›

Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa)

pdf 126 trang thiennha21 13/04/2022 6050
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_hoat_tinh_khang_khuan_cua_cao_chiet_ethanol_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa)

  1. Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁOGVHD: DỤC VÀThS. ĐÀO Ph ạTmẠ OMinh Nhựt TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trần Thị Tuyết Dung MSSV: 1311100019 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  2. Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁOGVHD: DỤC VÀ ThS. ĐÀO Ph TạẠmO Minh Nhựt TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ LÁ BÀNG (Terminalia catappa) Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Trần Thị Tuyết Dung MSSV: 1311100019 Lớp: 13DSH02 TP. Hồ Chí Minh, 2017
  3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tơi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác. Tơi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày .tháng .năm Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung
  4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt LỜI CẢM ƠN Con xin khắc ghi cơng ơn cha mẹ và những người thân đã nuơi dưỡng và giáo dục con nên người. Tơi xin gửi lịng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. - Khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi Trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. - Cơ chủ nhiệm, Thầy Cơ bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt quá trình học tập và hồn thành đề tài. Tơi xin chân thành biết ơn: Ths. Phạm Minh Nhựt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và cơng sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tơi hồn thành khĩa luận này. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh, ngày .tháng .năm Sinh viên Trần Thị Tuyết Dung
  5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây bàng 3 1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta 3 1.1.2. Sơ lược về cây bàng 3 1.1.3. Cơng dụng của cây bàng 5 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên từ thực vật 6 1.2.1. Carbohydrate 6 1.2.2. Alkaloid 7 1.2.3. Glycoside 8 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất cĩ nguồn gốc từ thực vật 18 1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn 18 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn 18 1.3.3. Một số hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn từ thực vật 21 1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và Việt Nam 26 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 29
  6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.4. Ảnh hưởng của dung mơi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật 30 1.5. Một số nhĩm vi khuẩn gây bệnh 31 1.5.1. Nhĩm vi khuẩn Escherichia coli 31 1.5.2. Nhĩm vi khuẩn Salmonella spp. 32 1.5.3. Nhĩm vi khuẩn Shigella spp. 34 1.5.4. Nhĩm vi khuẩn Listeria spp. 35 1.5.5. Nhĩm vi khuẩn Vibrio spp. 36 1.5.6. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Pseudomonas spp. 37 1.5.7. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Enterococcus spp. 38 1.5.8. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Staphylococcus aureus. 39 1.6. Sơ lược về vi khuẩn V.alginolyticus 40 1.6.1. Phân loại khoa học 40 1.6.2. Đặc điểm hình thái 40 1.6.3. Đặc điểm phân bố 41 1.6.4. Khả năng gây bệnh 42 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 44 2.1.1. Địa điểm 44 2.1.2. Thời gian. 44 2.2. Vật liệu 44 2.2.1. Vật liệu: 44 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 44 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hĩa chất 44 2.3.3. Hĩa chất, dung mơi 45 2.4. Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu 46 2.4.2. Phương pháp thu nhận cao thực vật và xác định hiệu suất thu hồi. 46 2.4.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh 47 2.4.4. Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị 48 2.4.5. Phương pháp pha lỗng mẫu 48 ii
  7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 49 2.4.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 50 2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hĩa học của cao chiết 51 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu 54 2.5. Bố trí thí nghiệm 54 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ lá bàng đối với dung mơi ethanol 70%. 56 2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. 57 2.5.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với chủng vi khuẩn gây bệnh. 58 2.5.4. Thí nghiệm 4: Định tính một số thành phần hĩa học cơ bản của TcEE. 60 2.5.5. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V. alginolyticus theo thời gian 62 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi TcEE 65 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối với chủng vi khuẩn chỉ thị. 65 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE đối nhĩm vi khuẩn Escherichia coli 66 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Listeria spp. 67 3.2.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Samonella spp 68 3.2.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Shigella spp 69 3.2.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Virio spp . 71 3.2.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 72 3.2.7. Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn và kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với 20 vi khuẩn chỉ thị. 73 3.3. Kết quả định tính một số thành phần hĩa học của TcEE 77 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của TcEE đến vi khuẩn V. alginolyticus 79 iii
  8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 83 4.1. Kết luận 83 4.2. Đề nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 iv
  9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DMSO: Dimethyl sulfoxide DNA: Deoxyribonucleic acid MIC: Minimum Inhibition Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu TSA: Trypton Soya Agar TSB: Trypton Soya Broth TcEE: Cao chiết Ethanol 70% từ lá bàng v
  10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất 17 Bảng 1.2. Những nhĩm hợp chất tự nhiên cĩ hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) 20 Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá bàng từ dung mơi ethanol 70% đối với 20 vi khuẩn chỉ thị 74 Bảng 3.2. Kết quả định tính thành phần hĩa học của TcEE 77 vi
  11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Lá và quả bàng. 4 Hình 1.2. Cấu trúc hĩa học một số chất thuộc nhĩm alkaloids. 8 Hình 1.3. Cấu trúc hĩa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid 12 Hình 1.4. Caffeic acid 13 Hình 1.5. Phân loại nhĩm phenolics theo cấu trúc hĩa học 13 Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) . 19 Hình 1.7. Cấu trúc hĩa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin 21 Hình 1.8. Cấu trúc hĩa học của catechine 22 Hình 1.9. Cấu trúc hĩa học của coumarine. 23 Hình 1.10. Cấu trúc hĩa học của phân tử Solamargine 24 Hình 1.11. Cấu trúc hĩa học của berberine 25 Hình 1.12. E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2µm (Bact, 2005). 31 Hình 1.13. Hình thái vi khuẩn Samonella spp. (Taragui, 2005). 33 Hình 1.14. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 34 Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. 35 Hình 1.16. Hình thái vi khuẩn Vibrio (Microscopy, 2004) 36 Hình 1.17. Hình thái vi khuẩn Pseudomonas spp. 37 Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Enterococcus 38 Hình 1.19. Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus 39 Hình 2.1. Phương pháp pha lỗng mẫu 45 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 55 Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ lá bàng. 56 Hình 2.4. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết 57 Hình 2.5. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết. 59 Hình 2.6. Quy trình định tính một số thành phần hĩa học của cao chiết ethanol 70% từ lá bàng. 61 Hình 2.7. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của cao chiết đến vi khuẩn V. alginolyticus theo thời gian. 63 vii
  12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Hình 3.1. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Escherichia coli 66 Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Listeria spp. 67 Hình 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Samonella spp. 68 Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Shigella spp. 70 Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn Virio spp. 71 Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của TcEE trên nhĩm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da 72 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện mật độ tế bào 80 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện giá trị OD600nm 80 viii
  13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Sức khỏe là vốn quý nhất của con người nhưng hiện nay vấn đề về thực phẩm bẩn đã khiến cho nguy cơ mắc nhiều loại bệnh tật đang gia tăng, do đĩ việc tìm ra phương thuốc chữa trị vừa mang lại hiệu quả nhưng khơng gây tác dụng phụ luơn được người dân quan tâm lựa chọn. Đã từ rất lâu, dựa vào kinh nghiệm dân gian con người đã biết sử dụng các loại cây cĩ trong tự nhiên để làm thực phẩm, thuốc chữa bệnh. Việt Nam là một quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới giĩ mùa cĩ nhiều điều kiện cho hệ thực vật phát triển tạo ra sự phong phú và đa dạng, đĩ là nguồn tài nguyên sinh học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được, nhiều cây thuốc quý với đầy đủ chủng loại và số lượng, trong đĩ cĩ cây bàng. Cây bàng tên khoa học là Terminalia catappa L, thuộc họ Bàng Combretaceae. Đây là một loại cây được trồng như một loại cây cảnh để lấy bĩng râm nhờ tán lá lớn và rậm. Qủa ăn được và cĩ vị hơi chua. Hạt bàng thì dùng làm nguyên liệu để chế biến thành mứt. Ở Việt Nam cây bàng dễ trồng, phát triển tốt và cĩ mặt ở hầu hết các địa bàn trong cả nước. Người dân từ xưa đã dùng lá bàng để chữa cảm sốt, ra mồ hơi, chữa tê thấp và lỵ. Dùng búp lá non phơi khơ, tán bột rắc trị ghẻ, sắc đặc ngậm trị sâu răng. Ngồi ra, người ta cịn dùng vỏ thân bàng dạng thuốc sắc uống trị lỵ và tiêu chảy, rửa vết loét, vết thương. Đặt biệt, nhựa lá non trộn với dầu hạt bơng và nấu chín là một thứ để chữa bệnh hủi. Hạt nấu chín dùng để chữa đi cầu ra máu. Ngồi ra, cũng được dùng đối với việc nuơi cá cảnh để xử lý kim loại nặng trong nước cĩ hại cho cá, ngăn ngừa hữu hiệu các loại vi khuẩn, các loại nấm trên cá. Mặc dù cĩ nhiều cơng dụng như vậy nhưng ở nước ta hiện nay chưa cĩ cơng trình khoa học mang tính hệ thống nghiên cứu về quá trình chiết tách hay xác định thành phần hĩa học, xác định cấu trúc của một số hợp chất trong cây bàng. Chính vì vậy chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng (Terminalia catappa L)” nhằm cung cấp thêm thơng tin về 1
  14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt loại cây này, gĩp phần vào việc khai thác, chế biến và ứng dụng các sản phẩm của cây bàng một cách hiệu quả, khoa học hơn. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tách chiết cao ethanol từ lá bàng và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn. - Bước đầu xác định một số thành phần hĩa học. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ lá bàng. - Đánh giá hiệu lực kháng khuẩn của cao chiết lá bàng theo thời gian. 4. Phạm vi nghiên cứu - Chỉ tách chiết cao lá bàng bằng dung mơi ethanol 70%. - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết đối với 20 chủng vi khuẩn chỉ thị. 2
  15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây bàng 1.1.1. Sơ lược về nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới giĩ mùa, cĩ tới ¾ diện tích cả nước là núi rừng. Với đặc điểm khí hậu và địa hình như vậy nên nước ta được đánh giá là nước cĩ nguồn tài nguyên sinh vật đa dạng và phong phú, được xếp thứ 16 trong số 25 quốc gia cĩ mức độ đa dạng sinh vật cao nhất thế giới. Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên cĩ giá trị . Các sản phẩm thiên nhiên cĩ hoạt tính sinh học được ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt là dùng làm thuốc chữa bệnh. Theo các nhà phân loại thực vật, nước ta cĩ khoảng 12.000 lồi thực vật bậc cao, trong đĩ khoảng 3.948 lồi được dùng làm dược liệu (Viện vật liệu, 2007). Nếu so với khoảng 20.000 lồi cây làm thuốc đã biết trên thế giới (IUCN, 1992) thì số lồi cây thuốc ở Việt Nam chiếm khoảng 19%. Tuy cĩ nguồn thực vật đa dạng và phong phú nhưng do chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi, cùng với sự khai thác khơng cĩ kế hoạch bảo tồn nên dẫn đến tình trạng trữ lượng các lồi cây ngày càng ít đi. Thế nên, hiện nay chúng ta cần khai thác cĩ hiệu quả về hoạt tính sinh học của các lồi cây và duy trì trồng lại các giống đã khai thác, để tạo ra các loại thuốc chữa bệnh mới đem lại lợi ít cho con người nhưng khơng làm cạn kiệt nguồn tài nguyên nước nhà. 1.1.2. Sơ lược về cây bàng 1.1.2.1. Phân loại khoa học Giới Plantae Angiospermae Eudicots Rosids Bộ Myrtales Họ Combretceae Chi Terminalia Lồi T. catappa 3
  16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Hình 1.1. Lá và quả bàng. 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái Cây Bàng ta là cây thân gỗ lớn sống tại vùng nhiệt đới, loại cây này cĩ thể cao 35 m, cĩ đường kính thân từ 40 – 80 cm. Với tán lá mọc thẳng, đối xứng và các cành nằm ngang tạo thành hình dáng giống như cái bát trải rộng. Lá to, dài khoảng 15 – 25 cm và rộng 10 – 14 cm, hình trứng, xanh sẫm và bĩng. Về mùa khơ thì lá chuyển thành màu đỏ ánh hồng hay nâu vàng sau đĩ rụng hết để hạn chế thốt hơi nước và giúp cây kích thích ra cành lá non. Bàng ta là lồi cây cĩ hoa đơn tính cùng gốc, nghĩa là hoa đực và hoa cái ra chung trên một cây. Hoa cĩ kích thước 1 cm cĩ màu trắng hơi xanh khơng cĩ cánh hoa, chúng mọc trên các nách lá hoặc ở đầu cành. Quả dài 5 – 7 cm, rộng 3 – 5,5 cm, khi non quả cĩ màu xanh sau đĩ ngã sang màu vàng và khi chín quả cĩ màu đỏ. Mùa quả tháng 8 - 10. Cây Bàng ta được trồng tại khu vực nhiệt đới, là lồi cây ưa sáng, cĩ tốc độ sinh trưởng nhanh. Cây chủ yếu được tái sinh bằng hạt. Cây bàng ta là loại cây cơng trình trồng lấy bĩng mát, phát triển nhanh, ít sâu bệnh, dễ chăm sĩc. Cây cĩ thể trồng trong vườn nhà, ven đường, lối đi trong khuân viên nhà máy 1.1.2.3. Phân bố Cây bàng được trồng khắp nơi làm cây bĩng mát. Người ta cho rằng cây bàng vốn khơng cĩ ở nước ta, mà di thực từ đảo Moluques vào. 4
  17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.1.2.4. Thành phần hĩa học Lá và vỏ cây chứa tanin: vỏ thân chứa từ 25 - 35% tanin pyrogalic và tanin catechic. Vỏ cành chứa 11% tanin. Nhân hạt chứa 50% dầu béo màu vàng nhạt hay lục nhạt, vị dễ chịu, giống như dầu hạng nhân, ăn được. Tuy nhiên nhân chỉ chiếm 10% tồn quả cho nên cuối cùng tồn quả chỉ chứa chừng 5% dầu béo, việc tách nhân lại địi hỏi nhiều cơng sức, chưa cơ giới hĩa được cho nên đến nay việc khai thác dầu hạt bàng chưa được đặt ra. Một số tính chất của dầu nhân hạt bàng đã được nghiên cứu kết quả như sau: Tỷ trọng 0,917, chỉ số khúc xạ ở 35°C là 1,4660, độ đơng đặc + 1°C, chỉ số axit 2,94, chỉ số xà phịng hĩa 0,38, axit tồn phần tách được ở dạng đặc, màu vàng nhạt hay trắng, phần axit đặc chiếm tới 36%. Do chỉ số iốt thấp và do khơng cho phản ứng hexabromua cho nên người ta cĩ thể kết luận dầu bàng khơng cĩ glyxerit linoleic và thuộc loại dầu khơng khơ. 1.1.3. Cơng dụng của cây bàng 1.1.3.1. Theo kinh nghiệm dân gian Cao vỏ thân cây bàng (bỏ lớp vỏ đen bên ngồi) cĩ tác dụng lợi tiểu, cường tim làm săn. Cao methanol cĩ tác dụng giảm co thắt ruột thỏ cơ lập. Lá được dùng làm thuốc chữa cảm sốt, làm ra mồ hơi, chữa tê thấp và lỵ. Búp non phơi khơ tán bột rắc trị ghẻ, trị sâu quảng, sắc đặc ngậm trị sâu răng. Dùng tươi, xào nĩng để đắp và chườm nơi đau nhức. Vỏ thân sắc uống trị lỵ và tiêu chảy, rửa vết loét, vết thương. Nhựa lá non trộn với dầu hạt bơng và nấu chín là một thứ thuốc để chữa hủi. Hạt nấu uống để trị tiêu chảy ra máu. 1.1.3.2. Trong đời sống – kinh tế Cây trồng địa phương. Nếu tổ chức trồng cây bàng trên quy mơ lớn để tạo ra nguồn hàng hĩa bàng khơng chỉ cĩ giá trị trực tiếp dùng để chữa bệnh và chăm sĩc sức khỏe, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lý thì đĩ cịn là một nguồn thu nhập trong phạm vi hộ gia đình và các cộng trên thị trường thì nĩ cịn gĩp phần vào sự 5
  18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt tăng trưởng kinh tế của đất nước. Trên thế giới, nhiều nước đã xuất khẩu các chế phẩm từ cây bàng và thu được nguồn ngoại tệ đáng kể. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới giĩ mùa, thích hợp cho sự phát triển của cây trồng nĩi chung. Nhất là ở những vùng đồng bằng cĩ khí hậu mát mẻ thích hợp cho việc trồng và phát triển cây bàng. 1.2. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên từ thực vật 1.2.1. Carbohydrate 1.2.1.1. Khái niệm Carbohydrate là một nhĩm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rải trong cơ thể sinh vật. Được cấu tạo từ các nguyên tố: C, H, O với cơng thức cấu tạo chung Cm(H2O)n, thường m = n (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). Nhìn chung hàm lượng carbohydrate ở thực vật cao hơn động vật. Ở thực vật carbohydrate thay đổi tùy theo lồi, giai đoạn sinh trưởng và phát triển. - Thực vật: chiếm khoảng 75% trong các bộ phận như củ, quả, lá, thân, cành. - Động vật: chiếm khoảng 2% trong gan, cơ máu, (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). 1.2.1.2. Phân loại Dựa vào cấu tạo, tính chất carbohydrate được chia làm 3 nhĩm lớn: monosaccharide, oligosaccharide (Disaccharide) và polysaccharide ( Phùng Trung Hùng và ctv, 2013). - Monosaccharide gồm: glucose, fructose. - Disaccharide gồm: saccharose, lactose, maltose. - Polysaccharide gồm: tinh bột, cellulose. 1.2.1.3. Vai trị Trong cơ thể sống carbohydrate giữ nhiều vai trị quan trọng: - Đảm bảo cung cấp khoảng 60% năng lượng cho các quá trình sống. - Cĩ vai trị cấu trúc, tạo hình (ví dụ: cellulose, peptidolican ). - Cĩ vai trị bảo vệ (mucopolysaccharide). - Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể) ( Nguyễn Phương Hà Linh, 2011). 6
  19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.2.2. Alkaloid 1.2.2.1. Khái niệm Alkaloid là những hợp chất hữu cơ cĩ chứa nitơ, đa số cĩ nhân dị vịng, cĩ phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đơi khi trong động vật. Thơng thường các alkaloid khơng tan trong nước, dễ tan trong các dung mơi hữu cơ. Trái lại thì các muối alkaloid thì dễ tan trong nước và hầu như khơng tan trong dung mơi hữu cơ ít phân cực. Từ đĩ, dựa vào độ tan khác nhau của các loại alkaloid mà sử dụng dung mơi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Alkaloid là amin cĩ nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid. Nhiều alkaloid cĩ các tác động dược lý học đối với con người và các động vật khác. Các alkaloid thơng thường là các dẫn xuất của các acid amin và phần nhiều trong số chúng cĩ vị đắng. Chúng được tìm thấy như là các chất chuyển hĩa phụ trong thực vật (ví dụ khoai tây hay cà chua), động vật (ví dụ các loại tơm, cua, ốc, hến) và nấm. Nhiều alkaloid cĩ thể được tinh chế từ các dịch chiết thơ bằng phương pháp chiết acid - base (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Alkaloid cĩ 2 phản ứng chính là phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Cĩ 2 nhĩm thuốc thử tạo tủa với alkaloid. Nhĩm thứ nhất cho tủa rất ít tan trong nước, tủa này sinh ra hầu hết do sự kết hợp của 1 cation lớn là alkaloid với 1 nhĩm amin lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử và nhĩm thứ 2 cho kết tủa ở dạng tinh thể. Đối với phản ứng tạo màu, cĩ 1 số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau. Phản ứng tạo tủa cho ta biết cĩ alkaloid hay khơng, cịn phản ứng tạo màu cho biết những chất cĩ trong alkaloid ( Phạm Thanh Kỳ, 1998). 1.2.2.2. Phân loại Các nhĩm alkaloid hiện bao gồm: - Nhĩm pyridine: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpine, nicotin, spartein, pelletierin. - Nhĩm isoquinolin: các alkaloid gốc thuốc phiện như morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, hydrastin, hydrastin, berberin. - Nhĩm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin. 7
  20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt - Nhĩm tropan: atropine, cocain, ecgonin, scopolamine. - Nhĩm quinolin: quinine, quinidine, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine, brucin, veratrin, cevadin. - Nhĩm phenothylamin : mescalin, ephedrine, dopamine, amphetamine. - Nhĩm indole : + Các tryptamin : DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin. + Các ergolin : Các alkaloid từ nhựa ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamine, acid lysergic v.v + Các beta-cabolin : harmin, harmalin, yohimbin, reserpine, emetin - Nhĩm purin: các xanthin như caffeine, theobromine, theophylline (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.2. Cấu trúc hĩa học một số chất thuộc nhĩm alkaloids. 1.2.2.3. Vai trị Đa số các alkaloid đều cĩ tác dụng diệt khuẩn, một số loại cĩ tác động lên hệ thần kinh như morphin, codein, cocain, Ngồi ra, alkaloid cịn làm hạ huyết áp và giúp chống ung thư ( Vũ Xuân Tạo, 2013). 1.2.3. Glycoside 1.2.3.1. Khái niệm Glycoside là những sản phẩm ngưng tụ của đường. Cấu tạo gồm 1 phần đường (glycon) kết hợp với 1 phần khơng phải là đường (aglycon) theo Vũ Kim Dung và ctv (2011). Hai phần kết hợp với nhau bằng dây nối acetal vì vậy phân tử glycoside 8
  21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt dễ bị phân hủy khi cĩ nước dưới ảnh hưởng của các enzyme (men) cĩ chứa trong cây. Bản chất glycoside gồm cả phần carbohydrate và phi carbohydrate (alcohol). Đây là dạng tinh thể khơng màu và tác dụng của glycoside phụ thuộc vào phần aglycon cịn phần glycon giúp tăng hoặc giảm tác dụng của chúng. Glycoside dễ bị hịa tan trong nước, cĩ vị đắng và tạo mùi thơm đặc trưng (Trần Trường Hận, 2010). 1.2.3.2. Phân loại Glycoside cĩ 3 cách phân loại dựa vào thành phần glycon, aglycon và kiểu liên kết giữa chúng (Vũ Kim Dung và ctv, 2011). - Phần đường: cĩ nhiều loại đường nhưng thường là glucose và đồng phân đường. - Liên kết giữa phần đường và phần khơng đường: C – glycosidic, O – glycosidic, N – glycosidic, S – glycosidic. - Nhĩm hợp chất khơng đường: saponins glycosidic, cardiac glycosidic, anthraquinone glycosidic, phenolic glycosidic, cyanogenic glycosidic, alcoholic glycosidic, coumarin glycosidic, chromonr glycosidic, steviol glycosidic. 1.2.3.3. Vai trị Glycoside giữ vai trị là nguồn dinh dưỡng cho cơ thể. Ngồi ra chúng cịn cĩ vai trị bảo vệ bằng cách tạo ra thể gây độc, qua quá trình thủy phân tạo ra 1 số chất kháng khuẩn thường tập chung ở vỏ và hạt như độc tố Solanine ở khoai tây (Trần Trường Hận, 2010). Một số glycoside quan trọng Saponin a. Khái niệm Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều lồi thực vật. Dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid lỗng, saponin bị thủy phân thành genin (sapogenin) và phần carbohydrate (Ngơ Văn Thu, 2011). Saponin thường ở dạng vơ định hình, cĩ vị đắng, tan được trong nước, alcohol và rất ít tan trong aceton, ether, hexan. Khi hịa tan saponin vào nước sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt (Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). 9
  22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt b. Phân loại Saponin được chia thành 2 nhĩm là saponin triterpenoid và saponin steroid ( Nguyễn Tấn Thịnh, 2013). - Saponin triterpenoid: + Saponin triterpenoid pentacyclic: nhĩm olean, nhĩm ursan, nhĩm hopan, nhĩm lupan. + Saponin triterpenoid tetracyclic: nhĩm dammaran, nhĩm lanostan, nhĩm cucurbitan - Saponin steroid: nhĩm spirostan, nhĩm furosatn, nhĩm aminofurostan, nhĩm spirosolan, nhĩm solanidan. c. Vai trị Vai trị của saponin: - Tác dụng long đờm chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nơn mửa, đi lỏng). - Một số saponin cĩ tác dụng chống viêm. - Một số cĩ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt. Anthraquione glycoside a. Khái niệm Anthraquione glycoside thường tồn tại dưới dạng glycoside. Đa số các anthraquione glycoside là các polyoxy anthraquione và nhân thường gắn các nhĩm chức –OH, -OCH3, -CH3, -COOH, Tùy theo vị trí các nhĩm chức dính vào nhân mà cĩ các dẫn chất khác nhau (Ngơ Văn Thu, 2011). Những dẫn xuất anthraquione glycoside đều cĩ màu từ vàng, vàng cam đến đỏ. Ở glycoside thì dễ tan trong nước, cịn thể tự do (aglycon) thì tan trong ether, chloroform và một số dung mơi hữu cơ khác (Ngơ Văn Thu, 2011). b. Phân loại Dẫn xuất Anthraquione glycoside cĩ thể chia làm 3 nhĩm: - Nhĩm phẩm nhuộm (các dẫn chất 1,2 dihydroxy anthraquione). - Nhĩm nhuộm tẩy (các dẫn chất 1,8 dihydroxy anthraquione). - Nhĩm dimer (Ngơ Văn Thu, 2011). 10
  23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt c. Vai trị Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthraquione glycoside cĩ tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư (Ngơ Văn Thu, 2011). Cardiae glycoside a. Khái niệm Cardiae glycoside là các glycoside thực vật, bao gồm hai phần là phần aglycon (khơng đường) và các glycine hay phần đường (Karkare, 2007). Cardiac glycoside là những chất kết tinh khơng màu, cĩ vị đắng. Chúng tan trong các dung mơi phân cực và dễ bị thủy phân trong mơi trường acid theo Karkare (2007). b. Vai trị Vai trị của Cardiac glycoside - Ở nồng độ thấp: cĩ tác dụng điều hịa nhịp tim - Ở nồng độ cao: gây nơn mửa, loạn nhịp tim, tiêu chảy, giảm sức co bĩp của tim (Karkare, 2007). Flavonoid a. Khái niệm Flavonoid là 1 nhĩm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật, đây cịn là sắc tố sinh học giúp tạo màu sắc cho hoa. Flavonoid cĩ cấu tạo gồm 2 vịng benzene A và B được nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Phần lớn các chất flavonoid cĩ màu vàng, tuy nhiên 1 số màu xanh, tím, đỏ và 1 số khác lại khơng màu. Trong thực vật cũng cĩ 1 số hợp chất khơng thuộc flavonoid cũng cĩ màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon (Quỳnh Ngọc, 2011). Chúng thường được cải biến bằng cách gắn thêm gốc (-OH), hoặc (-OCH3) và thường ở dạng phức với glucose và hữu cơ. Trong số này cĩ những chất phổ biến như flavonone, anthocyanin, flavon, catechine và rotenone. Chỉ riêng 2 nhĩm flavon, flavonone với các nhĩm thế OH và OCH3 thì theo lý thuyết cĩ thể gặp 38 627 chất (Ngơ Văn Thu, 1998). Các flavonoid cĩ hoạt tính kháng khuẩn do chúng cĩ khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn. Flavonoid càng ưa béo thì càng cĩ khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Quỳnh Ngọc, 2011). 11
  24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt b. Phân loại Dựa vào vị trí của gốc aryl (vịng B) và các mức độ oxy hĩa của mạch 3 C nên các flavonoid được chia thành 3 nhĩm chính: - Các flavonoid cĩ gốc aryl ở vị trí C-2: Euflavonoid. - Các flavonoid cĩ gốc aryl ở vị trí C-3: Isoflavonoid - Các flavonoid cĩ gốc aryl ở vị trí C-4: Neoflavonoid (Ngơ Văn Thu, 2011). Hình 1.3. Cấu trúc hĩa học của flavonoid (A) và các dạng flavonoid (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid c. Vai trị Các chất flavonoid là những chất oxy hĩa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hĩa bởi các gốc tự do như OH+, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hĩa, ) làm cho tế bào hoạt động khác thường. Flavonoid cịn cĩ khả năng tạo phức với các ion kim loại hay các hợp chất hữu cơ chứa các gốc nitrite, carboxyl, carbonyl, giúp bảo vệ vi sinh chống lại quá trình oxy hĩa cĩ hại như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hĩa. Do đĩ, các chất flavonoid cĩ tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa sơ vữa động mạch, tai biến mạch lão hĩa, tổn thương do bức xạ. Flavonoid cịn cĩ tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn ở gan và bảo vệ chức năng gan. Flavonoid cịn cĩ tác dụng chống dị ứng, kháng viêm bằng cách ngăn chặn sự phĩng thích hay tổng hợp các chất làm tăng tình trạng viêm và dị ứng như histamine, serine protease, prostaglandin, leukotriene, ( Quỳnh Ngọc, 2011). 12
  25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Phenolic a. Khái niệm Hợp chất phenolic là các hợp chất cĩ 1 hoặc nhiều vịng thơm với 1 hoặc nhiều nhĩm hydroxyl, chúng được phân bố rộng rãi trong thực vật và các sản phẩm trao đổi chất của thực vật. Hơn 8000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy từ các phân tử đơn giản như các acid phenolic đến các hợp chất polymer như tannin. Sự tích lũy các hợp chất phenolic phụ thuộc vào lồi, trạng thái sinh lý và vị trí địa lý của các lồi cây (Shetty và ctv, 2006). Đa số các hợp chất phenolic được tổng hợp từ phenylalanine. Ở thực vật nhĩm phenolic chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid, đây là 1 trong những hợp chất đơn giản cĩ độc tính sinh học và được cấu tạo từ dẫn xuất thế vịng phenolic. Một số phenolic như furanocoumarins thì khơng gây độc, nhưng khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, dưới ánh sáng cĩ bước sĩng gần với tia tử ngoại (UV-A) thì nĩ trở nên rất độc (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). Hình 1.4. Caffeic acid b. Phân loại Phenolic chia làm hai nhĩm: phenolic acids và flavonoid polyphenols. Phenolics Phenolic acids Flavonoid polyphenols Hình 1.5. Phân loại nhĩm phenolics theo cấu trúc hĩa học c. Vai trị Vai trị của nhĩm phenolic: - Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh, cơn trùng và các động vật ăn cỏ. 13
  26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt - Khả năng ức chế vi sinh vật và nấm sợi. - Chất chống oxy hĩa tự nhiên và tìm thấy trong táo và trà xanh. - Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm (Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, 2012). 1.2.4. Tannin a. Khái niệm “Tannin” được dùng đầu tiên vào năm 1796 để chỉ những nhất cĩ mặt trong dịch chiết từ thực vật cĩ khả năng kết hợp với protein của da sống động vật cho da biến thành da thuộc khơng thối và bền. Do đĩ, tannin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol cĩ trong thực vật, cĩ vị chát được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc da”. Tannin cĩ khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác (amino acid và alkaloid). Chúng thường gặp chủ yếu trong thực vật bậc cao ở những cây hai lá mầm. Tannin tan trong nước, kiềm lỗng, glycerin và aceton, đa số khơng tan trong các dung mơi hữu cơ và đồng thời tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thủy ngân, kẽm, sắt). b. Phân loại - Tannin cĩ thể chia thành hai loại chính: - Tannin thủy phân được hay cịn gọi là tannin pyrogallic (Gallic acid). - Tannin ngưng tụ hay cịn gọi là tannin pyrocatechic (Flavone). c. Vai trị Vai trị của tannin: - Bảo vệ thực vật khỏi các lồi cơn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu. - Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng. - Cơng dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy (Ngơ Thị Thùy Dương, 2012). 14
  27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.2.5. Steroid a. Khái niệm Steroid là một loại hợp chất hữu cơ, cĩ bộ khung cacbon stenan chứa bốn vịng cycloalkane được nối với nhau theo những cách đặc trưng riêng (Đặng Văn Hồi, 2009). Steroid là hợp chất chất béo hữu cơ hịa tan, cĩ nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp dễ tan trong chloroform, ether, rượu nĩng và khơng tan trong nước (Tơn Nữ Minh Nguyệt, 2011). b. Phân loại Steroid được chia làm 4 nhĩm chính (Đặng Văn Hồi, 2009): - Nhĩm steroid động vật: Cholesterol, cholestan-3β-ol, coprostan-β-ol, desosterol, coprosterol, cerebrosterol và lathosterol. - Nhĩm steroid của động vật biển khơng xương sống: Spongesterol, clionasterol, 24-methylencholesterol và fucosterol. - Nhĩm Steroid thực vật: Sistosterol (cĩ các đồng phân α,β,), stigmasterol, α- spinasterol và brassicasterol. - Nhĩm sterol nấm men: Ergosterol, zymosterol, acosterol và fecosterol. c. Vai trị - Tham gia vào các quá trình sinh học trong cơ thể sống. - Thường dùng làm các thuốc kích thích (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv,2011). 1.2.6. Amino acid a. Khái niệm Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Amino acid là một phân tử chứa cả nhĩm amin và carboxylate, chúng tạo thành các xích polymer ngắn gọi là peptide hay polypeptide. Tất cả amino acid tự nhiên đều thuộc α-amino acid, nhĩm amino (-NH2) gắn vào cacbon thứ 2 (hay cacbon α) của acid hữu cơ. Ngồi nhĩm – NH2, -COOH, trong amino acid tự nhiên cịn chứa các nhĩm chức khác như: -OH, HS-, -CO- 15
  28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt b. Phân loại Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 amino acid cơ bản thành các nhĩm. Một trong các cách phân loại là 20 amino acid được phân thành 5 nhĩm như sau (Hồ Chí Tuấn, 2009): - Nhĩm 1: các amino acid cĩ gốc R khơng phân cực kị nước, thuộc nhĩm này cĩ 6 amino acid: Glysine (G), Alanine (A), Valine (V), Leucine (L), Isoleucine (I), Proline (P). Nhĩm 2: các amino acid cĩ gốc R là nhân thơm thuộc nhĩm này cĩ 3 amino acid: Phenylamine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W). Nhĩm 3: các amino acid cĩ gốc R bazo, tích đện dương, thuộc nhĩm này cĩ 3 amino acid: Lysine (K), Arginine (R), Histidine (H). Nhĩm 4: các amino acid cĩ gốc R phân cực, khơng tích điện, thuộc nhĩm này cĩ 6 amino acid: Serine (S), Threonine (T), Cysteine (C), Methionine (M), Asparagine (N), Glutamine (Q). Nhĩm 5: các amino acid cĩ gốc R acid, tích điện âm, thuộc nhĩm này cĩ 2 amino acid: Aspartate (D), Glutamate (E). c. Vai trị Vai trị của amino acid trong cơ thể thực vật: - Thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp trao đổi chất. - Tăng hiệu quả của thuốc bảo vệ thực vật. - Tăng khả năng ra hoa và quả. 16
  29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Bảng 1.1. Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Amino acid Hoạt động sinh hĩa Glycine Là tiền chất của chlorophyll Proline Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước. Hydroxyproline Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action). Thiết yếu để tạo phấn hoa (tốt cho đậu trái). Glutamic Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino Glutamine acid khác và protein thơng qua phản ứng trao đổi. Serine Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng cho quá trinh tổng hợp cholorophyll. Arginine Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để phân chia tế bào. Phenylalanine Tiền chất cấu tạo nên lignine, tạo các chồi gỗ khỏe hơn. Alanine Vai trị rất quan trọng trong việc tạo hoocmon trao đổi chất và kháng virus. Tryptophan Tiền tố của indol-acetic acid, các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. 1.2.7. Isoprenoid (terpene) a. Khái niệm Isoprenoid (terpene) là một nhĩm chất lớn và đa dạng. Bộ khung carbon được tạo thành từ đơn vị cơ bản isoprene – C4H8. Terpene cĩ nhiều ở thực vật đặc biệt là lồi họ thơng. b. Phân loại Phân loại dựa vào số đơn vị isoprene cấu thành phân tử - Sesterterpenoid (5 đơn vị) - Triterpenoid (6 đơn vị) - Tetraterpenoid (8 đơn vị) 17
  30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt - Polyterpenoid (n đơn vị) - Monoterpenoid (2 đơn vị) - Sesquiterpenoid (3 đơn vị) - Diterpenoid (4 đơn vị) c. Vai trị - Ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn ngăn ngừa ung thư. - Bảo vệ thực vật. - Cĩ khả năng xua đuổi cơn trùng. 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất cĩ nguồn gốc từ thực vật 1.3.1. Khái niệm về hoạt tính kháng khuẩn Kháng khuẩn thực vật là tên gọi chung chỉ các hợp chất hữu cơ cĩ trong thực vật, cĩ tác dụng tiêu diệt hay kiềm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường cĩ tác dụng đặc hiệu lên các lồi vi sinh vật khác nhau ở một nồng độ thường rất nhỏ (Silva và Fernandes, 2010). 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế hoạt động khác nhau của các hợp chất kháng khuẩn cĩ trong thực vật đã được nghiên cứu. Chúng cĩ thể ức chế các vi sinh vật, gây trở ngại cho một số quá trình trao đổi chất hoặc cĩ thể điều chỉnh biểu hiện gen và con đường truyền tín hiệu (Etherton và ctv, 2002; Manson, 2003; Surh, 2003). Khơng phải tất cả cơ chế hoạt động đều làm việc trên các mục tiêu cụ thể, và một số vùng khác của tế bào cĩ thể bị ảnh hưởng bởi các cơ chế khác.(Hình 1.6) 18
  31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Hình 1.6. Những vị trí của vi khuẩn bị tác động bởi các hợp chất thực vật (Burt, 2004) Cao chiết từ các loại thực vật cĩ thể biểu hiện hoạt tính kháng lại các chủng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau như sự can thiệp vào các lớp đơi phospholipid của màng tế bào gây hậu quả làm gia tăng độ thấm, tổn hại các thành phần tế bào, phá hủy các enzyme tham gia vào việc hình thành năng lượng tế bào, tổng hợp các thành phần cấu trúc, và đồng thời phá hủy hoặc làm bất hoạt các vật liệu di truyền. Nĩi chung, cơ chế tác động của hợp chất kháng khuẩn tự nhiên cĩ liên quan đến sự rối loạn, phá vỡ màng tế bào chất, làm gián đoạn mất ổn định lực chuyển động của proton (PMF), dịng điện tử, sự vận chuyển tích cực, và đơng tụ các thành phần của tế bào (Kotzekidou và ctv, 2008). 19
  32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Bảng 1.2. Những nhĩm hợp chất tự nhiên cĩ hoạt tính kháng khuẩn (theo Cowan, 1999) Nhĩm Phân nhĩm Ví dụ Cơ chế Phenolic Phenol đơn Catechol Phá vỡ màng sinh chất Epicatechin Phá vỡ vách tế bào Phenolic acid Cinnamic acid Quinone Hypericin Liên kết bám dính, tạo phức hợp với thành tế bào, làm bất hoạt enzyme Flavonoid Chrysin Liên kết bám dính Flavone Tạo phức hợp với thành tế bào Abyssinone Khử hoạt tính enzyme Ức chế phiên mã ngược HIV Flavonol Tannin Ellagitannin Bám dính Protein Bám dính Adhesin Ức chế enzyme Phá vỡ màng sinh chất Tạo phức hợp với thành tế bào Phá vỡ vách tế bào Tạo phức kim loại - ion Coumarin Warfarin Tương tác DNA nhân thực (hoạt tính kháng virus) Terpenoid Capsaicin Phá vỡ vách tế bào Tinh dầu Alkaloid Berberine Xen vào thành tế bào hoặc DNA Piperine Lectin Mannose – specific Khĩa sự kết hợp của virus hoặc hấp Polypeptide agglutinin phụ Falxatin Hình thành cầu Disulfide Polyacetylen 8s – heptadeca – 2(Z), 9(Z) – diene – 4,6 – diyne – 1,8 diol 20
  33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.3.3. Một số hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn từ thực vật 1.3.3.1. Hợp chất Phenolic Nguyên nhân chính tạo ra độc tính của các hợp chất phenolic đối với vi sinh vật là sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hĩa, cĩ thể thơng qua phản ứng với nhĩm sulfhydryl hoặc thơng qua sự tương tác khơng đặc hiệu của các chất này với protein. a. Quinone Quinone là những vịng thơm với 2 nhĩm thế ketone. Chúng là những hợp chất màu, tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và cĩ phản ứng đặc trưng cao. Quinone cĩ thể tạo phức khơng thay đổi với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vơ hoạt và mất chức năng của protein. Do đĩ khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn. Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng. Quinone cũng tạo ra chất nền khơng thể sử dụng được cho các vi sinh vật. Người ta nhận thấy rằng anthraquinone được lấy từ một lồi cây cĩ nguồn gốc từ Pakistan cĩ khả năng kiểm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum, và Pseudomonas aeruginosa, cĩ khả năng diệt khuẩn đối với Pseudomonas pseudomalliae. Hypericin, một anthraquinone cho thấy là cĩ khả năng chống bệnh trầm cảm và cĩ hoạt tính kháng khuẩn tổng hợp (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Quinone Anthraquinone Hypericin Hình 1.7. Cấu trúc hĩa học của phân tử quinone, anthraquinone và hypericin b. Flavonoid Các hợp chất flavonoid tổng hợp bởi cây trồng để phản ứng lại sự nhiễm khuẩn và cĩ tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều vi sinh vật. Hoạt tính kháng khuẩn của 21
  34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein tan ngoại bào, tạo phức với thành tế bào vi khuẩn, và ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc khơng tổng hợp được. Các flavonoid càng ưa béo càng cĩ khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Catechin là những hợp chất flavonoid được nghiên cứu rộng rãi do chúng cĩ mặt trong trà xanh ơlong. Qua những nghiên cứu, người ta nhận thấy trà xanh cĩ hoạt tính kháng khuẩn đã ức chế Vibrio cholerae O1, Streptpcoccus mutans, Shigella spp., và các vi khuẩn, vi sinh vật khác. Catechin vơ hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio, ức chế enzyme glucosyltransferase của vi khuẩn S. mutans, cơ chế tác dụng cũng là do khả năng tạo phức như được mơ tả ở phần quinone. Hoạt động nghiên cứu gần đây được tiến hành trên cơ thể chuột, khi chuột được cho ăn khẩu phần ăn cĩ chứa 0,1% catechin cĩ nguồn gốc từ trà thì khe nứt do sâu răng của chuột do S. mutans gây ra giảm 40% (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). Hình 1.8. Cấu trúc hĩa học của catechine Nhiều nghiên cứu khác cho thấy rằng các dẫn xuất của flavones cĩ khả năng ức chế virus (RSV). Người ta đã tìm ra hoạt tính và phương thức hoạt động của quercetin, naringin, hesperretin và catechin. Trong khi naringin khơng ức chế virus typr 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khĩ thở ở trẻ hoặc RSV, thì ba flavonoid khác lại cĩ tác dụng theo những phương thức khác nhau. Hesperetin làm giảm sự sao chép nội bào của các lồi virus trên, catechin ứa chế sự lây nhiễm nhưng khơng làm giảm sự sao chép nội bào của RSV và HSV – 1, quercetin là chất cĩ hiệu quả tốt trong việc giảm tình trạng lây nhiễm các loại bệnh do vi sinh vật gây ra. Người ta cho rằng sự khác nhau nhỏ về cấu tạo trong các hợp chất cũng ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng. 22
  35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt c. Counarine Coumarine là hợp chất phenolic được tạo thành bởi benzene nĩng chảy và vịng α-pyrone. Chúng cĩ hoạt tính chống đơng máu, chống viêm và giãn mạch máu. Warfarin là một Coumarine đặc biệt nổi tiếng khi sử dụng như chất chống đơng máu sử dụng kèm theo đường miệng và đồng thời cũng được sử dụng để giết động vật gặm nhắm. Hình 1.9. Cấu trúc hĩa học của coumarine. Nhiều dẫn chất Coumarine cĩ tác dụng kháng khuẩn đặc biệt là chất novobiocine là một chất kháng sinh cĩ phổ kháng khuẩn rộng trong nấm Streptomyces niveus. Nĩ cũng cĩ hoạt tính chống lại virus. Coumarine được biết là cĩ độc tính cao vì thế cần được xử lý rất cẩn thận bởi y tế cộng đồng. Một vài Coumarine khác cũng cĩ hoạt tính chống lại vi sinh vật và cĩ khả năng ức chế nấm Candida albicans (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). d. Tannin Một trong những tính chất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein thơng qua các liên kết khơng đặc hiệu như lên kết hydro và các liên kết cộng hĩa trị. Khi liên kết với protein chúng cĩ thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng. Các protein này cĩ thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide Scalbert xem xét lại các tính chất kháng khuẩn của tannin vào năm 1991. Ơng đưa ra 33 nghiên cứu ghi nhận tính kháng khuẩn của tannin. Theo các nghiên cứu này, tannin cĩ thể ức chế sự phát triển của nấm sợi, nấm men và các vi khuẩn. Tính kháng khuẩn của tannin được tăng cường bởi tia cực tím (UV) cĩ mức ánh sáng kích hoạt bước sĩng 320 đến 400 nm. Ngồi ra, cĩ ít nhất hai nghiên cứu đã chỉ ra 23
  36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt rằng tannin cĩ thể ức chế virus nhờ cơ chế đảo ngược quá trình phiên mã DNA của virus. 1.3.3.2. Nhĩm alkaloid a. Solamargine Solamargine là một glycoalkaloid kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhĩm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Thường cĩ trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasianum) và các alkaloid khác trong lồi cây này cĩ khả năng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Hình 1.10. Cấu trúc hĩa học của phân tử Solamargine b. Berberine Berberine là một đại diện quan trọng của alkaloid cĩ trong các cây: hồng đằng, hồng lá, hồng liên cĩ tác dụng kháng khuẩn rộng đối với Shigella spp., Staphylococcus spp. (tụ cầu khuẩn), Vibrio spp., Streptococcus spp. Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine cĩ tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn acid. Ngồi ra nĩ cịn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với các nhĩm vi khuẩn gây bệnh sốt rét do berberine cĩ khả năng đột biến RNA của vi khuẩn gây sốt rét, chính điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với các loại vi khuẩn gây bệnh này. 24
  37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Hình 1.11. Cấu trúc hĩa học của berberine 1.3.3.3. Nhĩm terpenoid và tinh dầu Terpenene và terpenoid cĩa hoạt tính kháng khuẩn đối với nấm, vi khuẩn, virus và động vật nguyên sinh. Năm 1977, cĩ nghiên cứu cho rằng 60% các dẫn xuất của tinh dầu cĩ khả năng ức chế nấm, trong khi khoảng 30% ức chế được vi khuẩn. Đồng thời, các acid betulinic triterpenoid là một trong nhiều terpenoid cĩ khả năng ức chế được HIV. Cơ chế tác động của tecpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy đốn là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy các terpenoid hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật cĩ ích trong việc kiểm sốt Listeria monocytogene. Theo Mendoza, việc tăng nhĩm ưa nước (hydrophilicity) của kaurene diterpenoids thì làm giảm mạnh tính kháng khuẩn của chúng. Các nhà khoa học thực phẩm cũng đã tìm thấy các terpenoids hiện diện trong các loại tinh dầu thực vật cĩ ích trong việc kiểm sốt Listeria monocytogene. Dầu húng quế, một thảo dược được thương mại hĩa, được xác định là hiệu quả kháng khuẩn tương đương với 125 ppm clo khử trùng trong lá rau diếp (Tơn Nữ Minh Nguyệt và ctv, 2010). 1.3.3.4. Nhĩm lictin và polypeptide Cơ chế kháng khuẩn của lectin và polypeptide là do cĩ sự hình thành các ion trên màng vi sinh vật, hoặc do sự cạnh tranh và ức chế sự bám dính protein trên cơ quan thụ cảm vật chủ ở vi sinh vật. Bên cạnh đĩ chúng cịn phá vỡ màng tế bào, cản trở sự trao đổi chất và ảnh hưởng tới các thành phần tế bào chất. Thionin là peptide thường được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì, bao gồm 47 amino acid. Chúng cĩ khả năng ức chế nấm men, vi khuẩn Gram âm và Gram dương. 25
  38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Fabatin là một loại peptide cĩ trong đậu fava, cĩ cấu trúc liên quan tới γ- thionins từ ngũ cốc và nĩ ức chế được E.coli, P.aeruginosa, và Enterococcus hirae nhưng lại khơng ức chế Candida hoặc Saccharomyces. 1.3.4. Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và Việt Nam 1.3.4.1. Trên thế giới Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được cơng dụng diệt khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hĩa học Chester J.Cavallito đã phân tích được hợp chất Alicin trong tỏi cĩ cơng dụng như thuốc kháng sinh. Năm 1949, Dold và Knapp đã kiểm tra hoạt động kháng khuẩn của 27 chiết xuất từ thực vật chống lại 8 chủng sinh vật thử nghiệm: E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhosa, Shigella paradysenteria và cho thấy tỏi cĩ hoạt động chống lại tất cả các sinh vật được kiểm tra. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh, nước tinh chất từ tỏi cĩ thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn cĩ lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella spp. (Fulder,2005). Năm 1959, Horak đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ chiết xuất cây Cannabit sativa cĩ nguồn gốc từ Ấn Độ, ơng đã tìm thấy cannabiriolic là một chất cĩ tác dụng ức chế với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus pyogenes aureus, Streptococcus alpha haemolyticus, Streptococcus beta haemolyticus, Enterococcus, Diplococcus pneumoniae, B.subtilis, B.anthracis, Corynebacterium diphtheriae và Corynebacterium cutis, đặc biệt cĩ thể ức chế vi khuẩn kháng lại penicilin (Kabelik và ctv 1960). Năm 1982, Ueda cũng đã thử nghiệm chất chiết xuất từ cây thuốc và gia vị bằng dung mơi ethanol để ức chế vi khuẩn và nấm trong mơi trường nuơi cấy tại pH khác nhau. Đinh hương được nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cĩ thể chống lại tất cả các sinh vật thử nghiệm bao gồm cả vi khuẩn B.subtilis PCI, S.aureus 209P, E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus morganii. Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và ctv đã thử nghiệm thành cơng khả năng kháng khuẩn của các lồi cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata, 26
  39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhusnutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus và P.urinaria đối với Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ cĩ 2 cây Momordica chratina và Psidium và Psidium guajava cĩ hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. Năm 2000 nghiên cứu của Avancini CAM, Wiest JM, Mundstock EA, cho kết quả hoạt tính kháng khuẩn của “carqueja” (Baccharis trimera Less) ức chế được nhĩm vi khuẩn Gram dương (S.aureus, Streptococcus uberi) và Gram âm (Salmonella gallinarumand, Escherichia coli). Vào năm 2003 nhĩm Candan và ctv đã nghiên cứu tinh dầu trong lá cỏ thi (Achillea millefolium) cĩ hoạt tính kháng khuẩn cao hơn mẫu cao được chiết tử methanol. Tinh dầu cĩ thể ngăn chặn sự phát triển của các nhĩm vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes, nấm Candida albicans và ức chế yếu hơn đối với Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffiiand, Candida krussei. Vào năm 2006, nghiên cứu của nhĩm Asolini và ctv cho kết quả nhĩm hợp chất phenolic tồn tại trong mẫu cao chiết ethanol cĩ khả năng kháng khuẩn rất tốt. Mẫu dịch chiết từ a–ti–sơ (Cynara scolymus) và mẫu cao ethanol (80%) của cả a–ti-sơ và “macela” (Achyroline satureioides) ức chế sự phát triển của Bacillus cereus, B.subtilis, Pseudomonas aeruginosa và S.aureus. Năm 2011, Naveed Ahmad và ctv đã nghiên cứu về sự chống oxy hĩa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại dung mơi khác nhau. Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất từ lá của cây Syxygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi), Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) và Ficus religiosa (Peepal) chống lại Staphylococcus aureus. Chaghaby và ctv (2014) đã chứng minh các dịch chiết khác nhau từ lá cây Annona Squamosa L. đều cĩ hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương mạnh hơn Gram âm. Kết quả của ơng được nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học của Chopra và Greenwood, cho rằng vi khuẩn Gram âm ít bị ảnh hưởng nhiều bởi 27
  40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt những chất cĩ chiết xuất từ thực vật hơn so với vi khuẩn Gram dương là do chúng cĩ một lớp màng ngồi bao gồm các lipoprotein và lipopolysaccharide. Đĩ là lớp màng chọn lọc cho phép chúng cĩ khả năng điều hịa lưu thơng các chất ra vào bên trong cơ cấu nội bào. Mỗi một dịch chiết đều thể hiện khả năng kháng ít nhất 6/27 chủng vi khuẩn chỉ thị, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn ở những dịch chiết lên các chủng vi sinh vật là khác nhau. Sự khác nhau đĩ là do sự khác biệt giữa các hợp chất hố học cĩ trong mỗi loại dịch chiết. 1.3.4.2. Việt Nam Năm 1956, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc và khẳng định nhiều cây cĩ tác dụng kháng khuẩn mạnh. Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng và ctv đã nghiên cứu trên 1000 cây thuốc và chỉ ra việc sử dụng những cây thuốc rất an tồn và cĩ hoạt tính kháng khuẩn cao, từ đĩ nhĩm đã đưa ra chế phẩm cây Tơ Mộc trị tiêu chảy (Trần Nam Hà, 2008). Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu khơng để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuơi động vật thủy sản, bước đầu đã cĩ kết quả tốt ở quy mơ phịng thí nghiệm. Tác giả Đặng Xuân Cường (Đại học Nha Trang, 2009) đã nghiên cứu các phương pháp thu nhận dịch chiết cĩ hoạt tính kháng khuẩn từ lồi rong nâu Dictyota dichotama Việt Nam. Tác giả cũng cho thấy dịch chiết thu nhận từ lồi rong nâu này co hoạt tính kháng khuẩn khá tốt và đã phân tích được các thành phần cĩ trong dịch chiết từ rong nâu. Cùng năm 2009, Võ Thị Mai Hương đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Muồng Trâu trên 5 nhĩm vi khuẩn Vibrio spp. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus và cho kết quả kháng khuẩn cao hơn so với nghiên cứu tương tự vào năm 2002 của Elysha và ctv. Năm 2010, Phạm Văn Ngọt và ctv đã thơng báo kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của lồi Mộc Kí Ngũ Hùng (Dendrophthoepentadra (L.) Miq.) thuộc họ Tầm gửi. Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người. 28
  41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Năm 2012, tại Nha Trang, Lê Thị Hương Hà nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – chống oxy hĩa của cao dịch chiết từ củ hành tăm (Allium schoenoprasum) trên các chủng vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, E.coli, S.aureus, Pseudomonas, B.subtilis, B. cereus, Aspergillus, Penicillum. Võ Thị Mai Hương và Trần Thanh Phong (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ các loại dịch chiết ethanol, methanol và các phân đoạn n-Hexan, EtOAC, n-Butanol của methanol từ quả Nhàu và kết quả cho thấy các loại dung mơi trên đều cho hoạt tính kháng khuẩn cao với các vi khuẩn khảo sát Staphylococcus aureus, Salmonella typhii, Escherichia coli, Bacillus pumilus. Năm 2014, Huỳnh Kim Diệu và Võ Thị Tuyết đã đánh giá sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây hẹ (Allium tuberosum Roxb. Et Spreng) trên 8 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherrichia coli, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella icaluri, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. Kết quả nghiên cứu cao hẹ cĩ khả năng ức chế trên tất cả các chủng vi khuẩn thí nghiệm (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml). 1.3.5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 1.3.5.1. Khái niệm Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibition Concentration (MIC)) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) cĩ khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuơi cấy. Khi cho vi khuẩn tiếp xúc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) ở các liều lượng nồng độ khác nhau, vi khuẩn bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Một số vi khuẩn cĩ thể nhạy cảm với một ít hoặc với chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh). Chỉ số MIC cĩ tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn các chất kháng khuẩn (hoặc kháng sinh) phù hợp với từng loại vi khuẩn gây bệnh. Việc loại trừ sạch vi khuẩn cĩ thể dự đốn dựa vào dữ liệu MIC, đồng thời xác định được nồng độ tối ưu để làm chậm sự chọn lọc vi khuẩn kháng thuốc. 29
  42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 1.3.5.2. Phương pháp xác định Tùy theo phương pháp áp dụng mà cĩ nhiều cách xác định chỉ số MIC khác nhau. Các phương pháp phổ biến như: phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, phương pháp pha lỗng, phương pháp đặt khoanh giấy Sau đĩ ta cĩ thể xác định nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế hồn tồn sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách quan sát với mắt thường. 1.4. Ảnh hưởng của dung mơi đến khả năng tách chiết cao từ thực vật Tách chiết bằng dung mơi là quá trình di chuyển vật chất trong hệ hai pha rắn – lỏng. Quá trình này sẽ sử dụng một số dung mơi thích hợp để hịa tan các hợp chất tan cĩ trong thực vật, sau đĩ tách chúng ra khỏi phần khơng tan. Phần dung mơi hịa tan các chất được gọi là dịch chiết, phần khơng tan được gọi là bã thực vật. Dựa vào tính phân cực của dung mơi và của các nhĩm hợp chất ta cĩ thể dự đốn sự cĩ mặt của các chất trong mỗi phân đoạn ly trích, từ đĩ lựa chọn dung mơi tách chiết thích hợp: - Trong dịch chiết ete và ete dầu hỏa sẽ cĩ các thành phần của tinh dầu như monoterpene, các chất khơng phân cực như chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật, chlorophyll - Trong dịch chiết nước sẽ cĩ các glycoside, tannin - Trong dịch chiết chloroform sẽ cĩ mặt quinone, các aglycol do glycodise thủy phân, sesquiterpen, diterpen - Methanol và ethanol là những dung mơi phân cực hơn các hydrocacbon thế cho. Người ta cho rằng dung mơi thuộc nhĩm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào, hịa tan được các chất khơng phân cực đồng thời cũng cĩ khả năng tạo dây nối hydro với các nhĩm phân cực khác, nên quá trình chiết với các dung mơi này sẽ thu được lượng lớn thành phần các hợp chất tự nhiên. 2. Yêu cầu đối với dung mơi: - Dễ thấm vào dược liệu: dung mơi cĩ độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ. - Hịa tan nhiều hoạt chất, ít tạp chất. - Cĩ tính trơ về mặt hĩa học: khơng làm biến đổi hoạt chất, khơng gây khĩ khăn trong quá trình bảo quản, khơng bị phân hủy bởi nhiệt độ cao. 30
  43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt - Dễ dàng được loại bỏ, phải bay hơi được khi cần cơ đặc dịch chiết. - Khơng làm cao cĩ mùi đặc biệt, khĩ chịu. - Cần cĩ độ tinh khiết nhất định để khơng làm ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết cao. - Rẻ tiền, dễ kiếm. 2.1. Một số nhĩm vi khuẩn gây bệnh 2.1.1. Nhĩm vi khuẩn Escherichia coli 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que thẳng. Kích thước dài, ngắn khác nhau trung bình từ 2 - 3µm, rộng 0,5 µm; trong những điều kiện nuơi cấy khơng thích hợp (ví dụ trong mơi trường cĩ kháng sinh) trực khuẩn cĩ thể rất dài (6 – 8 µm). Rất ít chủng E.coli cĩ v, khơng sinh bào tử, hầu hết cĩ lơng và cĩ khả năng di động (Bùi Thị Hài Hồ, 2012). Trực khuẩn E.coli hiếu khí và kỵ khí tuỳ nghi, cĩ thể phát triển ở nhiệt độ từ 15oC – 40oC, phát triển ở nhiệt độ thích hợp 37oC với pH = 7,2 – 7,4; phát triển được ở pH = 5,5 – 8,0 (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). Trong mơi trường lỏng, sau 4 - 5 giờ, E.coli đã làm đục nhẹ mơi trường, càng để lâu càng đục nhiều và sau vài ngày cĩ thể đĩng váng mỏng trên mặt mơi trường, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên mơi trường thạch thường, sau 18 – 24 giờ, khuẩn lạc trịn, bờ đều, bĩng, khơng màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2 – 3 mm. Hình 1.12. E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2µm (Bact, 2005). 31
  44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.1.1.2. Khả năng gây bệnh E.coli là nguyên nhân gây ra các bệnh ở người như tiêu chảy, gây viêm đường tiêu hố, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hơ hấp. Là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong bệnh viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. Nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. E.coli cịn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Trong các loại độc tố của E.coli, độc tố shiga là nguy hiểm nhất được biết đến trên người, làm huỷ hoại các vi nhung mao hấp thu của tế bào biểu mơ ruột. Nĩ xâm nhập vào tế bào biểu mơ đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein làm chết tế bào. Hậu quả là gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng cĩ thể gây thủng ruột (Bùi Thị Hài Hồ, 2012). E.coli gây bệnh thực nghiệm: khả năng gây bệnh chi súc vật tương đối thấp, phải cần một số lượng lớn vi khuẩn vào phúc mạc chuột nhắt hoặc đường tĩnh mạch cho thỏ mới gây chết được súc vật. 2.1.2. Nhĩm vi khuẩn Salmonella spp. 2.1.2.1. Đặc điểm hình thái Salmonella spp. là trực khuẩn Gram âm, hình que, kích thước trung bình 3,0 x 0,5 µm. Cĩ nhiều lơng xung quanh thân (trừ A.gallinarum và S.pullorum), cĩ khả năng di động, khơng cĩ vỏ, khơng sinh bào tử (Trần Kim Hùng Nguyên, 2005). Là vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển được trên mơi trường nuơi cấy thơng thường. Vi khuẩn cĩ thể phát triển ở nhiệt độ 6 – 42oC và pH từ 6 – 9, nhưng điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC ở pH 7,2. Nuơi cấy trên mơi trường lỏng: sau khi nuơi cấy vài giờ Salmonella spp làm mơi trường đục nhẹ, sau 18 giờ làm đục nhiều, nuơi cấy lâu sẽ cĩ cặn ở đáy ống nghiệm và cĩ màng mỏng trên bề mặt mơi trường (Nguyễn Như Thanh, 1997). Nuơi cấy trên mơi trường thạch: vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc trịn, nhỏ, trong hoặc xám, nhẵn, bĩng hay lồi lên ở giữa. 32
  45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Hình 1.13. Hình thái vi khuẩn Samonella spp. (Taragui, 2005). 2.1.2.2. Khả năng gây bệnh Salmonella spp. là căn nguyên gây ra nhiều loại bệnh do thực phẩm nhiễm độc hay cịn gọi là ngộ độc thực phẩm. Các triệu chứng thường gặp như tiêu chảy, co thắt dạ dày, đau đầu, sốt, nơn mửa và mất nước (mất dịch cơ thể). Triệu chứng cĩ thể tiến triển từ 12 – 72 giờ sau khi nhiễm khuẩn. Các triệu chứng thường kéo dài trong vịng 4 – 7 ngày và sau đĩ tự hồi phục. Tuy nhiên một số ít trường hợp cĩ thể diễn biến nặng và gây tử vong (Phạm Thị Cẩm Hà, 2013). Salmonella spp. cịn gây bệnh thương hàn chủ yếu do S.typhii gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hố, cĩ thể gây thủng ruột; ngồi ra, cịn gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, chứng truỵ tim mạch Các bệnh khác (khơng phải thương hàn) thường là nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hố chủ yếu là do 2 tác nhân S.typhimurium, S.enteritidis gây ra, bệnh cĩ biểu hiện gây sốt, nơn, tiêu chảy. Ngồi ra, Salmonella cĩ thể gây nên các tổn thương ở ngồi đường tiêu hố như viêm màng não, cĩ thễ nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi Salmonella spp. gây bệnh thực nghiệm trên gia cầm: vi khuẩn Salmonella gây 3 thể bệnh: bệnh thương hàn, phĩ thương hàn và bệnh bạch lỵ. Đối với gia súc S.choleraesuis chủng Kunzendorf và S.typhisuis chủng Caoldagsen gây bệnh phĩ thương hàn cho heo, S.enteritidis chủng Dublin và Rostok gây bệnh phĩ thương hàn cho bị, bê, S.abortusovis gây bệnh sảy thai ở cừu, S.gallinarum – pullorum gây bệnh thương hàn cho gà (Nguyễn Như Thanh, 1997). 33
  46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.1.3. Nhĩm vi khuẩn Shigella spp. 2.1.3.1. Đặc điểm hình thái Shigella spp. thuộc họ Enterobacteriae (vi khuẩn đường ruột) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, dài với kích thước 0.5 – 0.6 x 1 – 3 µm, khơng sinh bào tử, khơng di động, thuộc nhĩm vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ nuơi cấy thích hợp là 37oC. Chúng cĩ thể sống nhiều ngày với điều kiện lý hố khắc nghiệt như trong tủ lạnh, đơng đá, trong mơi trường chứa 5% NaCl hay trong mơi trường cĩ pH 4,5. Shigella spp. nhạy với nhiệt và bị tiêu diệt khi khử trùng bằng phương pháp khử trùng Pasteur. Trong mơi trường lỏng: sau 18 – 24 giờ nuơi cấy vi khuẩn Shigella spp. làm đục đều mơi trường. Trên mơi trường đặc: sau 24 giờ nuơi cấy khuẩn lạc cĩ đường kính khoảng 1 mm, trịn, lồi, mặt nhẵn, rìa đều. Hình 1.14. Hình thái của vi khuẩn Shigella spp. (Reynolds, 2011) 2.1.3.2. Khả năng gây bệnh Nhiễm khuẩn Shigella spp. thường chỉ giới hạn ở đường tiêu hố. Chỉ cần số lượng nhỏ 10 – 100 vi khuẩn đủ gây bệnh. Sau khi xâm nhập, vi khuẩn tấn cơng lớp biểu mơ niêm mạc ruột già, tạo những áp xe nhỏ li ti rồi hoại tử, làm ung loét và xuất huyết. Triệu chứng chủ yếu là tiêu chảy phân nhầy máu, số lần đi tiêu 10 – 20 lần/ ngày và kèm theo đau bụng và sốt cao. Đa số sự hiện diện bạch cầu trong phân. Bệnh thường kéo dài dưới 7 ngày (Nguyễn Minh Hồng, 2013). 34
  47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Ngồi ra, Shigella spp. cịn gây các bệnh ở ngồi đường tiêu hố như viêm kết mạc, viêm âm đạo, viêm phổi, viêm khớp, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, theo Nguyễn Đức Hiền (2013). 2.1.4. Nhĩm vi khuẩn Listeria spp. 2.1.4.1. Đặc điểm hình thái Các lồi Listeria spp. là trực khuẩn Gram dương, cĩ kích thước ngắn (0,4 – 0,5 x 0,5 – 2,0 µm), chúng mọc trên các mơi trường nuơi cấy khơng acid, khơng sinh nha bào. Ở 20oC chúng di chuyển bằng lơng mọc xung quanh thân (peritrichous flagella), nhưng sự di động khơng quan sát được ở 37oC. Chúng là vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc và cĩ thể sinh trưởng trong một khoảng nhiệt độ dao động rộng từ 3 – 45oC (tối ưu là 30 – 36oC), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là rất chậm. Chúng cĩ thể mọc ở pH 9,6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở pH hơi kiềm hoặc mơi trường trung tính (Nguyễn Hữu Liêm, 2013). Hình 1.15. Hình thái vi khuẩn Listeria spp. 2.1.4.2. Khả năng gây bệnh Bệnh do Listeria spp. gây ra là bệnh hiếm gặp ở người với các triệu chứng rất nguy hiểm và cĩ tỷ lệ tử vong cao. Người nhiễm bệnh sẽ cĩ các dấu hiệu cận lâm sàng nhẹ như sốt, viêm dạ dày – ruột. Đồng thời L.monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mơ cấy ghép và cĩ hệ miễn dịch kém. Ở phụ nữ mang thai khi người mẹ bị nhiễm Listeria spp. thì cĩ triệu chứng rõ ràng hoặc cĩ những triệu chứng giống như bị cảm cúm nhưng bào thai và thai nhi sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng bao gồm sảy thai, chết non, viêm màng não ở trẻ sơ sinh hay nhiễm trùng. 35
  48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Listeria spp. gây bệnh cho động vật: bệnh do Listeria spp. tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với các dấu hiệu lâm sàng như viêm não, viêm màng não, nhiễm trùng máu, sảy thai, đẻ non. 2.1.5. Nhĩm vi khuẩn Vibrio spp. 2.1.5.1. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. cịn gọi là phẩy khuẩn, thuộc họ Vibrionaceae là nhĩm vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu khơng đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng khơng sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu. Tất cả những lồi vi khuẩn thuộc nhĩm Vibrio spp. đều là vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, phát triển trong mơi trường bổ sung muối (NaCl) và khơng sinh H2S. Hình 1.16. Hình thái vi khuẩn Vibrio (Microscopy, 2004) 2.1.5.2. Khả năng gây bệnh Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do Vibrio cholera gây ra. Biểu hiện lâm sàng của bệnh là nơn nhiều lần, dịch nơn lúc đầu là nước và thức ăn, về sau giống như dịch phân. Cơ thể bị sốt, sơi bụng hoặc đau bụng nhẹ, chuột rút, đi ngồi phân lỏng cĩ mùi tanh, dẫn đến cơ thể mất nước, điện giải, suy tim, suy kiệt và dẫn đến tử vong nếu khơng điều trị kịp thời. Ngồi ra, khi ta ăn phải thức ăn cĩ chứa độc tố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sẽ gây ra các biểu hiện lâm sàng như tiêu chảy nhiều lần trong ngày, đau bụng, buồn nơn và nơn (Hồng Ngân,2013). Một số loại vi khuẩn thuộc nhĩm Vibrio spp. đã được cơng bố là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở một số đối tượng thủy sản (Austin & Austin 1993). Một số bệnh ở thủy sản do Vibrio spp. gây ra như sau: bệnh phát sàng ở ấu trùng tơm, bệnh 36
  49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt xuất huyết lở loét ở một số cá biển, bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác và một số bệnh khác nhau: gây chết ở ấu trùng động vật thân mềm, gây bệnh đường ruột, bệnh hoại tử gan ở giáp xác (Đỗ Thị Hịa và ctv, 2004). 2.1.6. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Pseudomonas spp. 2.1.6.1. Đặc điểm hình thái Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Pseudomonas spp. là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc; cĩ hình thẳng, hai đầu trịn, dài 1 – 5 µm. Trực khuẩn ít khi cĩ vỏ, cĩ một tiêm mao đơn cực, di động, khơng sinh bào tử, tồn tại ở dạng đơn, bắt cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Trực khuẩn mọc dễ dàng trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC phát triển được ở nhiệt độ 5oC – 42oC. Trên mơi trường đặc, thường cĩ 2 loại khuẩn lạc, một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi. Hình 1.17. Hình thái vi khuẩn Pseudomonas spp. 2.1.6.2. Khả năng gây bệnh Pseudomonas spp. gây bệnh cho người: trực khuẩn Pseudomonas spp. gây bệnh cĩ điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc bị các vết bỏng, các vết thương hở, Tại chỗ, trực khuẩn gây viêm mủ (mủ cĩ màu xanh). Khi cĩ điều kiện thuận lợi, chúng gây bệnh tồn thân như nhiễm trùng hệ thống hơ hấp, nhiễm trùng máu hoặc 37
  50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt nhiễm trùng đường tiểu, viêm phế quản, viêm phổi, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm tủy xương Pseudomonas spp. gây bệnh thực nghiệm: súc vật cảm nhiễm là chuột lang, tiêm vào màng bụng chuột 0,1,- 0,5 ml canh khuẩn, khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần được hình thành những ổ mủ. 2.1.7. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Enterococcus spp. 2.1.7.1. Đặc điểm hình thái Enterococcus faecalis cĩ đầy đủ đặc tính của streptococcus, là vi khuẩn Gram dương thuộc nhĩm liên cầu khuẩn, cĩ đường kính < 2 µm. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 30 – 35oC. Enterococcus faecalis cĩ thể sống sĩt trên các bề mặt mơi trường, khơng chịu được sự thanh trùng, pH < 6,3, chất kháng sinh, chất sát trùng, khơng sinh độc tố (Dương Văn Sĩ, 2010). Hình 1.18. Hình thái vi khuẩn Enterococcus 2.1.7.2. Khả năng gây bệnh Vi khuẩn Enterococcus faecalis là vi khuẩn sống trong vi hệ bình thường của người, chúng là một trong những nguyên nhân gây ra các nhiễm trùng cơ hội trên cơ thể người khi cơ thể đang bị bệnh, hệ miễn dịch suy yếu hay do dùng kháng sinh lâu dài. Vi khuẩn Enterococcus faecalis thường gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu, gây nhiễm trùng vết thương (chủ yếu là phẫu thuật, vết loét và vết bỏng), và nhiễm khuẩn huyết. 38
  51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.1.8. Nhĩm vi khuẩn thuộc dịng Staphylococcus aureus. 2.1.8.1. Đặc điểm hình thái Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp.) cĩ hình cầu, đường kính 0,8 – 1 µm, đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho, cĩ thể đứng lẻ tẻ hoặc thành từng đơi hay thành từng chuỗi ngắn. Staphylococcus spp. là nhĩm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, khơng cĩ vỏ, khơng di động, khơng sinh bào tử và cĩ khả năng sinh độc tố. Chúng phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (nhiệt độ từ 10oC – 45oC). Hình 1.19. Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus. 2.1.8.2. Khả năng gây bệnh Tụ cầu khuẩn cĩ nhiều loại: cĩ loại gây bệnh, thường gặp nhất là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và cĩ loại bình thường sống trên da và niêm mạc, khơng gây bệnh. Staphylococcus aureus cư trú trên người và động vật, cĩ trong sữa bị bị bệnh, thịt heo tươi, trong đất là vi sinh vật gây bệnh cơ hội mạnh nhất. Vi khuẩn Staphylococcus spp. gây bệnh bằng cách bám dính vào da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) hay các tổ chức sâu hơn như tổ chức lympho, biểu mơ dạ dày ruột, bề mặc phế nang, tổ chức nội mơ. Ngồi ra Staphylococcus aureus cịn là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: Nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẫu, tác động lên hệ thần kinh trung ương. Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus spp) gây bệnh thực nghiệm: thỏ là động vật dễ cảm nhiễm nhất. Ngồi ra, cĩ thể dùng mèo non, chuột non để tìm độc tố ruột. 39
  52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.2. Sơ lược về vi khuẩn V.alginolyticus 2.2.1. Phân loại khoa học Giới Bacteria Ngành Proteobacteria Lớp Gamma proteobacteria Bộ Vibrinonales Họ Vibrinoceae Giống Vibrio Lồi Vibrio alginolyticus 2.2.2. Đặc điểm hình thái Vibrio alginolyticus là vi khuẩn Gram (-), hình que hơi uốn cong, kích thước 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6 µm, chúng khơng sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiêm mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Là lồi vi khuẩn kỵ khí, cĩ đặc điểm phản ứng dương tính với lysine, nitrate, lipid, gelatin, oxidase nhưng âm tính với ure, arginine và khơng phát sáng. Vibrio alginolyticus phát triển tốt trong mơi trường peptone 1% cĩ chứa 3, 6, 8, 10% NaCl, nhưng lại khơng phát triển ở 0% NaCl. Ngồi ra, vi khuẩn khơng sinh H2S và mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129 Theo mơ tả của Austin (2007) và của Viên Đại Phúc (2011) Vibrio alginolyticus cĩ đặc điểm đặc trưng là phát triển thành từng cụm trên bề mặt thạch rắn, trên mơi trường TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn cĩ màu vàng, bờ khơng đều, trên mơi trường TSA, khuẩn lạc cĩ màu trắng sữa, dễ mọc loang. Vibrio alginolyticus cĩ khả năng làm tan huyết, phân giải chitin, lipid, gelatin và tinh bột nhưng khơng phân giải aesculin. Vibrio alginolyticus lên men đường với glycerol, maltose, mannitol, mannose, salicin và sucrose nhưng khơng lên men đường với arabinose, inositol và lactose. Ultizur (1975) đã xác định Vibrio alginolyticus phát triển tốt nhất ở 370C. Yếu tố nhiệt độ, độ muối và nồng độ dinh dưỡng cĩ ảnh hưởng lớn đến tốc độ phát triển của vi khuẩn, trong đĩ nhiệt độ cĩ tác động lớn nhất. Ở 390C thời gian phát 40
  53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt triển giữa các thế hệ là 10-11 phút, cịn ở 210C thời gian là 60 phút. Cũng theo Ulitzur, sự phát triển của các lơng rung của roi và hoạt động bơi của vi khuẩn Vibrio alginolyticus phụ thuộc vào một mối quan hệ phức tạp giữa nhiệt độ, nồng độ muối và độ pH. 2.2.3. Đặc điểm phân bố Vibrio alginolyticus là một lồi vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng cĩ mặt ở hầu hết các mẫu thu từ nhiều đối tượng thủy sản khác nhau như cá, giáp xác, nhuyễn thể, rong biển Vibrio alginolyticus cĩ mặt trong mơi trường nước mặn ở vùng biển nhiệt đới ơn hịa và liên quan tới tỷ lệ chết cao trong hệ thống nuơi trồng thủy sản ở vùng biển Tunisian. Vi khuẩn này thường cĩ mặt ở những người thường ăn hải sản tươi sống hoặc chưa nấu chín dẫn đến viêm dạ dày ruột và bệnh đại tràng. Những bệnh này thường xuất hiện vào mùa hè, khi nhiệt độ nước tăng. Stephen đã phân lập Vibrio alginolyticus từ 9/12 loại hải sản ở vùng biển Ả Rập, với hầu hết các chủng cĩ nguồn gốc từ việc đánh bắt cá mịi tươi, cá thu, và cua. Vi khuẩn V.alginolyticus đã được biết là cùng mơi trường giống với vi khuẩn V.parahaemolyticus và thường được phân lập từ cùng một loại mẫu. Cả hai đều cĩ thể tồn tại ở mẫu hải sản bán phổ biến ở chợ tại Jakarta. Vi khuẩn V.alginolyticus xuất hiện với tần số cao hơn so với V.parahaemolyticus đã được báo cáo trong các mẫu nước biển và hải sản thu thập tại Na Uy, Hà Lan, và Nhật Bản. Sự phong phú tương đối của V.alginolyticus và V.parahaemolyticus trong nước biển nhiệt đới và các nguồn hải sản ít được nghiên cứu, nhưng một báo cáo gần đây cho thấy một tỷ lệ lớn các mẫu cá biển tươi sống thu được khuẩn lạc màu vàng hơn là khuẩn lạc xanh trên mơi trường thạch TCBS. Sakazaki đã đề xuất V.alginolyticus là một chỉ số so sánh cho bề mặt bị ơ nhiễm thứ cấp của hải sản và đồ dùng so với V.parahaemolyticus. Tuy nhiên, đề xuất này nên áp dụng đối với các vùng ở khu vực nhiệt đới, nơi 2 lồi vi khuẩn V.alginolyticus và V.parahaemolyticus phát triển phong phú. Theo Zhi, V.alginolyticus được phát hiện từ mẫu tơm ướp muối từ vụ ngộ độc thực phẩm, là tác nhân gây bệnh thơng qua điều tra dịch tễ và kiểm tra nguyên nhân gây bệnh. V.alginolyticus gây nhiễm trùng máu cho người và nhiễm vào vết thương 41
  54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt và nĩ được tìm thấy từ mẫu phân của người bị tiêu chảy chưa tìm được nguyên nhân gây bệnh. Từ các mẫu thức ăn dẫn đến ngộ độc thực phẩm. Vi khuẩn V.alginolyticus cũng liên quan đến dịch bệnh ở cá biển nuơi và tự nhiên cũng như dịch bệnh ở ấu trùng và con giống của nhuyễn thể và giáp xác trên thế giới. Dựa vào nghiên cứu của Hormansdorfer, V.alginolyticus được tìm thấy sự cĩ mặt của chúng trong nước biển, chất lắng cặn ở bề mặt đá san hơ. 2.2.4. Khả năng gây bệnh V.alginolyticus lần đầu tiên được xác định là một mầm bệnh của người vào năm 1973. Đơi khi nĩ gây ra nhiễm trùng mắt, tai và vết thương. V. alginolyticus là một lồi cĩ khả năng chịu mặn cao và cĩ thể phát triển trong nồng độ muối 10%. Hầu hết các chủng lâm sàng đều đến từ những vết thương bị nhiễm trùng bị nhiễm bẩn ở bãi biển. Tetracycline thường kết quả trong điều trị. V. alginolyticus là nguyên nhân hiếm gặp của nhiễm khuẩn huyết ở những người bị suy giảm miễn dịch. Theo nghiên cứu của Josenhans (2002) , nhiều vi khuẩn gây bệnh trên người, động vật và thực vật sử dụng roi để di chuyển. Đối với nhiều tác nhân gây bệnh, vận động là điều cần thiết trong một số giai đoạn của chu kỳ sống và độc tính cùng với sự vận động được điều khiển chặt chẽ bởi hệ thống gen. Theo Hưrmansdorfer (2000), Vibrio alginolyticus trong 13/45 mẫu thu từ nước biển và chất lắng cặn ở bề mặt đá san hơ. Tất cả các chủng này đều cĩ tính độc tạo ra sản phẩm men phân giải casein và lipid, 11/13 chủng phân giải tinh bột và gelatin, 7/13 chủng thể hiện tác dụng với lecithin và 2/13 chủng cĩ men phân giải hồng cầu. Cũng như các lồi vi khuẩn khác, khả năng tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính và các hoạt động thủy phân. Hoạt động thủy phân đã được xem là yếu tố độc tính bởi vì chúng cho phép vi khuẩn sống sĩt, sinh sản và xâm lấn các mơ vật chủ. Hoạt động phân giải protein của các sản phẩm ngoại bào cĩ tương quan với khả năng gây bệnh của nhiều lồi vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Hầu hết các chủng Vibrio alginolyticus phân lập đều cĩ sản phẩm của enzyme phân giải gelatin, lipid, ADN và casein, tất cả các yếu tố độc này cĩ thể giúp các sinh vật khác nhiễm vào và sinh sơi nảy nở. 42
  55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Theo nghiên cứu của Narjol (2006), Vibrio alginolyticus phân lập từ hầu ở Alaskan cĩ chứa gen trh (thermostable direct haemolysin-related haemolysin), tiết ra chất cĩ tác dụng làm tan hồng cầu, trước đây đã được báo cáo chỉ cĩ ở Vibrio parahaemolyticus (là yếu tố gây độc của vi khuẩn này), gen giống trh này đã được tách dịng và giải trình tự giống đến 98% so với gen trh2 Vibrio parahaemolyticus. Wang (2007) đã chứng minh rằng khả năng phân giải protein ngoại bào và các chất làm tan huyết cũng như sự lấy sắt của Vibrio alginolyticus. 43
  56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 2.1.1. Địa điểm Phịng thí nghiệm vi sinh, Phịng thí nghiệm Hĩa học, Khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thời gian: từ ngày 06/03/2017 đến 16/07/2017. 2.2. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu: Lá bàng (Terminalia catappa) thu hái tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long. 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 20 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh và Viện Nghiên cứu Nuơi Trồng Thủy sản II, bao gồm: - Nhĩm vi khuẩn Escherichia Coli: E. coli, ETEC, E. coli 0208, E. coli O157:H7. - Nhĩm vi khuẩn Shigella : S. sonnei, S. boydii, S. flexneri. - Nhĩm vi khuẩn Samonella spp : S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium, S. dublin. - Nhĩm vi khuẩn Vibrio : V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, V. cholerae. - Nhĩm vi khuẩn Listeria : L. monocytogenes, L. innocua. - Các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da : E. feacalis, S. aureus, P. aeruginosa. 2.3. Thiết bị, dụng cụ và hĩa chất 2.3.1. Dụng cụ - Erlen 1000ml. - Micropipette loại 10-100µl, 100- - Phễu . 1000µl. - Cốc thủy tinh 1000ml, 250ml, - Đầu tipe loại 100 µl, 1000µl. 100ml, 50ml. - Pipette thủy tinh 1 ml, 10 ml. - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml. - Pipette Pasteur. - Ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml. - Ống nghiệm lớn, nhỏ. - Ependoff 2 ml. - Đèn cồn. - Bình mơi trường 250 ml, 500ml. - Que cấy trang. 44
  57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt - Dụng cụ đục lỗ (d = 6 mm). - Bơng thấm và bơng khơng thấm - Thước đo. nước. - Giá ống nghiệm. - Các loại dụng cụ khác như: bao - Eppendorf. chịu nhiệt, kéo, giấy gĩi, kẹp gấp, - Đũa thủy tinh. muỗng, dao, thun, parafirm, giấy - Bình tia. lọc - Đĩa petri. 2.3.2. Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Tủ ấm 300C, 370c (Memmert - Bếp từ (Billy – England) merman) - Máy nước cất (Branstead USA) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Máy lắc - Máy cơ cách thủy. - Máy lọc chân khơng - Máy đo UV – VIS (Hach) - Máy xay mẫu 2.3.3. Hĩa chất, dung mơi - Mơi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Mơi trường TSA (Trypton Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). - Ciprofloxacin 500mg (Việt Nam) - H2SO4 đậm đặc, H2SO4 lỗng, HCl đậm đặc, chloroform. - Na nitro prusside, pyridine, ninhydrin, ammonia, gelatin 1%, glycerol. - Acid acetic glacial, acetic anhydrine, benzene, bột Magnesium. - NaOH 10%, Ferric chloride (FeCl3) 10%, lead acetate (Pb(C2H3O2)) 10%. - Thuốc thử: Molisch, Fehling A, Fehling B, Barfoed, Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner. - Ethanol 70% (Việt Nam). - Nước cất. - Dimethylsulfoxid (DMSO) (Trung Quốc). - NaCl - Agar 45
  58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý nguồn mẫu Mẫu thực vật được thu một lượng lớn tồn bộ các bộ phận thân, lá và cành mang đi rửa sạch và sấy khơ ở nhiệt độ 400C đạt khối lượng khơng đổi. Mẫu lá khơ được tiến cắt nhỏ và xay nhuyễn thành dạng bột. Lượng bột mẫu thu được sẽ được đĩng gĩi trong túi nhựa và bảo quản ở - 4oC để tách chiết cao sử dụng trong các thí nghiệm. 2.4.2. Phương pháp thu nhận cao thực vật và xác định hiệu suất thu hồi. 2.4.2.1. Phương pháp thu nhận cao thực vật Mẫu thực vật được tách chiết bởi nhiều loại dung mơi khác nhau bằng phương pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ thường và thu nhận cao chiết bằng cách cho bay hơi, loại bỏ lượng dung mơi của dịch chiết bằng các thiết bị cơ thích hợp. Nguyên tắc: sử dụng phương pháp chiết ngâm, mẫu thực vật được ngâm trong lượng lớn dung mơi (w/v) ở khoảng thời gian nhất định để các chất tan trong mẫu hịa tan vào dung mơi. Cách tiến hành: ngâm một lượng mẫu vào một lượng dung mơi (tỷ lệ 1:20 (w/v)) trong một bình kín để ở nhiệt độ phịng. Mẫu được ngâm trong khoảng 24h; thỉnh thoảng cĩ khấy trộn hoặc lắc sau đĩ đem đi lọc hoặc ly tâm, ép bã thu dịch chiết. tiếp tục cho thêm lượng dung mơi mới vào phần bã bột thực vật và chiết thêm một số lần nữa cho đến khi dịch lọc cĩ màu trong suốt. Phần dịch chiết được cơ đặc, thu hồi cao bằng phương pháp cơ quay chân khơng ở 400C (đối với dung mơi methanol) và cơ cách thủy ở 700C (đối với dung mơi ethanol, nước). Các cao chiết được bảo quản ở nhiệt độ - 40C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.2.2. Xác định hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi cao được tính theo cơng thức sau: 1 − 2 = × 100(%) 46
  59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Trong đĩ H: hiệu suất cao thu được (%) m1: khối lượng cốc thủy tinh cĩ chứa bột cao (g) m2: khối lượng cốc thủy tinh ban đầu (g) m: khối lượng mẫu bột ban đầu dùng để ngâm với dung mơi (g) Sau khi xác định hiệu suất thu hồi các loại cao thu hồi được bảo quản ở nhiệt độ 40C trong tủ lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi nghiệm thức trong thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.4.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh 2.4.3.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên mơi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đĩ các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 - 50C) để bảo quản. Qúa trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luơn được chuyển đến mơi trường mới trước khi già và chết. Tùy từng nhĩm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy truyền khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyền một lần. Cách tiến hành: Giống vi sinh thuần khiết, được bảo quản trong ống thạch nghiêng và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Sau 1 - 3 tháng phải cấy truyền vi sinh vật qua ống thạch nghiêng mới bằng cách dùng que cấy vịng lấy sinh khối vi sinh vật trong ống thạch nghiêng cũ ria vào ống thạch nghiêng mới, sau đĩ đem ống thạch nghiêng mới đi ủ, tùy từng loại vi sinh vật mà quyết định nhiệt độ ủ, nhiệt độ ủ giao động từ 48 - 72 giờ. Ống thạch nghiêng chứa vi sinh vật sau khi ủ xong được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.4.3.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngồi phương pháp giữ giống trên mơi trường thạch nghiêng, cĩ thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào cĩ thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước 47
  60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt trong tế bào. Để khác phục nhược điểm này người ta bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn cĩ chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40% cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.4.4. Phương pháp tăng sinh, xác đinh mật độ tế bào vi sinh vật chỉ thị Nhằm hoạt hĩa các vi khuẩn được giữ giống phát triển lại bình thường vì chúng cĩ thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuơi cấy vi sinh vật trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp. Mơi trường dinh dưỡng khơng những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà cịn phải đảm bảo cĩ đủ các điều kiện hĩa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và mơi trường. Cách tiến hành: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên mơi trường TSA hay trong glycerol 40%, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10ml mơi trường TSB trong điều kiện vơ trùng. Sau đĩ tiến hành lắc với tốc độ 150 vịng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục mơi trường nuơi cấy (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013). Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đĩ mật độ quang OD ở bước sĩng 600nm. Cơng thức tính tốn xác định mật độ tế bào (cơng thức McFahrland) 9 Mật độ = OD600 nm x 1,02 x 10 (cfu/ml) 2.4.5. Phương pháp pha lỗng mẫu Nguyên tắc: Pha lỗng mẫu là một trong những cơng đoạn cơ bản nhưng cĩ vai trị quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha lỗng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha lỗng mẫu (mẫu lỗng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong 48
  61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Cách tiến hành: Dùng micropipeptte hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng, khi đĩ ta sẽ được nồng độ pha lỗng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha lỗng ta được nồng độ pha lỗng là 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phương pháp pha lỗng mẫu 2.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) dựa trên phương pháp của Anonymous (1996) và Hadacek và ctv (2000) cĩ sự điều chỉnh phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm. Nguyên tắc: Dịch cao chiết ở các giếng sẽ khuếch tán vào mơi trường thạch và tác động lên các chủng vi khuẩn chỉ thị. Nếu cao chiết cĩ khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thì sẽ xuất hiện quầng trong bao quanh các giếng thạch (vịng ức chế). Từ đĩ, đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết bằng cách đo đường kính vịng ức chế (mm). 49
  62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Cách tiến hành Các chủng vi khuẩn được hoạt hĩa từ giống gốc trong mơi trường lỏng TSB, lắc qua đêm. Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hĩa ở mật độ 106 cfu/ml lên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng đường kính d = 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 – 3 cm. Chuẩn bị dịch cao chiết bằng cách hịa tan lượng cao chiết trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 1% theo nồng độ yêu cầu 100 mg/ml. Bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ để dịch cao được khuếch tán đều vào mơi trường thạch. Sau đĩ ủ các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả bằng cách đo giá trị đường kính vịng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đối chứng là kháng sinh Ciprofloxacin (500 µg/ml). 2.4.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Nguyên tắc: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết cĩ số lượng vi sinh vật bị kháng cao nhất. Nhằm mục đích xác định nồng độ ức chế nhỏ nhất của cao chiết đối với các vi sinh vật bị kháng. Sử dụng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method) ở các nồng độ khác nhau. Cách tiến hành: Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hĩa ở mật độ 106 cfu/ml trên đĩa TSA và tiến hành trang đều vi khuẩn lên đĩa. Đục lỗ để tạo giếng cĩ đường kính 6 mm trên đĩa TSA. Cao chiết được pha lỗng trong DMSO 1% với nồng độ gốc là 200 mg/ml. Từ nồng độ gốc pha lỗng theo cấp số 2 thành nhiều dãy nồng độ thấp hơn cụ thể như sau: 150 mg/ml, 100mg/ml, 50 mg/ml. Sau khi cĩ dịch cao chiết ở nhiều nồng độ, tiến hành bổ sung 100 µl dịch cao chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ để dịch cao được khuếch tán đều vào mơi trường thạch. Sau đĩ, ủ các đĩa vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả bằng cách đo giá trị đường kính vịng ức chế (mm) trên đĩa thạch. Mỗi nồng độ cao thí nghiệm được lặp lại ba lần. 50
  63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.4.8. Phương pháp xác định thành phần hĩa học của cao chiết Nguyên tắc: Định tính các nhĩm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết bằng các phản ứng hĩa học theo các phương pháp thơng dụng trong phịng thí nghiệm đã được chuẩn hĩa để sơ bộ hĩa thành phần hoạt chất (Lương Văn Tiến và ctv, 2015). Cách tiến hành: cao chiết được ngâm trong dung mơi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đĩ dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hĩa học với các lọai hĩa chất, thuốc thử đặc trưng. 2.4.8.1. Định tính carbohydrate Thử nghiệm Molisch: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đĩ cho 2 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ tư từ 2 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi cĩ hình thành phức hợp màu đỏ - tím. Thử nghiệm Fehling: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi cĩ xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O. Thử nghiệm Barfoed: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Brafoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm lạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch (Yadav và ctv, 2013). 2.4.8.2. Định tính saponin Thử nghiệm tạo bọt: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đĩ thêm 2 ml nước cất vào lắc mạnh. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện bọt và ổn định (Abba và ctv, 2009). 2.4.8.3. Định tính alkaloid Thử nghiệm Mayer: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng được tạo thành. Thử nghiệm Dragendorff: hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam. 51
  64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Thử nghiệm Hager: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng. Thử nghiệm Wagner: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wargner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ (Yadav và ctv, 2013). 2.4.8.4. Định tính cardiac glycoside Thử nghiệm Legal: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine hoặc 1 ml Na nitro prusside, sau đĩ bổ sung 5 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm. Thử nghiệm Keller Kiliani: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic (Yadav và ctv, 2013). 2.4.8.5. Định tính anthraquinone glycoside Thử nghiệm Bontrager: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch H2SO4 lỗng và đun sơi, sau đĩ tiến hành lọc nĩng và để nguội dịch lọc, bổ sung thêm 3 ml benzene lắc đều rồi để yên, tách lấy lớp benzene cho vào ống nghiệm khác, tiếp tục thêm 2 ml ammonia và quan sát màu trong lớp ammonia. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu hồng hoặc đỏ (Abba và ctv, 2009). 2.4.8.6. Định tính flavonoid Thử nghiệm alkaline: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào 5 giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl lỗng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Cĩ thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất. Thử nghiệm Shinoda: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho một ít bột Magnesium vào, cho từ từ 1 ml HCl đậm đặc vào sát thành ống nghiệm. Sau đĩ 52
  65. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt thêm 5 ml ethanol 95% và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi mẫu cĩ xuất hiện cam, hồng, đỏ đến tím, Thử nghiệm Ferric chloride: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đĩ cho thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím (Mamta và ctv, 2012). 2.4.8.7. Định tính các hợp chất phenol Thử nghiệm lead acetate: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 3 ml lead acetate 10% sau đĩ đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trong ống nghiệm. Thử nghiệm Gelatin: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng. (Mamta và ctv, 2012). 2.4.8.8. Định tính tannin Thử nghiệm Ferric chloride: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen (Abba và ctv, 2009). Thử nghiệm Lead acetate: hút 2 ml dung dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử lead acetate 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng (Mamta và ctv, 2012). 2.4.8.9. Định tính steroid Thử nghiệm Salkowski: hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid. Thử nghiệm Libermann Burchard: hút 2 ml dung dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, sau đĩ nhỏ từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: xuất hiện 53
  66. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt vịng màu nâu ở mặt phân cách và lớp trên cĩ màu xanh lá là sterol. Hình thành màu đỏ đậm là triterpenoid (mamta và ctv, 2012). 2.4.8.10. Định tính amino acid Thử nghiệm Ninhydrin: hút 1 ml dung dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đĩ cho một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sơi 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím (Yadav và ctv, 2013) 2.4.9. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm SAS version 9.4 với trắc nghiệm Tukey. Dữ liệu phân tích theo phương sai One-way ANOVA (P<0,05) cĩ ý nghĩa thống kê. 2.5. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của lá bàng được trình bày ở Hình 2.2. 54
  67. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt Mẫu lá bàng Xử lý mẫu Ngâm dung mơi ethanol 70% Lọc Cơ mẫu Cao chiết lá bàng Xác định sự Khảo sát ảnh Khảo sát hoạt hiện diện một số hưởng của cao tính kháng thành phần chiết lá bàng đến khuẩn của cao hĩa học của cao vi khuẩn V.alginolyticus Xác định chỉ số MIC củ a cao chiết ethanol 70% Đánh giá kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 55
  68. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.5.1. Thí nghiệm 1: Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết từ lá bàng đối với dung mơi ethanol 70%. 2.5.1.1. Quy trình thực nghiệm Mẫu lá bàng Xứ lý mẫu: phơi khơ, xay nhuyễn Ngâm với dung mơi (1:20 (w/v)) ethanol 70% Lọc tinh Bã Dịch lọc Cơ cách thủy 700C Cao chiết Bảo quản ở - 40C Hình 2.3. Quy trình tách chiết và thu hồi cao từ lá bàng. 2.5.1.2. Thuyết minh quy trình Lá bàng sau khi được thu nhận lá được rửa sạch và sấy ở 400C. Sau khi khơ, tiến hành đem xay nhỏ thành dạng bột. Tiến hành ngâm mẫu với các dung mơi ethanol 70% theo tỷ lệ 1:20 (w/v) trong 24 giờ. Sau đĩ, tiến hành lọc chân khơng mẫu thu nhận dịch chiết, phần bã tiếp tục 56
  69. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt được ngâm, lọc với lượng dung mơi như lần đầu cho đến khi dịch chiết cĩ màu nhạt dần. Thu tất cả dịch lọc, sau đĩ tiến hành loại bỏ dung mơi bằng phương pháp cơ cách thủy ở 70oC để thu nhận cao chiết (TcEE). Bảo quản cao chiết ở nhiệt độ - 40C. Xác định hiệu suất thu hồi cao chiết theo 3.4.2.2. 2.5.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của dung mơi tách chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết. 2.5.2.1. Quy trình thí nghiệm Vi sinh vật chỉ thị Mơi trường TSA Tăng sinh trong mơi trường TSB Hấp tiệt trùng 121oC – 1atm Lắc nhiệt độ phịng trong 15 phút (18 – 24 giờ) Đo OD600nm Đổ đĩa Hút 100 µl dịch vi khuẩn Cao chiết Cấy trang Pha lỗng về 106 cfu/ml DMSO 1% Đục lỗ (d=6mm) Nhỏ dịch Nồng độ 100 mg/ml Ủ 37oC/24 giờ Đo đường kính vịng kháng khuẩn Hình 2.4. Quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của TcEE 57
  70. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.5.2.2. Thuyết minh quy trình Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết lá bàng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml mơi trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. Cĩ bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vịng/phút từ 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Dịch nuơi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở bước sĩng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha lỗng bằng các ống nước muối sinh lí vơ trùng để đạt mật độ tế bào vi khuẩn 106 cfu/ml. Hút 100 µl dịch vi khuẩn đã được pha lỗng cho lên trung tâm đĩa thạch TSA đã chuẩn bị sẵn (riêng các chủng Vibrio spp. Mơi trường TSA cĩ bổ sung 1,5% NaCl). Tiến hành trang khơ, đều dịch vi khuẩn khắp bề mặt đĩa thạch trong điều kiện vơ trùng. Dùng ống trụ kim loại khử trùng cĩ đường kính d = 6 mm, đục các giếng trên bề mặt đĩa thạch sau khi trang. TcEE được hịa tan bằng DMSO 1% ở nồng độ 100mg/ml. Hút vào mỗi giếng 100 µl dịch cao hoặc chất kháng sinh (đối với mẫu đối chứng). Sau đĩ, các đĩa petri được để yên ở nhiệt độ phịng 2 giờ để dịch cao chiết từ các giếng khuếch tán vào mơi trường nuơi cấy vi khuẩn, sau đĩ ủ ở 37oC trong thời gian 18 – 24 giờ và đọc kết quả bằng cách đo đường kính vịng ức chế, Mẫu đối chứng là ciprofloxacin 8 µg/ml với chủng Vibrio spp. Và 500 µg/ml với các chủng cịn lại. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 2.5.3. Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của TcEE đối với chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết thúc thí nghiệm 2 TcEE cĩ hoạt tính kháng khuẩn cao. Vì vậy, mẫu cao chiết này sẽ được sử dụng để xác định chỉ số MIC đối với các chủng vi khuẩn đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion method). 58
  71. Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt 2.5.3.1. Quy trình thí nghiệm Vi sinh vật chỉ thị Mơi trường TSA Tăng sinh trong mơi trường TSB Hấp tiệt trùng o Lắc nhiệt độ phịng 121 C – 1atm trong 15 phút (18 – 24 giờ) Đổ đĩa Đo OD600nm Hút 100µl dịch vi khuẩn Cao chiết Pha lỗng về 106 cfu/ml Cấy trang DMSO 1% Đục lỗ (d=6mm) Cao ở các nồng độ 50-100-150 mg/ml Ủ 37oC/24 giờ Đo đường kính vịng kháng khuẩn Hình 2.5. Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết. 2.5.3.2. Thuyết minh quy trình Các chủng vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml mơi trường TSB (riêng với các chủng Vibrio spp. Cĩ bổ sung thêm 1,5% NaCl), để lắc với tốc độ 120 vịng/phút từ 18 – 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Dịch nuơi cấy vi khuẩn sau khi lắc được đo OD ở bước sĩng 600 nm để xác định mật độ tế bào và pha 59