Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp. và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp. và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA CNSH – TP – MP  ĐỒ Á N TỐ T NGHIÊP̣ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM SINH AFLATOXIN CỦA MỘT SỐ LACTOBACILLUS SPP. VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN HẠT CÀ PHÊ Ngành: CÔNG NGHÊ ̣ SINH HOC̣ Chuyên ngành: CÔNG NGHÊ ̣ SINH HOC̣ GVHD : TS. Nguyêñ Hoài Hương Sinh viên thưc̣ hiêṇ : Nguyêñ Phương Uyên Lớp : 13DSH01 MSSV : 1311100113 TP.HCM, tháng 07/2017
2. Đồ á n tốt nghiêp̣ LỜ I CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiêp̣ này là công trı̀nh nghiên cứ u của tôi dướ i sư ̣ hướ ng dâñ của Tiến sı ̃ Nguyêñ Hoài Hương khoa Công nghê ̣sinh hoc̣ – Thưc̣ phẩm – Môi trường của trường Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣Thành Phố Hồ Chı́ Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứ u khoa hoc̣ khác dướ i bất kỳ hı̀nh thứ c nào. Tp. Hồ Chı ́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thưc̣ hiêṇ Nguyêñ Phương Uyên
3. Đồ á n tốt nghiêp̣ LỜ I CẢ M ƠN Đầu tiên, em xin gử i lờ i cảm ơn đến gia đınh̀ em. Cảm ơn bố me ̣đa ̃ nuôi nấng và taọ điều kiêṇ cho em hoc̣ tâp̣ để em có đươc̣ thành quả ngày hôm nay. Cảm ơn anh hai đa ̃ bên canḥ và đông̣ viên em. Trong suốt khoảng thờ i gian hoc̣ taị trườ ng Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı ́ Minh, em đa ̃ đươc̣ các Thầy Cô trong Khoa Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ – Thưc̣ Phẩm – Môi Trườ ng đa ̃ hết lòng hướ ng dân,̃ giúp đỡ em trong quá trı̀nh hoc̣ tâp̣ taị trườ ng, cũng như trong qua trı̀nh thưc̣ hiêṇ đồ án. Em xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy Cô đa ̃ trang bi ̣cho em kiến thứ c để có thể thưc̣ hiêṇ đồ án này. Em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thı́ nghiêṃ và các baṇ cùng khóa đồ án đa ̃ quan tâm, giúp đỡ và taọ điều kiêṇ để em hoàn thành đồ án tốt nghiêp.̣ Đăc̣ biêt,̣ em xin chân thành cảm ơn Tiến sı ̃ Nguyêñ Hoài Hương đa ̃ tâṇ tı̀nh hướng dân,̃ chı̉ bảo em trong suốt quá trı̀nh xây dưng̣ đề cương và thưc̣ hiêṇ đồ án. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hôị Đồng Phản Biêṇ đa ̃ dành thờ i gian đoc̣ và nhâṇ xét đồ án tốt nghiêp̣ này. Em xin gử i đến Thầy Cô lờ i chúc sứ c khỏe. Trong quá trı̀nh làm đồ án, do kinh nghiêṃ còn thiếu và kiến thứ c chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua. Tp. Hồ Chı ́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thưc̣ hiêṇ Nguyêñ Phương Uyên
4. Đồ á n tốt nghiêp̣ MUC̣ LUC̣ DANH MUC̣ VIẾ T TẮ T iv DANH MUC̣ HÌNH Ả NH v DANH MUC̣ BẢ NG vi MỞ ĐẦ U 1 1. Tı́nh cấ p thiết củ a đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 1 3. Mục đích nghiên cứu 2 4. Mục tiêu nghiên cứu 2 5. Nội dung nghiên cứu 2 6. Phương pháp nghiên cứu 3 6.1 Phương pháp luận 3 6.2 Phương pháp xử lý số liệu 3 7. Kết quả đạt đươc̣ 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1 Tổng quan về nấm sợi 4 1.1.1 Giới thiệu chung 4 1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4 1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố 4 1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin 7 1.1.2.3 Độc tố Patulin 7 1.1.2.4 Độc tố Fumonisin 8 1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố 9 1.1.3.1 Phương pháp vật lý học 9 1.1.3.2 Phương pháp hoá học 10 1.1.3.3 Phương pháp sinh học 11 1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 14 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 14 i
5. Đồ á n tốt nghiêp̣ 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 14 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 16 1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn 17 1.2.2.1 Bacteriocins 17 1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác 18 1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic 19 1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 19 1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 21 1.3 Tá c haị củ a nấ m mố c lên haṭ cà phê 22 1.5 Chế biến và bảo quản haṭ cà phê truyền thống 23 1.5.1 Cá c phương phá p bảo quản cà phê thóc: 23 1.5.2 Cá c phương phá p bảo quản cà phê nhân: 25 1.6 Bảo quản haṭ cà phê bằng vi sinh vâṭ 25 CHƯƠNG 2: VÂṬ LIÊỤ VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨ U 27 2.1 Điạ điểm nghiên cứ u 27 2.2 Thời gian thưc̣ hiêṇ 27 2.3 Vâṭ liêụ nghiên cứ u 27 2.3.1 Vâṭ liêụ 27 2.3.2 Hóa chất và môi trường sử dung̣ 27 2.3.2.1 Hóa chất 27 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy 28 2.4. Thiết bị và dụng cụ 28 2.4.1. Thiết bị 28 2.4.2. Dụng cụ 28 2.5 Phương pháp luận 29 2.5.1 Mục tiêu đồ án 29 2.5.2 Nôị dung 29 2.6 Phương phá p nghiên cứ u 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứ u 29 ii
6. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.2 Khảo sá t đăc̣ điểm hı̀nh thá i, sinh hóa cá c chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. 31 2.6.2.1 Nhuộm gram: 31 2.6.2.2 Thử nghiệm Catalase: 32 2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng: 32 2.6.3 Khảo sá t sư ̣ phá t triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 33 2.6.4 Xây dưng̣ đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 34 2.6.5 Khảo sá t khả năng đố i khá ng trưc̣ tiếp của cá c chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 36 2.6.6 Ứ ng dung̣ dicḥ nuôi cấy cá c chủng Lactobacillus spp. trong đố i khá ng nấm mố c Aspergillus sp. HCP2 bảo quản haṭ cà phê 38 CHƯƠNG 3: KẾ T QUẢ VÀ BIÊṆ LUÂṆ 40 3.1 Khảo sá t sinh lý – sinh hóa củ a cá c chủ ng vi khuẩn lactic 40 3.1.1 Hı̀nh thá i khuẩn lac̣ 40 3.1.2 Nhuôṃ Gram 41 3.1.3 Thử nghiêṃ catalase 41 3.1.4 Xá c đinḥ hàm lương̣ acid tổng 42 3.2 Khảo sá t sư ̣ phá t triển củ a chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 45 3.3 Xây dưng̣ đường chuẩn tế bào củ a chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 46 3.4 Khảo sá t khả năng đố i khá ng trưc̣ tiếp củ a cá c chủ ng Lactobacillus spp. vớ i chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 47 3.6 Ứ ng dung̣ dicḥ nuôi cấ y cá c chủ ng Lactobacillus spp. trong đố i khá ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 bảo quản haṭ cà phê 49 CHƯƠNG 4: KẾ T LUÂṆ VÀ KIẾ N NGHI ̣ 60 1. Kết luâṇ 60 2. Kiến nghi ̣ 61 TÀ I LIÊỤ THAM KHẢ O 62 PHU ̣ LUC̣ 1 iii
7. Đồ á n tốt nghiêp̣ DANH MUC̣ VIẾ T TẮ T LAB: vi khuẩn sinh acid lactic ĐC: đối chứ ng TN: thı́ nghiêṃ NT: nghiêṃ thứ c PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth MRS: de Man, Rogosa và Sharpe MRS agar: de Man, Rogosa và Sharpe agar SAS: Statistical Analysis Systems iv
8. Đồ á n tốt nghiêp̣ DANH MUC̣ HÌNH Ả NH Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố 6 Hınh̀ 3.1 Hı̀nh thái khuẩn lac̣ các chủng Lactobacillus spp. 40 trên môi trường MRS Agar 40 Hınh̀ 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tı́m, Gram dương (A) 41 Tế bào E. coli bắt màu hồng, Gram âm (B) 41 Hınh̀ 3.3 Chủng Lactobacillus sp. L3 bắt màu tı́m, Gram dương 41 Hınh̀ 3.4 Chủng vi khuẩn Bacillus spp. phản ứ ng dương tı́nh vớ i catalase, bên trái – Chủng Lactobacillus spp. âm tı́nh vớ i catalase, bên phải (A) 42 Đối chứ ng là nướ c cất phản ứ ng âm tı́nh vớ i catalase, bên trái - Chủng Lactobacillus spp. âm tı́nh vớ i catalase, bên phải (B) 42 Hınh̀ 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L3 theo thờ i gian 43 Hınh̀ 3.6 Acid lactic (%) và giá tri OḌ ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. 44 Hınh̀ 3.7 Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 45 trên môi trường MRS Agar cải tiến 45 Hınh̀ 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 47 Hınh̀ 3.9 Khả năng đối kháng trưc̣ tiếp bằng phương pháp cấy hai đường của các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 49 Hınh̀ 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt 51 Hınh̀ 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải) 54 Các nghiêṃ thứ c: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiêṭ (từ trên xuống dướ i) 54 Hınh̀ 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải) 58 Các nghiêṃ thứ c: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 gia nhiêṭ ở 80oC trong 15 phút (từ trên xuống dướ i) 58 Hınh̀ 3.13 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ và không gia nhiêṭ các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 theo dõi qua từ ng ngày 59 v
9. Đồ á n tốt nghiêp̣ DANH MUC̣ BẢ NG Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 12 Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) 18 Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) 19 Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 20 Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá tri OḌ ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. 43 Bảng 3.2 Số liêụ dưng̣ đườ ng chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 46 Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ứ c chế chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 của các chủng Lactobacillus spp. 48 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g hạt cà phê) 50 Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. gia nhiêṭ 80oC trong 15 phút vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g) 55 vi
10. Đồ á n tốt nghiêp̣ MỞ ĐẦ U 1. Tı́nh cấ p thiết củ a đề tài Vê ̣sinh an toàn thưc̣ phẩm đang là vấn đề xa ̃ hôị cần giải quyết kip̣ thờ i để bảo vê ̣sứ c khỏe con ngườ i. Ở nướ c ta, vớ i đăc̣ điểm khı́ hâụ nhiêṭ đớ i nóng ẩm, đô ̣ ẩm trong không khı́ thường cao, là điều kiêṇ rất thuâṇ lơị cho nấm mốc phát triển, gây nhiêm̃ đôc̣ tố cho thưc̣ phẩm và thứ c ăn chăn nuôi, gây đôc̣ cho ngườ i và gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan ). Tı̀nh trang̣ phơi nhiêm̃ của nấm mốc ảnh hưở ng đến 25% mùa màng trên toàn thế giớ i, làm tổn thất trung bı̀nh 418 triêụ đô và ảnh hưở ng trên gia súc 472 triêụ đô mỗi năm (theo Bô ̣ Nông Nghiêp̣ Mỹ, 2009). Taị Viêṭ Nam, mỗi năm bi ạ ̉nh hưởng khoản 13 – 16% lương̣ nông sản tùy loai.̣ Trướ c thưc̣ trang̣ đó, con ngườ i đa ̃ và luôn tı̀m kiếm những hoaṭ chất sinh hoc̣ vừ a có tác dung̣ kháng nấm, vừ a không gây haị cho cơ thể con ngườ i. Môṭ trong những chủng đươc̣ nghiên cứ u và ứ ng dung̣ nhiều nhất chı́nh là các chủng sinh acid lactic. Vi khuẩn dang̣ này có hoaṭ tı́nh sinh hoc̣ khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diêṭ vi sinh vâṭ có haị và là nguồn vi sinh vâṭ hữu ı́ch, duy trı̀ hê ̣cân bằng vi khuẩn đường ruôt.̣ Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic và vấn đề ngộ độ thực phẩm và hư hại nông sản do nấm mốc gây ra mỗi năm. Đây là lí do chúng tôi chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp. và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê” 2. Tình hình nghiên cứu Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như: - Năm 2005, Johan Schnürer và Jesper Magnusson đa ̃ thưc̣ hiêṇ nghiên cứ u “Sư ̣ kháng nấm ở vi khuẩn lactic là chất bảo quản sinh hoc̣ ”. - “Tiềm năng kháng nấm ở thưc̣ phẩm của vi khuẩn lactic” vào năm 2007 của S. Rouse cùng công̣ sư.̣ 1
11. Đồ á n tốt nghiêp̣ - Rosalia Trias cùng công̣ sư ̣ vào năm 2008 đa ̃ công bố nghiên cứ u “Vi khuẩn lactic từ trái cây và rau củ là tác nhân kiểm soát sinh hoc̣ đối với mầm bênḥ là nấm và vi khuẩn trên cây trồng”. - “Khả năng ứ c chế sư ̣ phát triển của nấm mốc và sản sinh đôc̣ tố mycotoxin bằng hơp̣ chất của vi khuẩn lactic” của Nevena Blagojev cùng công̣ sư ̣ (2011). Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong thuỷ sản, chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm. Ngoài ra, sản phẩm còn chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh. Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải. 3. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic. 4. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp. phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống và thử ứng dụng chúng bảo quản hạt cà phê. 5. Nội dung nghiên cứu Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp. HCP2 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus spp. HCP2 2
12. Đồ á n tốt nghiêp̣ Ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. trong bảo quản haṭ cà phê. 6. Phương pháp nghiên cứu 6.1 Phương pháp luận Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm. Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là hợp chất thứ cấp, sẽ trích ly thu hoạt chất và ứng dụng trong bảo quản đậu phộng đã cảm nhiễm nấm mốc. 6.2 Phương pháp xử lý số liệu Phần mềm Excel để vẽ đồ thị. Phần mềm thống kê SAS 9.4. 7. Kết quả đạt đươc̣ Xác định khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. đối với chủng nấm mốc Aspergillus spp. HCP2 phân lập từ hạt cà phê. Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. nuôi cấy trên môi trường MRS Agar cải tiến. Ứng dụng thành công các dạng sản phẩm khác nhau của vi khuẩn Lactobacillus spp. trong bảo quản hạt cà phê. 3
13. Đồ á n tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm sợi 1.1.1 Giới thiệu chung Nấm (Fungi, số ít là Fungus) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của R.H.Whittaker (1996). Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta) là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology). Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nước, không khí, chuồng nuôi ), chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên do chúng có khả năng phân giải các hợp chất như: cellulose, protein, lipid, chitin Vi nấm (Micro fungi) là những nấm không có mũ nấm và có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Căn cứ vào hình thái, ta chia thành hai loại là nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous fungi) còn được gọi là nấm mốc. 1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp. Theo Nguyễn Thị Hiền (2009), trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loại ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, 15 loại trong số đó gây ung thư. Trong suốt một thời gian dài, chúng ta không chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm của nấm mốc. Cho đến những năm 1960, người ta mới khẳng định con người có thể bị bệnh nếu ăn phải thức ăn nhiễm mốc, dù chỉ với lượng nhỏ. Các loại độc tố chủ yếu được tiết ra bởi 5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm: Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic. 4
14. Đồ á n tốt nghiêp̣ Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và Acid cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon. Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether alternarion. Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà. Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện tổn thương ở gan và thận. Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá. Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thân,̣ ảnh hưởng trưc̣ tiếp lên hê ̣miêñ dich,̣ ăn mòn thành ruôṭ và da ̣dày. Ngoài ra còn có các dấu hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận. Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố. Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều độc tố như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai. Ngoài ra, độc tố nấm mốc còn gây mất cân bằng trong chuyển hoá thức ăn và giảm tỉ lệ sinh sản. Bên cạnh đó, các dẫn xuất của chúng thường độc với hệ thần kinh và gây tổn hại hệ thống cơ cùng rất nhiều hội chứng khác như: Bệnh ngoài da, chứng tăng sừng hoá, sảy thai 5
15. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố 6
16. Đồ á n tốt nghiêp̣ 1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc loài Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 chủng: A.flavus, A.parasiticus và A.nomius. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004). Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong. Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan. Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc. Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao. Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong số các aflatoxin. Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh. 1.1.2.3 Độc tố Patulin Patulin có tên gọi khác là Clavaxin, được biết đến trước tiên như là thuốc có thể chữa trị cảm lạnh. Trong quá trình sử dụng, người ta mới nhận biết được độc tính của patulin. Patulin là hợp chất không màu, kết tinh và tan trong nước, các dung môi phân cực. Người ta tách được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩm dạng hạt và hoa quả. 7
17. Đồ á n tốt nghiêp̣ Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và Bysschchlamys tạo ra. Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A. clavatus, A. giganteus, P. exppansum, P. urticae, P. griceofulvum. Patulin được coi như một độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan đến các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, nghiên cứu đã cho thấy patuilin còn gây thiệt hại cho DNA hay nhiễm sắc thể ở người. 1.1.2.4 Độc tố Fumonisin Trong các độc tố về nấm mốc, mối quan tâm về fumonisin ngày càng tăng cao. Đây là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp. Đây là nhóm độc tính cao với động vật và con người. Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong các fumonisin, chúng có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư cũng đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B – nhóm các hợp chất gây ung thư cho người. Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của fumonisin đến người cũng cho thấy, có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng lương thực nhiễm fumonisin. Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ sphingolopid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin. Các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận. 8
18. Đồ á n tốt nghiêp̣ 1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố 1.1.3.1 Phương pháp vật lý học Làm sach:̣ Trong quá trình xử lý nguyên liệu trước khi đưa vào sử dụng cần loại bỏ bụi, vỏ, tóc và hạt không đạt yêu cầu. Đối với một số loại hạt cần thiết phải rửa sạch trước khi phơi khô. Phân loaị cơ hoc:̣ Quá trình này loại bỏ các hạt nhiễm độc tố Mycotocxin. Giai đoạn này rất quan trọng vì rất có thể việc loại bỏ không hết sẽ đến việc độc tố đi vào thức ăn. Rửa bằng nước hoặc bằng dung dịch Na2CO3 cũng làm giảm nồng độ Mycotocxin trong hạt ngũ cốc. Có thể cho hạt vào nước và loại bỏ những hạt nổi. Phương pháp này cũng có thể loại bỏ Mycotocxin nhưng cần chú ý rằng, có một số hạt nổi nhưng không chứa mycotocxin Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 9
19. Đồ á n tốt nghiêp̣ Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao. Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan- ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg. Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.1.3.2 Phương pháp hoá học Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về 10
20. Đồ á n tốt nghiêp̣ khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin. Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin. Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.1.3.3 Phương pháp sinh học Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật. 11
21. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn Tên vi khuẩn Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Sử dụng các sản phẩm trao Bacillus Aspergillus đổi chất ngoại bào, sinh ra C. Munimbazi và pumilus parasiticus trong quá trình nuôi cấy B. LB.Bullerman, pumilus, ức chế sự phát 1997 triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus Streptomyces sp. tổng hợp Streptomyces Aspergillus được aflastatin A, là hợp Ono. M và cộng sp. parasiticus chất có bản chất là protein, sự, 1997 ức chế 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus A. xylosoxidan tổng hợp Achromobacter Aspergillus Cyclo (L-leucyl-L-prolyl), PS. Yan và cộng xylosoxidans parasiticus là 1 cyclodipeptide, ức chế sự, 2004 sự phát triển và sự tổng hợp aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. Lactobacillus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao I. Chang và JD. 12
22. Đồ á n tốt nghiêp̣ casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra Kim, trong quá trình nuôi cấy L. 2007. casei, ức chế sự phát triển và quá trình tổnghợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. flavus. Bacillus Aspergillus Hợp chất thứ cấp Ting Zang và cộng subtilis B-FS06 flavus sự, 2007. B. subtilis tổng hợp các Bacillus Aspergillus enzyme ngoại bào như R. Thakaew và subtilis flavus protease, chitinase, β-1,3- cộng sự, 2013 glucanase làm ức chế sự phát triển của nấm Asp. flavus. Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta. Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật. Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng. Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau: Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất. Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung. Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất. 13
23. Đồ á n tốt nghiêp̣ Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm. Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất. Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu. Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường. Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng. 1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 35°C. Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 - 10% NaCl. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn. Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài. Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus: Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes 14
24. Đồ á n tốt nghiêp̣ Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillacea Giống: Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus, Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này. Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm: Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium, cófructose- 1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45°C. Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic. Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. 15
25. Đồ á n tốt nghiêp̣ 1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan. Đặc biệt là magie và mangan, vì nó 16
26. Đồ á n tốt nghiêp̣ tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn 1.2.2.1 Bacteriocins Đa số các bacteriocin của vi khuẩn LAB có trọng lượng nhỏ ( 30 kDa), có tính thấm nước, không ổn định nhiệt và không được nghiên cứu rộng rãi. Lớp 4: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì còn có thêm chất khác. 17
27. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M. P. Zacharof, 2012) Chủng Bacteriocins Tác động Nisin Vi khuẩn gram dương Lactococcus lactis Clostridium spp. spp. Lacticin 3147 Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus dysgalaciae Enterococcus feacalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans L. acidphilus spp. Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương Pediococcus L. plantarum spp. Plantaricin EF, Plantaricin W, Carnobacteria Plantaricin JK, Plantaricin S Clostiridia Propionobacteria Leuconostoc Listeria monocytogenes gelidum Leucocin A Enterococcus feacalis L. casei spp. Lactocin 705 Listeria monocytogenes 1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác Các vi khuẩn sinh acid lactic còn có khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngoài bacteriocins. 18
28. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưở ng Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối Acid acetic rửa Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong H2O2 thức ăn giàu protein Hệ thống lactoperoxidase với H2O2 Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa) Lysozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic 1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu. Hoạt động kháng nấm của L. coryniformis ổn định khi bị ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L. plantarum và L. sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti 19
29. Đồ á n tốt nghiêp̣ và cộng sự năm 1998). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic. Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đươc̣ xác định Nguồn sản xuất Lactobacillus plantarum 4-hydroxy-phenyllacticacid 3-phenyllacticacid 21B 3 -hydroxydecanoicacid 3 - hydroxydodecanoicacid 3- Lactobacillus plantarum hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – MILAB14 Cyclo(Glyd d i-Leu) id methylhydantoin Lactobacillus plantarum mevalonolactone VTTE-78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- Lactibacillus and n- valeric acid. sanfranciscensis CB1 Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996) Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996). 20
30. Đồ á n tốt nghiêp̣ Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, 1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối. Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm. Trong bảo quản thực phẩm, có rất nhiều phương pháp được sử dụng, chẳng hạn như gia nhiệt, thay đổi pH, sử dụng các chất hoá học Các phương pháp này đều được ghi nhận là có hiệu quả cao, tuy nhiên lại gây ảnh hưởng đến môi trường, sức khoẻ con người. Các bacteriocins của vi khuẩn lactic có thể ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong 21
31. Đồ á n tốt nghiêp̣ bảo quản sinh học, đặc biệt là trong bảo quản thực phẩm do chúng có độ an toàn và có hoạt tính cao (José Luis Parada, 2007). Chẳng hạn như Lacticin 3147 ức chế vi khuẩm gram dương và ngăn cản sự phát triển các vi khuẩn không mong muốn trong phô mai, Pediocin PA-1 có khả năng ức chế Listeria spp., Nisin có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và đây cũng là bacteriocin thương mại duy nhất được FDA cho phép sử dụng, Nisaplin – một dạng sản phẩm chứa 2,5% Nisin được sử dụng ở hơn 50 quốc gia trong bảo quản thực phẩm. Một dạng chế phẩm từ bacteriocins của vi khuẩn lactic là BioProfit gồm Lactobacillus rhamnosus LC 705 và Propionibacterium freudenreichii JS dùng để bảo quản các loại thực phẩm từ sữa (Khurana và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, các bacteriocins lại không có tác dụng cao khi được sử dụng riêng lẻ, chính vì thế mà cần có các kỹ thuật hay kết hợp với các chất khác để làm tăng hoạt tính của chúng. Chẳng hạn như Sodium acetate hay Sodium lactate sẽ làm tăng hoạt tính của bacteriocin Lactocin 705 (José Luis Parada, 2007). Một trong những ứng dụng hiện đang được chú ý của bacteriocins từ vi khuẩn lactic đó chính là tạo bao bì sinh học, bảo vệ thực phẩm khỏi các nguy cơ gây hư hỏng (José Luis Parada, 2007). Các bacteriocins sẽ dần được giải phóng trên bề mặt màng bao và thực hiện chức năng sinh học của mình. Có rất nhiều cách để tổng hợp bao bì sinh học từ bacteriocins, chẳng hạn như phun, ngâm hay đóng gói trong các bao bảo quản. Một trong những cách là kết hợp trực tiếp bacteriocin với polymer, chẳng hạn như cho Nisin kết hợp với polymer sinh học. Một cách khác đó chính là tạo lớp màng bao từ bacteriocin hay hấp thụ bacteriocin lên bề mặt màng bao bằng polymer sinh học (Deegan L.H, 2006). 1.3 Tá c haị củ a nấ m mố c lên haṭ cà phê Cũng như các loaị haṭ khác, trái cà phê và haṭ cà phê là đối tương̣ dê ̃ bi ̣nhiêm̃ vi sinh vâṭ các khâu từ khi phát triển đến khi thu hoach,̣ bảo quản và vâṇ chuyển. Hoaṭ đông̣ 22
32. Đồ á n tốt nghiêp̣ của vi sinh vâṭ gây bất lơị cho chất lương̣ và mứ c đô ̣ an toàn của thành phẩm se ̃ phu ̣ thuôc̣ vào điều kiêṇ môi trườ ng tùy theo cách bảo quản haṭ và thành phẩm (L. R. Batista và công̣ sư,̣ 2003) Các nghiên cứ u về vi sinh vâṭ trên trái cà phê và haṭ cà phê đa ̃ chı̉ ra rằng chi nấm mốc chủ yếu sinh ra đôc̣ tố (Aspergillus, Penicillium và Fusarium) là nhân tố gây ô nhiêm̃ tư ̣ nhiên trên cà phê (L. R. Batista và công̣ sư,̣ 2003). Xuất hiêṇ nấm mốc trên cà phê đồng nghıã vớ i viêc̣ loaị bỏ lương̣ cà phê khá lớn để cách ly hoàn toàn phần bi ̣nhiêm̃ nấm và phần không nhiêm̃ nấm để tránh lây lan, đồng thờ i nấm mốc sản sinh ra đôc̣ tố aflatoxin tı́ch tu ̣ trong haṭ cà phê gây nguy hiểm cho ngườ i sử dung̣ nếu không đươc̣ xử lý tốt. 1.5 Chế biến và bảo quản haṭ cà phê truyền thống Có ba cách chế biến cà phê là chế biến khô, chế biến ướ t và chế biến bán ướ t. Tùy thuôc̣ vào cách chế biến thı̀ cà phê thành phẩm se ̃ có mùi, vi ̣khác nhau. Cà phê sau khi chế biến nhưng chưa đươc̣ rang đươc̣ goị là cà phê nhân, nhưng nếu còn phần vỏ trấu thı̀ đươc̣ goị là cà phê thóc. Sau khi chế biến, tùy vào yêu cầu mà cà phê se ̃ đươc̣ rang ngay hoăc̣ đem đi bảo quản. Môi trường bên ngoài có những tác nhân sau ảnh hưở ng đến quá trı̀nh bảo quản cà phê: - Đô ̣ẩm của haṭ cà phê và môi trường xung quanh - Nhiêṭ đô ̣của khối haṭ cà phê và môi trườ ng xung quanh - Đô ̣thông thoáng khı́ bên trong khối cà phê 1.5.1 Cá c phương phá p bảo quản cà phê thóc: Bảo quản khô - Phơi nắng - Sấy bằng không khı́ khô - Sấy bằng không khı́ nóng - Sử dung̣ các hóa chất hút nướ c 23
33. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bảo quản ở trang̣ thái thoáng gió tı́ch cưc̣ Cơ sở của phương pháp bảo quản thoáng gió tích cực là lợi dụng độ hổng của khối hạt cà phê mà quạt không khí khô và mát vào khối hạt nhiều lần, với mục đích làm giảm được nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt cà phê. Không khí thổi vào khối hạt cần đáp ứng các điều kiện sau: - Không khí phải được quạt đều trong toàn bộ khối hạt. - Cần đảm bảo đủ lượng không khí khô và mát để thực hiện được mục đích làm giảm nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt. - Chỉ quạt khi độ ẩm của không khí ngoài trời thấp, nghĩa là sau khi quạt độ ẩm của khối hạt phải giảm xuống. - Nhiệt độ không khí ngoài trời phải thấp hơn nhiệt độ của khối hạt. Bảo quản ở trạng thái nhiệt độ thấp Ở nhiệt độ thấp thì hoạt động sống của hạt cà phê, vi sinh vật, côn trùng đều bị hạn chế. Phương pháp được tiến hành bằng cách quạt không khí lạnh và không khí khô vào khối hạt cà phê. Do độ dẫn nhiệt của hạt cà phê kém nên không khí lạnh được giữ lại trong khối hạt một thời gian dài, hạn chế được các hoạt động sống của hạt cà phê giúp khối hạt cà phê được bảo quản được lâu. Với điều kiện thời tiết ở nước ta thường không áp dụng được phương pháp này, tuy nhiên có thể lợi dụng một số ngày lạnh và khô của mùa đông. Bảo quản kín Bảo quản kín hay còn gọi là bảo quản thiếu hay không có mặt O2. Khi thiếu O2 thì các quá trình hô hấp của các cấu tử sống gần như chấm dứt hoàn toàn, nó chuyển sang hô hấp hiếu khí. Hoạt động sống của các hệ vi sinh vật bị ngừng trệ vì trong khối hạt cà phê chủ yếu là vi sinh vật hiếu khí, trùng bọ bị tiêu diệt. Giảm khí O2 bằng cách có thể bổ sung vào khối hạt một lượng CO2 còn O2 mất đi do quá trình hô hấp của các cấu tử sống trong khối hạt cà phê. 24
34. Đồ á n tốt nghiêp̣ 1.5.2 Cá c phương phá p bảo quản cà phê nhân: Do đặc tính lý học cũng như sinh lý của cà phê nhân thay đổi khác với cà phê thóc nên trong bảo quản cà phê nhân quá trình bất lợi xảy ra nhanh hơn, độ bền bảo quản kém hơn cà phê thóc vì lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa có tính chất bảo vệ bị bóc đi, hạt cà phê tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên chế độ bảo quản và kiểm tra chất lượng cà phê khắt khe hơn so với cà phê thóc. Hiện nay thường dùng các phương pháp sau để bảo quản. Bảo quản trong bao Đây là phương pháp phổ biến được áp dụng nhiều. Khi bảo quản cần phải chú ý các điểm sau: - Độ ẩm cà phê nhân đưa vào bảo quản phải nhỏ hơn 13 % - Tạp chất trong cà phê càng ít càng tốt, đối với cà phê cấp I , II phần trăm tạp chất < 0,5 % - Chọn kho ẩm có cách nhiệt, ẩm tốt - Phải sát trùng và vệ sinh kho sạch sẽ trước khi xếp bao - Không xếp trực tiếp xuống nền và sát tường: cách nền 0,3 m, cách tường 0,5m. - Để tránh hiện tượng nén chặt các bao do sức nén của tải trọng các bao phía trên, cứ sau 3 tuần phải đảo thứ tự xếp bao một lần. Đổ thành đống rời Thực chất là bảo quản rời trong các silo. Để tiết kiệm bao bì và bảo quản thời gian lâu hơn, người ta thường bảo quản cà phê nhân trong các silo bằng tôn, bằng bê tông, hoặc bằng gỗ tốt khép kín. ưu điểm của phương pháp này là ngoài việc tiết kiệm bao bì và tăng thời gian bảo quản còn tiết kiệm được thể tích kho, tránh được hiện tượng nén chặt làm giảm độ rời của khối hạt cà phê nhân. Có hương và dòng khí N2 thoát ra. 1.6 Bảo quản haṭ cà phê bằng vi sinh vâṭ Ngũ cốc và thưc̣ phẩm chế biến từ ngũ cốc có ý nghıã lớ n trong sư ̣ phát triển của loài ngườ i vı̀ sư ̣ ảnh hưở ng của chúng lên nền nông nghiêp̣ thế giớ i, kinh tế và giá tri ̣dinh 25
35. Đồ á n tốt nghiêp̣ dưỡng (G. Font de Valdez và công̣ sư,̣ 2010). Nguồn dinh dưỡng đến từ haṭ ngũ cốc không chı̉ đươc̣ con ngườ i ưa chuông̣ mà còn là muc̣ tiêu của nấm mốc và vi sinh vâṭ gây hai.̣ Chất lương̣ và an toàn thưc̣ phẩm của các loaị ngũ cốc dang̣ haṭ và thưc̣ phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc bi ̣ảnh hưởng bở i nấm và vi khuẩn, dâñ đến thiêṭ haị về kinh tế và nguy haị đến sứ c khỏe ngườ i tiêu dùng. Bảo quản sinh hoc̣ đươc̣ đinḥ nghıã là kéo dài thời haṇ sử dung̣ sản phẩm bằng cách sử dung̣ hê ̣ thống sinh hoc̣ hoăc̣ chất kháng khuẩn của chúng – là môṭ công cu ̣ hữu ı́ch để tránh bi ̣ảnh hưởng bở i các tác nhân gây hai,̣ dù sử dung̣ riêng lẻ hay kết hơp̣ cùng các phương pháp bảo quản truyền thống, vâṭ lý hay hóa hoc̣ khác (G. Font de Valdez và công̣ sư,̣ 2010). 26
36. Đồ á n tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 2: VÂṬ LIÊỤ VÀ PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨ U 2.1 Điạ điểm nghiên cứ u Thı́ nghiêṃ đươc̣ tiến hành taị phòng thı́ nghiêṃ vi sinh Khoa Công Nghê ̣Sinh Hoc̣ – Thưc̣ Phẩm – Môi Trườ ng, trường Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣Thành Phố Hồ Chı́ Minh. 2.2 Thời gian thưc̣ hiêṇ Đề tài đươc̣ thưc̣ hiêṇ từ 02/2017 đến 07/2017. 2.3 Vâṭ liêụ nghiên cứ u 2.3.1 Vâṭ liêụ Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp. sử dung̣ từ bô ̣ sưu tâp̣ giống Lưu Đaị Kim Phương̣ 12DSH phân lâp,̣ vớ i các chủng Lactobacillus sp. C1 – 1, Lactobacillus sp. C7 – 7 phân lâp̣ từ cơm mẻ; Lactobacillus sp. L6, Lactobacillus sp. L4 và Lactobacillus sp. L3 phân lâp̣ từ nem chua. Riêng chủng Lactobacillus sp. L5 do Lê Thi ̣Hồng Thủy, 09DSH phân lâp.̣ Chủng nấm thuôc̣ Aspergillus spp. đươc̣ phân lâp̣ từ cà phê (HCP2) do Đỗ Tuyết Mai và Nguyêñ Thi Vâṇ Hương 11DSH phân lâp.̣ Carbendazim từ Công ty Cổ phần Bảo vê ̣Thưc̣ vâṭ Sài Gòn, Haṭ cà phê mua ở cử a hàng Phương Vy 432A Xô Viết Nghê ̣ Tınh,̃ Phườ ng 25, Quâṇ Bı̀nh Thanh,̣ thành phố Hồ Chı́ Minh. 2.3.2 Hóa chất và môi trường sử dung̣ 2.3.2.1 Hóa chất Các hóa chất dùng để pha môi trườ ng MRS – broth, MRS cải tiến và PDA Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Phenolphthalein. Các hóa chất để pha các loaị thuốc nhuôm:̣ thuốc nhuôṃ Malachite green, thuốc nhuôṃ Safranin, thuốc nhuôṃ Crystal violet 27
37. Đồ á n tốt nghiêp̣ NaOH 0,1N. Cồn 96°, 70°. Nước cất. 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường MRS broth, MRS agar, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic. Môi trường PDA để nuôi cấy nấm mốc. 2.4. Thiết bị và dụng cụ 2.4.1. Thiết bị Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba Tủ sấy (Memmert Germany) Máy ly tâm (Tuttligen Germany) Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) Autoclave (Memmert - Đức) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy – England) Máy nước cất (Branstead USA) Bể điều nhiệt 2.4.2. Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri nhựa và thuỷ tinh, erlen, cốc thuỷ tinh, bình định mức, ống đong, đũa thuỷ tinh. Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, micropipette 10 - 100μl, micropipette 100 - 1000μl. Que cấy, que trang, kẹp gắp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1,5 ml, ống falcon 50 ml. 28
38. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống. 2.5 Phương pháp luận 2.5.1 Mục tiêu đồ án Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ cấp của vi khuẩn Lactobacillus spp. trong bảo quản hạt cà phê. 2.5.2 Nôị dung Hoaṭ hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. và chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 Khảo sát đăc̣ điểm hı̀nh thái, sinh hóa của các chủng Lactobacillus spp. Khảo sát khả năng đối kháng trưc̣ tiếp của các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 Ứ ng dung̣ dicḥ nuôi cấy, hơp̣ chất thứ cấp của các chủng Lactobacillus spp. trong bảo quản haṭ cà phê. 2.6 Phương phá p nghiên cứ u 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứ u Quy trı̀nh đươc̣ thưc̣ hiêṇ theo sơ đồ sau: 29
39. Đồ á n tốt nghiêp̣ 30
40. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.2 Khảo sá t đăc̣ điểm hı̀nh thá i, sinh hóa cá c chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. Các chủng vi khuẩn lactic có thể bi ̣suy yếu và nhiêm̃ các loài vi khuẩn khác trong quá trı̀nh bảo quản. Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. Các chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy. 2.6.2.1 Nhuộm gram: 31
41. Đồ á n tốt nghiêp̣ Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hay Gram âm. Tiến hành: Dựa theo phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng. 2.6.2.2 Thử nghiệm Catalase: Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase. Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18-24 giờ. Quan sát kết quả. Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra. 2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng: Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả. Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau: Trong đó: V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml). K - Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009. V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml). 32
42. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.3 Khảo sá t sư ̣ phá t triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 Chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 phân lập từ hạt cà phê được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường đại học Công Nghệ Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài. Chủng nấm mốc tiến hành tăng sinh trong môi trường PDB. Chủng nấm mốc được cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ. Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sang môi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ. Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm. 33
43. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.4 Xây dưng̣ đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 Chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 đươc̣ tăng sinh trong môi trườ ng Potato D- Glucose Broth, ủ ở 37oC trong 72 giờ . Dùng que cấy vòng lấy bào tử cấy điểm lên đıã môi trườ ng Potato D-Glucose Agar, ủ ở 37oC trong 72 giờ . Tiến hành thu bào tử : o • Sau khi ủ ở 37 C trong 72 giờ , ngườ i thưc̣ hiêṇ quan sát các đıã PDA đa ̃ cấy và choṇ đıã PDA có bào tử xuất hiêṇ kıń đıa.̃ • Sử dung̣ nướ c muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 cho từ từ vào đıã PDA đa ̃ choṇ và caọ nhe ̣ trên bề măṭ để thu lấy bào tử . Lăp̣ laị nhiều lần đến khi bề măṭ đıã không còn bào tử . 34
44. Đồ á n tốt nghiêp̣ • Dùng nước muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 đinḥ mứ c lên 100ml. Nồng -2 đô ̣pha loang̃ là 10 . Xây dưng̣ đường chuẩn tế bào: • Sử dung̣ lương̣ bào tử vừ a thu đo bằng máy đo quang phổ UV – Vis ở bướ c sóng 620nm, dùng nướ c muối sinh lý 0,9% có 0,2% Tween 80 pha loang̃ 2 lần đến giá tri mong̣ muốn. Lăp̣ laị 3 lần và thu nhâṇ giá tri trung̣ bı̀nh. • Dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lương̣ bào tử trong môṭ ô, giá tri ̣cho phép là 25 – 250 bào tử trong môṭ ô. Lăp̣ laị 3 lần và thu nhâṇ giá tri trung̣ bı̀nh. • Sử dung̣ đồ thi ̣đường thẳng trong Excel để ve ̃ và ghi nhâṇ phương trı̀nh đường thẳng qua các giao điểm từ các giá tri đ̣ a ̃ chon.̣ 35
45. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.5 Khảo sá t khả năng đố i khá ng trưc̣ tiếp của cá c chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 Các chủng Lactobacillus spp. đươc̣ tăng sinh trong môi trườ ng MRS broth, ủ ở 37oC trong 24 giờ . Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm • Môi trường sử dụng là môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Phối môi trườ ng vào các đıã petri. • Dùng cây đuc̣ thacḥ chuyển khối thacḥ nấm mốc từ đıã nấm vào đıã môi trường MRS Agar cải tiến và đăṭ vào tâm đıa.̃ Ủ ở 37oc trong 24 giờ • Sau 24 giờ , tiến hành dùng que cấy vòng vacḥ 2 đườ ng vi khuẩn cách mép đıã 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một 36
46. Đồ á n tốt nghiêp̣ đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. • Quan sát, đoc̣ kết quả dưạ vào sư ̣ phát triển của nấm sau 3 ngày. • Tiến hành đo tı̉ lê ̣ứ c chế theo hı̀nh và công thứ c phần trăm: Trong đó: Dđc: đường kınh́ (mm) đıã nấm đối chứ ng Dtn: đường kı́nh (mm) đıã thı́ nghiêṃ Số liêụ đươc̣ xử lý bằng phần mềm SAS 9.4 37
47. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2.6.6 Ứ ng dung̣ dicḥ nuôi cấy cá c chủng Lactobacillus spp. trong đố i khá ng nấm mố c Aspergillus sp. HCP2 bảo quản haṭ cà phê Hạt cà phê sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, vỡ, bi ̣côn trùng hay đen, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g haṭ cà phê, sẽ được ngâm trong 100ml dịch nuôi cấy được chuẩn bị như sau: • Thı́ nghiêṃ 1: Dicḥ nuôi cấy nhiêṭ đô ̣phòng Đối chứ ng dương 100ml Cardabenzim 0,4% Đối chứ ng âm 100ml nước cất 38
48. Đồ á n tốt nghiêp̣ Nghiêṃ thứ c 100ml dicḥ nuôi cấy o • Thı́ nghiêṃ 2: Dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ 80 C trong 15 phút Đối chứ ng dương 100ml Cardabenzim 0,4% Đối chứ ng âm 100ml nước cất Nghiêṃ thứ c 100ml dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ Haṭ cà phê sau khi ngâm đươc̣ để khô ở nhiêṭ đô ̣ phòng, kế đến phối vào các chai 2 100ml vô trùng và đươc̣ cảm nhiêm̃ 0,1ml huyền phù nấm mốc mâṭ đô ̣ 10 bt/g. Theo dõi từ ng ngày ở nhiêṭ đô ̣thường. Mỗi thı́ nghiêṃ lăp̣ laị 3 lần. 39
49. Đồ á n tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 3: KẾ T QUẢ VÀ BIÊṆ LUÂṆ 3.1 Khảo sá t sinh lý – sinh hóa củ a cá c chủ ng vi khuẩn lactic Sáu chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L4, Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L6, Lactobacillus sp. C1 và Lactobacillus sp. C7-7 được khảo sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram, thử nghiệm catalase để kiểm tra tính thuần khiết cũng như khả năng lên men lactic của các chủng. 3.1.1 Hı̀nh thá i khuẩn lac̣ Khuẩn lac̣ lactic trên môi trườ ng MRS Agar thường có đườ ng kınh́ 2 – 5 mm, bờ đều, láng và lồi, tròn, mờ đuc.̣ Kết quả: khuẩn lac̣ các chủng Lactobacillus spp. mờ đuc,̣ tròn đều và lồi Hınh̀ 3.1 Hı̀nh thái khuẩn lac̣ các chủng Lactobacillus spp. trên môi trường MRS Agar 40
50. Đồ á n tốt nghiêp̣ 3.1.2 Nhuôṃ Gram A B Hınh̀ 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tı́m, Gram dương (A) Tế bào E. coli bắt màu hồng, Gram âm (B) Hınh̀ 3.3 Chủng Lactobacillus sp. L3 bắt màu tı́m, Gram dương 3.1.3 Thử nghiêṃ catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi 41
51. Đồ á n tốt nghiêp̣ bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb. có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương. Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, các chủng Lactobacillus spp. không có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase. A B Hınh̀ 3.4 Chủng vi khuẩn Bacillus spp. phản ứ ng dương tı́nh vớ i catalase, bên trái – Chủng Lactobacillus spp. âm tı́nh vớ i catalase, bên phải (A) Đối chứ ng là nướ c cất phản ứ ng âm tı́nh vớ i catalase, bên trái - Chủng Lactobacillus spp. âm tı́nh vớ i catalase, bên phải (B) 3.1.4 Xá c đinḥ hàm lương̣ acid tổng Khả năng lên men lactic thể hiện qua nồng độ acid tổng trong dịch nuôi cấy trong môi trường MRS sau 24 giờ nuôi cấy. Khả năng tăng trưởng của vi khuẩn thể hiện qua OD600nm. Hình 3.5 cho thấy qua các thờ i điểm khác nhau, giá tri ̣OD tăng lên theo thờ i gian nuôi cấy, qua đó cho thấy sinh khối vi khuẩn phát triển manḥ , acid lactic (%) tăng theo giá tri ̣OD. Sau 24 giờ nuôi cấy giá tri ̣OD cao nhất cũng là thờ i điểm sinh acid lactic manḥ nhất. 42
52. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L3 theo thờ i gian Bảng 3.1 Acid lactic (%) và giá tri OḌ ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. Chủ ng Acid lactic (%) OD600nm L6 2,526 1,835 L5 2,049 1,822 L4 2,015 1,999 L3 2,685 1,713 C7-7 2,267 1,82 C1-1 2,061 1,729 43
53. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.6 Acid lactic (%) và giá tri OḌ ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. Vớ i các chủng phân lâp̣ từ nem chua, chủng Lactobacillus sp. L6 và Lactobacillus sp. L3 có khả năng lên men lactic cao nhất trong khi chủng Lactobacillus sp. L5 và Lactobacillus sp. L4 lên men lactic yếu hơn. Vớ i hai chủng Lactobacillus sp. LC1-1 và Lactobacillus sp. LC7-7 phân lâp̣ từ cơm mẻ có khả năng lên men lactic khá cao. Giữa 6 chủng trên thı̀ khả năng lên men lactic của các chủng Lactobacillus sp. L6, Lactobacillus sp. L3 và Lactobacillus sp. LC1-1 rất tốt, còn các chủng Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L4 và Lactobacillus sp. LC7-7 có khả năng lên men nhưng không tốt bằng 3 chủng còn lai.̣ Về sinh khối của các chủng thı̀ chủng Lactobacillus sp. L4 sau 24 giờ nuôi cấy có giá tri ̣OD cao nhất so vớ i các chủng còn lai.̣ Các chủng Lactobacillus sp. L6, Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. LC7-7 và Lactobacillus sp. LC1-1 sau 24h sinh khối phát triển manh.̣ Riêng chủng Lactobacillus sp. L3 sau 24 giờ nuôi cấy sinh khối phát triển kém hơn các chủng còn laị. 44
54. Đồ á n tốt nghiêp̣ 3.2 Khảo sá t sư ̣ phá t triển củ a chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 Chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 đươc̣ phân lâp̣ từ haṭ cà phê lấy từ bô ̣ sưu tâp̣ giống phòng Vi sinh khoa Công Nghê ̣ Sinh Hoc̣ – Thưc̣ Phẩm – Môi Trườ ng thuôc̣ trườ ng Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣Thành Phố Hồ Chı́ Minh. Chủng nấm mốc này cần phải được kiểm tra khả năng phát triển, để xác định xem chúng có thích hợp làm nấm mốc chỉ thị tiến hành thí nghiệm. Môi trường thử nghiệm là MRS agar cải tiến (không bỏ Ammonium Citrate), đây là môi trường do nhóm trước thực hiện sử dụng vì đáp ứng yêu cầu cho thử nghiệm hoạt tính kháng nấm vi khuẩn phát triển tốt và thành phần môi trường không làm ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm mốc, thích hợp để khảo sát hoạt tính kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. Hınh̀ 3.7 Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 trên môi trường MRS Agar cải tiến 45
55. Đồ á n tốt nghiêp̣ Kết quả trên hınh̀ 3.7 cho thấy, sau 3 ngày trên môi trường MRS Agar cải tiến (không bỏ Ammonium citrate), chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 phát triển bı̀nh thường vớ i đườ ng kı́nh trung bı̀nh là (44,75 ± 5,79) mm. Kết quả trên cho thấy, chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 hoàn toàn khỏe manḥ và không bi nhị êm̃ các chủng nấm khác, thı́ch hơp̣ để tiến hành các thı́ nghiêṃ khảo sát. 3.3 Xây dưng̣ đường chuẩn tế bào củ a chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 Muc̣ đı́ch: xác đinḥ mâṭ đô ̣ bào tử nấm để cảm nhiêm̃ haṭ cà phê để khảo sát sư ̣ đối kháng Dùng phương pháp đếm trưc̣ tiếp bằng buồng đếm hồng cầu đinḥ lương̣ số lương̣ tế bào nấm mốc thu đươc̣ kết quả BTB1= = 599 (tb) 597+727+518+555 4 BTB2= = 551 (tb) 618+622+531+431 4 BTB2= = 490 (tb) 599+491+473+398 4 => BTB= = 546,667(tb) 599+551+490 , × Khi đo: Sô TB ( )3= × 4 = 2,2 × 10 (tb/ml) ́ ́ × , 𝑡𝑡𝑡𝑡 546 667 1000 7 Tổng hơp̣ c𝑚𝑚𝑚𝑚ùng số liê1ụ OD0 1 Bảng 3.2 Số liêụ dưng̣ đườ ng chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 n x logx OD 1 21866666,67 7,34 0,722 2 10933333,33 7,039 0,415 4 5466666,667 6,738 0,326 8 2733333,333 6,437 0,068 16 1366666,667 6,136 0,022 46
56. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 3.4 Khảo sá t khả năng đố i khá ng trưc̣ tiếp củ a cá c chủ ng Lactobacillus spp. vớ i chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 Sau khi đa ̃ đinḥ danh sơ bô ̣ và xác đinḥ đô ̣ thuần của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus spp., ngườ i thưc̣ hiêṇ đề tài tiến hành khảo sát khả năng đối kháng trưc̣ tiếp của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 bằng phương pháp cấy hai đườ ng nhằm khẳng đinḥ vi khuẩn có khả năng kháng nấm. Đối chứ ng âm sử dung̣ đıã môi trườ ng MRS Agar cải tiến đăṭ thacḥ nấm và không cấy vi khuẩn. 47
57. Đồ á n tốt nghiêp̣ Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ ứ c chế chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 của các chủng Lactobacillus spp. Vi khuẩn Tỉ lệ ức chế (%) α Dicḥ nuôi cấ y L3 29,24 ± 4,65 α Dicḥ nuôi cấ y L4 23,28 ± 6,83 α Dicḥ nuôi cấ y L5 27,75 ± 6,83 αβ Dicḥ nuôi cấ y L6 12,1 ± 19,01 β Dicḥ nuôi cấ y C1 0 ± 1,29 αβ Dicḥ nuôi cấ y C7 – 7 12,1 ± 7,85 Kết quả từ bảng 3.3, dicḥ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. L3, L4, L5 đều có khả năng ứ c chế chủng nấm mốc Aspergillus sp. HCP2 với tı̉ lê ̣ đối kháng cao hơn 20% và cao nhất là 29,24% đối vớ i dicḥ nuôi cấy chủng Lactobacillus sp. L3. Các chủng Lactobacillus sp. L6, Lactobacillus sp. C1 và Lactobacillus sp. C7-7 có khả năng đối kháng Aspergillus sp. HCP2 yếu khi thử nghiệm trên môi trường MRS cải tiến. 48
58. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.9 Khả năng đối kháng trưc̣ tiếp bằng phương pháp cấy hai đường của các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 3.6 Ứ ng dung̣ dicḥ nuôi cấ y cá c chủ ng Lactobacillus spp. trong đố i khá ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 bảo quản haṭ cà phê Để khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin trên hạt cà phê Aspergillus sp. HCP2 trong điều kiện in vivo, dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng để xử lý hạt cà phê trong thời gian 1 giờ , sau đó cảm nhiễm bào tử nấm mốc mâṭ độ 102 bt/g cà phê. Có hai trường hợp: trường hợp dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt và dịch nuôi cấy xử lý nhiệt 80 oC, 15 phút 49
59. Đồ á n tốt nghiêp̣ * Thı́ nghiêṃ 1: Dicḥ nuôi cấy không xử lý nhiêṭ Kết quả trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.10 Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g hạt cà phê) Ngày 1 3 5 7 10 14 Ngày đầu tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3 L6 - - + + ++ ++ 5 L5 - - - - - + 14 L4 - - - - - - 15 L3 - - - - - - 15 C7 – 7 - - - - - + 14 C1 - - - - - - 18 (-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều) Nhận xét: Đối chứ ng âm (Nướ c cất): bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 3 Đối chứ ng dương (Carbenzim): bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 3 Dicḥ nuôi cấy L6: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 5 Dicḥ nuôi cấy L5: bắt đầu moc̣ nấm từ ngày thứ 14 Dicḥ nuôi cấy L4: chưa moc̣ nấm đến ngày thứ 15 50
60. Đồ á n tốt nghiêp̣ Dicḥ nuôi cấy L3: chưa moc̣ nấm đến ngày thứ 15 Dicḥ nuôi cấy C7 – 7: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 14 Dicḥ nuôi cấy C1: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 18. Khả năng đối kháng in vivo sau khi được số hóa bằng ngày đầu tiên tơ nấm xuất hiện và khả năng đối kháng in vitro được biểu diễn chung trên hình 3.9. Hınh̀ 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt Như vậy khi xử lý hạt cà phê bằng dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không xử lý nhiệt, Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L4 và Lactobacillus sp. L3 có sư ̣ tương quan giữa ngày xuất hiện nấm trên hạt cà phê và tỉ lệ đối kháng in vitro. Riêng chủng Lactobacillus sp. C1 sư ̣ sai khác khá lớ n, trên thực tế dịch nuôi cấy Lactobacillus sp. C1 bảo vệ hạt khỏi mọc nấm trong thời gian dài nhất nhưng tỉ lệ đối kháng in vitro lại 51
61. Đồ á n tốt nghiêp̣ thấp. Điều này có thể do điều kiện dinh dưỡng vi sinh vật in vitro không hoàn toàn trùng với điều kiện ngoài tự nhiên. 52
62. Đồ á n tốt nghiêp̣ 53
63. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải) Các nghiêṃ thứ c: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiêṭ (từ trên xuống dướ i) 54
64. Đồ á n tốt nghiêp̣ * Thı́ nghiêṃ 2: Dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ 80oC trong 15 phút Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. gia nhiêṭ 80oC trong 15 phút vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 (nhiễm 102 bt/g) Ngày đầu Ngày 1 3 5 7 10 14 tiên mọc nấm ĐC (-) - ++ ++ ++ ++ ++ 3 ĐC (+) - + + + + + 3 L6 80oC - - +++ +++ +++ +++ 5 L5 80oC - - - + ++ ++ 7 L4 80oC - - + + + ++ 5 L3 80oC - ++ +++ +++ +++ +++ 3 C7 – 7 80oC - - + ++ ++ ++ 5 C1 80oC - +++ +++ +++ +++ +++ 3 (-: không mọc, +: mọc ít, ++: mọc trung bình, +++: mọc nhiều) Nhận xét: Đối chứ ng âm (Nướ c cất): bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 3 Đối chứ ng dương (Carbenzim): bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 3 Dicḥ nuôi cấy L6 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 5 Dicḥ nuôi cấy L5 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm từ ngày thứ 7 55
65. Đồ á n tốt nghiêp̣ Dicḥ nuôi cấy L4 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm từ ngày thứ 5 Dicḥ nuôi cấy L3 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm từ ngày thứ 3 Dicḥ nuôi cấy C7 – 7 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 5 Dicḥ nuôi cấy C1 gia nhiêṭ 80oC: bắt đầu moc̣ nấm vào ngày thứ 3 Từ kết quả ở bảng 3.5 và hınh̀ 3.12, có thể nhâṇ thấy dicḥ nuôi cấy gia nhiệt 80oC 15 phút làm giảm khả năng bảo quản. L5 gia nhiêṭ 80oC trong 15 phút có khả năng kháng nấm bền hơn so vớ i các chủng khác. Chủng L3 và C1 bảo quản yếu nhất. 56
66. Đồ á n tốt nghiêp̣ 57
67. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải) Các nghiêṃ thứ c: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 gia nhiêṭ ở 80oC trong 15 phút (từ trên xuống dướ i) Hình 3.13 so sánh khả năng bảo quản của các dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp. không gia nhiệt và gia nhiệt thể hiện qua ngày mọc tơ nấm đầu tiên. Kết quả cho thấy khả năng đối kháng nấm ở các trườ ng hơp̣ gia nhiêṭ ở 80oC trong 15 phút giảm manḥ . Các chủng L3, L4 và C1 khi dịch nuôi cấy không gia nhiệt có thể ngăn nấm mọc sau thời gian khá dài (>2 tuần) thì khi xử lý nhiệt lại làm giảm khả năng kháng nấm, nấm mọc ngay sau 3 ngày giống đối chứng âm. Điều này cho thấy hoạt chất đóng vài trò ức chế nấm mốc trong các chủng khác nhau là khác nhau, cần được tìm hiểu them để đưa ra hướng sản xuất chế phẩm. 58
68. Đồ á n tốt nghiêp̣ Hınh̀ 3.13 Khả năng đối kháng của dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ và không gia nhiêṭ các chủng Lactobacillus spp. vớ i chủng nấm Aspergillus sp. HCP2 theo dõi qua từ ng ngày 59
69. Đồ á n tốt nghiêp̣ CHƯƠNG 4: KẾ T LUÂṆ VÀ KIẾ N NGHI ̣ 1. Kết luâṇ Các chủng Lactobacillus spp. đươc̣ khẳng đinḥ là thuần khiết và là vi khuẩn lactic qua khảo sát laị đăc̣ điểm, hı̀nh thái, sinh lý và sinh hóa. Từ đườ ng chuẩn Aspergillus sp. HCP2 đa ̃ dưng̣ giúp kiểm soát đươc̣ mâṭ đô ̣nấm 2 cảm nhiêm̃ là 10 (bt/g). Ở đối kháng in vitro – đối kháng trưc̣ tiếp bằng phương pháp ria hai đườ ng, ngườ i thưc̣ hiêṇ đề tài nhâṇ thấy các chủng Lactobacillus spp. có nguồn gốc phân lâp̣ từ nem chua là Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L4 và Lactobacillus sp. L3 có khả năng kháng nấm cao hơn so vớ i các nghiêṃ thứ c còn lai.̣ Ở đối kháng in vivo – bảo quản haṭ cà phê bằng dicḥ nuôi cấy có cảm nhiêm̃ nấm 2 mốc Aspergillus sp. HCP2 vớ i mâṭ đô ̣10 (bt/g), thı́ nghiêṃ dicḥ nuôi cấy gia nhiêṭ 80oC trong 15 phút làm giảm khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp. chı̉ sau 3 đến 5 ngày quan sát. Riêng nghiêṃ thứ c dicḥ nuôi cấy Lactobacillus sp. L5 gia nhiêṭ 80oC kháng nấm tốt hơn khi sau 7 ngày quan sát, nấm mốc bắt đầu xuất hiên.̣ Vớ i thı́ nghiêṃ dicḥ nuôi cấy không gia nhiêt,̣ giữa đối kháng in vitro và đối kháng in vivo có sư ̣ tương quan khi khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L4 và Lactobacillus sp. L3 kháng nấm manḥ ở cả in vitro và in vivo. Chủng Lactobacillus sp. L6 có khả năng kháng nấm trong đối kháng in vitro nhưng kháng nấm yếu trong đối kháng in vivo khi nấm mốc bắt đầu xuất hiêṇ sau 5 ngày quan sát. Ngươc̣ lai,̣ chủng Lactobacillus sp. LC1-1 gần như không có khả năng kháng nấm trong điều kiêṇ in vitro nhưng laị cho khả năng kháng nấm manḥ trong điều kiêṇ in vivo sau 15 ngày quan sát vâñ bảo quản đươc̣ hat.̣ Riêng chủng Lactobacillus sp. LC7- 7 có khả năng kháng nấm ở cả hai điều kiêṇ in vitro và in vivo sau 14 ngày quan sát. 60
70. Đồ á n tốt nghiêp̣ 2. Kiến nghi ̣ Khảo sát về khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp. ở các nhiêṭ đô ̣ khác nhau để tı̀m hiểu mối tương quan giữa nhiêṭ đô ̣và khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp. Khảo sát sư ̣ khả năng sinh enzyme của các chủng Lactobacillus spp. dướ i tác đông̣ của nhiêṭ đô ̣ảnh hưở ng đến khả năng kháng nấm. 61
71. Đồ á n tốt nghiêp̣ TÀ I LIÊỤ THAM KHẢ O Tài liêụ tiếng Viêṭ 1. Trần Lê Bı́ch Trâm (2016) “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng.” Trường Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣ TP.HCM. 2. Lê Ngô Vũ Phương̣ (2016) “Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin” Trườ ng Đaị Hoc̣ Công Nghê ̣TP. HCM. Tài liêụ tiếng Anh 3. Gilberto V. de M Pereira, A. B. P. M., Vanete Thomaz-Soccol, Adenise L Woiciechowski, Ensei Neto, Carlos R. Soccol, Daõ Pedro de Carvalho Neto (May 2016). "Potential of lactic acid bacteria to improve the fermentation and quality of coffee during on farm processing." International Journal of Food Science & Technology: 1689 - 1695. 4. Graciela Rollán, G. m. V., Carla Luciana Gerez (November 2010). "Microbial applications in the biopreservation of cereals products." 5. Johan Schnurer, J. M. (2005). "Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives." Trends in Food Science & Technology. 6. L. R. Batista, S. M. C., Guilherme Prado, R. F. Schwan, Alan E. Wheals (2003). "Toxigenic fungi associated with processed (green) coffee beans (Coffea arabica L.)." International Journal of Food Microbiology: 293 - 300. 7. Nevena Blagojev, M. Š., Slavica Vesković- M0oračanin, Vladislava Šošo (2011). "Control of mould growth and mycotoxin production by lactic acid bacteria metabolites." Romanian Biotechnological Letters Vol. 17. 62
72. Đồ á n tốt nghiêp̣ 8. Rosalia Trias, L. B., Emilio Montesinos, Esther Badosa (December 2009). "Lactic acid bacteria from fresh fruit and vegetables as biocontrol agents of phytopathogenic bacteria and fungi." International Microbiology. 9. S. Rouse, D. H., A. Vaughan, D. van Sinderen (2007). "Lactic acid bacteria with potential to eliminate fungal spoilage in foods." Journal of Applied Microbiology. 63
73. Đồ á n tốt nghiêp̣ PHU ̣ LUC̣ Phu ̣luc̣ A: Nhuôṃ Gram Chủng Lactobacillus sp. L6 bắt màu tı́m, Gram dương (bên trái) Chủng Lactobacillus sp. L5 bắt màu tı́m, Gram dương (bên phải) Chủng Lactobacillus sp. L4 bắt màu tı́m, Gram dương (bên trái) Chủng Lactobacillus sp. LC7-7 bắt màu tı́m, Gram dương (bên phải) 1
74. Đồ á n tốt nghiêp̣ Chủng Lactobacillus sp. LC1-1 bắt màu tı́m, Gram dương 2
75. Đồ á n tốt nghiêp̣ Phu ̣luc̣ B: Acid lactic (%) theo thời gian củ a cá c chủ ng L6, L5, L4, LC7-7 và LC1-1 Acid lactic (%) theo thờ i gian của chủng Lactobacillus sp. L6 Acid lactic (%) theo thờ i gian của chủng Lactobacillus sp. L5 3
76. Đồ á n tốt nghiêp̣ Acid lactic (%) theo thờ i gian của chủng Lactobacillus sp. L4 Acid lactic (%) theo thờ i gian của chủng Lactobacillus sp. LC7-7 4
77. Đồ á n tốt nghiêp̣ Acid lactic (%) theo thờ i gian của chủng Lactobacillus sp. LC1-1 5
78. Đồ á n tốt nghiêp̣ Phu ̣luc̣ C: Tı ̉ lê ̣ứ c chế nấ m củ a cá c chủ ng Lactobacillus spp. vớ i chủ ng nấ m Aspergillus sp. HCP2 The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NTHUC 6 L3 L4 L5 L6 LC1-1 LC7-7 Number of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 6
79. Đồ á n tốt nghiêp̣ The SAS System 00:00 Wednesday, October 15, 2014 2 The ANOVA Procedure Dependent Variable: UCHCP2 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2062.090892 412.418178 4.59 0.0143 Error 12 1078.606561 89.883880 Corrected Total 17 3140.697454 R-Square Coeff Var Root MSE UCHCP2 Mean 0.656571 55.13876 9.480711 17.19428 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NTHUC 5 2062.090892 412.418178 4.59 0.0143 7
80. Đồ á n tốt nghiêp̣ The ANOVA Procedure Duncan's Multiple Range Test for UCHCP2 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 89.88388 Number of Means 2 3 4 5 6 Critical Range 16.87 17.65 18.13 18.45 18.67 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N NTHUC A 29.236 3 L3 A A 27.747 3 L5 A A 23.277 3 L4 A B A 12.104 3 L6 B A B A 12.104 3 LC7-7 B B -1.304 3 LC1-1 8