›

Đồ án Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu

pdf 78 trang thiennha21 12/04/2022 4760
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_he_enzyme_ngoai_bao_va_kha_nang_ky_sinh_tuyen.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp. CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH MSSV: 1151110383 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được xuất phát từ yêu cầu trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong đồ án được thu hoạch trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa được từng được ai công bố trước đây. Tp.HCM, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Trinh ii
  3. LỜI CẢM ƠN Mọi sự nỗ lực đều được đền đáp bằng những thành quả tốt đẹp và mọi trái ngọt đều do bàn tay con người vun xới. Để có thể đạt được những kết quả như ngày hôm nay, em biết ơn vô cùng và xin được tỏ lòng biết ơn bằng những lời cầu chúc tốt đẹp và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến: Xin được gửi đến BGH Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy cho em những kiến thức cùng những bài học kinh nghiệm vô cùng quý giá. Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và các anh chị trong Phòng Công nghệ vi sinh nói riêng. Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị vật chất cũng như những sự quan tâm giúp đỡ, giúp em hoàn thành tốt bài luận này. Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị Mai Châm và kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, những người đã tận tình hướng dẫn trong quá trình tiến hành cũng như từng bước giúp em hoàn thiện hơn bản thân và những bài học kinh nghiệm quan trọng trong bước đường tương lai. Nhờ sự động viên dìu dắt của thạc sĩ đã tạo động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện. Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ và tạo những điều kiện tốt nhất. Chính những kết quả này sẽ luôn là trang bài học quý giá với em trong suốt quãng đường phía trước. Tp.HCM ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Trinh iii
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu 3 1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật 4 Phân loại 4 Hình thức ký sinh trên thực vật 5 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. 5 Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. 5 Vòng đời của tuyến trùng M. incognita 6 Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. 6 Đặc điểm gây hại 8 Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. 9 1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum 9 1.3.1 Hệ thống phân loại 9 1.3.2 Phân bố 10 1.3.3 Đặc điểm hình thái 11 Hình thái đại thể 11 Hình thái vi thể 11 1.3.4 Đặc điểm sinh hóa 12 Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào 12 Enzyme protease 12 Chitinase 14 1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P. liacinum 15 Nhiệt độ 15 pH 16 iv
  5. Nguồn dinh dưỡng 16 1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng 17 Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng 18 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 19 2.2 Đối tượng nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm 19 Vật liệu 19 Dụng cụ 19 Thiết bị 19 Các môi trường và thuốc thử sử dụng 20 2.4 Nội dung nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum - Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch 23 2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum 24 2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum 27 3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P. lilacinum 27 3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum 32 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp. 38 3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. 38 v
  6. 3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. 41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1. Kết luận 45 4.2. Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 1 vi
  7. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BR – VT : Bà Rịa – Vũng Tàu BVTV : Bảo vệ thực vật IJ2 : Infective Juvenile 2 M : Meloidogyne MT : Môi trường NN-PTNT : Nông nghiệp- phát triển nông thôn PDA : Potato Dextrose Agar P : Purpureocillium TCA : Trichloroacetic WA : Water Agar CTV : cộng tác viên vii
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu 22 Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh 27 Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 30 Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau 31 Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh 33 Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 35 Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau 37 Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo thời gian 38 Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian 40 Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp. theo thời gian 41 Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian 44 viii
  9. DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Biểu đồ 3.1. Đường kính vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. 31 Biểu đồ 3.2. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. 36 Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. 40 Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. 43 Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp 8 Hình 1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250C 11 Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm 12 Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D). 28 Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C). 30 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B). 34 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và 72h (B) 36 Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C). 39 Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 ngày (C). 42 ix
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Theo báo cáo thống kê 6 tháng đầu năm của Bộ NN- PTNT Việt Nam năm 2014 sản lượng tiêu xuất khẩu đạt 111.000 tấn tăng 36% về lượng và 48% giá trị. Có thể nói, cây hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực đẩy mạnh phát triển kinh tế các địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế của đất nước. Cây hồ tiêu được phát triển với quy mô và tốc độ khá lớn tại các tỉnh miền Trung và Khu vực Đông Nam Bộ. Đặc biệt là Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê của Sở NN- PTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ 4 cả nước về diện tích trồng tiêu với tổng diện tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng hơn 12000 tấn, đứng thứ 4 cả nước (Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam). Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu trong những năm qua bị tổn thất đáng kể do cây thường bị bệnh với những dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, lá vàng, cây khô chết dần mà một trong những nguyên nhân là do tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. (Phạm Văn Biên, 1989 và Nguyễn Ngọc Châu, 1990). Đây được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong nông nghiệp. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau. Hiện nay, khoảng hơn 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại phổ biến là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla (Vũ Triệu Mân, 2007). Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học nhưng vẫn chưa tiêu diệt triệt để. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng đem lại những lo ngại: tồn dư thuốc trong nông sản, làm mất cân bằng hệ vi sinh vật, ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, hiện tượng kháng thuốc gây phát sinh những dịch bệnh khác nghiêm trọng hơn Còn rất nhiều những mối nguy hại không thể kể hết. Trong khi đó, việc áp dụng các tiến bộ trong công nghệ sinh học cũng như ứng dụng công nghệ vi sinh còn rất hạn chế, những lo ngại cũng như tâm lý khi sử dụng các sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn rất lạ và mơ hồ với chính những người nông dân. Trong tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc các vi sinh vật bản địa có khả năng ký sinh tuyến trùng gây hại là vấn đề đáng quan tâm và như mở ra cánh cửa 1
  11. Đồ án tốt nghiệp mới trong việc chủ động phòng trừ tác nhân gây bệnh, nhằm giảm thiệt hại và nâng cao chất lượng và sản lượng cây trồng. Một trong những giải pháp hữu hiệu góp phần đảm bảo an toàn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ cân bằng hệ vi sinh vật và gìn giữ môi trường. Nấm Purpureocillium lilacinum đã được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng (Jatalas và cs, 1979). Ngoài ra, chúng còn có thể sống hoại sinh trong đất xung quanh vùng rễ cây (Tigrano và cs, 1995). Do đó, năm 2014 Trung tâm Công nghệ sinh học đã tiến hành xác định sự phân bố của nấm này ở vùng Đông Nam Bộ, trong đó có Vũng Tàu. Việc phân lập, xác định hoạt tính enzyme ngoại bào hay khả năng kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau là rất cần thiết. Đó là lý do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu.” 2. Mục tiêu đề tài Khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P. lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh). So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của một số chủng nấm P. liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và khỏe mạnh. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Ý nghĩa khoa học Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng kí sinh tuyến trùng của nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở vũng Tàu. Ý nghĩa thực tiễn Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm P. lilacinum có hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase cũng như khả năng kí sinh tuyến trùng mạnh trong đất trồng tiêu góp phần vào việc định hướng sử dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ tuyến trùng hại tiêu trong tương lai. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc về đặc điểm rễ cây hồ tiêu Hệ thống rễ hồ tiêu thường gồm 3 -6 rễ cái và một chùm rễ phụ nằm dưới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống đất khoảng 2,5m và giữ nhiệm vụ hút nước. Các rễ cái cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. Đối với những cây trồng bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài nọc được 1 năm các rễ cái này có thể đâm sâu khoảng 2m. Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc. Phân bố ở độ sâu 15 – 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây. Rễ bám mọc ra từ các đốt phần thân dây tiêu, giúp cho dây bám vào choái, vách tường, để vươn lên cao. Khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của rễ bám là rất hạn chế và hầu như là không đáng kể. Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên có nhiều phương pháp cải tạo làm cho đất được tơi xốp và tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần ngập úng trong nước từ 12 – 24 giờ thì bộ rễ tiêu sẽ bị tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới thối rễ và dây tiêu sẽ bị chết. Một số sâu bệnh phát triển trên cây tiêu Trên rễ cây hồ tiêu thường xuất hiện một số bệnh: Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu. Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận này tạo điều kiện cho nấm và tuyến trùng có hại xâm nhập và gây bệnh cho tiêu. Rệp sáp giả (Pseudococidae) : gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu trên mặt đất hoặc gốc tiêu, rễ tiêu trong lòng đất. Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora, do tác động của tuyến trùng, côn trùng, chăm sóc, xới xáo, ngập úng làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm nhập và gây hại. Bệnh gây hại trên tất cả bộ phận của cây. Bệnh chết chậm: do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp., Các loại nấm này tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước, 3
  13. Đồ án tốt nghiệp cây giống Cây bị bệnh sinh trưởng chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng. Hoa quả rụng dần từ gốc đến ngọn. Các đốt cũng rụng dần, gốc thối, bó mạch thân cây hóa nâu. Bên cạnh đó bệnh tiêu cũng bị nhiều loài tuyến trùng gây hại, trong đó có hai loài gây hại nặng nề nhất là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục hang Radopholus (Michel Luc, 2005). Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống, thích nghi với đời sống ký sinh trên thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng phân biệt rõ ràng với nhóm ký sinh trên động vật và các nhóm sinh thái khác: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất (Nguyễn Bảo Vệ và ctv 2005). 1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật Phân loại Dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ : Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật. Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa. Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus. Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh trên tất cả các cơ quan của cây đang phát triển hoa, lá, thân, rễ trong đó rễ là nơi chịu ảnh hưởng nhiều nhất những tác động của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000). Hình thức ký sinh trên thực vật Có thể chia thành 3 nhóm: Ngoại ký sinh, bán nội ký sinh và nội ký sinh di chuyển. Ngoại ký sinh là tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong cơ thể thực vật mà bám vào bên ngoài bề mặt rễ, chúng dùng kim hút để châm chích và hút dinh dưỡng bên trong cây. Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau tuyến trùng vẫn ở ngoài đất. Nội ký sinh: toàn bộ phần cơ thể tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nội ký sinh di chuyển : tuyến trùng có khả năng di chuyển trong mô thực vật, chúng di chuyển từ mô này đến mô khác để dinh dưỡng. Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi cố định (tạo nên các tế bào dinh dưỡng) chúng mất khả năng di chuyển và trở lên phình to (béo phì). Các kiểu ký sinh này không loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có thể là nội ký sinh hay ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ. Ở tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang (Heterodera/ Globora), ấu trùng tuổi 2 là giai đoạn xâm nhập vào rễ. Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu hết tuyến trùng nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai đoạn đều có thể dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ (Vũ Triệu Mẫn, 2007). 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. Tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất. Chúng gây hại hơn 3000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng: rau màu, đậu, ngũ cốc, cây ăn quả, thảo mộc và nhiều cây cảnh thân gỗ khác (Malcolm & Charles, 2000). Tuyến trùng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng cây trồng. Theo thống kê có khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loại ký sinh gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp halpha (Vũ Triệu Mân, 2007). Một số loài Meloidogyne gây hại khá phổ biến và quan trọng đối với thực vật hiện nay: M. incognita là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân bố trên vùng địa lý rộng trên phạm vi toàn thế giới. Đây cũng là loài gây hại phổ biến trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng gây nhiều nhất trên : hồ tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ cà, cây họ đậu M. javanica là loài phổ biến thứ 2 sau M. incognita và có dải phân bố rộng tương tự. Đây là loài có khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3 – 6 tháng. Ở Việt Nam, loài này cũng ký sinh khá phổ biến trên các cây họ đậu, chuối M. arenaria là loài phổ biến thứ 3 sau 2 loài trên, phân bố khắp thế giới. Đây là loài gây hại phổ biến trên các cây họ đậu ở Việt Nam. M. graminicola ký sinh gây hại trên cây lúa ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới là chủ yếu (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ ) Ở nước ta, loài này ký sinh trên tương đối nhiều trên cây lúa ( giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước ) ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tuyến trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là tuyến trùng nội ký sinh rễ: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynedae, Bộ Tylenchida. Vòng đời của tuyến trùng M. incognita Vòng đời tuyến trùng M. incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính : trứng (ấu trùng tuổi 1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm), ấu trùng tuổi 3, ấu trùng tuổi 4 và tuyến trùng trưởng thành. Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, các giai đoạn khác hình thành và phát triển trong rễ cây. Trong chu kỳ vòng đời này ở tuyến trùng Meloidogyne spp. thì giai đoạn ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng trưởng thành giúp xác định loài (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993) Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, giữa và đuôi. Phần đầu còn được gọi là vùng môi. Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhô lên, hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt. Phần thân ở giữa chứa ruột giữa và cơ quan sinh 6
  16. Đồ án tốt nghiệp dục. Phần đuôi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. Con cái trưởng thành hình cầu, nằm sâu trong mô rễ. Đường kính cơ thể 0,5– 0,7 mm với cổ cân đối. Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Lớp vỏ cutin tương đối bền và có thể co giãn được. Vỏ cutin về cơ bản được chia thành 3 lớp : epidocutin, exocutin và endocutin (Bird, 1984). Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa. Ngoài ra năm 1986, Reddigari cũng đã tách được thành phần protein collagen từ 3 lớp của vỏ cutin của M. incognita với một lượng khác nhau ở mỗi lớp. Trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, hệ sinh dục, hệ bài tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Phía trong gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma. Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mô. Nó được tạo áp lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên. Áp lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng vận động được. Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ sinh sản. Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Ngọc Châu, 2003). Trứng được con cái đẻ ra bên ngoài cơ thể vào khối gelatin nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng nằm bên trong nốt sần. Có hình bầu dục dài hay hình quả thận, cũng có loại trứng hình tròn và tương đối lớn. Vỏ trứng là phần cứng bên ngoài của trứng tuyến trùng, giúp bảo vệ khỏi các tác nhân hóa học và vi sinh vật tấn công. Lớp vỏ trứng có thể có từ 1 – 5 lớp tùy thuộc vào từng loài tuyến trùng. Các cấu trúc phổ biến nhất có lớp nội lipid, một lớp chitin ở giữa (thành phần chính) và một lớp vitelline ngoài (Bird và McClure, 1976) Lớp bên ngoài bao gồm các vitellin protein. Lớp rào cản đầu tiên bên ngoài giúp ngăn cản sự xâm nhập của nấm lên trứng. Trong Bộ Tylenchida, tuyến trùng M. javanica, lớp vitelline là rất mỏng (10-40 nm) và chứa lipoprotein. Vỏ trứng của tuyến trùng sần rễ M. hapla có hơn 40% protein (Wharton, 1980). Dày 400 nm là lớp chitin lớn 7
  17. Đồ án tốt nghiệp được kết hợp với protein để tạo thành một phức tạp chitin-protein. Vỏ trứng M. javanica chứa 50% protein và 30% chitin (Bird và Bird, 1991). Vai trò chính của lớp chitin có thể đảm bảo độ bền cấu trúc vỏ trứng và để bảo vệ lớp lipid. Các lớp lipid bao gồm một loạt các màng lipoprotein (Wharton, 1980) và dày nhất ở các đầu (0.02- 0.04 µm). Các lớp lipid chịu trách nhiệm chống thấm của một số vỏ trứng, và nó bảo vệ trứng hạn chế chất độc hại (Wharton, 1980). Nếu các lớp chitin được loại bỏ, lớp lipid là dễ dàng bị hư hỏng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000) Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp Đặc điểm gây hại Quan sát mô học chỉ ra rằng sự xâm nhập của ấu trùng tuổi 2 xuất hiện nhiều nhất tại vùng mô phân sinh rễ. Tuyến trùng ở đất xâm nhập vào rễ tiêu ở giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm IJ2. Sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng khu trú tại một chỗ và dùng kim hút chọc thủng tế bào mô trụ của rễ, tiết men tiêu hóa vào mô để thực hiện dinh dưỡng. Tại đây, tuyến trùng nhanh chóng phát triển qua các giai đoạn để phát triển thành tuyến trùng trưởng thành (tuyến trùng đực dạng chỉ dài, tuyến trùng cái hình quả lê). Dưới tác dụng của men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra, các tế bào xung quanh tuyến trùng phát triển bất thường, tạo thành các tế bào khổng lồ có nhiều nhân. Rễ phình to ra tạo thành u hay nốt sần, hệ rễ bị biến dạng. Những nốt 8
  18. Đồ án tốt nghiệp sần này có thể nhỏ, riêng biệt hay to và xếp thành chuỗi, phụ thuộc vào mức độ nhiễm của cây ký chủ ( Nguyễn Ngọc Châu và ctv.,1990). Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. Trên thực tế, chỉ có thể phát hiện tình trạng của bệnh khi cây bắt đầu xuất hiện các triệu chứng bộ lá bắt đầu suy giảm nên việc khống chế và phòng trừ sẽ rơi vào tình trạng bị động và gặp rất nhiều khó khăn, kém hiệu quả dẫn đến cây chết, dịch bệnh lây lan trên diện rộng. Vì vậy, để phòng trừ có hiệu quả cần có các biện pháp phòng trừ tích cực, hiệu quả, chủ động. Một số biện pháp phòng trừ: biện pháp chọn giống, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học, biện pháp sinh học. Có 2 dạng phòng trừ sinh học: Phòng trừ sinh học nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng. Phòng trừ sinh học tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng. Hiện tại biện pháp phòng trừ sinh học vẫn chưa thể thay thế biện pháp hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, phòng trừ sinh học rất phù hợp trong hệ thống quản lý tuyến trùng. Trong đó, việc nghiên cứu, tìm tòi về khả năng đối kháng, ký sinh là những bước tiến quan trọng đang được quan tâm và phát triển. 1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum 1.3.1 Hệ thống phân loại Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi này chỉ có một đại diện duy nhất là Purpureocillium lilacinum (hay còn được biết đến với tên phổ biến Peacilomyces lilacinus). Nấm sợi Purpureocillium lilacinum là loài hoại sinh khá phổ biến và đang được chú trọng vì có tiềm năng trong việc kiểm soát mật độ của tuyến trùng gây hại trên cây trồng. Phân loại theo Jennifer và cs năm 2011 như sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Purpureocillium Loài: Pupureocillium lilacinum Loài Purpureocillium lilacinum được miêu tả đầu tiên bởi nghiên cứu của Charles Thomas vào năm 1910, dưới tên Penicillium lilacinum. Một số tên gọi khác của nó Penicillium amethystinum (Wehmer,1923), Spicaria rubidopurpurea (Aoki, 1941). Năm 1974, Samon đổi tên thành Paecilomyces. Những công bố trong thập niên 20 chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là đơn ngành (Inglis và Tigano, 2006). Nấm này đã từng được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes). Người ta đã phân lập được nhiều chủng nấm này từ khắp nơi trên thế giới và nó được chấp nhận như biến thể của chi Paecilomyces. Paecilomyces có mối quan hệ gần với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola (Sung và ctv, 2007). Loài nấm Paecilimyces lilacinus được nghiên cứu nhiều nhất trong việc phòng trừ tuyến trùng. Năm 2011, Jennifer và cs đã đổi tên Paecilomyces lilacinus thành Purpureocillium lilacinum và sử dụng cho tới hiện tại. Những kết quả khi phân tích quan hệ phát sinh loài của các chủng Purpureocillium lilacinum chỉ ra rằng nó có liên quan chặt chẽ với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài ký sinh thuộc chi Paecilomyces, họ Hypocreales (Inglis và Tigano, 2006). 1.3.2 Phân bố P. lilacinum đã được phân lập từ các môi trường sống bao gồm đất (canh tác và không canh tác, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông), nước thải và côn trùng, tuyến trùng. P. lilacinum cũng đã được tìm thấy trong trứng và con cái của tuyến trùng sần rễ và tuyến trùng bào nang. Ngoài ra, P. lilacinum cũng được tìm thấy trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995). 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Đặc điểm hình thái Hình thái đại thể Bào tử nấm P. lilacinum nảy mầm khi độ ẩm và chất dinh dưỡng đầy đủ. Khuẩn lạc trên môi trường thạch PDA tăng trưởng khá nhanh, đường kính đạt 5-7 cm trong vòng 14 ngày ở 280C ± 20C, có bề mặt dạng len hoặc xốp bông, ban đầu có màu trắng nhưng khi bắt đầu phát sinh bào tử chuyển thành màu tím, hoặc màu nâu khi đưa lên ánh sáng. Một số trường hợp, bào tử không màu nhưng đa số là màu tím (Samson, 1975). Hình1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250C ( ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm). Hình thái vi thể Các sợi nấm sinh dưỡng có thành trơn láng trong suốt và rộng khoảng 2,5 - 4,0 µm (Samson, 1974). Cuống bào tử đính phát sinh từ các sợi nấm cơ chất và sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng 400 - 600 µm. Cuống bào tử phình ra ở phía gốc và thon gọn ở phía ngọn gọi là thể bình. Bào tử đính phát sinh từ thể bình có dạng hình tròn hay bầu dục, ban đầu có vách trơn láng, sau đó trở nên hơi gồ ghề (Samson, 1974). 11
  21. Đồ án tốt nghiệp Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm P. lilacinum khi chụp từ kính hiển vi huỳnh quang độ phóng đại 460X ( 1.3.4 Đặc điểm sinh hóa Có rất nhiều nghiên cứu về enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum, đặc biệt là enzyme protease. Enzyme này có khả năng phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapla (Bonants và cs, 1995). Ngoài ra enzyme ngoại bào chitinase được tiết ra từ P. lilacinum cũng góp phần vào việc thủy phân thành phần của vỏ trứng tuyến trùng (Khan và cs, 2004). Các độc tố của nấm cũng được nghiên cứu, đáng chú ý là Peacilotoxin. Tuy nhiên việc tiết độc tố cũng tùy thuộc vào nguồn gốc phân lập của chủng nấm (Khan và cs, 2003; Park và cs, 2004). Năm 2003, Khan và cs đã thử nghiệm một chủng P. lilacinum để sản xuất Paecilotoxin và chủng này không hề sinh độc tố. Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào Enzyme protease Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng tạo các acid amin và NH3. Protease cần thiết cho các sinh vật sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau 12
  22. Đồ án tốt nghiệp về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất (Võ Thị Bích Vân, 2010) Phân loại protease: Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo của tâm hoạt động của enzyme. Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase (E.C.3.4.11-17) và exopeptidase(E.C.3.4.21-99). Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính. Cơ chế hoạt động của protease: Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Võ Thị Bích Vân, 2010). P. lilacinum có khả năng tiết ra serine protease. Năm 2004, Khan đã chứng minh rằng serine protease được tiết ra bởi chủng nấm P. lilacinum 251 làm ngừng sự phát triển của trứng M. javanica và làm giảm sự nở của ấu trùng hay có thể giết chết một lượng lớn ấu trùng tuổi 2 đã nở. Đồng thời nghiên cứu này còn chỉ ra rằng 13
  23. Đồ án tốt nghiệp enzyme này kết hợp với enzyme chitinase có thể gây tổn thương đến phôi trứng tuyến trùng và làm thay đổi cấu trúc vỏ trứng do lớp vitelline bị tan ra và thay đổi tính thấm ảnh hưởng đến lớp lipid trong cùng gây ra những thay đổi như trứng bị phồng lên. Chitinase Chitinase [Poly-Beta-1-4- (2-acetalmido-2-deoxy) -D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14. 3 → Hydrolase 2 → Glycosylase 1 → Glycosidase 14 → Chitinase Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ. Họ Glycohydrolase 18 là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens Họ Glycohydrolase 19 gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV. Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N- acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người. 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-f-chitobiosidase, N-acetyl-f-D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase, chitobiosidase và β–N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và f-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng f-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của f-N- acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và f-N- acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine (Đinh Minh Hiệp, 2007). Theo đó, P. lilacinum làm thay đổi phần nhiều cấu trúc của vỏ trứng dưới sự tác động của chitinase tạo không gian cho nấm trong suốt quá trình xâm nhập (Morgan-Jones và ctv, 1984). Đồng thời tiết ra enzyme chitinase làm mỏng đi lớp chitin của vỏ tuyến trùng và gây chia tách với lớp lipd trong cùng. Như vậy, việc sản sinh enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum cũng có ý nghĩa và vai trò quan trọng trong việc phá hủy vỏ trứng tuyến trùng với 3 lớp bảo vệ cơ bản: protein, chitin và lipid và lớp biểu bì cutin bên ngoài của con cái cùng các lỗ mở tự tiên trên cơ thể chúng là những nơi dễ bị xâm nhiễm. Nơi đầu tiên để nấm xâm nhập và là cơ sở để kiểm soát sinh học. Protease, chitinase, và lysozyme là các enzyme thường được tổng hợp và tiết ra bởi nấm làm bào mòn vỏ trứng và lớp biểu bì con cái tuyến trùng (Bonants và ctv, 1995; Dackman và ctv, 1989; Gupta và ctv, 1993). 1.3.5 Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của P. liacinum Nhiệt độ Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của nấm sợi là từ 20C đến 50C, tối ưu từ 220C đến 270C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 15
  25. Đồ án tốt nghiệp 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 00C và ở 600C (Trần Thị Nhã Uyên, 2010). Nấm P. lilacinum có thể tăng trưởng được trong một khoảng nhiệt độ khá rộng, từ 8- 38°C (46 đến 100°F), nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển khoảng 26-30°C (79-86°F) . pH Nói chung, nấm sợi có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH 9 (Ingold, 1967). Theo đó, loài P .lilacinus này cũng thích nghi với khoảng pH khá rộng 4 – 8 (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) và có thể tăng trưởng được trên môi trường có sự thay đổi nhiều cơ chất (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995). Nguồn dinh dưỡng Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Nếu các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Trần Thị Nhã Uyên, 2010). Ảnh hưởng của nguồn C: Nguồn C có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp. Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ, lipit Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều sinh vật khác. Các loài nấm sợi thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác. Ảnh hưởng của nguồn N: Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng. Có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men Dễ tiêu nhất là nguồn N từ casein.(Trần Thị Nhã Uyên, 2010). P. lilacinum rất dễ thích nghi với điều kiện sống, tùy thuộc vào sự sẵn có của các chất dinh dưỡng trong môi trường xung quanh. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Chúng có thể vừa sống hoại sinh trong đất, vừa ký sinh côn trùng (Rombach và ctv, 1986; Marti và ctv, 2006; Fiedler và Sosnowska, 2007), vừa ký sinh tuyến trùng (Tigrano và ctv, 1995). 1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng Tuyến trùng ký sinh thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về kinh tế đối với nhiều loại cây trồng. Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên, các chất hóa học diệt tuyến trùng hiện đang được coi là mối nguy hiểm đối với môi trường, đe dọa sức khỏe con người và động vật, chi phí cao, và làm xuất hiện các loại tuyến trùng có khả năng kháng thuốc. P. lilacinum được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học đối với một số loài tuyến trùng, như M. incognita. Một số loài nấm có khả năng ký sinh như Exophiala pisciphila; Scytalidium fulvum ký sinh trên trứng tuyến trùng; Scytalidium fulvum ký sinh bọc trứng bằng các sợi nấm ăn sâu vào bên trong; Paraphoma radicina ký sinh bọc trứng; Sợi nấm Phoma terrestris ăn sâu vào bên trong trứng; Phytophthora cinnamomi; F. solani; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces variotii ký sinh trên trứng tuyến trùng, Heterodera glycines; F.oxysporum ký sinh bọc trứng (Ownley Gintin và ctv, 1983) . Liên quan đến việc phá vỡ hay làm thủng lớp vỏ của tuyến trùng hay tuyến trùng còn chịu tác động dưới lực cơ học và tiêu hóa các enzyme từ nấm Verticillium suchlasporium (Lopez-Llorca and Robertson,1992; Stirling, 1991). Vào năm 1979, Jatala và ctv phát hiện rằng P. lilacinum ký sinh lên trứng của loài Meloidogyne incognita ở Peru và nhiều thử nghiệm dùng nó diệt tuyến trùng gây hại được thực hiện ở đây đã thành công. P. lilacinum được quan sát ký sinh lên trứng tuyến trùng lần đầu tiên bởi Lysek vào năm 1996. Đến năm 1991, Stirling và West đã phân lập được P. lilacinum từ nhiều loài tuyến trùng sần rễ, tuyến trùng bào nang và từ mẫu đất ở nhiều địa điểm. 17
  27. Đồ án tốt nghiệp Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng Trước khi lây nhiễm vào trứng tuyến trùng, P. lilacinum sẽ tiết enzyme phân hủy và áp chặt vào vỏ trứng. Nó tạo ra đĩa áp khắp vỏ trứng tuyến trùng sau đó một vài sợi nấm phát triển dọc theo bề mặt trứng tạo thành mạng lưới các sợi nấm trên trứng. Sự hiện diện của đĩa áp quanh trứng là dấu hiệu trứng này sẽ bị lây nhiễm (Money, 1998). Khi có mặt của protease cùng với chitinase của P. lilacinum làm tan rã lớp vitelline, sự phân tách chitin và lipid của vỏ trứng M. javanica tạo điều kiện vật lý cho sự xâm nhâp (Khan, 2004). Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng phá hủy các thành phần bên trong trứng, lúc này vỏ trứng trở nên rỗng, bào tử tiếp tục sinh trưởng và xâm nhiễm trứng gần đó . 18
  28. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện: 04/2015 – 08/2015 Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc phòng Công nghệ vi sinh (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM) 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu trồng ở Vũng Tàu. Trong đó, có 16 chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và 13 chủng từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.(Bảng 2.1). 2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm Vật liệu Con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne.spp được tách từ sần rễ tiêu và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0.5%) đến khi sử dụng. Dụng cụ Ống nghiệm 5ml, 10ml. Đĩa Petri 5cm, 9cm Pipep các loại Ống đong các loại Thước đo điện tử Nồi nấu môi trường Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc Thiết bị Nồi hấp vô trùng Tủ cấy vô trùng Tủ sấy (300C – 1800C) Tủ ấm Máy đo pH Máy li tâm 19
  29. Đồ án tốt nghiệp Cân phân tích điện tử Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ lạnh Các môi trƣờng và thuốc thử sử dụng Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Potato dextrose agar 39g Nước cất 1000ml pH = 6.1 – 6.5 Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến KH2PO4 1,5 g/l K2HPO4.3H2O 1,4 g/l CaCl2 .2H2O 0,4 g/l MgSO4 .7H2O 0,41 g/l NaCl 0,2 g/l Casein 1% Agar 16 g/l Cách pha casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn ( pha trong 100ml môi trường). Dung dịch đệm Sorensen: hoà tan 5,96g Na2HPO4 trong nước thành 250ml dung dịch Na2HPO4 1/15M. Hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml dung dịch KH2PO4 1/15M. Trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M, đo và chỉnh lại pH 7,6 thành dung dịch đệm sorensen 1/15 M. Thuốc thử Trichloroecetic acid (TCA) 10%: 10g TCA hòa tan với nước cất cho đủ 100ml ( thuốc thử dùng cho khả năng phân giải casein). Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến KH2PO4 1,5 g/l 20
  30. Đồ án tốt nghiệp K2HPO4.3H2O 1,4 g/l NaNO3 3,5g/l CaCl2 .2H2O 0,4 g/l MgSO4 .7H2O 0,41 g/l NaCl 0,2 g/l Chitin huyền phù 1% Agar 16 g/l Chuẩn bị huyền phù chitin 1%: Cân 5g vỏ tôm xay nhuyễn hòa tan trong 50ml dung dịch HCL đậm đặc. Khuấy đều trong 3 phút; sau đó thêm vào đó từ từ nước cất lạnh 50C cho tới 500ml, tạo huyền phù chitin màu trắng sữa. Huyền phù chitin được lọc qua giấy lọc. Rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính (pH=7). Bảo quản huyền phù trong tủ lạnh ( 20C – 60C ) (Dai và ctv, 2011). Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin) Iod tinh thể 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml Nghiền KI trong cối với 5 – 10 ml nước cất. Thêm Iod tinh thể vào và nghiền cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Cho dung dịch nghiền vào cốc đong và thêm nước cất đến 300 ml. Bảo quản trong lọ màu và sử dụng trong 30 ngày (Nguyễn Đức Lượng, 2003) Môi trường Water agar (WA) Nước cất 1000ml Agar 16 g/l Môi trường khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng - Môi trường Water Agar (WA) mềm Nước cất 1000ml Agar 14 g/l 21
  31. Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu STT Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập 1 KL 1.4 2 KL 5.2 3 KL 5.3 4 HT 1.2 5 HT 2.2 6 HT 3.1 Đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh (lá 7 HT 4.1 xanh) 8 HT 4.3 9 HT 5.1 10 HT 6.1 11 HT 6.3 12 HT 7.2 13 HT 7.3 14 KL 1.2 15 KL 1.3 16 KL 3.1 17 KL 4.1 18 KL 5.1 19 KL 6.1 20 KL 6.2 21 KL 8.2 Đất vùng rễ cây tiêu bị bệnh vàng 22 HT 1.1 lá 23 HT 1.3 24 HT 2.1 25 HT 2.3 26 HT 3.2 27 HT 3.3 28 HT 4.2 29 HT 5.2 22
  32. Đồ án tốt nghiệp 2.4 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và chitinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở các hệ sinh thái đất trồng tiêu thuộc tỉnh Vũng Tàu. Nội dung 2: Khảo sát và so sánh khả năng kí sinh khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của một số chủng P. lilacinum đại diện từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe mạnh và bị bệnh ở Vũng Tàu. 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1 Phƣơng pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum - Phƣơng pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trƣờng thạch Nguyên tắc Khi nuôi cấy nấm trên môi trường có chứa cơ chất thích hợp (casein, chitin), nấm P. lilacinum sẽ tiết ra enzyme tương ứng (protease,chitinase). Cơ chất sẽ bị phân giải dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi nhỏ thuốc thử vào, kích thước vòng trong suốt đó phản ánh hoạt động của enzyme (Lê Thị Huệ, 2010). Chuẩn bị Giống: nấm P. lilacinum từ ống giống (bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40C) được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ 280C ± 20C trong 5 – 7 ngày rồi cấy chuyền sang môi trường WA, ủ nhiệt độ 280C ± 20C trong 5 ngày. Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri. Thực hiện Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng, khoan lấy phần thạch có tơ nấm trên môi trường WA sau đó dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme. Mỗi chủng nấm khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường. Dùng parafilm quấn đĩa lại trước khi đưa ra khỏi tủ cấy. Ghi lại tên giống và ngày, giờ cấy để theo dõi. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp Chỉ tiêu theo dõi Đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được đo sau khi nhuộm thuốc thử ở thời điểm 24h, 48 và 72 h nuôi cấy. Đánh giá mức độ phân giải cơ chất của nấm dựa vào hiệu D – d (mm). Hiệu D – d của nấm càng lớn thì khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm đó càng mạnh. - Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease: Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm. Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm. Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm. + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) 5 mm. Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm. Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm. Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm 2.5.2 Phƣơng pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum Chuẩn bị Giống: nấm P. lilacinum từ ống giống (bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40C) được cấy chuyền sang môi trường PDA, ủ ở nhiệt độ 280C ± 20C. Sau 5 – 7 ngày, cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất nhằm hạn chế bị nhiễm trong quá trình theo dõi khi thử khả năng ký sinh. Sau khi rửa sạch, cho chúng vào các đĩa Petri có đặt 1 lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng. Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri. 24
  34. Đồ án tốt nghiệp Thực hiện Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng khoan lấy phần thạch có tơ nấm trên môi trường PDA rồi dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào tâm đĩa môi trường WA mềm. Ngay sau đó, đặt vào mỗi đĩa 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng tại 4 điểm xung quanh và cách khoanh nấm 0.5cm. Mỗi chủng nấm khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm. Ủ ở nhiệt độ phòng (280 – 300 ) theo dõi sự ký sinh của nấm. Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi sự kí sinh sau mỗi 24 giờ đến khi có chủng nấm khảo sát kí sinh hoàn toàn số khối trứng hay con cái ở 1 lần lặp lại. Tính số con cái hay khối trứng bị nấm kí sinh (sợi nấm xâm nhập, sử dụng chất dinh dưỡng của kí chủ tạo thành một cụm sợi nấm mang cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hay con cái). Mức độ ký sinh của tuyến trùng được tính theo phần trăm (%) và chia làm 4 cấp: - Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75% - Ký sinh khá: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trong khoảng 50 -75% - Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50% - Tỷ lệ ký sinh yếu: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh dưới 25% 2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P. lilacinum Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố: các chủng nấm Purpureocillium spp. (29 chủng) và thời gian khảo sát (3 mức thời gian 24, 48, 72 giờ). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi trường cảm ứng enzyme tương ứng. Sau khi lấy chỉ tiêu, tính hiệu D-d bằng chương trình Excel. Phân tích ANOVA hiệu D-d bằng phần mềm SAS 9.0. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05. Thí nghiệm khảo sát khả năng ký sinh của P. lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp. 25
  35. Đồ án tốt nghiệp Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố: các chủng nấm Purpureocillium spp. tối ưu về khả năng tiết enzyme ngoại bào (10 chủng) và thời gian khảo sát (Đối với con cái: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày; còn đối với khối trứng: từ ngày 1 đến ngày thứ 14). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi trường WA mềm. Sau khi lấy chỉ tiêu, tính tỷ lệ ký sinh bằng chương trình Excel. Phân tích ANOVA tỷ lệ ký sinh bằng phần mềm SAS 9.0. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum 3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P. lilacinum Để kiểm tra khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P. lilacinum, tiến hành theo phương pháp mục 2.5.1. Kết quả được ghi nhận trong bảng 3.1, 3.2 và ANOVA (phụ lục). Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh Vòng phân giải casein theo thời gian (D – d ( mm)) Chủng( A) 24h 48h 72h TB(A) KL 1.4 6.910g-j 6.637h-m 9.410a-f 7.652BC KL 5.2 7.413f-j 8.167c-j 6.583h-m 7.388BC KL 5.3 7.480e-j 9.523a-e 11.233a 9.412A HT 1.2 8.030c-j 8.777b-g 4.760lm 7.189BC HT 2.2 6.197j-m 7.013g-k 7.530d-k 6.913CD HT 3.1 7.507d-j 9.600a-d 6.967g-j 8.024BC HT 4.1 6.680g-l 7.413f-j 10.467ab 8.187B HT 4.3 7.077g-j 6.990g-k 6.520h-m 6.862CD HT 5.1 6.713g-l 4.547m 5.860klm 5.707D HT 6.1 5.553klm 7.163g-j 9.533a-e 7.417BC HT 6.3 6.927g-j 8.593b-h 7.570d-k 7.697BC HT 7.2 6.447i-m 6.470i-m 8.480b-i 7.132BC HT 7.3 6.343j-m 7.180g-j 9.820abc 7.781BC TB(B) 6.867B 7.544A 8.056A CV(%)=17.296 F(A)=6.751 F(B)=13.871 F(A*B)=5.876 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Dựa vào bảng 3.1 có thể thấy tất cả 13 chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh đều có khả năng tiết enzyme protease. Tuy nhiên, các chủng nấm P. lilacinum tiết enzyme yếu nhất sau 24h nuôi cấy, 48h và 72h sau đó chúng tiết enzyme tốt hơn nhưng đường kính vòng phân giải cơ chất không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Sự khác nhau về lượng enzyme được tiết ra có sự thay đổi 27
  37. Đồ án tốt nghiệp như vậy là do trong 24h đầu nấm phải thích nghi với môi trường nên khả năng phân giải cơ chất còn thấp. Trong 2 mốc thời gian kế tiếp nấm tiến hành dinh dưỡng và phân giải cơ chất casein mạnh hơn để tận dụng nguồn cơ chất cho việc dinh dưỡng. Khi xét riêng từng chủng, KL5.3 có khả năng tiết enzyme phân hủy casein tốt nhất (đường kính vòng phân giải casein là 9.412 mm), chủng tiết enzyme yếu nhất là HT5.1 (5.707 mm). Khi xét khả năng phân giải casein của các chủng nấm khảo sát theo thời gian, thấy rằng khả năng phân giải cơ chất của các chủng nấm khác nhau là khác nhau. Nhìn chung được chia thành 4 nhóm: Nhóm 1 là nhóm có khả năng phân hủy cơ chất tối ưu ở ngay 24h đầu và giảm dần sau đó (KL5.2, HT4.3); nhóm 2 có sự khác biệt hẳn khi đột ngột giảm khả năng phân giải tại 48h và tăng lên sau đó ở thời điểm 72h (HT5.1); nhóm 3 là nhóm các chủng có khả năng phân giải cơ chất tối ưu ở 48h (HT1.2, HT3.1, HT6.3) và nhóm còn lại là nhóm có đường kính vòng phân giải cơ chất tăng dần sau thời gian khảo sát (KL4.1, Kl5.3, HT2.2, HT4.1, HT6.1, HT7.2, HT7.3). Nhìn chung, chủng KL5.3 có khả năng phân giải casein mạnh nhất tại thời điểm 72h sau cấy, cũng tại thời điểm đó chủng HT4.1 cũng phân giải casein tương đối mạnh. Chủng HT5.1 có khả năng phân giải casein yếu nhất ở 48h sau cấy (4.547 mm). A B C D Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D). 28
  38. Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả ở bảng 3.2, cả 16 chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu của cây tiêu bị bệnh đều có khả năng tiết protease. Thời gian có sự ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tiết enzyme của các chủng, 72h là thời gian mà các chủng có khả năng tiết enzyme mạnh nhất (đường kính vòng phân giải casein trung bình 8.112 mm) và có sự khác biệt rõ ràng so với thời điểm 24h và 48h. Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở 24h và 48h. Ở bảng 3.2, khi xét riêng theo chủng, KL6.2 có khả năng phân giải casein tốt nhất (9.398 mm) và KL1.3 là chủng thể hiện khả năng phân giải casein yếu nhất (5.698 mm). Đồng thời, khi xét theo thời gian 24, 48 và 72h sau cấy, tương tự như nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh được chia thành 3 nhóm (đặc điểm tương tự như đối với nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh): Nhóm 2 bao gồm các chủng: KL54.1, Kl5.2, KL6.2, KL8.2, HT2.3 và HT3.3. Nhóm 3: KL6.1, HT1.1 và HT1.3. Nhóm 4: KL1.2, KL1.3, KL3.1, HT2.1, HT4.2, HT 5.2. Nhìn chung, HT5.2 có khả năng tiết enzyme phân giải casein mạnh nhất tại thời điểm 72h (10.557 mm), tiếp theo là chủng HT2.3. Chủng có khả năng phân giải casein yếu nhất là HT3.2 tại thời điểm 48h sau cấy (4.323 mm). 29
  39. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh Vòng phân giải casein theo thời gian (D - d (mm)) Chủng( A) 24h 48h 72h TB(A) KL 1.2 6.940h-q 7.917e-m 8.173d-l 7.677CDE KL 1.3 5.017rs 5.397p-s 6.680k-r 5.698H KL 3.1 6.643k-r 6.753j-r 8.930a-g 7.442DEF KL 4.1 6.883i-q 5.893o-s 8.213d-l 6.997EFG KL 5.1 8.000e-m 7.247g-o 8.770a-h 8.001CDE KL 6.1 6.953h-q 9.343a-e 6.227m-r 7.508DEF KL 6.2 9.950a-d 8.093e-l 10.150abc 9.398A KL 8.2 6.730j-r 5.130qrs 7.830e-n 6.563FGH HT 1.1 7.993e-m 9.347a-e 7.350f-o 8.230BCD HT 1.3 7.687e-o 10.290ab 7.333f-o 8.437A-D HT 2.1 5.370qrs 6.067n-s 6.790i-r 6.076GH HT 2.3 8.373c-k 7.223g-o 10.363ab 8.653ABC HT 3.2 6.943h-q 4.323s 6.847i-r 6.038GH HT 3.3 8.553b-j 10.370ab 6.950h-q 8.624ABC HT 4.2 6.443l-r 7.807e-n 8.633b-i 7.628C-F HT 5.2 7.767e-n 9.147a-f 10.557a 9.157AB TB(B) 7.265B 7.522B 8.112A CV(%)=14.933 F*A=11.352 F*B=9.054 F AB=4.506 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). A B C Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C). 30
  40. Đồ án tốt nghiệp So sánh khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau Biểu đồ 3.1. Đường kính vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. Nhìn chung, cả hai nhóm nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu được khảo sát có khả năng tiết enzyme protease không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê, do khả năng phân giải casein của các chủng nấm trong cùng 1 nhóm sinh thái đất trồng có mức chênh lệch rất khác nhau (biểu đồ 3.1). Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập Thời gian từ đất vùng rễ tiêu khỏe (%) từ đất vùng rễ tiêu bệnh (%) Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu 24h 0 38.462 61.538 0 6.25 37.5 56.25 0 48h 15.385 53.846 23.077 7.692 31.25 31.25 31.25 6.25 72h 7.692 69.231 23.077 0 18.75 50 31.25 0 Tuy nhiên, dựa vào bảng 3.3 ta có thể thấy rõ ràng mức độ phân giải casein của các chủng nấm được phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng có sự khác nhau theo 31
  41. Đồ án tốt nghiệp từng thời điểm khảo sát. Ở 24h, hầu hết các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có khả năng tiết enzyme ở mức trung bình – khá, trong khi có 6.25% chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh tiết enzyme mạnh và còn lại là trung bình – khá. Ở 48h, các chủng phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng có khả năng phân giải casein trong khoảng từ yếu đến mạnh. Các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe phân hủy cơ chất chủ yếu ở mức độ khá và chiếm 15.385% mạnh, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh có mức độ tiết enzyme mạnh, khá và trung bình tương đương nhau. Tại thời điểm 72h, sự tiết enzyme của các chủng tập trung trong khoảng trung bình đến mạnh và chiếm đa số là ở mức khá, đặc biệt, có 18.75% nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh phân giải casein mạnh. Nhìn chung, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh có khả năng phân giải casein ở mức độ mạnh cao hơn hơn các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe. Giải thích cho sự khác biệt này có thể là do sự tồn tại của các hợp chất có bản chất protein trong đất vùng rễ tiêu bị bệnh . 3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum Tiến hành khảo sát khả năng tiết enzyme chitinase của 29 chủng nấm P. lilacium theo phương pháp khảo sát sơ bộ mục 2.21. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.4 và 3.5. 32
  42. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh Vòng phân giải chitin theo thời gian ((D - d) mm) Chủng( A) 24h 48h 72h TB(A) KL 1.4 1.680rs 3.813h-l 1.037st 2.177F KL 5.2 2.527m-r 4.817fg 0.207st 2.538F KL 5.3 3.877h-k 6.907bc 4,153ghi 4.979B HT 1.2 2.950l-p 6.883bc 2.683m-q 4.172CD HT 2.2 2.843m-q 6.977bc 5.710de 5.177B HT 3.1 3.370i-m 7.183bc 1.783rs 4.112CD HT 4.1 3.113j-o 6.577bcd 1.750rs 3.813D HT 4.3 3.263j-n 6.303cd 2.180p-r 3.916CD HT 5.1 6.300cd 6.937bc 9.150a 7.462A HT 6.1 3.927hij 5.110ef 2.037q-r 3.691DE HT 6.3 3.027k-p 7.377b 2.787m-q 4.397C HT 7.2 2.323l-o 4.520fgh 5.207ef 4.017CD HT 7.3 2.263m-o 5.040efg 2.447n-r 3.250E TB(B) 3.190B 6.034A 3.169B CV(%)=13.237 F* =15.352 F* =105.968 F =4.810 A B AB Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ cây tiêu khỏe có khả năng tiết enzyme chitinase mạnh nhất tại thời điểm 48h sau khi nuôi cấy (đường kính vòng phân giải cơ chất trung bình 6.034 mm). Sự khác biệt về khả năng phân hủy chitin ở thời điểm 24h và 72h không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 3.4). Khi xét riêng theo chủng nấm, HT5.1 tiết enzyme chitinase mạnh nhất (đường kính vòng phân giải cơ chất 7.462 mm), yếu nhất là chủng KL1.4 và KL5.2. Từ bảng 3.4 có thể thấy rằng khả năng phân giải cơ chất của các chủng nấm phân lập từ 33
  43. Đồ án tốt nghiệp đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh có sự khác nhau theo thời gian và có thể chia thành 2 nhóm: Nhóm 1 là nhóm các chủng có đường kính vòng phân giải chitin tăng dần theo thời gian khảo sát (HT5.1 và HT7.2), nhóm các chủng còn lại có khả năng phân giải chitin tối ưu ở 48h và giảm xuống ở 72h. A B Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B). Dựa vào bảng kết quả thống kê bảng 3.5 ta thấy các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ cây tiêu bệnh có khả năng tiết enzyme chitinase tốt nhất sau 48h nuôi cấy (đường kính vòng phân giải cơ chất trung bình 5.534 mm) và yếu nhất sau 72h (1.847 mm). Xét theo từng chủng, HT1.1 phân giải chitin mạnh nhất (4.600 mm), chủng tiết enzyme yếu nhất là KL6.1 và KL6.2. Các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh phân giải chitin không chia theo từng nhóm như các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh, tất cả 16 chủng nấm phân lập từ vùng này đều có khả năng phân giải chitin tối ưu ở 48h. Trong đó, HT1.1 phân giải chitin mạnh nhất (8.213 mm), tiếp theo là các chủng HT4.2, HT2.1 và KL6.2, chủng phân giải chtin yếu nhất là KL6.1 (0.640 mm). 34
  44. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh Vòng phân giải chitin theo thời gian (D - d (mm)) Chủng( A) 24h 48h 72h TB(A) KL 1.2 2.537i-o 5.293cde 1.770p-s 3.200DEF KL 1.3 2.447j-p 5.36b-e 0.883st 2.897EF KL 3.1 3.593ghi 6.097bcd 1.307q-t 3.666BCD KL 4.1 2.557i-o 4.597efg 3.230h-l 3.461CDE KL 5.1 2.327k-q 3.457hij 2.137l-r 2.640F KL 6.1 1.953n-s 5.443b-e 0.640t 2.677F KL 6.2 2.600i-o 6.357bc 1.363p-t 3.440DE KL 8.2 2.677i-o 5.017de 1.977n-s 3.223DEF HT 1.1 3.333h-k 8.213a 2.253k-q 4.600A HT 1.3 3.003h-n 4.710ef 1.800p-s 3.171DEF HT 2.1 3.627f-i 6.170bc 2.753i-o 4.183AB HT 2.3 3.890fgh 5.330b-e 3.557g-j 4.259AB HT 3.2 3.237h-l 5.023de 1.087rst 3.116DEF HT 3.3 2.693i-o 5.577b-e 1.070rst 3.113DEF HT 4.2 3.173h-m 6.413b 2.693i-o 4.093ABC HT 5.2 2.107m-r 5.480b-e 1.027rst 2.871EF TB(B) 2.860B 5.534A 1.847C CV(%)=20.072 F*A=3.157 F*B=174.153 F AB=1.636 Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). 35
  45. Đồ án tốt nghiệp A B Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và 72h (B) So sánh khả năng tiết enzyme chtinase của các chủng nấm P. lilacinum phân lập ở hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau Biểu đồ 3.2. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. Nhìn chung, khả năng phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Do mức độ phân giải chitin của các chủng nấm trong cùng một nhóm có sự khác biệt rất lớn (biểu đồ 3.2). 36
  46. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập từ Mức độ tiết enzyme của nấm phân lập từ Thời gian đất vùng rễ tiêu khỏe (%) đất vùng rễ tiêu bị bệnh (%) Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu 24h 7.692 0 46.154 46.154 0 0 43.75 56.25 48h 76.923 15.385 7.692 0 81.25 12.5 6.25 0 72h 23.077 7.692 0 69.231 0 0 12.5 87.5 Mức độ phân giải chitin của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất đất trồng khác nhau là khác nhau theo thời gian. Ở 24h đầu, tất cả các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh phân hủy chitin ở mức trung bình yếu. Tương tự, nhưng các chủng nấm phân lập đất vùng rễ tiêu khỏe ngoài mức trung bình và yếu thì có 7.692 % chủng phân hủy chitin mạnh. Ở 48h, hầu hết các chủng có mức phân hủy chitin từ trung bình đến mạnh nhưng chiếm đa số là mạnh. Ở 72h, các chủng phân hủy chitin ở mức yếu là chính, nhưng đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có 23.077% chủng tiết enzyme mạnh. Qua thời gian khảo sát khả năng tiết enzyme chitinase, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có số chủng phân hủy chitin ở mức độ mạnh nhiều hơn so với nhóm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Tuyển chọn các chủng nấm có khả năng tiết enzyme ngoại bào tốt Tiêu chí chọn chủng: Các chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào hoặc protease mạnh nhất hoặc chitin mạnh nhất hoặc cả 2 loại enzyme ngoại bào đều mạnh. Đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh, chọn ra 5 chủng KL5.3, HT1.2, HT3.1, HT5.1, HT6.3. Còn đối với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe, thì các chủng được chọn là KL6.2, HT1.1, HT2.3, HT3.3, HT5.2. Vậy, có tất cả 10 chủng nấm tối ưu về khả năng tiết enzyme ngoại bào được chọn. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp. 3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. Dựa vào bảng 3.7, thấy các chủng nấm ký sinh trên con cái Meloidogyne với tỷ lệ trên 90% sau 4 ngày, hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Eapen và ctv (2005). Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo thời gian Tỷ lệ ký sinh STT Chủng NGÀY 1 NGÀY 2 NGÀY 3 NGÀY 4 1 KL 5.3 43.33bcd 75.67c 82.00cd 86.33cd 2 HT1.2 54.00a 84.33a 90.67ab 94.33ab 3 HT3.1 52.33ab 84.00a 94.67a 96.67a 4 HT5.1 52.33ab 82.00ab 88.33abc 91.00a-d 5 HT6.3 47.33a-d 76.67b 85.00bcd 88.33bcd 6 KL6.2 41.00d 72.00c 79.33d 85.33d 7 HT1.1 53.00ab 82.33a 87.67abc 92.00a-d 8 HT2.3 51.00abc 85.00a 93.33a 95.67a 9 HT3.3 46.00bcd 82.00ab 89.67ab 92.67abc 10 HT5.2 53.33ab 83.00a 89.33ab 92.67abc CV (%) 9,253 3,983 4,763 4,632 F 64,181* 57.070* 68.296* 43,352* Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). Khi quan sát dưới kính soi nổi Olympus (4X), sau 1 ngày sợi nấm P. lilacinum đã tiếp xúc với con cái trên bề mặt môi trường. Trong đó, sợi nấm chủng HT1.2 có khả năng bao quanh con cái tuyến trùng nhanh nhất, chủng yếu nhất là chủng KL6.2. Sau đó, vào ngày thứ 2, sợi nấm bắt đầu phủ khắp cơ thể con cái một cách nhanh chóng. Hầu hết các chủng đều có khả năng ký sinh rất tốt. Chủng có khả năng ký 38
  48. Đồ án tốt nghiệp sinh kém nhất là chủng KL5.3 và KL6.2 (cùng mức phân hạng c). Ngày thứ 3, các sợi nấm bao quanh con cái dày hơn ( Hình3.1.B) và hầu hết các chủng nấm đều ký sinh con cái ở mức độ mạnh. Và khả năng ký sinh của các chủng nấm tăng hơn ở ngày thứ 4 trong đó chủng có tỷ lệ ký sinh tốt nhất là HT3.1 và HT1.1 (cùng mức phân hạng a). KL6.1 có tỷ lệ ký sinh thấp nhất (mức phân hạng d). Nấm P. lilacinum ký sinh con cái tuyến trùng mạnh bởi vì các sợi nấm có thể xâm nhập vào qua các lỗ mở tự nhiên trên cơ thể như hậu môn, âm đạo (Jatala, 1986). Tuy nhiên, theo như báo cáo sau đó của Holland và ctv (1999), Khan và ctv (2006) cơ thể con cái bị sợi nấm xâm nhiễm trực tiếp do sự vắng mặt của các liên kết của lớp chitin trên cơ thể con cái. Khan và ctv (2006) giải thích về sự khác biệt đó là do thành phần enzyme khác nhau của mỗi chủng giúp cho việc thâm nhập trực tiếp vào cơ thể con cái. A B C Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C). Khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. của cả hai nhóm nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau hoàn toàn không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (biểu đồ 3.3) do khả năng ký sinh không đồng đều giữa các chủng trong cùng một vùng. Từ đó có thể thấy việc ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập. Ở bảng 3.8, mức độ ký sinh của nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe ngày đầu tiên hầu hết ở mức trung bình và khá, còn đối với nhóm nấm còn lại có mức độ ký sinh tuyến trùng từ khá đến mạnh. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp Đến ngày thứ 2, có sự thay đổi khi 100% số chủng của nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe đạt mức ký sinh mạnh, nhóm nấm phân lập từ vùng rễ tiêu bị bệnh chỉ 80% chủng có mức ký sinh mạnh. Ngày thứ 3 và 4 các chủng của cả hai nhóm đều cho khả năng ký sinh mạnh đạt 100%. Sự khác nhau về khả năng ký sinh của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau trong ngày đầu tiên là do các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh thích nghi với môi trường, nơi có mật độ tuyến trùng tồn tại nhiều hơn, nên khả năng ký sinh cũng mạnh hơn. Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất Thời gian vùng rễ tiêu khỏe (%) vùng rễ tiêu bệnh (%) Mạnh Khá Trung bình Yếu. Mạnh Khá Trung bình Yếu. NGÀY 1 0 60 40 0 60 40 0 0 NGÀY 2 100 0 0 0 80 20 0 0 NGÀY 3 100 0 0 0 100 0 0 0 NGÀY 4 100 0 0 0 100 0 0 0 40
  50. Đồ án tốt nghiệp 3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. Tiến hành chọn các chủng nấm P. lilacinum có khả năng tiết enzyme ngoại bào mạnh trong 29 chủng, rồi thử khả năng ký sinh của chúng lên khối trứng của tuyến trùng Meloidogyne spp. theo phương pháp mục 2.5.2. Kết quả hiển thị trong bảng 3.9, 3.10 và biểu đồ 3.6. Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp. theo thời gian Tỷ lệ ký sinh (%) STT Chủng nấm NGÀY 1 NGÀY 2 NGÀY 3 NGÀY 4 NGÀY 5 NGÀY 6 NGÀY 7 NGÀY 8 NGÀY 9 NGÀY 10 NGÀY 11 NGÀY 12 NGÀY 13 NGÀY 14 1 KL5.3 3.33b 4.33b 6.00b 7.67b 10.00b 12.33b 13.33b 14.67b 17.33c 19.67c 23.00c 24.67c 25.67c 27.00c 2 HT1.2 9.33b 12.67b 17.00ab 20.33ab 23.00ab 26.00ab 30.00ab 33.00ab 44.00ab 49.67ab 53.67ab 55.00ab 56.00ab 57.67ab 3 HT3.1 11.00ab 14.00ab 13.33b 16.00b 18.33b 20.67b 22.33b 24.00b 28.67bc 36.67bc 41.00abc 44.67abc 47.33bc 48.67bc 4 HT5.1 23.33 a 29.00a 33.33a 38.33a 44.00a 50.00a 54.00a 60.00a 67.67a 72.00a 76.00a 79.33a 82.00a 83.67a 5 HT6.3 2.67b 4.33b 5.00b 6.67b 8.00b 9.67b 11.33b 12.33b 17.00c 20.33c 23.00c 25.00c 26.33c 26.67c 6 KL6.2 4.00b 5.67b 8.67b 10.67b 12.67b 14.67b 17.67b 21.00b 24.33bc 35.00bc 37.33bc 39.67bc 41.33bc 43.00bc 7 HT1.1 2.00b 4.00b 5.33b 7.33b 8.67b 10.00b 12.67b 15.00b 23.67bc 28.00bc 32.33bc 34.33bc 36.00bc 37.67bc 8 HT2.3 6.33b 8.33b 10.67b 13.67b 16.33b 19.67b 23.33b 28.00b 33.67bc 37.33abc 40.67bc 43.67bc 48.67abc 50.33abc 9 HT3.3 2.67b 4.00b 7.00b 9.33b 11.33b 13.33b 17.00b 19.00b 27.00bc 33.00bc 35.00bc 37.33bc 39.00bc 41.00bc 10 HT5.2 2.33b 3.67b 5.33b 7.00b 8.00b 9.00b 9.67b 11.67b 21.00bc 23.67bc 26.00bc 27.67bc 29.00bc 31.00bc CV (%) 47.928 46.291 39.557 36.546 39.557 34.939 33.293 31.888 26.463 25.717 23.529 22.171 21.212 20.41 F 3.328* 3.663* 3.87* 3.925* 3.870* 4.593* 4.755* 5.161* 4.966* 4.727* 4.553* 4.488* 4.592* 4.520* Ghi chú: Trong cùng một nhóm giá trị trung bình, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (ns);* khác biệt có ý nghĩa (mức α = 0,05); khác biệt rất có ý nghĩa (mức α = 0,01). 41
  51. Đồ án tốt nghiệp Nhìn chung, tất cả 10 chủng được chọn đều có khả năng ký sinh trên khối trứng Meloidogyne spp. và thử nghiệm ký sinh diễn ra trong 14 ngày. Trong 5 ngày đầu tiên, sợi nấm chỉ mới bắt đầu tiếp xúc với bề mặt khối trứng chứ chưa đâm xuyên vào chúng. Dựa vào bảng 3.9, các chủng thuộc nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ cây khỏe có khả năng ký sinh tương đối tốt hơn các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Theo đó, trong 6 ngày đầu chủng HT5.1 có tỷ lệ ký sinh đạt cao nhất khoảng 50%, tiếp theo là chủng HT1.2, đa số các chủng còn lại ký sinh yếu. Ở ngày thứ 7 và thứ 8 kết quả cũng tương tự như vậy. Vào ngày thứ 9, chủng HT 5.1 vẫn duy trì khả năng ký sinh tốt nhất (50 – 75%); ngoài ra, còn có thêm chủng HT2.1, HT2.3 và HT3.3 có mức độ xâm nhiễm tuyến trùng trong khoảng 25 - 50%. Kết quả tương tự cho đến ngày thứ 11, HT5.1 có khả năng ký sinh khối trứng mạnh nhất, tỷ lệ xâm nhiễm lớn hơn 75%. Ở ba ngày cuối, chỉ duy nhất HT 5.1 có khả năng ký sinh khối trứng mạnh, còn lại hầu hết ở mức trung bình và ở mức độ khá là chủng HT1.2 và HT2.3. Có thể thấy rằng, việc ký sinh lên khối trứng tuyến trùng của các chủng phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase mạnh, trong đó chủng HT5.1 có khả năng tiết chitinase mạnh và tỷ lệ ký sinh đạt 83,67% ở ngày thứ 14 A B C Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne sp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 ngày (C). 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Nhìn chung, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe có khả năng ký sinh khối trứng cao hơn so với nhóm nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh ở tất cả các khoảng thời gian khảo sát, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê do khả năng ký sinh khối trứng của các chủng nấm trong cùng một vùng không đồng đều. Điều này được thể hiện trong biểu đồ 3.4 và bảng 3.10. Theo bảng 3.10, trong 7 ngày đầu tiên các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh chỉ đạt mức độ ký sinh yếu trên khối trứng tuyến trùng, trong khi các chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe duy trì khả năng ký sinh yếu - trung bình đến hết ngày thứ 5 nhưng sang ngày thứ 6, 7, 8 có 20% số chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe đạt mức ký sinh khá. Trong 4 ngày cuối có sự thay đổi đáng kể, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh ký sinh khối trứng tuyến trùng chỉ ở mức độ trung bình là chủ yếu. Trong khi các chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe ký sinh tuyến trùng ở mức độ từ trung bình đến mạnh (20% chủng ký sinh ở mức độ mạnh). Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. 43
  53. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất vùng rễ Mức độ ký sinh của nấm phân lập từ đất vùng Thời gian tiêu khỏe (%) rễ tiêu bệnh (%) Mạnh Khá Trung bình Yếu Mạnh Khá Trung bình Yếu Ngày 1 0 0 0 100 0 0 0 100 Ngày 2 0 0 20 80 0 0 0 100 Ngày 3 0 0 20 80 0 0 0 100 Ngày 4 0 0 20 80 0 0 0 100 Ngày 5 0 0 20 80 0 0 0 100 Ngày 6 0 20 20 60 0 0 0 100 Ngày 7 0 20 20 60 0 0 0 100 Ngày 8 0 20 20 60 0 0 20 80 Ngày 9 0 20 40 40 0 0 40 60 Ngày 10 0 20 40 40 0 0 80 20 Ngày 11 20 20 20 40 0 0 100 0 Ngày 12 20 20 40 20 0 0 100 0 Ngày 13 20 20 60 0 0 0 100 0 Ngày 14 20 20 60 0 0 20 80 0 Vậy, khả năng ký sinh khối trứng hay con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum không phụ thuộc vào nguồn gốc phân lập (hay hệ sinh thái đất mà chúng tồn tại). Trong nghiên cứu này, việc ký sinh tuyến trùng phụ thuộc vào hệ enzyme ngoại bào mà chúng tiết ra môi trường, chủng nấm tiết đồng thời enzyme protease và chitinase mạnh thì có khả năng xâm nhập tuyến trùng mạnh. Tuy nhiên, kết luận chỉ trong nội bộ của nghiên cứu với nhân lực và thiết bị chưa đầy đủ nên cần phải có nhiều nghiên cứu nữa bởi vì sự ký sinh tuyến trùng là một quá trình phức tạp. 44
  54. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Các chủng nấm P. lilacinum (29 chủng) được phân lập từ 2 vùng đất xung quanh rễ tiêu có lá xanh tốt (cây khỏe) và vùng đất rễ tiêu có lá bị vàng, kém phát triển (cây bệnh) đều có khả năng tiết enzyme ngoại bào (protease và chitinase) trên môi trường cảm ứng enzyme. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau. Các chủng có khả năng tiết enzyme protease mạnh là KL5.3, KL6.2, HT1.2, HT2.3, HT3.3, HT3.1 và chitinase mạnh là KL5.3, HT1.1, HT2.1, HT2.2, HT2.3 và HT5.1. Trong đó, các chủng: KL5.3, HT1.2, HT2.2, HT3.1 và HT5.1 phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe, còn lại là các chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau đều có khả năng tiết enzyme protease tốt hơn chitinase. Các chủng được tuyển chọn từ 2 nhóm nấm phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau đều có khả năng ký sinh con cái Meloidogyne spp. nhanh và mạnh hơn so với ký sinh khối trứng. Việc ký sinh tuyến trùng mạnh hay yếu cũng không phụ thuộc vào nguồn gốc vùng phân lập mẫu mà phụ thuộc vào khả năng tiết enzyme ngoại bào, chủng có khả năng tiết đồng thời enzyme ngoại bào protease và chitinase phân hủy cơ chất mạnh là chủng có thể ký sinh tuyến trùng mạnh. Chủng HT5.1 có khả năng kí sinh khối trứng mạnh và 2 chủng HT3.3 và 2.3 có khả năng lý sinh con cái mạnh. 4.2. Kiến nghị Phương pháp định tính enzyme ngoại bào thường không chính xác, do đó sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Cần phải tiến hành định lượng enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum, nhằm chọn lựa và xác định chính xác khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum. Khảo sát khả năng ký sinh của các chủng nấm P. lilacinum trên sần rễ, góp phần thực tế hóa tác động ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng trong môi trường tự nhiên. Và phải thực hiện cắt lát cơ thể tuyến trùng hay khối trứng để xác định sự xâm nhập của sợi nấm bên trong cơ thể chúng. 45
  55. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Ngọc Châu (2003), Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 2. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh (2000), Động vật chí Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 3. Hoàng Ngọc Duyên, 2010. Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng Meloidogyne spp.gây hại cây hồ tiêu tại Đak Nông. Luận văn thạc sĩ sinh học chuyên ngành sinh học thực nghiệm. Trường Đại học Tây Nguyên. 4. Vũ Thị Mỹ Linh, 2009. Khảo sát tác động của một số dịch chiết compost lên tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu ở điều kiện invitro. Đồ án tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học. Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM 5. Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học. Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Lê Thị Huệ, 2010. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ một số chủng nấm sợi thuộc Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng. Luận văn thạc sỹ sinh học chuyên ngành vi sinh vật. Trường Đại học Sư phạm.Thành phố Hồ Chí Minh. 7. Nguyễn Đức Lượng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2. NXB ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh. 8. Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Vũ Triệu Mẫn (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương, Đại học Nông Nghiệp I, Hà Nội Nghiệp I Hà Nội 10. Phan Quôc Sủng (1987), “Tìm hiểu về kỹ thuật trồng và chăm sóc cây tiêu”, Thông tin cà phê - ca cao, tr 23-29. 46
  56. Đồ án tốt nghiệp 11. Phan Quôc Sủng (1988a), Kinh nghiệm trồng và chăm sóc cây tiêu, Nhà xuât bản nông nghiệp, 35 trang. 12. Phan Quôc Sủng, Đào Thị Lan Hoa, Trân Kim Loang (2000), “Báo cáo. Thành phân sâu bệnh hại tiêu ở vùng Đông Nam Bộ và Tây Nguyên”, Báo cáo khoa học hàng năm, Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây Nguyên, 25 trang. 13. Nguyễn Vũ Thanh (1983), “Giun tròn ký sinh thực vật ở cây hồ tiêu tỉnh Bình Trị Thiên”, Tạp chí khoa học và kỹ thuật nông nghiệp tháng 4/1983, (250), tr 164-166. 14. Lê Ngọc Tú và các tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2). NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15. Trần Thị Nhã Uyên, 2010. Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn thạc sỹ sinh học chuyên ngành vi sinh vật. Trường Đại học Sư phạm.Thành phố Hồ Chí Minh. 16. Võ Thị Bích Vân, 2010. Nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn thạc sỹ sinh học chuyên ngành vi sinh vật. Trường Đại học Sư phạm.Thành phố Hồ Chí Minh. 17. Nguyễn Bảo Vệ, Trần Văn Hâu và Lê Thanh Phong. 2005. Giáo trình cây đa niên. Phần II, Cây công nghiệp Tài liệu tiếng anh 18. Anderson T. H, Domsch K. H., Gams W., 1995. Compendium of Soil Fungi. Lubrecht & Cramer Ltd. 19. Bird, A.F. & McClure, M.A. (1976). “The tylenchid (Nematoda) egg shell: structure, composition and permeability”. Parasitology, 72 (1), 19-28. 20. Bird, A. F. 1984. Nematoda. Pp. 212-233 inJ. Bereiter-Hahn, A. G. Matoltsy, and K. S. Richardo, eds. Biology of the integument, vol. 1. Invertebrates. New York: Springer-Verlag. 47
  57. Đồ án tốt nghiệp 21. Brian Kerry, 1980.” Biocontrol Fungal Parasites Of Female Cyst Nematodes”, Journal of Nematology, v. 12, no, 4. P 253 – 259. 22. G. Morgan – Jones, J.F. White, R. Rodriguez – Kaba (1984), “Fungal parasites of Meloidogyne incognita in an Alabama soybean fiels soil”, Department of Botany, plant Pathology, and Microbiology, Auburn University, Alabama Agricultural Experiment Station, Auburn, Alabama 36849, U.S.A – Nematropica, v. 14, no.1, p. 93-96. 23. Bonants P. J. M., Fitters P. F. L., Thijs H., den Belder E., Waalwijk C., Henfling J. W. D. M., 1995. A basic serine protease from Paecilomyces lilacinus with biological activity against Meloidogyne hapla eggs. Microbiology 141 (Pt 4): 775–84. 24. B. Ownley Gintin, G. Morgan-Jones, R. Rodríguez-Kábana (1983), “Fungi associated with several developmental stages of Heterodera glycines from an Alabama soybean field soil”, Nematrolica 13, p. 181-200. 25. De-hui Dai et al. (2011). “Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp. Hu1”. African Journal of Biotechnology, 10 (13), 2476-2485. 26. Eapen, S.J., B. Beena and K.V. Ramana, 2005. Tropical soil microflora of spice-based cropping systems as potential antagonists of rootknot nematodes. J. Invertebr Pathol., 88: 218–225 27. Fiedler Ż., Sosnowska D., 2007. Nematophagous fungus Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson is also a biological agent for control of greenhouse insects and mite pests. BioControl 52 (4): 547–8. 28. Filippe, Fabio, Hugo, Jackson, Lucas, José, 2011. In vitro larvicidal action of Paecilomyces marquandii crude extract. African Journal of Microbiology Research Vol. 5(21), pp. 3515-3519. 29. Gradisar H, Jozica F, Krizaj I, Roman, J (2005). Similarities and Specificities of Fungal 48
  58. Đồ án tốt nghiệp 30. Inglis P. W., Tigano M. S 2006. Identification and taxonomy of some entomopathogenic Paecilomyces spp. (Ascomycota) isolates using rDNA- ITS Sequences. Enetics and Molecular Biology 29 (1): 132–6. 31. Jatala P., Kaltenbach R., Bocangel M., 1979. Biological control of Meloidogyne incognita acrita and Globodera pallida on potatoes. Journal of Nematology 11: 303. 32. Khan A., Williams K. L., and Nevalainen H. K. M., 2004. Effects of Paecilomyces lilacinus protease and chitinase on the eggshell structures and hatching of Meloidogyne javanicajuveniles. Biological Control 31 (3): 346– 52. 33. Khan A., Williams K., Nevalainen H., 2003. Testing the nematophagous bioloigcal control strain Paecilomyces lilacinus 251 for paecilotoxin production. FEMS Microbiology Letters 227 (1): 107–11. 34. Keratinolytic Proteases: Comparison of Keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to Some Known Proteases. App. Environ. Microbiol., 71: 3420-3426. 35. Lopez-Llorca, L.V., Robertson, W.M., 1992b. Ultrastructure of infection of cyst nematode eggs by the nematophagous fungus Verticillium suchlasporium. Nematologica 39, 65–74. 36. Luangsa-Ard J, Houbraken J, van Doorn T, Hong SB, Borman AM, Hywel- Jones NL, Samson RA. (2011). "Purpureocillium, a new genus for the medically important Paecilomyces lilacinus". FEMS Microbiology Letters 321 (2): 141–9. 37. Malcolm C. Shurtleff, Charles W. Averre III (2000), Diagnosinh plant diseases caused by nematodes, The American Phytopathologycal Society, 187p. 38. Marti G. A., Lastra C. C., Pelizza S. A., García J. J., 2006. Isolation of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson (Ascomycota: Hypocreales) from the 49
  59. Đồ án tốt nghiệp Chagas disease vector, Triatoma infestans Klug (Hemiptera: Reduviidae) in an endemic area in Argentina. Mycopathologia162 (5): 369–72. 39. Money NP. (1998). Molecular genetics of host-specific toxins in plant disease. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. pp. 261–71. 40. Nguyen Van Nam, In-Jea Oh, Young-Ju Kim, Kil-Young Kim, Young- Cheol Kim, Ro-Dong Park (2009), “Purification and characterization of chitinases from Meloidogyne incognita egg-parasitic fungus Paecilomyces variotii DG-3”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 36, p. 195-203. 41. Nguyen Van Nam, Ro-Dong Park (2009), The role of Fungal Chitinases in Biological control of Plant root-knot nematode Meloidogyne incognita on Cucumber, Doctor of Philosophy Dissertation, Graduate school Chonnam National University. 42. Park J-O., Hargreaves J. R., McConville E. J., Stirling G. R., Ghisalberti E. L., 2004. Production of leucinostatins and nematicidal activity of Australian isolates of Paecilomyces lilacinus(Thom) Samson. Letters in Applied Microbiology 38: 271–6. 43. Thom C., 1910. Bulletin of the Bureau of Animal Industry US Department of Agriculture. 44. (Thom) Samson. 1974. Paecilomyces lilacinus . MycoBank. International Mycological Association. 45. Ramana, K. V, Mohandas, C. (1987), “Plant parasitic nematodes associated with Black pepper (Piper nigrum L.) in Kerala”, Indian Journal of Nematology (India), v. 17, p. 62-66. 46. Ramana, K. V., Mohandas, C. & Balakrishnan, R. (1987), “Role of plant parasitic nematodes in the slow wilt disease complex of Black pepper (Piper nigrum L.) in Kerala”, Indian Journal of Nematology (India), v. 17, p. 225- 230. 50
  60. Đồ án tốt nghiệp 47. Reddigari, S. R., Jansma, P. L., Premachandran, D., and Hussey, R. S. (1986), “Cuticular Collagenous Proteins of Second-stage Juveniles and Adult Females of Meloidogyne incognita: Isolation and Partial Characterization”, Journal of Nematology, Volume 18, No. 3. 48. Rombach M. C., Aguda R. M., Shepard B. M., Roberts D. W., 1986. Infection of rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae), by field application of entomopathogenic hyphomycetes (Deuteromycotina). Environmental Entomology 15 (5): 1070–3. 49. Samson RA. (1974). "Paecilomyces and some allied hyphomycetes". Studies in Mycology (Baarn: Centralbureau voor Schimmelcultures) 6: 58. 50. Samson, R.A., 1975. Paecilomyces and some Allied Hyphomycetes:Studies in Mycology, Vol. 6, pp: 1–119 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands 51. Sung G. H., Hywel-Jones N. L., Sung J. M., Luangsa-ard J. J., Shrestha B, Spatafora JW., 2007. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology 57 (1): 5–59. 52. Tigrano-Milani MS, Carneiro RG, de Faria MR, Frazão HS, McCoy CW. (1995). "Isozyme characterization and pathogenicity of Paecilomyces fumosoroseus and P. lilacinus to Diabrotica speciosa (Coleoptera: Chrysomelidae) and Meloidogyne javanica (Nematoda: Tylenchidae)". Biological Control 5 (3): 378–82. 53. Wharton, D. (1980). “Nematode eggshells”. Parasitology, 81, 447-463. Tài liệu từ Internet 54. 55. u.ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm 56. cuamot-so-chung-nam-soi-phan-lap-tu-rung-ngap-man-can-gio-29913/ 57. 51
  61. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng khác nhau. Phụ lục 1.1. Khả năng tiết enzyme ngoại bào protease Bảng số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein của 29 chủng khảo sát Đường kính vòng phân giải casein ( D - d ) 24h 48h 72h STT Chủng LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 1 KL 1.2 5.69 7.8 7.33 7.99 8.08 7.68 8.12 7.7 8.7 2 KL 1.3 3.92 5.12 6.01 5.6 5.84 4.75 6.28 7.02 6.74 3 KL 1.4 7.02 7.61 6.1 7.31 6.35 6.25 9.62 9.5 9.11 4 KL 3.1 6.92 5.41 7.6 7.97 6.4 5.89 7.9 9.29 9.6 5 KL 4.1 6.57 6.76 7.32 4.9 6.19 6.59 7.85 8.21 8.58 6 KL 5.1 8.36 7.58 8.06 6.91 8.09 6.74 8.42 9.48 8.41 7 KL 5.2 7.21 7.85 7.18 8.64 8.17 7.69 3.94 3.62 3.78 8 KL 5.3 7.9 7.18 7.36 8.98 10.05 9.54 12.82 12.03 8.85 9 KL 6.1 4.95 8.51 7.4 8.28 10.15 9.6 5.67 6.91 6.1 10 KL 6.2 10.92 10.17 8.76 6.35 8.49 9.44 10.36 10.86 9.23 11 KL 8.2 6.57 7.3 6.32 2.87 5.9 6.62 7.29 6.54 9.66 12 HT 1.1 7.9 7.56 8.52 8.28 9.36 10.4 7.59 6.52 7.94 13 HT 1.2 8.12 8.06 7.91 9.35 8.2 8.78 6.31 3.72 4.25 14 HT 1.3 7.69 8.23 7.14 10.99 10.36 9.52 7.21 5.43 9.36 15 HT 2.1 6.68 3.95 5.48 5.25 6.77 6.18 7.18 6.86 6.33 16 HT 2.2 5.77 6.17 6.65 7.4 5.87 7.77 8.19 8.27 6.13 17 HT 2.3 8.4 8.06 8.66 7.5 7.02 7.15 10.38 10.69 10.02 18 HT 3.1 7.9 6.9 7.72 9.17 10.47 9.16 7.52 5.36 8.02 19 HT 3.2 6.89 6.77 7.17 4.1 4.37 4.64 4.47 4.5 4.53 20 HT 3.3 10.07 8.41 7.18 11.33 10.21 9.57 7.54 7.06 6.25 21 HT 4.1 6.09 7.24 6.71 7.88 7.37 6.99 0.83 10.24 10.33 22 HT 4.2 6.98 5.67 6.68 7.05 7.65 8.72 9.17 9.84 6.89 23 HT 4.3 6.96 6.96 7.31 8.61 7.08 5.28 6.01 5.7 7.85 24 HT 5.1 6.88 7.15 6.11 3.99 3.7 5.95 4.47 6.12 6.99 25 HT 5.2 8.22 7.07 8.01 8.84 8.95 9.65 8.2 12.18 11.29 26 HT 6.1 5.88 6.19 4.59 7.82 7.41 6.26 9.23 9.72 9.65 27 HT 6.3 8.36 6.1 5.82 8.28 8.94 8.56 7.35 7.25 8.11 28 HT 7.2 6.94 5.75 5.91 7.65 8.52 3.24 8.14 9.13 8.17 29 HT 7.3 5.61 6.23 5.17 6.65 6.22 8.67 11.22 10.4 7.84 Kết quả phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS 9.0 khả năng tiết enzyme protease các chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe A 13 1 10 11 12 13 2 3 4 5 6 7 8 9 B 3 1 2 3 Number of Observations Read 117 Number of Observations Used 117 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F 1
  62. Đồ án tốt nghiệp Model 38 247.6254120 6.5164582 3.88 F A 12 78.8499675 6.5708306 3.92 0.0001 B 2 27.7419607 13.8709803 8.27 0.0006 A*B 24 141.0334838 5.8763952 3.50 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 1.677976 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 1.2157 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 9.4122 9 3 B 8.1867 9 7 B C B 8.0244 9 6 C B C B 7.7811 9 13 C B C B 7.6967 9 11 C B C B 7.6522 9 1 C B C B 7.4167 9 10 C B C B 7.3878 9 2 C B C B 7.1889 9 4 C B C B 7.1322 9 12 C C D 6.9133 9 5 C D C D 6.8622 9 8 D D 5.7067 9 9 t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 1.677976 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 0.584 2
  63. Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 8.0564 39 3 A A 7.5441 39 2 B 6.8674 39 1 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 1.677976 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 2.1056 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 11.233 3 A3B3 A B A 10.467 3 A7B3 B A B A C 9.820 3 A13B3 B A C B D A C 9.600 3 A6B2 B D A C E B D A C 9.533 3 A10B3 E B D A C E B D A C 9.523 3 A3B2 E B D A C E B D A C F 9.410 3 A1B3 E B D C F E B D G C F 8.777 3 A4B2 E B D G C F E B D G H C F 8.593 3 A11B2 E B D G H C F E B D I G H C F 8.480 3 A12B3 E D I G H C F E J D I G H C F 8.167 3 A2B2 E J D I G H C F E J D I G H C F 8.030 3 A4B1 E J D I G H F E J D I G H K F 7.570 3 A11B3 E J D I G H K F E J D I G H K F 7.530 3 A5B3 E J D I G H K F E J D I G H K F 7.507 3 A6B1 E J I G H K F E J I G H K F 7.480 3 A3B1 J I G H K F J I G H K F 7.413 3 A7B2 J I G H K F J I G H K F 7.413 3 A2B1 J I G H K J I G H K 7.180 3 A13B2 J I G H K J I G H K 7.163 3 A10B2 J I G H K J I G H K 7.077 3 A8B1 J I G H K J I G H K 7.013 3 A5B2 J I G H K J I G H K 6.990 3 A8B2 3
  64. Đồ án tốt nghiệp J I G H K J I G H K 6.967 3 A6B3 J I G H K J I G H K 6.927 3 A11B1 J I G H K J I G H K 6.910 3 A1B1 J I G H K J L I G H K 6.713 3 A9B1 J L I G H K J L I G H K 6.680 3 A7B1 J L I H K J L I M H K 6.637 3 A1B2 J L I M H K J L I M H K 6.583 3 A2B3 J L I M H K J L I M H K 6.520 3 A8B3 J L I M K J L I M K 6.470 3 A12B2 J L I M K J L I M K 6.447 3 A12B1 J L M K J L M K 6.343 3 A13B1 J L M K J L M K 6.197 3 A5B1 L M K L M K 5.860 3 A9B3 L M K L M K 5.553 3 A10B1 L M L M 4.760 3 A4B3 M M 4.547 3 A9B2 Kết quả phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS 9.0 khả năng tiết enzyme protease các chủng phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.721773 14.93281 1.139840 7.633125 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 15 170.2772937 11.3518196 8.74 <.0001 B 2 18.1071875 9.0535938 6.97 0.0015 A*B 30 135.1800792 4.5060026 3.47 <.0001 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 96 Error Mean Square 1.299235 Critical Value of t 1.98498 Least Significant Difference 1.0666 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 9.3978 9 7 A B A 9.1567 9 16 B A B A C 8.6533 9 12 B A C B A C 8.6244 9 14 4
  65. Đồ án tốt nghiệp B A C B D A C 8.4367 9 10 B D C B D C 8.2300 9 9 D C D E C 8.0056 9 5 D E C D E C 7.6767 9 1 D E C F D E C 7.6278 9 15 F D E F D E 7.5078 9 6 F D E F D E 7.4422 9 3 F E F E G 6.9967 9 4 F G F H G 6.5633 9 8 H G H G 6.0756 9 11 H G H G 6.0378 9 13 H H 5.6978 9 2 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 96 Error Mean Square 1.299235 Critical Value of t 1.98498 Least Significant Difference 0.4618 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 8.1123 48 3 B 7.5217 48 2 B B 7.2654 48 1 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 96 Error Mean Square 1.299235 Critical Value of t 1.98498 Least Significant Difference 1.8474 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N AB A 10.5567 3 A16B3 A B A 10.3700 3 A14B2 B A B A 10.3633 3 A12B3 B A B A 10.2900 3 A10B2 B A B A C 10.1500 3 A7B3 B A C B D A C 9.9500 3 A7B1 B D A C E B D A C 9.3467 3 A9B2 E B D A C 5
  66. Đồ án tốt nghiệp E B D A C 9.3433 3 A6B2 E B D A C E B D A C F 9.1467 3 A16B2 E B D A C F E B D A G C F 8.9300 3 A3B3 E B D A G C F E B D H A G C F 8.7700 3 A5B3 E B D H G C F E B D H I G C F 8.6333 3 A15B3 E B D H I G C F E B J D H I G C F 8.5533 3 A14B1 E J D H I G C F E K J D H I G C F 8.3733 3 A12B1 E K J D H I G F E K J D H I G L F 8.2133 3 A4B3 E K J D H I G L F E K J D H I G L F 8.1733 3 A1B3 E K J H I G L F E K J H I G L F 8.0933 3 A7B2 E K J H I G L F E K J M H I G L F 8.0000 3 A5B1 E K J M H I G L F E K J M H I G L F 7.9933 3 A9B1 E K J M H I G L F E K J M H I G L F 7.9167 3 A1B2 E K J M H I G L F E N K J M H I G L F 7.8300 3 A8B3 E N K J M H I G L F E N K J M H I G L F 7.8067 3 A15B2 E N K J M H I G L F E N K J M H I G L F 7.7667 3 A16B1 E N K J M H I G L F O E N K J M H I G L F 7.6867 3 A10B1 O N K J M H I G L F O N K J M H I G L F 7.3500 3 A9B3 O N K J M H I G L F O N K J M H I G L F 7.3333 3 A10B3 O N K J M H I G L O N K J M H I G L 7.2467 3 A5B2 O N K J M H I G L O P N K J M H I G L 7.2233 3 A12B2 O P N K J M H I L O P N K J M H I L Q 6.9533 3 A6B1 O P N K J M H I L Q O P N K J M H I L Q 6.9500 3 A14B3 O P N K J M H I L Q O P N K J M H I L Q 6.9433 3 A13B1 O P N K J M H I L Q O P N K J M H I L Q 6.9400 3 A1B1 O P N K J M I L Q O P N K J M I L Q 6.8833 3 A4B1 O P N K J M I L Q O P N K J M I R L Q 6.8467 3 A13B3 O P N K J M I R L Q O P N K J M I R L Q 6.7900 3 A11B3 O P N K J M R L Q O P N K J M R L Q 6.7533 3 A3B2 O P N K J M R L Q O P N K J M R L Q 6.7300 3 A8B1 O P N K M R L Q O P N K M R L Q 6.6800 3 A2B3 O P N K M R L Q O P N K M R L Q 6.6433 3 A3B1 O P N M R L Q O P N M R L Q 6.4433 3 A15B1 O P N M R Q O P N M R Q 6.2267 3 A6B3 O P N R Q O P N S R Q 6.0667 3 A11B2 O P S R Q 6
  67. Đồ án tốt nghiệp O P S R Q 5.8933 3 A4B2 P S R Q P S R Q 5.3967 3 A2B2 S R Q S R Q 5.3700 3 A11B1 S R Q S R Q 5.1300 3 A8B2 S R S R 5.0167 3 A2B1 S S 4.3233 3 A13B2 Phụ lục 1.2. Khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase Bảng số liệu đường kính vòng phân giải cơ chất casein của 29 chủng khảo sát Đường kính vòng phân giải chitin D - d STT Chủng 24h 48h 72h LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 LL1 LL2 LL3 1 KL 1.2 2.49 2.44 2.68 5.55 5.09 5.24 1.94 1.84 1.53 2 KL 1.3 2.18 2.9 2.26 4.71 4.73 6.64 0.14 0.73 0.95 3 KL 1.4 1.7 1.6 1.74 3.75 3.96 3.73 0.97 1.11 1.03 4 KL 3.1 3.76 4.4 2.62 6.47 5.58 6.24 0.84 1.07 2.01 5 KL 4.1 2.34 2.58 2.75 4.11 5.31 4.37 2.65 3.78 3.26 6 KL 5.1 2.03 2.46 2.49 3.15 4.92 2.3 3.36 1.94 1.11 7 KL 5.2 2.75 2.26 2.57 4.02 4.85 5.58 0.32 0.22 0.27 8 KL 5.3 2.98 4.63 4.02 7.19 6.23 7.3 4.43 3.67 4.36 9 KL 6.1 1.49 2.37 2 5.63 5.66 5.04 1.13 0.51 0.28 10 KL 6.2 2.75 2.3 2.75 7.69 5.98 5.4 1.87 1.35 0.87 11 KL 8.2 2.57 2.5 2.96 5.94 4.2 4.91 1 1.89 3.04 12 HT 1.1 3.12 3.41 3.47 8.03 6.82 9.79 2.48 2.13 2.15 13 HT 1.2 3.32 2.84 2.69 7.49 5.98 7.18 2.43 3.19 2.43 14 HT 1.3 2.02 2.74 4.25 4.86 4.76 4.51 1.8 2.41 1.19 15 HT 2.1 3.05 3.23 4.6 5.82 5.48 7.21 3.47 3.32 1.47 16 HT 2.2 2.78 3.12 2.63 6.27 7.52 7.14 5.21 6.72 5.2 17 HT 2.3 3.42 4.35 3.9 5.39 5.43 5.17 2.42 4.16 4.09 18 HT 3.1 3.17 3.55 3.39 8.23 7.22 6.1 2.29 0.87 2.19 19 HT 3.2 3.51 3.19 3.01 4.61 4.82 5.64 1.74 0.66 0.86 20 HT 3.3 2.98 2.76 2.34 5.46 4.56 6.71 1.27 0.96 0.98 21 HT 4.1 3.11 3.05 3.18 7.52 6.3 5.91 1.96 1.82 1.47 22 HT 4.2 2.62 3.95 2.95 7.17 5.87 6.2 3.21 2.12 2.75 23 HT 4.3 3.1 3.39 3.3 5.98 6.41 6.52 2.83 2.03 1.68 24 HT 5.1 6.22 6.25 6.43 6.86 6.94 7.01 8.82 8.54 8.68 25 HT 5.2 2.09 1.93 2.3 5.52 4.99 5.93 1.02 1.31 0.75 26 HT 6.1 4.17 3.82 3.79 5.1 6.31 3.92 1.09 2.81 2.21 27 HT 6.3 2.85 3.34 2.89 7.51 7.05 7.57 2.16 3.12 3.08 28 HT 7.2 2.06 2.02 2.89 3.82 4.64 5.1 5.15 4.92 5.55 29 HT 7.3 1.81 2.46 2.52 5.04 5.27 4.81 1.95 2.7 2.69 Kết quả phân tích ANOVA bằng phần mềm SAS 9.0 khả năng tiết enzyme chitiase các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.956405 13.23689 0.546785 4.130769 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F A 12 184.2286085 15.3523840 51.35 <.0001 B 2 211.9350615 105.9675308 354.44 <.0001 A*B 24 115.4339607 4.8097484 16.09 <.0001 7
  68. Đồ án tốt nghiệp Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 0.298974 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 0.5132 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N A A 7.4622 9 9 B 5.1767 9 5 B B 4.9789 9 3 C 4.3967 9 11 C D C 4.1722 9 4 D C D C 4.1122 9 6 D C D C 4.0167 9 12 D C D C 3.9156 9 8 D D 3.8133 9 7 D D E 3.6911 9 10 E E 3.2500 9 13 F 2.5378 9 2 F F 2.1767 9 1 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 0.298974 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 0.2465 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N B A 6.0341 39 2 B 3.1895 39 1 B B 3.1687 39 3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 78 Error Mean Square 0.298974 Critical Value of t 1.99085 Least Significant Difference 0.8888 Means with the same letter are not significantly different. 8