›

Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng của nano đồng

pdf 69 trang thiennha21 12/04/2022 4330
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng của nano đồng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_kha_nang_khang_nam_gay_benh_tren_cay_trong_cu.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh trên cây trồng của nano đồng

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY TRỒNG CỦA NANO ĐỒNG Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : VƯƠNG THỊ NGỌC HUYỀN MSSV: 1151110160 Lớp: 11DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện Vương Thị Ngọc Huyền i
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để tôi có thể học tập và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hai – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Đại Học Công nghệ Tp HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm. Tôi đã học được nhiều điều hay ở cô về kiến thức chuyên môn cũng như lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong công việc, và cả tình yêu thương đối với mọi người. Cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về trong thiết bị thí nghiệm thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành tốt đẹp Đồ án này. Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn. Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2010 – 2014. Cuối cùng, tôi xin kính chúc quý Thầy Cô trong Khoa và các bạn dồi dào sức khỏe, hạnh phúc, thành công trong công tác và trong cuộc sống. TP.HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện Vương Thị Ngọc Huyền ii
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu ứng dụng về hạt nano 3 1.1.1. Nghiên cứu sử dụng các hạt nano kích thích sự sinh trưởng , phát triển của thực vật 3 1.1.2. Nghiên cứu sử dụng các hạt nano để phòng trừ bệnh hại 5 1.2.Tổng quan về nano đồng 8 1.2.1.Cấu trúc về hạt nano đồng 8 1.2.2. Ứng dụng của hạt nano đồng 9 1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước 10 1.2.4. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11 1.3. Các loại nấm bệnh cây trồng 11 1.3.1 Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 11 1.3.2 Bệnh do nấm Colletotrichum spp.gây ra 12 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp.gây ra(Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19 2.2. Vật liệu 19 2.2.1. Nguồn mẫu 19 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 19 2.2.2.1.Dụng cụ 19 2. 3. Hóachất 20 2. 4 Môi trường nuôi cấy 20 2.5. Bố trí thí nghiệm: 21 2.5.1.Phương pháp phân lập nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà chua và thán thư trên trái thanh long (Agrios, 2005) 21 2.5.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 22 2.5.3. Chuẩn bị dung dịch nano đồng để làm thí nghiệm 23 2.5.3 Chuẩn bị đĩa môi trường có bổ sung nano đồng để thử nghiệm (b) 25 2.5.4. Đánh giá khả năng kháng nấm của dung dịch nano đồng ở các nồng độ . 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Kết quả phân lập nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà chua 27 3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm Fusarium sp. của dung dịch nano đồng 31 3.2.Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum sp. của dung dịch nano đồng 34 3.3.Đánh giá khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani của dung dịch nano đồng 41 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1. Kết luận 46 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 4.2. Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC A. CÁC BẢNG SỐ LIỆU THÔ 1 PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 4 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - FCC: cấu trúc lập phương tâm mặt - ns: non-significant - R.solani: Rhizoctonia solani -Cs: cộng sự -PGA: Potato D-Glucose Agar iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Đặc điểm gây hại của các loài Rhizoctonia (Nguyễn Thị Hai, 2013) 16 Bảng 3.1 Đường kính (mm) tản nấm Fusarium sp. ở các công thức xử lý nano đồng. 31 Bảng 3.2. Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Fusariumsp. 34 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nano đồng đến sự phát triển của nấm Colletotrichum sp. 34 Bảng 3.4. Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Colletotrichum sp. 40 Bảng 3.5 Đường kính (mm) phát triển của tản nấm Rhizoctonia sp. 41 Bảng 3.6 Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Rhizoctonia solani 43 v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc lập phương tâm mặt (FCC) của Đồng 9 Hình 1.2.Một số biều hiện gây bệnh do nấm Fuasarium sp. gây ra( trongraulamvuon.com). 12 Hình 1.3.Nấm Colletotrichum coffeanum gây bệnh khô cành khô quả ở cây cà phê (baovethucvatcongdong.info). 13 Hình 1.4.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colectotrichum gleosporiodies gây ra trên cây tiêu (phongtribenhtrentieu.blogspot.com) 14 Hình 1.5.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt (Jaw-Fen Wang, 2010) 14 Hình 1.6.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên trái thanh long và cành thanh long (Masanto Masyahit, 2009). 15 Hình 1.7.Biểu hiện bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra trên cây ngô (tiennong.vn). 17 Hình 1.8.Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh,(d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008). 18 Hình 2.1. Quy trình phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh 22 Hình 2.2.Quy trình tổng hợp hạt nano Đồng 24 Hình 2.3. Dung dịch nano đồng 25 Hình 3.1.Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm Fusarium sp.(a. Mặt trên tản nấm, b. Mặt dưới tản nấm, c. sợi nấm, d. bào tử). 27 Hình 3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm Rhizoctonia sp. (a. Mặt trước tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c.Sợi nấm). 29 Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm Colletotrichum sp. (a. Mặt trước tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c.Sợi nấm, d. bào tử nấm). 30 Hình 3.4. Đường kính của tản nấm Fusariumsp. 3 ngày sau khi cấy 32 Hình 3.5. Đường kính của tản nấm Fusarium sp. 6 ngày sau khi cấy 33 vi
  10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6. Đường kính phát triển của tản nấm Fusarium sp. 9 ngày sau khi cấy 33 Hình 3.7. Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichum sp. 37 Hình 3.8. Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichum sp. 38 Hình 3.9. Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichum acutatum 39 Hình 3.10. Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani 3 ngày sau khi cấy 43 Hình 3.11. Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani 6 ngày sau khi cấy 44 Hình 3.12. Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctoniasolani 9 ngày sau khi cấy 45 vii
  11. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Sự phát triển của đường kính tản nấm Fusarium sp. qua các ngày nuôi cấy ở các công thức 32 Biểu đồ 3.3. Sự phát triển của đường kính tản nấm Colletotrichum sp. qua các ngày nuôi cấy 36 Biểu đồ 3.3. Sự phát triển của đường kính tản nấm Rhizoctonia solaniqua các ngày nuôi cấy 42 viii
  12. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp. Thực tế cho thấy, tuy khu vực nông nghiệp chỉ chiếm tỷ trọng nhỏ (năm 2013 là 18,38%, năm 2014 là 18,12 %) và có tốc độ tăng trưởng thấp, nhưnglao động trong khu vực nông nghiệp, nông thôn đang chiếm tới trên 70% lực lượng lao động cả nước. Nông nghiệp Việt Nam là ngành kinh tế thâm dụng lao động và đầu tư thấp. Việc bỏ đồng vốn đầu tư trong nông nghiệp là rất khó khăn. Chính vì vậy với việc phải nhập khẩu hầu như toàn bộ các vật tư nông nghiệp từ nước ngoài là một bất lợi rất lớn cho nông dân Việt nam nói riêng và nền kinh tế nói chung. Trong các chi phí cho nông nghiệp, thời gian qua chúng ta đã vươn lên tự túc được một phần phân bón và đang dần tiến tới tự lực một cách cơ bản về loại vật tư này. Trong khi đó loại vật tư BVTV nói chung và thuốc trừ nấm bệnh nói riêng hầu như chưa có sự khởi đầu nào đáng kể. Hiện nay trong lĩnh vực sinh học, hiện tượng kháng thuốc của nấm, khuẩn đang trở nên ngày càng phổ biến. Do vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng các hạt nano kim loại với mục đích ức chế sự phát triển của chúng, đã có một số công bố tổng hợp nano đồng ức chế được chúng với nhiều khả quan. Trong xu thế đó, tại Việt Nam hiện nay cũng có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về nano đồng cũng như khảo sát các ứng dụng của chúng. Tuy nhiên, chưa có một công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống sự ảnh hưởng nano đồng lên nấm gây hại nhiều cây trồng. Hiện tại, Việt Nam đã có các chế phẩm thuốc trừ bệnh thuộc gốc đồng, nhưng lượng đồng tồn dư lại trong quá trình sử dụng còn rất nhiều do cây sử dụng không hết, gây ra ảnh hưởng rất lớn cho môi trường. Vì vậy, việc đi vào nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm từ đồng nano, sử dụng một lượng nhỏ đồng ở kích thước siêu nhỏ nhưng đem lại hiệu quả cao là một sự khởi đầu không dễ dàng nhưng có ý nghĩa rất lớn cho bước đột phá nhằm mục đích tự túc nguồn thuốc trừ nấm và bệnh hại cây trồng ở Việt Nam.Từ sự nhìn nhận này, sinh viên tiến hành đề tài“xác định khả năng kháng nấm bệnh của nano đồng”. 1
  13. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định khả năng kháng của nano đồng với một số loài nấm gây bệnh cây trồng. 2
  14. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu ứng dụng về hạt nano 1.1.1. Nghiên cứu sử dụng các hạt nano kích thích sự sinh trưởng , phát triển của thực vật Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu, tìm kiếm và ứng dụng các hạt siêu nhỏ để dùng trong ngành vật liệu, các chế phẩm phục vụ đời sống, cũng như trong y sinh học. Trong nông nghiệp việc tìm kiếm ứng dụng các hạt siêu nhỏ cũng không là một ngoại lệ. Việc ứng dụng các các hạt siêu nhỏ dưới dạng đơn chất hoặc oxid để thay thế các phân vi lượng dưới dạng muối hoặc chelate đã giúp tiết kiệm đáng kể chi phí và nâng cao hiệu lực cũng như hiệu quả sản xuất. Người ta nhận thấy rằng, việc sử dụng trực tiếp các muối hoặc các chelate kim loại của các nguyên tố vi lượng dễ gây ra tình trạng thừa, dẫn đến ô nhiễm môi trường, do cây sử dụng không hết. Trong khi đó, việc sử dụng các hạt kim loại hoặc các oxid của chúng ở kích thước siêu nhỏ, dưới 100 Nano mét, để cung cấp cho cây trồng, với liều lượng nhỏ hơn rất nhiều, lại cho kết quả rất tốt. Các nguyên tố thường được sử dụng trong kỹ thuật này thường là Cu, Zn, Mn, Mg, Co, Mo, Ti, Ag v.v Khi cung cấp các nguyên tố vi lượng cho cây dưới dạng các hạt cỡ Nanomét, các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa cũng như năng suất sản phẩm cây trồng được tăng lên rõ rệt. Ngoài việc sử dụng các hạt kim loại hoặc các oxid của chúng, với kích thước cỡ Nanomét, để cung cấp vi lượng cho cây, người ta cũng dùng một số hạt cỡ Nano mét của chúng để tạo ra thuốc trừ nấm hoặc vi khuẩn, tùy theo tính chất của kim loại này. Trong các nguyên tố được sử dụng trong loại công nghệ này có Cu, Zn, Al, Ag thường được sử dụng để làm thuốc trừ nấm. Theo tác giả Phạm Thị Bích Hợp (2014), trong bản thuyết minh nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấp thành phố (Hà nội), với đề tài “Nghiên cứu tác động của việc xử lý hạt giống trước khi gieo bằng các hạt sắt, đồng và coban có kích thước siêu nhỏ đến năng suất và chất lượng của cây đậu tương” đã dẫn ra rằng, khi sử dụng để làm phân vi lượng người ta thường dùng các oxid kim loại để sử lý hạt 3
  15. Đồ án tốt nghiệp giống hoặc phun lên lá cho cây hấp thụ. Tác giảBerahmand và cs (2012) đã sử dụng dung dịch keo bạc có kích thước ~20nm để phun cho cây với liều 40g/ ha để làm tăng sinh trưởng cho cây ngô làm thức ăn gia súc và cho thấy được sản lượng ngô tăng lên 17,5% so với khi không sử dụng. C.M. Lu, C.Y. Zhang, Wen J.Q. và cs (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt SiO2 và TiO2 khi sử lý hạt giống đậu đã cho thấy các hạt này làm tăng hàm lượng Nitrate reductase trong cây đậu và do đó đã làm tăng sức nẩy mầm của hạt. Nhiều tác giả cũng đã tiến hành các nghiên cứu khác nhau của các hạt kim loại siêu nhỏ trên cây trồng. Zhu và cs (2008) nghiên cứu quá trình hấp thu, vận chuyển và tích lũy các hạt oxid sắt trong cây bí ngô cho thấy cây bí ngô được trồng trong môi trường nước có chứa quặng từ thiết (Fe3O4) hạt nano có thể hấp thụ, dời và tích lũy các hạt trong mô thực vật. Zhang và cs (2005) nghiên cứu ảnh hưởng của TiO2 lên quá trình nảy mầm và sinh trưởng của cây bina (spinach) , nghiên cứu bằng cách đo tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của hạt giống bina. Sự gia tăng các yếu tố này được quan sát thấy ở 0,25-4‰ nano TiO2 được sử dụng. trong giai đoạn tăng trưởng, sự hình thành chất diệp lục, các hoạt động cacboxylase/ oxygenase ribulorebis phosphat và tỷ lệ quang hợp được tăng lên. Kết quả tốt nhất được tìm thấy ở 2,5‰ nano TiO2. Ngoài các hạt kim loại, Gonzales-Melendi và cs (2008) còn cho thấy các ống Cacbon siêu nhỏ đơn lớp cũng hoạt động như một hệ vận chuyển thông minh trong cây và có thể xâm nhập qua cả lớp vỏ dầy của hạt giống để tác động lên quá trình nẩy mầm và sinh trưởng của cây. Chính công trình của các tác giả Ấn độ (201) cho thấy, hạt giống lạc được xử lý bằng dung dịch hạt oxid kẽm có kích thước khoảng 25nm đã cho năng suất tăng 34% so với loại hạt được xử lý bằng dung dịch Zn sunfat đã chelat hóa có cùng nồng độ là 1000mg Zn/ lit. Để tăng cường hiệu lực và giảm thiểu lượng sử dụng nhằm tránh tình trạng dư thừa, gây ô nhiễm cho thực phẩm và đất trồng, các nhà khoa học Nga đã đề xuất việc sử dụng năng lượng bề mặt của các hạt siêu mịn, siêu phân tán, để kích thích sự nẩy mầm của hạt giống . Các nghiên cứu cho thấy, các hạt siêu mịn và siêu phân tán này 4
  16. Đồ án tốt nghiệp khi được sử dụng để xử lý hạt giống sẽ làm tăng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong cây, do tham gia trực tiếp vào các enzym hoặc hoạt hóa chúng. Các hạt này còn làm gia tăng hàm lượng các loại đường dễ tiêu và làm tăng năng suất cây trồng khoảng 20-25%. Mức tiêu tốn cho mỗi đơn vị diện tích của các hạt này cũng được giảm đi rất nhiều so với việc dùng chúng ở dạng thông thường. Dùng theo cách này mức tiêu tốn nguyên tố Sắt hoặc Đồng cho mỗi ha không vượt quá 80mg, cho Coban (Co) không quá 1000mg (C. Srinivasan, R. Saraswathi – 2010). Khi nghiên cứu sử dụng Coban cho mục đích này M. V. Kytskir, A. A. Nazarova, S. D. Polishuk và cs (2012) đã cho thấy, ngô và hướng dương sau khi được xử lý hạt Coban siêu nhỏ trước khi gieo trồng đã làm tăng sản lượng Ngô 24,4% và hàm lượng vitamin A tăng 32,8%, trong khi sản lượng hạt Hướng Dương tăng 16,9% và hàm lượng protein và dầu trong hạt tăng 45% và 8,6%. Một nghiên cứu của Eskov E. K., M.D. Eskova và G. I. Trurilov (2011) còn cho thấy khả năng sử dụng hạt Sắt kim loại siêu nhỏ để xử lý hạt giống còn làm giảm sự hút kim loại nặng từ đất đến 40%, từ đó tránh được khả năng phải dùng tới 20-40 tấn Dolomit hoặc Zeolit hay Than Hoạt Tính cần bón vào đất để kéo giảm sự ô nhiễm kim loại nặng cho nông sản v.v 1.1.2. Nghiên cứu sử dụng các hạt nano để phòng trừ bệnh hại Các nghiên cứu về việc sử dụng các hạt siêu nhỏ cỡ Nanomét dùng làm thuốc diệt nấm, khuẩn được tập trung nhiều vào các kim loại như Bạc, Đồng, Kẽm. Nhưng hiệu quả được đánh giá cao nhất là đối với Bạc và Đồng. Mặc dù vậy, việc nghiên cứu ứng dụng các hạt này trong nông nghiệp còn rất hạn chế, nếu không muốn nói là hầu như chưa có. Các lĩnh vực ứng dụng các hạt Nano chống nấm và vi khuẩn thường là trong may mặc, sơn, xử lý gỗ, mỹ phẩm v.v Các tác giả Ashavani Kumar, Praveen KumarVemula, Pulickel M. Ajayan & George John(2008) , cho thấy việc sử dụng các hạt Nano Bạc để phủ các bề mặt như gỗ, kính, kim loại và các hợp chất polyme khác có hiệu quả tuyệt vời để chống lại cả 2 loại mầm bệnh gram dương trên người (Staphylococcus aureus) và các vi khuẩn gram âm (Escherichia coli). 5
  17. Đồ án tốt nghiệp Ứng dụng của các hạt Nano còn được tác giả Alex Tiller (2008) đề cập đến trong nhiều lĩnh vực, trong đó có công nghệ thông tin trong nông nghiệp. Tác giả cho rằng hiện tại các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng các hạt có từ tính cỡ Nanomét để giám sát và điều khiển các hoạt động sinh học của cây ở mức độ các mô và thậm chí một tế bào đơn lẻ. Các “hạt thông tin” này còn có khả năng dự báo động đất hay đóng mở các vòi tưới cho các hệ thống tưới ngoài đồng. Một số nhà khoa học còn mơ đến một ngày mỗi cây trồng đều được cài đặt một cảm biến và đồng hồ sinh học, mà nó có thể thông tin chính xác các nhu cầu và thời điểm chúng cần. Trong bài viết “Công nghệ Nano sử dụng trong nông nghiệp: Lợi ích và rủi ro tiềm tàng” tác giả Jason C. White (2013) cho rằng các hạt Nano không phải chỉ do con người tạo ra, mà nó đã đồng hành với loài người từ khi con người xuất hiện trên trái đất này. Các hạt Nano được hình thành từ sự xói mòn, từ sự cháy, từ núi lửa và sóng biển. Chính vì vậy mà hạt Nano không phải là cái gì đó gây hại hoặc xấu. Hoạt động của con người cũng tạo ra các hạt Nano, như đốt than, khói xe, và sự phân hủy của các lốp xe. Tác giả cho rằng khả năng con người tạo ra các hạt Nano đã tăng lên mạnh mẽ trong khoảng 10 năm cuối. Tính chất của các hạt Nano rất khác biệt so với chính chúng ở trạng thái khối lớn, hoặc không phải ở kích thước Nano. Chính vì nó có diện tích bề mặt rất lớn ở cùng 1 khối lượng nên nó được dùng phủ cho các bề mặt hoạt động hoặc cho các đặc tính mong muốn khác. Thường thì đặc tính đặc biệt này rất có ích và có lợi. Tác giả còn dự báo công nghiệp công nghệ Nano mới chỉ khoảng 1 tỷ Đô la năm 2005, sẽ tăng lên 1 ngàn tỷ vào năm 2015. Tác giả cho rằng sử dụng công nghệ Nano trong nông nghiệp cũng nhận được sự quan tâm rất lớn. Các ứng dụng nhằm nâng cao mức sản xuất cũng như năng suất cây trồng, tăng hệ số sử dụng các nguồn tài nguyên, giảm thiểu chất thải v.v Các ứng dụng cụ thể được nhắc đến như phân bón Nano, thuốc trừ sâu Nano, xử lý chất thải nông nghiệp bằng công nghệ Nano, cảm biến sinh học Nano v.v Về vấn đề rủi ro tiềm tàng, tác giả cho rằng, các tài liệu về độc tính của các hạt Nano đối với cây trồng không có nhiều. Hầu hết các nghiên cứu chỉ quan tâm đến sự so sánh các vật liệu Nano với chính nó ở trạng thái thông thường hoặc ion. 6
  18. Đồ án tốt nghiệp Công nghệ nano ra đời đã tạo nên bước nhảy đột phá trong ngành điện tử, tin học, y sinh học, được ứng dụng rộng rãi trong đời sống như gạc chữa bỏng được phủ nano bạc, nước rửa rau sống, chất diệt khuẩn khử mùi trong máy lạnh (Lê Xuân Đính- 2013) Ở Việt Nam cũng đã có quảng cáo các chế phẩm từ công nghệ Nano, trong đó chủ yếu là Nano bạc, như Nano Bạc chuyên dùng trong sinh hoạt hàng ngày, Nano Bạc chuyên phòng và trị bệnh cho tôm cá, Nano Bạc chuyên phòng và trị bệnh trong trồng trọt, Nano Bạc chuyên phòng và trị bệnh cho đàn vật nuôi, Nano Bạc trong nuôi trồng thủy sảnv.v Các tác giả Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu và cộng tác viên (2008) đã có công bố công trình nghiên cứu “Chế tạo các hạt Nano Bạc bằng phương pháp chiếu xạ, dùng Polyvinyl pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định”, trong đó kết luận đã chế tạo thành công keo Nano Bạc bằng phương pháp chiếu xạ ¥ Co-60, với kích thước các hạt từ 2 – 15 nm. Cũng đã có một số tác giả thực hiện nghiên cứu về công nghệ sản xuất các hạt Nano kim loại, trong đó có tác giả Nguyễn Việt Dũng (2009) đã thực hiện đề tài về nghiên cứu công nghệ chế tạo hạt Nano Đồng. Tác giả Dũng cho rằng, trong những thập niên gần đây, Nano đồng đã thể hiện được vị trí riêng của mình và xuất hiện ngày càng nhiều trong các lĩnh vực. Đầu tiên là lĩnh vực bôi trơn, Nano Đồng được sử dụng kết hợp với các loại dầu nhờn truyền thống tạo nên một chất bôi trơn có khả năng dẫn nhiệt cao. Trong lĩnh vực xúc tác, Nano Đồng đóng vai trò chất xúc tác cho phản ứng phân huỷ CCl4, phản ứng Ullmann (phản ứng tổng hợp các hợp chất biaryl và polyaryl) . Trong lĩnh vực vật liệu, Nano Đồng góp phần làm tăng độ dẫn điện của nhựa epoxy, làm cầu nối trong các vi mạch điện tử . Trong lĩnh vực sinh học Nano Đồng được dùng làm chất diệt khuẩn E.Coli, Staphylococcus aureus . Trong lĩnh vực y học, hệ keo Nano Đồng cũng được xem như một loại thuốc sát trùng và thuốc điều trị ung thư đầy hứa hẹn. Đặc biệt các hạt nano nói chung và nano đồng được đánh giá là bước đột phá mới trong nông nghiệp để phòng trừ bệnh hại cây trồng. Kể 7
  19. Đồ án tốt nghiệp từ đầu những năm 1930 các hạt nano đồng hòa tan trong nước đã được sử dụng làm thuốc diệt nấm để kiểm soát nho và bệnh cây ăn quả (Kamel et al, 2014) Nano Đồng có thể được điều chế nhờ các phương pháp, như phương pháp polyol với sự hỗ trợ vi sóng, phương pháp khử hoá học, phương pháp quang hoá, phương pháp điện hoá, phương pháp lắng đọng hơi vật lý hoặc hoá học, phương pháp nhiệt phân , phương pháp siêu âm nhiệt (sonothermal), phương pháp siêu âm hoá học (sonochemical), . Trong số đó, phương pháp polyol với sự hỗ trợ vi sóng có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác. Đây là phương pháp điều chế Nano không quá phức tạp, phản ứng diễn ra êm dịu, dễ kiểm soát, thời gian chế tạo ngắn, độ tinh khiết sản phẩm cao, kiểm soát được thành phần, kích thước và hình dạng của sản phẩm, thiết bị đơn giản, dễ sử dụng. Tuy được quan tâm nghiên cứu nhiều nhưng trên thực tế ở Việt Nam chưa có nhiều chế phẩm Nano kim loại thực sự bước ra và đứng vũng trên thị trường, nhất là trong lĩnh vực nông nghiệp. Với chế phẩm Nano Bạc thì đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng trên thực tế nông nghiệp ở Việt nam, nhưng chế phẩm từ Nano Đồng thì hầu như chưa có. Được biết đã có tác giả bảo vệ thành công tiến bộ kỹ thuật về Nano Đồng, ứng dụng trừ nấm cho cây trồng, nhưng sau khi ra thị trường thì chế phẩm này bị ngưng sản xuất vì các hạt Đồng sớm bị lắng đọng trong thời gian một vài tháng. 1.2.Tổng quan về nano đồng 1.2.1.Cấu trúc về hạt nano đồng Về cấu trúc nguyên tử, tinh thể Đồng thuộc mạng lập phương tâm mặt (FCC), có hệ số xếp chặt là 0.74.Có bán kính nguyên tử là 1.96Å, bán kính ion là 1.22Å. Ái lực electron là 119.159 kJ.mol-1. Năng lượng ion hóa thứ nhất cao 745.482 kJ.mol-1 và năng lượng ion hóa thứ 8 là 16017 kJ.mol-1. 8
  20. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1. Cấu trúc lập phương tâm mặt (FCC) của Đồng Đồng có cấu hình electron là [Ar] 3d104s1, có một electron lớp ngoài cùng ở phân lớp s và đạt trạng thái bán bão hòa nên phân lớp d có 10 electron. Đồng khối có nhiệt độ nóng chảy tương đối cao, ở 1084.62 °C (1984.32°F, 1357.77 K), sôi ở nhiệt độ cao 2560°C (4640°F, 2833 K). 1.2.2. Ứng dụng của hạt nano đồng Ứng dụng tuyệt vời của hạt nano Đồng là hệ thống truyền nhiệt,kháng khuẩn, vật liệu siêu bền,cảm biến và làm chất xúc tác,giúp ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật (E.coli và S.cerevisiae).Ngoài ra, do sự ổn định của các hạt nano Đồng cộng với tính chất khử trùng mạnh mẽ của chúng nên các hạt nano Đồng có thể được sử dụng trong sơn hoặc nhựa phủ bên ngoài các thiết bị bệnh viện.( theo Saterlie, M., Sahin, H., Kavlicoglu, B., Liu, Y. & Graeve, 2011) Các chất lỏng thường có đặc tính truyền nhiệt kém nhưng khi kết hợp các chất lỏng này với các hạt nano kim loại sẽ giúp tăng độ dẫn nhiệt lên gấp 3 lần so với một chất lỏng tinh khiết và có thể tăng gấp hai lần tỷ lệ chuyển giao nhiệt của chất lỏng. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và chỉ ra rằng chỉ cần thêm 0.3% thể tích các hạt nano Đồng với đường kính trung bình nhỏ hơn 10nm vào trong dung dịch ethylene glycol sẽ làm tăng tính dẫn nhiệt của nó lên 40%.(Ma, H. Introduction, 2015) Bên cạnh tính chất trên, các hạt nano Đồng được sử dụng trong công nghệ pin nhiên liệu với sự hỗ trợ của một oxít kim loại như ZnO hoặc CeO2 có thể giúp chuyển đổi một phần lớn khí CO thành CO2.Đặc biệt,người ta thấy rằng, các hạt nano Đồng có khả năng hoạt động xúc tác mạnh nhất khi chúng có khích thước rất nhỏ (2-4nm). 9
  21. Đồ án tốt nghiệp Trong lĩnh vực kháng khuẩn: đồng được xem như một kim loại vệ sinh tự nhiên , làm giảm quá trình phát triển của các loài vi khuẩn như E-Coli, MRSA (Staphylococus aureus) và Leginella (O'Gorman, J. & Humphreys,2012) 1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 2011, nhóm tác giả Đặng Thị Mỹ Dung và các cộng sự đã tổng hợp được hạt nano Đồng có kích thước 10nm, sử dụng tiền chất CuSO4, chất khử NaBH4 cùng dung môi Polyethylene glycol (PEG). Sau khi tổng hợp thành công các hạt nano Đồng, nhóm tác giả nghiên cứu chế tạo mực in phun nano kim loại và ứng dụng trong công nghệ in các mạch in điện tử bằng công nghệ in phun nhằm giải quyết các vấn đề công nghệ phát sinh và làm chủ các thông số công nghệ in phun để có thể in được các điểm, đường và màng mỏng dẫn điện, chế tạo hạt nano kim loại Đồng (Cu) và chế tạo mực in nano kim loại Đồng từ hạt nano kim loại Đồng được chế tạo. Năm 2012, nhóm tác giả Võ Quốc Khương và các cộng sự đã sử dụng tiền chất Cu(NO3)2.3H2O, chất khử là N2H4.2H2O trong dung môi nước và chất làm bền CTAB, PVP để tổng hợp thành hạt nano Đồng có đường kính 10nm. Hiện nay, nano đồng được biết đến nhiều nhất và được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nộng nghiệp đó là chế phẩm thương mại Cup 2.9 SL, chế phẩm này được bán dưới dạng phân bón vi lượng ( theo Le Xuân Đính và cs, 2013). Chế phẩm này có kích thước hạt từ 5-7nm và phân tán rất bền, hầu như không bị lắng qua nhiều năm cất trữ. Trên thực tế, người dân đã sử dụng chế phẩm này để phòng và trị bệnh chết nhanh, chế chậm trên cây tiêu, có hiệu quả tốt; dùng trị bệnh ghẻ trái, xì mủ và rêu mọc trên cây cam quýt và nhiều cây thân mộc khác; dùng trị bệnh héo xanh chết dây trên cây bầu bí; trị bệnh cháy bìa lá trên cây lúa; dùng phòng và trị bệnh trên cây hành, táo, măng tây v. Năm 2014, nhóm PGS.TS Ngô Quốc Bưu và các cộng sự thuộc Viện Công nghệ môi trường đã ứng dụng nghiên cứu xử lý hạt nano kim loại Đồng vào cây họ đậu để tăng tỷ lệ nảy mầm, lượng diệp lục và năng suất chung cho cây đậu tương. Đặc biệt, nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano Đồng đối với ngô của nhóm các nhà khoa học gồm Churilov, Ngô Quốc Bưu và Nguyễn Hoài Châu đã cho thấy, ngô 10
  22. Đồ án tốt nghiệp gieo từ hạt được xử lý nano, có chiều dài mầm, khối lượng rễ, diện tích lá, hàm lượng chất béo, protein, cellulose và khối lượng chất khô đều cao hơn so với đối chứng. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 2013, Suresh K.Bhargava và Vipul Bansal đã sử dụng vi khuẩn Morganella RP4 và Morganella psycgotolerans- một vi khuẩn làm bền bạc để tổng hợp nano đồng. Năm 2013, đại học quốc gia Chugbuk- Hàn Quốc, nano đồng được tổng hợp bằng cách sử dụng dịch chiết lá cây để làm chất khử. Phản ứng CuSO4.5H2O với dịch chiết cây mộc lan trong môi trường nước. Năm 2014 nghiên cứu của Wei-Chen tại trường Đại học Texas ở Arlington cũng đã nghiên cứu loại vật liệu Cu-cy, với tính chất khi tiếp xúc với tia X sẽ làm giảm sự phát triển cả các khối u. Cụ thể, hạt nano đồng phát quang này được sử dụng trong phát hiện bức xạ trong điều trị ung thư. 1.3. Các loại nấm bệnh cây trồng 1.3.1 Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) Nấm Fusarium là một trong những loài nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng nhất.Fusarium gồm nhiều loài khác nhau có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau. Nhiều loài sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến động vật hoang dã, thú nuôi và con người. Tuy nhiên có nhiều loài nấm Fusarium là nấm hoại sinh phổ biến trong đất.Nấm này phân bố khắp các nơi trên thế giới, một vài loài có xu hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số loài chủ yếu xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt đới, ôn đới . Nấm Fusarium sp. tấn công chủ yếu vào bộ rễ. Đặc biệt, bệnh gây hại nặng nề trong diều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương. Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây trồng ở nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu đỗ. Hầu hết các loài gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxysporum complex. Nhóm Fusarium oxysporum complex có rất nhiều dạng chuyên hóa khác nhau, mỗi nhóm gây hại trên một nhóm kí chủ nhất định. 11
  23. Đồ án tốt nghiệp Bệnh gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ của cây khoai tây và cà chua. Ở gốc cây, vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc, gây hiện tượng thối khô tóp lại, cắt ngang phần thân cây bệnh thấy có đường bó mạch tròn quanh thân màu nâu xám. Triệu chứng ban đầu là có một vài lá khô héo vàng loang lổ và rụng xuống, sau đó toàn bộ lá héo rũ vàng dẫn đến chết cây. Lúc đầu trên ruộng chỉ có một vài cây héo vàng, nếu bị nặng có thể cả ruộng bị héo vàng và chết. Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp. là: bón phân đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ vi sinh vật trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho nấm Fusarium sp. Nấm phát triển và gây hại nặng trong điều kiện ấm và ẩm, khi nhiệt độ đất ở 25-300C và độ ẩm cao kết hợp với điều kiện cây sinh trưởng yếu thì nấm dễ dàng gây bệnh. Nấm xâm nhiễm vào cây trồng qua vết thương cơ giới trên rễ cây. Nấm gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài. Chúng lan truyền từ vùng này sang vùng khác thông qua hạt giống, cây giống, nguồn nước tưới Hình 1.2.Một số biều hiện gây bệnh do nấm Fuasarium sp. gây ra (trongraulamvuon.com). 1.3.2 Bệnh do nấm Colletotrichum spp.gây ra Nhiều nhà nghiên cứu bệnh cây thường dùng từ “thán thư” để chỉ các bệnh do Colletotrichum gây ra. Triệu chứng của bệnh là việc hình thành các vết đốm hoại tử màu đậm, lõm xuống, vết bệnh thường có vòng tròn. Nấm Colletotrichum spp. có khả năng tấn công lên hầu hết những cây trồng vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, là 12
  24. Đồ án tốt nghiệp nguyên nhân gây ra thiệt hại to lớn đối với sự tạo trái hoặc quả của cây trồng do sự ra hoa của cây giảm khi nấm tấn công lên lá, chồi, hoa, trái của nhiều loại cây: ca cao, tiêu, cà phê, cà chua,thanh long, chuối, xoài, táo, nho, đu đủ, dâu tây và một số loại cây trồng khác (Holliday, 1980; Agrios, 2005). Bên cạnh đó, bệnh này không chỉ gây hại ngoài đồng mà còn gây hại trên quả sau khi thu hoạch (Hadden và Black, 1989). Triệu chứng và dấu hiệu của bệnh thán thư có thể thay đổi theo cây ký chủ, bộ phận cây bị tấn công và điều kiện ngoại cảnh nhưng nhìn chung đều là các vết đốm chết hoại, trên vết đốm có các ổ bào tử (đĩa cành nấm) màu gạch non hoặc đen. Nấm Colletotrichum coffeanum gây bệnh trên cây cà phê làm trái còn non bị hư hỏng, hạt cà phê hư hỏng từ 20– 80%. Khi bệnh mới xuất hiện trên lá, cành, thân làm rụng lá, cành trơ trụi khô đen. Bệnh thường phát sinh gây hại từ giai đoạn cà phê ra hoa đến khi quả già, nhất là trong thời tiết ẩm thấp, mưa nhiều. Hình 1.3.NấmColletotrichum coffeanum gây bệnh khô cành khô quả ở cây cà phê (baovethucvatcongdong.info). Bệnh thán thư trên cây tiêu do nấm Colletotrichum gloeosporiodies. Bệnh thường gây hại ở đầu mép lá tiêu, làm lá bị cháy, trường hợp nhiễm nặng lá sẽ bị rụng, có thể gây hại thân, nhánh cây tiêu làm tháo đốt, khô cành. Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường phát triển vào mùa mưa. 13
  25. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colectotrichum gleosporiodies gây ra trên cây tiêu (phongtribenhtrentieu.blogspot.com). Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất ớt trên toàn cầu (Kim, 2007). Bệnh tấn công lên lá, thân và quả làm giảm năng suất. Hình 1.5.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt (Jaw-Fen Wang, 2010). Năm 2009, Masanto Masyahit được xem là người đầu tiên ở Malaysia báo cáo bệnh thán thư trên thanh long do tác nhân chính là Colletotrichum gloeosporioides. Theo kết luận của báo cáo thì bệnh chịu tác động của yếu tố điều kiện môi trường và kỹ thuật canh tác hơn là những yếu tố khí hậu. 14
  26. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6.Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioidesgây ra trên trái thanh long và cành thanh long (Masanto Masyahit, 2009). 1.3.3 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp.gây ra(Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) Ở Việt Nam có nhiều bệnh do nấm Rhizoctonia gây ra. Một số loài phát triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc ẩm độ cao. Nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt đất ở cây non và trên bắp, thân và lá ở cây trưởng thành. Một số triệu chứng thường gặp do Rhizoctonia gây ra bao gồm: thối rễ, lở cổ rễ cây non, teo thắt thân, khô vằn và thối nhũn. 15
  27. Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1.Đặc điểm gây hại của các loài Rhizoctonia (Nguyễn Thị Hai, 2013) - Các triệu chứng phụ thuộc vào loài, chủng nấm và cây ký chủ, bao - gồm lở cổ rễ cây con, héo, chết cây con, thối rễ con và thối rễ. Thối Triêu trứng - bắp cải do Rhizoctonia gây ra những vết thối đen trên lá. Bệnh khô chính - vằn lúa và khô vằn ngô gây ra các vết bệnh màu vàng và các vết - mất màu bất thường xen kẽ. - Việc chẩn đoán thường phụ thuộc vào quá trình phân lập và giám - định nấm thuần trên môi trường nhân tạo. Các hạch nấm điển hình Dấu hiệu chẩn đoán - màu nâu, hình dạng bất định được hình thành ở một số loài trên - các mô ký chủ bị bệnh. - Các sợi nấm Rhizoctonia trong tàn dư cây bệnh xâm nhiễm trực tiếp Xâm nhiễm - vào mô cây và một số tạo các cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt. Hạch - nấm nảy mầm tạo ra sợi nấm xâm nhiễm vào cây - Băng một số loại thuốc trừ nấm. Phòng trừ - Đối kháng bằng nấm Trichoderma spp. Vết bệnh ở cây con thường có màu nâu, thối nhũn và teo thắt lại ở phần thân sát mặt đất và dẫn tới hiện tượng cây bị đổ rạp trên mặt đất được gọi là lở cổ rễ cây con. Trên những cây già hơn vết bệnh hóa gỗ rắn chắc và thắt lại tại phần thân tiếp giáp với mặt đất gọi là hiện tượng teo thắt thân. Trên lúa và ngô những vết chết loang lổ như hình vân mây trên phiến lá và bẹ lá được gọi là bệnh khô vằn. Bệnh thường xuất hiện khi cây đã lớn và đang đóng bắp. 16
  28. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7.Biểu hiện bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra trên cây ngô (tiennong.vn). Nấm này còn gây bệnh trên cây cải bắp và xà lách gọi là bệnh thối ướt, vết bệnh lúc đầu là vết lá chết màu nâu vàng ở các lá ngoài, sau đó vết bệnh lan rất nhanh và gây thối toàn bắp. Nấm Rhizoctonia solani là một nấm có thể kí sinh trên rất nhiều loại cây trồng. Nấm phát triển rất nhanh, hạch nấm và sợi nấm có thể tồn tại trên các mô cây sống hoặc tồn tại trong tàn dư cây trồng và trong đất trong thời gian dài vì chúng chứa một lượng lớn chất dự trữ. Sự xâm nhiễm của đất bắt đầu từ hạch nấm, nguồn hạch nấm có thể từ đất, rễ, tàn dư cây trồng, hạt hay củ giống bị bệnh. Hạch nấm khi nảy nầm có thể tạo thành sợi nấm, sợi nấm tiếp xúc với mô cây, xâm nhiễm trực tiếp xuyên vào trong tế bào cây. Trong một số trường hợp, sợi nấm xâm nhiễm qua mô chết hay qua các vết thương cơ giới trên cây. Quá trình xâm nhiễm làm cản trở quá trình hút nước và trao đổi chất dinh dưỡng, kết quả làm cho mô cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống. Bên cạnh đó, nấm Rhizoctonia solani còn sản sinh enzyme cellulilitic và pectinolitic và độc tố thực vật. Độc tố này giết chết mô chủ, khi mô chủ bị chết và bị phân hủy giải phóng chất hữu cơ làm trăng sự sinh trưởng tiếp tục của nấm. Kết quả làm cho mô cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối 17
  29. Đồ án tốt nghiệp và cây bị đổ rạp xuống. Rhizoctonia có thể gây hại trên cay rau màu quanh năm, nhưng phổ biến nhất là trong vụ Xuân. Tại Việt Nam, nấm thường xuất hiện trên bắp cải, ngô và các loại cây rau màu. Thời tiết nóng ẩm rất thích hợp cho nấm phát triển, triệu chứng bệnh có thể xuất hiện từ 3– 7 ngày sau khi diễn ra quá trình xâm nhiễm. Hình 1.8.Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh,(d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008). 18
  30. Đồ án tốt nghiệp Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 5/2015 đến tháng 8/2015. Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường thuộc trường Đại học Công nghệ Tp.HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Nguồn mẫu 2.2.1.1. Nguồn mẫu đồng – Mẫu nano đồng do phòng lap Cao Minh Thì- trung tâm nghiên cứu công nghệ nano cung cấp có kích thước hạt là 20nm, nồng độ đồng nano là 0,76%. 2.2.1.2. Nguồn mẫu nấm bệnh Cây cà chua bị bệnh lở cổ rể được thu thập tại các vườn trồng cà chua ở huyện Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh. Trái thanh long bị bệnh được thu thập tại vườn thanh long ở Long An. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1.Dụng cụ – Ống nghiệm – Đĩa petri – Que cấy – Đũa thủy tinh – Khoan thạch hình trụ – Cốc thủy tinh – Ống đong – Đèn cồn 2.2.2.2.Thiết bị – Tủ cấy – Máy hấp Autoclave – Kính hiển vi 19
  31. Đồ án tốt nghiệp – Tủ lạnh – Cân phân tích – Máy cất nước – Bếp từ – Tủ ủ 2. 3. Hóachất D-Glucose Agar Nước cất Cồn 700, 960 2. 4 Môi trường nuôi cấy a.Môi trường phân lập nấm bệnh Môi trường WA (Water Agar) Thành phần môi trường: - Nước cất: 1000 ml - Agar: 20 g/l - Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l Cho agar và thuốc kháng khuẩn vào nước cất đun sôi, đem hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, để môi trường hạ xuống nhiệt độ 600C, đem đổ môi trường. Môi trường WA là môi trường phổ biến để phân lập nấm bệnh. b. Môi trường nuôi cấy nấm bệnh và khảo sát khả năng kháng bệnh của Cu- nano Môi trường Potato D-Glucose Agar (PDA) Thành phần môi trường: - Nước cất: 1000 ml - Agar: 20 g/l - D – Glucose: 20g - Khoai tây: 200g - Thuốc kháng khuẩn Chloramphenycol: 0,25 g/l 20
  32. Đồ án tốt nghiệp Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt hạt lựu, cân đủ 200 g cho nước cất vào đun sôi khoảng 20 phút kể từ khi bắt đầu sôi. Lọc bỏ phần bã, đun sôi trở lại, tiếp theo cho lần lượt đường và agar vào (Lưu ý vừa cho vừa khuấy đều để tránh bị vón cục). Cho vào bình môi trường, đem hấp khử trùng ở nhiệt 1210C trong 20 phút. 2.5. Bố trí thí nghiệm: _ Phân lập nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà chua. _ Phân lập nấm gây bệnh thán thư trên trái thanh long. _ Tiến hành thí nghiệm khảo sátmức độ kháng bệnh của Cu-Nano trên các loại nấm gây bệnh hại cây trồng là Fusarium sp.; Rhizoctonia sp.;Colletotrichum sp. trên môi trường PDA. 2.5.1.Phương pháp phân lập nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà chua và thán thư trên trái thanh long(Agrios, 2005) ❖ Các bước thu mẫu Chọn các mẫu mới bị bệnh để phân lập. Mẫu được đựng trong các túi nilon đã hấp khử trùng. Mỗi mẫu bệnh được cho vào từng túi riêng, ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy. Mẫu lấy về, phân lập sớm nhất trong thời gian có thể hoặc bảo quản trong tủ mát để tránh bị các loại nấm và vi khuẩn hoại sinh lây nhiễm, phát triển và lan nhanh. ❖ Các bước phân lập, cấy truyền và làm thuần mẫu nấm bệnh Khử trùng mẫu cấy: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ bụi bẩn. Dùng dao mổ đã khử trùng cắt những mẫu cấy nhỏ từ phần ranh giới giữa mô không có dấu hiệu bệnh và mô mới bị bệnh.Khử trùng mẫu bệnh bằng cách nhúng nhanh vào cồn 700 trong 30 giây, rửa lại nhiều lần trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng. Dùng kẹp đã khử trùng gấp giữ và ấn nhẹ những mẫu cấy lên mặt thạch gần mép đĩa môi trường phân lập WA. Đặt ngược đĩa cấy để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những mẫu cấy, dùng que cấy đã khử trùng cấy truyền bằng cách cấy đỉnh đầu sợi nấm sang đĩa môi trường PDA để tách rời các chủng nấm. Tiến hành làm thuần các mẫu nấm qua nhiều lần cấy truyền. 21
  33. Đồ án tốt nghiệp Các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vi sinh dưới ngọn lửa đèn cồn. Hình 2.1.Quy trình phân lập nấm bệnh từ mẫu thực vật nhiễm bệnh ❖ Tần suất xuất hiện (%) của chủng nấm phân lập được tính theo công thức: Tần suất bắt gặp = A/B x 100 Trong đó: A là số lần xuất hiện của chủng nấm. B là tổng số mẫu phân lập. 2.5.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) ❖ Quan sát đại thể nấm sợi Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 1 tuần. Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; Dạng sợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; Màu sắc của môi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử trong thời gian nuôi ủ. ❖ Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phòng ẩm. Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. 22
  34. Đồ án tốt nghiệp Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1 cm2) từ đĩa môi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy.Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm thí nghiệm cấy vào 4 mặt bên của khối thạch.Sau đó đậy lamelle lên trên khối thạch.Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 4 – 5 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn; Hình dạng cuống bào tử; Đặc điểm hình dạng. màu sắc, kích thước bào tử 2.5.3. Chuẩn bị dung dịch đồng nano để làm thí nghiệm Chuẩn bị: – Muối Đồng (II) chloride dehydrate CuCl2.2H2O 99.0% (Merck) – Chất khử: Sodium borohydride(NaBH4) 92.0% (China) – Dung môi: nước cất – chất bảo vệ: Polyvinylpyrrolidone (PVP, Mw = 40.000 g/mol) (China) Quy trình thí nghiệm: Dung dịch CuCl2.2H2O 23 Dung dịch PVP (gia nhiệt)
  35. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.2.Quy trình tổng hợp hạt nano Đồng Cân 0.17(g) CuCl2.2H2O cho vào becher + 50 ml nước cất khuấy đều; 0.19(g) NaBH4 vào becher + 25ml nước cất khuấy đều; 1.6(g) PVP vào becher + 10ml nước cất và được gia nhiệt trên máy khuấy từ.Sau đó cho dung dịch CuCl2.2H2O đã được phân tán đều vào dung dịch PVP (0,004M) đang gia nhiệt dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh nhạt.Sau đó nhỏ từng giọt dung dịch NaBH4 vào dung dịch CuCl2.2H2O + PVP sẽ xuất hiện màu đỏ, thu được dung dịch chứa nano đồng. 24
  36. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3.Dung dịch nano đồng 2.5.3 Chuẩn bị đĩa môi trường có bổ sung nano đồng để thử nghiệm (b) Đối với từng loại nấm bệnh, thí nghiệm gồm các công thức như sau: ❖ Công thức 1: đối chứng – môi trường PDA không bổ sung dung dịch nano đồng. ❖ Công thức 2: môi trường PDA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 300ppm. ❖ Công thức 3: môi trường PDA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 380ppm. ❖ Công thức 4:môi trường PGA có bổ sung dung dịch nano đồng liều 450ppm. Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 đĩa Cách thực hiện: môi trường PDA sau khi được hấp khử trùng, để nguội xuống khoảng 500C thì bắt đầu hút dung dịch nano đồng cho vào môi trường lần lượt theo liều lượng như trên. Tiến hành đổ đĩa, để cho đĩa môi trường đông lại hoàn toàn. 25
  37. Đồ án tốt nghiệp 2.5.4. Đánh giá khả năng kháng nấm của dung dịch nano đồng ở các nồng độ - Dùng cây đục lỗ đường kính 5 mm, đục lỗ thạch trên đĩa petri có chứa sinh khối nấm bệnh từ đĩa nấm bệnh đã làm thuần trước đó. - Dùng dao cấy chuyển cục thạch vừa đục xong sang đĩa môi trường (b) vô trùng đã chuẩn bị sẵn. - Ghi chú tên nấm, ngày, giờ cấy và đem ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát sự phát triển của nấm. Chỉ tiêu theo dõi: – Đo đường kính tản nấm (mm) ở các ngày sau cấy đến khi tản nấm chạm thành đĩa. – Đường kính trung bình tính theo công thức: = d1+ d2 2 (Trong đó, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố) – Tính độ hữu hiệu của thuốc theo công thức Vincent (1927) − 𝑖ệ 푙ự ủ 푡ℎ ố (%) = × 100 Trong đó: C: Đường kính tản nấm trên môi trường không thuốc T: Đường kính tản nấm trên môi trường có thuốc 26
  38. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập nấm gây bệnh lở cổ rễ trên cây cà chua Từ cây cà chua bị bệnh ở Củ Chi- TP Hồ Chí Minh và thán thư trên trái thanh long sinh viên tiến hành phân lập, làm thuần và đã thu được một số chủng nấm như sau: Chủng nấm thứ nhất A B V B C D Hình 3.1.Hình thái đại thể và vi thể chủng nấm Fusarium sp.(a. Mặt trên tản nấm, b. Mặt dưới tản nấm, c. sợi nấm, d. bào tử). 27
  39. Đồ án tốt nghiệp Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái tản nấm chủng nấm thứ nhất, mặt trên tản nấm có màu trắng hơi ngả sang màu kem, hình thể tơi xốp, ở giữa phồng lên như bông gòn. Sợi nấm đan xen vào nhau và phát triển rất nhanh trên môi trường PDA. Mặt dưới tản nấm có vòng tròn đồng tâm, có màu vàng nhạt đến vàng cam hơi hồng. Đặc điểm vi thể: Qua quá trình quan sát bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào tử nấm có kích thước lớn, có hình dạng lưỡi liềm, dạng cong quẹo hoặc thon dài. Bào tử có 3 đến 5 vách ngăn được hình thành trên bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất dài hoặc trên các cành bào phân sinh nhánh. So sánh với đặc điểm mô tả về nấm Fusarium sp.của Agrios (2005) như:. mặt trên tản nấm Fusarium sp. có màu trắng kem, vàng hoặc vàng cam. Mặt dưới có thể không màu, vàng cam hoặc màu nâu. Bào tử có vách ngăn từ 1 - 3 ngăn, hình elip, hình cầu hoặc hình trứng , sinh viên khẳng định đây là nấm Fusarium sp. và sử dụng chúng làm chủng nấm để khảo sát trong thí nghiệm này. Chủng nấm thứ hai Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể tản nấm thứ hai , mặt trên tản nấm có màu trắng sốp sau chuyển thành màu nâu và hình thành nhiều hạch, nấm phát triển mạnh trên môi trường PDA. Mặt dưới có màu vàng nhạt đến cam nhạt. Đặc điểm vi thể: Khi quan sát qua kính hiển vi quang học ở vật kính 40X, bào tử chủng nấm thứ hai có dạng sợi đa bào, màu nâu, sợi nấm phân nhánh thẳng gốc 900 với sợi chính (đây là đặc điểm nhận dạng của nấm Rhizoctonia solani), ở chổ phân nhánh hơi thắt lại và có vách ngăn nhỏ.Vì vậy, sinh viên kết luận rằng đây là chủng nấm Rhizoctonia solani và sử dụng cho các nội dung tiếp theo 28
  40. Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.2.Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm Rhizoctonia sp. (a. Mặt trước tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c.Sợi nấm). Chủng nấm thứ ba: nấm gây bệnh thán thư trên trái thanh long Đặc điểm đại thể: Khi quan sát hình thái đại thể tản nấm thứ ba mặt trên tản nấm có màu trắng đến trắng xám nhạt hoặc xám đậm, ở giữa hơi phồng lên và phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây PDA. Mặt dưới có màu vàng nhạt đến cam nhạt với những đốm tròn nhỏ có màu đen nằm rãi rác. Đặc điểm vi thể: Khi quan sát qua kính hiển vi quang học ở vật kính 100X, bào tử chủng nấm 3 có hình que, khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn. Cuống bào tử không có vách ngăn,bào tử có hình que, trong suốt. 29
  41. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.3. Hình thái đại thể và vi thể của chủng nấm Colletotrichum sp.(a. Mặt trước tản nấm, b. Mặt sau tản nấm, c.Sợi nấm, d. bào tử nấm). Đối chứng với tài liệu của Nguyễn Văn Bá và ctv (2005), Vũ Triệu Mân (2012) và Agrios (2005), tản nấm Colletotrichum có màu trắng đến xám nhạt, giống bông gòn, sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn. Nấm này sinh sản bằng bào tử, bào tử không có vách ngăn, bào tử thon nhọn không phân nhánh. Chủng nấm này có những đặc điểm giống với mô tả của tác giả nên kết luận chủng nấm thứ 3 là nấm Colletotrichum sp. 30
  42. Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát kháng nấm của sản phẩm nano đồng. 3.2.1. Khảo sát khả năng kháng nấm Fusarium sp. của dung dịch nano đồng Fusarium sp. là nấm gây hại phổ biến trên nhiều loài cây trồng. Hiện nay, rất nhiều loại thuốc hóa học được sử dụng để trừ loài dịch gây hại này. Trong đó, nhóm thuốc gốc đồng được sử dụng khá nhiều, dẫn đến dư lượng đồng trong nông sản tăng cao cũng như gây ô nhiễm nguồn đất, nước Việc sử dụng nano đồng sẽ giúp giảm thiểu lượng hóa chất trong phòng trừ nấm Fusarium sp. nói riêng và nấm bệnh nói chung. Kết quả đánh giá khả năng kháng nấm Fusarium sp. của sản phẩm nano đồng được trình bày như sau: Bảng 3.1 Đường kính (mm) tản nấm Fusarium sp. ở các công thức xử lý nano đồng. Đường kính (mm) tản nấm Fusarium sp. ở các Công thức thí công thức qua các ngày theo dõi nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT 1: đối chứng 15,33±0,58a 62,00±3,0a 83,00±0,0a CT2: 300ppm 8,67± 1,15b 51,00 ± 7,81b 56,67±7,77b CT3: 380ppm 8,67±1,15b 44,0 ±0,0b 44,00±0,0b CT4: 450ppm 5, 00 ± 0,0c 5,00±0,0c 5,00±0,0c Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD Các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%. Kết quả trình bày ở bảng 3.1 cho thấy, ở các nồng độ thử nghiệm, nano đồng ít nhiều đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Fusarium sp Đường kính tản nấm ở tất cả các công thức có bổ sung thuốc đều nhỏ hơn hẳn so với đối chứng. Vào thời điểm 3 ngày sau cấy, đường kính tản nấm ở các công thức bổ sung 300ppm và 380ppm nano đồng chỉ mới khoảng 8,67 mm (đối chứng là 15,33mm) nhưng đến 9 ngày sau khi cấy, đường kính của tản nấm ở các công thức này tương ứng. Trong khi 31
  43. Đồ án tốt nghiệp đó, đường kính tản nấm Fusarium sp. gần như không tăng ở nồng độ bổ sung 450ppm nano đồng. 90 80 70 60 CT 1: đối chứng 50 CT2: 300ppm 40 CT3: 380ppm 30 CT4: 450ppm 20 10 0 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy Biểu đồ 3.1. Sự phát triển của đường kính tản nấm Fusarium sp. qua các ngày nuôi cấy ở các công thức. Hình 3.4.Đường kính của tản nấm Fusarium sp. 3 ngày sau khi cấy. 32
  44. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5.Đường kính của tản nấm Fusarium sp. 6 ngày sau khi cấy. Hình 3.6.Đường kính phát triển của tản nấm Fusarium sp. 9 ngày sau khi cấy. Dựa trên hiệu quả ức chế nấm Fusarium sp., số liệu ở bảng 3.2 cho thấy nano đồng có hiệu lực tốt đối với nấm Fusarium sp trong điều kiện in vitro. Tuy vậy, hiệu quả ức chế của nano đồng tăng dần theo nồng độ sử dụng. Vào thời điểm 3 ngày sau cấy, ở nồng độ 300ppm và 380ppm, thuốc chỉ ức chế được khoảng 43% sự phát triển của nấm nhưng sau đó, hiệu lực lại giảm hẳn. Trong khi đó, ở nồng độ 450ppm, thuốc có thể ức chế 67,38% sự phát triển của nấm vào thời điểm 3 ngày sau cấy và tăng lên đến 93,98% ở thời điểm 9 ngày sau khi cấy. Sỡ dĩ tỷ lệ ức chế nấm của thuốc tăng cao ở thời điểm này là do ở đĩa có thuốc nano đồng 450ppm nấm bị ức 33
  45. Đồ án tốt nghiệp chế mạnh và không phát triển thêm kể từ 3 ngày sau khi cấy. Trái lại, nấm ở đĩa môi trường tiếp tục phát triển, đường kính tăng dần theo thời gian. Kết quả này cũng trùng với nhận xét của nhiều tác giả khác, Kanhed et al (2014) cho biết, Nano đồng có khả năng ức chế cao với nấm Fusarium oxysporum. Thử nghiệm bón nano đồng cho cây cà chua trong nhà lưới, Wade Elmer (2014) cho biết, Nano đồng với liều dùng 100 và 1000µg/ml cho hiệu quả phòng trừ tốt đối với bệnh héo rũ do nấm Fuarium gây ra. Hiệu quả khống chế bệnh của Nano đồng tốt hơn so với các loại nano kim loại khác như Al, Fe, Mn, Ni, Zn và với chế phẩm đồng ở dạng hạt lớn hơn. Bảng 3.2. Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Fusarium sp. Hiệu lực (%) của dung dịch nano đồng đối với nấm Côngthức thí Fusarium sp. qua các ngày theo dõi nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT2: 300ppm 43,44 17,74 31,72 CT3: 380ppm 43,44 29,03 46,99 CT4: 450ppm 67,38 91,94 93,98 Như vậy, trong điều kiện invitro, dung dịch nano đồng 450ppm có hiệu quả ức chế rất cao với nấm Fusarium sp. gây bệnh lở cổ rễ cây cà chua. 3.2.Đánh giá khả năng kháng nấm Colletotrichum sp. của dung dịch nano đồng Colletotrichum sp. là một trong những loài nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt và nhiều loại cây trồng khác. Đây là bệnh rất khó phòng trừ vì khả năng lây lan mạnh, đặc biệt trong mùa mưa. Trên môi trường PDA. nấm phát triển nhanh, sau khi nuôi cấy 3 ngày đường kính tản nấm đã được 57mm và lan đầy đĩa sau 9 ngày nuôi cấy. Kết quả đánh giá hiệu quả ức chế nấm Colletotrichum sp. của Nano đồng được trình bày như sau: Bảng 3.3.Ảnh hưởng của nano đồng đến sự phát triển củanấm Colletotrichum sp. 34
  46. Đồ án tốt nghiệp Đường kính (mm) tản nấm Colletotrichum sp. qua Công thức thí các ngày theo dõi. nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT 1: đối chứng 57,33± 2,52a 80,67±1,15a 90,0±0,0a CT2: 300ppm 54,67 ± 3,51a 77,67±1,53a 80,33±1,53b CT3: 380ppm 53,0 ± 2,0ab 59,67±2,08b 64,0±1,0c CT4: 450ppm 48,33 ±2,08b 50,33±1,53c 54,67±1,53d Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD Các chữ cái trên cùng 1 cột có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95%. Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy, nấm Colletotrichum sp. có thể sinh trưởng và phát triển được ở các công thức nano đồng khác nhau. Sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm Colletotrichum sp. ở các công thức có bổ sung 300ppm và 380ppm nano đồng và công thức đối chứng là tương đương nhau (53- 57mm) và cao hơn so với công thức bổ sung 450ppm nano đồng (48,33mm).Đến 6 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm ở công thức 2 (300ppm nano đồng) đã phát triển đến 77,67mm tương đương với đường kính ở công thức đối chứng (80,67mm). Tản nấm ở công thức 3 (380ppm nano đồng) phát triển được 59,67mm, kém hơn so với công thức 2 (300ppm nano đồng) và công thức đối chứng nhưng cao hơn có ý nghĩa so với công thức 450ppm nano đồng (50,33mm). Đến 9 ngày sau khi cấy, nấm ở công thức đối chứng đã phủ kín đĩa (90mm). Trong khi đó, nấm ở công thức 2 (300ppm nano đồng) phát triển kém hơn hẳn nhưng tản nấm cũng có đường kính là 80,33mm. Tuy phát triển kém hơn công thức đối chứng và công thức 2 cũng như có sự suy giảm tăng dần theo nồng độ nano đồng nhưng đường kính tản nấm ở công thức 3 (380ppm nano đồng) và công thức 4 (450ppm nano đồng) cũng đạt tương ứng là 64mm và 54,67mm. Nhìn chung, số liệu ở bảng 3.3 cũng cho thấy, ở hầu hết các công thức, nấm Colletotrichum sp. phát triển kém hơn hẳn so với đối chứng nhưng chúng vẫn tăng trưởng qua thời gian nuôi cấy. Điều này thể hiện ở hình 3.8, đường kính tản nấm tăng dần qua các thời gian nuôi cấy. Hay nói cách khác, hiệu lực ức chế của nano 35
  47. Đồ án tốt nghiệp đồng không cao đối với nấm Colletotrichum sp Số liệu cụ thể về khả năng ức chế của nano đồng đối với nấm Colletotrichum sp. được trình bày ở bảng 3.4. 100 90 80 70 60 CT 1: đối chứng 50 CT2: 300ppm CT3: 380ppm 40 CT4: 450ppm 30 20 10 0 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy Biểu đồ 3.3. Sự phát triển của đường kính tản nấm Colletotrichum sp. qua các ngày nuôi cấy. 36
  48. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.7. Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichum sp. 3 ngày sau khi cấy A: Đối chứng ;B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 37
  49. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.8.Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichumsp. 6 ngày sau khi cấy A: Đối chứng ;B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 38
  50. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.9.Đường kính phát triển của tản nấm Colletotrichum sp. 9 ngày sau khi cấy. A: Đối chứng ; B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 39
  51. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Colletotrichum sp. Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối Công thức thí với nấm Colletotrichum sp. qua các ngày theo dõi. nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT2: 300ppm 4,64 3,72 10,74 CT3: 380ppm 7,55 26,03 28,89 CT4: 450ppm 15,70 37,61 39,26 Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy ,hiệu lực kháng nấm Colletotrichum sp. của dung dịch nano đồng khác nhau theo từng thời điểm và có sự tăng dần khi tăng nồng độ dung dịch đồng nano. Ở 3 ngày sau khi cấy, hiệu lực kháng nấm ở nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm là cao nhất (15,70%) gấp khoảng 3 lần so với hiệu lực kháng nấm ở nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm (4,64%) và gấp khoảng 2 lần so với hiệu lực kháng nấm ở nồng độ 380ppm (7,55%). Ở 6 ngày sau khi cấy, hiệu lực kháng nấm có sự thay đổi rõ rệt và có sự chênh lệch giữa các nồng độ. Ở nồng độ 450ppm, hiệu lực kháng nấm là 37,61% gấp gần 13 lần so với hiệu lực kháng nấm ở nồng độ 300ppm. Ở 9 ngày sau khi cấy, hiệu lực kháng nấm ở nồng độ 450ppm vẫn cho kết quả tốt nhất với hiệu lực kháng nấm là 39,26%. Trong khi hiệu lực này chỉ khoảng 28,89% đối với nồng độ 380ppm và chỉ 10,74% đối với nồng độ 300ppm. Từ số liệu ở các bảng và hình trên, có thể thấy rằng trong điều kiện in vitro, dung dịch nano đồng khảo sát với nồng độ từ 300ppm-450ppm cho hiệu quả khống chế rất thấp đối với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây thanh long. Vì vậy, cần phải tăng nồng độ thử nghiệm để có kết luận chính xác hơn. 40
  52. Đồ án tốt nghiệp 3.3.Đánh giá khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani của dung dịch nano đồng Bệnh héo rũ do nấm R. solani làm gây tổn thất nghiêm trọng cho hơn 200 loài cây trồng (Lee et al., 2008). Sản lượng cây trồng bị mất có khi lên đến 50% (Kiewnick et al., 2001), hoặc 70% (Davis et al., 1997) và khoảng 20% của khoai tây (Grosch et al., 2005). Nhiều nghiên cứu đều cho rằng việc phòng trừ nấm R. solani khá khó khăn do phổ ký chủ rộng và khả năng sống sót của chúng rất lớn (Grosch et al., 2006). Vì vậy, việc tìm ra biện pháp hữu hiệu đối với tác nhân này hiện là yêu cầu cấp bách không những ở Việt nam mà cả trên phạm vi trên thế giới. Trong những năm gần đây, những tiến bộ về kỹ thuật đã góp phần quan trọng làm giảm tác hại của các loài nấm bệnh hại cây trồng nói chung và nấm Rhizoctonia solani nói riêng .Park et al., 2006 cho biết, sử dụng nano silica bạc ở nồng độ 10ppm ngăn chận 100% sự phát triển của nấm R.solani. Kết quả đánh giá hiệu quả khống chế nấm R.solani trong nghiên cứu này được trình bày như sau: Bảng 3.5 Đường kính (mm) phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani Đường kính (mm) phát triển của tản nấm Công thức thí Rhizoctonia solani qua các ngày theo dõi nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT1: đối chứng 39,67± 8,02ns 81,33±2,52ns 90,0±0,0ns CT2: 300ppm 38,0±8,19ns 81,0±2,0ns 90,0±0,0ns CT3: 380ppm 37,33±8,74ns 79,67±3,06ns 90,0±0,0ns CT4: 450ppm 36,67 ±8,33ns 78,0±2,0ns 90,0±0,0ns Ghi chú: Các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD - Ns = non-significant Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho ta thấy cho thấy, nấm Rhizoctonia solani phát triển nhanh trên môi trường PDA và chúng cũng phát triển khá tốt trên cả các đĩa môi trường PDA có bổ sung nano đồng ở các nồng độ khác nhau. Ở 3,6 ngày sau khi cấy, đường kính sinh trưởng trung bình của tản nấm sau 3 lần thí nghiệm lặp lại 41
  53. Đồ án tốt nghiệp ở các nghiệm thức nồng độ nano đồng đều xấp xỉ đường kính sinh trưởng trung bình của tản nấm sau 3 lần thí nghiêm lặp lại ở nghiệm thức đối chứng. Ở 9 ngày sau khi cấy, đường kính sinh trưởng trung bình của tản nấm ở các nghiệm thức có bổ sung nano đồng đều tương đương với đường kính sinh trưởng trung bình của tản nấm ở nghiệm thức đối chứng. Điều này cũng có nghĩa rằng, dung dịch nano đồng thử nghiệm với các nồng khảo sát không có hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani.Tuy nhiên, Arnab et al (2014) cho rằng, nano đồng và nano bạc có hiệu quả phòng trừ tốt các loài nấm bệnh, trong đó có nấm Rhizoctonia solani. Vì vậy, cần lặp lại thí nghiệm ở các nồng độ cao hơn để có kết luận chính xác hơn. 100 90 80 70 60 CT 1: đối chứng 50 CT2: 300ppm CT3: 380ppm 40 CT4: 450ppm 30 20 10 0 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy Biểu đồ 3.3. Sự phát triển của đường kính tản nấm Rhizoctonia solani qua các ngày nuôi cấy. 42
  54. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6.Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với nấm Rhizoctonia solani Hiệu lực (%) ức chế của dung dịch nano đồng đối với Công thức thí nấm Rhizoctonia solani qua các ngày theo dõi nghiệm 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT2: 300ppm 4,21 0,41 0 CT3: 380ppm 5,90 2,04 0 CT4: 450ppm 7,56 4,09 0 A B C D Hình 3.10.Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani 3 ngày sau khi cấy A: Đối chứng ;B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 43
  55. Đồ án tốt nghiệp A B C C Hình 3.11.Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani 6 ngày sau khi cấy A: Đối chứng ;B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 44
  56. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.12. Đường kính phát triển của tản nấm Rhizoctonia solani 9 ngày sau khi cấy A: Đối chứng ;B: Nồng độ dung dịch nano đồng 300ppm , C:Nồng độ dung dịch nano đồng 380ppm ; D:Nồng độ dung dịch nano đồng 450ppm. 45
  57. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã phân lập được các 2 chủng nấm gây bệnh thối cổ rễ cây cà chua là nấm Fusarium sp và nấm Rhizoctonia solani. - Đã phân lập được nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên trái thanh long để làm vật liệu khảo sát tính kháng nấm của nano đồng. - Trong điều kiện invitro, dung dịch nano đồng 450ppm ( có hiệu lực kháng nấm 9 ngày sau khi cấy là 93,98%) khống chế > 90% sự phát triển của nấm Fusarium sp gây lở cổ rễ cây cà chua. - Dung dịch nano đồng nồng độ 300ppm , 380ppm và 450ppm khống chế yếu đồi với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư thanh long và không có hiệu quả đối với nấm Rhiozctonia solani. 4.2. Kiến nghị - Thử nghiệm hiệu quả của nano đối với nấm Fusarium sp ở điều kiện invivo. - Tiến hành đánh giá lại hiệu quả kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư thanh long và Rhiozctonia solani ở liều lượng cao hơn. - Đánh giá độc tính của thuốc đối với động vật máu nóng và các loài thiên địch khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 46
  58. Đồ án tốt nghiệp Dang, T. M. D., Le, T. T. T., Fribourg-Blanc, E. & Dang, M. C. Synthesis and optical properties of copper nanoparticles prepared by a chemical reduction method. Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology2, 015009, doi:10.1088/2043-6262/2/1/015009 (2011). Phạm Thị Bích Hợp- 2004. Nghiên cứu tác động của việc xử lý hạt giống trước khi gieo bằng các hạt sắt, đồng và coban có kích thước siêu nhỏ đến năng suất và chất lượng của cây đậu tương. Nguyễn Thị Hai, 2013. Bài giảng ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. Đại học Công Nghệ TP. Hồ Chí minh Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng, Nguyễn Tiến Thắng,Ngô Kế Sương (2008). Khảo sát khả năng đối kháng in vitro của các chủng nấm Trichoderma đối với 3 loài nấm gây bệnh cây trồng (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Phytophthora palmivora), Tạpchí Khoa học và Công nghệ, tập 46, số 4A, trang 93-99 Võ Quốc Khương, N. T. P. P. Tổng hợp nano đồng bằng phương pháp khử Hydrazin. (2012). Vũ Triệu Mân, 2007. Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại học Nông Nghiệp I – Hà Nội. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T. 2009. Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp. ACIAR: Canberra. C.M.Thi, N. V. L., P.V.Viet Nano kim loại & Oxit kim loại. Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu và 3 tác giả khác – 2008. Chế tạo các hạt Nano Bạc bằng phương pháp chiếu xạ, dùng Polyvinyl pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định. Tạp chí KH & CN, tập 46, số 3 – 2008, trang 81-86 47
  59. Đồ án tốt nghiệp Roger Shivas và Dr Dean Beasley (2005). Phương pháp quản lý mẫu bệnh thựcvật, Bảo tàng bệnh cây, Sở Nông nghiệp và Thủy sản Queensland, Australia. Tài liệu nước ngoài Alex Tiller – 2008. Future of Agriculture Technology - Nano Particles Ashavani Kumar, Praveen Kumar Vemula, Pulickel M. Ajayan & George John, 2008.Silver-nanoparticle-embedded antimicrobial paints based on vegetable. Nature Materials 7, 236 - 241 (2008) Published online: 20 January 2008 Berahmand, A. G. Panahi, H. Sahabi e al – 2012. Effects of silver nanoparticles and magnetic field on growth of fodder maize. Biol. Trace elem. Res. 149, p. 419- 424. C. M. Lu, C. Y. Zhang, Wen JQ et al – 2002. Reseach of the effect of nanometer materials on germination and growth and enhancement of Glycine max and its mechanism. Soya Bean Science 21, p 168-172. C. Srinivasan, R. Saraswathi - 2010. Nano-Agricultue. Carbon Nanotubes enhence tomato seed germination and plant growth. CurrentScience 99, p. 274-275. E. K. Exkov, Exkova M. D., G. I. Trurilov – 2011. Phương pháp nâng cao sự an toàn sinh thái mùa màng đối với đất nông nghiệp bị ô nhiễm do công nghiệp. Tạp chí Zaiavka số 2011100308/13-11.01.2011. G. E. Pholmanhic, L. V. Kovalenko – 1999. Các kim loại siêu phân tán trong sản xuất nông nghiệp. M. IMET RAN, 80 tr. (tiếng nga) G. I. Trurilov – 2010. Ảnh hưởng sinh thái học của các kim loại dạng hạt Nano. Luận án tiến sĩ – Balashikha – 2010. (tiếng nga) G. V. Pavlov, G. E. Pholmanhic – 1999. Hoạt tính sinh học của bột siêu phân tán. Chuyên khảo// Biên tập bởi Erista L. K. và Archiushina A. M. – 1999, 78 tr. (tiếng nga). 48
  60. Đồ án tốt nghiệp Jason C. White, 2013 - Chief Scientist, Department of Analytical Chemistry, The Connecticut Agricultural ExperimentStation, New Haven CT. Nanotechnology Use in Agriculture:Benefits and Potential Risks. Presented at the 2013 APHL Annual Meeting and 7th Government Environmental Laboratory Conference Jaw-FenWang(2010). Characterization of Colletotrichum spp.Characterization of Colletotrichum spp. causing pepper anthracnose and development of resistant pepper lines, Asian Seed Congress. Kamel A. Abd-Elsalam, Mousa A.Alguthaym-2015.Nanobiofungicides: are they the Next-Generation of Fungicides? Journal of Nanotechnology and Materials Science, p. 65-123. L. V. Kovalenko, G. E. Pholmanhic – 2001. Tăng cường sự nẩy mầm của hạt giống bằng bột sắt siêu phân tán. Những thành tựu KHKT APK – 2001, 126 tr. (tiếng nga). L. zhang et al – 2005. Effect of Nano TiO2 on strength naturally aged seeds and growth of spinach. Biol. Trace Elem. Res. 105, p. 83-01. M. V. Kutskir, A. A. Nazarova, Polishuk X. D. và cs – 2012. Chất kích thích sinh trưởng thực vật trên cơ sở bột Nano-Coban. Tuyển tập “Kỹ thuật công nghệ mới trong công nghiệp và nông nghiệp” – Tài liệu hội thảo khoa học thực tiễn lần thứ nhất toàn Nga tháng 12-2012 – Trung tâm KHCN quốc tế thành phố Biixk – 2012, tr. 280-283. Ma, H. Introduction. 1-11, doi:10.1007/978-1-4939-2504-9_1 (2015). Ma, L., Zou, X. & Chen, W. A New X-Ray Activated Nanoparticle Photosensitizer for Cancer Treatment. Journal of Biomedical Nanotechnology10, 1501-1508, doi:10.1166/jbn.2014.1954 (2014). Masanto Masyahit, Kamaruzaman Sijam, Yahya Awang and Mohd Ghazali Mohd Satar (2009).The First Report of the Occurrence of Anthracnose Disease Caused by Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. on Dragon Fruit (Hylocereus spp.) in Peninsular 49
  61. Đồ án tốt nghiệp Malaysia, American Journal of Applied Sciences 6 (5): 902-912. Nazarova, A. A. et al. Biosafety of the application of biogenic nanometal powders in husbandry. Advances in Natural Sciences: Nanoscience and Nanotechnology5, 015013, doi:10.1088/2043-6262/5/1/015013 (2014). O'Gorman, J. & Humphreys, H. Application of copper to prevent and control infection. Whereare we now? J Hosp Infect81, 217-223, doi:10.1016/j.jhin.2012.05.009 (2012). P. Gonzales-Melendi et al – 2008. Nanoparticles as smart treatment-delivery systems in plant. Annual of Botany 101, p. 187-195. Ramanathan, R. et al. Aqueous phase synthesis of copper nanoparticles: a link between heavy metal resistance and nanoparticle synthesis ability in bacterial systems. Nanoscale5, 2300-2306, doi:10.1039/c2nr32887a (2013). Saterlie, M., Sahin, H., Kavlicoglu, B., Liu, Y. & Graeve, O. Particle size effects in the thermal conductivity enhancement of copper-based nanofluids. Nanoscale Res Lett6, 217, doi:10.1186/1556-276X-6-217 (2011) T. N. V. K. V. Prasad, P. Sudhakar, Y. Srenivasulu et al. - 2012. Effects of ZnO nanoparticles on the germination, growth and yield of peanut. J. Plant Nutrition 35:6, P. 905-927. V. Sah and I. Belozerova – 2009. Influence of metal nanoparticles on the soil microbial community and germination of lettuce seeds. Water, Air and Soil Polution 97, p. 143-148. Zhu, J. Han, Q. Ciao – 2008. Uptake, translocation and accumulation of manufactured ion oxide nanoparticles by pumkin plant. J. Envir. Monitoring 10, p. 713-717. 50
  62. PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. CÁC BẢNG SỐ LIỆU THÔ A1. Đường kính(mm) phát triển của tản nấm Fusarium sp. số lần 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy lặp lại CT 1: đối chứng 1 16 65 83 2 15 59 83 3 15 62 83 CT2: 300ppm 1 10 55 59 2 8 56 63 3 8 42 48 CT3: 380ppm 1 10 44 44 2 8 44 44 3 8 44 44 CT4: 450ppm 1 5 5 5 2 5 5 5 3 5 5 5 1
  63. Đồ án tốt nghiệp A2. Đường kính(mm) phát triển của tản nấm Colletotrichumacutatum số lần lặp lại 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT 1: đối chứng 1 57 80 90 2 55 80 90 3 60 82 90 CT2: 300ppm 1 55 78 80 2 51 76 79 3 58 79 82 CT3: 380ppm 1 51 58 65 2 53 59 64 3 55 62 63 CT4: 450ppm 1 46 50 55 2 50 52 56 3 49 49 53 2
  64. Đồ án tốt nghiệp A3. Đường kính(mm) phát triển của tản nấm Rhizoctoniaspp. số lần lặp lại 3 ngày sau cấy 6 ngày sau cấy 9 ngày sau cấy CT 1: đối chứng 1 57 80 90 2 55 80 90 3 60 82 90 CT2: 300ppm 1 55 78 80 2 51 76 79 3 58 79 82 CT3: 380ppm 1 51 58 65 2 53 59 64 3 55 62 63 CT4: 450ppm 1 46 50 55 2 50 52 56 3 49 49 53 3
  65. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU B1. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano đồng đến tốc độ tăng trưởng kích thước tản nấm fusarium sp. ❖ Đường kính trung bình của tản nấm ❖ 3 NGÀY SAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 166.917 3 55.6389 74.19 0.0000 Within groups 6.0 8 0.75 Total (Corr.) 172.917 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 5.0 X 380ppm 3 8.66667 X 300ppm 3 8.66667 X DOICHUNG 3 15.3333 X ❖ 6 NGÀYSAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5535.0 3 1845.0 105.43 0.0000 Within groups 140.0 8 17.5 Total (Corr.) 5675.0 11 4
  66. Đồ án tốt nghiệp Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 5.0 X 380ppm 3 44.0 X 300ppm 3 51.0 X DOICHUNG 3 62.0 X ❖ 9 NGÀYSAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9487.0 3 3162.33 209.66 0.0000 Within groups 120.667 8 15.0833 Total (Corr.) 9607.67 11 Multiple Range Tests Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 5.0 X 380ppm 3 44.0 X 300ppm 3 56.6667 X DOICHUNG 3 83.0 X 5
  67. Đồ án tốt nghiệp B2. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano đồng đến tốc độ tăng trưởng kích thước tản nấm Colletotrichum sp. Đường kính trung bình của tản nấm ❖ 3 NGÀYSAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 128.667 3 42.8889 6.35 0.0164 Within groups 54.0 8 6.75 Total (Corr.) 182.667 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 48.3333 X 380ppm 3 53.0 XX 300ppm 3 54.6667 X DOICHUNG 3 57.3333 X ❖ 6 NGÀY SAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1896.25 3 632.083 244.68 0.0000 Within groups 20.6667 8 2.58333 Total (Corr.) 1916.92 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 50.3333 X 380ppm 3 59.6667 X 300ppm 3 77.6667 X DOICHUNG 3 80.6667 X 6
  68. Đồ án tốt nghiệp ❖ 9NGÀY SAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2272.92 3 757.639 534.80 0.0000 Within groups 11.3333 8 1.41667 Total (Corr.) 2284.25 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 54.6667 X 380ppm 3 64.0 X 300ppm 3 80.3333 X DC 3 90.0 X B3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano đồng đến tốc độ tăng trưởng kích thước tản nấm Rhizoctonia solani. Đường kính trung bình của tản nấm ❖ 3 NGÀY SAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14.9167 3 4.97222 0.07 0.0001 Within groups 554.0 8 69.25 Total (Corr.) 568.917 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 36.6667 X 380ppm 3 37.3333 X 300ppm 3 38.0 X DC 3 39.6667 X 7
  69. Đồ án tốt nghiệp ❖ 6 NGÀYSAU KHI CẤY: ANOVA Table DUONG KINH TAN NAM by NONG DO NANO DONG Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 20.6667 3 6.88889 1.16 0.0001 Within groups 47.3333 8 5.91667 Total (Corr.) 68.0 11 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 450ppm 3 78.0 X 380ppm 3 79.6667 X 300ppm 3 81.0 X DC 3 81.3333 X 8