có chứa một ít nước đang đun nóng 85 – 90oC (không để cho sôi) trên bếp. Bước 2: Tiến hành nhuộm tiêu bản Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ hơi nước nóng 36
  48. Đồ án tốt nghiệp trong 5 – 10 phút. Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung. Rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây (lúc đó các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu). Đặt tiêu bản lên giá đỡ, giá được đặt trên chậu rửa. Đặt giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch safranin hay fuchsin lên trên miếng giấy lọc, để 30 giây. Rửa nước rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi. Bước 3: Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu soi kính (x100). Kết quả: Tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh lục, tế bào chất bắt màu đỏ hồng. Lưu ý: Để dễ dàng quan sát được bào tử nên cấy vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng chứa 0,005% MnCl2 (5mg/l) trước 2 tuần trên môi trường thạch nghiêng. Có thể thay thế dung dịch lục Malachite 5% bằng dung dịch Methylen Blue 6%. 2.6.2.3. Thử nghiệm di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm 0,5 – 0,7% agar. Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. 37
  49. Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Dùng que cấy cấy thẳng đâm vào môi trường thạch mềm, lưu ý không đâm đến chạm đáy ống nghiệm. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở 37oC và quan sát sau 1-3 ngày. Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động. 2.6.2.4. Thử nghiệm Catalase Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase. Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18 – 24 giờ. Quan sát kết quả. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra. 2.6.2.5. Hàm lượng acid tổng Mục đích: Xác định hàm lượng acid tồng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả. 38
  50. Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau: V1 × K %Acid lactic = x 100% V2 Trong đó: V1: Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml). K: Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009. V2: Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml). 2.6.2.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn. Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường Sucrose, Maltose và Xylose. Sau đó phối vào ống nghiệm có ống durham, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát. Kết quả: Dương tính khi môi trường đục, chuyển vàng và có hay không sinh khí trong ống durham. Kết quả âm tính khi môi trường trong, không sinh hơi. 2.6.2.7. Thử nghiệm Protease Mục đích: Xác định khả năng tiết enzyme protease phân huỷ cơ chất casein. Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường MRS có bổ sung casein 1% đã được hấp khử trùng. Đục lỗ đĩa thạch và hút dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các lỗ. Sau đó ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ và đo đường kính vòng phân giải. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng phân huỷ casein khi xung quanh lỗ có vòng phân giải, nếu không có thì xung quanh lỗ, môi trường vẫn sẽ đục. 39
  51. Đồ án tốt nghiệp 2.6.2.8. Thử nghiệm Chitinase: Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme chitinase phân huỷ chitin. Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường gồm huyền phù chitin 1% bổ sung 2% agar đã được hấp khử trùng. Đục lỗ đĩa thạch và bơm dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các lỗ. Sau đó ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ và nhỏ thuốc thử Lugol rồi đo đường kính vòng phân giải. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme chitinase khi môi trường xung quanh tạo quầng sáng không bắt màu thuốc thử Lugol. 2.6.3. Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5. 2.6.3.1. Định tính khả năng sinh IAA Phương pháp Salkowski: Thuốc thử Salkowski sẽ cho màu vàng nhạt đến hồng đậm tuỳ thuộc vào hàm lượng IAA có trong dịch nuôi cấy. Đo bước sóng 530nm. Thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000rpm/phút trong 15 phút, lấy 1ml dịch cho vào ống nghiệm dán băng kéo đen , bổ sung 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để trong bóng tối 15 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm, dựa vào đường chuẩn xác định nồng độ IAA tạo thành. 2.6.3.2. Định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Chuẩn bị thuốc thử Salkowski. Lấy 553ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ được dung dịch H2SO4 10,8M. Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít dung dịch H2SO4 10,8M ở trên. Ta thu được thuốc thử Salkowski. 40
  52. Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị dung dịch IAA các nồng độ chuẩn: Cân 0.01g IAA bổ sung vào 100ml môi trường MRS Broth ban đầu, thu được dung dịch IAA có nồng độ 100mg/l. Pha loãng để thu được dung dịch IAA ở các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25 mg/l. Hút 1ml mỗi nồng độ IAA ở trên cho vào ống nghiệm được dán băng keo đen, bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Salkowski, lắc đều, để 15 phút trong tối ở nhiệt độ phòng chờ phản ứng xảy ra hoàn toàn. Tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm. Từ kết quả, ta xác định được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530 và nồng độ IAA (mg/l) gọi tắt là đường chuẩn IAA. 2.6.4. Khả sát khả năng phát triển của chủng nấm Fusarium sp.: Chủng nấm Fusarium sp. Tăng sinh trong môi trường PDB Ủ 25 – 30oC, 24 giờ Cấy điểm sang môi trường PDA và MRS Agar cải tiến Ủ 25 – 30oC,72 giờ Đo đường kính tản nấm xác định khả năng Quan hình hình thái nấm tăng trưởng của nấm 41
  53. Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Chủng nấm Fusarium sp. được lấy từ phòng thí nghiệm Trung tâm Ươm tạo, Khu Nông nghiệp Công Nghệ Cao Thành phố Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài. Chủng nấm mốc được tăng sinh trong môi trường PDB sau đó ủ cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ. Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sang môi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 25 – 30°C trong vòng 72 giờ. Tiến hành quan sát hình thái bào tử của chủng nấm bằng phương pháp phòng ẩm. Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của tản nấm. 42
  54. Đồ án tốt nghiệp 2.6.5. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm Fusarium sp.: Chủng vi khuẩn Chủng nấm Fusarium sp. Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Tăng sinh trong môi trường PDB Ủ 25 – 30oC, 24 giờ Cấy điểm trên môi trường PDA Ủ 37oC, 24 giờ Ủ 25 – 30oC, 72 giờ Đục lỗ Đĩa MRS Agar cải tiến Tỉ lệ ức chế nấm Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. 43
  55. Đồ án tốt nghiệp Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến, được kẻ 2 đường cách đều mép đĩa 1.5 cm. Chủng nấm được tăng sinh trong môi trường PDB ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ sau đó cấy điểm trên môi trường PDA. Đục thạch nấm với cấy đục lỗ có đường kính 0.5cm và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ. Sử dụng que cấy vòng cấy ria 2 đường đã kẻ trước đó lên đĩa thạch MRS Agar cải tiến có thạch nấm. Đĩa đối chứng âm không cấy ria và Đối chứng dương cấy ria Carbenzym với nồng độ 150µl trong 100ml nước cất và đối chứng cấy ria môi trường nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm. Công thức tính tỉ lệ kháng nấm: Dđối chứng− Dthí nghiệm Tỉ lệ kháng nấm (%) = x 100% Dđối chứng Trong đó: Dđối chứng : Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm). Dthí nghiệm: Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm). 44
  56. Đồ án tốt nghiệp 2.6.6. Ảnh hưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 đến độ khoẻ mầm ở cây bắp Mục đích: Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành: Kết quả khảo sát đến độ khoẻ của mầm theo (Abdul Baki and Anderson, 1973) với công thức: Độ khỏe mầm = (Trung bình chiều dài rễ + trung bình chiều dài chồi) x tỷ lệ hạt nảy mầm (%). 45
  57. Đồ án tốt nghiệp 2.6.7. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy sau gia nhiệt của chủng Lactobacillus sp. L5 với Fusarium sp.: Chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở các Đun nóng ở các mức nhiệt 100oC, mức nhiệt 100oC, Không đun 80oC, 65oC trong Không đun 80oC, 65oC trong 15 phút 15 phút Đĩa MRS Agar cải tiến Chủng nấm mốc trên PDA Ủ 37oC, 72 giờ Đục lỗ Đo đường kính tăng trưởng của tản nấm Tỉ lệ ức chế nấm 46
  58. Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 2N và không trung hoà: 1. Phần trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. 2. Phần không trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm. Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến, được kẻ 2 đường cách đều mép đĩa 1.5cm. Chủng nấm được tăng sinh trong môi trường PDB ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ sau đó cấy điểm trên môi trường PDA.Đục thạch nấm với cấy đục lỗ có đường kính 0.5cm và đặt vào tâm đĩa. Ủ ở 25 – 30oC trong 24 giờ. Sử dụng que cấy vòng cấy ria dịch nuôi cấy đun, trung hoà; không đun, trung hoà; đun, không trung hoà và không đun không trung hoà ở các mức nhiệt độ lên 2 đường đã kẻ trước đó trên đĩa thạch MRS Agar cải tiến có thạch nấm. Đĩa đối chứng âm không cấy ria và Đối chứng dương cấy ria Carbenzym với nồng đồ 150µl trong 100ml nước cất và đối chứng cấy ria môi trường nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ. Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm. 47
  59. Đồ án tốt nghiệp Công thức tính tỉ lệ kháng nấm: Dđối chứng− Dthí nghiệm Tỉ lệ kháng nấm (%) = x 100% Dđối chứng Trong đó: Dđối chứng : Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm). Dthí nghiệm: Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm). 48
  60. Đồ án tốt nghiệp 2.6.8. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch buôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với sự nảy mầm của hạt. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở các Đun nóng ở các mức nhiệt 100oC, mức nhiệt 100oC, Không đun 80oC, 65oC trong Không đun 80oC, 65oC trong 15 phút 15 phút Hạt bắp đã Xử lí hạt khử trùng bề mặt bằng cồn 70o Đất được hấp khử trùng ở Trồng hạt 121oC trong 20 phút Tỉ lệ nảy mầm, chiều dài cây, sinh khối cây 49
  61. Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 1N và không trung hoà: 1. Phần trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. 2. Phần không trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng nảy mầm của hạt bắp: Hạt bắp được lựa chọn cảm quan với những hạt to khoẻ, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen. Hạt bắp sau đó được rửa bằng các ngâm trong cồn 70 trong 30 giây sau đó rửa lại bằng nước cất. Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong erlen sau đó cho hạt bắp và ngâm trong mỗi nghiệm thức: NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. 50
  62. Đồ án tốt nghiệp NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt không ngâm NT11: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Đất Tribat được mua tại vườn cây cảnh sau đó được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại bỏ vi khuẩn, nấm lẫn trong đất. Sau đó đất được chia ra từng ly nhựa với lượng đất bằng nhau, gieo mỗi cốc 3 hạt với mỗi nghiệm thức trồng 36 hạt. Canh thời gian nảy mầy của hạt, tính tỉ lệ nảy mầm, sinh khối, thân, lá, rễ so sánh với hạt ngâm trong nước và hạt không ngâm. 51
  63. Đồ án tốt nghiệp 2.6.9. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus spp. L5 có cảm nhiễm nấm mốc đối với sự nảy mầm của hạt. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Tăng sinh trong môi trường MRS Broth Trung hoà pH=6 Không trung hoà Đun nóng ở Đun nóng ở các mức các mức Không đun Không đun nhiệt 100oC, nhiệt 100oC, 80oC, 65oC 80oC, 65oC trong 15 trong 15 Xử lí hạt Hạt bắp đã khử trùng bề mặt bằng 2 Cảm nhiễm nấm 1cm nấm trên đĩa cồn 70o thạch trên 1 gam hạt Đất được hấp khử Trồng hạt trùng ở 121oC Tỉ lệ nảy mầm, chiều dài cây, sinh khối cây 52
  64. Đồ án tốt nghiệp Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%. Dịch nuôi cấy được chia trung hoà về pH=6 bằng NaOH 2N và không trung hoà: . Phần trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. . Phần không trung hoà: Đun 100oC, 80oC, 65oC trong 15 phút. Không đun. Tiến hành khảo sát khả năng nảy mầm của hạt bắp: Hạt bắp được lựa chọn cảm quan với những hạt to khoẻ, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen. Hạt bắp sau đó được rửa bằng các ngâm trong cồn 70 30 giây sau đó rửa lại bằng nước cất. Hạt được cảm nhiễm nấm Fusarium sp. Với diện tích 1cm2 tản nấm trên 1 gam hạt. Chủng vi khuẩn được tăng sinh trong erlen sau đó cho hạt bắp và ngâm trong mỗi nghiệm thức trong 30 phút NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. 53
  65. Đồ án tốt nghiệp NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt không ngâm NT11: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Đất Tribat được mua tại vườn cây cảnh sau đó được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút để loại bỏ vi khuẩn, nấm lẫn trong đất. Sau đó đất được chia ra từng li với lượng đất bằng nhau, gieo mỗi cốc 3 hạt với mỗi nghiệm thức trồng 36 hạt. Canh thời gian nảy mầy của hạt, tính tỉ lệ nảy mầm, sinh khối, thân, lá, rễ so sánh với hạt ngâm trong nước và hạt không ngâm. 54
  66. Đồ án tốt nghiệp 2.3.9. Ứng dụng sử dụng dịch nuôi cấy bảo quản hạt bắp Hạt bắp Khử trùng bề mặt bằng cồn Ngâm trong dịch nuôi cấy 30 phút Để khô ở nhiệt độ phòng Huyền phù nấm 2 Chai thuỷ tinh 100ml mốc 10 bào tử Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt bắp được lựa chọn cảm quan, mẩy, không bị tổn thương vật lí, lá mầm không bị đen, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g bắp, sẽ được ngâm trong 100ml dịch nuôi cấy được chuẩn bị như sau: NT1: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT2: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 100oC trong 15 phút. NT3: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. 55
  67. Đồ án tốt nghiệp NT4: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 80oC trong 15 phút. NT5: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT6: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, đun 65oC trong 15 phút. NT7: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy trung hoà, không đun. NT8: Hạt ngâm trong dịch nuôi cấy không trung hoà, không đun. NT9: Hạt ngâm trong nước NT10: Hạt ngâm trong dịch Carbenzim 0,15%. Sau khi ngâm 30 phút, hạt sẽ được để khô. Cảm nhiễm bằng 0,1ml huyền phù nấm chứa 1cm thạch nấm trong 100ml nước muối bổ sung Tween 80 0,2% trên 1 gam hạt. Sau đó tiến hành quan sát. 56
  68. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Khảo sát sinh lý, sinh hóa và tính thuần của chủng Lactobacillus sp. L5 Chủng Lactobacillus sp. L5 được lấy từ ống giống khoa CNSH – TP – MT, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Đã được sử dụng và nghiên cứu qua các đồ án tốt nghiệp cho thấy chúng có khả năng kháng nấm. Nên người thực hiện đề tài đã sử dụng chúng vi khuẩn LAB này sử dụng cho đề tài. Để khẳng định tính thuần, sinh enzyme ngoại bào người thực hiện đề tài đã hoạt hoá từ ống giống bảo quản lạnh đông và kiểm tra một số đặc điểm thường có của chủng Lactobacillus sp. L5 để đề tài được thực hiện với độ tin cậy cao. 3.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên đĩa MRS Agar Hình 3.1: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 trên đĩa MRS Agar (Trái) và khuẩn lạc quan sát dưới kín hiển vi (phải). Kết quả: Khuẩn lạc Lactobacillus sp. L5 có hình tròn bóng lồi, bờ đều, màu trắng đục. 57
  69. Đồ án tốt nghiệp 3.1.2. Hình thái tế bào Nhuộm Gram: Hình 3.2: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm Gram. Kết luận: Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 là vi khuẩn Gram dương do bắt màu tím dưới thuốc thử bổ sung, hình que, có thể đứng đơn lẻ hay theo cụm hay chuỗi. Nhuộm bào tử: Hình 3.3: Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau nhuộm bào tử. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 bắt màu hồng do thuốc thử bổ sung và do không sinh bào tử. 58
  70. Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. Thử nghiệm Catalase Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của L5, Đối chứng âm vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 trong nước cất, Thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. Kết quả thử nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không có khả năng sinh catalase. Thử nghiệm được so sánh với chủng vi khuẩn Bacillus spp. 3.1.4. Khả năng di động Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy. 59
  71. Đồ án tốt nghiệp Khi ta ủ vi khuẩn sau 24 giờ ở 37oC, do ống nghiệm được bịt kín nên nếu có khí sinh ra sẽ đẩy phần thạch trồi lên so với đáy ống. Hình 3.5: Khả năng di động của chủng Lactobacillus sp. L5 (A: ĐC Bacillus spp.; B: Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ). Kết quả: Chủng Lactobacillus sp. L5 không lan rộng chỉ tăng sinh khôi theo đường cấy và không sinh hơi so với đối chứng chủng Bacillus spp. mọc lan và sinh hơi đẩy thạch lên cao so với thử nghiệm. 60
  72. Đồ án tốt nghiệp 3.1.5. Hàm lượng acid tổng Để thử nghiệm môi trường khảo sát kháng nấm tốt, người thực hiện đề tài tiến hành thử nghiệm xác định hàm lượng acid tổng để khẳng định chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid lactic cao, có hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 37oC trong 24 giờ. Bảng 3.1: Hàm lượng % acid lactic của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Chủng % Acid tổng trung bình OD hiệu chỉnh trung bình Lactobacillus sp. L5 1,3 2,3 3.1.6. Khả năng lên men đường Theo cơ chế trao đổi chất, LAB có thể thuộc nhóm lên men đồng hình hoặc nhóm lên men dị hình. Đối với lên men đồng hình, acid lactic là sản phẩm duy nhất theo con đường đường phân, đối với lên men dị hình vì sử dụng con đường 6- phosphogluconate/phosphoketolase vì thế thì ngoài acid lactic còn có CO2. Như vậy, khi lên men nếu chỉ sinh acid, không sinh khí thì LAB thuộc nhóm lên men đồng hình. Ngược lại nếu cả acid và khí tạo thành LAB thuộc nhóm lên men dị hình. Các chủng LAB khác nhau có khả năng lên men các con đường khác nhau.Kết quả lên men các loại đường cho thấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng lên men đồng hình đường Saccarose, Glucose, lên men dị hình Lactose và không có khả năng lên men Xylose. Chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng lên men Saccarose, Glucose, Lactose và không có khả năng lên men Xylose. 61
  73. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 Loại đường Saccarose Lactose Glucose Xylose Kết quả + + + - Hình 3.6: Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp. L5 3.1.7. Thử nghiệm Chitinase Hình 3.7: Thử nghiệm chitinase của chủng Lactobacillus sp. L5 62
  74. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả kháng nấm trực tiếp, người thực hiện đề tài thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào gồm chitinase và protease. Kết quả cho thấy chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng phân giải chitin sau khi gia nhiệt ở 100C, 80C, 65C. 3.1.8. Thử nghiệm Protease Hình 3.8: Thử nghiệm protease của chủng Lactobacillus sp. L5 Từ kết quả kháng nấm trực tiếp, người thực hiện đề tài thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào gồm chitinase và protease. Kết quả cho thấy chủng Lactobacillus sp. L5 có khả năng phân giải protease sau khi gia nhiệt ở 100C, 80C, 65C. Kết luận: Như vậy qua các kết quả trên người thực hiện đề tài khẳng định giống Lacotbacillus sp. L5 thuần khiết, sinh enzyme ngoại bào Chitinase, Protease, âm tính với Catalase, không di động, sinh acid lactic phù hợp cho các thí nghiệm của đề tài. 63
  75. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Định tính và định lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5. Basavaraj M. Kuraber và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về khả năng sinh IAA của các chủng để kích thích khả năng sinh trưởng và phát triển của các loại hạt. Người thực hiện đề tài đã kiểm tra khả năng sinh IAA trong dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây. Hình 3.9: Dịch nuôi cấy sau ly tâm đổi màu khi cho thuốc thử so với ĐC. Bảng 3.3: Kết quả biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ IAA. Thể tích IAA 100m/l (ml) 0 5 10 15 20 25 Thể tích môi trường MRS 100 95 90 85 80 75 Nồng độ IAA (µg/ml) 0 5 10 15 20 25 Số đo 0D 530 0 0.156 0.258 0.423 0.540 0.653 64
  76. Đồ án tốt nghiệp ĐƯỜNG CHUẨN IAA 0.7 0.6 y = 0.0262x + 0.011 R² = 0.9964 0.5 0.4 0.3 OD530nm 0.2 0.1 0 0 5 10 15 20 25 30 Nồng độ IAA ( µg/ml) Hình 3.10: Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (μg/ml) Sau khi đo quang dịch nuôi cấy của chủng Lactobacillus sp. L5 và đường chuẩn tính được nồng độ IAA có trong dịch nuôi cấy sau 24 giờ là 3,1 μg/ml. Như vậy chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng sinh IAA. 3.2 Khảo sát khả năng phát triển của các chủng nấm Fusarium sp.: Nấm Fusarium sp. Là loại nấm có nhiều trong đất tự nhiên, phát triển mạnh, gây hại cho rễ cây như bắp, cà chua, hồ tiêu. Chúng có thể xuất hiện ở hạt gây ngộ độc cho các loại gia súc khi ăn phải. Trong khi đó đã có nhiều đề tài sử dụng chủng LAB kháng các loại nấm Aspergillus spp. trong các đề tài tốt nghiệp trước nên người thực hiện đề tài chọn chủng nấm mốc Fusarium sp. Để tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5. Sau khi lấy chủng nấm mốc người thực hiện đề tài đã tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng nấm mốc trên môi trường PDA, MRA Agar cải tiến, quan 65
  77. Đồ án tốt nghiệp sát hình thái, bào tử nấm để khẳng định chủng nấm thuần, không bị tạp nhiễm bởi các loại nấm khác. Môi trường thử nghiệm là MRS Agar cải tiến (không bổ sung Ammonium Citrate) đây là môi trường thích hợp vì đáp ứng yêu cầu cho thử nghiệm hoạt tính kháng nấm vi khuẩn phát triển tốt và thành phần môi trường không làm ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm mốc, thích hợp để khảo sát hoạt tính kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Bảng 3.4: Đường kính phát triển của chủng nấm mốc Fusarium sp. Môi trường MRS cải tiến PDA Đường kính tản nấm (mm) 62,3 ± 0,5 59,5 ± 0,6 Hình 3.11: Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Fusarium sp. trên môi trường MRS Agar cải tiến và PDA sau 3 ngày. Nấm Fusarium sp. được phân biệt dựa vào hình dạng sợi nấm tới xốp, màu sắc hệ sợi nấm trắng, màu sắc mặt dưới của tản nấm màu vàng nhạt. Đây là sắc tối chính, 66
  78. Đồ án tốt nghiệp tập trung ở giữa tản nấm, còn xung quanh tản nấm có màu tương đương với sắc tố chính nhưng nhạt hơn. Hình 3.12: Hình thái sợi nấm và bảo tử nấm mốc Fusarium sp. dưới kính hiển vi Kết quả từ bảng 3.3 và hình 3.11, 3.12 cho thấy, sau 3 ngày ủ ở nhiệt độ phòng trên môi trường PDA nấm phát triển tốt không tạp nhiễm các loại nấm khác và sau khi chấy chuyền qua môi trường MRS Agar cải tiến chủng nấm mốc Fusarium sp. phát triển bình thường, đường kính trung bình là 62,3 ± 0,5mm trên môi trường MRS Agả cải tiến và 59,5 ± 0,6 trên môi trường PDA. Thích hợp để tiến hành các thí nghiệm khảo sát. 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp.: Sau khi tiến hành quan sát hình thái, nhuộm Gram, thử nghiệm các phản ứng sinh hoá đối với chủng vi khuẩn lactic và bước đầu khẳng định đó là chủng Lactobacillus sp. L5 , người thực hiện đề tài tiến hành khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 với chủng nấm mốc Fusarium sp. nhằm khẳng định vi khuẩn có khả năng sản sinh hợp chất kháng nấm. Đối chứng dương sử dụng là thuốc trừ nấm Carbenzim 0,15% là thuốc trừ nấm phổ rộng và có 67
  79. Đồ án tốt nghiệp đặc tính lưu dẫn. Thuốc hấp thụ qua rễ và lá để đi vào bên trong cây. Thuốc ngăn cản quá trình hình thành cơ quan xâm nhiễm của mầm bệnh (germ tubes, appressoria, mycelia) tế bào của nấm mốc. Bảng 3.5: Tỉ lệ ức chế (%) chủng nấm mốc Fusarium sp. của Lactobacillus sp. L5. Chủng nấm Fusarium sp. Đối chứng Carbenzim 0,15% 64,7 Lactobacillus sp. L5 61,4 Hình 3.13: Khả năng ức chế nấm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 đối với nấm mốc Fusarium sp. Kết quả từ bảng 3.4 và xử lý Excel từ hình 3.13 cho thấy, dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ đối kháng cao khá cao là 61%, khả năng kháng này tuy không cao hơn so với đối chứng dương Carbenzym 0,15%. Nhưng cũng cho thấy đây là tiềm năng khi kháng nấm bằng chủng Lactobacillus sp. L5. 68
  80. Đồ án tốt nghiệp 3.4. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 sau gia nhiệt. Để bảo quản hạt hay thúc đẩy khả năng nảy mầm của hạt. Chúng ta cần biết được độ pH hay số lượng vi khuẩn có trong dịch còn sống hay đã chết. Cho nên người thực hiện đề tài đã tiến hành khảo sát kháng nấm trong điều kiện invitro với các mốc gia nhiệt ở 100oC, 80oC và 65oC trong 15 phút và trung hoà pH = 6 và không trung hoà pH. Khảo sát khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn sau khi gia nhiệt trung hoà pH = 6 và không trung hoà pH. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của các mức xử lí nhiệt sau 15 phút đến tỉ lệ ức chế Fusarium sp. Nghiệm thức Trung hoà KTH Carbenzim 0,15% ĐC(-) MT 7,5f ± 5,4 5f ± 3,7 - Không đun 57,2a ± 3 50,9b ± 1,6 60,7a ± 0,6 Đun 65C 49,6d ± 2,7 43,8c ± 3,7 61,3a ± 1 Đun 80C 34,3f ± 2,8 20,3bc ± 2,3 61,4a ± 0,4 Đun 100C 17e ± 4,9 10,7e ± 3,4 60,5a ± 1,2 69
  81. Đồ án tốt nghiệp ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ ĐỘ XỬ LÝ NHIỆT DỊCH NUÔI CẤY LACTOBACILLUS SP. L5 LÊN KHẢ NĂNG KHÁNG FUSARIUM SP. (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 Đun 100 Đun 80 Đun 65 Không đun Môi trường Trung hoà K TH Carbenzim Hình 3.14: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 lên khả năng kháng Fusarium sp. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVAvà phần mềm Excel từ bảng và hình cho thấy: Tỉ lệ ức chế chủng nấm Fusarium sp. ở thí nghiệm không đun trung hoà pH và không đun không trung hoà cho kết quả đối kháng cao gần như tương đương với đối chúng Carbenzim, cụ thể tỉ lệ kháng của NT không đun, trung hoà p H là 57,2%, không đun không trung hoà là 50,9% và đối chứng Carbenzim 0,15%, là 60,7%. Khi đun ở 65oC trung hoà và không trung hoà tỉ lệ kháng có giảm nhưng không đáng kể so với đối chứng Carbenzim 0,15% là 49,6%, 43,8% và 61,3%. Tuy nhiên khi đun ở 80oC và 100oC trung hoà và không trung hoà thì tỉ lệ kháng nấm Fusarium sp. giảm rõ rệt cụ thể ở 100oC trung hoà là 17%, không trung hoà là 10,7%. Ở 80oC trung hoà là 34,3%, không trung hoà chỉ còn 20.3%. Có sự khác biệt so với đối chứng carbenzim. Người thực hiện đề tài cũng đã thử ảnh hưởng của môi 70
  82. Đồ án tốt nghiệp trường nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 có ảnh hưởng tới sự kháng nấm mốc không, kết quả chỉ kháng 5 – 7% so với đối chứng là 60,7% của Carbenzim. Như vậy người thực hiện đề tài thấy rằng khi gia nhiệt ở các mức nhiệt 65oC, 80oC và 100oC, tỉ lệ kháng giảm dần. So với kết quả kháng nấm Aspergillus sp. CĐP1 của Bích Trâm (2016) thì tỉ lệ kháng là 65.85%, sau khi gia nhiệt tỉ lệ kháng giảm còn 33.54%; chứng tỏ tác nhân kháng nấm là có thể là protein, có thể enzyme ngoại bào. Tuy nhiên enzyme ngoại bào bị bất hoạt khi gia nhiệt lên cao. Hình 3.15: Khả năng ức chế nấm của chủng Lacotbacillus sp. L5 sau khi gia nhiệt. (I: Không gia nhiệt; II: Đun 100oC; III: Đun 80oC; IV: ĐUN 65oC) 71
  83. Đồ án tốt nghiệp 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với sự phát triển của hạt bắp. 3.5.1. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới thời gian nảy mầm. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới thời gian nảy mầm. THỜI GIAN NẢY MẦM (Giờ) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 72-74 70-72 Nước cất 72-73 68-71 Đun 100, TH 70-72 68-71 Đun 100, KTH 70-72 68-71 Đun 80, TH 71-73 70-72 Đun 80, KTH 71-73 71-72 Đun 65, TH 71-73 71-72 Đun 65, KTH 74-75 72-73 K Đun, TH 74-75 71-73 K Đun, KTH 74-75 72-73 72
  84. Đồ án tốt nghiệp THỜI GIAN NẢY MẦM 76 (Giờ) 74 72 70 68 66 64 62 CN KCN Hình 3.16: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy trước và sau gia nhiệt đối với thời gian nảy mầm của hạt bắp. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVAvà phần mềm Excel từ bảng 3.7 và hình 3.16 cho thấy: Dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tới thời gian nảy mầm của hạt nhưng không đáng kể. Ở thí nghiệm đun 100oC cho thời gian nảy mầm từ 68-70 giờ sau khi gieo tương đương với đối chứng dương và âm là carbenzim và nước, và thời gian nảy mầm tăng dần KHI sự gia nhiệt giảm dần. Khi đun ở 80oC thời gian nảy mầm của hạt tăng lên khoảng từ 70-71 giờ sau khi gieo, nhiều hơn không đáng kể so với đối chứng. Khi gia nhiệt ở 65oC và không gia nhiệt thì thời gian nảy mầm tương đương nhau và lâu hơn so với đối chứng carbenzim, nước khoảng từ 71-74 giờ sau khi gieo. 73
  85. Đồ án tốt nghiệp Người thực hiện đề tài cũng đã thử ảnh hưởng thời gian nảy mầm của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L5 khi đối kháng nấm mốc bằng cách cảm nhiễm nấm vào hạt trước khi gieo, kết quả cho thấy nấm mốc làm cho thời gian nảy mầm của hạt chậm hơn khoảng 1-3 giờ so với hạt không nhiễm nấm. Như vậy người thực hiện đề tài thấy rằng khi gia nhiệt ở các mức nhiệt 100oC, 80oC và 65oC, thời gian nảy mầm giảm dần, chứng tỏ tác nhân ảnh hưởng đến thời gian nảy mầm là enzyme ngoại bào. 3.5.2. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới tỉ lệ nảy mầm. TỈ LỆ NẢY MẦM (%) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 70 70 Đối chứng (-) 81,48 83,24 Đun 100, TH 81,4 85,2 Đun 100, K TH 78,3 85,2 Đun 80, TH 70,4 76,8 Đun 80, K TH 74,27 85,2 Đun 65, TH 81,48 85,18 Đun 65, K TH 74,27 85,2 K Đun, TH 81,4 79,6 Không đun, K TH 81,48 88,89 74
  86. Đồ án tốt nghiệp TỈ LỆ NẢY MẦM 100 (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CN Không CN Hình 3.17: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới tỉ lệ nảy mầm. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.8 và hình 3.17 cho thấy: Khi ngâm với Carbenzim tỉ lệ nảy mầm của hạt bị ức chế cho nên Carbenzim đã ảnh hưởng không tốt đến quá trình nảy mầm của hạt bắp. Trong khi đó ở các nghiệm thức khác lại cho tỉ lệ nảy mầm là tương đối đồng đều và có phần tốt hơn so với carbenzim. Và cao nhất là nghiệm thức không đun, không trung hòa là 88.9% cao hơn so với carbenzim (70%). Tuy nhiên ở các nghiệm thức có cảm nhiễm nấm tỉ lệ nảy mầm thấp hơn so với các nghiệm thức không cảm nhiễm nấm. Ví dụ như ở nghiệm thức đun 65oC trung hoà không cảm nhiễm nấm có tỉ lệ nảy mầm là 85,2% trong khi đó khi cảm nhiễm nấm giảm 11% phần trăm chỉ còn 74,3% nhưng vẫn cao hơn đối chứng Carbenzim là 70%. 75
  87. Đồ án tốt nghiệp Ở giai đoạn này nấm chưa có tác động cụ thể đến rễ cây nên kết quả chưa xác định cụ thể được nên người thực hiện đề tài tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của Lactobacillus sp. L5 đối với chủng nấm mốc Fusarium sp về chiều cao cây, chiều dài rễ và sinh khối tươi của cây bắp ở các nghiệm thức khác nhau. 3.5.3. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều cao. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đối với chiều cao của cây bắp ngày 7. CHIỀU CAO CÂY (mm) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 170i ± 10 180,7i ± 5,8 Nước cất 192,3fgh ± 2,5 195,7efgh ± 4,6 Đun 100, TH 246b ± 3 255,3a ± 5 Đun 100, KTH 227,3d ± 4 238c ± 2 Đun 80, TH 234,7cd ± 3,2 247,3c ± 4 Đun 80, KTH 228,7d ± 1,5 238c ± 3 Đun 65, TH 198ef ± 2,6 202e ± 5,6 Đun 65, KTH 190hg ± 7,5 197,3efg ± 3,2 K Đun, TH 191,3fhg ± 1,5 194efgh ± 4,4 K Đun, KTH 188,3h ± 3,1 189,7h ± 4,9 76
  88. Đồ án tốt nghiệp CHIỀU CAO CÂY SAU 7 NGÀY 300 250 (mm) 200 150 100 50 0 CN KCN Hình 3.18: Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới chiều cao cây bắp sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.10 và hình 3.19 cho thấy: Dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tích cực đến khả năng tăng chiều cao cây, đặc biệt là đối với dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ tăng chiều cao rõ rệt nhất 255mm so với carbenzim (195mm) và nước (180mm). Chiều cao cây giảm sau khi cảm nhiễm nấm với tỷ lệ trung bình là 8mm. Số liệu sau khi được xử lí thông kê cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, dịch nuôi cấy không gia nhiệt, khả năng ức chế nấm và khả năng phát triển chiều cao cây là tương đương nhau, xếp hạng xấp xỉ và cao hơn so với nước và carbenzim. 77
  89. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.19: Chiều cao cây NT THKCN sau 7 ngày. Hình 3.20: Chiều cao cây NT THCN sau 7 ngày. 78
  90. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21: Chiều cao cây ở NT KTHKCN sau 7 ngày Hình 3.22: Chiều cao cây ở NT THKCN sau 7 ngày 79
  91. Đồ án tốt nghiệp 3.5.4. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới chiều dài rễ Bảng 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới rễ sau 7 ngày CHIỀU DÀI RỄ (mm) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 170edf ± 2 180,3d ± 2,1 Nước cất 83,7j ± 4,2 84,3j ± 1,5 Đun 100, TH 192bc ± 6,5 204a ± 10,1 Đun 100, KTH 187,7c ± 5,1 198,3ab ± 2,5 Đun 80, TH 179,3ed ± 3,5 195,3b ± 6 Đun 80, KTH 176edf ± 4,6 180d ± 3,6 Đun 65, TH 165g ± 3,6 171gf ± 4,6 Đun 65, KTH 156,7h ± 5,7 172,3ef ± 4,6 K Đun, TH 86j ± 3,6 94,3i ± 1,5 K Đun, KTH 87,7ij ± 2,1 94,3i ± 0,6 80
  92. Đồ án tốt nghiệp CHIỀU DÀI RỄ SAU 7 NGÀY 250 (mm) 200 150 100 50 0 CN KCN Hình 3.23: Đồ thị thể hiện chiều dài rễ ở các nghiệm thức sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.11 và hình 3.24 cho thấy: Dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ảnh hưởng tích cực đến khả năng phát triển rễ, cao nhất là dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ tăng chiều là 204 mm, tăng trung bình khoảng 25 mm so với carbenzim và 120 mm so với nước. Chiều dài rễ giảm sau khi cảm nhiễm nấm với tỷ lệ trung bình là 9 mm. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, khả năng ức chế nấm và khả năng phát triển rễ là tương đương nhau nhưng khi gia nhiệt càng cao thì khả năng tăng trưởng càng tốt. 81
  93. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.24: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THKCN sau 7 ngày. Hình 3.25: Chiều dài rễ cây bắp ở NT THCN sau 7 ngày. 82
  94. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.26: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTH KCN sau 7 ngày. Hình 3.27: Chiều dài rễ cây bắp ở NT KTHCN sau 7 ngày. 83
  95. Đồ án tốt nghiệp 3.5.5. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tới sinh khối tươi. Bảng 3.11: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy tới sinh khối tươi sau 7 ngày. SINH KHỐI TƯƠI (mg) Nghiệm thức Cảm nhiễm Không CN Carbenzim 897,4j ± 11,5 987,4j ± 35,2 Nước cất 1131,3hi ± 55,2 1220hg ± 70 Đun 100, TH 1810cd ± 60,8 2560a ± 45,8 Đun 100, KTH 1781d ± 47,1 2173,3b ± 76,4 Đun 80, TH 1536,7e ± 51,3 2103,3b ± 23,1 Đun 80, KTH 1570g ± 26,5 1876,7c ± 45,1 Đun 65, TH 1263,3g ± 95 1490ef ± 75,5 Đun 65, KTH 1296,7g ± 57,7 1520ef ± 34,6 K Đun, TH 1166,7hi ± 49,3 1433,3f ± 34,6 K Đun, KTH 1106,7i ± 49,3 1300g ± 34,6 84
  96. Đồ án tốt nghiệp SINH KHỐI TƯƠI 3000 (mg) 2500 2000 1500 1000 500 0 Cảm nhiễm Không CN Hình 3.28: Biểu đồ thể hiện sinh khối tươi của cây ở các NT sau 7 ngày. Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.12 và hình 3.29 cho thấy: Sinh khối tươi của cây sau khi ngâm dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tốt hơn so với carbenzim và nước, cao nhất là dịch đun 100oC trung hòa cho tỷ lệ sinh khối tươi là 2560 mg, cho sinh khối tươi nhiều hơn so với nước (1220 mg) và carbenzim (987.4 mg). Sinh khối tươi sau khi cảm nhiễm nấm sẽ có sự chênh lệch không đáng kể với khi chưa cảm nhiễm với tỷ lệ trung bình là 310 mg. Kết quả sau khi sau xử lý số liệu cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100oC, trung hòa xếp hạng cao nhất và hơn hẳn so với nước và carbenzim với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, khả năng ức chế nấm tương đương nhau và khả năng tăng sinh khối tươi tăng khi gia nhiệt lên cao, tác nhân ức chế nấm và kích thích sinh trưởng ngoài enzyme còn có tác nhân khác cần tìm hiểu. 85
  97. Đồ án tốt nghiệp 3.5.6. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ của cây. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến độ khoẻ mầm sau 7 ngày Độ khoẻ của mầm N7 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Carnbenzim 280,4f ± 9,1 291e ± 4,5 Nước cất 194,3j ± 1,9 228,2i ± 4,9 Đun 100, TH 357b ± 4,9 374,4a ± 9,4 Đun 100, K TH 292,2e ± 1,4 355,6b ± 2,1 Đun 80, TH 337,4c ± 4,3 360,8b ± 4,2 Đun 80, KTH 284,9ef ± 3,9 340,7c ± 0,8 Đun 65, TH 255,6g ± 3,1 304d ± 8,2 Đun 65, KTH 244h ± 6,2 301,3d ± 1,6 Không đun, TH 195,2j ± 3,5 235i ± 2,5 Không đun, K TH 194,3j ± 3,2 231,5i ± 4,2 86
  98. Đồ án tốt nghiệp 400 70 350 60 300 50 250 40 200 30 150 100 20 Tỉ lệ lệ Tỉ (%) chế ức Độ khỏe khỏe Độ của mầm 50 10 0 0 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Tỉ lệ đối kháng (%) 400 70 350 60 300 50 250 40 200 150 30 100 20 Độ khỏe mầm khỏe Độ mầm 50 10 lệ Tỉ (%) chế ức 0 0 Cảm nhiễm Không cảm nhiễm Tỉ lệ đối kháng (%) Hình 3.29: Đồ thị biểu thị độ khoẻ của mầm cây bắp sau 7 ngày Kết quả sau khi xử lý số liệu trên ANOVA và phần mềm Excel từ bảng 3.9 và hình 3.18 cho thấy: Độ khỏe của mầm sau khi ngâm dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 tốt hơn so với nước (100%) và đối với hạt đã cảm nhiễm nấm thì tỷ lệ trung bình giảm 87
  99. Đồ án tốt nghiệp 19% so với chưa cảm nhiễm. Mầm khỏe nhất khi ngâm trong dịch đun 100C, trung hòa (197.7%), tốt hơn so với nước 92.7%. So với dịch không đun thì tốt hơn (67%) nhưng khả năng kháng nấm thì giảm 41%. Sau khi xử lí số liệu cho thấy, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt 100C, trung hòa xếp hạng cao hơn so với nước, với độ tin cậy là 95%. Ngoài ra, dịch nuôi cấy sau khi gia nhiệt tuy hoạt tính kháng nấm giảm nhưng vẫn có khả năng ức chế và lại kích thích tăng trưởng cho cây, ngoài tác nhân kháng nấm và kích thích tăng trưởng là enzyme còn có tác nhân kháng cần phải tìm hiểu. 88
  100. Đồ án tốt nghiệp 3.6. Ứng dụng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 trong bảo quản hạt. Thí nghiệm này nhằm xác định thời gian kháng nấm tối đa ở các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 đối với nấm Fusarium sp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.30: Bảng 3. 13: Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 ở các nghiệm thức ứng dụng bảo quản hạt bắp. Ngày 1 3 5 7 10 14 21 Nhày bắt đầu mọc nấm Carbenzim 0,15% - - - - + ++ ++ 10 ĐC (Nước cất) - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 100, THCN - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 100, KTHCN - + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 Đun 80, THCN - - + ++ +++ ++++ ++++ 5 Đun 80, KTHCN - + + ++ +++ ++++ ++++ 3 Đun 65, THCN - - - - + ++ +++ 10 Đun 65, KTHCN - - - - + ++ +++ 10 K Đun, THCN - - - - + ++ ++++ 10 K Đun, KTHCN - - - - + ++ +++ 10 (+: bắt đầu xuất hiện nấm, ++: nấm mọc tơ trắng; +++ nấm mọc dày tơ dài có màu xanh; ++++ nấm mọc dày khắp bề mặt hạt có màu xanh). 89
  101. Đồ án tốt nghiệp 90
  102. Đồ án tốt nghiệp 91
  103. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.30: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của các nghiệm thức dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 10, ngày 14, ngày 21. Từ trên xuống: ĐC (+) Đối chứng Carbenzim 0,15%, ĐC (-) Đối chứng nước cất, NT 1 100TH, NT2 100KTH, NT3 80TH, NT4 80KTH, NT5 65TH, NT6 65KTH, NT7 KĐTH, NT8 KĐKTH). ĐC (+) Đối chứng Carbenzim: Nấm mốc phát triển sau 10 ngày. ĐC (-) Đối chứng nước cất: Nấm mốc bắt đầu mọc ở ngày thứ 3 và phát triển khá mạnh. 92
  104. Đồ án tốt nghiệp NT1 100TH: Nấm mốc bắt đầu mọc vào ngày 3 và phát triển khá mạnh cho thấy tỉ lệ kháng nấm thấp ứng với thí nghiệm invitro tỉ lệ kháng nấm chỉ 17%. NT2 100KTH: Nấm mốc cũng mọc vào ngày 3 và phát triển mạnh ứng với tỉ lệ đối kháng invitro là 10,7%. NT3 80TH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển từ ngày 5. NT4 80KTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 3. NT5 65TH: Ở nghiệm thức này nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. NT6 65KTH: Nấm mốc mọc và phát triển ở ngày 10. NT7 KĐTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. NT8 KĐKTH: Nấm mốc bắt đầu mọc và phát triển ở ngày 10. Qua kết quả từ bảng 3.13 và hình 3.30 cho thấy khi gia nhiệt lên càng cao tỉ lệ kháng nấm càng giảm. Cụ thể ở NT KĐTH và KĐKTH bảo quản được 14 ngày nhưng khi gia nhiệt lên cao ở 65oC giảm còn 7 ngày, lên 80oC còn 5 ngày và 100oC chỉ đc 3 ngày bằng với đối chứng ngâm nước cất. THẢO LUẬN Từ các kết quả khảo sát khả năng kháng nấm và kích thích tăng trưởng từ chủng Lactobacillus sp. L5, người thực hiện đề tài đề xuất sản xuất chế phẩm sinh học kháng nấm để bảo quảo hạt và chế phẩm vừa kích thích tăng trưởng vừa kháng đc nấm nhằm nâng cao khả năng bảo quản hạt và kích thích tăng trưởng của hạt mà không sử dụng đến các hợp chất hoá học dư lượng trong hạt và ảnh hưởng đến chất lượng của hạt trong sản xuất. 93
  105. Đồ án tốt nghiệp ĐỀ NGHỊ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SP. L5 Mật rỉ Xử lý Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Giống vsv LAB Tiệt trùng Nhân giống trên MRS broth ở 37C Nuôi cấy ở 37C, 24 giờ trong 1 ngày Gia nhiệt ở 65C Phối trộn trong 15 phút Phối trộn Chế phẩm kích Chế phẩm bảo thích nảy mầm hạt quản hạt 94
  106. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 ban đầu được khẳng định là chủng vi khuẩn lactic bằng các biện pháp sinh hoá, sinh lý, hình thái. Chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 được xác định là có khả năng kháng nấm thông qua thí nghiệm đối kháng với chủng nấm mốc Fusarium sp. với tỉ lệ đối kháng trung bình 61%. Dịch nuôi cấy của Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm và khả năng này thay đổi nhưng không đáng kể theo pH, nhưng giảm 35 - 40% khi gia nhiệt 100°C, 20 – 23% ở 80oC và 5 – 7% ở 65oC trong 15 phút. Ứng dụng thành công dịch nuôi cấy trong bảo quản hạt bắp. Ứng dụng thành công dịch nuôi cấy trong thúc đẩy sự phát triển của hạt bắp và ức chế nấm Fusarium sp. gây thối rễ ở cây bắp. 4.2. Kiến nghị Vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm triển vọng vì vậy cần phải được định danh đến cấp loài nhờ API kit hay giải trình tự gene 16S rRNA. Xác định thành phần hoá học có trong dịch nuôi cấy. Xác định chất và hàm lượng có khả năng kích thích sinh trưởng của cây bắp. Sản xuất chế phẩm lỏng Lactobacillus sp. L5 có khả năng kháng nấm và kích thích sinh trưởng cho cây bắp nhằm nâng cao sản lượng và chất lượng. 95