Đồ án Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng bemisia tabaci và rệp aphis gossypii của nấm paecilomyces lilacinus

130 trang thiennha21 12/04/2022 4890

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng bemisia tabaci và rệp aphis gossypii của nấm paecilomyces lilacinus", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_danh_gia_kha_nang_gay_chet_bo_phan_trang_bemisia_tabac.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng bemisia tabaci và rệp aphis gossypii của nấm paecilomyces lilacinus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY CHẾT BỌ PHẤN TRẮNG BEMISIA TABACI VÀ RỆP APHIS GOSSYPII CỦA NẤM PAECILOMYCES LILACINUS Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ XUÂN HƯƠNG MSSV: 1151110153 Lớp: 11DSH04 TP. Hồ Chí Minh, 2015
LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực. Mọi thơng tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Xuân Hương
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hồn thành tốt khĩa học 2011 – 2015. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cơ trong khoa Cơng nghệ sinh học, Thực phẩm và Mơi trường đã giảng dạy em trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Hai người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành, cán bộ phịng thí nghiệm Trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em cĩ thể hồn thành tốt đồ án. Em xin cảm ơn các anh chị phịng vi sinh Khu Nơng Nghiệp Cơng Nghệ Cao TPHCM đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án. Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phịng thí nghiệm vi sinh, đặc biệt là bạn Huỳnh Thị Ngọc Trâm đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng em trải qua những khĩ khăn trong quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, con xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình đặc biệt là ba mẹ đã luơn bên cạnh, cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con cĩ thể hồn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Xuân Hương
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 3 1.1.1. Phân loại khoa học 3 1.1.2. Đặc điểm sinh thái 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái 4 1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. 6 1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ 7 1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập 9 1.3. Một số thành tựu và ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống. 13 1.3.1. Sản xuất enzyme 14 1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp 15 1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 16 1.3.4. Xứ lý mơi trường 16 1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. 17 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. 17 1.6. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phịng trừ bọ phấn và các cơn trùng chích hút khác. 19 i
Đồ án tốt nghiệp 1.6.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 19 1.6.2. Tổng quan về rệp 25 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30 2.2. Thiết bị - hĩa chất - vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1. Thiết bị - hĩa chất 30 2.2.2. Vật liệu 31 2.2.3. Các mơi trường sử dụng 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus 34 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 37 2.3.3. Định tính khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. 41 2.3.4. Đánh giá khả năng gây chết của bọ phấn và rệp của nấm Paecilomyces lilacinus. 41 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 43 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus 48 3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 51 3.2.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên mơi trường thạch. 51 ii
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Hoạt tính Chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 53 3.3. Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. 55 3.4. Đánh giá khả năng gây chết cơn trùng chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus. 58 3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus 58 3.4.2 Đánh giá khả năng gây chết rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus. 60 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 62 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus 62 3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 65 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces lilacinus. 68 3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 70 3.5.5. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 72 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75 4.1. Kết luận 75 4.2. Đề nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CZ: Czapeck - Dox ĐC: Đối chứng MA: Malt NT: Nghiệm thức PDA: Potato D - Glucose Agar SA: Sabouraud + KC iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces lilacinus phân lập lại sau khi lây nhiễm trên bọ phấn. 49 Bảng 3.2 Đường kính vịng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 51 Bảng 3.3 Hoạt tính của enzyme chitinase sau 1,2,3,4,5 ngày nuơi cấy 54 Bảng 3.4 Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus 56 Bảng 3.5 Số bọ phấn Bemisia tabaci chết ở các ngày sau chủng. 58 Bảng 3.6 Hiệu lực diệt bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus 59 Bảng 3.7 Số rệp Aphis gossypii chết ở các ngày sau chủng 61 Bảng 3.8 Hiệu lực diệt rệp của nấm Pacilomyces lilacinus 61 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 64 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces lilacinus qua các ngày. 66 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces lilacinus 68 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển đường kính của Paecilomyces lilacinus. 71 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces lilacinus. 73 Bảng 3.14 Tỷ lệ ức chế nấm Paecilomyces lilacinus của một số loại thuốc hĩa học. 73 v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. 5 Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. 6 Hình 1.3 Cấu tạo hĩa học của độc tố paecilotoxin. 7 Hình 1.4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii 10 Hình 1.5 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus 12 Hình 1.6 Cành bào đài, bào tử của nấm Paecilomyces fumosoroseus 12 Hình 1.7 Cành bào đài, bào tử nấm Paecilomyces amoeneroseus 13 Hình 1.8 Các giai đoạn trong vịng đời của bọ phấn trắng 20 Hình 1.9 Cấu tạo ngồi của rệp 25 Hình 1.10 Cấu tạo ngồi của rệp 26 Hình 2.1 Hộp dùng để bố trí thí nghiệm 35 Hình 2.2 Các hộp dùng để đựng rệp bố trí thí nghiệm 42 Hình 3. 1 Nấm phân lập lại từ bọ phấn Bemisia tabaci 48 Hình 3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vịng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 NSC) 52 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 NSC 52 Hình 3. 4 Hoạt độ enzyme chitinase sau các ngày nuơi cấy 54 Hình 3.5 Sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vịng phân giải protease của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 ngày). 56 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 ngày nuơi cấy 57 Hình 3.7 Mẫu bọ phấn khơng bị kí sinh (a) và mẫu bọ phấn bị kí sinh (b) được soi bằng kính lúp soi nổi 59 Hình 3. 8 Mẫu bọ phấn khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học 60 Hình 3. 9 Mẫu rệp khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học 62 vi
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Sự phát triển của Paecilomyces lilacinus trên mơi trường cĩ pH khác nhau ở 14 NSC (a: pH5, b: pH6, c: pH7, d: pH8) 63 Hình 3.11 Đường kính nấm Paecilomyces lilacinus ở các pH mơi trường 5, 6, 7, 8 qua các ngày nuơi cấy. 64 Hình 3.12 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC 65 Hình 3.13 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy 66 Hình 3.14 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau nuơi cấy 68 Hình 3.15 Sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 69 Hình 3.16 Tản nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC 70 Hình 3.17 Sự phát triển đường kính của nấm Paecilomyces lilacinus dưới nguồn Cacbon khác nhau 71 Hình 3.18 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy 72 vii
Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Rau là loại thực phẩm khơng thể thiếu trong bữa ăn của người Việt Nam. Đặc biệt là các loại rau ăn quả họ cà như: cà chua, ớt, cà tím lại càng được ưa chuộng vì chứa nhiều dinh dưỡng. Tại thành phố Hồ Chí Minh, diện tích trồng các cây ăn quả dài ngày như cà chua, ớt, cà tím chiếm 8- 17% tổng diện tích trồng rau (Nguồn: Sở Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thơn, 2013). Theo Chi cục Bảo vệ Thực vật thành phố, đây là các loại cây ký chủ chính của bọ phấn trắng. Nguyễn Đỗ Hồng Việt (2009) cho biết, bọ phấn trắng Bemisia tabaci xuất hiện rất sớm (chỉ 7 ngày sau khi trồng) và gây hại nặng cho cây cà pháo ở Tây Ninh. Tại các tỉnh ở miền Bắc Việt Nam, bọ phấn trắng xuất hiện và gây hại cho sản xuất cà chua. Quan trọng hơn nữa, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (Nguyễn Thơ, 1984; Ngơ Bích Hào, Hà Viết Cường, 2010) với tỷ lệ phát bệnh từ 40-100%. Ngồi cây cà chua, virus cịn lây nhiễm trên cây ớt cay, thuốc lá Bọ phấn là lồi đa thực nên số lượng phát triển quanh năm trên đồng ruộng và việc phịng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khĩ khăn. Tương tự như bọ phấn trắng, rệp Aphis gossypii là cơn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới. Rệp gây hại trực tiếp và truyền bệnh virus cho nhiều loại cây trồng. Biện pháp phịng trừ các lồi sâu chích hút này hiện nay chủ yếu là dùng thuốc hĩa học. Tuy nhiên, thuốc hĩa học cĩ độc tính rất cao, khĩ phân hủy trong điều kiện bình thường, sẽ tích tụ lại trong đất, nước, khơng khí và các sản phẩm nơng nghiệp, làm ơ nhiễm mơi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người, và sinh vật cĩ ích, gây hiện tượng kháng thuốc dẫn tới nguy cơ bùng phát dịch hại trên nhiều loại cây trồng. Trong số các tác nhân sinh học, nấm Paecilomyces spp. đang được quan tâm vì hiệu quả kí sinh cao đối với các lồi cơn trùng chích hút. Nhiều nước trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành cơng nhiều loại chế phẩm sinh học cĩ nguồn gốc từ nấm Paecilomyces spp. để phịng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng. Tuy nhiên, ở Việt 1
Đồ án tốt nghiệp Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về lồi nấm cĩ ích này vẫn cịn khá hạn chế. Với những lý do trên sinh viên chọn đề tài: “Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus.” 2. Mục đích nghiên cứu Xác định khả năng gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus để làm cơ sở ứng dụng chúng trong phịng trừ các đối tượng này. 3. Nội dung nghiên cứu Phân lập lại nấm Paecilomyces lilacinus trên bọ phấn trắng Bemisia tabaci. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces lilacinus. Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn Bemisia tabaci và rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. 1. Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 1.1.1. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Paecilomyces Chi Paecilomyces do Bainier mơ tả vào 1907, sau đĩ được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều lồi mới. Chuyên luận về chi nấm này của Samson (1974) chấp nhận 16 lồi đã mơ tả, đồng thời tổ hợp mới 9 lồi và đề nghị 6 lồi mới, tất cả tập hợp trong 2 nhĩm lồi. Nhĩm lồi thứ nhất là nhĩm lồi Paecilomyces cĩ các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các lồi ưa nhiệt ơn hịa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, cĩ khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác. Nhĩm lồi thứ hai là nhĩm lồi Isarioides gồm các lồi khơng cĩ giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ơn hịa và cĩ khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng. Nhiều lồi trong nhĩm hai này kí sinh gây bệnh cơn trùng (Samson R.A.,1974). Đến năm 2004, dựa trên các kỹ thuật phương tiện hiện đại các lồi trong chi Paecilomyces được Samson R.A. hệ thống lại với 26 lồi. Năm 2005 nhĩm tác giả Liang Z.Q., Y.F., Chu, H.L. và Liu, A. Y. đã tiến hành đề tra và thu thập các nguồn nấm Paecilomyces tại Trung Quốc. Kết quả điều tra thu thập đã phát hiện ra một số lồi mới như Paecilomyces cylindricosporus sp. nov, Paecilomyces gunnii Z. Q. Liang, v.v. Các lồi này được thu thập từ đất và xác cơn trùng bị nấm ký sinh tại vùng cao của tỉnh Hồ Bắc. Cùng với các lồi đã được ghi nhận trước đĩ, nhĩm tác giả đã xây dựng khĩa định loại của 28 lồi trong chi Paecilomyces thu thập tại Trung Quốc. 3
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2. Đặc điểm sinh thái Nấm Paecilomyces spp. sinh sống trong đất, trong xác bã thực vật, trong thức ăn, giấy Một số lồi được phân lập trên cơn trùng ngủ nghỉ trong đất (theo trích dẫn Trần Ngọc Mai,2009). Trên thế giới cĩ rất nhiều lồi, cĩ phổ ký sinh cơn trùng rộng, cả ở vùng nhiệt đới và ơn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ, và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phịng và ngồi tự nhiên. Chi Paecilomyces cĩ nhiều lồi nhưng chủ yếu là hai lồi Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii. Một vài lồi Paecilomyces spp. cĩ khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550C (Samson, 1974). Hai lồi nấm chịu nhiệt trên cĩ khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là lồi quan trọng ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều lồi Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất cĩ hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al., 2003) . Một số lồi quan trọng trong phịng trừ sinh học như: Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết cơn trùng. Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất. Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, cơn trùng. Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đơi khi cịn ở cơn trùng chết, rừng cao su. (Crop Protection Compennium, 2002). 1.1.3. Đặc điểm hình thái 1.1.3.1. Đặc điểm đại thể Paecilomyces spp. là loại nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác cơn trùng. Khi được nuơi cấy trong mơi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, cĩ dạng thảm nhung, dạng bĩ sợi và thường lúc đầu cĩ màu trắng sau đĩ khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường 4
Đồ án tốt nghiệp được gọi là nấm tím) tùy vào từng lồi. Cũng cĩ lồi màu nâu hay vàng sẫm. Sợi nấm mềm, cĩ vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Khuẩn lạc thường mọc toả trịn, mép khuẩn lạc trơn nhẵn hoặc cĩ răng cưa. Khuẩn lạc kết chặt tạo thành các cột bào tử đính theo các vịng trịn đồng tâm quanh điểm cấy. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả như Barnett và Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972), Luangsa – Ard et al. (2006) thì ngồi đặc điểm khuẩn lạc, và kích thước cơ quan sinh bào tử, hình dạng và kích thước của bào tử là những chỉ tiêu cơ bản để phân biệt và định danh các lồi khác nhau của Paecilomyces. . Hình 1. 1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp) 1.1.3.2. Đặc điểm vi thể Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, nhẵn kích thước 4-7 x 30 -120 µm, mức độ phân nhánh của nấm phình to, phía trên nhỏ và uốn cong. Cuống bào tử bình thường sắp xếp dạng vịng hoặc khơng đồng đều, ở đỉnh cĩ nhiều thể bình mọc thành cụm vịng, thể bình cĩ chiều dài 2-7µm, phân gốc phình to hình elip, phần cổ hình trụ dài. Phần đỉnh thể bình lần lượt kéo dài phân chia thành các bào tử phân sinh một tế bào hình trứng kích thước 2.5-4 x 3.5 -5 µm . Bào tử phân sinh đơn bào, 5
Đồ án tốt nghiệp khơng màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc cĩ gai (Đỗ Thị Hồng, 2007). Hình 1. 2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp. (Nguồn: 1.1.4. Độc tố của nấm Paecilomyces spp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp. là paecilotoxin (leucinostatins), là một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ. Paecilotoxin cĩ cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hịa ở đầu N và amine ở đầu C. Paecilotoxin cĩ pháp danh hĩa học là (2S) - N- [(1S) - 1 - [[(1S) - 1- [[(1S)-1-[2[2- (3 - arbamoyl - propylcarbomoyl) - propan- 2ylcarbamoyl]propan - 2- ylcarbamoy]-3-methylbutylcarbomoy]-3-methyl-butyl] carbomoyl] propan-2- ycarbomoyl] - 2 - hydroxy - 3 - methyl - butyl] - carbomyl] - 5 - hydroxyl -3methyl - 7oxo-nonyl ] - 4 - methyl - 1 - [(E,4S) - 4 - methylhex – 2 - enoyl-pyrrolidin-2- carboxamide. (Nevalainen Helena, 1977). Sản phẩm của paecilotoxin cĩ rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B. Tùy từng lồi khác nhau mà cĩ sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hố thứ cấp này cĩ thể gây ra tác động diệt tuyến trùng. 6
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 3 Cấu tạo hĩa học của độc tố paecilotoxin. 1.1.5. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp. đối với ký chủ Chu kỳ sống của Paecilomyces spp. cĩ thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các bào tử sẽ tiếp xúc với cơn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lơng. Các bào tử bám vào lớp vỏ của cơn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ. Ống mầm phát triển dưới dạng một vịi bám xuyên qua biểu bì cơn trùng và đi vào trong xoang máu. Vịi bám là một tế bào cĩ kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, cĩ dịch nhầy để bám vào vỏ cơn trùng. Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học. Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thơng trong xoang máu của cơn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể cơn trùng để sinh trưởng và sinh sản. Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể cơn trùng. Paecilomyces spp. sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của cơn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày. Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của cơn trùng và phát triển thành đảm bào tử. Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, chu kỳ sống được hồn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và khơng cĩ sự cĩ mặt của vi sinh vật hoại sinh. 7
Đồ án tốt nghiệp Thơng thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thơng qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền bệnh. Trung gian đĩ cĩ thể là những lồi ký sinh hay cơn trùng ăn thịt. Nấm Paecilomyces spp. tấn cơng vào xoang máu của bọ phấn thơng qua lớp biểu bì hoặc đường miệng. Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mơ cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể cơn trùng. Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của cơn trùng là một quá trình thụ động nhờ giĩ và nước. Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì. Bào tử của nấm cĩ một lớp bên ngồi là bĩ sợi đan xen là các đuơi kị nước. Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuơi kị nước. Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện cĩ trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì cơn trùng dễ hơn. Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chĩng với sự tác động của các điều kiện sẵn cĩ của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên bề mặt cơn trùng. Nấm nảy mầm trong phạm vi cĩ đủ nguồn Carbon và Nitơ. Nấm xâm nhập vào cơn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám. Lớp biểu bì của cơn trùng cĩ hai lớp: ngồi là epicuticle và trong là procuticle. Epicuticle cĩ cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng khơng cĩ chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp cĩ chứa acid béo, lipid, sterol. Các procuticle phần lớn cĩ các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon. Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể cơn trùng để cĩ thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản. Sự xâm nhập vào cơ thể cơn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra và nhờ áp lực cơ học. Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì. Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngồi nhờ áp lực cơ học. Bào tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì. Giác bám là đầu tận 8
Đồ án tốt nghiệp cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử. Giác bám gắn vào biểu bì cơn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên. Sau đĩ, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu. Các nghiên cứu cịn cho thấy cĩ sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+ và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khĩ xuyên qua. Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể cơn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn. Những sợi nấm này được phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết. Sau đĩ, sợi nấm xâm nhập mơ, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hĩa khử lympo trong máu. Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hồn của cơn trùng, làm cơn trùng biếng ăn, đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hĩa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đĩ làm rối loạn và mất chức năng sinh lý. Sau khi cơn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể cơn trùng rồi phát triển sợi nấm ra tồn bộ cơ thể cơn trùng và hình thành bào tử. Quá trình xâm nhập vào cơ thể cơn trùng cịn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme. Một loạt các loại enzyme ngoại bào cĩ thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì cơn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận cĩ vai trị quan trọng trong việc xâm nhiễm. Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì cơn trùng nên cần cĩ sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau. Trong đĩ, chitanase và endoprotease là hai enzyme giữ vai trị quan trọng nhất. 1.2. Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập Xếp theo hệ thống phân loại nấm của Anisworth, 1966, 1970, 1971, Mccoy và ctv (1988), Samson và ctv (1988) đã cho rằng Paecilomyces spp. thuộc ngành phụ lớp nấm bất tồn Deueromycetes, giống Paecilomyces. Cĩ rất nhiều lồi trên thế giới, khoảng 31 lồi phân bố trê diện rộng trong đĩ cĩ thể kể đến là 9
Đồ án tốt nghiệp Paecilomyces farinosus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus, (trích dẫn bởi Nguyễn Phước Vĩnh, 2008)  Paecilomyces vatiotii Bainier (1907) Khuẩn lạc phát triển rất nhanh, cĩ màu vàng nâu hoặc vàng đất. Cuống bào tử đính mọc rậm rạp. Thể bình cĩ hình trụ hoặc elip. Bào tử cĩ dạng hình cầu, elip, hình thoi, màu sắc từ trong suốt đến vàng, bề mặt trơn láng, kích thước 3 -5 x 2 4 µm, hình thành từ chuỗi phân ly dài. Hậu bào tử thường hiện diện đơn lẻ hay trong một chuỗi ngăn, màu nâu, cĩ hình dạng từ hình cầu đến hình quả lê, đường kính 4 - 8 µm (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson,1980) Hình 1. 4 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces variotii Nguồn: (  Paecilomyces lilacinus Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru. Hiện tại, cĩ thể phân lập lồi nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong cơn trùng. Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phịng 270C ± 20C. Sợi nấm ban đầu cĩ màu trắng sau đĩ chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử. Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài. Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ. Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975). 10
Đồ án tốt nghiệp Trong nghiên cứu của Eng (2001), cĩ 82,9% trong số 41 nơng trại được khảo sát ở Sarawalk cĩ sự hiện diện của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Từ đĩ cĩ thể nhận thấy P.lilacinus cĩ khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, cĩ phạm vi thích ứng rộng và cĩ khả năng phát triển tốt ở 26 – 300C. Theo Fransen (1990) và Lacey et al. (1996) vi nấm là tác nhân sinh học duy nhất ký sinh trên cơ thể bọ phấn trắng và một trong số đĩ cĩ lồi Paecilomyces lilacinus. Khi một bào tử của Paecilomyces lilacinus nằm trong đất tìm thấy được kí chủ nhất định, nĩ sẽ tiết ra hệ enzyme để xuyên qua lớp da ngồi của cơn trùng. Paecilomyces lilacinus cũng cĩ thể xâm nhập vào cơ thể cơn trùng qua lỗ thở, hậu mơn và cả đường miệng. Sau đĩ phát triển thành các ống mầm và hình thành nhiều sợi nấm, sợi nấm cĩ thể lây lan trong lớp dịch giữa các tế bào hay các mơ rồi bao phủ cả bên trong và bên ngồi cơ thể cơn trùng rồi sinh ra bào tử. Theo nhiều nghiên cứu thì đa phần sự tử vong của cơn trùng là do sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, phá hoại các mơ và các độc tố mà vi nấm tạo ra trong cơ thể cơn trùng. Một báo cáo gần đây của Gortari et al. (2008) thì Paecilomyces lilacinus là một lồi vi nấm cĩ khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in vitro. Hai chủng ngồi tự nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 được phân lập từ đất trong tại cơng viên trung tâm của thành phố La Plata và trên một cánh đồng nơng nghiệp ở Argentina cho thấy cĩ khả năng ký sinh trên trứng của T. cannis. Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T. cannis của 2 chủng tuyến trùng nhiên P. Lilacinus LPSC # 876 và P. Lilacinus LPSC # 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%. 11
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 5 Cành bào đài, thể bình, và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus Nguồn: (  Paecilomyces fumosoroseus Wize Khuẩn lạc phát triển tương đối trên mơi trường Malt – Agar, cĩ đường kính khoảng 4cm sau 14 ngày ở 250C, ban đầu màu trắng, sau đĩ chuyển sang màu hồng đậm. Sợi nấm trong suốt, bề mặt trơn láng, rộng 1.5 – 3.5 µm. Cuốn bào tử đính mọc thẳng đứng từ bên dưới chất nền hoặc từ sợi nấm, chiều dài tối đa khoảng 100µm, rộng 1,5 - 2µm, bên trên cĩ từ 4 đến 6 thể bình với kích thước 5.7 – 8 x 1 - 2µm. Bào tử cĩ dạng hình trụ hoặc hình thoi , bề mặt trơn láng, cĩ màu biến đổi từ trong suốt đến hồng, kích thước 3 – 4 x 1 -2 µm (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson, 1980). Hình 1. 6 Cành bào đài, bào tử của nấm Paecilomyces fumosoroseus ( 12
Đồ án tốt nghiệp  Paecilomyces amoeneroseus P.Henn Khuẩn lạc phát triển rất chậm trên mơi trường Malt – Agar, chỉ đạt khoảng 2,5 - 3cm sau 14 ngày ở 250C. sợi khuẩn ty từ trong suốt đến đỏ, rộng từ 1,5 – 2,5 µm bao gồm những nhánh phức tạp cĩ nhiều vịng xoắn chứa 2 – thể bình. Bào tử nhỏ 2,5 – 3,5 x 1,7 – 2,2 µm, cĩ dạng hình cầu, elip, thỉnh thoảng cĩ xuất hiện hình trụ, trong suốt, bề mặt trơn láng (theo trích dẫn của Domsch, Gam và Anderson, 1980) Hình 1. 7 Cành bào đài, bào tử nấm Paecilomyces amoeneroseus Nguồn: ( 1.3. Một số thành tựu và ứng dụng của nấm Paecilomyces spp. vào thực tiễn đời sống. – Nấm Paecilomyces spp. gây bệnh cho các lồi cơn trùng thuộc bộ cánh vảy thường gây dịch bệnh trên ruộng đậu. Nấm Paecilomyces spp. cịn được sử dụng để diệt sâu đo Trichoplusia ni, sâu xanh Spodoptera frugiperda, sâu ăn tạp Spodoptera litura (Yoshinori Tanada và Harry K. Kaya,1993). Nấm Paecilomyces spp. cĩ hiệu quả cao đối với việc phịng trị sâu do cĩ độc tố gọi là Mycotoxin. Ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã chứng minh được nếu sử dụng nấm Paecilomyces spp. với nồng độ 108 bào tử.ml-1 chủng vào sâu non, sâu non sẽ chết sau 6-8 ngày. Khi chết xác sâu sẽ bị khơ lại, sau đĩ nấm sẽ phát triển và cơ thể của sâu sẽ bị bao phủ bởi lớp nấm màu xanh (Vimala Devi, P.S. 1994). Ngồi ra, người ta cịn sử dụng nấm 13
Đồ án tốt nghiệp Paecilomyces spp. để phịng trừ sâu hại bơng, sâu cuốn lá lúa, sâu đục thân bắp (Trần Văn Mão, 2002) – Đến nay Nhật Bản, Mỹ, Ấn Độ và Bỉ đã sản xuất nấm Paecilomyces fumosoroeus cĩ khả năng thương mại hĩa trên thị trường cĩ tên thương mại là PreFeRal, Priority, Pae – Sin để phịng trừ Rệp Sáp và Rầy mềm. (Yasuhisa Kunimi,2004 trích dẫn bởi Lê Thị Thanh Thảo,2006). – Từ năm 2010 đến nay, nhĩm nghiên cứu nấm ký sinh cơn trùng – Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành điều tra, thu thập và phân lập được một số lồi nấm ký sinh tự nhiên trên sâu hại tại các tỉnh phía Bắc và Tây Nguyên. Trên ve sầu hại cà phê ở Đắk Lak đã xác định được nấm Paecilomyces cicadae (Miquel) Samson ký sinh trên sâu non. – Kết quả đánh giá bước đầu cho thấy nấm Paecilomyces spp. đạt hiệu quả phịng trừ rầy nâu 75-80% trong điều kiện nhà lưới. Nấm Paecilomyces cicadae cĩ hiệu quả phịng trừ ve sầu hại cà phê đạt từ 50-60% trên đồng ruộng tại Đăk Lăk. Nấm Paecilomyces sp. cĩ mặt rất phổ biến trên đồng ruộng. Ngồi rầy nâu, chúng cịn ký sinh trên nhiều lồi cơn trùng khác, giữ vai trị quan trọng trong việc điều hịa số lượng cơn trùng, bảo đảm sự cân bằng của hệ sinh thái. Sử dụng các chế phẩm sinh học từ các lồi nấm ký sinh để hạn chế sử dụng các loại thuốc hĩa học BVTV nhất là các loại thuốc trừ bệnh cây, cĩ ý nghĩa quan trọng nhằm bảo vệ sự đa dạng sinh học và quản lý dịch hại. 1.3.1. Sản xuất enzyme Paecilomyces spp. được biết đến như một chủng nấm sản xuất và cung cấp nguồn enzyme tiềm năng. Paecilomyces spp. tiết ra enzyme để dễ xâm nhập vào ký chủ hơn và giúp chúng phát triển nhờ thủy phân cơ chất hay thâm chí cịn lấn át các lồi vi sinh vật khác phát triển. Đã cĩ nhiều nghiên cứu về sự sản sinh enzyme của Paecilomyces spp., nhiều nhất là về các enzyme hydrolase: protease, cellulase, dextranase 14
Đồ án tốt nghiệp Paecilomyces spp. sinh ra ba loại protease: acid, trung tính và kiềm. Các protease acid và trung tính cĩ thể ứng dụng trong cơng nghệ sản xuất bia và bánh kẹo. Protease kiềm thì ứng dụng trong cơng nghiệp thuộc da. Paecilomyces spp. thuộc nhĩm nấm Ascomycetes cĩ mặt trong đất, nước, khơng khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất Paecilomyces spp. cịn gọi là nấm thối mềm, vì chúng cĩ khả năng phân hủy cellulose. Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) cĩ nhiều ứng dụng trong y học và nền cơng nghiệp vì nĩ thủy phân dextran. Sự hiện diện của dextran cĩ nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose. Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này. Dextranase cĩ thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans, cĩ thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng. Nĩ cũng được sử dụng để tạo ra các dextran cĩ trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào. Hơn nữa, dextranase cĩ ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất cĩ lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic. Và loại enzyme này cũng đã được tiết ra bởi nhiều lồi nấm trong đĩ cĩ nấm Paecilomyces spp. 1.3.2. Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp Paecilomyces spp. sản xuất các hợp chất thứ cấp. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một số lồi Paecilomyces spp. cĩ thể tổng hợp các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học rất hữu ích. Fingolimod là hợp chất được tổng hợp dựa trên chất chuyển hĩa thứ cấp do nấm tổng hợp là myriocin (ISP-I), là một chất ức chế miễn dịch mạnh đã được phê duyệt bởi FDA (U.S. Food and Drug Administration) như là một loại thuốc điều trị mới cho chứng đa sơ cứng. Fingolimod đã được tổng hợp bởi nhĩm nghiên cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992). ISP-I được thu nhận từ P. cicadae. Fingolimod cĩ tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan. Các nhà khoa học cho rằng nĩ cĩ thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thơng qua trung 15
Đồ án tốt nghiệp gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới. Ngồi ra, fingolimod cịn được cho rằng làm tăng tế bào nội mơ và bảo vệ chức năng của chúng. Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P. variotii. Hợp chất này lần đầu tiên được cơ lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan). Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ mơi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hĩa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các polysaccharide được chiết xuất từ P. farinosus cĩ hoạt tính chống oxy hĩa cao, chỉ thấp hơn vitamin C một ít. 1.3.3. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phịng trừ các dịch hại là một cơng việc quan trọng hiện nay trong ngành nơng nghiệp vì sự an tồn, thân thiện với mơi trường và hiệu quả cao. Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P. fumosoroseus để diệt trừ các loại cơn trùng. Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh. Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm P.fumosoroseus, và được xem là cĩ khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành). Ngồi ra trên thị trường cịn cĩ một số sản phẩm như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phịng trừ tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất. 1.3.4. Xứ lý mơi trường Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử lý ơ nhiễm khơng khí thơng qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các chất ơ nhiễm hữu cơ và vơ cơ thành hợp chất ít độc hại hơn. Formaldehyde là một chất phổ biến và nĩ là sản phẩm của các nguồn sinh học và từ mơi trường (sinh ra từ nhà máy cơng nghiệp). Formaldehyde cĩ độc tính 16
Đồ án tốt nghiệp cao do phản ứng khơng đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nĩ là chất gây ơ nhiễm mơi trường. P. variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này cĩ enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase. Enzyme này cĩ tính đặc hiệu cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde. Ngồi ra, enzyme alcohol oxidase từ P. variotii cĩ khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho việc ứng dụng xử lý formaldehyde. Ngồi ra, cĩ một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm thuốc và thực phẩm cĩ lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang et al., 2003). 1.4. Một số sản phẩm của Paecilomyces spp. NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces fumosoroseus nhằm kiểm sốt bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành. Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào cơn trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin. Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát triển nhanh chĩng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống. Cơn trùng sẽ chết trong vịng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi cơn trùng chết, bào tử của nấm sẽ nảy mầm trên bề mặt của cơn trùng ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, làm cho cơ thể cơn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngồi. Trong điều kiện bất lợi, sẽ khơng cĩ sự hình thành bào tử tuy nhiên ta cĩ thể nhận thấy sự ký sinh của nấm qua màu sắc của cơ thể cơn trùng khi chết, đĩ là màu nâu hay qua sự méo mĩ của cơ thể cơn trùng. 1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. – Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm. Nếu mơi trường khơng tốt nấm mọc yếu hoặc khơng mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với cơn trùng. Trong quá trình hình thành bào tử, nấm cần các nguồn C, N. Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh 17
Đồ án tốt nghiệp hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát triển của Paecilomyces spp. (Bharati et al., 2007). Kết quả cuối cùng thu được: sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (5,625 cm). Mannose cĩ khả năng thấp nhất, các cơ chất khác cĩ tác dụng vừa phải. Cịn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al. (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp. Kết quả thu được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate. Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất. – Nhiệt độ và ẩm độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp., khi nuơi cấy nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 150C cĩ lợi cho sự hình thành bào tử hơn là 24-260C, nhưng ở nhiệt độ 180C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18% so với nhiệt độ 250C. Nguyên nhân này cĩ thể là do nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình dị hĩa và làm tăng quá trình đồng hĩa, từ đĩ làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão,2002) – Gần đây Stathers, T.E., D. Moore và C. Prior (2004) đã cho cơng bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đế sự phát triển của nấm Paecilomyces spp. và xác định nấm Paecilomyces spp. thích hợp ở nhiệt độ 280C và ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80-90% (Phạm Thị Thùy,2004) – Độ ẩm cao sẽ rất cĩ lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độ thấp sẽ cĩ lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces spp. cĩ khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0-34% hơn là khi ẩm độ 75%. Nấm cơn trùng nĩi chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm Paecilomyces spp. cũng khơng ngoại lệ. Vì vậy,ánh sáng là nhân tố khơng thể thiếu trong sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces spp. (Trần Văn Mão,2002). Các nhà khoa học cũng cho biết nấm Paecilomyces spp. khi tấn cơng vào cơ thể cơn trùng nếu gặp những điều kiện khơng thích hợp về nhiệt độ và ẩm độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên 18
Đồ án tốt nghiệp những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phĩ lại với mơi trường (Penland,1982). – Ảnh hưởng của các loại mơi trường: Theo Sung Mi Shim (2003) nghiên cứu rằng cĩ sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai mơi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuơi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuơi cấy). Vì vậy, PDA là mơi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm. – Ảnh hưởng của độ pH: thường nấm sống trong phạm vi pH = 3,5 - 8. Nhưng nấm cơn trùng ưa pH acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 - 6. Theo như nghiên cứu của Sung Mi Shim et al. (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.fumosoroseus nằm trong khoảng 6 - 9, cịn nấm P.japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). – Ảnh hưởng của độ thống khí: nấm cơn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng địi hỏi cĩ lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuơi hay trong cả biên độ rộng của khơng gian nuơi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.6. Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp. trong phịng trừ bọ phấn và các cơn trùng chích hút khác. 1.6.1. Tổng quan về bọ phấn trắng 1.6.1.1. Phân loại khoa học Giới: Animanila Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Sternorrhyncha Chi: Bemisia Lồi: B.tabaci 19
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 8 Các giai đoạn trong vịng đời của bọ phấn trắng (Nguồn: organicsoiltechnology.com) 1.6.1.2. Đặc điểm sinh thái Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều lồi cây trồng. Ký chủ của bọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đĩ cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 lồi, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của hơn 80 lồi. Ở các nước ơn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng cho cây trồng trong nhà kính và ngồi đồng ruộng, bọ phấn Aleyrodes proletella gây hại nặng cho rau họ thập tự. Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các lồi 20
Đồ án tốt nghiệp Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bơng và nhiều loại cây trồng khác cĩ giá trị kinh tế cao. Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 lồi, chúng thuộc 161 giống của 3 phân họ Aleurodicinae, Aleyrodinae, Udamoselinae (Evans,2008). Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 - 1998, ở nước ta cĩ 7 lồi bọ phấn cĩ tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp. gây hại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây hại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím. Theo kết quả điều tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 lồi: Aleurodicus dispersus gây hại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh; Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt. 1.6.1.3. Đặc điểm hình thái Trưởng thành cĩ kích thước nhỏ, thích bay và thường cĩ màu trắng đục, cĩ lớp sáp phấn trên cánh, chiều dài cơ thể 1 -3 mm. Trưởng thành của bọ phấn trắng cái cĩ màu vàng nhạt hoặc trắng . Lá non chưa hồn chỉnh (chưa mở) là nơi con cái ưa thích đẻ trứng, giao phối ngay sau khi vũ hĩa. Trứng cĩ hình quả lê hoặc quả trứng, cĩ cuống gắn chặt cố định trên các mơ lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày. Phần mở rộng của cuống nhỏ mĩc dính này là phương tiện để thụ tinh. Mỗi con cái cĩ thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa. Ấu trùng tuổi 1 - 3 cĩ thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; Tuổi 4 thường được gọi là nhộng. Ấu trùng mới nở cĩ màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bĩng. Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể . Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại. Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 21
Đồ án tốt nghiệp ngày. Mỗi lần lột xác là cĩ sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen. Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng cĩ hình bầu dục hoặc thuơn dài và cĩ những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng. Đĩ là các lỗ thở và cĩ thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền khơng khí. Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4) là nhộng giả vì chúng cĩ hoạt động ăn trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đĩ vũ hĩa thơng qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng. Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mơ cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía. Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo vệ khỏi các tác động bên ngồi, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng. 1.6.1.4. Tổng quan về tác hại do bọ phấn trắng gây ra Bọ phấn trắng (B. tabaci) là một trong những lồi lồi dịch hại nơng nghiệp nguy hiểm nhất trên phạm vi tồn cầu (Philip A. Stansly et.al, 2010). Chúng gây hại cho hầu hết các lồi cây trồng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Luko Hilje et al, 2001). Các cây trồng là kí chủ của bọ phấn trắng lên đến 600 lồi thuộc 5 họ cây phổ biến bao gồm cây họ đậu (99 lồi), cây họ cúc, họ bơng, họ cà và họ thầu dầu. Ngồi tác hại trực tiếp đến sinh trưởng phát triển của cây, bọ phấn trắng cịn là vecto truyền bệnh virus cho cây. Đây chính là tác hại quan trọng nhất của bọ phấn trắng. Các tác giả cho biết, bọ phấn trắng là vecto truyền hơn 150 loại virus gây bệnh cho cây trồng (Polston and Anderson 1997; Jones 2003). Trên cây cà chua, các cây họ ớt, bọ phấn trắng là vecto duy nhất truyền virus gây xoăn vàng ngọn cà chua (virus Tomato Yellow Leaf Curl Virus: TYLCV) (Ghanim M et al. 1998; Ghanim M, Czosnek H, 2000; Liu et al, 2013; Rubinstein G, Czosnek H., 1997). Cùng quan điểm này, Muniyappa et al (2000); Sylvia Jelinex (2010) cho biết, bệnh xoăn lá cà chua do virus (Tomato leaf curl virus: ToLCV) và bệnh xoăn vàng ngọn cà chua (TYLCV) gây hại nặng cho sản xuất cà chua tại Ấn Độ, Úc và nhiều nước 22
Đồ án tốt nghiệp Châu Á được lan truyền bởi bọ phấn trắng. Chúng tấn cơng cây trồng từ khi cây mới mọc và phát triển, gây hại cho đến khi thu hoạch. Tỷ lệ cây bị bệnh chiếm từ 50 đến 100%. Nhiều diện tích cây trồng bị đốn bỏ vì tác hại của virus. Thiệt hại do bọ phấn trắng lên đến hàng tỷ đơ la/năm (Gill, 1992; Zalom et al. 1995; Heinz 1996; Henneberry et al. 1997; Henneberry et al. 1998; Chu and Henneberry 1998. Bọ phấn trắng là dịch hại nguy hiểm nhất cho hầu hết các loại cây trồng trong nhà kính (Premalatha K. và Rajangam. J, 2010). Trong điều kiện nhà kính, bọ phấn trắng tấn cơng mạnh trên cây rau ăn trái như cà chua, ớt ngọt, cà tím, dưa leo (Cock, 1986). Tại Mỹ, bọ phấn trắng gây hại làm giảm 13% năng suất dưa lê (Jetter et al. 2001). Bọ phấn trắng đã hình thành tính kháng đối với khoảng 35 hoạt chất thuốc trừ sâu được báo cáo trên ít nhất 20 nước trên thế giới (Elbert và Nauen, 2000; Cahill và ctv., 1995; Ahmad và ctv., 2002; Kranthi và ctv., 2002; Horowitz và ctv., 1998; Prabhaker và ctv., 1992; Cahill và ctv., 1996a; Dittrich và ctv., 1990; Denholm và ctv., 1998). Mất mát do bọ phấn trắng gây ra trên tồn cầu, ước tính trên 300 triệu đơ la Mỹ/năm (De Barro and Driver 1997; White 1998). Vì vậy, việc nghiên cứu để xây dựng biện pháp phịng trừ bọ phấn trắng đã và đang được đặc biệt chú ý (Philip A et.al, 2012). Một chương trình quản lý tổng hợp bọ phấn trắng mang tính quốc tế (Tropical Whitefly IPM Project) đã được triển khai từ năm 1996 đến năm 2004 và đã xác định được rằng việc lạm dụng thuốc hĩa học nguyên nhân gây nên sự bùng phát của lồi dịch hại này ở các nước vùng nhiệt đới (Francisco J. Morales, 2006). Tại Việt Nam, bọ phấn trắng được coi là dịch hại chính và là vecto truyền bệnh virus trên nhiều loại cây trồng (Lê Thị Liễu, Trần Đình Chiến, 2005; Trần Đình Phả et al. 2009). Trên cây cà chua ở miền Bắc, chúng xuất hiện và gây hại trong suốt cả vụ. Trong số 33 lồi bọ phấn trắng thu được trên các cây trồng ở Hà Nội, Bemisia tabaci là luơn xuất hiện thường xuyên, gây hại nặng trên nhiều loại cây trồng như đậu đỗ, cà chua, bắp cải, xu hào, súp lơ (Đàm Ngọc Hân, 2010). Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá cà chua, ổi, ớt chích hút dịch cây. Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, cĩ thể 23
Đồ án tốt nghiệp bị héo, vàng lá, thậm chí cĩ thể chết. Chất bài tiết của bọ phấn trắng cĩ đường tạo điều kiện cho nấm bồ hĩng phát triển hại cây. Bọ phấn thường gây hại trong mùa khơ, chúng cĩ phân tán trên phạm vi rộng nhờ giĩ. Ngồi ra, bọ phấn cịn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đĩ cĩ nhĩm cây rau thực phẩm bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt Bệnh xoăn lá cĩ thể xuất hiện ngay từ khi cây cịn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa. Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng. Cây bị bệnh cịi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá cịn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thơ cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn khơng phát triển được. Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong. Cây bị bệnh sớm và nặng cĩ thể chết. Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây cĩ thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều. Nếu cĩ trái thì trái nhỏ, méo mĩ, cứng, chất lượng kém. Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe. Bọ phấn Bemisia tabaci là cơn trùng mơi giới truyền bệnh. Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây cà chua, virus được truyền đi trong vịng 15 - 30 phút. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh khơng tồn tại lan truyền qua hạt giống và qua đất. Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa. Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua nhiều năm; các giống cà chua địa phương cĩ khả năng kháng bệnh virus cao. 24
Đồ án tốt nghiệp 1.6.2. Tổng quan về rệp 1.6.2.1. Phân loại khoa học Giới: Animalia Ngành: Arthropoda Lớp: Insecta Bộ: Hemiptera Họ: Aphididae Chi: Aphis Lồi: A. gossypii Hình 1. 9 Cấu tạo ngồi của rệp (Vickers L. H, 2012) 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 1. 10 Cấu tạo ngồi của rệp (Vickers L. H, 2012) 1.6.2.2 Đặc điểm sinh thái Rệp Aphis gossypii cĩ khoảng 4700 lồi, chúng cĩ thể kí sinh trên nhiều loại cây trồng và cỏ dại khác nhau như các cây ngơ, lúa mì, khoai tây, bơng, ớt, hoa hồng, cam, quýt, thuộc các họ lúa, họ dưa, họ cà, họ cĩ múi, gây thiệt hại hàng tỷ đơ la Mỹ mỗi năm cho ngành nơng nghiệp trồng trọt. Rệp là nhĩm cơn trùng chích hút phổ biến nhất hiện nay, phân bố tập trung nhất ở các vùng ơn đới, một số sống ở cả cận nhiệt đới và nhiệt đới với số lượng khoảng 3700 lồi rệp đã được biết trên thế giới (Holman J., 2009). Các loại rệp phá hoại cây trồng mạnh như rệp bơng Aphis gossypii Glover, rệp ngơ Aphis maydis, rệp đậu chúng thường ẩn ở phần mặt dưới của lá, thân non và chích hút nhựa tại đĩ (Von Dohlen C., Rowe C., Heie O.,2006) vừa làm cạn nguồn dinh dưỡng của cây vừa tiết ra chất đường mật khơng chỉ làm đĩng khí khổng của lá mà cịn gĩp phần 26
Đồ án tốt nghiệp tăng sự phát triển của mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến các mơ quang hợp, ảnh hưởng nghiêm trọng tới trao đổi chất và năng suất cây trồng. Ngồi ra, việc chích hút nhựa cây của các lồi rệp làm lây lan virus gây bệnh từ cây bệnh sang các cây khỏe mạnh. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu và thống kê của các nhà khoa học, nước ta chịu sự ảnh hưởng của hơn 250 lồi rệp khác nhau. Tại đồng bằng sơng Cửu Long, cây sầu riêng bị rệp sáp phá hoại. Một số cây ăn quả ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ cận cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều lồi rệp làm giảm năng suất và thiệt hại về kinh tế. Cây cà phê tại một số vùng ở Tây Nguyên cũng đang gặp phải vấn nạn rệp sáp và rệp bơng. Tại tỉnh Đắc Lắc, rệp sáp kí sinh trên chùm hoa và quả non gây thiệt hại từ 8 –25%. Tại tỉnh Đắc Nơng, rệp đã tấn cơng gây hư hại trên 500 ha, trong đĩ gây thiệt hại nặng cho hơn 200 ha (Bá Thăng, 2012). 1.6.2.3. Đặc điểm hình thái Cơ thể rệp chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), cĩ ba cặp chân phân đốt, mắt kép và cĩ một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ xương ngồi bằng chitin, chiều dài từ 1 – 10 mm (Hình 1.1). Rệp cĩ một lớp biểu bì mềm, cĩ cánh (dạng màng) hoặc khơng cánh. Phần lớn thân rệp cĩ màu xanh lá cây, đen, nâu, hồng hoặc khơng màu. Rệp cĩ thể sinh sản theo cả hình thức đơn tính và hữu tính. Vào mùa thu, khi cĩ sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm sút về nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái con. Đặc điểm di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một nhiễm sắc thể giới tính. Rệp con hữu tính cĩ thể thiếu cánh, thậm trí thiếu vịi chích hút (McGavin G. C.,1999). Khi trưởng thành, rệp cái giao phối với rệp đực rồi đẻ trứng. Trứng sống sĩt qua mùa đơng khắc nghiệt rồi nở ra rệp cái cĩ cánh hoặc khơng cánh (Hình 1.2). Các rệp cái sẽ sinh sản vơ tính ra rệp cái khơng cánh hoặc rệp cái cĩ cánh (khi khan hiếm thức ăn) để bay đến cây kí chủ khác. Tuy nhiên, trong mơi trường ấm áp như ở vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp 27
Đồ án tốt nghiệp cĩ thể sinh sản vơ tính trong nhiều năm. Trong vịng đời, một rệp cái cĩ thể sinh ra 31 đến 93 rệp con theo hình thức sinh sản này (Hồ Khắc Tín,1981). Đặc biệt, một số lồi cĩ khả năng sinh sản lồng, khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì rệp cái con cũng chuẩn bị sinh ra thế hệ tiếp theo đã cĩ sẵn trong cơ thể nĩ. Cách sinh sản này cĩ thể ảnh hưởng đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản tăng lên (Jahna G. C., Almazanb L. P., Paciab J. B., 2005). Trong điều kiện thuận lợi, vịng đời trung bình của một cá thể rệp khoảng 30 ngày. Rệp con sinh ra sẽ phát triển trong khoảng 4 đến 10 ngày để trưởng thành và bắt đầu sinh sản ra các thế hệ mới (Lloyd J. E.,3013). 1.6.2.4 Tổng quan về tác hại do rệp gây ra Khi cây trồng vượt qua giai đoạn cây con, bắt đầu phân cành lúc này xuất hiện các loại sâu hại như rầy xanh, rệp Aphis gossypii (Vũ Khắc Nhượng,1991). Rệp Aphis gossypii phát sinh và gây hại mạnh trong điều kiện nhiệt độ 23 – 250C, ẩm độ 80 -85% (Lê Lương Tề, 2005). Mưa to, ẩm độ cao sẽ làm giảm mật độ và hạn chế sự phát sinh của rệp. Khi mật độ cao hoặc thức ăn khơng cịn phù hợp, rệp Aphis gossypii hình thành loại hình cĩ cánh để di chuyển sang cây khác và tiếp tục gây hại (Viện Bảo Vệ Thực Vật, 2003). Rệp tập trung sinh sống ở ngọn cây và lá non, chúng làm cành lá cong queo, hình dạng thay đổi, khơng phát triển Rệp A. gossypii là loại rệp điển hình ở Việt Nam, chúng cĩ thể phát triển quanh năm trên một phạm vi kí chủ rất rộng gồm các cây trong họ bầu bí, bơng, cà, cúc và hàng loạt cây thân gỗ, trong đĩ phổ biến nhất là các loại dưa, bầu bí, bơng, cà, ớt và khoai sọ. Ngồi ra rệp Aphis gossypii cịn là tác nhân truyền bệnh virus gây bệnh khảm qua các thế hệ sau, khơng cĩ thời gian ủ virus trong cơ thể và virus chỉ tồn tại trong cơ thể nĩ dưới 4 giờ sau mỗi lần chích hút, nhưng rệp cĩ khả năng hấp thụ virus sau khi chích hút cây bệnh dưới 1 phút cĩ thể truyền bệnh (Nguyễn Thị Nghiêm, 1996). Ngồi ra một số nhà khoa học đã nghiên cứu về diễn biến mật độ rệp Aphis gossypii trên một số cây trồng cho rằng rệp thường xuất hiện trên cây khoai tây và cây ớt tại Ấn Độ vào tháng 8,9,10 và tiếp tục phát triển cho tới tháng 4,5,6. Trong thời kì này chúng hình thành 2 đỉnh cao về số lượng. Đỉnh cao lần 1 cĩ mật độ thấp 28
Đồ án tốt nghiệp hơn vào khoảng cuối tháng 11, lần 2 vào tháng 2 với mật độ rất cao sau đĩ mật độ giảm dần (Verma và Parihar,1990). Trong quá trình nghiên cứu về rệp Aphis gossypii đã phát hiện mức độ thích nghi của rệp với mơi trường và nguồn thức ăn cĩ liên quan chặt chẽ đến đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của rệp (George,1983). Sau khi rệp gây hại trên một số cây trồng chúng thường cĩ hiện tượng phát tán tìm kí chủ mới bằng cách mọc cánh xuất hiện nhũng cá thể cĩ cánh trong quần thể bay đi hoặc nhờ giĩ để phát tán. Hoạt động phát tán của rệp cao nhất vào đầu tháng 3, số lượng rệp bay vào buổi sáng thường cao hơn rất nhiều so với buổi chiều. Theo Yayma và Ronald (2007) khi mật độ quần thể rệp cao, chúng sẽ sản sinh nhiều rệp trưởng thành cĩ cánh và cĩ thể di cư để tìm nguồn thức ăn mới. Với tốc độ sinh sản nhanh, số lượng rệp con được đẻ ra của một con cái nhiều và vịng đời ngắn cộng với sự đa thực của chúng, cĩ thể khẳng định rệp bơng cĩ sức gây hại rất lớn. Rệp cĩ khả năng gia tăng quần thể rất nhanh trong điều kiện thuận lợi. Ấu trùng và rệp trưởng thành tập trung mặt dưới lá, nhất là đọt non, bơng, chồi hút nhựa làm cho các bộ phận này bị khơ héo hoặc để lại những vết thâm đen trên lá. Trên cây ớt, rệp gây hại trầm trọng ở tầng giữa rồi đến tầng trên, hại ít nhất ở tầng dưới. Rệp thường sống tập trung ở mặt dưới lá ớt nhất là lá bánh tẻ. Ở những cây đã ra hoa, quả, thu hoạch thường cao hơn đối với giai đoạn phát triển thân lá. Khi mật độ rệp cao thì chúng bắt đầu di chuyển nhiều lên các lá non và các chồi ngọn, khi đĩ ở tầng trên các lá non, chồi ngọn, nụ, hoa mật độ rệp nhiều hơn so với hai tầng lá giữ và dưới. Rệp thường tập trung với số lượng lớn ở đọt non làm lá bị quăn và phân tiết ra thu hút nhiều muội đen trên lá, thân, cành kể cả nụ, hoa. Ngồi tác hại làm giảm năng suất, chất lượng cây ớt cịn truyền 1 số loại virus gây bệnh từ những cây bệnh sang các cây khỏe mạnh. 29
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ ngày 7/8/2014 đến ngày 13/7/2015 tại phịng thí nghiệm trường Đại Học Cơng Nghệ TPHCM. 2.2. Thiết bị - hĩa chất - vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị - hĩa chất 2.2.1.1. Thiết bị Nồi hấp khử trùng Máy đo quang phổ UV-Vis 2550 Máy ly tâm Universal 320 Que cấy điểm Đèn cồn Ống nghiệm Falcon Đũa thủy tinh Kính hiển vi quang học Dao cấy Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm Đĩa petri Micropipet Erlen Hộp nuơi cơn trùng. Lame đếm Thoma, kính hiển vi, kính lúp sơi nổi, máy lắc Voltex. Pipet, cốc thủy tinh, micropipet 1000µl, 100µl và đầu tuýp. Bơng thấm nước, bơng khơng thấm nước Bao nhựa, dây thun, giấy báo 30
Đồ án tốt nghiệp 2.2.1.2. Hĩa chất Dịch TCA 5% Lugol Tween 80 Cồn 960, 700 Methylene blue MgSO4.7H2O K2HPO4 KNO3 NaCl FeSO4.7H2O Glucose Pepton NaNO3 KCl CaCl2 2.2.2. Vật liệu Nấm Paecilomyces lilacinus đã được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) và được tái phân lập lại bởi sinh viên thực hiện đề tài. Nguồn bọ phấn, rệp được thu từ vườn của nhà dân tại Củ Chi. 2.2.3. Các mơi trường sử dụng 2.2.3.1. Mơi trường phân lập nấm: PDA (Potato D - Glucose Agar) D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Cách chuẩn bị dịch chiết khoai tây: Cân 200 g khoai tây đã được gọt vỏ, sau đĩ thái nhỏ thành hình vuơng. Đong vào cốc thủy tinh 1000ml nước cất, thêm khoai tây đã thái ở trên vào đun sơi trong 20 phút. Sau đĩ, để nguội, dùng bơng thấm nước 31
Đồ án tốt nghiệp lọc phần dịch, gạn bỏ phần xác khoai tây để thu dịch chiết khoai tây, bổ sung agar và đường theo tỉ lệ và đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 15 phút. - Song song đĩ chuẩn bị các đĩa Petri đã được rửa sạch và sấy khơ, đem gĩi bằng giấy báo, rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 15 phút. - Đổ mơi trường ra đĩa petri và chờ thạch đơng trong 15 phút, sau đĩ đem bảo quản, sẵn sàng cho sử dụng. 2.2.3.2. Mơi trường PSA (Potato Sucrose Agar) Sucrose 20 g Agar 20 g Khoai tây 200 g Phần chuẩn bị mơi trường cũng được tiến hành tương tự như đã nêu ở phần trên. 2.2.3.3. Mơi trường thử nghiệm hoạt tính protase sử dụng casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương,2001) Casein 1 % MgSO4.7H2O 3 g K2HPO4 3 g KNO3 1 g NaCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 15 g Chloramphenicol 0,1 g Nước cất: bổ sung cho đủ 1000ml 2.2.3.4. Mơi trường định tính sự sinh tổng hợp enzyme chitinase (Lê Thị Huệ, 2010) NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g 32
Đồ án tốt nghiệp KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch chitin huyền phù 1% đến 1000ml Cách pha dịch chitin huyền phù 1%: Theo phương pháp của Dai et al. 2011 (dẫn theo Nguyễn Thị Hà, 2012) dung dịch chitin huyền phù 1% được chuẩn bị như sau: 1g bột chitin được cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, để ở 40C và để qua đêm. Thêm vào hỗn hợp 50ml ethanol (-200C) khuấy đều thật nhanh và ủ qua đêm. Ly tâm hỗn hợp ở 5000 vịng/phút, trong 20 phút, thu lấy tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính. Thu dịch huyền phù và bổ sung nước cất đến 100ml. 2.2.3.5. Mơi trường sử dụng để nuơi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase (Xia Guoquing Chungsheng, Zhou Ju, 2001) Glucose 1g NH4NO3 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g K2HPO4 0,7 g KH2PO4 0,3 g FeSO4.7H2O 0,01 g ZnSO4 0,001 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch chitine huyền phù 1% đến 1000ml. pH: 6-7 2.2.3.6. Mơi trường Sauboraud + Khống chất Glucose 40 g Pepton 15 g 33
Đồ án tốt nghiệp KH2PO4 1 g MgSO4.7H2O 1 g Agar 20 g Bổ sung nước cất đến 1000ml 2.2.3.7. Mơi trường Czapeck - Dox Glucose 1 % NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 20 g Bổ sung nước cất đến 1000ml 2.2.3.8. Mơi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hịa vào 1 lít nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, cĩ khuấy, đến 45 - 500C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút. Sau đĩ, nâng nhiệt độ lên 65 - 680C, cĩ khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hĩa xảy ra hồn tồn (kết quả là khơng thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thơ hoặc bơng thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách hết tủa lần nữa, pha lỗng để dịch cĩ hàm lượng chất khơ hịa tan khoảng 6 - 8 độ Brix. Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết. Phối mơi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, 15 phút. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus 2.3.1.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus từ bọ phấn, tạo dịng thuần nguồn nấm thu được. 34
Đồ án tốt nghiệp a) Phân lập Thực hiện: Thu bọ phấn trắng trên đồng và đem về nuơi trên lá, cuống lá được quấn bằng bơng hút ẩm để giữ lá tươi, khơng bị héo. Phun nấm Paecilomyces lilacinus được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) lên bọ phấn. Hằng ngày quan sát và thu bọ phấn bị chết. Các cá thể bọ phấn bị chết được cho vào đĩa petri cĩ đặt giấy hút ẩm. Tiến hành thu thập cá thể bị chết và được bao bọc bởi sợi nấm màu trắng. Sau đĩ tiến hành phân lập nấm ký sinh trên mơi trường PDA theo phương pháp của Lawrence (1997). Hình 2. 1 Hộp dùng để bố trí thí nghiệm b) Tạo dịng thuần Bước 1: Nấu mơi trường PDA, sau đĩ đem hấp tiệt trùng 1210C (áp suất 1atm), trong thời gian 15 phút, sau đĩ để nguội 500C và bổ sung kháng sinh. Đổ mơi trường ra đĩa đã được hấp vơ trùng và để nguội. 35
Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Cấy phân lập nấm: Tiến hành vệ sinh mẫu nấm kí sinh, dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đĩ làm nguội và chấm nhẹ vào điểm cĩ bào tử đặc trưng của các nguồn nấm ký sinh trên cơ thể bọ và khơng bị nhiễm tạp sau đĩ cấy điểm nhẹ lên bền mặt mơi trường. Để đĩa mơi trường cấy phân lập trong phịng thí nghiệm 2 – 3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa mơi trường khác nhau để làm thuần chủng. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)  Quan sát đại thể nấm sợi Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mơ tả đặc điểm tản nấm của chúng khi nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng. Các chủng nấm phân lập được sẽ được cấy điểm trên tâm đĩa mơi trường PDA và được ủ 2 tuần. Quan sát mơ tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; dạng sợi nấm; màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của mơi trường do sắc tố nấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử trong thời gian nuơi ủ.  Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phịng ẩm) Quan sát hình thái vi thể các chủng nấm phân lập được bằng phương pháp tiêu bản phịng ẩm. Chuẩn bị một đĩa mơi trường PDA và một đĩa petri vơ trùng nuơi cấy chứa: mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên hai thanh đũa tre. Sử dụng dao mổ vơ trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa mơi trường PDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuơi cấy. Dùng dây cấy đã khử trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces cấy vào 4 mặt bên của khối thạch. Sau đĩ đậy lamelle lên trên khối thạch. Nhỏ nước cất vơ trùng cho ướt tồn bộ giấy thấm trong đĩa. Ủ đĩa ở nhiệt độ phịng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tử xảy ra (thường là 2 – 3 ngày). Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lên một lame sạch cĩ sẵn một giọt Methylene blue. Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở 36
Đồ án tốt nghiệp độ phĩng đại 400 lần và mơ tả đặc điểm: Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 2.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên mơi trường thạch (Nguyễn Thị Hà, 2012) Nguyên tắc: Khi nuơi cấy trong mơi trường thạch cĩ bổ sung chitin 1% làm chất cảm ứng, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng cĩ cấu trúc mạch ngắn hơn là N-acetyl- D-glucosamine. Các dạng đơn phân này khơng cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol. Do đĩ sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần mơi trường trong suốt bao quanh nấm phản ảnh khả năng sinh tổng hợp chitinase. – Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vơ trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho mơi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch cĩ đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuơi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa mơi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phịng trong 4 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đĩ đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vịng phân giải và đường kính nấm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri. 2.3.2.2. Phương pháp nuơi cấy Paecilomyces lilacinus để thu nhận enzyme chitinase.  Bước 1 : Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và mơi trường sinh enzyme chitinase. – Chuẩn bị nguồn nấm Paecilomyces lilacinus. 37
Đồ án tốt nghiệp Sử dụng đĩa PDA nuơi cấy nấm Paecilomyces lilacinus 14 ngày. Cho vào đĩa nấm 10ml nước muối sinh lý vơ trùng và lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối nấm trên bề mặt thạch. – Chuẩn bị mơi trường: Cho 50ml mơi trường vào erlen 100ml sau đĩ đem hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong vịng 15 phút. Sau đĩ, để nguội đến khoảng 300C.  Bước 2: Tiến hành nuơi cấy Dùng micro pipette hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa mơi trường sao cho mật độ bào tử đạt 106 CFU/ml. Sau đĩ, tiến hành ủ trên máy lắc với 150 vịng/phút trong vịng 1,2,3,4,5 ngày. 2.3.2.3. Phương pháp thu nhận dịch mơi trường chứa enzyme chitinase (Nguyễn Đức Lượng, 2003) – Nguyên tắc: Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong mơi trường lỏng, vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzyme thủy phân. Các enzyme thủy phân là các enzyme hịa tan trong nước. Do đĩ, để thu nhận enzyme trong trường hợp nuơi cấy chìm là phải thu nhận dịch nuơi cấy (sau khi tách sinh khối và các thành phần khơng hịa tan của mơi trường). – Tiến hành: Dịch nuơi cấy trong erlen sau 1,2,3,4,5 ngày được lọc qua giấy lọc và thu dịch enzyme. 2.3.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase (Nguyễn Đức Lượng,2003) a) Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine: 38
Đồ án tốt nghiệp Ống ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 nghiệm N-acetyl- Dglucosamin 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 e 8.3 mg/ml (ml) Nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 (ml) Nồng độ N - acetyl- 0 0,083 0,166 0,249 0,33 0,415 0,498 0,581 0,664 0,747 0,83 Dglucosamin e (mg/ml) OD535nm – Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 6 ống nghiệm đã được rửa và làm khơ, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS và đun sơi trong 10 phút (cĩ đậy nắp hay nút bơng khơng thấm nước). – Làm lạnh đến nhiệt độ phịng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm. Đo mật độ quang ở bước sĩng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng. – Sau khi cĩ các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vẽ đường chuẩn glucose với trục hồnh là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD). Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y=ax+b và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel. b) Xác định hoạt độ enzyme chitinase: – Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa vào lượng đường khử N-acetyl- β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng thủy phân. Khi cho chitinase tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, N-acetyl-β-D-Glucosamine sinh ra trong phản ứng được định lượng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5 - dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3-amino-5 nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến ở bước sĩng 535nm (Nguyễn Thị Hà, 2012). 39
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khơ – Ống phản ứng: Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp được ủ ở 300C trong 60 phút. Ngưng phản ứng bằng cách đun sơi cách thủy 5 phút. Ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều, đun sơi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phịng. Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sĩng 535 nm. – Ống khơng phản ứng: Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sơi cách thủy 5 phút sau đĩ thêm 3 ml dịch cơ chất chitin vào rồi làm tương tự như cách bước của ống phản ứng. c) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần thiết để giải phĩng 1 µmol N-acetyl-D-glucosamine từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định. Đơn vị hoạt tính = (UI/ml) Với a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn. n: hệ số pha lỗng. v: thể tích hỗn hợp phản ứng. t: thời gian phản ứng (phút). V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml) 40
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Định tính khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. Nguyên tắc: Khi nuơi cấy trong mơi trường thạch cĩ bổ sung casein 1%, nấm sợi sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng amino acid được tạo thành sẽ khơng phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ cĩ casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vơ trùng đã hấp ở 1210C trong 15 phút, cho mơi trường từ bình vào 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch cĩ đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuơi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa mơi trường cảm ứng, ủ ở nhiệt độ phịng trong 4 ngày. Cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đĩ đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vịng phân giải và đường kính nấm. 2.3.4. Đánh giá khả năng gây chết của bọ phấn và rệp của nấm Paecilomyces lilacinus. 2.3.3.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus. Thực hiện: Theo phương pháp của Ayhan GƯKÇE và M. Kubilay ER. (2004), các cá thể bọ phấn trắng trưởng thành nằm trên lá thu thập được ngồi tự nhiên được bỏ các hộp cĩ nắp đậy được đục lỗ. Sau đĩ, hút 1ml phân NPK 16:16:8 nồng độ (0.66g/ml) cho vào bơng thấm nước quấn trên cuống lá giúp lá tươi lâu hơn. Tiến hành phun 10ml dịch huyền phù bào tử nấm cĩ nồng độ 108cfu/ml lên các hộp đã chuẩn bị. Mẫu đối chứng được phun bằng nước cất. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces cĩ nồng độ 108cfu/ml. Cơng thức 2: Phun nước cất. Mỗi cơng thức được lặp lại 10 lần, mỗi lần 1hộp chứa 20 cá thể bọ phấn trưởng thành. 41
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2. Đánh giá khả năng gây chết rệp của nấm Paecilomyces lilacinus. Thực hiện: cách thực hiện như trên bọ phấn. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: Phun dịch huyền phù bào tử nấm Paecilomyces cĩ nồng độ 108cfu/ml. Cơng thức 2: Phun nước cất. Mỗi cơng thức được lặp lại 10 lần, mỗi lần 1 hộp chứa 30 cá thể rệp Aphis gossypii Hình 2. 2 Các hộp dùng để đựng rệp bố trí thí nghiệm  Chỉ tiêu theo dõi: – Số bọ phấn, rệp bị chết – Hiệu lực gây chết của nấm Paecilomyces lilacinus (%) Xử lý số liệu: Hiệu lực gây chết cơn trùng được tính theo cơng thức Abbot (1925): 42
Đồ án tốt nghiệp Ca- Ta M (%) = x 100 Ca Trong đĩ: Ca là số sâu sống ở cơng thức đối chứng sau thí nghiệm Ta là số sâu sống ở cơng thức thí nghiệm sau thí nghiệm 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 2.3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus.  Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: pH 5 Cơng thức 2: pH 6 Cơng thức 3: pH 7 Cơng thức 4: pH 8 Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA. Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy 0 0 sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 25 C ± 2 C 5mm trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Khoanh khuẩn lạc Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo cơng thức: 43
Đồ án tốt nghiệp d = (d1+ d2)/2 Trong đĩ: d1, d2 là độ dài hai đường chéo phần khuẩn lạc phân bố Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14 ngày sau khi cấy. Tốc độ phát triển trung bình (cm/ngày): trung bình của 3 lần đo đường kính nấm từ 6 - 8; 8 - 10; 10 - 12 ngày sau nuơi cấy. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở giá trị pH nào thì nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt hơn cả. 2.3.5.2. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus trong các mơi trường khác nhau  Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: mơi trường PDA Cơng thức 2: mơi trường Malt agar Cơng thức 3: mơi trường Czapeck - Dox Cơng thức 4: mơi trường Sabouraud agar Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA, Malt agar, Czapeck – dox agar, Sabouraud agar với 3 lần lặp lại cho mỗi mơi trường. Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như mục 2.3.5.1. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở mơi trường nào thì nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt hơn cả. 2.3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Nguyên tắc: Thực hiện theo phương pháp Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết (2006). Mỗi lồi Paecilomyces lilacinus khác nhau thì sống ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Do vậy, tiến hành khảo sát chế độ chiếu 44
Đồ án tốt nghiệp sáng: 12 giờ sáng/12 giờ tối và tối liên tục và theo dõi, đánh giá sự phát triển của nấm. Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: điều kiện 12h sáng/12h tối Cơng thức 2: điều kiện tối liên tục Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA với 3 lần lặp lại cho mỗi điều kiện chiếu sáng. Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi thực hiện tương tự mục 2.3.5.1. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở điều kiện chiếu sáng nào thì nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt hơn cả. 2.3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.  Bố trí thí nghiệm: Được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên. Cơng thức 1: mơi trường PDA Cơng thức 2: PSA Mỗi cơng thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa. Thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường PDA, và PSA với 3 lần lặp lại cho mỗi mơi trường. Mơi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đĩ đổ mơi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm cĩ đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa mơi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như mục 2.3.5.1. Sau đĩ so sánh và nhận xét ở mơi trường nào thì nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt hơn cả. 45
Đồ án tốt nghiệp 2.3.5.5. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Bố trí thí nghiệm Cơng thức Tên thương phẩm Hoạt chất Liều sử dụng 1 Đối chứng (nước cất) - - 2 Carbenzim 50WP Carbenzim 0,2% 3 Cup 2,9 SL Cu 0,25% 4 Saizole 5SC Hexaconazole 0,2% 5 Antracol 70WP Probineb 2,5% Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần mơt đĩa petri, thực hiện trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ phịng.  Tiến hành: – Chuẩn bị nguồn nấm thí nghiệm và mơi trường nuơi cấy Nguồn nấm Paecilomyces: Chủng Paecilomyces lilacinus được nuơi cấy trên mơi trường PDA và ủ ở nhiệt độ phịng trong 14 ngày. Mơi trường nuơi cấy: Mỗi chai mơi trường PDA sau khi được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút sẽ được để nguội đến 500C rồi bổ sung từng loại thuốc bảo vệ thực vật (ứng với từng nghiệm thức) theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất. – Tiến hành nuơi cấy Đổ đĩa và để nguội cho đến khi mơi trường đơng lại trong đĩa petri rồi dùng khoan thạch hình trụ, đường kính 5 mm đục một miếng thạch cĩ chứa nấm Paecilomyces lilacinus từ đĩa nấm đã chuẩn bị và đặt vào vị trí tâm đĩa mơi trường vừa chuẩn bị xong. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri và đem ủ ở nhiệt độ phịng. 46
Đồ án tốt nghiệp  Chỉ tiêu theo dõi – Đo đường kính tản nấm (cm) ở các ngày sau cấy đến khi tản nấm ở cơng thức đối chứng chạm thành đĩa thì ngừng theo dõi. – Đường kính trung bình tính theo cơng thức: = (Trong đĩ, d1 và d2 là hai đường chéo tản nấm phân bố) Đường kính khuẩn lạc (cm) và tính phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo cơng thức: I = [(C-T)]/C]*100 Trong đĩ: I: % khuẩn lạc bị ức chế. C: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. T: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. (Theo cơng thức Abbott (1925) và Viện nghiên cứu cao su Việt Nam (2006))  Đánh giá cấp độ ảnh hưởng của thuốc theo (Hassan,1989). – Cấp 1: khơng ảnh hưởng ( 90 %) 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Dùng phần mềm SAS 9.1 và Excel 2007 để xử lý số liệu cĩ được. Tiến hành xử lý số liệu thống kê trong SAS 9.1 (Statistical Analysis System) theo trình tự: Xử lý số liệu của kết quả nghiên cứu So sánh các tham số đặc trưng của hai hay nhiều kết quả nghiên cứu. Phép phân tích phương sai ANOVA và giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với độ tin cậy 99% và 95%. 47
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm Paecilomyces lilacinus Sử dụng nguồn nấm Paecilomyces lilacinus của Phùng Lê Kim Yến (2014) và phun lại trên bọ phấn. Từ những cá thể bọ phấn bị nghi ngờ bị chết do nhiễm nấm Paecilomyces, sinh viên đã tiến hành phân lập lại và cho những kết quả như sau: Sau 3 ngày nuơi cấy trên mơi trường PDA đã xuất hiện tản nấm cĩ màu trắng xốp sang màu hồng rồi màu hồng tím. Đặc điểm của chủng nấm phân lập lại hồn tồn trùng khớp với đặc điểm của chủng Paecilomyces lilacinus ban đầu của Phùng Lê Kim Yến (2014) và được mơ tả ở bảng 3.1. Hình 3. 1 Nấm phân lập lại từ bọ phấn Bemisia tabaci 48
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces lilacinus phân lập lại sau khi lây nhiễm trên bọ phấn. Paecilomyces lilacinus Chủng nấm sinh viên phân Đặc điểm (Phùng Lê Kim Yến, 2014) lập được sau khi lây nhiễm bọ phấn. - Hình trịn đồng tâm, cĩ dạng - Khuẩn lạc mọc dạng bơng thảm nhung. xốp, hình trịn đồng tâm, mép khuẩn lạc trơn nhẵn hoặc cĩ răng cưa, viền trắng Đại thể - Chủng nấm phân lập được khi Ban đầu sợi tơ nấm cĩ màu nuơi cấy trên mơi trường PDA, trắng, mềm, mịn. Sau 3 ngày, ban đầu sợi tơ nấm màu trắng, sợi nấm chuyển sang màu tím mịn. Sau 3 ngày, sợi nấm nhạt, rồi tới tím đậm là do sự chuyển qua màu hồng hoặc tím xuất hiện của bào tử nấm và ở cho thấy sự xuất hiện bào tử. 16 ngày sau khi cấy thì trên bề mặt của tản nấm xuất hiện những giọt dịch. 49
Đồ án tốt nghiệp Cĩ sự xuất hiện của Quan sát dưới kính hiển vi cuống bào tử phân nhánh mọc quang học x 100, sinh viên lên từ sợi nấm. Phía trên cuống nhận thấy sự xuất hiện của là thể bình dài với phần cuống cuống bào tử phân sinh phân Vi thể phồng ở gốc, nhọn ở đầu và nhánh, dạng đơn, chúng phân mọc thành từng cụm. Tiếp trên nhánh dưới các dạng vịng hoặc thể bình là chuỗi bào tử dài với khơng đồng đều. những bào tử cĩ dạng thoi và Phía trên cuống là thể bình những đoạn bào tử này cũng dài với phần cuống phồng ở gốc, hay bị đứt ra. nhọn ở đầu. Ở đỉnh cĩ nhiều thể bình mọc thành từng cụm. Tiếp trên thể bình là chuỗi bào tử dài với những bào tử cĩ dạng hình thoi. Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối. 50
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. 3.2.1. Khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus trên mơi trường thạch. Bảng 3. 2 Đường kính vịng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Đường kính vịng phân giải (D), đường kính nấm (d) của chủng Paecilomyces Chỉ tiêu theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D (cm) 1,333 ± 0,029 2,000 ± 0,000 2,400 ± 0,289 2,867 ± 0,058 d (cm) 0,700 ± 0,000 1,330 ± 0,058 1,667 ± 0,058 2,067 ± 0,058 a b b b D/d 1,905 ± 0,042 1,502 ± 0,063 1,441 ± 0,051 1,388 ± 0,059 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD trong cùng một hàng cĩ cùng chữ theo sau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức ý nghĩa 1%. 51
Đồ án tốt nghiệp a b c d Hình 3. 2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vịng phân giải chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 NSC) DKN (cm) 2.5 a 2 1.905 b 1.502 1.441b b 1.5 1.388 1 0.5 0 NSC 1 2 3 4 Hình 3. 3 Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 NSC 52
Đồ án tốt nghiệp Số liệu bảng 3.2 cho thấy nấm Paecilomyces lilacinus cĩ khả năng sinh enzyme chitinase. Đường kính vịng phân giải tăng dần qua các ngày nuơi cấy. Ở ngày thứ nhất sau khi nuơi cấy, mặc dù đường kính tản nấm chỉ đạt 0,7cm nhưng đường kính vịng phân giải đã lên đến 1,333cm. Đến ngày thứ 4 sau khi cấy, đường kính vịng phân giải của nấm đã đạt 2,87cm. Tỷ lệ D/d cũng là chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh enzyme của nấm, tỷ lệ D/d cao nhất trong 1NSC trên mơi trường cĩ cơ chất cảm ứng là chitin. Điều này là do, tản nấm được chuyển từ mơi trường PDA với nguồn cơ chất là D - Glucose sang mơi trường mới cĩ cơ chất là chitin nên hoạt tính enzyme chitinase là cao nhất, để thủy phân cơ chất thành nguồn dinh dưỡng. Kích thước nấm cũng phát triển nhưng ít vì đây là cơ chất mới nên cần cĩ thời gian để nấm quen và sử dụng. Ở giai đoạn này tỷ lệ D/d đối với chủng Paecilomyces lilacinus là 1,905. Mặt khác, khi tấn cơng cơn trùng, nếu hoạt độ của enzyme chitinase trong những ngày đầu mạnh sẽ giúp cho nấm thủy phân được lớp da để xâm nhập vào cơ thể cơn trùng. Sau đĩ, khi nấm đã thích nghi với mơi trường mới và một lượng lớn enzyme ở các ngày đầu tiết ra đã phân giải lượng lớn chitin thì nấm sẽ phát triển nhanh về kích thước, đồng thời do đã quen với nguồn cơ chất nên lượng enzyme tiết ra cũng được điều chỉnh về mức thích hợp làm cho tỷ lệ D/d giảm dần ở ngày 3 và ngày 4. Như vậy, nấm Paecilomyces lilacinus phân lập được cĩ khả năng sinh enzyme chitinase, điều này là hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu trước đây đối với loại nấm ký sinh cơn trùng. 3.2.2. Hoạt tính Chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus. Để xác định hoạt tính enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus, sinh viên tiến hành nuơi cấy nấm trên mơi trường lỏng theo phương pháp của (Nguyễn Đức Lượng, 2003). Mục đích của thí nghiệm này ngồi việc định lượng khả năng sinh enzyme chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus cịn xác định được thời gian nuơi cấy thích hợp để thu enzyme chitinase của nấm. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.4 53
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 3 Hoạt tính của enzyme chitinase sau 1,2,3,4,5 ngày nuơi cấy Ngày nuơi cấy Hoạt tính (U/ml) 1 1,412c ± 0,300 2 3,172 b ± 0,154 3 4,702 a ± 0,795 4 4,502a ± 0,246 5 3,822ab ± 0,075 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD, các giá trị trung bình trong cùng một cột cĩ cùng chữ theo sau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức ý nghĩa 1% theo trắc nghiệm LSD. U/ml 6 4.742a 4.502a 5 3.822ab 4 3.172b 3 c 2 1.412 1 0 NSC 1 2 3 4 5 Hình 3. 4 Hoạt độ enzyme chitinase sau các ngày nuơi cấy 54
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào bảng 3.3 và biểu đồ ta thấy hoạt tính enzyme tăng dần sau 2,3,4 ngày nuơi cấy, đạt giá trị cao nhất vào ngày 3 rồi giảm dần sau đĩ. Điều này cĩ thể giải thích như sau: khoảng thời gian đầu nuơi cấy, bào tử nấm nảy mầm và sử dụng nguồn đường glucose cĩ sẵn trong mơi trường để phát triển sinh khối nấm, lúc này (tức từ lúc cấy đến ngày 1) nên hoạt tính chưa cao (cụ thể là hoạt tính chitinase ngày 1 là 1,412 U/ml) hoặc cĩ thể là chưa cĩ sự sinh tổng hợp enzyme. Và khi nguồn đường được sử dụng hết thì nấm mới bắt đầu tổng hợp enzyme chitinase mạnh để phân giải nguồn cơ chất chitin thành các monomer dễ sử dụng. Vì vậy hoạt tính chitinase tăng lên ở ngày 2 (3,172 U/ml), nhưng lúc này lượng glucose trong mơi trường giảm dần, và khi đĩ chitin phát huy khả năng cảm ứng enzyme, nhưng vẫn chưa đạt hiệu quả cảm ứng cao nhất vì chịu sự ức chế một phần của glucose. Sở dĩ hoạt tính đạt giá trị tối đa ở ngày 3 (4,742 U/ml) là vì khi đĩ đường glucose trong mơi trường đã cạn kiệt, khả năng cảm ứng enzyme của chitin đạt tối đa, sinh khối nấm đã phát triển tốt nên chúng tiết ra một lượng lớn enzyme để phân giải cơ chất đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của chúng phục vụ cho quá trình đồng hĩa. Sau đĩ, khi đã quen dần với nguồn cơ chất mới, lượng enzyme tiết ra được điều tiết đến một lượng hợp lí, do đĩ hoạt tính giảm dần ở ngày 5 hoạt tính chỉ cịn 3,822 U/ml. 3.3. Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus. Cấu tạo lớp da của cơn trùng gồm protein, lipid và chitin. Muốn xâm nhập vào cơ thể cơn trùng, nấm phải phân giải và đâm qua được lớp da. Vì vậy, bên cạnh sinh enzyme chitinase nấm ký sinh cơn trùng phải cĩ khả năng sinh enzyme protease. Kết quả theo dõi khả năng sinh enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.5. 55
a b c d Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 4 Khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus Đường kính vịng phân giải (D), đường kính nấm (d) của chủng Chỉ tiêu Paecilomyces lilacinus theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D (cm) 1,300 ± 0,058 2,000 ± 0,000 2,367 ± 0,058 3,000 ± 0,000 d (cm) 0,667 ± 0,000 1,367 ± 0,058 1,767 ± 0,058 2,533 ± 0,058 a b b c D/d 1,952 ± 0,083 1,4650 ± 0,063 1,34 ± 0,000 1,185 ± 0,027 Ghi chú: NSC: ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD trong cùng một hàng cĩ cùng chữ theo sau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức ý nghĩa 1%. a b c d Hình 3. 5 Sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus (a, b, c, d là vịng phân giải enzyme protease của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1, 2, 3, 4 ngày). 56
Đồ án tốt nghiệp DKN (cm) 2.5 1.952a 2 1.465b 1.5 1.34b b 1.185 1 0.5 0 1 2 3 4 NSC Hình 3. 6 Biểu đồ thể hiện sự phân giải casein của nấm Paecilomyces lilacinus qua 1,2,3,4 ngày nuơi cấy Dựa vào số liệu ở bảng 3.4 và hình 3.6 cĩ thể thấy đường kính vịng phân giải tăng dần qua các ngày nuơi cấy. Ở ngày thứ nhất sau khi nuơi cấy, mặc dù đường kính tản nấm chỉ đạt 0,667cm nhưng đường kính vịng phân giải đã lên đến 1,30cm. Đến ngày thứ 4 sau khi cấy, đường kính vịng phân giải của nấm đã đạt 3cm. Nấm Paecilomyces lilacinus cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Đây là enzyme cần thiết đối với lồi nấm ký sinh cơn trùng. Tỷ lệ D/d cũng là chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh enzyme của nấm, tỷ lệ D/d cao nhất trong 1NSC trên mơi trường cĩ cơ chất cảm ứng là casein. Điều này là do tản nấm được chuyển từ mơi trường PDA với nguồn cơ chất là D - Glucose sang mơi trường mới cĩ cơ chất là casein nên nấm sẽ tiết ra lượng lớn enzyme protease phân giải casein thành các amino acid để dễ sử dụng. Kích thước nấm cũng phát triển nhưng ít vì đây là cơ chất mới nên cần cĩ thời gian để nấm quen và sử dụng. Ở giai đoạn này tỷ lệ D/d là 1,952. Sang đến những ngày sau, lúc này nấm đã quen và thích nghi với mơi trường mới nên nấm phát triển nhanh hơn. Nấm sẽ điều tiết ra một lượng enzyme vừa đủ để phân hủy casein nuơi bản thân phát triển. Do đĩ, các ngày sau tỷ lệ D/d thấp dần, 3NSC tỉ lệ D/d là 1,340 và 4NSC tỉ lệ D/d là 1,185. 57
Đồ án tốt nghiệp Đồng thời cũng theo J-O.Park et al. (2004), phần lớn những nấm ký sinh cơn trùng hay tuyến trùng thì tiết ra khá nhiều enzyme protease. Tuy nhiên, việc ký sinh cịn phải phụ thuộc vào những yếu tố khác nữa, trong đĩ cĩ enzyme chitinase. Như vậy, nấm Paecilomyces lilacinus cĩ khả năng sinh enzyme protease, điều này là hồn tồn phù hợp với các loại nấm ký sinh cơn trùng. 3.4. Đánh giá khả năng gây chết cơn trùng chích hút của nấm Paecilomyces lilacinus. 3.4.1. Đánh giá khả năng gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus Bọ phấn trắng Bemisia tabaci là cơn trùng chích hút gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau đặc biệt là các loại rau ăn quả, ăn lá thì ngồi tác hại trực tiếp đến sự sinh trưởng phát triển của cây trồng bọ phấn cịn là vecto truyền nhiều bệnh nguy hiểm khác. Hiện nay, việc phịng trừ bọ phấn trắng ở Việt Nam chủ yếu là thuốc hĩa học nhưng trên thế giới người ta đã sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus để trừ bọ phấn cho hiệu quả rất cao. Vì vậy, sinh viên thực hiện thí nghiệm này nhằm đánh giá hiệu lực gây chết bọ phấn trắng Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus để cĩ hướng sử dụng cho sản xuấn nơng nghiệp. Bảng 3. 5 Số bọ phấn Bemisia tabaci chết ở các ngày sau chủng. Cơng thức Số bọ phấn bị chết do nấm kí sinh ở các ngày sau chủng 3 ngày 7 ngày Phun nấm Paecilomyces 13,60 ± 0,52 19,60 ± 0,5 Nước cất 0 0 Thử nghiệm 20 cá thể bọ phấn/lần nhắc. 58
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 6 Hiệu lực diệt bọ phấn của nấm Paecilomyces lilacinus Hiệu lực gây chết (%) bọ phấn trắng ở các ngày sau Cơng thức chủng 3 ngày 7 ngày Phun nấm (108cfu/ml) 24,50 89,5 Nước cất 0 0 Ghi chú: Hiệu lực được hiệu tính theo cơng thức Abbot (1925) Số liệu ở bảng 3.5 và bảng 3.6 cho thấy, hiệu lực gây chết bọ phấn Bemisia tabaci của nấm Paecilomyces lilacinus chậm nhưng rất cao. Ở 3 ngày sau khi nhiễm tỷ lệ gây chết chỉ cĩ 24,50% nhưng đến 7 ngày tỷ lệ chết đã lên đến 89,5%. Kết quả này cĩ xu hướng cao hơn so với chủng nấm Paecilomyces trong nghiên cứu của Claire Vidal et al (1998) vớ tỷ lệ gây chết là 70% sau 1 tuần. Để kiểm tra, sinh viên đã tiến hành soi kính các cá thể bị chết, kết quả cho thấy 100% bọ phấn bị chết đều cĩ sợ nấm bao quanh cơ thể (Hình 3.7) và khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm trên cơ thể bọ phấn là nấm Paecilomyces lilacinus (Hình 3.8). a b Hình 3. 7 Mẫu bọ phấn khơng bị kí sinh (a) và mẫu bọ phấn bị kí sinh (b) được soi bằng kính lúp soi nổi 59
Đồ án tốt nghiệp a b c d Hình 3. 8 Mẫu bọ phấn khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học a) độ phĩng đại 10 lần; b) độ phĩng đại 100 lần Mẫu bọ phấn bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học c) độ phĩng đại 10 lần; d) độ phĩng đại 100 lần. 3.4.2 Đánh giá khả năng gây chết rệp Aphis gossypii của nấm Paecilomyces lilacinus. Trên nhiều loại cây trồng, ngồi bọ phấn cịn nhiều loại cơn trùng chích hút khác xuất hiện rất phổ biến, đặc biệt là rệp. Rệp Aphis gossypii gây hại trên nhiều loại cây trồng và cũng là vecto truyền nhiều bệnh virus cho cây. Vậy ngồi bọ phấn trắng, nấm Paecilomyces lilacinus cĩ diệt được rệp hay khơng? Làm rõ điều này sẽ giúp định hướng cho việc sử dụng nấm Paecilomyces trong phịng trừ sâu hại cây trồng. 60
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 7 Số rệp Aphis gossypii chết ở các ngày sau chủng Số rệp chết ở các ngày sau chủng Cơng thức 3 ngày 7 ngày Phun nấm 22,00 ± 0,52 29,10 ± 0,5 Nước cất 0 0 Thử nghiệm 30 cá thể rệp/lần nhắc. 3.5.2.2 Hiệu lực diệt rệp của nấm Paecilomyces Bảng 3. 8 Hiệu lực diệt rệp của nấm Pacilomyces lilacinus Hiệu lực gây chết (%) ở các ngày sau chủng Cơng thức 3 ngày 7ngày Phun nấm (108cfu/ml) 18,34 85,34 Nước cất 0 0 Ghi chú: Hiệu lực được hiệu đính theo cơng thức Abbot (1925) Dựa vào số liệu ở bảng 3.7 và 3.8 cho thấy, cũng giống như với bọ phấn trắng, nấm Paecilomyces lilacinus cũng cĩ khả năng ký sinh gây chết rệp Aphis gossypii. Sau 3 ngày chỉ cĩ 18,34% rệp bị kí sinh, nhưng đến 7 ngày sau khi lây nhiễm đã tăng lên 85,34% rệp bị nấm ký sinh. Điều này mở ra một triển vọng rất khả quan cho việc sử dụng chủng nấm Paecilomyces lilacinus để phịng trừ rệp Aphis gossypii và bọ phấn trắng Bemisia tabaci trên các loại cây trồng khác. 61
Đồ án tốt nghiệp b a c d Hình 3. 9 Mẫu rệp khơng bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học a) độ phĩng đại 10 lần; b) độ phĩng đại 100 lần Mẫu rệp bị ký sinh được soi bằng kính hiển vi quang học b) độ phĩng đại 10 lần; d) độ phĩng đại 100 lần 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. 3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus Tùy thuộc vào pH khác nhau mà sự tăng trưởng của nấm cũng thay đổi. Sự thay đổi của pH tức là sự thay đổi của ion H+ cĩ trong mơi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, điều này làm ảnh hưởng khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định; làm thay đổi trạng thái điện ly các 62
Đồ án tốt nghiệp phân tử của chất dinh dưỡng, từ đĩ làm giảm khả năng sử dụng dinh dưỡng của vi sinh vật. Bên cạnh đĩ, pH ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cĩ mặt trên thành tế bào. Điều này, quyết định đến sự phát triển của vi sinh vật trong mơi trường. a b c d Hình 3. 10 Sự phát triển của Paecilomyces lilacinus trên mơi trường cĩ pH khác nhau ở 14 NSC (a: pH5, b: pH6, c: pH7, d: pH8) 63
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 9 Ảnh hưởng của pH mơi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Cơng thức Đường kính nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14 NSC pH 5 1,627a ± 0,025 4,117a ± 0,058 6,183a ± 0,029 7,583a ± 0,030 pH 6 1,660a ± 0,017 4,117a ± 0,029 6,150ab ± 0,100 7,517ab ± 0,030 pH 7 1,643a ± 0,040 3,917b ± 0,058 6,050b ± 0,050 7,483b ± 0,030 pH 8 1,560b ± 0,017 3,853b ± 0,025 6,100ab ± 0,050 7,567b ± 0,060 Ghi chú:NSC: ngày sau cấy; các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD trong cùng một cột cĩ cùng chữ theo sau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,05. DKN (cm) 8.000 7.000 6.000 pH5 5.000 pH6 4.000 pH7 3.000 pH8 2.000 1.000 0.000 NSC 2 6 10 14 Hình 3. 11 Đường kính nấm Paecilomyces lilacinus ở các pH mơi trường 5, 6, 7, 8 qua các ngày nuơi cấy. Dựa vào số liệu bảng 3.9 và biểu đồ cho thấy, mặc dù nấm Paecilomyces lilacinus phát triển tốt ở khoảng pH thí nghiệm (pH 5 – 8) cũng như khơng cĩ sự 64
Đồ án tốt nghiệp khác biệt nhiều về màu sắc nấm khi quan sát bằng mắt thường. Tuy nhiên, dựa vào đường kính khuẩn lạc của nấm cũng cĩ thể thấy rằng, trong khoảng pH khảo nghiệm, nấm cĩ xu hướng phát triểt tốt nhất ở pH5. Kết quả này cũng trùng với nhận xét của các tác giả trên thế giới. Sung Mi Shim et al. (2003) cho biết pH phù hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh cơn trùng Paecilomyces fumosoroseus là từ 5 đến 9, nhưng tốt nhất là ở pH6. Cịn theo Bansal et al (1989), P.lilacinus cĩ thể phát triển tốt nhất ở pH5. Choi et al. (1999) lại thơng báo rằng sợi nấm của P. japonica phát triển tốt nhất ở pH7. 3.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces lilacinus. Trong quá trình phát triển nấm cần nhiều chất dinh dưỡng. Tùy vào từng mơi trường nuơi cấy khác nhau mà nấm sẽ cĩ tốc độ sinh trưởng khác nhau. a b c d Hình 3. 12 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 NSC (a - Mơi trường PDA, b - Mơi trường Malt agar, c - Mơi trường Sabouraud, d - Mơi trường Czapeck –Dox) 65
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3. 10 Ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến sự phát triển đường kính nấm Paecilomyces lilacinus qua các ngày. Cơng thức Đường kính tản nấm (cm) qua các ngày nuơi cấy 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14NSC a a b P 1,350 ± 0,000 3,750a ± 0,050 6,033 ± 0,058 7,720 ± 0,029 MA 1,300b ± 0,000 3,783a ± 0,029 6,067a ± 0,076 7,780a ± 0,029 CZ 1,117d ± 0,000 2,883c ± 0,104 4,950c ± 0,000 6,400d ± 0,050 c b c SA 1,250 ± 0,000 3,183b ± 0,029 5,283 ± 0,029 7,280 ± 0,050 Ghi chú: P: mơi trường PDA, MA: mơi trường Malt, CZ: mơi trường Czapeck - Dox, SA: mơi trường Sabouraud + KC, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD trong cùng một cột cĩ cùng chữ theo sau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức ý nghĩa α = 0,01 DKN (cm) 9.00 8.00 7.00 6.00 CZ 5.00 SA 4.00 MA 3.00 PDA 2.00 1.00 0.00 NSC 2 6 10 14 Hình 3. 13 Nấm Paecilomyces lilacinus ở ngày thứ 14 sau khi cấy (a - Mơi trường PDA, b - Mơi trường Malt agar, c - Mơi trường Sabouraud, d - Mơi trương Czapeck -Dox) 66
Đồ án tốt nghiệp Theo Archana MR và Ramaswamy K (2012), nấm Paecilomyces ký sinh cơn trùng cĩ sự phát triển khơng đồng đều giữa 3 mơi trường: PDA, Sabouraud-KC và Czapeck - Dox. Dựa vào số liệu bảng 3.10 và biểu đồ, cĩ thể thấy đường kính nấm đạt giá trị cao nhất ở mơi trường Malt, tiếp đĩ là mơi trường PDA, Sabouraud-KC và cuối cùng là mơi trường Czapeck - Dox. Điều này là phù hợp theo nghiên cứu của Sung Mi Shim (2003) khi tác giả cho rằng cĩ sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai mơi trường PDA (6,73 cm sau 14 ngày nuơi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuơi cấy).Mặc dù mơi trường Czapeck - Dox cĩ nhiều thành phần khống nhưng hàm lượng đường chỉ chiếm 1% nên điều này hạn chế phần nào sự phát triển của tơ nấm và tạo điều kiện hình thành bào tử sớm hơn các mơi trường cịn lại (quan sát thấy xuất hiện màu tím trên tản nấm sớm hơn). Cịn ở mơi trường Sabouraud-KC tuy hàm lượng khống ít hơn nhưng lại cĩ hàm lượng đường đến 4% cùng nguồn protein, vitamin cĩ trong peptone hỗ trợ tốt cho sự phát triển của nấm nên ở mơi trường này tơ nấm phát triển tốt hơn. Cịn ở mơi trường PDA, hàm lượng đường chiếm 2% (ít hơn so với mơi trường Sabouraud - KC), protein chiếm 2% cùng nhiều khống chất và các vitiamin (Wikipedia), do đĩ ở mơi trường PDA nấm phát triển tốt hơn 2 mơi trường trước. Nấm phát triển tốt nhất ở mơi trường malt bởi vì trong dịch malt ,thành phần amino acid và peptide chiếm 5 - 7% chất hịa tan (Nguyễn Hồi Hương, 2009). Như vậy nấm Paecilomyces lilacinus cĩ thể phát triển ở cả 4 loại mơi trường khảo sát nhưng phát triển tốt nhất ở mơi trường Malt – Agar rồi đến mơi trường PDA và kém nhất ở mơi trường Czapeck – Dox. 67