›

Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan oncidium sp. in vitro

pdf 73 trang thiennha21 12/04/2022 2570
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan oncidium sp. in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_khao_sat_anh_huong_cua_dich_chiet_len_su_sinh_truong_v.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan oncidium sp. in vitro

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM Ngành : Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phan Quốc Tâm Sinh viên thực hiện : Mai Duy Vinh MSSV: 107111227 Lớp: 07DSH02 TP. Hồ Chí Minh, năm 2012
  2. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 1
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1. Sơ lược về hoa lan 1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới Hoa lan được mệnh danh là nữ hoàng của các loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng khắp thế giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước. Thị trường tiêu thụ hoa lan của khối châu Âu rất hấp dẫn. Hình 1.1. Giàn treo lan Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỉ EUR. Trong đó, Hà Lan là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan trong khối EU Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác, nhưng do nhu cầu tiêu thụ lan trong khối EU cao nên trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới trên 155 tỉ sản phẩm, giá trị kinh ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỉ EUR (International Statistics Flowers and Plants, 2007). Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang nguồn lợi kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á. Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu là hoa lan nhiệt đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium . Sonia và Jumbo White. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Oncidium và Vanda. Hơn 80% Dendrobium trên thị trường thế giới là từ Thái Lan. Chỉ với loại hoa lan chủ lực là Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 2
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Giá trị xuất khẩu năm 2000 khoảng 1.765 triệu baht. Dendrobium được chọn là sản phẩm vô địch bởi vì sản phẩm của nó xuất khẩu liên tục trong năm. Hiện tại, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan. Nó trở thành niềm kiêu hãnh của người trồng hoa lan ở Thái Lan. Hiện nay Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan. Đài loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp bằng qui trình công nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất khẩu loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ Điệp cắt cành. Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu Phalaenopsis. Trong đó, 12 triệu hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu đến Nhật Bản, 3 triệu đến Trung Quốc, 2,5 triệu tới Hoa Kì và 3,5 triệu cho các quốc gia khác. Trong tháng 6 năm 2004, Hoa Kì đã cung cấp giấy phép xuất khẩu Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kì. 1.1.1.2 . Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5 – 6 %. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hoa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển khá nhanh. Chỉ riêng Tp.HCM diện tích vườn lan lên tới 80 ha, hoa lan đang mang lại thu nhập cao cho nhiều nông dân. Tuy nhiên, do cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, các nhà vườn nhập cây giống ồ ạt từ nước ngoài như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Báo cáo điều tra thống kê của Sở NN&PTNT Tp.HCM, 2008). Theo thống kê của Sở NN & PTNT Tp.HCM trong năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan cây kiểng chỉ đạt 200 - 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600 - 700 tỉ đồng. Theo TS. Dương Hoa Xô – Trung tâm Công nghệ sinh học, đến nay đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho 7 nhóm giống hoa lan, có khả năng cung cấp 200.000 cây con hoa lan nuôi cấy mô thuộc các nhóm Mokara, Dendrobium, SVTH : Mai Duy Vinh Trang 3
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Phaleanopsis, Catlleya. Năm 2007, đã cung cấp cho các nhà vườn khoảng 50.000 cây hoa lan nuôi cấy mô các loại. Năm 2008, sản xuất 100.000 cây giống hoa lan cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium và một số giống lan rừng quý. Đến 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa Tết là những loại hoa mới là và cao cấp như tiểu quỳnh, lily, tulip, địa lan, hồ điệp nhân giống bằng công nghệ in vitro. Hiện nay, rất nhiều loại hoa đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tại Việt Nam, như lan Dendrobium, phalaenopsis, vanda, catlleya, Oncidium, vạn thọ Pháp, cúc Đài Loan, hoa salem, cẩm chướng, hoàng thảo, hoa đồng tiền nhập nội (các giống Tamara, Banesa, Caliente ). Thị trường tiêu thụ hoa trong nước ngày càng mở rộng, mỗi năm tiêu thụ hàng triệu cây hoa các loại, riêng hoa lan cũng gần 2 triệu cây. Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú săn tìm trong rừng sâu. Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3 % về chi và 76,5 % về loài lan rừng của Việt Nam. Không ít loài lan được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới mang tên Đà Lạt, 10/12 loài lan quý của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những năm sau 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kĩ thuật công nghệ cao và sản xuất. Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.00 đồng/gốc lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 - 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô, và đặc biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt và cộng sự ở Viện Sinh học Tây Nguyên đã nhân giống thành công Hồng hài - loài lan hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống, khó sinh sản. Theo PGS. TS.Dương Tấn Nhựt, thành phố Đà Lạt là cỗ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan trong tự nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản SVTH : Mai Duy Vinh Trang 4
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mĩ, Nhật Bản, Đài Loan Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước ASEAN khác. 1.1.2. Sơ lược về lan Oncidium Lan Vũ Nữ (Oncidium) là một loại lan gồm khoảng chừng 600 giống phân bố rộng rãi ở Nam Mỹ, với hình dạng và màu sắc hoa rất đẹp và đa dạng. Loại lan này có những củ bẹ to hoặc nhỏ, phía trên có 1 hoặc 2 lá. Hình 1.2. Lan vũ nữ đỏ Tùy theo từng giống, có loài có lá dầy và cứng, có loài dài và mềm. Dò hoa có loài dài như Onc. falcipetalum, Onc. carthagenense, Onc. divaricatum v.v và cũng có những dò hoa ngắn như Onc. cheirophorum. Mỗi dò mang từ 30 đến 100 hoa và có nhiều giống hoa lớn đến 4-5 cm. Oncidium là giống Lan thích nghi được với biên độ sinh thái khá rộng, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 25 oC. 1.1.2.1. Phân loại Vị trí phân loại: Lan Oncidium thuộc: Giới : Phantae (Thực vật) Ngành : Angiospermatophyta (Hạt kín) Lớp : Monodicotyledonae (cây một lá mầm) Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae SVTH : Mai Duy Vinh Trang 5
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Chi : Oncidium Loài : Oncidium sp. 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của lan Oncidium Oncidium có khoảng 750 loài phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, với sự phân bố rộng rãi như vậy nên hoa của các loài lan thuộc giống Oncidium thường có nhiều màu sắc khác nhau. * Rễ Lan Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Oncidium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở đất. Hình 1.3. Oncidium Red Thông thường rễ thường mọc dưới các nách lá cuối cùng đâm sâu xuống đất hay giá thể. Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối dày đặc . * Thân lan Oncidium thuộc nhóm đa thân (còn gọi là nhóm hợp trục). Thân lan có thể ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá. Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành. Giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây. * Giả hành Giả hành là những đoạn phình, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy trong điều kiện khô SVTH : Mai Duy Vinh Trang 6
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm hạn khi cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được, giả hành có nhiều hình dạng như: hình cầu, thuôn dài, hình trụ xếp chồng lên nhau * Lá Hình dạng và cấu trúc lá rất da dạng, lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng, dạng lá mềm mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống của cây. Các lá mọc song song nhau và ôm lấy thân giả. * Hoa Hoa có vòng bao quanh và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng. Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên. Các cánh đài dựng đứng hay trải ra. Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là cánh môi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn. Sự đa dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rất lớn. Cánh môi có các dạng như nguyên chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh. Những bông hoa của giống Oncidium có sắc thái của màu vàng với đốm nâu, có thể rất dài. Các cánh hoa thường xù trên các cạnh, như là môi . Môi là rất lớn, một phần ngăn chặn các cánh hoa và đài hoa nhỏ Một số hoa lan Oncidium là rất dài: Oncidum altissimum và của Oncidium baueri có thể phát triển lên một tầm cao 5 m, trong khi sarcodes Oncidum có thể đạt tới 3 m. * Trái Họ Orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 7
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm * Hạt Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt. Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi – microspermeae) nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau 8 - 12 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái của lan Oncidium 1.1.3.1. Ánh sáng Oncidium là loài ưa ánh sáng nhưng không chịu được ánh sáng trực tiếp, những giống này có thể trồng dưới ánh đèn được. Những giống lá to và dày cần nhiều ánh sáng hơn là những giống lá nhỏ và mềm. Cường độ ánh sáng khoảng 50%. Ánh sáng yếu hơn cây vẫn phát triển tốt như thân, lá xanh đẹp, tuy nhiên cho hoa kém. Để cây ra hoa tốt cần 70% ánh sáng. 1.1.3.2. Nhiệt độ Về nhiệt độ thì cây phát triển rất tốt ở nhiệt độ 15 – 35oC đây là khoảng nhiệt độ trung bình và ấm, nếu giảm nhiệt độ xuống dưới 15oC một vài giờ cây không chết nhưng kéo dài cây sẽ không ra hoa, nếu nhiệt độ tăng quá cao cần tăng độ ẩm và tích cực thông thoáng gió. 1.1.3.3. Ẩm độ Cần ẩm độ trung bình 50 - 70%. Oncidium là cây cần ẩm độ cao, đặc biệt trong thời kỳ tăng vì vậy trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày vào mùa khô, 2 lần/ngày trong mùa mưa. Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 8
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1.3.4. pH môi trường Độ PH của môi trường thích hợp cho mô phát triển, trong khoảng 4,8 - 5,5, thông thường biên độ pH trong khoảng 5 - 5,2 là tốt nhất. 1.1.3.5. Nước Nước rất quan trọng cho cây để tăng trưởng. Nếu thiếu nước cây sẽ không phát triển và có thể bị chết khô. Nhìn thấy thân cây hay lá cây bị nhăn nheo, là cây thiếu nước. Còn quá nhiều nước cây bị úng, thối rễ, là điều kiện tốt cho vi khuẩn, nấm xâm nhập làm cây chết. Nước giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo giữa các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn. Chế độ nước tưới cần cung cấp cho cây là khoảng 2 - 3 ngày tưới một lần tùy thuộc vào điều kiện thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm. Vào mùa đông trời rét cần giảm số lần tưới nước, nước tưới cũng cần phải sạch sẽ tránh nguồn nước ô nhiễm sẽ làm chết cây. 1.1.3.6. Giá thể Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu. Có thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi lửa, xơ dừa hoặc đá. Để trồng lan Oncidium cần ẩm nhưng thoát nước tốt như than hoặc xơ dừa. 1.1.3.7. Phân bón Trong quá trình chăm sóc hoa cần bón phân cho hoa với các loại phân bón chủ yếu là: phân 20-20-20 và phân 30-10-10 và có thể phun một số loại phân bón lá hay chất kích thích sinh trưởng để điều khiển ra hoa. Vì cây có giả hành có khả năng dự trữ dinh dưỡng để nuôi cây. Có thể bón phân mỗi tuần 2 lần, cần tăng cường phân Kali. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 9
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.1.3.8. Phòng trừ sâu bệnh hại Sâu bệnh hại chủ yếu trên nhóm lan vũ nữ: - Ốc: Phòng trừ bằng cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo), Dioto. - Bệnh thối mềm vi khuẩn: do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám, sử dụng 1 trong 3 hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan + Alpine, Mexyl.MZ + Alpine. Tóm lại: Việc nuôi trồng và chăm sóc hoa lan không thể bỏ qua giai đoạn thay chậu. thường thay chậu vào mùa xuân khi cây còn non đã mọc được khoảng một gang tay đây là giai đoạn thay chậu tốt nhất, dùng vỏ cây loại nhỏ cho các giống cây có rễ nhỏ và những giống có rễ lớn dùng vỏ cây loại trung bình, nén chặt vỏ cây vào chậu trồng sao cho cây đứng thẳng, vững giữ độ ẩm cao và ngừng tưới nước đến khi cây ra rễ, một số loài lá cứng, dầy như Oncidium mule ears hay Oncidium amplitum vv có thể buộc chặt chúng vào các vỏ cây và thân cây, sau một thời gian chúng bám vào thân cây và hút chất dinh dưỡng từ đó. Đối với loài lan vũ nữ hoa có thể nở vào tất cả các mùa trong năm, chúng ưa bóng mát nên tránh để ngoài trời. Công việc tưới phân và tưới nước phải được tiến hành vào buổi sáng sớm hoặc chiều mát nên tưới nước trước khoảng 15 phút sau đó mới tưới phân để cây hấp thụ tốt. Tưới đúng liều lượng nếu không cây sẽ chết hoặc rụng lá. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 10
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2. Nhân giống vô tính in vitro 1.2.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2003). Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ. Trước kia người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực vật để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2003). Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng. 1.2.2. Lịch sử Những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật: - 1665, Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. - 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. - 1902, Haberlandt lần đầu thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm trong ống nghiệm nhưng không thành công. - 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt. - 1926, FW Went chứng minh trong lá bao mầm của lúa mạch có mặt các chất sinh trưởng. - 1934, White thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài. Kogl F và cộng sự xác định loại hormone thực vật đầu tiên là IAA. - 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng ở cà rốt và cây thuốc lá. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 11
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - 1940, Gautheret nghiên cứu sự hình thành chồi bất định trong nuôi cấy mô tế bào thượng tầng cây Ulmus. - 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cà rốt. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, lĩnh vực này phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp được công bố. 1.2.3.Ưu điểm và hạn chế của vi nhân giống 1.2.3.1. Ưu điểm - Nâng cao chất lượng cây giống: loại trừ virus, nấm. Cây giống sạch bệnh được tạo ra thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc. - Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền. - Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và các cơ quan khác nhau của cây như trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, chồi phát hoa mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại. Từ một cây trong vòng 2 - 3 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. - Sản phẩm cây đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp. - Tạo được dòng toàn cây cái (cây chà là) hay toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn. - Tiết kiệm thời gian: mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống. - Dễ dàng vận chuyển. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 12
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, không phụ thuộc mùa vụ. Vì nhân giống được xem là công cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền. Giảm được nhiều công sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống. 1.2.3.2. Hạn chế - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm chưa được nhân nhanh. - Chi phí sản xuất cao, đòi hỏi trình độ khoa học kĩ thuật cao, chi phí cho công nhân thường chiếm khoảng 60% hoặc cao hơn trên tổng giá trị toàn sản phẩm. - Giá thành cao, cao hơn so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép, nhân giống bằng hạt nên thường khó áp dụng để thương mại hóa. - Hiện tượng biến đổi kiểu hình: do hiện tượng biến dị tế bào soma. Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. - Quá trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. 1.2.4. Các bước trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro - Chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa - Nhân giống in vitro - Tạo cây con bầu đất - Đưa các cây ra đồng ruộng - Chọn lọc cây đầu dòng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 13
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hình 1.4. Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mẫu được nuôi cấy thường còn ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hóa mạnh. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra, chồi đỉnh và chồi non của hạt mới nảy mầm cũng được sử dụng. Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp. Môi trường được sử dụng rộng rãi trong nhân giống hiện nay là môi trường MS. Đối với mẫu dễ bị hóa nâu môi trường thường được bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25 - 150 mg/l). ♦ Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) và thể cắt (cutting) đốt ngoài ra còn có thể giò (protocorm). Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên có những cây trồng không có khả năng nhân giống người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi bằng mô sẹo. Để tạo thể nhân giống trong môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 và các chất hữu cơ khác. ♦ Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu SVTH : Mai Duy Vinh Trang 14
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm nuôi cấy là những thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nuôi cấy kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh chóng. Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn. ♦ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra ngoài môi trường bên ngoài. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy tương tự với quá trình nuôi cấy ngoài tự nhiên, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Thường dung các chất thuộc nhóm auxin kích thích ra rễ. ♦ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ. Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn, cây con dễ bị mất nước, mau bị héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ được ẩm. Trong những ngày đầu cần được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước. Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần lụi đi và rễ mới xuất hiện. Cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. ♦ Nhân giống in vitro Cây con sau khi được chuyển ra luống ươm hay cấy vào bầu đất sau 7 - 10 ngày thì bắt đầu ra rễ. Sau đó được phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho mỗi loại). Tuy nhiên do quá trình nhân giống in vitro có nhiều tốn kém thì cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Điều kiện nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng thái bằng cách điều kiện khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp Hệ số nhân giống trên luống ươm phải tiếp tục đảm bảo cây mẹ ở trạng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 15
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm thái cân bằng, khống chế bằng cách giảm dinh dưỡng, duy trì độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thấp Hệ số nhân giống trên luống ươm càng cao giúp cho việc giảm giá thành càng có ý nghĩa. ♦ Cây con bầu đất Cây con từ ống nghiệm hay được nhân giống trên luống ươm được cấy trên luống đất 15 - 20 ngày cho cây ra rễ và phát triển khỏe, sau đó được cấy vào bầu đất (cây chuối). Bầu đất có cơ chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân là 1/1, ngoài ra hàng tuần được phun dinh dưỡng khoáng 1 - 2 lần/tuần thường dùng phân khoáng có tỉ lệ N - P - K: 20-20-20. Thời gian cây con ở giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm cây trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối). Cây bầu đất được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí mát để cây phát triển nhanh và khỏe. ♦ Chọn lọc cây đầu dòng Là vấn đề quan trọng đối với cây ăn trái nhằm tạo ra một quần thể đồng đều có năng suất cao và ổn định. Những cây được chọn đầu dòng được đưa vào nhân giống trở lại bằng nuôi cấy mô. Hiện tại công nghiệp nhân giống được ứng dụng nhiều trong kinh tế để giải quyết nhu cầu về giống cho sản xuất, giống cho cây lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, cây ăn trái, hoa và cây dược liệu. 1.2.5. Các phương pháp nhân giống in vitro - Gieo hạt in vitro - Nhân giống bằng chồi nách - Nhân giống bằng chồi đỉnh - Nhân giống bằng chồi bất định - Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo - Nhân giống bằng các đoạn giả hành - Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn - Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) SVTH : Mai Duy Vinh Trang 16
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 1.2.6.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy - Kiểu di truyền - Tuổi của cây - Tuổi của mô và cơ quan - Tình trạng sinh lí - Vị trí của mẫu cấy trên cây - Kích thước mẫu cấy - Vết thương - Phương pháp cấy Không có hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể làm mô cấy. Tuy nhiên, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa. Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên phải chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng của các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau. Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng 2000 - 3000 lux. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 17
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Một số điểm cần lưu ý - Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90o rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn. - Trước khi cấy, phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 70o. - Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4 - 5 mẫu, tránh để nhiều không kịp cấy sẽ bị khô. - Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy. 1.2.6.2. Ảnh hưởng của môi trường Khi bắt đầu nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỉ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp. Trong hàng trăm môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích khác nhau, có thể chia ra làm 3 loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: Môi trường White, Knop, Knudson C. - Môi trường trung bình: Môi trường B5 của Gamborg. - Môi trường giàu dinh dưỡng: Môi trường Murashige và Linsmaier - Skoog. Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với môi trường nào nhất. Hiện nay, môi trường MS được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cây. Vì vậy, người mới bắt đầu nuôi cấy thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 18
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.2.6.3. Đảm bảo điều kiện vô trùng ♦ Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt. Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lí, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70o sau đó mới xử lí trong dung dịch diệt khuẩn. Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy. Trong thời gian xử lí, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lí nên rửa kĩ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lí xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3 - 5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu. Tuy nhiên nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc sẽ đạt kết quả. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 19
  21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Buồng cấy thường có diện tích hẹp, rộng từ 10 – 15 m2, có 2 lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lí hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4 % ra một số nắp đĩa petri để rải vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi, khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% trong 24h. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 70o. Các dụng cụ mang vào buồng cấy phải vô trùng trước: áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất Trên bàn thường xuyên có 1 đèn cồn(hay đèn gas) để sử dụng khi cấy và một cốc đựng đèn cồn 90o để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kĩ đến khuỷu tay bằng cồn 70o. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại. 1.2.7. Những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô ♦ Sự tạp nhiễm Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng, môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy. - Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, mẫu lá, phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên để mẫu sống và phát triển SVTH : Mai Duy Vinh Trang 20
  22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas - Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. - Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra. - Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm, chúng có nhiều loài khác nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus putrescentiae Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường không phát hiện nhiễm chúng, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng. Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 21
  23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm và ve bét cùng lúc. Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2 tuần. ♦ Tính bất định về mặt di truyền Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Creissen and Karp 1985; Fish and Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị dòng soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất và biến dị này không di truyền. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong and Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. ♦ Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: - Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 %. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác. - Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 22
  24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol. Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra một số phương pháp khi thao tác trên mẫu: - Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non - Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy - Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần ♦ Hiện tượng thủy tinh thể Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy. Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây. Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách: - Tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp. - Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường - Giảm sự sản sinh ethylene trong bình nuôi cấy - Xử lí acid absixic hay một số chất ức chế sinh trưởng - Tăng cường độ ánh sang và giảm nhiệt độ phòng nuôi 1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo SVTH : Mai Duy Vinh Trang 23
  25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh. Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi cấy những mô đặc hiệu nào đó. Một số môi trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trong chúng đảm bảo sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường MS nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác. Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy thì bao giờ cũng gồm 5 thành phần chính: - Các muối khoáng đa lượng và vi lượng - Các vitamin - Các amino acid - Nguồn carbon: đường - Các chất điều khiển sinh trưởng - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, lòng trắng trứng , lòng đỏ trứng , dịch chiết cá nục , sữa tươi. - Agar 1.3.1. Các khoáng vô cơ Với MS: Murashige và Skoog (1962); White (1963); B5: Gamborg (1968); N6: Nitsch và Nisch (1969); WP: Loyd và McCown (1980). 1.3.1.1. Nhóm đa lượng Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 24
  26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Đạm Đạm giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân, lá, rễ phát triển, giúp cho quá trình quang hợp mạnh. Thiếu đạm, cây nhợt nhạt, ốm yếu, sinh trưởng kém, cằn cỗi Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau: - CO(NH2)2 : Urea (46% N) - (NH4)2SO4 : Ammonium sulphate (22% N) - KNO3 : Potassium nitrate (14% N) - NH4NO3 : Ammonium nitrate (34% N) - NaNO3 : Sodium nitrate (16,4% N) - Ca(NO3)2 : Calcium nitrate (15,5% N) ♦ Lân (P) Lân giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa, rễ, hoa lâu rụng Các chất cung cấp lân: - Super lân (20% P2O5) - (NH4)2HPO4 : Diamonium phosphate DAP (46% P2O5) - (NH4)3HPO4.3H2O : Trianium phosphate (15,21% P) - KH2PO4 : Phosphate potassium (10,35% P) ♦ Kali (K) Kali giúp tạo các bó mạch trong cây, giúp cây đứng thẳng, cứng cáp, chắc Các chất cung cấp kali như: - KCl : Potassium chlorua (60% K2O) - K2SO4 : Potassium sulphate ( 48% K2O) - KNO3 : Potassium nitrate (44% K2O) - KH2PO4 : Phosphate ( 40% K2O) ♦ Calcium (Ca) Calcium giúp tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc Các chất cung cấp Ca như: CaCl2, Ca(NO3)2. Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 25
  27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm nhiều, trở nên quá mập, tàn lá rợp xuống, dễ gãy. Thừa Ca, cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được. ♦ Magnesium (Mg) Magnesium thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp cho cây. Nếu dư, lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị héo khô. Thiếu Mg, bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá. ♦ Sulfur (S) Sulfur là thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng. Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như K2SO4, MgSO4 Thiếu S thì cây cằn cỗi, lá vàng, cây ốm yếu, thiếu sức sống. 1.3.1.2. Nhóm vi lượng Nhóm này rất cần thiết cho lan mặc dù cần rất ít (không quá 5 mg/l). Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo, Mn, Fe ♦ Sắt (Fe) Sắt đóng vai trò tạo diệp lục, giúp cây quang hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu Fe làm lá cây có màu nhạt, cây không quang hợp tốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. ♦ Đồng (Cu) Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc, lá bạc tái, mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi héo khô. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. ♦ Kẽm (Zn) Kẽm giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây, đồng thời giảm tưới lân. ♦ Mangan (Mn) Thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 26
  28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Molyden (Mo) Mo giúp điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (Sodium Molypdate) để cung cấp Mo cho cây. 1.3.2. Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Tất cả các tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng, nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Nên phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo - inositol. Ngoài ra còn có: biotin, acid folic, panthotheic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Nhu cầu vitamin trong môi trường nuôi cấy nói chung không quan trọng và cũng không cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Các vitamin này được thêm vào môi trường chỉ khi nồng độ thiamin thấp hơn nhu cầu cần thiết hoặc để cho huyền phù tế bào có thể tăng trưởng khi mật độ tế bào khởi đầu thấp. ♦ Vitamin B1 (Thiamin.HCl) Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 - 10 mg/l. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vit B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của vit B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vit B1. ♦ Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) Có thể khử trùng bằng nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân hủy. Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng nuôi cấy tối có thể tăng lên 10 - 50 ppm. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 27
  29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin) Là tiền chất của pyridoxal – phosphate - cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao xảy ra phản ứng: Pyridoxin + Phosphate -> Pyridoxalphosphate ♦ Myo-Inositol (Bios I) Inositol thường được nhắc đến như một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp. Có vai trò trong sinh tổng hợp tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic và pectine. Inosit là chất bền vững khi khử trùng. Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm. Khi phân tích thành phần của nước dừa người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính. ♦ Biotin (Bios II) Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ thấp từ 0,001 - 0,01 ppm. 1.3.3. Đường Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh dưỡng. Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1 - 12%, thông dụng là 2 - 3%. Các nguồn carbonhyddate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galatose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các nguồn cacrbolhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu (Peer, 1971; Ball, 1953) và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino (phản ứng Millard). Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 28
  30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.3.4. Vai trò của nước dừa và các dịch chiết 1.3.4.1. Nước dừa Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong môi trường nuôi cấy là công trình nghiên cứu của Van Overbeek và cộng sự (1941,1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose và fructose. Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo). Khi nuôi cấy phôi lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1995; Niimoto và Sagawa, 1961). Thông thường nước dừa được xử lí để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có thể kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ cặn. Nước dừa thường sử dụng nồng độ từ 5 - 20% (v/v). 1.3.4.2. Các dịch bổ sung ♦ Lòng trắng trứng Lòng trắng chiếm khoảng 60% toàn bộ trọng lượng quả trứng và nước là thành phần chính chiếm khoảng 88%. Lòng trắng trứng thường có khoảng 9,7-11% protein, trong đó có hơn 40 loại protein khác nhau. Ovalbumin là protein chính và chiếm khoảng 54% tổng số protein của lòng trắng trứng. Ovotransferrin (conalbumin) và ovomucoid chiếm khoảng 12% và 11% tương ứng (bảng 1). Các loại protein khác là ovomucin, ovoglobulin, lysozyme, ovomacroglobulin, ovoglycoprotein, flavoprotein, ovoinhibitor, cystatin và avidin. Carbohydrate chiếm khaỏng 0,5-0,6% lòng trắng trứng, chúng tồn tại ở dạng tự do hay kết hợp với SVTH : Mai Duy Vinh Trang 29
  31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm protein. Lượng lipid (0,01%) trong lòng trắng trứng rất nhỏ so với lượng lipid có mặt trong lòng đỏ trứng ♦ Lòng đỏ trứng gà Lòng đỏ tập trung chủ yếu các chất dinh dưỡng, lòng đỏ trứng gà có 13,6% đạm, 29,8% béo và 1,6% chất khoáng. Chất đạm trong lòng đỏ trứng có thành phần các acid amin tốt nhất và toàn diện nhất. Thành phần của lòng trắng trứng đa số là nước, có 10,3% chất đạm, chất béo và rất ít chất khoáng. Chất đạm của lòng đỏ trứng chủ yếu thuộc loại đơn giản và ở trạng thái hòa tan; Còn chất đạm của lòng trắng chủ yếu là Albumin và cũng có thành phần các acid amin tương đối toàn diện. Chất đạm của trứng là nguồn cung cấp rất tốt các acid amin cần thiết có vai trò quan trọng cho cơ thể, đặc biệt cần cho sự phát triển cả về cân nặng và chiều cao của trẻ. Trứng có nguồn chất béo rất quí, đó là Lecithin vì Lecithin thường có ít ở các thực phẩm khác. Lecithin tham gia vào thành phần các tế bào và dịch thể của tổ chức, đặc biệt là tổ chức não. Nhiều nghiên cứu cho thấy Lecithin có tác dụng điều hòa lượng cholesterol, ngăn ngừa tích lũy cholesterol, thúc đẩy quá trình phân tách cholesterol và bài xuất các thành phần thu được ra khỏi cơ thể. Trứng cũng chứa lượng cholesterol đáng kể (600mg cholesterol/100g trứng gà), nhưng lại có tương quan thuận lợi giữa Lecithin và cholesterol do vậy Lecithin sẽ phát huy vai trò điều hòa cholesterol, ngăn ngừa quá trình xơ vữa động mạch và đào thải cholesterol ra khỏi cơ thể. Trứng cũng là nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng rất tốt. Các chất khoáng như sắt, kẽm, đồng, mangan, iod tập trung hầu hết trong lòng đỏ. Lòng đỏ trứng có cả các vitamin tan trong nước (B1, B6) và vitamin tan trong dầu (Vitamin A, D, K). Trong lòng trắng trứng chỉ có một ít vitamin tan trong nước (B2, B6). Cả trong lòng đỏ và lòng trắng trứng đều có chất Biotin. Biotin là vitamin B8, tham gia vào chu trình sản xuất năng lượng để đáp ứng nhu cầu của cơ thể. Trong lòng trắng trứng tươi, chất Biotin kết hợp với một protein là Avidin làm mất hoạt tính của SVTH : Mai Duy Vinh Trang 30
  32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Biotin, tạo phức hợp Biotin - Avidin rất bền vững và không chịu tác dụng của men tiêu hóa. Khi nấu chín, Avidin sẽ được giải phóng khỏi phức hợp Biotin - Avidin. ♦ Dịch chiết cá nục Cá nục là một loài cá có thành phần dinh dưỡng khá cao. Trong 100g cá nục: 92 kcal, 21,3 g protein, 0,8g lipid, 1,3g tro, 246 mg K, 58 mg Calcium, 2,3 mg Fe, 29 mg Phosphorus, 67 mg Natri, 27mg Vitamin A, 0,23mg Vitamin B2, 304mg Vitamin PP. Để tránh tình trạng đóng cục cá nục được nghiền nát và cho vào môi trường nuôi cấy. ♦ Sữa tươi Sữa tươi là nguồn cung cấp nhiều chất dinh dưỡng như protein, lipid, các khoáng chất cần thiết. Trong 100ml sữa tươi có 3,1g protein, 3,4g lipid, 9,2 g carbohydrate, 110g canxi, 230 I.U Vitamin A, 40 I.U Vitamin D3, 90,5 mg photphorus, 13,9 mg magiê, 760mcg kẽm, 205 mcg mangan. Với thành phần dinh dưỡng như vậy sữa tươi sẽ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng tốt cho cây được bô sung làm dịch chiết trong nuôi cấy mô. ♦ Các dịch chiết khác Dịch chiết nấm men, dịch chiết mạch nha, casein thủy phân, dịch chiết lúa mì cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. - Dịch chiết nấm men (YE): Với dịch chiết nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần hóa học của nấm men ít được phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng. - Dịch thủy phân casein (CH): Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật, chủ yếu làm nguồn bổ sung amino acid. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 31
  33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 1.3.5. Amino acid Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ. Các nguồn nitrogen hữu cơ thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparagine và adenine. Khi amino acid được cung cấp riêng rẽ thì cần phải cẩn thận vì nó có thể cản trở sự tăng trưởng của tế bào. Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp amino acid nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng. Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau, có thể do yêu cầu của từng loại tế bào không giống nhau. Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng. 1.3.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay còn gọi là Phytohormone đóng vai trò điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh thực vật từ những tế bào và mô tách rời. Phytohormone gồm các chất như: auxin, abscising, ethylene, gibberelline, cytokinene. Trong đó, hai loại hormone quan trọng nhất là auxin và cytokinine quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro. ♦ Auxin Là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA là dẫn xuất hay tiền chất của IAA và cũng có cùng vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng. Auxin tự nhiên được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, nơi có sự phân chia tế bào nhanh (trừ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng). Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 32
  34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Cơ chế tác động của auxin lên sự giãn của tế bào: Hình 1.5. Cơ chế tác động của auxin lên sự giãn của tế bào Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật. Đặc tính chủ yếu của auxin là kích thích sự tăng trưởng và kéo dài của tế bào. Ở một số loài, auxin làm tăng sự tổng hợp enzyme (peroxidase ở lõi thuốc lá, cellulose synthegtase ở kiều mạch), auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật, auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng mô sẹo, NAA, IBA được sử dụng phổ biến thay thế 2,4 - D vì hạn chế được hiện tượng đột biến. Auxin còn là yếu tố ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố (Nguyễn Đức Lượng, 2002). SVTH : Mai Duy Vinh Trang 33
  35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Trong quá trình nghiên cứu người ta cũng nhận thấy một số ảnh hưởng của auxin đối với thực vật: - Kích thích cho tế bào nở lớn và sinh trưởng thân. - Kích thích phân bào ở thượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp với cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Kích thích phát sinh rễ trên đoạn thân, phát triển rễ nhánh và biệt hóa phát sinh rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Ức chế sinh trưởng chồi bên. - Biệt hóa nhu mô libe và nhu mô gỗ. - Ức chế hay thúc đẩy sự rụng lá và trái phụ thuộc vào thời gian và vị trí lá, trái. - Sinh trưởng hoa - được kích thích bởi auxin. - Tạo môi trường phản ứng về dinh dưỡng của chồi và rễ với ánh sáng và lực hấp dẫn. ♦ Cytokinin Các cytokinin gồm kinetin, BA, zeatin Sau zeatin, 30 cytokinin khác đã được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lí giống nước dừa hay kinetin. Cytokinin được tổng hợp từ adenine, xuất hiện ở chóp rễ và hạt đang phát triển. Ảnh hưởng của cytokinin đến thực vật: - Phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và khối u, thúc đẩy phát sinh chồi. - Tác động sự nở lớn tế bào. - Tác động trực tiếp đến phân bào của trái và chồi đỉnh. - Làm chậm lão hóa lá. - Kích thích sự mở khí khổng ở vài loài thực vật. - Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn. - Tích tụ diệp lục và chuyển hóa etioplast vào diệp lục. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 34
  36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm ♦ Gibberelline (GA) Chỉ có acid gibberellinic A3 (GA3) được sử dụng. Nó không có bán ở dạng nguyên chất. Đây là một chất tự nhiên, phân hủy nhanh trong dung dịch nhầy và ưu tiên bảo quản trong cồn 96% và để trong tủ lạnh. Chúng ta cần lưu ý là các chất điều hòa tăng trưởng bị phân hủy hoặc trong lúc bảo quản chúng hoặc trong lúc hấp khử trùng ở autoclave. Các GA quan trọng ở thực vật là GA1, là GA đầu tiên tác động đến sự vươn thân, kích thích kéo dài tế bào. Các GA được tổng hợp từ mevalonic acid ở mô non của chồi và hạt đang phát triển. Một số ảnh hưởng của GA được biết đến: - GA1 kích thích vươn thân qua kích thích phân bào và kéo dài tế bào. Tạo ra thân cao ngược với tính lùn cây. - Kích thích hạt nảy mầm ở hạt cần xử lí lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm. - Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme. - Kích thích sự hình thành và phát triển trái như nho. ♦ Abscisic acid (ABA) ABA là một phân tử đơn, được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục để thích ứng với stress nước. Vì quy luật tác động của ABA trên sự rụng và lão hóa, nên ABA được nghĩ như một chất ức chế. Ảnh hưởng của ABA: - Trong nước có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng. - ABA gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thu bởi phôi đang sinh trưởng. - ABA phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt. - ABA tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp enzyme amylase ở hạt ngũ cốc đang nảy mầm. - ABA phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi. ♦ Hexitol Các hexitol như myo - inositol được xem là có vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô (Pollar et al., 1961 và Steinhard et al., 1962). Myo -inositol là một hexitol SVTH : Mai Duy Vinh Trang 35
  37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm được chú ý trong quá trình sinh tổng hợp cyclitol, sự nảy mầm của hạt, sự chuyên chở đường, dinh dưỡng khoáng, sự trao đổi đường, sự thành lập cấu trúc nhân và vách tế bào, sự cân bằng hormone (Loewus and Loewus, 1983). 1.3.7. Một số yếu tố khác ♦ Than hoạt tính Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sẽ có lợi ích và có tác dụng khử độc. Sẽ kích thích sự tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản trở đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. Than hoạt tính ảnh hưởng trên 3 mặt: - Hút các hợp chất cản. - Hút các chất điều hòa sinh trưởng. - Làm đen môi trường. ♦ Agar Đối với môi trường tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và sẽ chết vì thiếu oxy. Để tránh tình trạng này thì môi trường được làm đặc bằng agar. Agar là một loại tinh bột có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum. Nếu agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây ra. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 – 1%. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra gel và tan ở nhiệt độ 60 – 100oC, đặc lại khi nhiệt độ còn 35oC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa, agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 36
  38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 37
  39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 2.1. Địa điểm thực hiện đề tài Địa điểm: Đồ án tốt nghiệp được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, khoa Môi trường và CNSH, Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp. HCM. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu PLB lan Oncidium in vitro được lấy từ Công ty TNHH Nông Sinh Tp. Hồ Chí Minh. Chọn PLB có kích thước đồng đều nhau, hoàn toàn khỏe mạnh và sạch bệnh. 2.2.2. Hóa chất Môi trường nuôi cấy: sử dụng môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) làm môi trường nền. - Dịch chiết các loại như lòng trắng trứng gà, lòng đỏ trứng gà, cá nục, sữa tươi được bổ sung vào với nồng độ thay đổi lần lượt là: 0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/l. - Các chất bổ sung: ▪ Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: NAA (1mg/l), BA (2 mg/l) ▪ Nước dừa (50 ml/l) ▪ Đường (30 g/l) ▪ Than hoạt tính (1 g/l) ▪ Agar (9 g/l) 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ Bình nuôi cấy bằng thủy tinh dung tích 100 ml và 500 ml. ♦ Dụng cụ pha môi trường và khử trùng - Cân phân tích có tải cân từ 0,0001g đến 250g SVTH : Mai Duy Vinh Trang 38
  40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm - Máy đo pH - Ống đong có dung tích 1000 ml, 500 ml, 100 ml, cốc thủy tinh 50 - 1000 ml - Bình định mức 25 ml, 50 ml - Đũa khuấy thủy tinh - Nồi hấp khử trùng - Tủ lạnh để bảo quản hóa chất - Pipette ♦ Dụng cụ trong phòng cấy - Tủ cấy đôi - Dụng cụ giải phẫu mô: dao, kéo, kẹp, đèn cồn - Khay đựng mẫu cấy 2.2.4. Điều kiện thí nghiệm Điều kiện nuôi cấy in vitro - Thời gian chiếu sáng : 10 giờ/ngày - Cường độ ánh sáng : 2.500 – 3.000 lux - Nhiệt độ : 25 ± 2oC - Độ ẩm trung bình : 75 – 80% SVTH : Mai Duy Vinh Trang 39
  41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Cách pha môi trường nuôi cấy Hút dung dịch mẹ các khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và vitamin. Cân các chất đường, than, dịch chiết, agar và hút NAA, BA, nước dừa. Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất đến thể tích đã định sẵn. Định mức và đo pH đến 5,7 - 5,8 (điều chỉnh bằng NaOH 1N hay HCl 1N). Chia đều môi trường cho mỗi bình theo từng nghiệm thức Đậy nắp bình cẩn thận tránh cho môi trường bị nhiễm từ bên ngoài ở mức thấp nhất. Hấp khử trùng ở tủ hấp điều kiện 121oC, 1 atm, 20 phút. 2.3.2. Các thao tác trong phòng thí nghiệm 2.3.2.1. Điều chỉnh PH Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh bằng NaOH và HCl sau khi đã pha xong môi trường và chuẩn bị đưa vào hấp khử trùng. Dùng pH kế để đo độ pH. Đặc biệt, đo pH trước khi đưa than hoạt tính vào. 2.3.2.2. Khử trùng Khử trùng bình cấy và các dụng cụ khác (dụng cụ kim loại, giấy nhôm ) bằng nồi hấp Autoclave ở 121oC, 1atm. Áp suất khi hấp môi trường không nên lên quá 1 atm vì sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm (không bền) với nhiệt độ ở trong môi trường. 2.3.2.3. Các thao tác trong tủ cấy Rửa sạch tay bằng xà phòng trước khi thao tác, mặc áo blue, khẩu trang, mang gang tay. Khử trùng tủ cấy trước khi thao tác cấy: lau kĩ tủ bằng cồn 70o, bật UV 30 phút, tắt UV, khởi động tủ cấy và lau lại tủ cấy bằng cồn 70o. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 40
  42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Lau cồn 70o các bình môi trường, đốt dụng cụ cấy bằng kim loại (kẹp, dao cấy) bằng cồn 96o sau mỗi lần thay đổi thao tác và gác lên kệ để nguội mới tiến hành cấy. Trên bàn cấy thường xuyên có đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 96o để nhúng các dụng cụ làm việc. Các mẫu bị rơi trên mặt bàn không được sử dụng lại. Hơ nhẹ miệng chai môi trường trước và sau khi cấy. Khi mở nắp chai hoặc ống nghiệm môi trường nuôi cấy, dùng ngón tay kế út và ngón tay út cầm lấy nắp gòn và không chạm tay vào bề mặt bên trong của nắp gòn, cũng như không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào cho đến khi gắp nó trở lại chai môi trường. Thao tác cấy phải nhanh nhẹn, hạn chế vơ tay qua mẫu đang cấy. Tránh để tay mới lau cồn gần đèn cồn. Vệ sinh sạch sẽ tủ cấy bằng cồn 70o sau khi kết thúc công việc. 2.3.3 Bố trí thí nghiệm Đề tài được thực hiện trên giống Lan vũ nữ Oncidium in vitro, các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 5 bình, 3 mẫu cấy/bình. 2.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của lòng trắng trứng lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro Bảng 2.1. Ảnh hưởng của lòng trắng trứng lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro SVTH : Mai Duy Vinh Trang 41
  43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Lòng trắng Nghiệm thức trứng(ml/l) NAA (mg/l) BA (mg/l) A0 0 1 2 A1 10 1 2 A2 20 1 2 A3 30 1 2 A4 40 1 2 A5 50 1 2 Bổ sung thêm đường 30 g/l, than hoạt tính 1 g/l, agar 9 g/l. 2.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của lòng đỏ trứng gà lên sự phát sinh hình thái của lan vũ nữ Oncidium in vitro Bảng 2.2 Ảnh hưởng của lòng đỏ trứng gà lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro Nghiệm thức Lòng đỏ trứng gà(ml/l) NAA(mg/l) BA (mg/l) B0 0 1 2 B1 10 1 2 B2 20 1 2 B3 30 1 2 B4 40 1 2 B5 50 1 2 Bổ sung đường 30 g/l, than hoạt tính 1 g/l, agar 9 g/l. 2.3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết cá nục lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro SVTH : Mai Duy Vinh Trang 42
  44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Bảng 2.3 Ảnh hưởng của dịch chiết dịch chiết cá nục lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro Nghiệm thức Dịch chiết cá nục(g/l) NAA(mg/l) BA (mg/l) C0 0 1 2 C1 10 1 2 C2 20 1 2 C3 30 1 2 C4 40 1 2 C5 50 1 2 Bổ sung thêm đường 30 g/l, than hoạt tính 1 g/l, agar 9 g/l. 2.3.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết sữa tươi lên sự phát sinh hình thái của Lan vũ nữ Oncidium in vitro Bảng 2.4 Ảnh hưởng của dịch sữa tươi lên sự phát sinh hình thái của lan Oncidium in vitro Dịch chiết sữa tươi Nghiệm thức NAA (mg/l) BA (mg/l) (g/l) D0 0 1 2 D1 10 1 2 D2 20 1 2 D3 30 1 2 D4 40 1 2 D5 50 1 2 Bổ sung đường 30 g/l, than hoạt tính 1 g/l, agar 9 g/l. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 43
  45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 2.4. Các chỉ tiêu theo dõi - Quan sát và lấy kết quả sau 4 tuần, 8 tuần - Quan sát các đặc điểm sinh trưởng của mẫu cấy, sự phát sinh hình thái của mẫu cấy như: màu sắc lá, số lượng lá, đặc điểm về hình thái của lá, rễ và cây. - Xác định trọng lượng tươi của mẫu cấy (g/mẫu) - Xác định số PLB - Ghi nhận số cây con (cây/mẫu) - Số lượng chồi (chồi/mẫu) - Ghi nhận số lượng lá (lá/cây) - Chiều dài lá (cm) - Đường kính lá (cm) - Ghi nhận nếu có sự xuất hiện PLB (đếm số PLB, số chồi và số cây) - Số lượng rễ (rễ/cây) - Chiều dài của rễ (cm) SVTH : Mai Duy Vinh Trang 44
  46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 45
  47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ lòng trắng trứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium sp. Các cụm PLB của lan Oncidium được dùng làm mẫu trong thí nghiệm xác định nồng độ lòng trắng trứng thích hợp cho sự sinh trưởng của lan Oncidium. Sau 2 tuần nuôi cấy các PLB Oncidium tăng sinh, bắt đầu định hướng biệt hóa, lúc đầu PLB xanh nhạt, kích thước trung bình, sang tuần thứ tư PLB gia tăng kích thước, xanh đậm dần, một số PLB phát triển thành chồi và cây con, tạo thêm nhiều PLB mới sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung kết hợp với nồng độ BA là 2 mg/l, nồng độ NAA là 1mg/l, nước dừa 50ml/l, đường 30g/l, than hoạt tính 1g/l, agar 9g/l còn nồng độ lòng trắng trứng thì thay đổi tạo thành các môi trường khác nhau, các kết quả thí nghiệm được thu nhận và trình bày ở bảng 3.1, hình 3.1 và hình 3.2 như sau: SVTH : Mai Duy Vinh Trang 46
  48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 47
  49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ lòng trắng trứng lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với các nồng độ của lòng trắng trứng là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 48
  50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ lòng trắng trứng lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy(tt). A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với các nồng độ của lòng trắng trứng là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 49
  51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.3 cho thấy cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Kết quả thí nghiệm cho thấy khi không bổ sung lòng trắng trứng (nghiệm thức I0), khả năng sống sót của PLB là khá cao, khi bổ sung lòng trắng trứng vào môi trường nuôi cấy (từ 10 đến 50 ml/l), thì khi tăng nồng độ lòng trắng trứng (từ 10 đến 30 ml/l), tỷ lệ sống cao. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ lòng trắng trứng lên thì mẫu bắt đầu chết (nghiệm thức A4 và A5). Khi tăng nồng độ lòng trắng trứng cũng làm gia tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy, như vậy tỷ lệ sống sót và trọng lượng tươi có mối tương quan thuận với nhau. Cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Nghiệm thức A0, sau 2 tuần, mẫu cấy bắt đầu phản ứng tăng sinh. Sau 4 tuần, PLB tăng sinh mạnh, PLB xanh tốt, khỏe sáng bóng, sau đó các PLB tạo ra trước bắt đầu xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, sau 6 tuần các chồi bắt đầu phát triển. Tuy nhiên các chồi chưa phát triển thành cây. Nghiệm thức A1, sau 2 tuần, mẫu cấy có cảm ứng và bắt đầu tăng sinh. Mẫu tăng sinh khá nhanh, phát triển tốt, đa số các PLB xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, tạo thêm một số PLB mới. Sau 4 tuần, phần lớn PLB đều phát triển thành chồi, sau 6 tuần chồi khá nhiều, nhưng chưa phát triển thành cây. Nghiệm thức A2, sau 2 tuần, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh mạnh mẽ, PLB xanh tốt, khỏe sáng bóng, sau đó một số PLB tạo ra trước bắt đầu xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, sau 6 tuần các chồi phát triển mạnh mẽ. Nghiệm thức A3, sau 2 tuần, mẫu cấy có cảm ứng và bắt đầu tăng sinh. Mẫu tăng sinh khá nhanh, phát triển tốt, đa số các PLB xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, tạo thêm một số PLB mới. Sau 4 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 50
  52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm tuần, phần lớn PLB đều phát triển thành chồi, sau 6 tuần chồi phát triển nhiều dày đặc nhưng chưa phát triển thành cây. Nghiệm thức A4, sau 2 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng PLB không tăng sinh nhiều, chỉ tạo ra một số ít PLB mới. Sau 4 tuần PLB phát triển thành chồi nhưng rất cằn cỗi và kém phát triển lá vàng úa rồi chết, một số sống sót nhưng kém sức sống. Sau 8 tuần số lượng PLB đã chết hết, các chồi và cây con phát triển kém. Nghiệm thức A5, sau 2 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng PLB tăng sinh không đáng kể, chỉ tạo ra một số ít PLB mới. Sau 8 tuần PLB phát triển thành chồi nhưng rất cằn cỗi và kém phát triển lá vàng úa rồi chết, một số sống sót nhưng kém sức sống. Tỷ lệ mẫu chết rất nhiều. Nhìn chung trong thí nghiệm này, nghiệm thức A3 tốt nhất có số chồi nhiều nhất, chồi phát triển tốt xanh, có trọng lượng tươi cao nhất. 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của lòng đỏ trứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium sp Các cụm PLB của lan Oncidium được dùng làm mẫu trong thí nghiệm xác định nồng độ lòng đỏ trứng thích hợp cho sự sinh trưởng của lan Oncidium. Sau 2 tuần nuôi cấy các PLB tăng sinh, bắt đầu định hướng biệt hóa, lúc đầu PLB xanh nhạt, kích thước trung bình, sang tuần thứ tư PLB gia tăng kích thước, xanh đậm dần, một số PLB phát triển thành chồi và cây con, tạo thêm nhiều PLB mới sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung kết hợp với nồng độ BA là 2 mg/l, nồng độ NAA là 1mg/l, nước dừa 50ml/l, đường 30g/l, than hoạt tính 1g/l, agar 9g/l còn nồng độ lòng trắng trứng thì thay đổi tạo thành các môi trường khác nhau, các kết quả thí nghiệm được thu nhận và trình bày ở bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4 như sau: SVTH : Mai Duy Vinh Trang 51
  53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 52
  54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ lòng đỏ trứng lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với các nồng độ của lòng đỏ trứng là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 53
  55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lòng đỏ trứng lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy(tt). B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với các nồng độ của lòng đỏ trứng là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 54
  56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.2 cho thấy cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Kết quả thí nghiệm cho thấy khi không bổ sung lòng đỏ trứng (nghiệm thức B0), khả năng sống sót của PLB là khá cao, khi bổ sung lòng đỏ trứng vào môi trường nuôi cấy (từ 10 đến 50 ml/l), thì trọng lượng tươi cũng tăng dần theo nồng độ dịch lòng đỏ trứng ( từ 10 đến 30 ml/l). Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ lòng đỏ trứng lên thì trọng lượng tươi bắt đầu giảm theo nồng độ lòng đỏ trứng ( từ 40 đến 50 ml/l) (Hình 3.2). Cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Nghiệm thức B0, sau 2 tuần, mẫu cấy bắt đầu phản ứng tăng sinh. Sau 4 tuần, PLB tăng sinh mạnh, PLB xanh tốt, sau đó các PLB tạo ra trước bắt đầu xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, sau 6 tuần các chồi phát triển nhiều hơn nhưng chưa phát triển thành cây con. Nghiệm thức B1, sau 2 tuần, mẫu cấy bắt đầu phản ứng tăng sinh. Sau 4 tuần, PLB tăng sinh mạnh, PLB xanh tốt, sau đó các PLB tạo ra trước bắt đầu xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, sau 6 tuần các chồi phát triển nhiều xanh tốt. Nghiệm thức B2, sau 2 tuần, mẫu cấy có cảm ứng và bắt đầu tăng sinh. Mẫu tăng sinh khá nhanh, phát triển tốt, đa số các PLB xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, tạo thêm một số PLB mới. Sau 4 tuần, phần lớn PLB đều phát triển thành chồi, sau 6 tuần chồi phát triển nhiều và dày đặc Nghiệm thức B3, sau 2 tuần, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh mạnh mẽ, PLB xanh tốt, khỏe sáng bóng, sau đó một số PLB tạo ra trước bắt đầu xuất hiện các mầm lá, các mầm lá này kéo dài thành lá và PLB phát triển thành chồi, sau 6 tuần các chồi này xuất hiện các sơ khởi rễ, chúng kéo dài thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh. Sau 8 tuần PLB phát triển bình thường, chồi và cây con phát triển xanh tốt. Nghiệm thức B4, sau 2 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng PLB không tăng sinh nhiều, chỉ tạo ra một số ít PLB mới. Sau 8 tuần PLB phát triển SVTH : Mai Duy Vinh Trang 55
  57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm thành chồi nhưng rất cằn cỗi và kém phát triển, một số sống sót nhưng kém sức sống, một số chồi phát triển thành cây con. Nghiệm thức B5, sau 2 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng PLB tăng sinh không đáng kể, chỉ tạo ra một số ít PLB mới. Sau 8 tuần PLB phát triển thành chồi nhưng rất cằn cỗi và kém phát triển. Nhìn chung trong thí nghiệm này, nghiệm thức B3 tốt nhất có tỷ lệ trọng lượng tươi cao, số lượng PLB và chồi không nhiều nhưng phát triển tốt, và số cây con trong nghiệm thức này bắt đầu phát triển tốt. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của dịch chiết cá nục bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium sp Các cụm PLB của lan Oncidium được sử dụng làm nguồn mẫu để nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết cá nục lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Oncidium. Việc nhân giống in vitro trên đối tượng hoa lan mang lại hệ số nhân giống rất cao, cây giống đồng đều về hình thái, đồng nhất về mặt di truyền, có thể nhân giống nhanh và chủ động, tuy nhiên để có được các cây con có chất lượng tốt thì việc chuẩn hóa cây giống trước khi đưa ra vườn ươm để thích nghi cây là điều rất quan trọng, nó thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà nhân giống. Đặc biệt cây con Oncidium khá yếu ớt nếu chuyển ra ngoài vườn ươm mà cây quá nhỏ hay bộ rễ yếu thì dễ dẫn đến hiện tượng cây con chết hàng loạt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu môi trường nhân giống giúp cây con phát triển mạnh bộ lá cứng cáp, xanh đậm, bộ rễ phát triển tốt (rễ to khỏe) giúp cây thích nghi tốt hơn khi chuyển ra vườn ươm. Thí nghiệm này bổ sung thêm dịch chiết cá nục với các nồng độ khác nhau từ 0; 10; 20; 30; 40; 50 g/l vào môi trường nuôi cấy chồi Oncidium nhằm tìm ra nồng độ dịch chiết cá nục tối ưu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chồi, tăng khả năng ra rễ, tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển cây con in vitro ra vườn ươm. Các kết quả thí nghiệm được thu nhận và trình bày ở bảng 3.3, hình 3.5 và hình 3.6 như sau: SVTH : Mai Duy Vinh Trang 56
  58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 57
  59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết cá nục lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với các nồng độ của dịch chiết cá nục là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 58
  60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ dich chiết cá nục lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy(tt). C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với các nồng độ của dich chiết cá nục là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 59
  61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.3cho thấy khi vắng mặt dịch chiết cá nục (nghiệm thức C0), chồi vẫn có khả năng sinh trưởng và phát triển khá tốt. Khi bổ sung dịch chiết giá vào môi trường nuôi cấy (từ 10 đến 50 g/l), thì khi bổ sung 10 g/l dịch chiết cá nục vào môi trường nuôi cấy (nghiệm thức C1) mẫu cấy phát triển kém hơn so với đối chứng, số lượng PLB và chồi phát triển yếu. Tăng lượng dịch chiết (từ 20 đến 30 mg/l), thì khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy tỷ lệ thuận với nồng độ dịch chiết. Ở nồng độ dịch chiết (từ 40 đến 50 mg/l) thì khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy tỷ lệ nghịch với nồng độ dịch chiết. Nồng độ dịch chiết càng cao mẫu cấy sinh trưởng và phát triển càng kém. Cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Nghiệm thức C0, sau 4 tuần, mẫu cấy có cảm ứng và chồi bắt đầu tăng sinh tạo một số chồi mới. Sau 6 tuần nuôi cấy, số lượng PLB và chồi phát triển dày đặc, xanh tốt nhưng các chồi chưa mọc rễ thành cây. Nghiệm thức C1, sau 4 tuần, các chồi vẫn có màu xanh bình thường, nhưng chưa tăng trưởng. Sau 6 tuần, chỉ có một số chồi tăng sinh nhưng rất chậm không có khả năng mọc rễ phát triển thành cây, số lượng PLB phát triển rất ít. Nghiệm thức C2, sau 4 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng và bắt đầu quá trình tăng trưởng, lá xanh bóng đẹp, bắt đầu hình thành một số chồi mới. Sau 6 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển chiều cao kéo dài thân và lá. Sau 8 tuần, một chồi đã hình thành sơ khởi rễ, rể nhanh chóng kéo dài để phát triển thành cây hoàn chỉnh, số lượng PLB và chồi ít phát triển. Nghiệm thức C3, sau 4 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng và bắt đầu quá trình tăng trưởng khá mạnh mẽ, lá xanh bóng đẹp, bắt đầu hình thành một số chồi mới. Sau 6 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển chiều cao kéo dài thân và lá. Sau 8 tuần, một chồi đã hình thành sơ khởi rễ, rể nhanh chóng kéo dài để phát triển thành cây hoàn chỉnh, số lượng PLB và chồi cũng phát triễn khá nhiều xanh tốt. Về đặc điểm sinh trưởng của cây có bộ lá xanh tốt, cây mập và dài, kích thước lớn, lá bóng đẹp, phát triển rễ mạnh. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 60
  62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nghiệm thức C4, sau 4 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường nhưng và bắt đầu quá trình tăng trưởng, số lượng PLB phát triển, hình thành một số chồi mới. Sau 6 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển chiều cao kéo dài thân và lá. Sau 8 tuần, một chồi đã hình thành sơ khởi rễ, rể nhanh chóng kéo dài để phát triển thành cây hoàn chỉnh, chồi chậm phát triển. Nghiệm thức C5, sau 2 tuần mẫu cấy có phản ứng với môi trường, nhưng không có dấu hiệu tăng trưởng. Sau 6 tuần các chồi ban đầu vàng dần, héo và có dấu hiệu chết, ở phần gốc chồi. Chồi mẹ bị héo lá, không hình thành rễ. Bắt đầu hình thành nhiều chồi con, nhỏ. Sau 8 tuần hầu như toàn bộ chồi đều cằn cỗi, kém sức sống và chết hàng loạt. Nhìn chung trong thí nghiệm này, nghiệm thức C3 tốt nhất có trọng lượng tươi, số lượng PLB và số chồi phát triển khá đều và tốt. Số lượng cây, chiều cao cây, số lượng lá phát triển tốt nhất. 3.3. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của sữa tươi bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium sp Các cụm PLB của lan Oncidium được sử dụng làm nguồn mẫu để nghiên cứu ảnh hưởng của sữa tươi lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Oncidium. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành bổ sung thêm sữa tươi vào môi trường nuôi cấy với các nồng độ khác nhau từ 0; 10; 20; 30; 40; 50 ml/l vào môi trường nuôi cấy chồi Oncidium nhằm tìm ra nồng độ sữa tươi tối ưu thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chồi, tăng khả năng ra rễ, tăng tỷ lệ sống sót khi chuyển cây con in vitro ra vườn ươm. Sau 2 tuần, mẫu cấy có phản ứng với môi trường và bắt đầu cảm ứng, tuy nhiên tăng sinh ít, chưa có sự khác biệt nhiều giữa các nghiệm thức, sang đến tuần thứ bắt đầu có sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm rõ rệt. Sau 8 tuần nuôi cấy, theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy, chúng tôi tiến hành thu thập kết quả, xử lý số liệu, trình bày trong bảng 3.3, hình 3.7 và hình 3.8 như sau: SVTH : Mai Duy Vinh Trang 61
  63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 62
  64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ sữa tươi lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy. D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với các nồng độ của sữa tươi là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 63
  65. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ sữa tươi lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium sp in vitro sau 8 tuần nuôi cấy(tt). D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với các nồng độ của sữa tươi là: 0; 10; 20; 30; 40 SVTH : Mai Duy Vinh Trang 64
  66. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.4 cho thấy khi vắng mặt sữa tươi (nghiệm thức D0), chồi vẫn có khả năng sinh trưởng và phát triển khá tốt, sau 4 tuần nuôi cấy số lượng PLB và chồi phát triển mạnh mẽ và xanh tốt. Khi bổ sung sữa tươi vào môi trường nuôi cấy (từ 10 đến 50 ml/l), thì khi bổ sung 10 đến 20 ml/l dịch chiết cà chua vào môi trường nuôi cấy (nghiệm thức D1 và D2) mẫu cấy phát triển không khác biệt so với đối chứng, số lượng PLB và chồi phát triển nhiều, chồi chưa mọc rễ hình thành cây con. Khi bổ sung 30 ml/l sữ tươi vào môi trường cấy chồi tỏ ra rất hiệu quả đối với chồi . Tuy nhiên nếu tăng nồng độ dịch chiết cà chua bổ sung vào môi trường nuôi cấy chồi là 40 đế 50 ml/l thì sự gia tăng nồng độ tỷ lệ nghịch với tốc độ tăng trưởng của cây, cây trở nên kém phát triển, cằn cỗi, lùn ra ít chồi, phát triển rễ kém, một số héo úa và chết. Cụ thể ở từng nghiệm thức như sau: Nghiệm thức D0, sau 4 tuần, mẫu cấy có cảm ứng và chồi bắt đầu tăng sinh tạo một số chồi mới. Sau 6 tuần nuôi cấy, số lượng PLB và chồi phát triển mạnh mẽ, xanh và tốt tuy nhiên chồi chưa mọc rễ để phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Nghiệm thức D1, sau 4 tuần, các chồi tăng trưởng khá mạnh, bộ lá và thân chồi màu xanh bóng. Sau 6 tuần, chồi vẫn phát triển bình thường không tạo ra rễ để phát triển thành cây, số lượng PLB hầu như không phát triển. Nghiệm thức D2, sau 4 tuần mẫu cấy phản ứng mạnh mẽ với môi trường nuôi cấy, số lượng chồi tăng nhanh và phát triển xanh tốt. Sau 6 tuần nuôi cấy số lượng PLB và chồi phát triển mạnh , một số chồi phát triển chiều cao kéo dài thành thân và lá nhưng vẫn chưa có rễ để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Nghiệm thức D3, sau 4 tuần mẫu cấy phản ứng mạnh mẽ với môi trường nuôi cấy, số lượng chồi tăng nhanh và phát triển xanh tốt. Sau 6 tuần nuôi cấy chồi phát triển mạnh , một số chồi phát triển chiều cao kéo dài thành thân và lá, một số chồi đã mọc rễ và phát triển thành thành cây hoàn chỉnh. Sau 8 Tuần số lượng chồi phát triển thành cây nhiều, cây phát triển xanh tốt. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 65
  67. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm Nghiệm thức D4, sau 4 tuần số lượng chồi phát triển xanh tốt, một số chồi bắt đầu mọc rễ phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Sau 6 tuần số lượng chồi phát triển thành cây con nhiều nhưng cây thiều sức sống kém phát triển. Nghiệm thức D5, sau 4 tuần mẫu cấy phát triển kém chưa có dấu hiệu rõ. Sau 6 tuần nuôi cấy một số chồi phát triển chiều cao kéo dài thành thân và lá bắt đầu mọc rễ phát triển thành cây hoàn chỉnh, cây thiếu sức sống phát triển kém. Nhìn chung trong thí nghiệm này, nghiệm thức D3 tốt nhất có trọng lượng tươi, số lượng PLB và số chồi phát triển khá đều và tốt. Số lượng cây, chiều cao cây, số lượng lá phát triển tốt nhất. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 66
  68. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm SVTH : Mai Duy Vinh Trang 67
  69. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 4.1. Kết luận 4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ lòng trắng trứng lên sự sinh trưởng của lan Oncidium Trong thí nghiệm này, nghiệm thức A3 (môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l NAA, 50 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 9 g/l agar, 30g/l đường và 30ml/l lòng trắng trứng) cho kết quả tốt nhất có trọng lượng tươi cao nhất, số lượng PLB và chồi phát triển xanh tốt, số chồi nhiều nhất . 4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ lòng đỏ trứng bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium Trong thí nghiệm này, nghiệm thức B3 (môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l NAA,50 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 9 g/l agar, 30g/l đường và 30 ml/l lòng đỏ trứng) cho kết quả tốt nhất, mẫu cấy có trọng lượng tươi cao nhất có số PLB và chồi phát triển tốt, cây xanh tốt. 4.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của dịch chiết cá bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium Trong thí nghiệm này, nghiệm thức C3 (môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l NAA, 50 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 9 g/l agar, 30g/l đường và 30 g/l dịch chiết cá) cho hiệu quả tốt nhất, mẫu cấy có trọng lượng tươi cao, số cây con nhiều nhất cây phát triển tốt xanh đẹp, rễ, thân, lá phát triển tốt nhất, số chồi và PLB phát triển xanh tốt. 4.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của sữa tươi bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của lan Oncidium Trong thí nghiệm này, nghiệm thức D3 (môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA, 1 mg/l NAA, 50 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, 9 g/l agar, 30g/l đường và 30 g/l sữa tươi) cho hiệu quả tốt nhất, mẫu cấy có trọng lượng tươi cao, số cây con nhiều nhất cây phát triển tốt xanh đẹp, rễ, thân, lá phát triển tốt nhất, số chồi và PLB phát triển xanh tốt. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 68
  70. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 4.2. Đề nghị Để có thể đánh giá được hiệu quả sinh trưởng, chất lượng cây con, khả năng sống sót của cây con khi ra vườn ươm cần tiến hành chuyển cây con ra vườn ươm chăm sóc, theo dõi sinh trưởng ghi nhận lại các chỉ tiêu sinh trưởng ở vườn ươm sẽ đánh giá được chính xác và cụ thể hơn, tuy nhiên vì thời gian thực hiện đồ án có hạn nên khi chuyển cây con ra điều kiện ex vitro trồng và chăm sóc chưa đủ thời gian để thu thập kết quả và đánh giá khả năng sinh trưởng tại vườn ươm. Vì vậy, chúng tôi xin đưa ra một số đề nghị sau: – Cần nghiên cứu tạo mô sẹo Oncidium để rút ngắn thời gian nhân giống và gia tăng hệ số nhân giống. – Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng của mô sẹo, phôi, PLB và cây con Oncidium. – Sử dụng các chất làm đặc môi trường khác để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng của mô sẹo, phôi, PLB và cây con và lên hệ thống rễ của cây. – Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại dịch chiết khác có nguồn gốc thực vật như: giá, khoai tây, cà rốt, cà chua lên sự sinh trưởng và phát triển của lan Oncidium ở các giai đoạn phát triển khác nhau. – Nghiên cứu chuẩn hóa kích thước cây con trước khi chuyển ra vườn ươm. Cần phải chuyển cây con ra vườn ươm trồng và chăm sóc cây con, đánh giá được ảnh hưởng của loại dịch chiết nào cho kết quả tối ưu nhất đối với quá trình thuần hóa cây con tại vườn ươm. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 69
  71. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt [1]. Phan Thúc Huân (1989). Hoa lan, Cây cảnh và vấn đề phát triển sản xuất, kinh doanh, xuất khẩu, NXB Tp. Hồ Chí Minh. [2]. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978). Phân loại thực vật - Thực vật bậc cao. NXB Đại Học và Trung Học chuyên nghiệp. [3]. Nguyễn Như Khanh (2002). Sinh học phát triển thực vật. NXB Giáo Dục. [4]. Dương Công Kiên (2002). Nuôi cấy mô thực vật. NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. [5]. Dương Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật (tập 2). NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. [6]. Dương Công Kiên (2006). Nuôi cấy mô (tập 3), Tủ sách ĐH Khoa học tự nhiên. [7]. Nguyễn Xuân Linh (1998). Hoa và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp. [8]. Dương Tấn Nhựt (2007). Công nghệ sinh học thực vật (tập 1). NXB Nông nghiệp - TP. Hồ Chí Minh. [9]. Dương Tấn Nhựt (2007). Công Nghệ Sinh Học Thực Vật (tập 2), NXB Nông Nghiệp. [10]. Hoàng Thị Sản (2003). Phân loại học thực vật. NXB Giáo Dục. [11]. Nguyễn Thiên Tịnh (1996). Kỹ thuật trồng lan, NXB Nông nghiệp. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 70
  72. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 2. Tài liệu tiếng Anh [12]. Alisdair R.F., Lothar W. (2001). Molecular and biochemical triggers of potato tuber development. Plant Physiol, 127: 1459-1465. [13]. Arditti J., Ernst R. (1993). Micropropagation of orchids. John Wiley & Sons, New York, USA. [14]. Chen, J.T., Chang, W.C. (2001). Effects of auxins and cytokinins on direct somatic embryogenesis from leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’. - Plant Growth Regul. 34: 229- 232. [15]. Evans D. A., Sharp W., Flick C. (1981). Growth and behaviour of cell cultures. In: Thorpe T.A. (Ed.), Plant Tissue Culture - Methods and Application in Agriculture. Orlando, Florida, USA. Academic Press: 45-113. [16]. Fridborg F., Eriksson T. (1975). Effects of activated charcoal on growth and morphogenesis in cell cultures. Physiol. Plant. 34: 306-308. [17]. Gibson D.M., Ketchum R.S.B., Christen A.A. (1993). Initiation and growth of cell, Plant Cell Rep., 12(9): 479-482. [18]. Malabadi, R.B.; Mulgund, G.S.; Kallappa, N. (2005). Micropropagation of Dendrobium nobile from shoot tip sections. J Plant Physiol 162: 473–478. [19]. Murashige, T.; Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473–497. [20]. Murthy, B. N. S.; Murch, S. J.; Saxena, P. K. (1998). Thidiazuron: a potent regulator of in vitro morphogenesis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 34:267–275. [21]. Teob, E.S. (ed.) (1989). Orchids of Asia. - Times Books International, Singapore. SVTH : Mai Duy Vinh Trang 71
  73. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phan Quốc Tâm 3. Tài liệu Internet [22]. [23]. [24]. [25]. [26]. http:// www.sciencedirect.com [27]. http:// www.springer.com SVTH : Mai Duy Vinh Trang 72