›

Đồ án Đánh giá chỉ tiêu vi sinh trên gan heo tại địa bàn chợ Bàu Sen quận 5 thành phố Hồ Chí Minh

pdf 59 trang thiennha21 12/04/2022 3160
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá chỉ tiêu vi sinh trên gan heo tại địa bàn chợ Bàu Sen quận 5 thành phố Hồ Chí Minh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_chi_tieu_vi_sinh_tren_gan_heo_tai_dia_ban_cho.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá chỉ tiêu vi sinh trên gan heo tại địa bàn chợ Bàu Sen quận 5 thành phố Hồ Chí Minh

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN GAN HEO TẠI ĐỊA BÀN CHỢ BÀU SEN QUẬN 5 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TH.S PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG NGÂN QUỲNH NHƯ MSSV: 1191111035 Lớp: 11HSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2013
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm là một trong những vấn đề vô cùng quan trọng, không chỉ với sức khoẻ, phát triển nòi giống mà còn liên quan đến đến việc xuất khẩu lƣơng thực, thực phẩm của mỗi địa phƣơng, mỗi quốc gia. Đặc biệt là các nƣớc khu vực châu Á, nơi đang tập trung sự phát triển mạnh mẽ về kinh tế, xã hội. Việt Nam là một nƣớc sản xuất, xuất khẩu lƣơng thực thực phẩm vì vậy việc kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cảng phải đƣợc chú trọng và kiểm tra chặt chẽ. Hiện nay, tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm diễn ra rất phức tạp, chất lƣợng thực phẩm tƣơi sống và đƣợc bày bán chƣa đƣợc kiểm soát và đánh giá đúng mức. Vì thế những ca gây ngộ độc thực phẩm từ nguyên liệu tƣơi sống bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, hay nhiễm hóa chất độc hại trong chăn nuôi hoặc trong quá trình sơ chế và bảo quản. Khả năng gây hại cho sức khỏe con ngƣời khi sử dụng gan heo làm thực phẩm rất cao. Vì gan heo có chứa nhiều vitamin A và sắt trị bệnh thiếu máu đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng. Một số nơi gan heo còn chế biến làm gỏi hoặc ăn sống (ẩm thực Liban, món gan sashimi ). Thực phẩm tƣơi sống không qua chế biến, nấu chín kỹ rất dễ gây tiêu chảy, ngộ độc thực phẩm. Để góp phần đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng nhƣ đƣa ra biện pháp phòng ngừa, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh trên gan heo tại địa bàn chợ Bàu Sen quận 5, thành phố Hồ Chí Minh” làm đề tài tốt nghiệp. Hy vọng đề tài tốt nghiệp này sẽ giúp tôi hiểu rõ, thành thạo hơn các thao tác phân tích vi sinh trong phòng thí nghiệm. Đồng thời góp phần phản ánh hiện trạng vệ sinh an toàn thực phẩm trên gan heo tại địa bàn chợ Bàu Sen hiện nay. 1
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá chỉ tiêu vi sinh trên gan heo đƣợc bán tại địa bàn chợ Bàu Sen ở quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. Thông qua phân tích các chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí, Coliform và E.coli. - Đề ra biện pháp. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân tích và đánh giá dựa trên 3 chỉ tiêu vi sinh - Tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) - Coliform - E.coli 4. Phạm vi nghiên cứu Mẫu đƣợc lấy tại 10 quầy bán gan heo tƣơi sống tại chợ Bàu Sen trên địa bàn quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 5. Kết quả đạt đƣợc của đề tài - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) - Xác định tổng số Coliform - Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli 2
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vệ sinh an toàn thực phẩm 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm hay còn đƣợc gọi tên thông dụng là ngộ độc thức ăn hay trúng thực là các biểu hiện bệnh lý xuất hiện sau khi ăn, uống và cũng là hiện tƣợng ngƣời bị trúng độc, ngộ độc do ăn, uống phải những loại thực phẩm nhiễm khuẩn, nhiễm độc hoặc có chứa chất gây ngộ độc hoặc thức ăn bị biến chất, ôi thiu, có chất bảo quản, phụ gia Nó cũng có thể coi là là bệnh truyền qua thực phẩm, là kết quả của việc ăn thực phẩm bị ô nhiễm. Ngƣời bị ngộ độc thực phẩm thƣờng biểu hiện qua những triệu chứng lâm sàng nhƣ nôn mửa, tiêu chảy, chóng mặt, sốt, đau bụng Ngộ độc thực phẩm không chỉ gây hại cho sức khỏe (có thể dẫn đến tử vong) mà còn khiến tinh thần con ngƣời mệt mỏi. “Nguồn: ” 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Thực phẩm dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, các chất hóa học, độc hại vật lý có thể gây ngộ độc nguy hiểm và ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Có 3 nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm thƣờng gặp, do hóa chất bảo quản thực phẩm (thuốc trừ sâu, hóa chất chống sâu mọt ), do hóa chất dùng trong chế biến thực phẩm (phẩm màu, hàn the ), do tác nhân vật lý và do vi sinh vật.[1] 1.1.2.1. Các tác nhân vật lý Do nhiễm chất phóng xạ, kim loại, các mảnh thủy tinh, vật lạ khác lẫn vào thực phẩm cũng gây hại, tổn thƣơng niêm mạc dạ dày 1.1.2.2. Các tác nhân hóa học Các chất nhiễm trong công nghiệp và môi trƣờng: chất phóng xạ, kim loại nặng (chì, thủy ngân, asen ) Các chất hóa học dùng trong nông nghiệp: thuốc trừ sâu, phân bón hóa học, chất kích thích tăng trƣởng 3
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các chất phụ gia sử dụng không đúng quy định: chất tạo màu, tạo mùi, tạo ngọt, chất bảo quản, chất tẩy rửa Các chất độc hại trong quá trình chế biến: các chất sinh ra do phản ứng hóa học, do quá trình bảo quản không đúng cách khiến vi sinh vật, nấm mốc phát triển hay biến chất gây hƣ hỏng Các chất gây dị ứng trong hải sản. Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm: mầm khoai tây, sắn, măng, nấm độc 1.1.2.3. Các tác nhân sinh học Vi khuẩn: là nguyên nhân hay gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm cấp tính, có nhiều ngƣời mắc và gây ảnh hƣởng không nhỏ tới sức khoẻ. Trong không khí, trên cơ thể ngƣời cũng có hàng trăm loại vi khuẩn cƣ trú ở da, miệng, đƣờng hô hấp, tiêu hóa Thức ăn chín để ở nhiệt độ bình thƣờng là môi trƣờng tốt cho vi khuẩn xâm nhập và phát triển. Sau bữa ăn chỉ cần vài giờ là số lƣợng vi khuẩn có thể sinh sản đến mức gây ngộ độc thực phẩm. Virus: ô nhiễm trong thực phẩm có thể gây viên gan, bại liệt hoặc tiêu chảy. Tiêu chảy do thực phẩm nhiễm virus Rota là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và suy dinh dƣỡng ở trẻ dƣới 5 tuổi. Những thực phẩm có khả năng nhiễm virus: các loài nhuyễn thể nhƣ loài hàu, trai, sò chƣa nấu chín là nguyên nhân chính gây bệnh. Nấm mốc: Nấm mốc phát triển trong thực phẩm có khả năng sinh độc tố vi nấm nguy hiểm và tác động ảnh hƣởng của những độc tố này khác nhau. Chẳng hạn ung thƣ gan do aflatoxin ở các nƣớc miền nhiệt đới, suy thận do ochratoxin ở các nƣớc Bắc Âu độc tố vi nấm có thể tác động trên nhiều tổ chức cơ thể khác nhau. Những thực phẩm có khả năng nhiễm nấm mốc : thƣờng là các thực phẩm từ thực vật nhƣ ngô, đỗ, lạc 4
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ký sinh vật (ký sinh trùng): Đa số các trƣờng hợp bị nhiễm giun sán đều do vệ sinh cá nhân kém, thực phẩm chƣa nấu chín hoặc rau quả ăn sống chƣa rửa sạch. Giun sán có thể sống ở bất cứ cơ quan hoặc mô nào trong cơ thể, nhƣng thƣờng hay gặp nhất là ở ruột. 1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây Thực phẩm cung cấp các chất dinh dƣỡng nhƣ chất đạm, đƣờng, béo, các vitamin và muối khoáng, đảm bảo sức khoẻ của con ngƣời, đồng thời cũng có thể là nguồn gây bệnh, thậm chí còn dẫn đến tử vong. Không một thức ăn nào đƣợc coi là có giá trị dinh dƣỡng nếu nhƣ nó không bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm. Thực phẩm an toàn sẽ cải thiện đƣợc sức khoẻ của con ngƣời và cung cấp một nền tảng hiệu quả cho sự phát triển và xoá đói giảm nghèo. Mọi ngƣời ngày càng quan tâm đến các nguy cơ sức khoẻ do vi khuẩn gây bệnh và các hoá chất nguy cơ tiềm ẩn trong thực phẩm. Hàng tỷ ngƣời đã bị mắc bệnh và nhiều ngƣời đã chết do ăn phải các thực phẩm không an toàn. Hơn 1/3 dân số của các nƣớc phát triển bị ảnh hƣởng bởi các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm và vấn đề này càng trầm trọng hơn đối với các nƣớc đang phát triển (trong đó có Việt Nam). Bảng 1.1 : Ngộ độc thực phẩm ở một số nƣớc “Nguồn : Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm” Đối tƣợng Ngộ độc thực phẩm Chi phí - 5 % dân số/ năm (>10 triệu ngƣời) Mỹ - 175 ca / 1000 dân 1531USD/ca - Mỗi năm chết 5000 ngƣời Anh 190ca / 1000 dân 789 bảng Anh/ca Úc 4.2 triệu ca / năm 1679 AUS/ca Trung Quốc Chỉ 1/10 số ngộ độc thực phẩm đƣợc thống kê WHO - - Các nƣớc phát triển: 10% bị ngộ độc thực 5
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP phẩm - - Các nƣớc kém phát triển: cao hơn nhiều - - Các nƣớc có quy định báo cáo: chỉ đạt 1% số bị ngộ độc thực phẩm Bảng 1.2 : Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam năm 2007- 2012 “Nguồn: Số liệu thống kê tại cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm” Năm Số vụ Số mắc Số chết 2007 247 7329 55 2008 205 7829 62 2009 152 5212 35 2010 175 5664 51 2011 148 4700 27 2012 168 5541 34 Cộng 1095 36275 264 Ngộ độc thực phẩm là không thể tránh khỏi nếu chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm không đảm bảo, thiếu sự quan tâm đúng mức của mỗi ngƣời dân, mỗi gia đình và mỗi quốc gia. Mọi thực phẩm đều có nguy cơ tiểm ẩn bị vi khuẩn xâm nhập. Do vậy, bảo vệ và giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm của mỗi quốc gia. Ngày nay, việc áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản xuất trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm, các chất hoá học ngày càng đƣợc tham gia nhiều vào quy trình sản xuất, chế biến, phân phối vào bảo quản thực phẩm. Điều đó dễ dàng tạo ra nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Chính vì vậy, khi xã hội ngày càng phát triển, công tác đảm bảo vệ sinh môi trƣờng, an toàn thực phẩm càng phải đƣợc coi trọng. 1.2. Một số vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm phổ biến 1.2.1. Vi sinh vật hiếu khí 6
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trƣởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu phản ánh mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm, độ tƣơi mới hay nguy cơ hƣ hỏng của thực phẩm. Chỉ tiêu này chỉ thị chất lƣợng vệ sinh của thực phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng số vi sinh vật hiếu khí có tác dụng đánh giá chất lƣợng vệ sinh trong quá trình sản xuất, vận chuyển và bảo quản các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nhƣ thực phẩm khô hay thực phẩm đông lạnh. Với các thực phẩm tƣơi sống, tổng vi sinh vật hiếu khí còn đƣợc dùng làm tiêu chuẩn hƣớng dẫn thời gian bảo quản. Các loại thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí vẫn có thể nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác. Do đó, chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí đƣợc sử dụng để đánh giá chất lƣợng vệ sinh hơn là độ an toàn thực phẩm. Chỉ số này đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng và thể hiện dƣới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong một đơn vị khối lƣợng hay thể tích thực phẩm. Chỉ tiêu này có nhiều cách gọi khác nhau nhƣ: tổng số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count – APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count – TPC), tổng số vi khuẩn sống (Total Viable Count – TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count – SPC).[11] 1.2.2. Coliform Coliforms đƣợc xem là những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lƣợng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lƣợng Coliforms trong thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lƣợng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang đƣợc tranh cãi về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không đƣợc sự thống nhất trong các hội đồng khoa học. 1.2.2.1. Đặc điểm 7
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Coliforms là nhóm những trực khuẩn đƣờng ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong vòng 24 – 48 giờ. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi đƣợc ủ ở 44oC trong môi trƣờng canh EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi đƣợc ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột ở ngƣời và các động vật máu nóng khác và đƣợc sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nƣớc uống cũng nhƣ để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trƣờng. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliforms phân đƣợc quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là E.coli là loài đƣợc quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia ( với một loài duy nhất là E.coli), Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E.aerobacter và E.cloacae).[3] 1.2.2.2. Đặc tính sinh hóa Bảng 1.3 : Biểu hiện sinh hoá các giống của Coliforms trong thử nghiệm IMViC. Phản ứng Indol Methyl red VogesProskauer Citrate Escherichia +(-) + - - Citrobacter -(+) + - + -(+) - + + Klebsiella Enterobacter -(+) - + + Ghi chú: + phản ứng dƣơng tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dƣơng tính và -(+): đa số là phản ứng âm tính.[3] 1.2.3. Escherichia coli 8
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Escherichia coli còn có tên là Bacteriam coli Commue đƣợc ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trƣờng hợp tiêu chảy ở trẻ em.[6] Hình 1.1: Escherichia coli 1.2.3.1. Phân loại khoa học Giới: Vi khuẩn (Bacteria) Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Escherichia Loài: Escherichia coli 1.2.3.2. Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thƣớc dài hay ngắn tuỳ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy trung bình 2 – 3µm x 0,5µm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lƣỡng cực hai đầu. 1.2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh hóa 9
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trƣờng dinh dƣỡng thông thƣờng chịu đƣợc nhiệt độ biến thiên từ 4 – 45oC. Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tạo khuẩn lạc tròn ƣớt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. Trên thạch gelatin không tan chảy. Môi trƣờng canh dinh dƣỡng: làm đục đều môi trƣờng, sau lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối. Môi trƣòng Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn lạc tím ánh kim. Môi trƣờng MacConkey (MCK) tạo khóm đỏ hồng. Môi trƣờng Kligler iron agar (KIA) lên men đƣờng glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S. Môi trƣờng Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ. E. coli lên men sinh hơi đƣờng glucose, manitol, lactose, galactose nhƣng không sinh hơi đƣờng maltose, arabinose. E.coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite. Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đƣờng ruột khác, ngƣời ta thƣờng sử dụng thử nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là (+)( +)( -)( -). 1.2.3.4. Sức đề kháng E. coli bị diệt ở 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 15 - 30 phút. Các chất sát trùng nhƣ acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E. coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. 10
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.3.5. Kháng nguyên Vi khuẩn đƣờng ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính chất kháng nguyên, ngƣời ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau. Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi formol 5%. Kháng nguyên O đƣợc chia làm 4 nhóm chính: OI, OII, OIII, OIV, với trên 150 loại khác nhau, nó bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ. Kháng nguyên K (capsule antigen) có bản chất là polysaccharid hay protein, chịu nhiệt kém (dễ bị phá huỷ ở 100oC trong 1 giờ). Kháng nguyên K giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay đƣờng tiết niệu. Kháng nguyên H (flagellar antigen) có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H. Kháng nguyên F (fimbrial antigen) giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột, rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, ngƣời ta có thể định danh vi khuẩn. 1.2.3.6. Độc tố E. coli sinh ra các độc tố sau: Nội độc tố (lipo polysaccharide) có sẵn trong tế bào, chỉ giải phóng ra bên ngoài khi tế bào vi sinh vật bị phá hủy. Chỉ có ở vi khuẩn gram âm. Nội độc tố của E.coli gồm 2 loại: Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, chia làm 2 phần LTa và LTb, mang tính kháng nguyên. LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng 11
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP lƣợng AMP vòng do đó kích thích bài tiết CT và Bicarbonate, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nƣớc. Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên. ST hoạt hoá fuanylcylase làm tăng GMP vòng dẫn đến kích thích bài tiết nƣớc muối gây tiêu chảy. Ngoại độc tố do vi khuẩn sản xuất, tiết ra bên ngoài tế bào. Ngoại độc tố của E.coli có trọng lƣợng phân tử 70 KDa, mang tính kháng nguyên. 1.2.3.7. Các dòng E.coli gây hại Theo P. J. Quinn và cs(1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nƣớc, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho ngƣời và động vật, giúp ổn định sinh lý đƣờng ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện đƣợc 5 dòng có khả năng gây hại cho ngƣời và động vật: EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột. EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E. coli) gây bệnh đƣờng ruột, gây tiêu chảy do có kháng nguyên mạnh và độc tố ruột. ETEC (Enterotoxigenic E. coli) do có độc tố ruột enterotoxin gây tiêu chảy. EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. Vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng làm tiêu hủy các hạt vùi trong không bào và nhân lên trong tế bào. Làm cho niêm mạc đai tràng bị viêm, gây nên tổn thƣơng nhƣ loét niêm mạc, gây tiêu chảy lẫn máu, đàm. 1.2.3.8. Khả năng gây bệnh Chúng tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), các dòng vi khuẩn này có một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy không có máu hoặc có máu và các hội chứng khác ở ngƣời. 12
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh đƣờng ruột của vi khuẩn E. coli cũng có một số điểm giống vi khuẩn Salmonella và họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterobacteriaceae). Để gây bệnh trƣớc hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá huỷ các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sản sinh độc tố đƣờng ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt (ST) làm tăng tính thẩm xuất của tế bào thành ruột và phá huỷ tế bào, yếu tố không chịu nhiệt (LT) sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc làm rối loạn chu trình này. Nƣớc từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nƣớc và thức ăn gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng chống lại hiện tƣợng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá huỷ tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh ra độc tố toxogenic và verotoxin phá huỷ tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết. 1.2.3.9. Triệu chứng E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến nhất, đặc biệt là ở trẻ em. Chủ yếu là qua đƣờng tiêu hoá do sử dụng nguồn nƣớc và ăn phải thức ăn bị ô nhiễm có chứa lƣợng lớn vi khuẩn E. coli. Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli thì trong vòng 4 – 48 giờ sẽ có các triệu chứng nhƣ đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 – 15 lần/ngày có lẫn máu trong phân, đôi khi có buồn nôn. Nếu không đƣợc cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nƣớc, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong. 1.2.4. Salmonella spp. Salmonella lần đầu tiên phát hiện cách đây khoảng 100 năm từ một ngƣời bị chết khi ăn phải thịt bò bị nhiễm khuẩn. 13
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Salmonella hiện diện tự nhiên trong ruột, trong phân của các loài động vật nhƣ heo, bò, gia cầm [8] Hình 1.2: Salmonella. 1.2.4.1. Phân loại khoa học Giới: Vi khuẩn (Bacteria) Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Giống: Salmonella Loài: Salmonella.pp 1.2.4.2. Đặc điểm hình thái Là trực khuẩn gram âm hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, có tiên mao (trừ S. gallinarum và S.pullorum). Kích thƣớc tế bào: 0,7 ÷ 1.5 x 2-5 m. 1.2.4.3. Đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh hóa Là loại kị khí tùy nghi. Phát triển tốt ở nhiệt độ 35 ÷ 37oC, pH thích hợp ở 7.6, nhƣng có thể phát triển đƣợc ở (pH= 6 ÷ 9). Nếu pH 9 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt. 14
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Salamonella phát triển mạnh trong môi trƣờng Mac Conkey, EMB và tạo ra hai loại khuẩn lạc: - Khuẩn lạc S: nhẵn tròn, hơi lồi, bóng. - Khuẩn lạc R: gồ ghề, không đều, mặt dẹp, khô. Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng NA tạo khóm trắng ƣớt hơi lồi. Trên NB tạo cặn đục đều, để lâu cặn bị lắng xuống. Trên thạch máu không gây dung huyết. Trên thạch gelatin không gây tan chảy. Trong môi trƣờng chẩn đoán chuyên biệt: BSA tạo khóm đen, Brilliant Green Agar (BGA) tạo khóm có vòng đỏ, HE tạo khóm xanh có tâm đen, XLD tạo khóm hồng có tâm đen. Trong môi trƣờng đƣờng: lên men sinh hơi glucose, mannol, sorbitol, arabinose. Lên men không đều saccharose, không lên men lactose, salicin, arabinose. Không có khả năng phát triển ở nồng độ muối cao. Chúng sử dụng axit amin nhƣ một nguồn nitơ. Các phản ứng sinh hóa: Indol (-), Methylred (+), citrate (+), H2S (+), Urê (-), [8] LDC(+), chuyển hóa NO3 thành NO2. 1.2.4.4. Kháng nguyên Có 3 loại kháng nguyên O, H, Vi Kháng nguyên O có 65 yếu tố khác nhau đƣợc chia làm 34 nhóm A, B, C, C1 Kháng nguyên H gồm 60 loại đƣợc chia làm 2 pha. Pha đặc biệt đƣợc kí hiệu a,b,c,g,m và pha không đặc biệt đƣợc kí hiệu 1,2,3 Kháng nguyên Vi chỉ có ở 1 số chủng nhƣ Salmonella typhi và Salmonella paratyphi. 1.2.4.5. Độc tố Có 2 loại độc tố ruột và thần kinh. 15
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Độc tố ruột gồm nội độc tố và ngoại độc tố. Ngoài tác dụng gây tiêu chảy, độc tố ruột còn gây viêm loét xuất huyết và thủng ruột, do vậy tiêu chảy do Salmonella gây ra có hiện tƣợng phân lẫn máu. Ngoại độc tố thần kinh: độc tố tác động lên thần kinh gây choáng, gây sốc và run rẩy, đi lại khó khăn. 1.2.4.6. Khả năng gây bệnh Salmonella spp. theo thức ăn xâm nhập vào cơ thể qua đƣờng miệng. Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động xuống ruột non và sinh sản ở đó, một số khác đi vào hệ bạch huyết và tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết. Nhƣng vì Salmonella spp. là vi khuẩn ƣa môi trƣờng ruột nên nhanh chóng trở về ruột. Sau đó, Salmonella spp. chui qua màng nhầy và vào thành ruột. Nội độc tố sẽ đƣợc thoát ra khi vi khuẩn bị phân hủy trong máu cũng nhƣ trong ruột, gây nhiễm độc cấp bằng hội chứng rối loạn tiêu hóa khá nặng, nhƣng chỉ sau 1-2 ngày bệnh nhân nhanh chóng trở lại bình thƣờng không để lại di chứng, vì các tế bào niêm mạc ruột tiết ra một loại peptide có tính chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh. Nhƣng ở ngƣời già yếu và trẻ nhỏ có thể bị rối loạn tiêu hóa nặng hơn, đôi khi bị tử vong. 1.2.4.7. Triệu chứng Các triệu chứng do Salmonella gây ra thƣờng là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng biểu hiện thƣờng sau 12-36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng thƣờng kéo dài ít nhất 2-7 ngày. Không phải tất cả mọi ngƣời khi tiêu thụ thực phẩm đều bị nhiễm Salmonella đều có biểu hiện bệnh, ngƣợc lại một số ngƣời không có triệu chứng lâm sang khi tiêu thụ phải thực phẩm nhiễm vi sinh vật này khi đó chúng đƣợc bài tiết ra bên ngoài. Salmonella gây nên bệnh sốt thƣơng hàn thuộc các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C, các dòng này thƣờng không gây bệnh cho các loài động vật. 1.2.5. Staphylococcus aureus 16
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện năm 1878 phân lập từ mủ ung nhọt và đến năm 1884 đƣợc Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ.[9] Hình 1.3: Staphylococcus aureus 1.2.5.1. Phân loại khoa học Giới: Vi khuẩn (Bacteria) Ngành: Fimicutes Lớp: Bacili Bộ: Baciliales Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphyloccus aureus 1.2.5.2. Đặc điểm hình thái Là vi khuẩn dạng hình cầu, bắt màu gram dƣơng. Kích thƣớc cỡ 0.8 – 1.2 m. Không di động, không sinh bào tử, có hay không có giáp mô. 1.2.5.3. Đặc điểm nuôi cấy và đặc tính sinh hóa Là loại hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp 30-37oC, pH thích hợp 7-7.5. 17
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trên môi trƣờng thạch NA hay TSA tạo khóm vàng đến vàng đậm do có sắc tố vàng. Trên thạch máu gây dung huyết. Trên thạch Chapman hay MSA tạo khóm vàng. Trên thạch BP tạo khóm đen, xung quanh khóm có vòng sáng. Trong môi trƣờng canh dinh dƣỡng: tạo cặn đục đều, có mùi mủ. Trên môi trƣờng đƣờng: lên men sinh hơi glucose, mannit, lactose. Không lên men glyxerin, ducitol, inulin. Các phản ứng sinh hóa: Catalase (+), Coagulase (+), Phosphatase (+), - - [9] Dezoxynuclease(+), H2S (-), MR (+), VP (+), khử NO3 thành NO2 . 1.2.5.4. Kháng nguyên Kháng nguyên O bao gồm peptidoglucan, protid A, acid teichoic và một số enzyme gây độc. Các enzyme gây độc bao gồm: catalse, coagulase, hemolynase, ctaphylokinase làm tan tơ huyết. 1.2.5.5. Độc tố Nội độc tố (endotoxin) nhƣ leukocidine diệt bạch cầu, exfoliatine tạo mụn nƣớc trên da Các ngoại độc tố (exotoxin) nhƣ anpha-toxin (hemolysine) và beta-toxin gây độc cho nhiều loại tế bào và làm tan hồng cầu. Ngoại độc tố ruột enterotoxin gây trúng độc thực phẩm. Enterotoxin là độc tố ruột, có khoảng 50% các chủng Staphyloccus aureus có ngoại độc tố ruột thƣờng bền với nhiệt, độc tố ruột bị phá hủy ở nhiệt độ 100oC. 1.2.5.6. Khả năng gây bệnh Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có lien quan đến cấu tạo của vách vi khuẩn. Một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tƣợng thực bào. 18
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hầu hết các chủng tụ cầu vàng đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt (protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiện tƣợng gắn độc đáo này mà số lƣợng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tƣợng opsonin hóa: chúng là các receptor cho các đại thực bào. Quá trình gắn trên giúp tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi đại thực bào. Ngoài ra, phần lớn các chủng tụ cầu đều có khả năng sản xuất một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này, vi khuẩn tạo đƣợc một lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy niêm mạc. Ngoài enzyme coagulase làm tan tơ huyết, tụ cầu còn sản xuất một số enzyme quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ của chủng vi khuẩn này nhƣ hyaluronidase, enzyme này có khả năng phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có thể phát tán. Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất đƣợc enzyme penicillinase (beta-lactamse). Enzyme này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ bản của kháng sinh nhƣ penicillin G, ampicillin và ureidopenicillin, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. 19
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.5.7. Triệu chứng S.aureus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đƣờng tiếp xúc với ngƣời chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. Khi vi sinh vật này xâm nhiễm vào trong thực phẩm, chúng tiết độc tố vào trong sản phẩm và gây độc. Khi con ngƣời tiêu thụ loại thực phẩm có độc tố này, sau 4-6h ủ bệnh sẽ bộc phát các triệu chứng lâm sang nhƣ tiêu chảy, nôn mữa, các triệu chứng sẽ kéo dài 6-8h. Các thực phẩm có hàm lƣợng muối cao (jambon, kem tổng hợp ) có nguy cơ cao nhiễm vi sinh vật này vì ít khi đƣợc xử lý với nhiệt độ cao hơn 40oC. 1.3. Tổng quan về gan heo 1.3.4. Thành phần, giá trị dinh dưỡng của gan heo Gan là bộ phận quan trọng nhất trong chuyển hoá vật chất của hoạt động sống. Toàn bộ lƣợng chất dinh dƣỡng do cơ thể hấp thu đƣợc qua hệ thống tiêu hoá đều thấm qua máu và đi đến gan. Gan rất giàu vitamin. Gan heo chứa nhiều vitamin A và các vitamin nhóm B, PP, acid pantolenic, biotin và các vitamin tan trong dầu nhƣ vitamin A, E, D. Trong gan có chứa nhiều enzym nhƣ protease, lipase, arginase, nuclease, amilase, catalase Hình 1.4: Vị trí gan trên cơ thể heo con. 20
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 1.4: Thành phần giá trị dinh dƣỡng của gan heo. Thành phần Giá trị % Nƣớc 71.4 Tro 1.5 Chất béo 3.6 Chất hòa tan 4.7 Protein 18.8 Bảng 1.5: Thành phần acid amin có trong gan heo. Hàm lƣợng % Hàm lƣợng % Acid amin Acid amin theo protid theo protid Arginine 6.0 Cystine 1.3 Histidine 2.8 Threonine 4.4 Glycine 7.3 Tryptophan 1.6 Leucine 8.4 Phenylanine 5.4 Isoleucine 5.4 Tyrosine 4.6 Valine 6.5 Serine 7.3 Methionine 2.2 Acid aspartic 6.9 1.3.2. Chỉ tiêu cảm quan Bảng 1.6: Chỉ tiêu cảm quan gan heo tƣơi và gan heo bị bệnh. Chỉ tiêu Gan heo tƣơi Gan heo bị bệnh cảm quan Dùng tay sờ vào thấy gan mềm, mịn, láng. Gan bị sần sùi, có Cảm quan Khi dùng ngón tay ấn vào mặt gan thì thấy những chấm lạ hoặc bị bên ngoài gan lõm xuống và giữ nguyên vết lõm khi lở. rút tay ra. 21
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có màu sẫm đen hoặc Màu sắc Có màu đỏ sẫm hoặc màu tím nhạt. tái khi để lâu, đông lạnh qua nhiều ngày. Mùi Không có mùi lạ. Có mùi tanh, ôi. Hình 1.5: (a) Gan heo tƣơi. (b) Gan heo bị bệnh. (c) Gan heo đông lạnh. CHƢƠNG 2 22
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm 2.1.1. Thời gian 2.1.1.1. Thời gian thực hiện đề tài Thực hiện trên phòng thí nghiệm: Ngày 17 tháng 06 đến ngày 16 tháng 08 năm 2013. Thời gian viết bài: Ngày 16 tháng 08 đến ngày 16 tháng 09 năm 2013. 2.1.1.2. Thời gian lấy mẫu Độ lặp lại là 3 lần. Quầy số 1 đến quầy số 5 đƣợc thu mẫu lần 1 ngày 18 tháng 06 năm 2013. lần 2 ngày 25 tháng 06 năm 2013. lần 3 ngày 23 tháng 07 năm 2013. Quầy số 6 đến quầy số 10 đƣợc thu mẫu lần 1 ngày 30 tháng 07 năm 2013. lần 2 ngày 06 tháng 08 năm 2013. lần 3 ngày 13 tháng 08 năm 2013. 2.1.2. Địa điểm 2.1.2.1. Địa điểm thực hiện đề tài Thực hiện phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng, Trƣờng Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ, Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2.2. Địa điểm lấy mẫu Mẫu đƣợc lấy tại 10 quầy bán gan heo tƣơi tại chợ Bàu Sen. Địa chỉ 381/28 đƣờng An Dƣơng Vƣơng, Phƣờng 3, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh hoặc 138/26 đƣờng Nguyễn Trãi, Phƣờng 3, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 23
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHỢ BÀU SEN HEO – GAN BÒ QU HEO – GAN Ầ Ký hiệu: Q10 Y RAU HEO – GAN Ký hiệu: Q1 QU – Ầ Ký hiệu: Q9 C BÒ Y TH Ủ - PHÁ LẤU QU HEO – GAN Ị Ả SÚC T GIA Ký hiệu: Q2 THỊ T QUAY HEO – GAN QU HEO – GAN Ký hiệu: Q3 Ầ – Y CÁ Y CÁ Ký hiệu: Q8 GIA C GIA GÀ – VỊT – HEO – GAN BÒ TH Ầ M Ủ Ký hiệu: Q7 BÒ Y H Y LÒNG HEO Ả HEO – GAN I S Ả Ký hiệu: Q4 N HEO – GAN HEO Ký hiệu: Q6 T Ạ LÒNG HEO P HÓA GÀ – VỊT HUY ẾT – HEO HEO – GAN GÀ TIẾT CANH Ký hiệu: Q5 THỨC ĂN SÁNG CHỢ BÀU SEN Hình 2.1: Sơ đồ thu mẫu chợ Bàu Sen quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 24
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.2. Vật liệu 2.2.1. Mẫu Loại mẫu: Gan heo tƣơi. Mẫu đƣợc lấy vào buổi sang từ 6 – 8 giờ. 2.2.2. Hóa chất, môi trường Saline Pepton Water (SPW) (HiMedia - Ấn Độ) Plate Count Agar pH 7.0 ± 0.2 (PCA) (HiMedia - Ấn Độ) Tryptone Soya Agar (TSA) (HiMedia - Ấn Độ) Violet Red Bile Agar (VRB) (HiMedia - Ấn Độ) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) (HiMedia - Ấn Độ) Eosin Methyl Blue (EMB) (HiMedia - Ấn Độ) Canh tryptone (HiMedia - Ấn Độ) Canh Methyl red Voges Proskauer (MR-VP) (HiMedia - Ấn Độ) Thạch Simmon Citrate (HiMedia - Ấn Độ) Thuốc thử Kovac’s (Merck – Đức) Thuốc thử Methyl red (HiMedia - Ấn Độ) Thuốc thử 1 α-naphtol 5% (HiMedia - Ấn Độ) KOH 40% NaCl Cồn 70o Cồn 96o Nƣớc cất. 2.2.3. Dụng cụ Ống nghiệm có nắp Đĩa petri vô trùng Pipette 5ml, 10ml Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 600ml 25
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ống đong 100ml Bình thủy tinh chứa môi trƣờng 500ml, 1000ml 1 hộp ống Durham Đèn cồn Đũa khuấy Kéo y tế Túi nylon vô khuẩn Cân điện tử Que cấy vòng Que cấy thẳng Khăn giấy Bông không thấm nƣớc Bông y tế. 2.2.4. Thiết bị Autoclave Bếp từ, bếp đun Tủ ấm 30oC, 37oC, 44oC Tủ cấy Bể ổn nhiệt. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu 2.3.1.1. Thu mẫu Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phƣơng pháp lấy mẫu. Mẫu đƣợc mang về phòng thí nghiệm để phân tích ngay. Mẫu sau khi lấy cho vào túi nylon sạch, vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Các mẫu thực phẩm sau khi lấy phải đảm bảo không nhiễm vào nhau. 26
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.2: Mẫu gan heo 2.3.1.2. Cân mẫu Dụng cụ lấy mẫu (kéo, muỗng) phải đƣợc khử trùng. Bao đựng mẫu phân tích sử dụng bao vô khuẩn. Nơi cân mẫu cần đảm bảo vô trùng. Lƣợng mẫu cần cân: 10g 2.3.1.3. Đồng nhất mẫu Đồng nhất mẫu phân tích trong điều kiện vô trùng. Sự phân phối của vi sinh vật không đồng đều nhau, để đảm bảo tính đồng nhất trong mẫu nên cắt mẫu hay nghiền mẫu bằng thiết bị chuyên dùng. 2.3.1.4. Pha loãng mẫu Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu phân tích cần đƣợc pha loãng liên tiếp và đƣợc xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào môi trƣờng thích hợp. Kỹ thuật pha loãng thƣờng qua các bƣớc sau: Dung dịch pha loãng mẫu SPW: sử dụng 90ml / mẫu => 5 mẫu tƣơng ứng 450 ml SPW Mẫu đƣợc cân 10g cho vào túi vô khuẩn, thêm vào túi 90ml dung dịch pha loãng mẫu SPW ta đƣợc độ pha loãng 10-1. Để pha loãng cho mẫu đếm tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC). Sử dụng nồng độ 10-2, 10-3, 10-4. 27
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hút 1ml mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nƣớc muối, lắc đều ta có dung dịch mẫu ở nồng độ 10-2. Tƣơng tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch nƣớc muối, lắc đều ta có dung dịch mẫu ở nồng độ 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng nhƣ mong muốn. Hình 2.3: Phƣơng pháp pha loãng 2.3.2. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) bằng phương pháp đổ đĩa 2.3.2.1. Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng thực phẩm (khả năng hƣ hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. 2.3.2.2. Nguyên tắc Để xác định số lƣợng vi sinh vật trong một đơn vị khối lƣợng bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc phải trải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trƣờng sau khi ủ đƣợc xem nhƣ chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này đƣợc ủ 30oC trong 3 ngày. Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào 28
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP độ pha loãng cũng nhƣ thể tích cấy để quy về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lƣợng mẫu thực phẩm. 2.3.2.3. Quy trình phân tích Cân 10g mẫu và 90ml môi trƣờng SPW, đồng nhất 30 giây. Ta đƣợc độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nƣớc muối sinh lý để đƣợc độ pha loãng 10-2, 10-3 , 10-4 Hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã khử trùng, đổ khoảng 15ml môi trƣờng PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Lật ngƣợc đĩa, ủ ở 30oC trong 72 giờ Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 – 250 để đếm Tính toán kết quả Hình 2.3: Phƣơng pháp đổ đĩa định lƣợng tổng vi sinh vật hiếu khí. 2.3.2.4. Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu 29
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dùng kéo đƣợc khử trùng cắt 10g mẫu cho vào bao vô khuẩn. Thêm 90ml môi trƣờng SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây. Dịch đƣợc đồng nhất xong tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nƣớc muối sinh lý đã hấp khử trùng, lắc đều. Ta đƣợc 10-2. Tƣơng tự cho độ pha loãng 10-3 , 10-4. Cấy mẫu Dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đổ khoảng 15ml môi trƣờng PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều. Thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Chờ môi trƣờng đặc lại, lật ngƣợc đĩa ủ trong tủ ấm 30oC. Sau 72 giờ chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 khuẩn lạc để đếm. Hình 2.4: Một số thao tác trong kỹ thuật đỗ đĩa. Ghi kết quả Chọn những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 đến 250 và đếm. Công thức tính kết quả: 30
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP N A (cfu / g) n1 V1 f1 ni Vi f i Trong đó: A: Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu. (CFU/g). N: Tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn. ni: Số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. V: Thể tích dung dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: Độ pha loãng tƣơng ứng. 2.3.3. Định lượng tổng số Coliform bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.3.3.1. Ý nghĩa Coliforms đƣợc xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lƣợng của chúng hiện diện trong nƣớc, thực phẩm đƣợc dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. 2.3.3.2. Nguyên tắc Cấy một lƣợng mẫu xác định trên môi trƣờng thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 37oC sau 24-48 giờ. Ngoài lactose môi trƣờng chọn lọc cho coliform còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dƣơng. Trên môi trƣờng này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đƣờng kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định đƣợc thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng canh chọn lọc nhƣ BGBL. Do tế bào bị tổn thƣơng hay giảm sức sống do quá trình đồng nhất mẫu vì vậy phải cấy mẫu vào môi trƣờng tăng sinh không chọn lọc TSA, trƣớc khi bổ sung môi trƣờng chọn lọc. 31
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3.3. Quy trình phân tích Cân 10g mẫu và 90ml môi trƣờng SPW, đồng nhất 30 giây. Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Đổ khoảng 5ml môi trƣờng TSA sau khi đƣợc hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC, lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng 30 – 60 phút. Đổ khoảng 10 - 15 ml môi trƣờng VRB đã đun tan và làm nguội đến 45oC. Lật ngƣợc đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến màu đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đƣờng kính >5mm. Chọn 3 – 5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL. Ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ. Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. 32
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.5: Phƣơng pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliform. Hình 2.6: Nuôi cấy khẳng định Coliform. 33
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.3.4. Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu Dùng kéo đƣợc khử trùng cắt 10g mẫu cho vào bao vô khuẩn. Thêm 90ml môi trƣờng SPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây. Đổ đĩa Dùng pipetman hút 1ml cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đổ khoảng 5ml môi trƣờng TSA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc tròn đĩa petri theo chiều xuôi và chiều ngƣợc kim đồng hồ để trộn đều mẫu với môi trƣờng và để ở nhiệt độ phòng 30 đến 60 phút. Giai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thƣơng hay bị suy yếu trong quá trình đồng nhất mẫu. Sau đó, đổ 10 – 15ml môi trƣờng VRB (môi trƣờng dùng nƣớc cất hấp khử trùng, sau đó cân hóa chất trong điều kiện vô trùng. Đun tan dung dịch VRB) để nguội 45oC. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn Coliform. Chờ môi trƣờng đặc lại, lật ngƣợc đĩa ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả Chọn các đĩa có 10 đến 100 khuẩn lạc Coliform để tính. Khuẩn lạc đặc trƣng có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đƣờng kính >0.5mm. Khẳng định Chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng cấy vào 5 ống môi trƣờng BGBL, có ống Durham, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Phản ứng dƣơng tính (+) khi vi sinh vật sinh khí trong ống durham và làm đục môi trƣờng. Tỷ lệ khẳng định là số khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính với số khuẩn lạc đem thử nghiệm. Ghi kết quả Đếm số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa và số ống sinh hơi. Công thức tính tổng số Coliform N C R (cfu/g) nVf 34
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đặc trƣng trên tổng số đĩa chọn đếm. n: số đĩa có số khuẩn lạc đƣợc chọn tại mỗi độ pha loãng V: thể tích cấy vào mỗi đĩa (ml) f: độ pha loãng có số khuẩn lạc đƣợc chọn tại các đĩa đếm R: Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL / Số khuẩn lạc đã cấy. 2.3.4. Định tính E.coli bằng phương pháp cấy ria và nghiệm pháp IMViC 2.3.4.1. Ý nghĩa Đây là phƣơng pháp định tính để kết luận phát hiện hay không có E.coli trong mẫu xác định. Escherichia coli là chỉ tiêu đánh giá mức độ ô nhiễm, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm. 2.3.4.2. Nguyên tắc Cấy mẫu vào môi trƣờng tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trƣờng EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa (nghiệm pháp IMViC). 2.3.4.3. Quy trình phân tích Hình 2.7: Cấy mẫu, tăng sinh E.coli trong môi trƣờng canh BGBL. 35
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Cân 10g mẫu và 90ml môi trƣờng SPW, đồng nhất 30 giây. Lấy 1ml mẫu trên cho vào 5ml BGBL có ống durham. Ủ ở 44oC trong 24 – 48 giờ. Chọn các ống đục và có sinh hơi cấy sang môi trƣờng EMB. Mẫu không sinh hơi đƣợc xem là âm tính với E.coli. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc tròn lồi, có tâm đen, có ánh kim tuyến, đƣờng kính khoảng 1mm để cấy sang các môi trƣờng canh tryptone, MR-VP, Simmon Citrate để thử nghiệm sinh hóa. Ủ ở 37oC qua đêm. Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-) Một trong những phản ứng trên sai thì kết luận không phải là E.coli. Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện E.coli. Cấy mẫu Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trƣờng tăng sinh BGCL. Ủ 24 giờ ở 44oC. Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dƣơng tính (làm đục môi trƣờng và có sinh hơi). Cấy chuyển sang môi trƣờng thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. 36
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhận dạng khuẩn lạc E.coli: khuẩn lạc tròn, lồi, có tâm đen, có ánh kim tuyến, đƣờng kính khoảng 0.5mm. Chọn những khuẩn lạc đặc trƣng để thử nghiệm sinh hóa. Thử nghiệm khẳng định - Thử nghiệm Indol: Cấy chuyền một vi khuẩn chọn lọc đặc trƣng từ môi trƣờng thạch EMB vào môi trƣờng canh Tryptone, nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dƣơng tính (+) khi trên bề mặt xuất hiện vòng đỏ cánh sen. Âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. Hình 2.8: Thử nghiệm Indol. - Thử nghiệm Methyl red: Cấy chuyền một vi khuẩn chọn lọc đặc trƣng từ môi trƣờng thạch EMB vào môi trƣờng MR-VP borth (Methyl red – Voges Proskawer), nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào dung dịch. Phản ứng dƣơng tính (+) khi môi trƣờng chuyển sang màu đỏ. Âm tính (-) khi môi trƣờng giữ nguyên màu vàng. Hình 2.9: Thử nghiệm Methyl red. 37
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Thử nghiệm Voges-Proskauer: Cấy chuyền một vi khuẩn chọn lọc đặc trƣng từ môi trƣờng thạch EMB vào môi trƣờng MR-VP borth (Methyl red – Voges Proskawer), nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Thêm vài giọt dung dịch 1 α-naphtol 5%, sau đó thêm vài giọt dung dịch KOH 40%. Phản ứng âm tính (-) môi trƣờng giữ nguyên màu. Dƣơng tính (+) khi có màu đỏ ở trên bề mặt môi trƣờng. Hình 2.10: Thử nghiệm Voges-Proskauer - Thử nghiệm Citrate: Cấy ria vi khuẩn từ môi trƣờng thạch EMB vào ống thạch nghiêng có chứa môi trƣờng Simmons Citrate Agar (SCA), nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Phản ứng âm tính (-) khi môi trƣờng giữ nguyên màu, không có sinh khối. Dƣơng tính (+) khi môi trƣờng chuyển sang màu xanh dƣơng, có sinh khối. Hình 2.11: Thử nghiệm Citrate 38
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.3.4.4. Ghi kết quả Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC (+ + - -) Bảng 2.1: Kết quả thử nghiệm IMViC TT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges-Proskauer - 4 Khả năng sử dụng Citrate - 2.4. Xử lý số liệu 2.4.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 30 mẫu gan heo tƣơi đƣợc lấy từ 10 quầy khác nhau trên địa bàn chợ Bàu Sen, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. Thí nghiệm đƣợc chia làm 2 đợt. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần. GAN HEO TƢƠI Thu mẫu tại các quầy khảo sát. Đánh giá các chỉ tiêu CẢM QUAN VI SINH TPC Coliform E.coli NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN Hình 2.12: Sơ đồ bố trí thí nghiệm. 39
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.2. Phương pháp TPC: Đánh giá chỉ tiêu TPC bằng phƣơng pháp định lƣợng, nuôi cấy và đếm các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch. Tính toán kết quả. Coliform: Tƣơng tự cũng nhƣ TPC. Đánh giá bằng phƣơng pháp định lƣợng và đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trƣng. Tính toán kết quả. E.coli: Đánh giá bằng phƣơng pháp định tính, sử dụng nghiệm pháp IMViC. Đánh giá mẫu có đạt tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm hay không bằng cách so sánh với tiêu chuẩn cho phép về vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm. 2.4.3. Xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2007 để xử lý số liệu, tính toán và vẽ biểu đồ. 40
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá cảm quan Các mẫu gan heo tƣơi đem phân tích đƣợc mua vào thời điểm từ 6 giờ đến 8 giờ sáng. Trƣớc khi tiến hành phân tích các chỉ tiêu vi sinh, chúng tôi tiến hành đánh giá chỉ tiêu cảm quan của 10 quầy gan heo với 3 lần kiểm tra lặp lại. 3.1.1. Chỉ tiêu đánh giá Hình 3.1: Mẫu gan heo. Nhìn chung phần lớn các mẫu gan đều đạt chỉ tiêu về mặt cảm quan, 4 mẫu không đạt chất lƣợng cảm quan (gan có mùi hôi). Phần lớn heo đƣợc giết mổ vào thời điểm giữa khuya và gần sáng. Do chất lƣợng của thịt heo cũng nhƣ nội tạng còn rất tốt. Nên khi lấy mẫu vào lúc 6 – 8 giờ sáng, các mẫu gan heo đều đạt chỉ tiêu cảm quan. Nhƣng điều này cũng không thể phản ánh đƣợc các chỉ tiêu vi sinh để xác định mức độ nhiễm của mẫu. 41
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Còn riêng đối với 4 mẫu của quầy số 5, số 6, số 7 và quầy số 9 có mùi hôi, không tƣơi có thể do lƣợng tiêu thụ ngày hôm trƣớc không cao, còn tồn lại và không đƣợc bảo quản tốt, sau đó đƣợc bày bán. Vì vậy khả năng nhiễm vi sinh vật trong mẫu ở 4 quầy là khá cao nên việc phải phân tích các chỉ tiêu vi sinh đóng vai trò quan trọng. 3.2. Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật 3.2.1. Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí Kết quả phân tích chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) đƣợc trình bày ở hình 3.2. Hình 3.2: Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu gan heo của các quầy. Dựa vào hình 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng: Các vi sinh vật đều hiện diện trong tất cả các mẫu khảo sát với mật độ khác nhau. Trong tổng số 10 quầy khảo sát, có 4 quầy vƣợt quá tiêu chuẩn của Bộ Y tế 106 CFU/g. Đó là quầy 2, 5, 6 và 7. Trong khi đó, 6 quầy còn lại đều cho kết quả phân tích TPC thấp hơn nhiều so với tiêu chuẩn. Trong 4 quầy khảo sát vƣợt tiêu chuẩn thì quầy số 2 và quầy số 4, mật độ TPC mặc dù cao hơn tiêu chuẩn nhƣng mức độ không nghiêm trọng so với các mẫu gan heo ở 42
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP quầy 6 và quầy số 7. Mật độ vi sinh vật trên mẫu gan ở 2 quầy này cao hơn tiêu chuẩn gấp 2 lần. Khi lấy mẫu ở quầy số 6 và quầy số 7, đánh giá cảm quan ở 2 quầy không đƣợc tốt. Có thể mẫu không tiêu thụ đƣợc hết, để qua ngày không đƣợc bảo quản tốt khiến vi sinh vật phát triển vƣợt quá mức quy định của Bộ Y tế. Vì vậy thực phẩm tƣơi sống không tiêu thụ đƣợc hết trong ngày, phải đƣợc bảo quản đúng cách để vi sinh vật bị ức chế, không phát triển quá nhiều gây hƣ hỏng. Tổng vi sinh vật hiếu khí là chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng thực phẩm. Nếu mật độ TPC trong mẫu quá cao sẽ làm giảm chất lƣợng của thực phẩm đồng thời làm tăng nguy cơ nhiễm vi khuẩn gây bệnh. Mật độ TPC cao trong mẫu gan heo dẫn đến quá trình biến dƣỡng các thực phẩm trong mẫu xảy ra nhanh hơn làm cho nguồn mẫu mau hƣ hỏng hơn. Kết quả phân tích này, chúng tôi khuyến cáo ngƣời tiêu dùng nên thận trọng khi mua gan heo ở 2 quầy số 6 và quầy số 7. 43
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.3: Đếm TPC trên môi trƣờng thạch PCA ở độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. 3.2.2. Đánh giá chỉ tiêu Coliform tổng số Hình 3.4: Mật độ trung bình biểu thị Coliform tổng số của các quầy. Dựa vào hình 3.4, chúng tôi nhận thấy rằng: Trong 10 quầy lấy mẫu gan heo kiểm tra thì mật độ Coliform của mỗi quầy khác nhau. Có 6 quầy vƣợt quá tiêu chuẩn của Bô 44
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Y tế cho phép 102 CFU/g, là quầy số 2, 5, 6, 7, 8 và quầy số 9. Trong khi các quầy còn lại có mật độ thấp hơn so với tiêu chuẩn. Trong tổng số 10 quầy khảo sát với mẫu gan heo ở 6 quầy có chỉ tiêu Coliform vƣợt quá tiêu chuẩn. Đáng chú ý là các quầy số 5, 6, 7, 9 vƣợt gấp rƣỡi, hơn gấp 2 lần so với tiêu chuẩn cho phép. Khi đánh giá cảm quan, mẫu gan của các quầy này có mùi hôi, màu tím tái, không đƣợc tƣơi. Vì vậy, mật độ Coliform vƣợt quá giới hạn và đặc biệt nghiêm trọng cũng là đều hiển nhiên. Coliform đƣợc xem nhƣ những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lƣợng chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị càng lớn thì khả năng hiện diện của vi sinh vật khác gây bệnh trong thực phẩm càng cao. Với kết quả 6 quầy kiểm tra vƣợt chỉ tiêu Coliform tổng số cho phép trong thực phẩm tƣơi sống, chúng ta có thể thấy rằng cách bảo quản, buôn bán của các quầy không đảm bảo vệ sinh, chất lƣợng an toàn thực phẩm. Đặc biệt, khuyến cáo ngƣời tiêu dùng nên thận trọng khi mua gan heo ở quầy số 5, 6, 7 và 9. Qua kết quả này, chúng ta có thể dự đoán đƣợc khả năng nhiễm vi sinh vật gây bệnh khác của gan heo. Nhất là vi sinh vật đƣờng ruột. Hình 3.5: Khuẩn lạc Coliform trên môi trƣờng VRB. 45
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.6: Coliform đƣợc cấy trên 2 đĩa môi trƣờng VRB. Hình 3.7: Khẳng định Coliform trên môi trƣờng canh BGBL. 46
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2.3. Đánh giá chỉ tiêu E.coli Hình 3.8: Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm E.coli trên mẫu gan heo. Dựa vào hình 3.8, chúng tôi nhận thấy rằng: Trong 10 quầy lấy mẫu gan heo kiểm tra với 3 lần lặp lại có 8 mẫu (26.7%) trên 30 mẫu đƣợc đem đi phân tích dƣơng tính với E.coli. Các mẫu còn lại (73.3%) âm tính với E.coli. Trong 8 mẫu dƣơng tính thuộc các quầy số 5, số 6, số 7 và số 9. Theo tiêu chuẩn thực phẩm tƣơi sống không đƣợc phép nhiễm E.coli. Nhƣng trong các mẫu phân tích lại có 26.7% mẫu dƣơng tính với E.coli. Điều này cũng phản ánh vệ sinh an toàn thực phẩm tại các quầy 5, 6, 7 và 9 đặc biệt không tốt, có nhiều nguy cơ gây nguy hiểm đến ngƣời tiêu dùng. Cần có biện pháp khắc phục, giám sát chặt chẽ vệ sinh an toàn thực phẩm tƣơi sống để nâng cao sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Và khuyến cáo không nên sử dụng gan heo ở các quầy này. 47
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.9: E.coli tăng sinh trong môi trƣờng BGBL. Các ống dƣơng tính đƣợc cấy sang EMB để phân lập. Hình 3.10: Khuẩn lạc E.coli đƣợc cấy phân lập 3 chiều trên môi trƣờng EMB. 48
  50. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 3.11: Khẳng định bằng thử nghiệm IMViC dƣơng tính với E.coli. Từ kết quả phân tích 3 chỉ tiêu vi sinh trên mẫu gan heo của 10 quầy tại địa bàn chợ Bàu Sen quận 5, thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi thấy rằng: Các quầy số 2, 5, 6, 7, 8 và 9 đều không đạt chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm. Các quầy 1, 3, 4 và 10 đạt tiêu chuẩn đánh giá thực phẩm tƣơi sống của Bộ Y tế. Từ đó, chúng tôi thấy rằng tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm tại địa bàn chợ Bàu Sen vẫn chƣa đƣợc tốt. 6 quầy nhiễm vi sinh vật có thể do một số nguyên nhân nhƣ nguồn nƣớc sử dụng để rửa thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, cách bảo quản không tốt, có nhiều tác nhân bên ngoài (ruồi, bụi, khu vực bày bán gần cống rãnh, ngƣời bán không đeo bao tay, dụng cụ chứa đựng, cân không vệ sinh sạch sẽ ) cũng là nơi vi sinh vật trú ẩn, phát triển. Là mầm mống gây bệnh, ngộ độc thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng. Thực phẩm là nhu cầu tất yếu phục vụ đời sống của con ngƣời thì việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm là việc rất quan trọng. Vì chúng ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe con ngƣời. Cần có biện pháp, kiến nghị các quầy kiểm tra không đạt chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm để bảo vệ sức khỏe ngƣời tiêu dùng. 49
  51. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đối với chỉ tiêu cảm quan: Khoảng 87% số mẫu khảo sát trong tình trạng tƣơi, tốt, đạt chất lƣợng và tiêu chuẩn đánh giá cảm quan. Và 13% mẫu không đạt tiêu chuẩn thuộc các quầy số 5, 6, 7 và 9. Đối với chỉ tiêu TPC: Trong số 10 quầy kiểm tra thì có 6 quầy đạt chỉ tiêu TPC cho phép, 4 quầy vƣợt chỉ tiêu 106 CFU/g. Đặc biệt nghiêm trọng ở quầy số 6 và quầy số 7 vƣợt hơn gấp đôi tiêu chuẩn Bộ Y tế quy định. Đối với chỉ tiêu Coliform: Có 6 quầy vƣợt quá quy định cho phép 102 CFU/g đối với Coliform tổng số. Đặc biệt quầy số 6 và quầy số 7 vƣợt gấp 2 lần quy định cho phép. Đối với chỉ tiêu E.coli: Trong 30 mẫu gan heo đƣa vào phòng thí nghiệm phân tích, có 8 mẫu (26.7%) dƣơng tính với E.coli và (73.3%) tƣơng đƣơng 19 mẫu âm tính với E.coli. Các mẫu dƣơng tính với E.coli thuộc các quầy số 5, 6, 7 và quầy số 9. 4.2. Kiến nghị Để cải thiện tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm gan heo trên địa bàn chợ Bàu Sen, quận 5 nói riêng và thành phố Hồ Chí Minh nói chung, chúng tôi có một số kiến nghị nhƣ sau: Tìm hiểu kỹ nguyên nhân để khắc phục hiệu quả (do lƣợng tiêu thụ gan heo không nhiều nên gan để lâu qua ngày, không đƣợc bảo quản tốt là mầm mống phát triển vi sinh vật gây bệnh, gần cống thải, gần bãi rác ) Kiểm tra chặt chẽ các lò mổ vì đây là nguồn cung cấp và vận chuyển thực phẩm. Kiểm định các động vật thƣờng xuyên, loại bỏ các động vật bị bệnh để có nguồn thực phẩm sạch. 50
  52. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vận chuyển và bảo quản đúng quy định an toàn vệ sinh thực phẩm. Tránh nhập hàng lậu trái phép. Các dụng cụ sử dụng phải đƣợc vệ sinh sạch sẽ, kể cả các nguồn nƣớc để rửa thực phẩm Các gian hàng trong chợ phải sạch sẽ, ngƣời bán nên sử dụng bao tay trong quá trình bán. Thƣờng xuyên tổ chức các đợt kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm để đề ra tình hình và giải pháp khắc phục. 51
  53. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bùi Xuân Duy (2011). Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trên hải sản tươi sống bán tại địa bàn quận 3, TP.Hồ Chí Minh, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. [2] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hƣơng (2008). Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh. [3] Ths.Phạm Minh Nhựt (2007). Bài giảng phân tích đánh giá chất lƣợng thực phẩm, Trƣờng đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. [4] Vũ Thị Thắm (2010). Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trên sữa đậu nành đường phố bán tại địa bàn phường 25, quận Bình Thạnh, TP.Hồ Chí Minh, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh. [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] 216890 [13] 52
  54. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Phụ lục A: Nhật ký lấy mẫu MẪU GAN HEO STT Quầy lấy mẫu Lần lặp lại Thời gian lấy mẫu Ký hiệu 1 Q1 1 18 / 06 / 2013. Q1 – 1 2 Q1 2 25 / 06 / 2013. Q1 – 2 3 Q1 3 23 / 07 / 2013. Q1 – 3 4 Q2 1 18 / 06 / 2013. Q2 – 1 5 Q2 2 25 / 06 / 2013. Q2 – 2 6 Q2 3 23 / 07 / 2013. Q2 – 3 7 Q3 1 18 / 06 / 2013. Q3 – 1 8 Q3 2 25 / 06 / 2013. Q3 – 2 9 Q3 3 23 / 07 / 2013. Q3 – 3 10 Q4 1 18 / 06 / 2013. Q4 – 1 11 Q4 2 25 / 06 / 2013. Q4 – 2 12 Q4 3 23 / 07 / 2013. Q4 – 3 13 Q5 1 18 / 06 / 2013. Q5 – 1 14 Q5 2 25 / 06 / 2013. Q5 – 2 15 Q5 3 23 / 07 / 2013. Q5 – 3 16 Q6 1 30 / 07 / 2013. Q6 – 1 17 Q6 2 06 / 08 / 2013. Q6 – 2 18 Q6 3 13 / 08 / 2013. Q6 – 3 19 Q7 1 30 / 07 / 2013. Q7 – 1 20 Q7 2 06 / 08 / 2013. Q7 – 2 21 Q7 3 13 / 08 / 2013. Q7 – 3 22 Q8 1 30 / 07 / 2013. Q8 – 1 53
  55. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 23 Q8 2 06 / 08 / 2013. Q8 – 2 24 Q8 3 13 / 08 / 2013. Q8 – 3 25 Q9 1 30 / 07 / 2013. Q9 – 1 26 Q9 2 06 / 08 / 2013. Q9 – 2 27 Q9 3 13 / 08 / 2013. Q9 – 3 28 Q10 1 30 / 07 / 2013. Q10 – 1 29 Q10 2 06 / 08 / 2013. Q10 – 2 30 Q10 3 13 / 08 / 2013. Q10 – 3 Phụ lục B: Bảng kết quả đánh giá cảm quan Chỉ tiêu Điểm đánh giá Yêu cầu Màu đặc trƣng của gan tƣơi. Có màu đỏ sẫm 3 hoặc tím nhạt. Màu sắc 2 Màu sẫm hơi nâu hoặc tím tái không đồng đều. Không có màu đặc trƣng của gan tƣơi. Màu đen 1 sẫm. Dùng tay sờ vào thấy gan mềm, mịn, láng. Khi 3 dùng ngón tay ấn vào mặt gan thì thấy gan lõm xuống và giữ nguyên vết lõm khi rút tay ra. Cấu trúc Dùng tay sờ thấy gan hơi cứng hoặc bề mặt 2 không đƣợc láng mịn. Gan bị sần sùi, cứng, bề mặt có những chấm lạ 1 hoặc bị lở. 3 Không có mùi lạ. Mùi 2 Mùi không đặc trƣng, hơi tanh. 1 Mùi tanh, ôi. 54
  56. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục C: Bảng kết quả phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) của 10 quầy gan heo trong 3 lần kiểm tra Quầy Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1 1.85 x 106 3.16 x 105 3.91 x 105 8. 52 x 105 2 1.53 x 106 7.78 x 104 1.49 x 106 1.03 x 106 3 3.70 x 105 2.99 x 105 1.20 x 106 6.23 x 105 4 5.61 x 105 2.96 x 105 4.01 x 105 4.19 x 105 5 2.29 x 106 5.66 x 105 2.63 x 105 1.04 x 106 6 2.19 x 106 1.90 x 106 2.00 x 106 2.03 x 106 7 2.46 x 106 2.30 x 106 2.18 x 106 2.31 x 106 8 3.19 x 105 3.50 x 105 2.33 x 105 3.01 x 105 9 5.60 x 105 3.55 x 105 1.98 x 106 9.65 x 105 10 1.81 x 106 3.32 x 104 5.13 x 105 7.92 x 105 Phụ lục D: Bảng kết quả phân tích Coliform tổng số của 10 quầy gan heo trong 3 lần kiểm tra Quầy Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1 1.00 x 102 1.10 x 102 0 7.00 x 101 2 1.00 x 102 0 2.20 x 102 1.07 x 102 3 0 1.10 x 102 0 3.67 x 101 4 0 1.00 x 102 0 3.33 x 101 5 3.00 x 102 2.20 x 102 0 1.73 x 102 6 5.00 x 102 0 2.00 x 102 2.33 x 102 7 3.90 x 102 4.40 x 102 0 2.77 x 102 8 0 0 3.30 x 102 1.10 x 102 9 2.20 x 102 0 3.00 x 102 1.73 x 102 10 0 0 2.20 x 102 7.33 x 101 55
  57. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phụ lục E: Bảng kết quả định tính E.coli của 10 quầy gan heo trong 3 lần lặp lại Kết quả định tính E.coli Kết quả định tính E.coli Quầy Quầy Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 - - - 6 + - + 2 - - - 7 + + - 3 - - - 8 - - - 4 - - - 9 + - + 5 + + - 10 - - - Phụ lục F: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật (Theo TCVN 5287:1994) F.1. Nƣớc muối sinh lý Natriclorua 8.5g Nƣớc cất 1000ml F.2. Môi trƣờng Plate Count Agar (PCA) Tryptone 5g Cao nấm men 2.5g Glucose 1g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml F.3. Môi trƣờng Brilliant Green Bile Lactose 2% (BGBL 2%) Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Dung dịch 0.1% Brilliant Green 13.3ml Nƣớc cất 1000ml 56
  58. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP F.4. Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya Peptone 15g Tryptone peptone 5g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml F.5. Môi trƣờng Violet Red Bile Agar (VRB) Peptone 7g Cao nấm men 3g Lactose 10g Natriclorua 5g Muối mật 1.5g Đỏ trung tính 0.03g Tím tinh thể 0.002g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml F.6. Môi trƣờng Eosine Methylen Blue Agar (EMB) Peptone 10g Lactose 10g Dikalihydrophotohate 2g Eosine 0.4g Xanh methylen 0.065g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml F.7. Thuốc thử Kovac’s (để thử phản ứng Indol) Hòa 5 g P – Dimethylaminobenzaldehyt vào 75 ml Amyl alcohol, đun nhẹ ở 50 – 55oC đến tan hết, để nguội và cho thêm 25 ml axit sulfuaric đậm đặc. 57
  59. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP F.8. Môi trƣờng Methyl Red – Voges Proskauer (MR – VP) Peptone 5g Dikalihydrophotphate 5g Glucose 5g Nƣớc cất 1000ml F.9. Môi trƣờng Simons Citrate Amonidihydro photphate 1g Dikakihydrophotphate 1g Natriclorua 5g Natricitrate 2g MagieSunfate 0.2g Bromothymol xanh 0.08g Agar 12.5g Nƣớc cất 1000ml 58