Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng (Raphanus sativus L.)

66 trang thiennha21 12/04/2022 5470

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng (Raphanus sativus L.)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_hoat_tinh_khang_khuan_tu_dich_chiet_cu_cai_tr.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng (Raphanus sativus L.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN BARIA VUNGTAU UNIVERSITY CAP Sa in t ia c q u e s ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CỦ CẢI TRẮNG (Raphanus sativus L.) Giáo viên hướng dẫn : Th.s Phạm Thị Kim Ngọc Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Hồng Loan Lớp : DH13TP Ngành : Công Nghệ Thực Phẩm Vũng Tàu, 06/2017
VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN Độc lập - Tự do - Hạnh phúc PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và Tên: Bùi Thị Hồng Loan MSSV: 13030375 Ngành: Công nghệ Thực phẩm Lớp: DH13TP Trình Độ Đào Tạo : Đại Học Hệ Đào Tạo: Đại học chính quy 1. Tên đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) 2. Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2016 3. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/06/2017 4. Họ và tên người hướng dẫn: Th.S Phạm Thị Kim Ngọc Bà Rịa-Vũng Tàu, ngày 26 tháng 6 năm 2017 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) TRƯỞNG BỘ MÔN TRƯỞNG KHOA (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
Tôi cam đoan rằng tất cả những kết quả nghiên cứu được nêu trong đồ án này là do tôi thực hiện, các ý tưởng tham khảo và những kết quả trích dẫn từ các công trình khác đều được nêu rõ trong đồ án. Vũng Tàu, năm 2017 Sinh viên thực hiện
Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học cho đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu, quý thầy cô trong ngành Công nghệ Thực phẩm - những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá để em có thể bước vào sự nghiệp trong tương lai. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Kim Ngọc. Cảm ơn cô đã tận tình quan tâm, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án, đã giải đáp những thắc mắc trong quá trình nghiên cứu. Trong quá trình thực hiện đồ án này vì kiến thức thực tế em còn hạn chế và thời gian thực hiện không nhiều nên sẽ không tránh khỏi sai sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến và nhận xét của quý thầy cô, các bạn để em có thể rút kinh nghiệm và hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn!
LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v BẢNG PHỤ LỤC vi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Tổng quan về củ cải trắng 2 1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng 2 1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng 3 1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản 3 1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng 5 1.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng 6 1.2. Giới thiệu chung về khuẩn 8 1.2.1. Bacillus cereus 8 1.2.2. Pseudomonas aeruginosa 10 1.2.3. Salmonella typhi 11 1.2.4. Staphylococcus aureus 13 1.3. Giới thiệu chung về nấm mốc 14 1.3.1. Nấm mốcAspergillus flavus 14 1.3.1.1. Phân loại [47] 14 1.3. L2. Đặc điểm của nấmAspergillus flavus [43] 15 1.3.1.3. Hình thức sinh sản [43] 16 1.3.1.4. Một số bệnh lý do nấm mốcAspergillus flavus gây ra [43] 16 1.3.2. Nấm mốcFusarium solani [8] 17 1.3.2.1. Phân loại 17 1.3.2.2. Đặc điểm của nấmFusarium solani [41] 17 1.3.2.3. Hình thức sinh sản 18
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT 1.3.2.4. Một số bệnh lý do nấm mốcF. solani 19 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Phương tiện nghiên cứu 20 2.1.1. Thời gian và địa điểm 20 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.3. Phạm vi nghiên cứu 20 2.1.4. Hóa chất sử dụng 20 2.1.5. Thiết bị - Dụng cụ 20 2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 21 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.2.1. Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết 21 2.2.2.2. Chuẩn bị giống 23 2.2.2.3. Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau 24 2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng 24 2.2.2.5. Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng 27 3.2. Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng 30 3.3.1. Kết quả kháng khuẩn 30 3.3.2. Kết quả kháng nấm mốc 33 3.4. Bàn luận 35 KẾT LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 45
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu cơ lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO Rs-AFP1, Rs-AFP2 (Raphanus sativus antifungal peptide 1): peptide giàu cysteine có khả năng ức chế sự phát triển của nấm. MR: Methyl Red - Thử nghiệm Methyl Red VP: Voges Proskauer - Thử nghiệm Voges Proskauer MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton MIC: Minimal Inhibitory Concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB SDA: Sabouraud Dextrose Agar Môi trường dinh dương SDA PDA: Potato Dextrose Agar Môi trường dinh dưỡng PDA DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức năng và sinh sản của các sinh vật và nhiều loài virus RNA: Acid ribonucleic rpm: tốc độ vòng/ phút Am: thuốc kháng sinh Amipicillin Ge: thuốc kháng sinh Gentamycin Te: thuốc kháng sinh Tetracycline Ter: thuốc kháng sinh Terbinafine
Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tươi 4 Bảng 3.1. Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng 27 Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm) 30 Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm) 34
Hình 1.1. Cây và củ cải trắng 2 Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải củ 3 Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 9 Hình 1.4. Vi khuẩn P. aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 11 Hình 1.5. Vi khuẩn S. typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 12 Hình 1.6. Vi khuẩn S. aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB 14 Hình 1.7. Aspergillus flavus 15 Hình 1.8. Fusarium solani 17 Hình 1.9. Loài F. solani : A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi trường (Dương Minh,2010) 18 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 2.2. Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009) 25 Hình 3.1. Khả năng kháng B. cereus của cao củ cải trắng 32 Hình 3.2. Khả năng kháng P. aeruginosa của cao củ cải trắng 33 Hình 3.3. Khả năng kháng S. aureus của cao củ cải trắng 33 Hình 3.4. Khả năng kháng S. typhi của cao củ cải trắng 33 Hình 3.5. Khả năng kháng A. flavus của cao củ cải trắng 34 Hình 3.6. Khả năng kháng F. solani của cao củ cải trắng 34 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc khác nhau 35
BẢNG PHỤ LỤC Phụ lục A. Môi trường và kháng sinh 45 Phụ lục B. Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảosát 46 Phụ lục C. Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển v i 46 Phụ lục D. Cao thành phẩm 47 Phụ lục E. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus 47 Phụ lục F. Phụ lục F. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Pseudomonas aeruginosa 49 Phụ lục G. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus 51 Phụ lục H. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi 53 Phụ lục I. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng nấm mốc trênA. flavus 55
ĐẶT VẤN ĐỀ Củ cải trắng có tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cảiBrassicaceae, là cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Theo các tài liệu y học cổ truyền, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, đắng, tính bình, không độc, có tác dụng long đờm, trừ viêm được dùng trong chữa trị khá nhiều bệnh đường hô hấp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa. Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau củ phổ biến, rẻ tiền, được trồng và sử dụng nhiều. Một số nghiên cứu khoa học công bố gần đây ở nước ngoài cho thấy dịch chiết từ củ cải trắng trồng ở 1 số nước khác nhau có khả năng khử các gốc tự do, làm giảm các quá trình oxi hóa, vốn là nguyên nhân sâu xa gây ra nhiều loại bệnh tật ở người. Hoạt tính kháng khuẩn của củ cải trắng cũng được đánh giá cao. Nước ép và dịch trích ly từ củ cải trắng bằng các dung môi khác nhau (nước, methanol, etahnol, ethyl acetate, este dầu hỏa) đã được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc khác nhau. Tuy nhiên, hoạt tính của dịch chiết phụ thuộc vào giống và đặc điểm nguồn gốc, điều kiện địa lý của vùng trồng. Đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng(Raphanus sativus L.). Trong nghiên cứu này của chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết thô của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về củ cải trắng 1.1.1. Đặc điểm của cây và củ cải trắng Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học làRaphanus sativus L. thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta , lớp Magnoliopsida , bộ Brassicales, họBrassicaceae , chi Raphanus , loài sativus [22]. Củ cải trắng là tên gọi phổ biến ở Việt Nam. Ngoài ra , Raphanus sativus L.còn có các tên gọi khác như Rettich (Đức), Daikon (Nhật), Hua piahs (Thái Lan), Lai fu (Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc), Muli (Ấn Độ) [22]. Củ cải được thuần hóa ở Châu Âu trong thời kì tiền La Mã. Những cư dân cổ đại của Hy Lạp cho rằng các loại củ cải có giá trị nhất trong tất cả các loại cây trồng lấy củ. Loại củ này được xem là một thực phẩm thông dụng ở Ai Cập trước khi các kim tự tháp được xây dựng và củ cải cũng rất phổ biến ở thời Ý cổ đại. Chính Columbus và những người đầu tiên khai hoang Châu Âu đã đem củ cải vào trồng trọt [16]. Củ cải được sử dụng như một loại thực phẩm trong bữa ăn của người Ai Cập cổ vào khoảng 2700 - 2200 trước công nguyên, sau đó được trồng ở châu Âu vào thế kỉ 16 - 17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20. Ở khu vực Đông Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450 năm trước và ở Nhật Bản khoảng 1300 năm trước [20]. Cây củ cải là một loại cây cho củ hàng năm hoặc hai năm một lần. Loại cây này được trồng chủ yếu để lấy củ do rễ củ chứa nhiều chất dinh dưỡng. Cây củ cải cao khoảng 30 - 120 cm, có loại bề mặt láng nhẵn nhưng cũng có loại bề mặt sần sùi hoặc có loại có lông cứng, mọc thẳng đứng vàcuống lá phân thành nhánh. Củ cải có nhiều thịt, phình ra, có nhiều màu sắc như trắng, hồng, đỏ hoặc đen. Ngoài ra, hình dạng củ cải có thể thuôn dài hoặc có dạng hình cầu [21]. Hình 1.1. Cây và củ cải trắng
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Lá to có dạng hình đàn lia xẻ lá, có cuống, có lớp lông tơ mỏng láng bề mặt, rìa lá có răng cưa. Lá non thường không phân nhánh và có răng cưa [21]. Hoa của cây củ cải có màu hơi đỏ tía hay màu hồng tới gần trắng với gân hoa màu tím dài từ 1,5- 2 cm, đường gân nhỏ dần về phía cuống lá. Bên trong hoa còn có chỉ nhị mảnh, bao phấn hình mũi tên nằm trong vòi nhụy và đầu nhụy. Quả cải thuộc loại quả không nẻ, có dạng hình thoi phình to ở giữa và nhọn dần về hai đầu, khi bóp nhẹ quả cải sẽ thấy một đường nứt xuất hiện và bên trong đó là các hạt cải. Một quả cải cho được từ 2 đến 4 hạt cải. Hạt cải có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kích thước hạt khoảng 2,5 - 4 mm [21]. Củ cải có thể trồng quanh năm nhưng để thu được củ cải chất lượng tốt thì thường trồng vào mùa xuân và đầu mùa thu. Thời gian nuôi trồng của củ cải từ khoảng 50 đến 90 ngày, phụ thuộc vào từng loại khác nhau và chất lượng sản phẩm khi thu hoạch. Để thu hoạch một loại củ cải nặng 500 g thì thời gian thu hoạch khoảng 50 đến 60 ngày vào mùa hè và khoảng 70 đến 80 ngày vào mùa đông. Củ cải phát triển tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 20 - 250C, pH đất trồng tối ưu từ 6,0 - 6,5 cũng như cần ánh sáng và nước với liều lượng thích hợp để tăng trưởng [22]. Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây cải củ 1.1.2. Thành phần hóa học của củ cải trắng 1.1.2.1. Thành phần hóa học cơ bản Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1. Trong củ cải trắng, ngoài thành phần nước chiếm tỉ lệ cao thì protein chiếm tới 1,5% khối lượng. Củ cải có chứa nhiều acid amin thiết yếu như lysine, methionine, tryptophan, phenylalanine, threonine, valine,leucine, isoleucine, histidine, cũng như các acid béo như acid palmitic, acid oleic, acid linoleic, acid linolenic [40]. Củ cải trắng có hàm lượng lipid thấp. Lipid trong củ cải giúp tạo vị ngon cho củ. Trong củ cải, glucid chiếm hàm lượng cao. Sucrose là một loại carbohydrate dự trữ
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT quan trọng trong thực vật, đặc biệt trong các cơ quan lưu trữ như củ, rễ và hạt. Kích thước củ cải càng lớn thì hàm lượng sucrose và glucose càng cao. Glucid trong củ cải trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ. Đường trong củ cải trắng chủ yếu là glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan. Tinh bột thay đổi tùy theo giống, chiếm từ 0,2 - 0,5%. Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5 % gồm chủ yếu là cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mô nâng đỡ và thành tế bào của củ cải trắng, đóng vai trò tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học. Pectin chiếm khoảng 0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu dưới dạng calcium pectate. Ngoài ra, củ cải trắng còn nổi bật với hàm lượng lipid thấp, hàm lượng vitamin và khoáng cao. Một số khoáng vi lượng cũng được tìm thấy trong củ cải trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flo và iod với hàm lượng tổng lên đến 18 pg/100 g [28, 30, 17]. Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong 100g củ cải trắng tươi STT Thành phần Đơn vị Hàm lượng 1 Nước G 92,1 2 Năng lượng Kcal 21 3 Protein G 1,5 4 Lipid G 0,1 5 Glucid G 3,6 6 Chất xơ G 1,5 7 Tro g 1,2 8 Đường tổng g 2,5 9 Canxi mg 40 10 Sắt mg 1,1 11 Magie mg 15 12 Phospho mg 41 13 Kali mg 242
14 Natri mg 10 15 Đồng pg 150 16 Vitamin C mg 30 17 Vitamin B1 mg 0,06 18 Vitamin B2 mg 0,06 19 Vitamin PP mg 0,5 20 Vitamin B5 mg 0,138 21 Vitamin B6 mg 0,046 (Nguồn: National Nutrient Database for Standard). 1.1.2.2. Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng Trong củ cải trắng có nhiều enzyme được tìm thấy như enzyme amylase, invertase, ß-galactosidase, protease, cellulase, peroxidase. Enzyme invertase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân đường sucrose thành glucose và fructose ở thực vật bậc cao, đặc biệt là ở các mô dự trữ. Sucrose là một sản phẩm ban đầu của phản ứng quang hợp, chúng cũng được xem là cacbohydrate vận chuyển tự do trong các cơ quan ở thực vật. Protease còn là enzyme quan trọng trong việc điều chỉnh lại sự lão hóa ở cây [28]. Ngoài ra còn có các acid hữu cơ có lợi cho sức khỏe như acid malic, acid oxalic, acid erythorbic có trong củ cải và acid erucic, acid linoleic, acid oleic có trong hạt củ cải. Bên cạnh đó, trong củ cải còn có acid palmitic, acid stearic trong dịch trích ly ether dầu hỏa từ hạt củ cải, acid glutamic trong củ cải muối chua [12]. Ở củ cải có nhiều acid phenolic như acid caffeic, acid p-coumaric, acid ferulic, acid hydroxycinnamic, acid p-hydroxybenzoic, acid vanillic, acid salicylic, acid gentisic, anthocyanin, pelargonidin, cyanidin. Trong củ cải trắng có các hợp chất flavonoid như quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin và luteolin. Ngoài ra, trong củ cải còn có polysaccharides, proteoglycans, sắc tố, hợp chất có chứa lưu huỳnh,các chất kháng khuẩn (saphanin và sulphoraphene), ß-carotene. Hàm lượng raphanusol A và B trong củ cải trắng tăng khi có ánh sáng và giảm khi thiếu ánh sáng. Raphanusol A và raphanusol B là chất ức chế sự tăng tưởng của cây trồng để cây củ cải không bị úa vàng và hạt củ cải bị hư [12]. Ngành Công nghệ Thực phẩm
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Mùi hăng của củ cải được tìm thấy bởi hợp chất glucosinolate. Ở củ cải tồn tại 4 loại glucosinolate là glucoraphenin, dehydroerucin, glucobrassicin và glucoerucin. Glucosinolate trong củ cải giúp tăng lượng enzyme tham gia vào việc giải độc các chất gây ung thư. Chất này có tiềm năng được sử dụng như một chất ngăn chặn sự lão hóa [21]. I.2.2.3. Tác dụng sinh học của củ cải trắng Rosa M.P. Gutierrez và Rosalinda L.Perez (2004) đã nghiên cứu về thành phần các hợp chất có mặt trong củ cải trắng gồm: alkaloid và các hợp chất có nitơ, coumarin, enzyme, glucosinolate, các acid hữu cơ, các hợp chất phenol Nghiên cứu cũng đã khẳng định nước ép từ củ cải trắng có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn G+, G" và nhiều loại nấm (E. Coli, Pseudomonas pyocyaneus, Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae và Fusarium culmorum ) do sự tồn tại của các peptide giàu cystein Rs-AFP1 và Rs-AFP2, các protein RAP-1 (6,1 kDa) và RAP-2 (6,2 kDa), acid cafeic, acid ferulic, p- hydroxybenzoic acid. Ngoài ra, cũng theo công bố này, củ cải còn có hoạt tính miễn dịch, chống oxi hóa, chống ung thư, kháng virus, [12]. Hirotaka Katsuzaki và cộng sự (2004) đã có nghiên cứu so sánh hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng và nước ở nhiệt độ bình thường. Kết quả thực nghiệm cho thấy rằng hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết củ cải trắng bằng nước nóng cao hơn dịch chiết bằng nước ở nhiệt độ bình thường. Hợp chất chống oxi hóa được phân lập và xác định là L-tryptophan. Khi tiến hành nghiên cứu trên gan chuột thì L-tryptophan chuyển hóa thành 5-hydroxyl tryptophan [14]. Narisa Kamkaen và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về khả năng ức chế enzyme tyrosinase của 16 loại rau khác nhau ở Thái Lan, bao gồm củ cải trắng. Mẫu rau được rửa sạch, cắt nhỏ, xay nhuyễn. Quá trình trích ly được thực hiện với các dung môi hexan, ethyl acetate, methanol và propylen glycol 50% với tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1: 4, trích ly bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Dịch sau trích ly được lọc loại bỏ bã. Pha loãng 5 lần dịch sau lọc để có dung dịch mẫu phân tích. Khả năng ức chế Tyrosinase từ nấm được xác định bằng cách cho vào ống nghiệm 20 pl tyrosinase 1000 U/ml, 20 pl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8), 100 pl dịch mẫu và 20 pl dung dịch L-DOPA 0,85 mM. Ủ ở 250C trong 10 phút rồi đo độ hấp thu ở 475 nm. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết hexan, ethyl acetate,
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT methanol và propylen glycol 50% của củ cải trắng ức chế tyrosinase từ nấm ở các mức lần lượt là 38,43; 68,73; 53,51 và 88,50 % [23]. R. Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng dụng mỹ phẩm. Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn) và ức chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol. Nghiên cứu cũng đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml. Do đó, tác giả cũng đề nghị về việc xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ phẩm dưỡng da [25]. Syed Sultan Beevi và cộng sự (2010) khảo sát thành phần các hợp chất polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và củ cải trắngRaphanus sativus L. Lá và củ được tách riêng, rửa sạch, sấy khô và xay thành bột mịn, bảo quản ở -200C đến khi phân tích. Bột sau đó được trích ly với các dung môi tinh khiết (methanol, chloroform, acetone, ethyl acetate và hexan) 3 lần, mỗi lần 24 giờ ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1: 40 (g/ml). Dịch trích ly sau đó được gom lại, cô giảm áp ở 400C thu cắn, cắn hòa tan lại vào methanol để dùng làm mẫu phân tích xác định thành phần polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa. Kết quả cho thấy trong lá và củ cải có các chất chống oxy hóa và có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết methanol và acetone của lá củ cải trắng có tổng hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77 mg/g chất khô, có thể so sánh với trà xanh và trà đen. Phân tích HPLC- DAD cho thấy sự hiện diện của catechin, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid, myricetin, và quercetin trong dịch chiết tất cả các dung môi trên cả lá và củ, hàm lượng các chất trong lá cao hơn trong củ. Dịch chiết methanol từ lá và củ cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion kim loại. Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử superoxide là 23 và 52 mg/ml cho, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi khử gốc NO'. 56 và 62 pg/ml, tương ứng [34]. S. Shukla và cộng sự (2011) đã khảo sát khả năng kháng khuẩn của nước ép từ củ cải trắng Ân Độ. Củ cải tươi, rửa sạch, ép lấy nước, lọc loại bã và cô giảm áp ở 35 ±
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT 50C để thu cao. Cao này sau đó hòa tan lại vào nước ở các nồng độ xác định dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. Các chủng vi sinh được khảo sát gồmS. aureus, E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis . Mẫu đối chứng là kháng sinh ampicillin. Kết quả cho thấy nước ép từ củ cải trắng Ân Độ có khả năng ức chế sự phát triển của cả 5 chủng vi sinh khảo sát, giá trị MIC xác định được dao động trong khoảng 0,078 - 0,625 mg/ml, trong đó hiệu quả tác động lên 2 chủngE. coli và Enterococcus faecalis là tương đương với ampicillin, và cao hơn ampicillin khi tác động lên Klebsiella pneumoniae (MIC là 0,078 mg/ml so với 0,312 mg/ml của ampicillin) [31]. K. Agarwal, R. Varma (2014) đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả năng khử gốc tự do DPPH của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước nóng của củ cải trắng có khả năng khử gốc tự do DPPH ở mức 58,38% với nồng độ 200 ^g/ml, giá trị IC50 là 166,79 ^g/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có sự tồn tại của alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [19]. H. Caglar Kaymak và cộng sự (2015) đã so sánh hoạt tính kháng khuẩn in vitro của củ cải trắng và củ cải đen ở Thổ Nhĩ Kì. Hai loại củ cải trắng và đen được trồng và chăm sóc như nhau, thu hoạch sau 80 ngày gieo hạt được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô, xay thành bột. Bột củ cải sau đó trích ly bằng phương pháp Soxhlet bằng dung môi methanol trong 72 giờ, nhiệt độ không vượt quá nhiệt độ sôi của dung môi. Dịch chiết sau đó đem lọc qua giấy Whatman No.1 rồi cô giảm áp thu cao. Cao này dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. Hơn 100 giống vi sinh vật thuộc 52 loài khác nhau đã được dùng nghiên cứu. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol của củ cải trắng và củ cải đen có khả năng hạn chế sự phát triển của Arthrobacter atrocyaneus, Corynebacterium ammoniagenes, Enterobacter hormaechei, Kocuria rosea, Neisseria subflava, Pantoea agglomerans, Proteus vulgaris, Psychrobacter immobilis và Shigella dysenteriae. Ngoài ra, dịch chiết methanol của củ cải trắng còn tác động lênBacillus sphaericus và Corynebacterium flavescen . Nhìn chung, củ cải trắng có phạm vi kháng khuẩn rộng và mạnh hơn củ cải đen [13]. 1.2. Giới thiệu chung về khuẩn 1.2.1. Bacillus cereus Bacillus cereus (B. cereus) thuộc: - Giới: Bacteria,
- Ngành: Firmicutes, - Lớp: Bacilli, - Bộ: Bacillales, - Họ: Bacillaceae, - Chi: Bacillus, - Loài: cereus, - Tên khoa học là Bacillus cereus. B. cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 500C, tối ưu ở 35 - 400C, pH dao động từ 4,5 - 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô, ,)[44]. Nồng độ muối tối đa cho sự sinh trưởng củaB. cereus là 7,5% (Rajkowski và Bennett, 2003). Khi có oxy, B. cereus phát triển tối ưu nhưng chúng cũng có thể sống ở điều kiện kỵ khí. Các tế bào B. cereus được nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí ít chịu được nhiệt và acid hơn các tế bào B. cereus nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí hoặc nửa kỵ khí (Mols và cộng sự, 2009). Bào tử củaB. cereus có khả năng chịu nhiệt khô hơn nhiệt ẩm và thường chịu nhiệt lâu hơn trong các thực phẩm có chứa hoạt độ nước thấp (Jenson và Moir, 2003). B. cereus cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase, lecithinase. Chúng lên men glucose sinh acid trong điều kiện kỵ khí, khử nitrate tạo thành nitrite, dương tính với thử nghiệm VP (Voges Proskauer), thủy phân được L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0,001% lysozyme. B. cereus không lên men được mannitol cũng như arabinose [44]. Hình 1.3. Vi khuẩn B. cereus sau khi nhuộm Gram và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. Ngộ độc thực phẩm gây ra bởiB. cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng. Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 CFU/g đủ gây ngộ độc. Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởiB. cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 - 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 - 24 giờ. Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 - 5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ [44]. 1.2.2. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) thuộc: - Giới: Bacteria, - Ngành: Proteobacteria, - Lớp: GammaProteobacteria, - Bộ: Pseudomonadales, - Họ: Pseudomonadaceae, - Chi: Pseudomonas , - Loài: aeruginosa , - Tên khoa học là Pseudomonas aeruginosa . P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực.P. aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu có NO3- làm chất nhận điện tử, phát triển tối ưu ở 370C [44]. P. aeruginosa cho phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase, urease nhưng lại cho kết quả âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer) và indole. Ngoài ra, P. aeruginosa có khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin. Chúng có khả năng thủy phân casein và tạo enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được tinh bột. P. aeruginosa cũng không có khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid [24].
Hình 1.4. Vi khuẩn P. aeruginosa khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB Loài này hiện diện phổ biến trong đất, nước, bề mặt cơ thể động thực vật, là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên người. Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ. P. aeruginosa có thể gây nhiều bệnh khác nhau ở người: gây viêm màng trong tim ở những người có van tim giả; gây viêm đường hô hấp ở những người có đường hô hấp hoặc hệ thống tự bảo vệ bị suy yếu; gây viêm phổi ở những bệnh nhân có bệnh mãn tính về phổi và bị chứng sung huyết tim; gây nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu ở những bệnh nhân suy giảm hệ thống miễn dịch như AIDS, giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường, bỏng nặng; gây viêm màng não mủ và áp xe não; gây viêm tai; gây bệnh hóa sừng ở mắt ở những người có hệ thống bảo vệ suy yếu; gây viêm tủy xương; gây nhiễm trùng da, mô mềm; P. aeruginosa là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ có một số ít các kháng sinh có tác dụng đối với giốngPseudomonas là fluoroquinolone, gentamycin và imipenem [44]. 1.2.3. Salmonella typhi Salmonella typhi (S. typhi) thuộc: - Giới: Bacteria, - Ngành: Proteobacteria, - Lớp: Gammaproteobacteria, - Bộ: Enterobacteriales, - HọEnterobacteriaceae, - Chi: Salmonella,
- Loài: enterica, -Tên khoa học là Salmonella enterica serovar typhi. S. typhi là loài vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động nhờ tiên mao, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử. Vi khuẩn này sinh trưởng tốt nhất tại nhiệt độ 370C, là nhiệt độ cơ thể người, là nguyên nhân gây bệnh sốt thương hàn. S. typhi phát triển tối ưu trong môi trường có pH trung tính nhưng khoảng pH phát triển của chúng lại rất rộng (pH = 4 - 9). Khi pH thấp, oxy có tác dụng rất tốt đến sự phát triển của chúng. S. typhi không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao [39, 41, 44]. S. typhi có khả năng lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophan, hầu hết các chủng đều sinh H2S [44]. Hình 1.5. Vi khuẩn S. typhi khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB S. typhi gây ra sốt thương hàn. Vi khuẩn này theo thực phẩm vào đường tiêu hóa, vào niêm mạc ruột đến hạch lympho và sinh sản, phát triển tại đây. Thời gian này là thời gian ủ bệnh [41]. Sau khi phát triển với số lượng lớn, một số tự phân giải. Kết quả là các độc tố được giải phóng và gây độc. Một số khác sẽ theo hệ lympho vào máu và gây nhiễm khuẩn máu. Từ máu Salmonella đi đến khắp cơ thể gây ra những áp xe khu trú, thường thấy nhất ở bọng đái, ống tiêu hóa [41]. Sau 10 - 14 ngày ủ bệnh, nhiệt độ cơ thể tăng và người cảm thấy lạnh. Nhiệt độ tăng dần và giữ khoảng 39 - 400C trong hai tuần đầu. Cơ thể bệnh nhân suy nhược nhanh chóng, ăn không ngon, mệt mỏi, gan và lá lách to dần, xuất huyết ngoài da,
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT lượng bạch cầu giảm. Sau ba tuần, bệnh giảm dần. Sau hai tuần giảm bệnh, có 5 - 10% trường hợp có thể tái phát [41]. 1.2.4. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (S. aureus) thuộc: - Giới: Eubacteria, - Ngành: Firmicutes, - Lớp: Bacilli, - Bộ: Bacillales, - Họ: Staphylococcaceae , - Chi: Staphylococcus , - Loài: aureus, - Tên khoa học là Staphylococcus aureus . S. aureus là loài vi khuẩn Gram dương, dạng hình cầu, là loại yếm khí tùy tiện. Khi quan sát dưới kính hiển vi S. aureus trông giống như chùm nho. S.aureus có khả năng phân hủy máu trên môi trường thạch. S. aureus không hình thành chuỗi dài, không di động, không sinh bào tử [39]. Trên môi trường thông thường, S. aureus có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ 10 - 420C, pH 7,4 - 7,6. Vi khuẩn này hoạt động tốt nhất trong môi trường giàu oxy. S. aureus có thể sinh trưởng trên nhiều môi trường thông thường, giàu dinh dưỡng, sữa, gelatin hay thạch. Khi S. aureus sinh trưởng trên môi trường nuôi cấy có thạch tạo thành các khuẩn lạc có đường kính 2 - 4 mm sau 24 giờ. Khuẩn lạc thường có hình tròn, lồi, nhẵn trơn, mờ đục, bề mặt sáng. S. aureus khi sinh trưởng trên môi trường thạch đặc trưng tạo thành các khuẩn lạc màu vàng nên được gọi là tụ cầu vàng [39]. S. aureus có phản ứng dương tính với enzyme catalase, có khả năng chuyển H2O2 thành nước và oxy. Đặc điểm này làm cho catalase trở thành phép thử hữu hiệu giúp phân biệt các chủng Staphylococcus với Enterococcus . Một số lượng nhỏ các chủngS. aureus có thể phân biệt với phần lớn Staphylococcus khác bằng cách thử phản ứng phát hiện coagulase. S.aureus thường phản ứng dương tính (do tạo ra coagulase), gây đông tụ, trong khi một số chủng lại có phản ứng âm tính [44].
Hình 1.6. Vi khuẩn S. aureus khi chụp bằng kính hiển vi điện tử và khuẩn lạc trên môi trường thạch TSB S. aureus có phản ứng với ADNase (tạo vùng sáng trong trên môi trường dinh dưỡng thạch), lipid (màu vàng và mùi ôi), phosphatease dương tính (có màu hồng), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl [39, 44]. Trong tự nhiên S. aureus thường được tìm thấy trên da, mũi, tóc hay lông của các loài động vật máu nóng. S. aureus sản sinh một số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 4 - 6 giờ người bị ngộ độc có các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 - 8 giờ. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít khi được xử lý ở nhiệt độ cao hơn 400C) và các loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loài vi sinh vật này. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến. Khoảng 20% dân số thường xuyên mang theo S. aureus [39, 44]. .3. Giới thiệu chung vê nam mốc 1.3.1. Nấm mốc Aspergillus flavus 1.3.1.1. Phân loại [47] Aspergillus flavus là một loại nấm thường có mặt trong môi trường và có thể gây bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài. Chúng cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho người, liên quan đến bệnh aspergillosis của phổi và đôi khi gây bệnh trên kết mạc, nấm tai, nhiễm trùng mũi hầu. Nhiều dòng nấm sinh ra một lượng lớn độc tố aflatoxin, một trong những chất gây ung thư và gây độc cấp tính.
Hình 1.7. Aspergillus flavus Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergillus Loài: A. flavus 1.3.1.2. Đặc điểm của nấm Aspergillus flavus [43] Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài, có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5 pm, có khi đến 10 pm, thậm chí đến 1 mm. Chiều dài sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm xù xì như bông. Trên môi trường đặc biệt và trên một số hợp chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. Giống như các loài Aspergillus, A. flavus có một trên toàn thế giới. Điều này có lẽ kết quả từ việc sản xuất của nhiều bào tử trong không khí, dễ dàng phân tán bởi các chuyển động không khí và có thể do côn trùng. Thành phần không khí có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc. A. flavus phát triển tốt với hoạt độ nước từ 0,86 và 0,96. Nhiệt độ thích hợp là 30-380C, tối đa là 44-470C, độ ẩm tương ứng để bảo từ nảy mầm là 80%, độ ẩm thích hợp sinh sản vô tính là 86%.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT 1.3.1.3. Hình thức sinh sản [43] Nấm mốc sinh sản dưới hình thức: vô tính Trong sinh sản vô tính: nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. Nấm sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng là sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Bào tử đính (conidium) là các bào tử không có túi bao bọc ở giống nấmAspergillus, Pénicillium , Hình dạng, kích thước, màu sắc và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm; cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thẻ phân nhánh như ở Pénicillium . Bào tử đính hình thành từ những cụm trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma ; 1.3.1.4. Một số bệnh lý do nấm mốc Aspergillus flavus gây ra [43] Aspergillus flavus cũng có thể là tác nhân gây bệnh cho thực vật và động vật, trong đó có con người và vật nuôi. Nấm có thể nhiễm trên bắp, đậu phụng, cotton và cây đậu. Nấm thường thấy dưới dạng các mảng nấm và có thể nhìn thấy được. Các bệnh nhân nhiễm nấm A. flavus thường là suy giảm miễn dịch. A. flavus là tác nhân đứng hàng thứ hai hay gặp nhiều nhất của nhóm nấm gây bệnh aspergillosis, tác nhân đầu tiên là nấm Aspergillus Fumigatus . A. flavus có thể xâm nhập vào các động mạch phổ hoặc não và gây tình trạng nhồi máu. Ngoài ra nó còn sinh ra độc tố (aflatoxin) là một trong những tác nhân gây ung thư (HCC_hepatocellular carcinoma). Sự phá hủy của nấm A. flavus đặc biệt thường hay sinh aflatoxin, có thể gây viêm gan cấp, ung thư gan và gây suy giảm miễn dịch. Đồng thời qua một số nghiên cứu tại các quốc gia cho thấy tỷ lệ ung thư gan có viêm gan siêu vi đi kèm thì thường tỷ lệ nhiễm nấm cùng lúc cũng rất cao. Trong tự nhiên,A. flavus có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau. Đặc biệt chúng sống trên các thực vật hoại sinh như mô thực vật và động vật bị chết trong đất. Vì lý do này nên nó có thể tái sinh dinh dưỡng liên tục. Trong một loạt ca bệnh được báo cáo về nấm A. flavus ở người, nhiều ca đưa đến nhièu biến chứng nặng, thậm chí tử vong: viêm màng ngoài tim dẫn đến tử vong do A. flavus trên bệnh nhân bị bạch cầu cấp, hoặc dị ứng viêm mũi xoang ở bệnh nhân ở Qatar do A.flavus, hoặc bệnh nhân ghép gan bị viêm cơ do nấm A. flavus (Clinical transplantation, 22: 2008, 508-510).
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 1.3.2. Nấm mốc Fusarium solani [8] Bệnh héo vàng do nấm F. solani gây hại là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho rau, củ, quả ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Mỹ, Anh, Ý, Nam Phi, Ân Độ, Australia Bệnh này có phạm vi kí chủ rộng, xuất hiện và gây hại nhiều nơi nhất là vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. 1.3.2.1. Phân loại Hình 1.8. Fusarium solani Giới : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Nectriceae Chi: Fusarium Loài: F. solani 1.3.2.2. Đặc điểm của nấm Fusarium solani [41] Giai đoạn hữu tính F.solani là Haematonectria heamatococca . Tuy nhiên, tên gọi này thường ít thông dụng. Giai đoạn hữu tính hầu như không gây bệnh cho cây, dù từ môi trường nuôi cấy.
o ^ \ ___Ẩ___ 1- . __ V o 31 Cà p A c " E ~-/ A í -—t »— 1 — 9 ị Ị '" T ■ ■ T—* r—- B F OCX Hình 1.9. Loài F. solani : A-B: đại bào tử; C-D: tiểu bào tử; E-G: bào tử đính trên môi trường (Dương Minh,2010) Giai đoạn vô tính là F. solani thường ký sinh gây hại cây. Tiểu bào tử củaF. solani trong suốt, hình trụ, hay nêm (9-16 x 2-4pm), có thể có 1 vách ngăn. Đại bào tử có thể có hoặc không có một vài chủng, hình trụ hoặc liềm (40-100 x 5-7,5pm), thường có 3-5 hay 7 vách ngăn. Nhiệt độ tối thiểu để sợi nấm phát triển và hình thành bào tử trong nuôi cấy là 280C. Bào tử áo là những bào tử có vách dày (10-11 x 8-9pm). Li et al, (1998) cho biết ở loài F.solani f.sp. glycines nhiệt độ 300C giúp kích thích hình thành bào tử áo. Thường bào tử áo có dạng đơn, đôi khi có dạng đôi chúng được hình thành từ phần cuối, bên hông hay ở giữa của đại bào thìFusarium có thể tồn tại trong đất dưới dạng bào tử áo qua thời gian dài, bào tử áo có thể lưu tồn trong đất từ 15 đến 20 ngày. Bệnh lây lan qua than rễ, đất bị nhiệm bệnh và truyền qua giống, ngoài sựu lây lan thứ cấp của bệnh có thể được thực hiện qua nguồn nước và cơ giới Fusarium thường tấn công cây trồng dễ dàng khi bị thiếu ánh sáng. Phơi nắng ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm hiệu quả của việc tiêm chủngF.solani. Trên cây trồng, loài F. solani f.so.pisi (gây chết cây) phát triển tốt khi đất được cung cấp thêm P, K, Mg hòa tan, C và N tổng số. Das (1991), cho biết khuẩn lạc của F.solani sẽ phát triển kém khi hàm lượng K+ giảm dưới 3mM. Nếu thiếu Bo và Fe, F.solani f.sp.phaseoli sẽ gia tăng mức gây hại lên trục hạ diệp của cây. Ngược lại, Keawruang et al, (1989), bón thạch cao (CaSO4) và hàm lượng nước tốt có thể làm giảm bệnh thối rễ do F.solani gây ra. I.3.2.3. Hình thức sinh sản Nấm F. solani sản sinh ra 3 loại bào tử vô tính đó là tiểu bào tử, đại bào tử và bào tử hậu.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Các bào tử hậu thường có dạng hình tròn, có thành bào tử dày do các sợi nấm tạo thành loại bào tử này thường có 3 đến 5 ngăn, chúng được sinh ra trong các đại bào tử hoặc xen giữa các sợi nấm già [8, 47]. Tiểu bào tử là các bào tử có 3 hay 5 ngăn, có hình trứng, hình bầu dục, đây là dạng bào tử có nhiều nhất và được sản sinh trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong tất cả các điều kiện, thường được sinh ra trong các mạch dẫn của cây bị bệnh. Đại bào tử là các bào tử có từ 3 đến 5 ngăn. Đại bào tử có hình bán nguyệt, hình lưỡi liềm. Đại bào tử có thể tồn lưu trong đất lâu đến 30 năm và nó chính là nguồn lan truyền bệnh cho các năm sau và các cây khác. I.3.2.4. Một số bệnh lý do nấm mốc F. solani Nấm F. solani là loài nấm tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây bệnh vào bên trong bó mạch, chủ yếu thông qua bộ rễ do rễ làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng nên nấm cũng theo con đường đó mà xâm nhập vào cây, sau khi xâm nhập gây bệnh nấm làm cho bó mạch bị chuyển sang màu nâu xấm hoặc nâu đen, lá cây bị héo do độc tố nấm tiết ra làm tắc bó mạch, dẫn đến mất chức năng quang hợp và cây bị chết [8].
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu 2.1.1. Thời gian và địa điểm Thời gian: 06/02/2017 đến 06/06/2017 Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu. Một phần nghiên cứu được thực hiện ở phòng F45 Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp TP.HCM. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Củ cải tươi sau khi thu hoạch được rửa sạch, cắt lát dày 1-1,2 cm, sấy ở 500C đến khi còn 6 - 7% ẩm. Củ cải khô sau đó được xay nhỏ, lọt qua sàng 40 mesh và trích ly bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, methanol, ethyl acetate, este dầu hỏa) thu được cao củ cải. 2.1.3. Phạm vi nghiên cứu Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ củ cải trắng bằng hệ dung môi ethanol - nước trên các đối tượng: • Aspergillus flavus (VTCC-F-824) • Fusarium solani (VTCC-F-827) • Bacillus cereus (VTCC 1005) • Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) • Salmonella typhi (ATCC 6538) • Staphylococcus aureus (ATCC 14028) 2.1.4. Hóa chất sử dụng Hóa chất sử dụng: môi trường SDA (Ân Độ) và môi trường PDA (Ân Độ), MHA (Himedia, Ân Độ), TSB (Pháp). 2.1.5. Thiết bi - Dụng cụ Máy ly tâm, máy đo pH, buồng đếm hồng cầu; Micropipet; Vortex; cân phân tích, Nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi; Và các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm.
2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.I. Phương pháp định tính các thành phần trong cao chiết > Định tính alkaloids Cân 2 g mẫu cao cho vào 20 ml dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 50%. Thêm 2 giọt dung dịch ammoniac đậm đặc và thêm một ít dung môi chloroform vào rồi lắc nhẹ để trộn đều và hỗn hợp được đưa vào phễu chiết. Chờ một lúc để hỗn hợp tách lớp rồi đem đi chiết thu được 2 lớp dịch riêng biệt rồi đem kiểm tra với thuốc thử Dragendorf. Lần lượt cho 1 ml thuốc thử Dragendorf vào trong 2 lớp dịch được
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT tách riêng biệt. Hỗn hợp nào hình thành kết tủa màu nâu đỏ chứng tỏ có sự hiện diện của alkaloids [36]. > Định tính tannin Lấy 2 g cao hòa tan trong 10 ml dung dịch cồn 50% rồi chia làm 3 phần bằng nhau: - Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại tannin [41]. - Thử nghiệm gelatin: Hòa tan một lượng nhỏ gelatin dạng hạt vào trong phần thứ hai rồi lắc đều cho gelatin hòa tan hoàn toàn. Sau đó để yên hỗn hợp, nếu xuất hiện kết tủa trắng lơ lửng bên trong chứng tỏ mẫu cao có sự hiện diện của tannin [36]. - Thử nghiệm chì acetate: Nhỏ 3 giọt dung dịch chì acetate vào phần thứ ba, lắc đều cho đến khi thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt thì chứng tỏ có sự tồn tại của tannin trong mẫu cao [36]. > Định tính anthraquinones Cân 0,5 g mẫu cao hòa vào 5 ml dung môi chloroform và lắc đều trong vòng 5 phút. Tiến hành lọc hỗn hợp trên để thu được dịch trong rồi bổ sung thêm dung dịch amoniac 10% với thể tích bằng với thể tích của dịch trong vừa lọc. Nếu ta thấy có xuất hiện lớp nước màu đỏ hay hồng hoặc tím sau khi lắc đều chứng tỏ có sự hiện diện của anthraquinones tự do có trong mẫu cao [36]. > Định tính saponin - Thử nghiệm 1: Lấy 1g mẫu cao cho vào 2 ml dung dịch NaCl rồi lắc đều sau đó hút 2 ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm rồi thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm rồi nhẹ nhàng đảo ngược ống (không tạo rung) và để yên trong 15 phút. Sự lắng xuống của các tế bào hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36]. - Thử nghiệm 2: Cân 1 g mẫu cao rồi hòa tan trong 10 ml nước cất sau đó lắc mạnh trong 30 giây và để yên hỗn hợp trong vòng 30 phút. Nếu có sự hình thành của bọt khí không tan chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong mẫu cao [36]. > Định tính flavonoids Cân 2 g mẫu cao hòa tan trong 10 ml nước cất rồi hút 3 ml hỗn hợp vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với dung dịch FeCl3 [36].
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 - Thử nghiệm NaOH 10%: Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của ílavonoids trong mẫu cao [36]. - Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều. Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại ílavonoids trong mẫu cao [36]. 2.2.2.2. Chuẩn bị giống > Nấm mốc Tiến hành giữ các giống nấm mốc trên môi trường thạch SDA trên đĩa Petri bằng phương pháp cấy chấm góc. Đầu tiên pha môi trường thạch SDA (65 gam/lít), hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội xuống 40-500C rồi đem đi đổ đĩa Petri. Các đĩa này được để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ để kiểm tra môi trường không bị nhiễm. Đĩa Petri sau 24 giờ sẽ được dùng để cấy chuyền các giống nấm mốc nhằm mục đích giữ giống. Sau khi cấy các đĩa Petri được đem ủ trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ thường và bảo quản trong 2 - 3 tuần ở nhiệt độ mát. Để chuẩn bị thử nghiệm cấy nấm mốc qua môi trường thạch nghiêng, nuôi nấm mốc trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Thực hiện lấy bào tử nấm mốc: bơm 10 ml nước muối sinh lý vào ống thạch nghiêng đã cấy nấm mốc, lắc ống nghiệm trên vortex với tốc độ quay 3200 rpm thời gian 5 phút. Đổ lấy dịch huyền phù vào ống ly tâm và ly tâm với tốc độ vòng 5000 rpm thời gian 10-15 phút. Đổ phần dịch bên trên thu lấy phần cặn phía dưới. cặn này sẽ hòa tan vào dung dịch nước muối sinh lý để được mật độ 5 x106 bào tử/ ml. Đây chính là dịch nấm mốc để nghiên cứu. > Vi khuẩn Bảo quản giống: vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng TSB, đem ủ ở 370C trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch không bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 370C, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 - 12 giờ. Môi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật. Chuẩn bị sẵn glycerol và effendorf đã được hấp tiệt trùng. Tiến hành bơm 400 pl dịch vi khuẩn nuôi cấy vào effendorf rồi cho tiếp 600 pl glycerol rồi đem cho vào tủ lạnh đông sâu ở - 490C để giữ giống cho quá trình làm thí nghiệm.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Tăng sinh: vi khuẩn lấy ra từ tủ đông sâu cần được rã đông khoảng 2 tiếng bằng cách hạ nhiệt độ từ từ xuống để tránh vi khuẩn sốc nhiệt gây chết. Để hoạt hóa vi khuẩn tiến hành tăng sinh với 3 ml môi trường TSB cho 40 gl dịch vi khuẩn rồi 10 ml môi trường với 0,5 ml dịch và 100 ml môi trường với 1 ml dịch, ở mỗi giai đoạn này đều ủ ở 370C trong 100 rpm từ 10 - 12 giờ. Thực hiện lấy tế bào vi khuẩn: huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 5000 rpm để tách sinh khối ra khỏi môi trường rồi rửa sinh khối vi sinh vật bằng 3 lần nước cất vô trùng và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độ đục tương đương 0,5 MC Farland. Huyền phù vi khuẩn này được dùng trong các khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. 2.2.2.3. Chuẩn bị pha cao củ cải ở các nồng độ khác nhau Cao củ cải trắng được pha trong dung dịch DMSO 5% vô trùng với các nồng độ 1600, 800, 400, 200 và 100 mg/ml. Cao với các nồng độ khác nhau sau đó được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng. Các kháng sinh được sử dụng để đối chứng là ampicillin (10 gg/đĩa), gentamycin (10 gg/đĩa), tetracycline (30 gg/đĩa) dùng cho khuẩn và terbinaílne (1 mg/ml pha trong DMSO 5%) dùng cho mốc, chứng âm là dung dịch DMSO 5% vô trùng. 2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch của Hadacek và cộng sự (2000). Theo đó, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo bán kính vòng ức chế vi sinh vật (BK) theo công thức BK (mm) = D - d với D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính khoanh giấy kháng. Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Cách tiến hành: ♦♦♦ Đối với nấm mốc Pha môi trường PDA (39 g/l), hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội đến 40 - 500C, thực hiện đổ đĩa Petri, ủ trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ thường để kiểm tra môi trường không bị nhiễm.
Cho vào đĩa petri 100 pl dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.2.2, trang đều dịch nấm mốc trên đĩa thạch, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng. + Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch. Mỗi đĩa petri được đặt 7 khoanh giấy Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế. - 5 đĩa giấy chứa 10 pl cao củ cải trắng với các nồng độ khác nhau. - 1 đĩa chứng âm chứa 10 pl dung dịch DMSO 5% vô trùng. - 1 đĩa giấy chứng dương là kháng sinh có nồng độ được trình bày ở mục 2.2.2.3. Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 - 48 giờ. ♦♦♦ Đối với vi khuẩn Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Cho vào mỗi đĩa Petri 25 ml môi trường MHA vô trùng (khoảng 40 - 500C) và 1 ml dịch vi khuẩn mật độ 1,5 x 106 CFU/ml, lắc đều, để yên khoảng 45 phút cho môi trường đông đặc. Mỗi đĩa Petri được đặt 7 đĩa giấy, trong đó gồm: - 5 đĩa giấy chứa 10 pl cao củ cải trắng với các nồng độ khác nhau đã trình bày ở mục 2.2.2.4. - 1 đĩa chứng âm chứa 10 pl dung dịch DMSO 5% vô trùng. - 1 đĩa giấy chứng dương là kháng sinh có nồng độ như đã trình bày trong phần 2.2.2.3. Mỗi nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần. Các đĩa được ủ ở 37oC trong vòng 16 - 20 giờ. Đường kính vùng ức chế được đo bằng thước đo đơn vị mm [42]. Đo đường kính vòng kháng khuẩn từ 2 điểm đối xứng nhau Đĩa giấy đặt lên môi trên đường tròn đi trường chưa có vòng qua tâm của đĩa giấy kháng khuẩn xung quanh đĩa giấy d = 0 m m Đĩa Petri có sẵn môi trường và vi khuấn Hình 2.2. Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009)
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 2.2.2.5. Xử lý số liệu Kết quả vòng kháng khuẩn đo được sẽ được tính từ trung bình của các lần lặp lại, thể hiện theo dạng trung trình ± SD. Kiểm tra sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phân tích ANOVA và LSD trên phần mềm Statgraphics.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất có trong cao củ cải trắng Theo Kukum Agarwal và Rajana Varma (2014) trong củ cải có các nhóm chất alkaloid, glycoside, triterpenoid và steroid nhưng không tìm thấy sự hiện diện của các hợp chất carbohydrate, đường khử, flavonoid, tannin, hợp chất phenolic, saponin, protein và acid amin. Tuy nhiên, G. Aruna, Venu G. Yerragunt, Akondi B. Raju (2012) cũng đã nghiên cứu các hợp phần có tính chất dược lý trong củ cải trắng và đã xác định được đó là các flavonoid, glycoside, alkaloid, saponin, tannin, polyphenol, anthocyanin, glucosinolate và isothiocyante. Nghiên cứu của Safia Janiua, Maliha Shahid, Fakhir-i-Abbas (2013) cũng cho thấy trong củ cải trắng tồn tại các hợp chất có tác dụng chữa bệnh như tannin, saponin, flavonoid, phlobatannin, anthraquinone, carbohydrate, đường khử, steroid, phytosterol, alkaloid, acid amin, terpenoid, cardiac glycoside và chalcone [2, 18]. Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu củ cải khảo sát, chúng tôi tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.2.2.1. Kết quả ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các hợp chất có trong mẫu cao củ cải trắng Thí nghiệm Kết quả Kết luận 1. Định tính alkaloid + 2. Định tính tannin
Thử nghiệm FeCl3 + Thử nghiệm chì acetate + Thử nghiệm gelatin + 3. Định tính anthraquinones 4. Định tính saponin
Thử nghiệm 1 Thử nghiệm 2 5. Định tính ílavonoids Thử nghiệm NaOH + Thử nghiệm FeCỈ3 + Từ 5 thử nghiệm khảo sát định tính như trình bày, kết quả có 3 thử nghiệm đạt dương tính:
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 - Alkaloids - Tannin - Flavonoids Kết quả này tương tự với các nghiên cứu đã trình bày ở trên. Có 2 thử nghiệm thu được kết quả âm tính là saponin và anthraquinones. Theo chúng tôi có thể là do sự khác nhau về nguồn nguyên liệu, bởi thành phần của nguyên liệu chịu ảnh hưởng rất nhiều của giống, đất đai, thổ nhưỡng, điều kiện chăm sóc, Từ kết quả định tính xác định được trong củ cải trắng có hợp chất alkaloid, tannin và flavonoid. Các hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn nên theo chúng tôi có lẽ sự kháng khuẩn của cao củ cải trắng là do các hợp chất này tạo ra. 3.2. Kết quả kháng khuẩn và nấm mốc của cao củ cải trắng 3.3.1. Kết quả kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của cao củ cải trắng đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (100; 200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại 4 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm hai chủng Gram âm(Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005). Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiên qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Đường kính vòng kháng khuẩn của cao củ cải trắng (mm) Nồng độ STT B. cereus S. typhi P. aeruginosa S. aureus (mg/ml) 1 1600 15,56c ± 0,88 13,67c ± 0,71 17,89b ± 0,60 16,78c ± 0,67 2 800 15,00c ± 0,50 13,33c ± 0,87 15,00c ± 0,71 15,89d ± 0,60 3 400 13,89d ± 1,05 11,89d ± 1,27 12,22d ± 0,44 14,11e ± 0,33 4 200 12,67e ± 0,50 11,89d ± 1,27 10,67e ± 0,50 13,33f ± 0,50 5 100 11,56f ± 0,88 9,89e ± 1,67 8,78f ± 0,67 11,56g ± 0,73 6 Ampicilin 8,67g ± 0,58 19,00a ± 0,00 0 9,67h ± 0,58 7 Gentamycin 16,67b ± 1,15 14,67b ± 0,58 21,00a ± 0,00 18,67b ± 1,15 8 Tetracycline 24,67a ± 1,15 19,00a ± 1,00 0 22,33a ± 0,58
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Trong cùng một cột, các số có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Theo bảng 3.2 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng trên từng chủng vi khuẩn chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau: - Trên chủng vi khuẩn B. cereus khi khảo sát ở các nồng độ chúng tôi nhận thấy ở hai nồng độ 1600 mg/ml và 800 mg/ml không có chênh lệch đáng kể và không khác nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05, kết quả lần lượt là 15,56 ± 0,88 mm và 15,00 ± 0,50 mm. Các nồng độ còn lại là 400 mg/ml, 200 mg/ml và 100 mg/ml kết quả thu được ở 3 nồng độ trên lần lượt là: 13,89 ± 1,05, 12,67± 0,50 và 11,56 ± 0,88 mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của cao củ cải trắng đối với chủngB. cereus tương đối cao, nhận thấy dịch chiết củ cải có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng độ thấp. - Trên chủng S. typhi khi khảo sát các nồng độ trên, chúng tôi nhận thấy rằng hai nồng độ đầu là 1600 mg/ml và 800 mg/ml có kết quả ghi nhận lần lượt là 13,67 ± 0,71 mm và 13,33 ± 0,87 mm không khác nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Mặt khác, ở hai nồng độ tiếp theo là 400 mg/ml và 200 mg/ml hoàn toàn không khác nhau, kết quả thu được ở cả hai nồng độ là 11,89 ± 1,27 mm. Và nồng độ cuối cùng là thấp nhất so với các nồng độ trước với kết quả là 9,89 ± 1,67 mm. Qua kết quả trên, chúng tôi nhận thấy đối với chủngS. typhi ở các nồng độ gần nhau thì khả năng kháng của cao củ cải hầu hết cho ra kết quả tương đương nhau, ở nồng độ cuối kết quả thu được thấp hơn nhiều. Hầu như với chủng này cao củ cải kháng yếu hơn so với chủng B. cereus. - Trên chủng P. aeruginosa khi chúng tôi tiến hành khảo sát với 5 nồng độ trên, nhận thấy ở tất cả các nồng độ đều có sự khác biệt nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Cụ thể ở nồng độ cao nhất và nồng độ thấp nhất thu được kết quả lần lượt là 17,89 ± 0,60 mm và 8,78 ± 0,67 mm, kết quả cho thấy hoạt tính cao củ cải giảm dần từ nồng độ cao nhất đến nồng độ thấp nhất. Dựa theo kết quả ghi nhận được, chúng tôi nhận thấy với chủngP. aeruginosa , cao củ cải ở nồng độ cao (1600 mg/ml) có khả năng kháng tốt và càng dần về nồng độ thấp thì hoạt tính giảm dần và có xu hướng giảm đi một nửa so với nồng độ cao nhất. - Cuối cùng là chủngS. aureus, tương tự như chủng P. aeruginosa , chúng tôi nhận thấy các nồng độ khảo sát có sự khác biệt nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05. Mặc dù chủngS. aureus có kết quả giảm dần từ nồng độ cao nhất đến nồng độ thấp nhất tương tự như P. aeruginosa nhưng theo kết quả ghi nhận được ở nồng độ cao củ cải là 100
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT mg/ml thì cao củ cải vẫn giữ được hoạt tính kháng tốt (11,56 ± 0,73 mm). So với hoạt tính ở B. cereus đối với nồng độ 100 mg/ml thì cao củ cải có khả năng kháng tương đương đối với hai chủng này. Dựa trên kết quả thí nghiệm với DMSO 5%, các mẫu chứng âm không xuất hiện vòng kháng khuẩn, điều này được khẳng định khi đa số các thí nghiệm về kháng khuẩn đều dùng DMSO làm chứng âm [33]. DMSO không kháng khuẩn ở tất cả các dịch chiết với các dung môi khác nhau. Vì vậy có thể kết luận rằng DMSO hòa tan đa số các hợp chất và sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh hưởng đến kết quả kháng khuẩn [29]. Cao củ cải trắng có khả năng ức chế sự phát triển của cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ kháng phụ thuộc nồng độ của cao sử dụng. Hiệu quả kháng của cao củ cải tốt nhất trên P. aeruginosa và thấp nhất với S. typhi . Đối với S. aureus và B. cereus, mức độ kháng không cao nhưP. aeruginosa , chỉ thấy được sự khác biệt rõ nét ở nồng độ cao nhất (1600 mg/ml) và nồng độ thấp nhất (100 mg/ml), hầu như hoạt tính kháng không giảm đáng kể khi so sánh với những nồng độ gần kề nhau. Tuy nhiên, khi giảm nồng độ xuống còn 100 mg/ml thì vòng kháng khuẩn có đường kính ghi nhận được ở hai chủng vi khuẩn S. aureus và B. cereus là khá cao và cao hơn cả P. aeruginosa khi ở cùng nồng độ khảo sát thấp, kết quả thu được lần lượt củaS. aureus, B. cereus là 11,56 ± 0,73 mm; 11,56 ± 0,88 mm. Ở nồng độ 1600 mg/ml, hiệu quả kháng của cao củ cải thấp hơn của tetracycline mức 30 pg, tương đương với 10 pg gentamycin và cao hơn 10 pg ampicilin (trừS. typhi với vòng kháng đạt 19,00 ± 0,00 mm). Đặc biệt, vớiP. aeruginosa , hai kháng sinh là ampicilin và tetracycline không có khả năng kháng với chủng này, nhưng cao củ cải trắng lại có khả năng kháng tốt, nồng độ 100 mg/ml vẫn cho thấy vòng kháng đạt 8,78 ± 0,67 mm. Hình 3.1. Khả năng kháng B. cereus của cao củ cải trắng
Hình 3.2. Khả năng kháng P. aeruginosa của cao củ cải trắng Hình 3.3. Khả năng kháng S. aureus của cao củ cải trắng Hình 3.4. Khả năng kháng S. typhi của cao củ cải trắng (1): chứng âm DMSO 5%, (2): 1600mg/ml, (3): 800 mg/ml, (4): 400 mg/ml, (5): 200 mg/ml, (6): 100 mg/ml, (7): chứng dương gồm 3 loại (a) Ampicillin , (b) Gentamycin, (c) Tetracycline 3.3.2. Kết quả kháng nấm mốc Hoạt tính kháng nấm của cao củ cải trắng đã được nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (100; 200; 400; 800; 1600 mg/ml) chống lại chủng nấm mốc gây bệnh như A. flavus và F. solani . Khả năng kháng nấm được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc được thể hiện qua đường kính kháng nấm được tạo ra trên đĩa petri được trình bày ở bảng 3.3.
Hình 3.6. Khả năng kháng A. flavus của cao củ cải trắng Hình 3.5. Khả năng kháng F. solani của cao củ cải trắng (0): chứng âm DMSO 5%, (1): 1600mg/ml, (2): 800 mg/ml, (3): 400 mg/ml, (4): 200 mg/ml, (5): 100 mg/ml, (tâm): chứng dương gồm loại (Ter) Terbinaíine Bảng 3.3. Đường kính vòng kháng nấm của cao củ cải trắng (mm) Hiệu số vòng kháng đối với các VSV kiểm định STT Nồng độ (mg/ml) D-d (mm) A. flavus F. solani 1 1600 11,5b ± 0,84 0,0 2 800 8,5c ± 0,84 0,0 3 400 6,83d ± 0,41 0,0 4 200 5,83f ± 0,41 0,0 5 100 0,0 0,0 6 Terbinafine 39,33a ± 0,58 21,0 ± 1,73 7 7 Trong cùng một cột, các số có chữ số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức ý nghĩa a = 0,05.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 * Nhận xét DMSO 5% là mẫu chứng âm không thể kháng mốc giống với khuẩn được trình bày ở 3.3.1. Loại thuốc kháng Terbinafine có thể kháng sinh hai loại nấm mốc A. flavus và F. solani. Thuốc kháng sinh có hoạt tính kháng cao hơn và tốt hơn so với dịch chiết cao của củ cải trắng. Dịch cao chiết từ củ cải có hoạt tính kháng đối với chủngA. flavus nhưng không có hoạt tính kháng đối với chủngF. solani. • Với nồng đồ cao 1600 mg/ml và 800 mg/ml tôi nhận thấy rằng vòng kháng sinh to,rõ ràng và có sự chênh lệch khá nhiều với kết quả lần lượt là 11,5 ± 0,84; 8,5 ± 0,84 mm và khác nhau ở mức độ ý nghĩa a = 0,05. Các nồng độ còn lại 400 mg/ml, 200 mg/ml và 100mg/ml có sự chênh lệch nhiều hơn và nhận thấy được sự khác biệt rõ nét kết quả lần lượt là 6,83 ± 0,41; 5,83 ± 0,41; 0 mm. Nồng độ cao có thể kháng được nấm mốc ở 200 mg/ml. Ở nồng độ 100 mg/ml thì cao của củ cải trắng không có hoạt tính kháng. Vì khi nồng độ cao càng thấp thì hoạt tính kháng càng giảm. Ở nồng độ 200 mg/ml vẫn còn hoạt tính kháng. uA.flavus kái s. aureus u p. aeruginosa Nồng độ dịch chiết củ cải trắng (mg/ml) Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của cao củ cải trắng từ 4 chủng vi khuẩn và nấm mốc khác nhau 3.4. Bàn luận Các kháng sinh chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm gentamycin, ampicillin và tetracycline, terbinafine.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Trong đó, gentamycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, có khả năng kháng hiệu quả nhiều loại bệnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây ra. Cơ chế tác dụng của gentamycin là ức chế tổng hợp protein và phá vỡ toàn bộ màng tế bào vi khuẩn. Gentamycin khuếch tán vào trong tế bào và được vận chuyển qua màng tế bào chất nhờ năng lượng từ hệ thống vận chuyển electron của một quá trình phụ thuộc vào O2. Pha vận chuyển này có thể bị ức chế bởi các cation Ca2+, Mg2+, làm giảm pH và tăng áp lực thẩm thấu. Sau khi qua màng sẽ được vận chuyển nhanh đến gắn với các tiểu đơn vị của ribosome làm giảm độ chính xác của các RNA thông tin, dẫn đến kết hợp sai các acid amin trong chuỗi polypeptide của vi khuẩn [7, 37]. Ampicillin là kháng sinh phổ rộng đầu tiên hoạt động chống lại vi khuẩn Gram dương bao gồmStreptococcus pneumoniae , Streptococcus pyogenes , S. aureus và một số loài Enterococcus . Hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram âm bao gồm Neisseria meningitidis , Haemophilus influenzae và một số loàiEnterobacteriaceae . Ampicillin nằm trong nhóm penicillin kháng sinh P-lactam và là một phần của họ aminopenicillin [3, 27]. Ampicillin hoạt động như một chất ức chế không thuận nghịch của enzyme transpeptidase, là một enzyme cần thiết của vi khuẩn để tạo nên thành tế bào [1, 9]. Ampicillin ức chế giai đoạn cuối cùng của sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn trong sự phân đôi tế bào, dẫn đến việc phân tách tế bào. Do đó, cơ chế của ampicillin là tác động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptide của màng tế bào vi khuẩn [27, 1]. Tetracycline ức chế rất nhiều phản ứng enzyme thiết yếu cho các quá trình quan trọng của tế bào vi khuẩn. Các phản ứng sinh hóa nhạy cảm nhất được ức chế là sự tổng hợp các protein [7]. Tetracycline hoạt động bằng cách liên kết đặc hiệu với ribosome 30S của vi khuẩn, ngăn sự gắn kết của aminoacyl tRNA với phức hợp RNA- ribosome. Đồng thời tetracycline ức chế các bước khác của quá trình tổng hợp protein. Tetracycline cũng có thể làm thay đổi màng tế bào chất và điều này là nguyên nhân làm đảo lộn trật tự các nucleotide và các hợp chất khác ra khỏi tế bào. Do vậy mà tetracycline không trực tiếp giết chết vi khuẩn mà thay vào đó ức chế màng tế bào của vi khuẩn [26, 4]. Terbinafine có tác dụng là ảnh hưởng đến khả năng tạo chất hóa học là các sterol của nấm. Các sterol là thành phần quan trọng của màng tế bào nấm và liên kết chúng
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT với nhau. Sự ảnh hưởng này làm suy yếu màng tế bào. Terbinafine can thiệp chọn lọc vào giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng hợp ergosterol, dẫn đến sự thiếu hụt ergosterol và làm tăng sự tích tụ nồng độ squalene trong nội tế bào và làm chết tế bào nấm. Terbinafine phát huy tác dụng bằng cách ức chế squalene epoxidase trong màng tế bào nấm [10]. Nói về khả năng kháng khuẩn và nấm của các hợp chất có nguồn gốc thực vật, đã có nhiều nghiên cứu báo cáo về hoạt tính của các loại cây có khả năng kháng khuẩn và nấm cao. Và khi so sánh với dịch chiết cao thô của củ cải trắng mà tôi nghiên cứu, tôi nhận thấy rằng so với các loại cây khác, dịch chiết cao thô của củ cải có hoạt tính tương đối cao. Mặc dù dịch chiết cao thô của củ cải không phải là loại cây có hoạt tính kháng khuẩn và nấm cao nhất nhưng nó cũng được xem là một trong những loại cây lấy củ có khả năng kháng và diệt khuẩn tốt. Cụ thể như sau: - Zdenka Cvetni (2004), nghiên cứu về chiết xuất từ hạt bưởi có khả năng kháng các vi khuẩn thử nghiệm. Chiết xuất ethanol cho thấy hoạt tính thấp (vùng ức chế 10 - 12 mm) đối với các chủng vi khuẩn khảo nghiệmB. cereus, S. aureus. Kết quả thu được cụ thể như sau:B. cereus 12 mm, S. aureus 10 - 12 mm. Riêng đối với P. aeruginosa thì kết quả cho thấy chiết xuất từ hạt bưởi không có tác dụng đối với vi khuẩn này. Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất tương đối thấp, so với nghiên cứu về cao củ cải trắng thì thấp hơn nhiều và cao củ cải trắng còn có khả năng kháng được P.aeruginosa với kết quả kháng cao [9]. - Theo khảo sát của Võ Thị Mai Hương (2009) về hoạt tính kháng khuẩn của lá muồng trâu được thử nghiệm với các chủng vi sinh vật cho thấy lá có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt. Đem dịch chiết này tiến hành thử nghiệm với các chủng vi khuẩn được tuyển chọn (trong đó có S. aureus), kết quả cho thấy khả năng kháng của dịch chiết này đối với S. aureus là 18,30 ± 0,75 mm. So với cao củ cải trắng ở nồng độ 1600 mg/ml là 16,78 ± 0,67 mm, cho thấy khả năng kháng của cao củ cải trắng so với dịch chiết nguyên chất của lá muồng trâu không chênh lệch nhiều và tương đối cao [45]. - Theo kết quả nghiên cứu của Faiyaz A và cộng sự (2012) từ hạt củ cải đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh như S. aureus, P. aeruginosa , S. typhi . Theo nghiên cứu này thì hạt củ cải chiết xuất từ ethanol có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất và đường kính nằm trong khoảng từ 12 - 21 mm. Đối với kết quả từ cao củ cải của chúng tôi đối
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017___ ĐHBRVT với các chủng vi khuẩn thử nghiệm gồmS. aureus, P. aeruginosa, S. typhi thì đường kính vòng kháng khuẩn ở nồng độ 1600 mg/ml lần lượt là 16,78 mm, 17,89 mm và 13,67 mm. Dựa vào kết quả trên, hoạt tính kháng khuẩn từ cao củ cải là tương đương với chiết xuất từ hạt củ cải [11]. - Theo báo cáo của Jinxu Sun (2012) về quả mâm xôi nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn của quả này với các chủngvi khuẩn. Kết quả thu được từ thử nghiệm trên nhiều loại vi khuẩn như E.coli, S. aureus, B. subtiỉis, .Riêng với S. aureus thì đường kính vòng kháng khuẩn theo báo cáo này đạt 13,50 mm. So với nồng độ cao 1600 mg/ml thì cao củ cải có hoạt tính cao hơn và đường kính vòng kháng khuẩn đạt đến 16,78 mm [32]. - Nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn (2013) cũng đã khẳng định dịch chiết giàu ílavonoid từ cây diếp cá khi trích ly bằng ethanol với hàm ẩm 19,21% có tác dụng kháng khuẩn trên 4 đối tượng nghiên cứu gồmB. subtilis 18 mm, E. coli 17 mm, P. aeruginosa 14 mm, S. aureus 20 mm. So sánh với cao củ cải trắng của chúng tôi đối với 2 chủng P. aeruginosa và S. aureus, chúng tôi nhận thấy cao củ cải trắng có hoạt tính cao hơn ở P. aeruginosa và thấp hơn ở S. aureus so với dịch chiết từ cây diếp cá. Và kết quả cao củ cải chúng tôi ghi nhận đường kính kháng khuẩn đối vớiP. aeruginosa và S. aureus lần lượt là 17,89 mm và 16,78 mm [38]. Antara Sen (2004), nghiên cứu về chiết xuất từ lá Melia azedarach L có khả năng kháng các vi khuẩn và nấm thử nghiệm. Chiết xuất ethanol, methanol, este dầu hỏa, nước cho thấy hoạt tính cao (vùng ức chế 20 - 22 mm) đối với các chủng vi khuẩn khảo nghiệm A. flavus. Kết quả thu được cụ thể lần lượt như sau: A. flavus 21,5 ± 0,32; 18,3 ± 0,54; 17,5 ± 0,56; 11,3 ± 0,41 mm. Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất tương đối cao, so với nghiên cứu về dịch chiết cao thô của củ cải trắng thì tương đối cao hơn [5]. Qua nghiên cứu trên, nhận thấy rằng các thành phần trong cao củ cải trắng có hoạt tính kháng khuẩn và nấm hiệu quả, là cơ sở cho việc nghiên cứu về các loại virus và phân lập cũng như phân tích các hợp chất, thành phần có trong đó để ứng dụng vào thực tiễn và các nghiên cứu y học, dịch tễ.
KẾT LUẬN Qua thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết của củ cải trắng (Raphanus sativus L.) ” chúng tôi thu được các kết quả như sau: - Kết quả định tính cho thấy các hợp chất có trong cao củ cải trắng thu được bao gồm: flavonoid, alkaloid và tannin. - Kết quả khảo sát về hoạt tính của cao củ cải đối với các chủng vi khuẩn được thử nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 1600 mg/ml đạt đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở 4 loại chủng khuẩn và loại chủng mốc và ở nồng độ cao 100 mg/ml thì cao củ cải trắng vẫn còn hoạt tính kháng. Ngoài ra, ở nồng độ 1600 mg/ml nhận thấy cao củ cải có khả năng kháng tốt hơn kháng sinh ampicillin, tetracycline và tương đương với hai loại kháng sinh còn lại là gentamycin, terbinafine. Các kết quả trên sẽ là nghiên cứu tiền đề khi triển khai ứng dụng dịch chiết của củ cải vào sản xuất, chế biến một số thực phẩm có hoạt tính kháng khuẩn hay bảo quản thực phẩm theo hướng dùng các hợp chất sinh học tự nhiên, an toàn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO > Tài liệu bằng tiếng anh: [1] . Adnan, S., Paterson, DL., Lipman, J., Roberts, JA., 2013, ‘Ampicillin/sulbactam: its potential use in treating infections in critically ill patients’, International Journal of Antimicrobial Agents, Vol 42, No. 5, pp. 384-389. [2] . Agarwal, Kumkum, Varma, Ranjana, 2014, ‘Radical Scavenging Ability and Biochemical Screening of a Common Asian Vegetable - Raphanus sativus L.’,Intemational Journal of Pharmaceutical. Sciences Review and Research, Vol. 27, No. 1, pp. 127 - 134. [3] . Akova, M., 2008, ‘Sulbactam-containing beta-lactamase inhibitor combinations’, European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases,Vol.14, Suppl 1, pp. 185- 188. [4] . Akul Mehta, 2011, Mechanism of Action of Tetracyclines, 27 May 2011, [5] . Antara Sen và Amla Batra, 2012, ‘ Evaluation Of Antimicrobial Activity Of Different Solvent Extracts Of Medicinal Plant: Melia Azedarach L.’, International Journal Of Current Pharmaceutial Research, Vol. 4, pp. 975 - 7066. [6] . Aruna, G., et al., 2012, 'Photochemistry and pharmacology of Raphanus sativus’. International Journal of drug formulation and research, Vol. 3, Issue 1, pp. 43 - 52. [7] . Begg, F.J., et al., 1995,‘Aminoglycosides - 50 years on’, British Journal of Clinical Pharmacology, Vol. 39, No. 6, pp. 597 - 603. [8] . CAB International, 2006. Crop Protection Compendium, 2006 Edition Wallingford, UK: CaB International. www.cabicompendium.org/cpc,S'e/ec/e<7 texts for Fusarium. [9] . Cvetni, Zdenka, 2004, ‘Antimicrobial activity of grapefruit seed and pulp ethanolic extract’, Acta Pharmaceutica, Vol. 54, No. 3, pp. 243 - 250. [10] . C. J. Jessup et al., 2000, ‘An Evaluation Of The In Vitro Activity Of Terbinafine’, Medied Mycology, Vol. 38, pp. 155 - 159.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 [11] . Faiyaz, A., Izharul, H., Danish, K. Chishti, Haqeeq, A., 2012, ‘Antibacterial activity of Raphanus sativus Linn. Seed extract’, Global journal of medical research, Vol. 12, Issue 11, Version 1.0, pp. 24 - 33. [12] . Gutierrez, Rosa M.P., Perez, Rosalinda L., 2004, ' Raphanus sativus (Radish): their chemistry and biology ’, The Scientific Word journal, Vol. 4, pp. 811 - 837. [13] . H. Caglar Kaymak và Faika Yarali và Mesude Figen DONMEZ 2015, ‘The Effects of Bio-priming with PGPR on Germination of Radish (Raphanus sativus L.) Seeds under Saline Conditions’, Turkish Journal of Agriculture and Forestry, Vol. 33, pp. 23 - 28. [14] . Hirotaka Katsuzaki và Masnobu Ota, 2004, ' Chemistry and antioxidative activity of hot water extract of Japanese radish (daikon) Article in BioFactors, Vol. 21, pp. 211-400. [15] . Hauser, Alan R 2013. Antibiotic Basics for Clinicians. Lippincott Williams and Wikins, pp. 25-28. [16] . Jones, L. J. L., Thorpe, J. P., Wallis, G. P., 1982, ' Genetic divergence in four species of the genus Raphanus: Implications for the ancestry of the domestic radish R. sativus’. J. Linnean Society, Vol. 18, No. 1, pp. 35 - 48. [17] . Jahan, M.G.S., et al., 2014, ' Correlation between P-amylase activity and starch content in different cultivars of radish (Raphanus sativus L.) ’ , Biotechnology, Vol. 9, No. 7, pp. 298 - 302. [18] . Janiua, Safia., Shahid, Maliha., Fakhir-i-Abbas, 2013, ‘Phytochemical nanlysis and in vitro antibacterial activity of root peel extract of Raphanus sativus L.var niger’, Advancement in Medical plant research, Vol. 1, No. 1, pp. 1 - 7. [19] . K. Agarwal, R. Varma , 2014, ‘ Wound Healing Biomaterials’ , Functional Biomaterials, Vol. 2. [20] . Kole, C., 2007, ' Genome mapping and molecular breeding in plants’, New York: Springer Berlin Heidelberg, Vol. 5: Vegetable. [21] . Lim, T.K., 2015. Edible medicinal and non-medicinal plant. Springer Dordrecht Heidelberg New York London, Vol. 9: Modified Stems, Roots, Bulbs, pp. 829 - 869.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 [22] . Morgan, W., Midmore, D., 2003. Daikon in Australia . Rural industries research and development corporation, pp. 2 - 4. [23] . Narisa Kamkaen, Chantana Mekseepralard và Jenny Wilkinson, 2010, ‘Antimicrobial and Antioxidant Activities of Traditional Thai Herbal Remedies for Aphthous Ulcers ‘, Phytotherapy Research, Vol. 24, pp. 31 - 51. [24] . Ningthoujam, Debananda Singh, Ningthoujam, Shovarani, 2008, ‘Isolation and Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Strain DN1 Degrading p- Nitrophenol’, Research Journal of Microbiology, Vol. 3, No. 5, pp. 345 - 351. [25] . R. Jakmatakul, Rutt Suttisri và Parkpoom Tengamnuay, (2009), ‘Evaluation of antityrosinase and antioxidant activities of Raphanus sativus root: Comparison between freeze-dried juice and methanolic extract ’, Thai Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 33, pp. 22 - 33. [26] . Rafal Klajn, 2002, Chemistry and chemical biology of tetracyclines, 12/12/2002, [27] . Rafailidis, PI., Ioannidou, EN., Falagas, ME., 2007, ‘Ampicillin/Sulbactam Current Status in Severe Bacterial Infections’, Drugs, Vol 67, No. 13, pp. 1829-1849. [28] . Sarowar Jahan, M. G., et al., 2011, ' Screening of some enzyme and nutrients in radish (Raphanus sativus L.) roof, Philippine Journal of Veterinary and Animal Sciences, Vol. 37, pp. 89 - 100. [29] . Senthilkumar, A., Venkatesalu, V.,2013, ‘Chemical constituents, in vitro antioxidant and antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood apple’, Industrial Crops and Products, Vol. 46, pp. 66 - 72. [30] . Singh, Preeti, Singh, Jaspal, 2013, 'Medical and therapeutic utilities of Raphanus sativus’, International Journal of plant, animal and environmental Sciences, Vol. 3, Issue 2, pp. 103 - 105. [31] . Surekha Shukla et al., 2011,‘ Antimicrobial Efficacy Of Raphanus Sativus Root Juice’, International Joural Of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 3, No 5, pp 89 - 92. [32] . Sun, J., Zhu HX., Guo J., Xiao DG., 2012, ‘Antimicrobial action of purified raspberry flavonoid’, African Journal of Biotechnology, Vol. 11, No. 11, pp. 2704 - 2710.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 [33] . Su, Pai-Wei, Yang, Cheng-Hong, Yang, Jyh-Femg,Su, Pei-Yu, Chuang, Li- Yeh, 2015, ‘Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens’, Molecules 2015, Vol. 20, pp. 11119 - 11130. [34] . Syed Sultan Beevi, Mangamoori Lakshmi Narasu và Bandi Boje Gowda, 2010, ‘Polyphenolics Profile, Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Leaves and Stem of Raphanus sativus L.’, Plant Foods for Human Nutrition, Vol. 65, pp. 8 - 17. [35] . Thwani, Amina N. AL., Ghanima, Kais K., Taqi, Rami A., 2014, ‘ Effect of ethanol extract of Radish (Raphanus sativus L.) seeds and Lactobacillus acidophilus on enteropathogenic Escherichia coli in vitro and in vio’, University of Baghdad, pp. 166 - 181. [36] . Yusuf, A. Z., Zarik, A., Shemau, Z., Abdullahi, M., Halima, S. A. ‘Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn’, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol. 6, No. 2, pp. 10 - 16. [37] . Zembower, T.R., et al., 1998, ‘The utility of aminoglycosidesin an era of energing durg resistance’, International Journal of Antimicrobial Agents, Vol. 10, Issue 2, pp. 95 - 105. >K rpTài 5. • liệu 1 bang. y i tiêng• Ạ việt: • ^ i [38] . Hoàng Văn Tuấn, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Thị Hiền, ‘Nghiên cứu tách chiết và xác định một số hoạt tính sinh học của dịch chiết flavonoid từ cây diếp cá (Houttuynia cordata thunberg) thu hái tại Hà Nội’, Tạp chí sinh học 2013, Số 35(3se), trang 183 - 187. [39] . Lê Thanh Bình. 2012. Cơ sở vi sinh vật học thực phẩm. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. [40] . Nguyễn Công Khẩn, Hà Thị Anh Đào, 2007, 'Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam ’,Nhà xuất bản Y học, trang 103. [41] . Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm. 2012. Vệ sinh và an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. HCM. [42] . Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình. 2013.Kháng sinh — Đề kháng kháng sinh — Kỹ thuật kháng sinh đồ. Các vấn đề cơ bản thường gặp .Nhà xuất bản Y học, pp. 61 - 63.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 [43] .Phan Thúy Hiền, 2009,‘Cẩm Nang Chuẩn Đoán Bệnh Cây Ở Việt Nam ’, &ID=2551 [44] . Trần Linh Thước. 2013. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. [45] . Võ Thị Mai Hương, 2009, ‘Thành phần hóa sinh và khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá muồng trầu (Cassia Alata L.)’, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 52, trang 45 - 52. [46] . vn/cm-nang-chn-on-bnh-cy-vit-nam [47] .
PHỤ LỤC Phụ lục A. Môi trường và kháng sinh Hình phụ lục A1. Môi trường Mueller Hinton Agar (MHA), Tryptone Soya Broth (TSB), Saubouraud Dextrose Agar (SDA), Potato Dextrose Agar (PDA) Hình phụ lục A2. Đĩa giấy kháng sinh gentamycin (Ge), ampicillin (Am), tetracycline (Te), terbinafine (Ter) của công ty Nam Khoa
Phụ lục B. Kết quả nhuộm Gram của 4 chủng vi khuẩn khảo sát Hình phụ lục B1. Kết quả nhuộm Gram của B. cereus và P. aeruginosa Hình phụ lục B.2. Kết quả nhuộm Gram của S. aureus và S. typhi Phụ lục C. Đếm bào tử nấm mốc trên kính hiển vi Hình phụ lục C.1. kết quả đếm bào tử của F. solani và A. flavus
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2013-2017 Phụ lục D. Cao thành phẩm Hình phụ lục D.1. Cao củ cải Phụ lục E. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Bacillus cereus. Summary Statistics for duong kinh vong khang nong Coun Average Standard Coeff. of Mini Maxi Ran Stnd. do t deviation variation mum mum ge Skewness 100 9 11.5556 0.881917 7.63197% 10.0 13.0 3.0 -0.262158 1600 9 15.5556 0.881917 5.66947% 14.0 17.0 3.0 -0.262158 200 9 12.6667 0.5 3.94737% 12.0 13.0 1.0 -1.04978 400 9 13.8889 1.05409 7.58947% 13.0 16.0 3.0 1.34033 800 9 15.0 0.5 3.33333% 14.0 16.0 2.0 0.0 Am 3 8.66667 0.57735 6.66173% 8.0 9.0 1.0 -1.22474 Ge 3 16.6667 1.1547 6.9282% 16.0 18.0 2.0 1.22474 Te 3 24.6667 1.1547 4.68122% 24.0 26.0 2.0 1.22474 Total 54 14.2222 3.30047 23.2064% 8.0 26.0 18 4.62781 ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do Source Sum of D f Mean Square F-Ratio P-Value Squares Between groups 546.0 7 78.0 114.51 0.0000 Within groups 31.3333 46 0.681159 Total (Corr.) 577.333 53
Stnd. error nong do Count Mean (pooled s) Lower Upper limit limit 100 9 11.5556 0.275108 11.164 11.9471 1600 9 15.5556 0.275108 15.164 15.9471 200 9 12.6667 0.275108 12.2751 13.0582 400 9 13.8889 0.275108 13.4973 14.2805 800 9 15.0 0.275108 14.6084 15.3916 Am 3 8.66667 0.476501 7.98845 9.34489 Ge 3 16.6667 0.476501 15.9884 17.3449 Te 3 24.6667 0.476501 23.9884 25.3449 Total 54 14.2222 Multiple Range Tests for vong khang by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups Ampicillin 3 8.66667 X 100 9 11.5556 X 200 9 12.6667 X 400 9 13.8889 X 800 9 15.0 X 1600 9 15.5556 X Gentamycin 3 16.6667 X Tetracycline 3 24.6667 X
Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) khuẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1600 mg/ml 16 16 16 15 15 16 15 17 14 800 mg/ml 15 16 15 15 15 15 15 15 14 400 mg/ml 13 16 13 13 14 14 14 15 13 200 mg/ml 12 13 13 12 12 13 13 13 13 100 mg/ml 12 13 12 10 11 11 11 12 12 Gentamycin 16 18 16 Ampicillin 9 8 9 Tetracycline 24 24 26 Phu luc F. Phu luc F. Kết quả ANOVA, LSD về sư khác biêt ở từng nồng đô cao củ cải và số liêu thô đường kính vòng kháng khuẩn trênPseudomonas aeruginosa. Summary Statistics for duong kinh vong khang nong Cou Standard Coeff. of Mini Maxim Ran Stnd. Average do nt deviation variation mum um ge skewness 100 9 11.5556 0.881917 7.63197% 10.0 13.0 3.0 -0.262158 1600 9 15.5556 0.881917 5.66947% 14.0 17.0 3.0 -0.262158 200 9 12.6667 0.5 3.94737% 12.0 13.0 1.0 -1.04978 400 9 13.8889 1.05409 7.58947% 13.0 16.0 3.0 1.34033 800 9 15.0 0.5 3.33333% 14.0 16.0 2.0 0.0 Am 3 8.66667 0.57735 6.66173% 8.0 9.0 1.0 -1.22474 Ge 3 16.6667 1.1547 6.9282% 16.0 18.0 2.0 1.22474 Te 3 24.6667 1.1547 4.68122% 24.0 26.0 2.0 1.22474 18. Total 54 14.2222 3.30047 23.2064% 8.0 26.0 4.62781 0 ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do Source Sum of D f Mean F-Ratio P-Value
Squares Square Between groups 546.0 7 78.0 114.51 0.0000 Within groups 31.3333 46 0.681159 Total (Corr.) 577.333 53 Table of Means for vong khang by nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error nong do Count Mean (pooled s) Lower Upper limit limit 100 9 11.5556 0.275108 11.164 11.9471 1600 9 15.5556 0.275108 15.164 15.9471 200 9 12.6667 0.275108 12.2751 13.0582 400 9 13.8889 0.275108 13.4973 14.2805 800 9 15.0 0.275108 14.6084 15.3916 Ampicillin 3 8.66667 0.476501 7.98845 9.34489 Gentamycin 3 16.6667 0.476501 15.9884 17.3449 Tetracycline 3 24.6667 0.476501 23.9884 25.3449 Total 54 14.2222 Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups Ampicillin 3 8.66667 X 100 9 11.5556 X 200 9 12.6667 X 400 9 13.8889 X 800 9 15.0 X 1600 9 15.5556 X Gentamycin 3 16.6667 X
Tetracycline 3 24.6667 X Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng 3 loại thuốc kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline) Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) khuẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1600 mg/ml 18 18 17 17 19 18 18 18 18 800 mg/ml 15 15 15 14 14 15 16 16 15 400 mg/ml 13 12 13 12 12 12 12 12 12 200 mg/ml 11 11 11 11 11 10 10 11 10 100 mg/ml 9 9 9 9 9 9 7 9 9 Gentamycin 21 21 21 Amipicillin 0 0 0 Tetracycline 0 0 0 Phụ lục G. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Staphylcoccus aureus. Summary Statistics for duong kinh vong khang Coun Averag Standard Coeff. of Minim Maxi Ran Stnd. nong do t e deviation variation um mum ge skewness 100 9 11.5556 0.726483 6.28687% 10.0 12.0 2.0 -1.83796 1600 9 16.7778 0.666667 3.97351% 16.0 18.0 2.0 0.311654 200 9 13.3333 0.5 3.75% 13.0 14.0 1.0 1.04978 400 9 14.1111 0.333333 2.3622% 14.0 15.0 1.0 3.67423 800 9 15.8889 0.600925 3.78205% 15.0 17.0 2.0 -0.0223967 Am 3 9.66667 0.57735 5.97259% 9.0 10.0 1.0 -1.22474 Ge 3 18.6667 1.1547 6.1859% 18.0 20.0 2.0 1.22474 Te 3 22.3333 0.57735 2.58515% 22.0 23.0 1.0 1.22474 14. Total 54 14.7593 2.99645 20.3021% 9.0 23.0 1.89083 0 ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do
Sum of Mean Source F-Ratio P-Value Squares D f Square Between 458.315 7 65.4735 171.56 0.0000 groups Within groups 17.5556 46 0.381643 Total (Corr.) 475.87 53 Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups Ampicillin 3 9.66667 X 100 9 11.5556 X 200 9 13.3333 X 400 9 14.1111 X 800 9 15.8889 X 1600 9 16.7778 X Gentamycin 3 18.6667 X Tetracycline 3 22.3333 X Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng và 3 loại thuốc kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline). Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) khuẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1600 mg/ml 16 17 17 18 16 16 17 17 17 800 mg/ml 15 16 16 16 15 16 16 16 17 400 mg/ml 14 14 15 14 14 14 14 14 14 200 mg/ml 14 14 14 13 13 13 13 13 13 100 mg/ml 11 12 11 12 12 10 12 12 12 Gentamycin 20 18 18 Amipicillin 9 10 10 Tetracycline 22 22 23
Phụ lục H. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng khuẩn trên Salmonella Typhi. Summary Statistics for duong kinh vong khang nong Cou Standard Coeff. of Minim Maxim Ran Stnd. Average do nt deviation variation um um ge skewness 100 9 9.88889 1.16667 11.7978% 8.0 12.0 4.0 0.327483 1600 9 13.6667 0.707107 5.17395% 13.0 15.0 2.0 0.742307 200 9 10.5556 1.424 13.4905% 8.0 13.0 5.0 0.028613 400 9 11.8889 1.2693 10.6763% 10.0 13.0 3.0 -0.836565 800 9 13.3333 0.866025 6.49519% 12.0 15.0 3.0 0.808122 Am 3 19.0 0.0 0.0% 19.0 19.0 0.0 Ge 3 14.6667 0.57735 3.93648% 14.0 15.0 1.0 -1.22474 Te 3 19.0 1.0 5.26316% 18.0 20.0 2.0 0.0 12. Total 54 12.8148 2.85548 22.2826% 8.0 20.0 2.3389 0 ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do Sum of Mean Source F-Ratio P-Value Squares D f Square Between groups 379.481 7 54.2116 47.35 0.0000 Within groups 52.6667 46 1.14493 Total (Corr.) 432.148 53 Table of Means for vong khang by nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error Lower Upper nong do Count Mean (pooled s) limit limit 100 9 9.88889 0.356671 9.38123 10.3966 1600 9 13.6667 0.356671 13.159 14.1743 200 9 10.5556 0.356671 10.0479 11.0632 400 9 11.8889 0.356671 11.3812 12.3966 800 9 13.3333 0.356671 12.8257 13.841
Ampicillin 3 19.0 0.617772 18.1207 19.8793 Gentamycin 3 14.6667 0.617772 13.7874 15.546 Tetracycline 3 19.0 0.617772 18.1207 19.8793 Total 54 12.8148 Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do Method: 95.0 percent LSD nong do Count Mean Homogeneous Groups 100 9 9.88889 X 200 9 10.5556 X 400 9 11.8889 X 800 9 13.3333 X 1600 9 13.6667 X Gentamycin 3 14.6667 X Ampicillin 3 19.0 X Tetracycline 3 19.0 X Bảng số liệu thô về đường kính kháng khuẩn của cao củ cải trắng và 3 loại thuốc kháng (gentamycin, ampicillin và tetracycline) Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) khuẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1600 mg/ml 14 14 13 13 13 14 14 13 15 800 mg/ml 14 13 14 13 13 13 15 12 13 400 mg/ml 13 13 13 11 10 10 13 12 12 200 mg/ml 11 12 11 10 10 10 8 13 10 100 mg/ml 10 11 10 9 9 10 8 12 10 Gentamycin 15 15 14 Ampicillin 19 19 19 Tetracycline 18 20 19
Phụ lục I. Kết quả ANOVA, LSD về sự khác biệt ở từng nồng độ cao củ cải và số liệu thô đường kính vòng kháng nấm mốc trên A. flavus Summary Statistics for duong kinh vong khang nong Coun Standard Coeff. of Minim Maxim Ran Stnd. Average do t deviation variation um um ge skewness 1600 6 5.83333 0.408248 6.99854% 5.0 6.0 1.0 -2.44949 200 6 11.5 0.83666 7.2753% 11.0 13.0 2.0 1.53672 400 6 8.5 0.83666 9.84306% 7.0 9.0 2.0 -1.53672 800 6 6.83333 0.408248 5.97437% 6.0 7.0 1.0 -2.44949 Ter 3 39.3333 0.57735 1.46784% 39.0 40.0 1.0 1.22474 35. Total 27 11.6296 10.2099 87.7922% 5.0 40.0 5.11384 0 ANOVA Table for duong kinh vong khang by nong do Sum of Mean Source F-Ratio P-Value Squares Df Square Between 2700.96 4 675.241 1591.64 0.0000 groups Within groups 9.33333 22 0.424242 Total (Corr.) 2710.3 26 Table of Means for duong kinh vong khang by nong do with 95.0 percent LSD intervals Stnd. error nong do Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit 1600 6 5.83333 0.265908 5.44339 6.22327 200 6 11.5 0.265908 11.1101 11.8899 400 6 8.5 0.265908 8.11006 8.88994 800 6 6.83333 0.265908 6.44339 7.22327 Ter 3 39.3333 0.376051 38.7819 39.8848 Total 27 11.6296 Multiple Range Tests for duong kinh vong khang by nong do Method: 95.0 percent LSD
nong do Count Mean Homogeneous Groups 1600 6 5.83333 X 800 6 6.83333 X 400 6 8.5 X 200 6 11.5 X Ter 3 39.3333 X Bảng số liệu thô về đường kính kháng nấm mốc của cao củ cải trắng và thuốc kháng terbinafine Dịch kháng Số lần lặp lại đường kính vòng kháng khuẩn (mm) khuẩn 1 2 3 4 5 6 1600 mg/ml 11 11 11 11 12 13 800 mg/ml 8 7 9 9 9 9 400 mg/ml 7 7 7 7 7 7 200 mg/ml 6 6 6 6 6 5 Ter 39 40 39