Đồ án Bước đầu phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải

pdf 59 trang thiennha21 12/04/2022 100
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_buoc_dau_phan_lap_tuyen_chon_mot_so_chung_vi_khuan_xu.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN XỬ LÝ NITRATE TRONG NƯỚC THẢI Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS.Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thanh Nam MSSV: 107111096 Lớp:07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2011
  2. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vấn đề ô nhiễm môi trường đã và đang là vấn đề nóng mà xã hội đang quan tâm, không giới hạn ở phạm vi khu vực một quốc gia nào mà là vấn đề toàn cầu. Nền công nghiệp hiện đại đã mang lại nhiều lợi ích thiết thực không thể phủ nhận. Thế nhưng đằng sau những lợi ích đó con người đang dần làm hủy hoại môi trường sống của mình như:Vấn đề ấm lên toàn cầu, ô nhiễm nguồn nước, ô nhiễm không khí, ô nhiễm đất nhưng trên hết là vấn đề ô nhiễm nguồn nước kể cả nguồn nước ngầm có nguy cơ đe dọa sự sống còn của chúng ta. Trong rất nhiều tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước thì nitrate là tác nhân gây ô nhiễm phổ biến hơn cả trong hoạt động công nghiệp lẫn nông nghiệp. Ô nhiễm nitrate ảnh hưởng trực tiếp đến sự tồn tại của các sinh vật thủy sinh và sức khỏe con người. Hiện nay có khá nhiều phương pháp để xử lý nitrate trong nước thải như thẩm thấu ngược, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học nhưng trong tất cả các phương pháp thì phương pháp sinh học mang lại hiệu quả nhiều hơn thông qua việc sữ dụng các vi sinhh vật để xử lý chúng. Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả làm giảm lượng nitrate trong nước thải thì việc phân lập và chọn lọc các chủng vi sinh vật có khả năng khử nitrate mạnh trong nước là điều cần thiết. Các vi sinh vật khử nitrate phân bố rất nhiều trong đất, bùn và trong nước, chúng bao gồm vi khuẩn, vi khuẩn cổ và nấm. Gần đây, khả năng khử nitrate có thể có ở khoảng 150 loài thuộc 50 họ. Trong số các loài này, Pseodomonas, Neisseria, Bacillus là những vi khuẩn khử nitrate phồ biến nhất và quá trình khử nitrate của chúng có thể 1
  3. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt thực hiện ở điều kiện kỵ khí và bán kỵ khí. Tuy nhiên, Alcaligenes faecalis và Paracoccus denitrificans được chứng minh là có khả năng thực hiện sự khử nitrate bằng cách sử dụng đồng thời nitrate và oxy như chất nhận điện tử. Vì vậy, việc tìm ra chủng có hoạt tính khử nitrate mạnh, thích ứng điều kiện xử lý khác nhau nhằm xử lý thích hợp cho từng loại nước thải khác nhau là việc làm hết sức cần thiết. Với ý nghĩa khoa học và thực tiển nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn xử lý nitrate trong nước thải”, đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Vi sinh Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 1.2 Mục đích Tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính khử nitrate mạnh từ nước thải nhà máy giấy nhằm ứng dụng xử lý nitrate trong nước thải công nghiệp. 1.3 Nội dung - Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate. -Thử nghiệm khả năng xử lý nitrate của các chủng này trong phòng thí nghiệm. 1.4 Phạm vi nghiên cứu Những nghiên cứu hiện thời đang ở giai đoạn đầu sàng lọc tuyển chọn các chủng có hoạt tính khử nitrate và đánh giá hiệu quả làm giảm nitrate được thực hiện ở phạm vi phòng thí nghiệm. 2
  4. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về nước thải và nitrate trong nước thải 2.1.1 Đôi nét về nước thải Trên toàn cầu, nước là một tài nguyên vô cùng phong phú nhưng nước chỉ hữu dụng với con người khi nó ở đúng nơi, đúng chỗ, đúng dạng và đạt chất lượng theo yêu cầu. Hơn 99% trữ lượng nước trên thế giới nằm ở dạng không hữu dụng đối với đa số các mục đích của con người do độ mặn (nước biển), địa điểm, dạng (băng hà). 2.1.1.1. Phân bố và dạng của nước trên trái đất Bảng 2.1.Bảng phân bố và dạng của nước trên Trái đất % Tổng Diện tích Tổng thể tích Địa điểm lượng (km2) nước (km3) nước Các đại dương và biển (nước mặn) 361.000.000 1.230.000.000 97.2000 Khí quyển (hơi nước) 510.000.000 12.700 0,0010 Sông, rạch 1.200 0,0001 Nước ngầm (đến độ sâu 0,8 km) 130.000.000 4.000.000 0,3100 Hồ nước ngọt 855.000 123.000 0,0090 Tảng băng và băng hà 28.200.000 28.600.000 2.1500 3
  5. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Con người khai thác các nguồn nước tự nhiên để cung cấp nước cho các nhu cầu sinh hoạt và sản xuất. Sau khi sử dụng nước bị nhiễm bẩn do chứa nhiều vi trùng và các chất thải khác. Nếu không được xử lý trước khi thải vào các nguồn nước công cộng, chúng sẽ làm ô nhiễm môi trường. Vì vậy, nước thải trước khi thải vào sông, hồ nguồn nước) cần phải được xử lý thích đáng. Mức độ xử lý phụ thuộc vào nồng độ bẩn của nước thải, khả năng pha loãng giữa nước thải với nước nguồn và các yêu cầu về mặt vệ sinh, khả năng "tự làm sạch của nguồn nước". Theo các quy định về bảo vệ môi trường của Việt Nam, ô nhiễm nước là việc đưa vào các nguồn nước các tác nhân lý, hóa, sinh học và nhiệt không đặc trưng về thành phần hoặc hàm lượng đối với môi trường ban đầu đến mức có khả năng gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển bình thường của một loại sinh vật nào đó hoặc thay đổi tính chất trong lành của môi trường ban đầu. Theo một định nghĩa khác "Ô nhiễm nước mặt diễn ra khi đưa quá nhiều các tạp chất, các chất không mong đợi, các tác nhân gây nguy hại vào các nguồn nước, vượt khỏi khả năng tự làm sạch của các nguồn nước này" 4
  6. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Bảng 2.2. Các đặc điểm lý học, hóa học và sinh học của nước thải và nguồn sinh ra nó (Wastewater Engineering: treatment, reuse, disposal, 1991) Đặc điểm Nguồn Lý học Màu Nước thải sinh hoạt hay công nghiệp, thường do sự phân hủy của các chất thải hữu cơ. Mùi Nước thải công nghiệp, sự phân hủy của nước thải Chất rắn Nước cấp, nước thải sinh hoạt và công nghiệp, xói mòn đất. Nhiệt Nước thải sinh hoạt, công nghiệp Hóa học Carbohydrate Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp Dầu, mỡ Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp Thuốc trừ sâu Nước thải nông nghiệp Phenols Nước thải công nghiệp 5
  7. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Protein Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp Chất hữu cơ bay Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp hơi Các chất nguy Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp hiểm Các chất khác Do sự phân hủy của các chất hữu cơ trong nước thải trong tự nhiên Tính kiềm Chất thải sinh hoạt, nước cấp, nước ngầm Chlorides Nước cấp, nước ngầm Kim loại nặng Nước thải công nghiệp Nitrogen Nước thải sinh hoạt, công nghiệp pH Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp Phosphorus Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp, rửa trôi Sulfur Nước thải sinh hoạt, thương mại, công nghiệp, nước cấp 6
  8. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hydrogen sulfide Sự phân hủy của nước thải sinh hoạt Methane Sự phân hủy của nước thải sinh hoạt Oxygen Nước cấp, sự trao đổi qua bề mặt tiếp xúc không khí - nước Sinh học Động vật Các dòng chảy hở và hệ thống xử lý Thực vật Các dòng chảy hở và hệ thống xử lý Eubacteria Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý Archaebacteria Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý Virus Nước thải sinh hoạt, hệ thống xử lý 7
  9. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.1.3 Những chất gây ô nhiễm cần chú trọng và nguyên nhân Bảng 2.3.Các chất ô nhiễm quan trọng cần chú trọng đến trong quá trình xử lý nước thải (Wastewater Engineering: Treatment, Diposal, Reuse, 1989) Chất gây ô nhiễm Nguyên nhân được xem là quan trọng Các chất rắn lơ Tạo nên bùn lắng và môi trường yếm khí khi nước thải lửng chưa xử lý được thải vào môi trường. Biểu thị bằng đơn vị mg/L. Các chất hữu cơ có Bao gồm chủ yếu là carbohydrate, protein và chất béo. thể phân hủy bằng Thường được đo bằng chỉ tiêu BOD và COD. Nếu thải con đường sinh học thẳng vào nguồn nước, quá trình phân hủy sinh học sẽ làm suy kiệt oxy hòa tan của nguồn nước. Các mầm bệnh Các bệnh truyền nhiễm có thể lây nhiễm từ các vi sinh vật gây bệnh trong nước thải. Thông số quản lý là MPN (Most Probable Number). Các dưỡng chất N và P cần thiết cho sự phát triển của các sinh vật. Khi được thải vào nguồn nước nó có thể làm gia tăng sự phát triển của các loài không mong đợi. Khi thải ra với số lượng lớn trên mặt đất nó có thể gây ô nhiễm nước ngầm. 8
  10. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Các chất ô nhiễm Các hợp chất hữu cơ hay vô cơ có khả năng gây ung nguy hại thư, biến dị, thai dị dạng hoặc gây độc cấp tính. Các chất hữu cơ Không thể xử lý được bằng các biện pháp thông khó phân hủy thường. Ví dụ các nông dược, phenols Kim loại nặng Có trong nước thải thương mại và công nghiệp và cần loại bỏ khi tái sử dụng nước thải. Một số ion kim loại ức chế các quá trình xử lý sinh học Chất vô cơ hòa tan Hạn chế việc sử dụng nước cho các mục đích nông nghiệp, công nghiệp Nhiệt năng Làm giảm khả năng bão hòa oxy trong nước và thúc đẩy sự phát triển của thủy sinh vật Ion hydrogen Có khả năng gây nguy hại cho thủy sinh vật 9
  11. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.2 Giới thiệu về nitrate trong nước thải Cấu tạo hóa học: - Nitrate là muối của acid nitrite. Trong muối nitrat, ion NO3 có cấu tạo hình tam giác đều với góc ONO bằng 120 độ và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 Angtron. Hình 2.1: Cấu tạo hóa học nitrate - Đặc điểm về muối nitrate: Ion NO3 không có màu nên các muối nitrat của những cation không màu đều không có màu. Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan trong nước. Một vài muối hút ẩm trong không khí như NaNO3 và NH4NO3. Muối nitrate của những kim loại hóa trị hai và hóa trị ba thường ở dạng hydrat. Muối nitrate khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt ( chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380 - 500 độ C). Còn các nitrate của kim loại khác dễ phân hủy khi đun nóng. Độ bền nhiệt của muối nitrate phụ thuộc vào bản chất cation kim loại. Nitrate có mặt trong môi trường qua các hoạt động cộng nghiệp, nông nghiệp chính vì lẽ đó chúng cũng có mặt trong nước.Trong nông nghiệp: Nitrate đi vào nguồn nước qua việc bón phân, phân bón gốc nitrate sử dụng phổ biến nhất là NaNO3 và NH4NO3. Sau khi bón phân, thực vật lấy đi một phần lượng nitơ được bón vào, cụ thể là 25-30%. Dư lượng còn lại di vào trong nước ngầm và nước mặt do các hợp chất nitrate thường có thể tan trong nước. 10
  12. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.3 Nguồn gốc hình thành nitrate Quá trình hình thành nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần hoàn của nitơ trong tự nhiên. Nitrate hình thành qua quá trình nitrate hóa Hình 2.2: Chu trình nitơ (Nguồn Quá trình nitrate hóa là quá trình oxy hóa sinh hóa nitơ của các muối amon đầu tiên thành nitrite và sau đó thành nitrate trong điều kiện thích ứng (có oxy và nhiệt độ trên 4oC) nhờ hoạt động của các vi sinh vật. Khi bón các phân N hữu cơ như phân bánh dầu, phân cá, bèo hoa dâu chúng ta cung cấp cho đất lượng protein khá cao. Các chất này sẽ bị khoáng hóa nhanh chóng và phóng thích NH4+. 11
  13. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Phân hóa học chứa N hữu cơ như urea, khi bón vào đất cũng cần có vi sinh vật phân giải thành ammonium mới được cây sử dụng. Do vi sinh vật tiết ra phân hóa tố urease để thủy phân urea, để sau cùng cho ra NH3 theo phản ứng: CO(NH2)2 + H2O (NH4)2CO2 2NH3 + CO2 Vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa gồm có 2 nhóm , trong đó có 7 nhóm vi khuẩn tự dưỡng: Vi khuẩn nitrite: oxy hóa amoniac thành nitrite hoàn thành giai đoạn thứ nhất. Vi khuẩn nitrate: oxy hóa nitrite thành nitrate, hoàn thành giai đoạn thứ hai. + Nhóm vi khuẩn ôxít hoá NH4 thành NO2: Nhóm này do 5 chi vi khuẩn đảm nhiệm:  Vi khuẩn hình (que) bầu dục: Nitrosomonas  Vi khuẩn hình cầu: Nitrosococcus  Vi khuẩn xoắn: Nitrosospira  Vi khuẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa và có nang : Nitrosococystis  Vi khẩn có khuẩn lạc nhầy nhụa, không có nang: Nitrosogcola + Nhóm vi khuẩn ôxít hoá nitrite thành nitrate  Vi khuẩn không có zoogloea: Nitrobacter  Vi khuẩn có zoogloea: Nitrocystis Trong bảy chi vi khuẩn trên đây, Nitrosomonas và Nitrobacter là thường gặp nhất. Ngoài các vi khuẩn trên, các vi sinh vật dị dưỡng như Streptomyces, Pseudomonas, 12
  14. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Aspergillus cũng có tham gia quá trình chuyển hóa N này nhưng không quan trọng lắm. Các phản ứng được biểu diễn qua các phương trình sau: Nitrosomonas 2NH3 + 3O2 2HNO2 + 2H2O Nitrobacter 2HNO2 + O2 2HNO3 Hoặc (NH4)2CO3 + 3O2 = 2HNO2 + CO2 + 3H2O 2HNO2 + O2 = 2 HNO3 Nếu cây cối không kịp hấp thụ hết lượng nitrate này thì nước mưa và nước tưới sẽ làm cho nó ngấm vào lòng đất, làm ô nhiễm nguồn nước ngầm. Tuy nhiên con người lại chính là thủ phạm tạo ra nguồn ô nhiễm nitrate lớn nhất thông qua các hoạt động nông nghiệp như:  Sử dụng phân bón hóa học hoặc hữu cơ  Chăn nuôi  Thải nước và rác không qua xử lý  Hệ thống bể phốt 13
  15. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.4 Quá trình phản nitrate (Denitrification) Con đường chuyển hoá của nitrate qua các quá trình đồng hoá - dị hoá để trở về các dạng như N2, NO, N2O được gọi là quá trình phản nitrate. Trong quá trình khử nitrate thì nitrate bị khử thành nitrite, oxit nitơ, amoniac, hoặc nitơ nguyên tố. Thông thường nhất , các nitrate được chuyển đổi thành các phần tử nitơ tinh khiết. Quá trình khử sinh học của nitrate đến khí nitơ (N2) thực hiện bởi những vi khuẩn dị dưỡng tùy ý. Những vi khuẩn này cần nguồn cacbon như là nguồn thức ăn, chúng có thể sử dụng nguồn oxy hòa tan trong nước hoặc lấy từ nitrate. Những đại diện của vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình này là Pseudomonas, Stenotrophomonas, Escherichia. Phần lớn những vi khuẩn khử nitrate chỉ khử nitrate đến nitrite, các loài khác lại khử nitrite đến amoniac. Vi khuẩn khử nitrate phần lớn là những vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, chúng sử dụng oxy hòa tan hoặc nitrate như là nguồn oxi cho quá trình trao đổi chất và oxy hóa các chất hữu cơ.Tuy nhiên sự khử nitrate chỉ xảy ra khi có sự thiếu hụt oxy và khi đó nitrate trở thành nguồn cung cấp oxy chính cho các vi sinh vật .Nếu trong môi trường tồn tại oxy hòa tan và nitrate thì vi khuẩn sẽ sử dụng oxy hòa tan trước. Điều này sẽ dẫn đến lượng nitrate bị khử sẽ thấp hơn, do sự khử nitrate chỉ xảy ra dưới điều kiện yếm khí hoặc thiếu oxi ( khi nồng độ oxy hòa tan ít hơn 0.5mg/L , lý tưởng là dưới - 0.2mg/l). Khi đó vi khuẩn phá vỡ nitrate (NO3 ) thành oxi (O2), lượng nitrate sẽ bị khử về dạng N2O và lần lượt thành khí nitơ, và thoát ra khí quyển do độ hòa tan thấp. Phương trình mô tả quá trình khử nitrate như sau: - - 6 NO3 + 5 CH3OH 3N2+ 5 CO2+ 7 H2O + 6 OH Trong phương trình trên CH3OH đóng vai trò là nguồn cacbon cho quá trình khử nitrate xảy ra, pH tối ưu cho quá trình khử nitrate là từ 7.0 - 8.5, quá trình khử nitrate là một quá trình làm tăng độ kiềm, làm pH môi trường tăng cao. 14
  16. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate Những điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả khử nitrate là :  Nồng độ nitrate  Điều kiện yếm khí  Sự hiện diện của chất hữu cơ  pH môi trường  Nhiệt độ ( chỉ từ 5oC-30oC)  Độ kiềm  Kim loại dạng vết Ảnh hưởng của nguồn carbon :Tỉ lệ tăng trưởng cao nhất là khi xử dụng nguồn cacbon methanol hoặc acid acetic, thấp hơn khi sử dụng nước thải thô và thấp nhất là khi sử dụng nguồn carbon nội sinh ở nhiệt độ thấp. Ảnh hưởng pH :Sự gia tăng oxít nitơ (NO) xuất hiện ở pH 7,3 thì dinitơ oxyt (N2O) có xu hướng bị tái hấp thụ và tiếp theo bị khử trong quá trình phản nitrate trở thành nitơ phân tử. Điều kiện yếm khí :Quá trình phản nitrate đến nitơ phân tử chỉ xảy ra trong điều kiện kỵ khí hay kỵ khí một phần, nên quá trình này thường gặp trong đất yếm khí và trong đáy sâu của các hồ, các biển không có oxy hoặc giàu các chất hữu cơ đang bị phân huỷ. 2.1.5 Những tác động tích cực và tiêu cực của nitrate 2.1.5.1Tích cực Hơn 90% nitơ được hấp thụ ở thực vật là ở dạng nitrate, nitơ cần thiết cho sự tăng trưởng và sinh sản cho cả thực vật và động vật, là thành phần cơ bản của protein, khi động vật ăn thực vật, thì các dạng nitơ trong thực vật có tác động quan trọng trên sự 15
  17. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt tăng trưởng và sinh sản của chúng. Do vậy, việc cung cấp đầy đủ lượng nitrate cần thiết có lợi cho sự tăng trưởng ở thực vật ( Marshall Christy and George S. Smith). Trong nông nghiệp : Nitrate được sử dụng chủ yếu làm phân bón. Trong công nghiệp : Nitrate được dùng làm thủy tinh và thuốc nổ và tham gia trong sản xuất nhiều hóa chất khác. Trong thực phẩm nitrate được sử dụng rộng rãi để tăng cường màu sắc và kéo dài tuổi thọ của các loại thịt chế biến (Human Health Fact Sheet, August 2005). Tất cả các nhóm vi sinh vật, nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn đều cần N để sinh trưởng và sinh sản. Chúng cũng sữ dụng nitơ dạng nitrate hoặc ammoni hoặc cả hai dạng Nitrate còn đóng vai trò là chất nhận điện tử trong điều kiện thiếu oxy ở ở vi khuẩn ky khí tùy nghi và một số loài vi khuẩn ky khí. Những nghiên cứu của Abir U. Igamberdiev và Robert D. Hill , 2004, chứng minh nitrate tham gia vào duy trì năng lượng ở tế bào thực vật trong điều kiện thiếu oxy. Hình 2.3: Vai trò Nitrate, NO, Haemoglobin trong duy trì chuổi chuyền điện tử, duy trì năng lượng giúp thực vật thích nghi trong điều kiện thiếu oxi ( 16
  18. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.1.5.2 Tác hại nitrate Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới WHO thì hàm lượng NO3- trong nước ngầm sử dụng cho cấp nước sinh hoạt ở hầu hết các nước phát triển đang tăng lên. - NO3 khi vào cơ thể người tham gia phản ứng khử ở dạ dày và đường ruột do tác - dụng của các men tiêu hoá sinh ra NO2 . Nitrite sinh ra phản ứng với Hemoglobin tạo thành Methaemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxi của Hemoglobin. Thông thường Hemoglobin chứa Fe2+, ion này có khả năng liên kết với oxi. Khi có mặt NO2- 2+ nó sẽ chuyển hoá Fe làm cho hồng cầu không làm được nhiệm vụ chuyển tải O2. Nếu duy trì lâu sẽ dẫn tới tử vong. - + - - 4HbFe2+ O2 + 4 NO2 + 2 H2O > 2 HbFe3 + OH + 4 NO3 + O2 Sự tạo thành methaemoglobinemia đặc biệt thấy rõ ở trẻ em. Trẻ em mắc chứng bệnh này thường xanh xao ( bệnh Blue baby ) và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt là trẻ dưới 6 tháng tuổi. Hình 2.4:Hội chứng trẻ xanh - Ngoài ra, NO2 trong cơ thể dễ tác động với các amin tạo thành nitrosamine một hợp chất tiền gây ung thư. 17
  19. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Các hợp chất nitroso được tạo thành từ amin bậc hai và axit nitrơ (HNO2) có thể trở nên bền vững hơn nhờ tách loại proton để trở thành nitrosamine như sau: Các amin bậc ba trong môi trường axit yếu ở pH = 3- 6 với sự có mặt của ion nitrite chúng dễ dàng phân huỷ thành anđehit và amin bậc hai. Sau đó amin bậc hai tiếp tục chuyển thành nitrosamin. Các amin bậc hai thường xuất hiện trong quá trình nấu rán thực phẩm giàu protein hay quá trình lên men. Nitrite có trong rau quả vào khoảng 0,05 - 2 mg/kg. Khi dùng thực phẩm hay nguồn nước chứa hàm lượng nitrite vượt quá giới hạn cho phép sẽ gây ngộ độc, ở liều lượng cao có thể gây chết người. Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy nên tổ chức y tế thế giới và các quốc gia đều có những quy định về hàm lượng nitrat và nitrite trong các rau quả, trong nước uống. Quy định về hàm lượng nitrate và nitrite trong trong nước uống của một số quốc gia, tổ chức như sau 18
  20. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Bảng 2.4.Tiêu chuẩn về hàm lượng nitrate và nitrite trong nước uống theo các tổ chức ( /2-26- 20098-43-19PM.png) - - STT Tổ chức Hàm lượng NO3 (mg/l) Hàm lượng NO2 (mg/l) 1 WHO 45 2 TCVN 5501-91 50 0,1 3 Canada 10 1 4 EEC 50 0,1 5 CHLB Đức 50 0,1 2.2 Giới thiệu về vi sinh vật xử lý nitrate Vi khuẩn khử nitrate đã được nghiên cứu khá rộng do bởi chúng có sự tham gia vào chu trình chuyển hóa nitơ. 2.2.1 Vi khuẩn Paracoccus species Paracoccus là cầu khuẩn, Gram âm , không di động , không sinh bào tử, ky khí, có hoạt tính khử nitrate, 14 loài thuộc chi này đã được xác định và chúng có hình thái tương tự nhau như: P. alcaliphilus, P. aminophilus, P. denitrificans, P.solventivorans và P. versutus 19
  21. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hình 2.5.Vi khuẩn Paracoccus ( 2.2.2 Rhodobacter sphaeroides Vi khuẩn Rhodobacter sphaeroides thuộc nhóm thuộc chi Proteobacteria. Nhóm này có khả năng phát triển trong các điều kiện khác nhau.Vi dụ Rhodobacter sphaeroides có thể nhận năng lượng từ nhiều nguồn khác nhau: quang hợp, lithotrophyl , hố hấp hiếu khí và kỵ khí. Chúng có thể cố định phân tử nitơ, tổng hợp các tetrapyrole quan trong, dịp lục tố, heme, và các vitamin B12. 20
  22. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hình 2.6. Ảnh hiển vi điện tử Rhodobacter sphaeroides (The University of Texas - Houston Health Science CenterDepartment of Microbiology & Molecular Genetics ( 2.2.3 Thiomicrospira denitrificans Là vi khuẩn hóa tự dưỡng phát triển nhờ việc cố định CO2 nhờ vào năng lượng 2- o giải phóng bởi quá trình oxi hóa. Chúng có khả năng sử dụng H2S, S2O3 ,S và làm 2+ giảm Fe , pyrite, NH3, NO2 và H2 (Kuenen và Bos, 1989).Chúng có thể sử dụng O2, - NO3 làm chất nhận điện tử ( Kelly và Wood, 2001) 21
  23. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hình 2.7:Ảnh hiển vi điện tử vi khuẩn Thiomicrospira denitrificans 2.2.4 Thiobacillus denitrificans Chúng phân bố rộng rãi và là loài vi khuẩn thuộc nhóm hóa tự dưỡng. Chúng có khã năng oxi hóa các hợp chất sulfur vô cơ như: Hydrosulfid và Thiosulfate đến khử nitơ. Những chất nhận điện tử mà các Thiobacillus denitrificans có thể sử dụng là những khoáng ít hòa tan chứa những ion khử hoặc sulfur, như pyrite (FeS2) và FeS. Các chủng vi khuẩn này được sử dụng trong hệ thống xử lý nước nhằm loại bỏ nitrate, sự khử nitrate của Thiobacillus denitrificans phụ thuộc Fe2+ oxi hóa dưới điều kiện yếm khí. 22
  24. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt . Hình 2.8:Thiobacillus denitrificans Photo credit: T.E. Letain, S.I. Martin, H.R. Beller ( 2.3 Cơ chế sinh hóa của quá trình khử nitrate Dưới tác động của các vi sinh vật khử nitrate, nitrate lần lượt bị khử các dạng sau: - - N03 N02 NO N2O N2 Một số vi khuẩn như Paracoccus species, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Rhodobacter sphaeroides có thể khử nitrate đến khí nitơ. Phương trình khử sinh học nitrate đến khí nitơ: Vi khuẩn khử nitrate - - 6 NO3 + 5 CH3OH 3 N2 + 5 CO2 + 7 H2O + 6 OH Quá trình khử nitrate về dạng khí nitơ bởi các chủng vi khuẩn trong giai đoạn này không đòi hỏi sự cung cấp oxy, nó là một quá trình xử lý kỵ khí, nitơ tạo ra sẽ giải phóng vào không khí. Nguồn carbon cũng được cung cấp để đẩy nhanh quá trình. 23
  25. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Quá trình này được điều hòa chặt chẽ bởi vi sinh vật vì một số sản phẩm của sự khử nitrate đến khí nitơ là độc đối với sự trao đổi chất. Điều này có thể giải thích dựa số lượng lớn các gen tham gia vào quá trình này và số lượng hạn chế số vi khuẩn có khả năng khử nitrate. Hệ thống chuyển điện tử nitrate trên màng tế bào có vai trò như một nơi oxi hóa NADH và có nhiều vai trò khác trong sự trao đổi chất. Sự khử nitrate nhận vào 8 điện tử từ quá trình trao đỗi chất, các điện tử được thêm vào để hình thành khí N2 so với chỉ hai điện tử đối với sự khử nitrate đơn độc : - - + - N03 + 2e + 2H N02 + H20 Sự cho điện tử từ NADH qua phức hợp cytochrome b/c1 và cuối cùng đến nitơ oxit reductase qua con đường khác để bơm proton qua màng . Hình 2.9 minh họa cho sự sắp xếp đặt biệt của các enzyme khử nitrate trên màng tế bào. Hình 2.9: Sự khử nitrate trên màng, NADH dehydrogenase complex (DH), nitrate reductase (NAR), nitrite reductase (NIR), NO reductase (NOR), N2O reductase (N2OR) ( 24
  26. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Việc khử nitrate dẫn đến hình thành khí như NO2, NO, N2O, N2 các khí này thoát ra khỏi tế bào đi vào trong khí quyển làm mất dần đi lượng nitrate trong đất dẩn đến thiếu nguồn đạm cho đất. 2.4 Các phương pháp khử nitrate 2.3.1 Phương pháp trao đổi ion Phương pháp trao đổi ion là quá trình hóa lý, trong đó các ion chuyển đồi từ pha rắn đến pha lỏng và ngược lại. Quá trình diễn ra chủ yếu do lực hút tĩnh điện các ion ở các nhóm chức trên bề mặt pha rắn và các ion này trao đổi với các ion trong dung dịch. Trong xử lý nitrate người ta thường sử dụng là nhựa resine có gắn cac ion trao đổi (Cl-) Nguyên tắc: Chuyển ion trao đổi từ pha này sang pha khác: + Các ion đích từ trong nước ô nhiểm chảy vào pha rắn ( resin) + Các ion khác được giải phóng vào dòng chảy từ resin Hình 2.10: Cơ chế trao đổi ion nitrate và resine 25
  27. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt ( Các bước xử lý: + Các chất ô nhiễm sẽ hấp thụ lên resin chloride tạo thành phức hợp resine nitrate + Resine sẽ được tái tạo với nước muối + Dung dịch nước chứa chất ô nhiễm muối này sẽ được thải bỏ qua cống rảnh Trong quá trình trao đổi ion, các resine đặc biêt được sử dụng để trao đổi những ion cloride với nitrate. Về cơ bản, quá trình này dựa trên điện của các ion nên đòi hỏi dung dịch nước phải được trung hòa về điện, do vậy việc đưa vào một ion âm thì ion khác sẽ bị loại bỏ khỏi nước. Ngoài nitrate các ion khác như ion sulfate, ion chloride, ion bisulfate, ion bicarbonate, ion carbonate cũng được loại bỏ. Các cation thông thường hoặc các ion dương như canxi, magne, natri cũng được loại bỏ bằng phương pháp này (Guter, 1981) Phương pháp loại bỏ nitrate này không loại bỏ hoàn toàn chất ô nhiễm từ dung dịch. Tuy nhiên, “một trong những cơ sở về trao đổi ion của San Joaquin Vallay kết quả nghiên cứu của ông là làm giảm lượng nitrate từ 16mg/L còn 2.6mg/L” (Moore, 1991). Chi phí cho việc làm giảm này là 24.2 cents/1000 gal (Moore, 1991). Cho đến nay phương pháp này vẫn mang lại hiệu quả cao nhất 2.3.2 Phương pháp thẩm thấu Màng bán thấm (RO) sẽ khử nitrate đạt tiêu chuẩn nước uống, tuy nhiên phương pháp này thường được sử dụng cho nước có TDS cao và bị nhiễm mặn. Dùng phương pháp này khoảng 65% nitrate sẽ bị khử. Hiệu quả quá trình khử nitrate thấp hơn so với các anion khác, nhất là RO loại bỏ hầu hết ion sulfate. Do đó RO thường được sử dụng trước quá trình trao đổi ion để quá trình khử nitrate có hiệu quả. 26
  28. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.3.3 Phương pháp hóa sinh học Sử dụng vi khuẩn khử nitrate và các vi sinh vật, ion nitrate có thể được làm giảm đến dạng khí N2. Những vi sinh vật này có thể thực hiện quá trình làm giảm lượng nitrate qua phản ứng sau: + - 6H + 6NO3 + 5CH3OH 3N2 + 5CO2 + 13H2O (Zajic, 328). Việc dùng chất hóa học như ethanol có thể dùng làm giảm nitrate. Đôi khi việc này rất cần thiết để chuyển nitơ từ dạng ion ammonium về dạng nitrite nhờ các chủng Nitrosomonas tạo thuận lợi cho việc loại bỏ tất cả nitơ từ dạng dung dịch (Shuval , 1977), hợp chất nitrite thì được oxy hóa về dạng nitrate. Sau đó lượng nitrite này sẽ được làm giảm theo cơ chế trên. Bên cạnh việc sử dụng các vi khuẩn đặc biệt, Tảo quang hợp cũng làm giảm lượng nitrate trong nước. (Zajic, 329). - 3- + + aCO2 + cNO3 + ePO4 + (c+3e)H 1/2(b-c-3e)H2O -> CaHbNcOdPe + (a+b/4+c/5-d/2-5e/4)O2 Cả hai quá trình này có thể góp phần vào hiệu quả loại bỏ nitrate, tuy nhiên cơ chế dùng vi sinh vật dễ bị ảnh hưởng của các chất độc hóa học hoặc những hợp chất có mặt trong nước. Những độc tố này có thể làm giảm hiệu quả làm giảm nitrate của các vi sinh vật (Tổ chức hoạt động Hợp tác Kinh tế và Phát triển, 1974). Một điều quan trọng khác chi phối quá trình này là” clorine trong các quá trình công nghệ trước đó làm giảm hiệu quả hiệu quả xử lý nitrate trong nước thải. Trong nhiều trường hợp nitrate dễ bị oxy hóa bởi chlorine (Moore, 1991, p. 238). Tuy nhiên, lợi ích lớn nhất của quá trình khử nitơ bằng cơ chế sinh hóa là nitơ được loại bỏ hoàn toàn ở dạng khí của nó (Organization for Economic Co-Operation and Development, 1974) vì vậy sẽ không có dư lượng hoặc phát sinh các vấn đề xử lý khí nitơ này. 27
  29. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.3.4 Phương pháp hóa học Do nitrate có độ hòa tan cao, thiếu sự liên kết và hút bám nên phương pháp keo tụ hóa học hay làm mềm bằng vôi tỏ ra không có hiệu quả. Phương pháp khử hóa học bao gồm quá trình khử nitrate thành khí nitơ. Ion sắt tỏ ra là chất khử có ý nghĩa kinh tế, tuy nhiên phương pháp này cũng có những mặt hạn chế nhất định cho việc ứng dụng nó. Khi đồng (Cu) được dùng làm chất xúc tác, chỉ khoảng 70% nitrate bị khử và đòi hỏi một lượng ion sắt tương đối lớn (kết quả sinh ra một lượng bùn lớn). 2.3.5 Các phương pháp khác Phương pháp keo tụ hóa học Phương pháp làm mềm bằng vôi 2.5 Giới thiệu về một số công nghệ xử lý nitrate theo phương sinh học 2.5.1 Giải pháp khử Nitơ Amoni trong nước sinh hoạt khu Nam hà nội (TS. Lều Thọ Bách,Viện Khoa học và Kỹ thuật Môi trường, Đại học Xây dựng) Dây chuyền công nghệ kết hợp hai quá trình nitrate hóa - khử nitrate (Hình 2.11a) có khả năng khử hoàn toàn nitơ amôn trong nước ngầm tại khu vực Pháp Vân, etanol là nguồn cacbon thích hợp để bổ sung trong công đoạn khử nitraet. Sử dụng vật liệu Polyeste sợi ép không yêu cần rữa lọc Hình 2.11: Sơ đồ công nghệ xử lý nitrate , (a): Nitrate hóa- khử nitrate, (b): Khử nitrate- nitrate hóa với dòng tuần hoàn 28
  30. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Việc ứng dụng các công nghệ trên để xử lý sinh học nitơ amôn trong nước ngầm Hà Nội đạt hiệu suất cao và ổn định đảm bảo khử được nitơ amôn trong nước đáp ứng yêu cầu do Bộ Y tế ban hành 11 mg/l) cần tiến hành khử triệt để nitơ amôn theo dây chuyền nêu trên hình 2.11 b, etanol là nguồn các bon thích hợp cho công đoạn khử nitrate. Xử lý nitơ amôn theo sơ đồ công nghệ khử nitrate - nitrate hoá có dòng tuần hoàn (hình 2.11, b) có ưu điểm là quản lý được lượng cacbon hữu cơ dư từ quá trình khử nitrate, không gây tái ô nhiễm nước sau xử lý, DO là chỉ tiêu vận hành quan trọng trong quá trình nitrate hóa và khử nitrate. Để đạt được hiệu quả xử lý nitơ cao, cần duy trì nồng độ DO trong bể nitrate hoá ở mức 3 - 3,5 mg/l và trong bể khử nitrat ở mức 0,6 - 1 mg/l. 29
  31. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.5.2 Công nghệ USB (Upflow Sludge Blanket) Những nét chính của thiết bị: Hình 2.12: Sơ đồ công nghệ xử lý USB Hệ thống USB bao gồm một đoạn phản ứng thực hiện với một bùn hạt (granule) thu được bằng cách cô đọng tập trung vi khuẩn khử nitơ tới một mật độ cao, đoạn tiếp theo tách pha hơi-rắn có tác dụng tách khí nitơ từ bùn hạt, khí này sinh ra từ quá trình nitrate hóa và cuối cùng là giai đoạn kết tủa để tách bùn hạt ra khỏi nước xử lý. Nước thải chứa acid nitrite được đưa vào hệ USB từ nơi thấp của hệ thống và đi qua vùng phản ứng, hình thành một dòng hướng lên. Ở trong quá trình này, nitơ nitrite chuyển thành khí nitơ bằng vi khuẩn khử nitơ được chứa trong hạt nhỏ granule. Sau đó khí nitơ tạo thành bọt mịn và bay lên trên, như vậy nó được tách khỏi hạt granule bằng phương pháp tách hơi-rắn ở phần trên của bể. Khí nitơ sau khi tách ra sẽ được giải phóng vào trong bầu khí quyển, trong khi đó bùn hạt cũng được tách ra khỏi nước xử lý ở giai đoạn kết tủa và được hoàn lưu qua bể phản ứng. 30
  32. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Trong quá trình khử nitrate, cần có một nguồn cacbon hữu cơ làm nguồn năng lượng cho vi khuẩn khử nitơ nhưng trong trường hợp những nơi nước thải không chứa cacbon hữu cơ, ta phải thêm mêtan vào. Chức năng: (1) Thực hiện việc chuyển tải nitơ hiệu suất cao Bùn hạt sử dụng hệ USB vẫn giữ lại được mật độ vi khuẩn khử nitơ và lượng sinh khối trong bể aerotank cao có thể đạt đến mức 50000- 80000 mg/l Vì vậy, theo như hệ thống thường, tải lượng nitơ được giới hạn tới 1- 2kg-m3N/ngày. Trái ngược với nó, theo như hệ thống USB, có thể đạt đến tải lượng tối đa 30 kg-m3N/ngày, thậm chí bình thường là 10-20 kg- m3N/ngày. Điều đó có nghĩa kích thước thiết bị của hệ thống USB chỉ cần 1/10-30 so với phương pháp thông thường. Vì vậy, hệ thống USB đã đưa ra khả năng giảm mạnh không chỉ diện tích lắp đặt thiết bị mà còn giá cả thiết bị. (2) Xử lý nitơ hiệu quả. Bằng cách sử dụng bùn hạt giữ lại vi khuẩn khử nitơ ở một mật độ cao, hệ USB chịu được sự dao động tải trọng và có mức độ thích ứng cao đối với nước thải có mật độ nitơ nitrite đến vài chục đến vài ngàn mg/l, có khả năng nước xử lý cuối cùng giảm xuống dưới 10mg/l một cách ổn định. (3) Giảm chi phí hoạt động (4) Giảm tổng lượng bùn sinh ra. 31
  33. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hình 2.13: Mô hình hệ thống USB 32
  34. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.5.3 Công Nghệ USBF (upflow sludge blanket clarifier) Qui trình USBF được cải tiến từ quy trình bùn hoạt tính cổ điển kết hợp với quá trình anoxic và vùng lắng bùn lơ lững trong một công trình xử lý sinh học. Hình 2.14: Công Nghệ USBF Là một hệ thống kết hợp nên chiếm ít không gian và các thiết bị đi kèm. Quy trình USBF được thiết kế để: Khử chất hữu cơ dạng carbonate (BOD) Khử BOD, nitrate hóa và khử nitrtate Khử BOD, nitrate hóa/ khử nitrtate và khử phốt pho Để khử carbonate, vùng anoxic được xem như vùng lựa chọn mà ở đó sự pha trộn dòng thải sẽ làm tăng khả năng lắng và khống chế quá trình tăng trưởng vi sinh vật. Để nitrate hóa, khử nitrate và khử phospho, vùng anoxic có thể đảm đương được vai trò này. Trong quy trình này, NH3-N bị oxy hóa thành nitrite và sau đó thành nitrate bởi vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter trong từng vùng sục khí riêng biệt. Nitrate được tuần hoàn trở lại vùng anoxic và được khử liên tục tối đa. Trong phản ứng này 33
  35. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt BOD đầu vào được xem như nguồn carbon hay nguồn năng lượng để khử nitrate thành những phân tử nitơ. Quy trình USBF có khả năng khử BOD5 đến dưới 5 mg/l, TSS dưới 10 mg/l mà không qua công đoạn lọc, nitơ tổng cộng dưới 1.0 mg/l và phospho tổng cộng dưới 0.5 đến 2.0 mg/l. Quá trình đặc biệt khử phospho đến 0.2 - 0.5 mg/l có thể thực hiện được bằng cách thêm muối kim loại trong vùng hiếu khí ngay thời điểm dòng thải bắt đầu vào vùng lắng. Các loại muối có thể sử dụng như muối nhôm (Al2(SO4)3.14H2O), Aluminate natri (Na2O.Al2O3), Chlorua sắt (FeCl3), (FeCl2), Sulfate sắt (FeSO4.&H2O) hay Sulfate sắt 3 (Fe2(SO4)3). 2.6 Biện pháp ngăn ngừa ô nhiễm nitrate 2.6.1 Hoạt động nông nghiệp Ô nhiễm nitrate chủ yếu là do hoạt động nông nghiệp do vậy ngăn chặn sự ô nhiễm này cần có biện pháp quản lý chặt chẽ. Ở Mỹ người ta đưa ra biện pháp quản lý về cung cấp chất dinh dưỡng như BMPs ( Best Management Practices) Thực hành quản lý tốt (BMPs) (J. P. Lilly, 1991) là những phương pháp canh tác mà giúp cho thực vật phát triển tối ưu và giảm thiểu ảnh hưởng đến môi trường. Một số phương pháp thực hành quản lý tốt chất dinh dưỡng đã được sử dụng trên tất cả hệ thống canh tác khắp bắc Carolina. Các BMP trình bày ở đây là hướng chủ yếu hướng tới giảm thiểu thiệt hại môi trường từ nitơ và phốt pho. Chỉ bón phân cho đất khi cần thiết: Kiểm tra dinh dưỡng đất là cần thiết, đất được thu mẫu và kiểm tra phân tích ở các phòng thí nghiệm. Thiết lập các mục tiêu năng suất thực tế: Để từ đó cung cấp được lượng phân phù hợp cho từng loại cây trồng, có thể căn cứ vào hiệu quả năng suất vụ mùa trước, ước tính cho vụ mùa sau cung cấp lượng vừa đủ và hiệu quả. 34
  36. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Không nên bón quá nhiều phân nhằm nâng cao năng suất cho những loại hình canh tác có năng suất phi thực tế. Điều này chẳng những gây tốn kém về kinh phí mà còn gây ô nhiễm nguồn nước, nhạy cảm nhất nhất là ô nhiễm nước do nitơ vì rất dễ mất từ đất đi vào nguồn nước. Chọn nguồn nitơ thích hợp: Điều quan trọng là thời gian lưu lại trong đất của các hợp chất nitơ này đủ dài để rễ có thể hấp thu cần cho sự tăng trưởng và phát triển. Một khi nitơ di vào trong thực vật thì nó sẽ không bị mất và cũng không trở thành chất ô nhiễm. Những nguồn nitơ có thể bị mất sau khi bón phân khoảng vài tháng. Nitơ ammoni (NH4) thì dễ ở lại trong đất hơn là nitơ dạng nitrate (NO3) và dễ dàng phân hủy trong nước . Bón nitơ và phospho hợp lý: Nitơ và phospho rất ít mất do xói mòn nếu được bón vào đất bằng việc trộn lẩn hoặc cày bừa. Khi bón phân nên bón vào vùng có cấy trồng, tránh bón phấn tràn lan như vẫn làm trước đây là rải ném gây tốn kém và dễ dàng rữa trôi. Khi bón phân con đường phun hoặc tưới có ưu điểm thực vật dễ dàng hấp thu nhưng cũng có nhiều hạn chế như phương pháp rải. Do đó không nên bón phân theo cách này Thời gian bón phân nitơ phù họp.Thời gian bón là rất quan trọng với phân bón nitơ hơn các chất dinh dưỡng khác bời vì nitơ được bón với lượng lớn để tăng năng suất mùa vụ và rất biến động. Phospho thì ổn định hơn khi được trộn vào trong đất. Lý tưởng nhất là bón phân nitơ thường xuyên và từng lượng nhỏ phù hợp cho từng giai đoạn của cây trồng. 35
  37. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 2.6.2 Phi nông nghiệp. Dựa trên 6 yếu tố ảnh hưởng việc ngấm nitrate trong khu vực trồng cỏ phục phụ nhu cầu giải trí và mỹ quang Bảy việc có thể được chấp nhận và thực hiện bởi nhà quản lý để giúp ngăn chặn việc ngấm nitrate vào hệ thống nước mặt và nước ngầm. Mà một trong những bước quan trong này là hạn chế lượng nitrate sử dụng, nên sử dụng nguồn cung cấp nitơ giải phóng chậm, hoặc loại phân bón chứa nitơ có tỉ lệ hòa tan thấp ở những vùng canh tác có thể áp dụng được (Bocher, 1995, p.66). Trong quá trình trồn trọt cỏ cảnh này thì chú ý thêm vào Zeolite vì zeoolite có khả năng giữ lại các chất như Kali ,can-xi,phospho, magne, ammoni (Bocher, 1995, p. 66). 2.6.3 Kiểm soát kho lưu trữ phân bón Một phương pháp khác để ngăn chặn việc ô nhiễm nitrate ở những vùng canh tác có quan hệ với kho lưu trữ phân bón.Nên lưu trữ phân bón trong kho bằng bêtông sẽ tránh được việc rò rỉ vào đất. 2.6.4 Quản lý lũ lụt Là một trong những biện pháp cơ bản ngăn chặn ô nguồn nhiễm nước ngầm. 36
  38. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 01/04/2011 - 25/6/2011 3.1.2. Địa điểm Phòng Thí Nghiệm Vi Sinh Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 3.2 Vật liệu –Thiết Bị 3.2.1 Mẫu Mẫu nước thải được thu tại bể gôm nhà máy giấy Sài Gòn Tp.HCM chưa qua bể xử lý. 3.2.2 Hóa chất + Potassium sodium tetrate tetrahydrate C4H4O6KNa.4H2O + Dung dịch NaOH 10%: Cân 100g NaOH pha trong 900ml nước cất + Dung dịch PDA (Phenol disulfonic acid): Hòa tan 30g phenol vào 200ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, khuấy đều, đun cách thủy trong 2 giờ, để nguội, bảo quản trong chai sẫm màu. + Dung dịch nitrate chuẩn (100µg/ml): Hòa tan 0,163g KNO3 khan trong nước cất, định mức đến 1 lít. + N-napthylethylenediamin hydrocloride. + Dung dịch sulfanilamide 0,2% 37
  39. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt +Dung dịch H2SO4 đậm đặc 98% + Dung dịch HCl 1N 3.2.3 Thiết bị +Tủ ủ vi sinh +Máy đo độ hấp thụ mật độ quang + Máy tiệt trùng Auto clave 3.3. Phương pháp nghiên cứu sử dụng 3.3.1 Phương pháp thu mẫu : Thực hiện theo phương pháp của tác giả Trần Linh Thước về thu mẫu và bảo quản mẫu nước: Nguyên tắc : Mẫu mang tính đại diện, giữ nguyên các đặc tính ban đầu, tránh nhiễm khuẩn trong quá trình thu mẫu, bảo quản và vận chuyển, mẫu cần được phân tích trong vòng 6 giờ sau thu mẫu, trường hợp phân cần tích ngay bảo quản mẫu dưới 10oC bằng nước đá hoặt đá khô, nếu chưa phân tích ngay thì bảo quản mẫu ở nhiệt độ 0 – 5 oC trong tủ lạnh và cần phân tích trong vòng 6-12 giờ. Cách thực hiện : Một lít mẫu nước thải được thu tại bể gôm nước thải nhà máy giấy Sài Gòn Tp.HCM, sử dụng các chai vô trùng có nắp đậy, mẫu được lấy tại 5 vị trí 4 góc bể và ở giữa bể, khi lấy mẫu tại 5 vi trí này mẫu được lấy ở cả bề mặt và độ sâu 20cm-30cm (bằng chai vô trùng có nắp đậy mở bằng dây) tránh nhiễm khuẩn từ tay người lấy. Hỗn hợp mẫu được chứa trong chai 1 lít đã khử trùng, dán nhãn, ghi chú ngày, giờ lấy mẫu, loại nước thải, tên người thu mẫu, bảo quản trong thùng đá (10oC) chuyển ngay về phòng thí nghiệm phân tích trong vòng 6 giờ, trong quá trình vận chuyển tránh va đập, xáo trộn, nhiệt độ quá nóng hoặc quá lạnh, tránh ánh nắng trực tiếp. 38
  40. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 3.3.2 Phương pháp phân lập: Được thực hiện theo mô tả của tác giả Yu và ctv, 2009 như sau: Sử dụng môi trường phân lập là môi trường thạch có thành phần như sau : KNO3 2g, MgSO4 0.2g, C4H4O=KNa.4H2O 0.5g, Agar 16g, nước cất vừa đủ 1000ml, PH = 7.2, tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút, ủ các đĩa ở nhiệt độ 37oC trong 7 ngày. Các khuẩn lạc riêng rẽ được cấy chuyền nhiều trên môi trường trên cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần khiết. Chủng thuần khiết thu được giữ trong ống thạch nghiên, bảo quản 4oC. 3.3.3 Phương pháp xác định vi khuẩn khử nitrate Nguyên tắc: Theo tác giả Trần Linh Thước các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xức tác khử nitrate thành nitrite diễn ra trong điều kiện không có oxi phân tử. Nitrite sinh ra từ sự khử nitrate phản ứng với sulfanilamide và N-napthylethylenediamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng. Nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các sản phẩm khác nên mặt dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không xuất hiện màu hồng, trong trường hợp này cần kiểm chứng sự cạn kiệt nitrate với bụi kẽm. Kẽm sẽ phản ứng nitrate tạo ra nitrite, trường hợp cho màu hồng là âm tính với nitratase, không chuyển màu là dương tính. 39
  41. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 3.3.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600nm, các tế bào vi khuẩn hấp thụ mạnh chùm ánh sáng ở bước sóng này (Yu và ctv, 2009): Sử dụng môi trường tăng sinh Nutrient Broth (không chứa nitrate, thành phần môi trường trình bày ở mục 3, phụ lục III), trong điều kiện lắc 150 vòng/phút, sau thời gian tăng sinh dịch nuôi cấy sẽ được đo ở bước sóng trên, sử dụng cuvet đo làm từ thạch anh. Pha loãng dịch nuôi cấy với nước cất để đạt mật độ mong muốn. 3.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng nitrate Nguyên tắc xác định: Ion NO3- tác dụng với axít phenoldisulfonic (PDA) thành nitrophenoldisulfonic acid (khi muối nitrate ở điều kiện khan), khi kiềm hóa thì trở nên - màu vàng và có cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ NO3 có trong mẫu. Màu của phức và nồng độ NO3- tuân theo định luât Beer trong khoảng 410-480nm, nếu nồng độ - NO3 trong khoảng 0,1-2 ppm thì nên đo cường độ 410nm và nồng độ càng lớn thì bước sóng hấp thụ càng cao . Bước sóng 480nm có thể dùng với mẫu có nồng độ lên đến 12ppm. Hàm lượng nitrate được xác định như sau : -Xây dựng phương trình đường chuẩn độ hấp thu mật độ quang theo nồng độ nitrate theo từng bước sau: 40
  42. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hóa chất Các bình định mức số Thể tích nirate chuẩn (100µg/ml) 0 5 10 15 20 25 Cô cạn mẫu đến khô trên nồi cách thủy Thể tích dung dịch PDA (ml) 1 1 1 1 1 1 Thể tích nước cất (ml) 25 25 25 25 25 25 Trung hòa acid dư bằng NaOH 10% đến pH trung tính Chuyển vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, đo độ hấp thụ các mẫu ở bước sóng 410nm Đo độ hấp thu D Phương pháp này sử dụng được khi hệ số tương quan R ≥ 0,99, xác định phương trình đường chuẩn dạng Y = ax + b, trong đó Y là nồng độ µg/ml, x là độ hấp thu mật độ quang. -Dịch nuôi cấy sau mỗi 24 giờ sẽ được lọc qua giấy lọc đường kính Ø=11 để loại bỏ tế bào vi khuẩn, tráng rữa lọc nhiều lần bằng nước cất, dịch sau lọc được làm khan bằng cách đun cách thủy trong các cốc thủy tinh cho đến khi khô (không để khét). Bổ sung 1ml dung dịch PDA và 25ml nước cất, trung hòa bằng NaOH 10% đến pH trung tính, định mức 100ml tới vạch, đo ở bước sóng 410nm ghi nhận mật độ quang , thay vào giá trị x phương trình trên xác định nồng độ nitrate. Chú ý: 41
  43. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt - Trong trường hợp mẫu có NO2 > 0,2mg/l sẽ ảnh hưởng đến kết quả phân tích, do - có thể bị oxi hóa thành NO3 . Để loại bỏ thêm 5ml ure-acetic hoặc 2ml dung dịch acid sulfamic 2% vào 50ml mẫu. Trường hợp mẫu nhiễm clorua gây sai số, để xử lý thêm vào thể tích xác định vừa đủ dung dịch Ag2SO4 để kết tủa hết ion Clo. Độ màu: nếu mẫu nước có độ màu > 10 đơn vị, cần loại bỏ bằng cách thêm 2ml dung dịch huyền phù Al(OH)3 vào 100ml mẫu ban đầu. Trường hợp thí nghiệm này không có sự ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu trên. Yx100 Tính toán: Nồng độ nitrate trong mẫu ban đầu C (mg/ml) = 10x1000 Trong đó : Y: nồng độ (µg/ml) 100: thể tích bình định mức (ml) 10: thể tích dịch nuôi cấy cần xác định hàm lượng (ml) 1000: đổi ra đơn vị mg 3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu: Xử lý với phần mềm Statgraphic Plus 3.0 và Microsoft Excell phiên bản 2007. 3.4. Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Nội dung 1: Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate Mẫu thu về từ nhà máy được tiến hành phân lập ngay. Hút 10 ml nước thải cho vào 90 ml nước muối sinh lý có nồng độ (0,85%) trong erlen, đậy bằng nút bông, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút với tốc độ lắc 150 vòng/ phút. Sau thời gian ủ trên, hút 1ml mẫu được pha loãng thành các dãy nồng độ khác nhau và được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng ( có thành phần được trình bày 42
  44. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt mục 1 ở phụ lục III ). Ủ các đĩa ở nhiệt độ 37oC trong 7 ngày. Ghi nhận lại hình thái của khuẩn lạc. Sau đó, các khuẩn lạc riêng rẽ được cấy chuyền nhiều lần cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc sau khi làm thuần sẽ được cấy vào thạch nghiêng và bảo quản để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi ghi nhận hình thái, chúng tôi thu được hai khuẩn lạc (chủng N1 và N2). Hai chủng này được thực hiện các thử nghiệm sinh hóa để bước đầu khẳng định chúng. Các thử nghiệm sinh hóa bao gồm: - Định tính khả năng khử nitrate - Nhuộm Gram - Thử nghiệm Catalase - Thử nghiệm Methyl Red và Voges – Proskauer. - Thử nghiệm khả năng sinh Indole - Thử nghiệm khả năng làm tan gelatin - Thử nghiệm Citrate - Thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột - Khả năng đồng hóa nguồn carbon: glucose, lactose, sucrose 3.4.2 Nội dung 2: Thử nghiệm khả năng xử lý nitrate của các chủng này trong phòng thí nghiệm 3.4.2.1. Đánh giá hiệu quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát bằng cách bổ sung trực tiếp vào môi trường. Môi trường Nitrate broth (chứa KNO3 2g/l tương ứng với nồng độ nitrate ban đầu là 0,2565 mg/ml) được sử dụng xác định hiệu quả loại bỏ nitrate. 43
  45. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Từ mỗi chủng khuẩn lạc thu được, được tăng sinh trong erlen (100ml) chứa 10ml môi trường Nutrient broth (không chứa nitrate) đậy bằng nút gòn phủ bạc bên ngoài, ủ trong 24 giờ với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian ủ tiến hành đo ở bước sóng 600nm để xác định mật độ vi khuẩn trong Erlen, pha loãng để đạt độ hấp thụ mật độ quang 1.0. Nếu mật độ chưa đạt có thể ủ lâu hơn. Sử dụng 1ml dịch nuối cấy (OD =1.0 tương đương 109 cfu/ml ) cho vào chai chứa 100ml môi trường nitrate trên đã khử trùng, đậy bằng nút cao su tạo điều kiện thiếu khí, bao giấy bạc bên ngoài,ủ ở nhiệt độ 370C trong điều kiện tĩnh trong 8 ngày, mẫu đối chứng được thực hiện cùng điều kiện nhưng không bổ sung vi khuẩn. Ở mỗi thời điểm 24 giờ, tiến hành thu mẫu để phân tích hàm lượng nitrate còn lại trong mẫu. Mỗi thời điểm phân tích lặp lại 3 lần. Phương pháp phân tích hàm lượng nitrate được mô tả mục 3.3.5. Mẫu đối 3 mẫu thí nghiệm chứng Hình 3.1. Dịch sau tăng sinh được ủ trong các bình môi trường dinh dưỡng Nitrate broth 44
  46. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 3.4.2.2 . Đánh giá hiệu quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát bằng cách bổ sung hạt gel anginate chứa vi khuẩn vào môi trường khảo sát. Môi trường Nitrate broth (chứa KNO3 2g/l), nồng độ nitrate ban đầu là 0,2478 mg/ml được sử dụng xác định hiệu quả loại bỏ nitrate. Giai đoạn tăng sinh tiến hành tương tự như mô tả ở mục 3.4.2.1, sau giai đoạn tăng sinh các dịch tăng sinh đạt mật độ quang OD =1.0 tương đương 109 cfu/ml. Sử dụng 50ml mỗi dịch tăng sinh có mật độ tế bào trên được hòa trộn với 50ml dung dịch gel anginate 2% , dùng xylanh vô trùng hút hỗn hợp này,tạo thành các hat gel đường kính 5mm chứa tế bào vi khuẩn. Cân 1g hạt chứa tế bào vi khuẩn mỗi chủng trong các cốc vô trùng, cho vào chai chứa 100ml môi trường nitrate trên đã khử trùng, đậy bằng nút cao su tạo điều kiện thiếu khí, bao giấy bạc bên ngoài, ủ ở nhiệt độ 370C trong điều kiện tĩnh trong 8 ngày, mẫu đối chứng được thực hiện cùng điều kiện nhưng không bổ sung vi khuẩn. Ở mỗi thời điểm 24 giờ, tiến hành thu mẫu để phân tích hàm lượng nitrate còn lại trong mẫu. Mỗi thời điểm phân tích lặp lại 3 lần. Phương pháp xác định hàm lượng nitrate được mô tả mục 3.3.5. 45
  47. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng xử lý nitrate 4.1.1. Về hình dáng khuẩn lạc Kết quả phân lập thu được hai chủng khuẩn lạc phát triển được trên môi trường phân lập trên chứa nguồn carbon duy nhất (Potassium sodium tetrate tetrahydrate), nguồn nitơ cung cấp dưới dạng KNO3. Hai khuẩn lạc này có đặc điểm như sau: + Khuẩn lạc thứ nhất (N1): Khuẩn lạc tròn đều, lồi màu trắng sữa đồng nhất, trơn, nhày, có xu hướng mọc lan ra bề môi trường. Không nhận thấy có phát triển vi khuẩn ở phần sâu môi trường thạch. + Khuẩn lạc thứ 2 ( N2) : Khuẩn lạc tròn đều, lồi, màu cam đồng nhất, trơn, nhày, có xu hướng mọc lan ra bề môi trường. Không nhận thấy có phát triển vi khuẩn ở phần sâu môi trường thạch. Hình 4.1 Khuẩn lạc N1 trên môi trường phân lập sau 24 giờ cấy 46
  48. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Hình 4.2 Khuẩn lạc N2 trên môi trường phân lập sau 24 giờ cấy 4.1.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa 4.1.2.1 Định tính khả năng khử nitrate Kết quả định tính khả năng khử nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát cho thấy rằng hai chủng N1 và N2 đều cho kết quả dương tính với thử nghiệm nitrate trên môi trường Nitrate Broth sau khi bổ sung thuốc thử vào dịch nuôi cấy hai chủng trên và mẫu đối chứng. Màu hồng tạo ra rất đậm ở cả hai chủng N1 và N2 chứng tỏ rằng lượng nitrite tạo ra trong môi trường khá nhiều từ phản ứng khử nitrate chỉ sau 24 giờ nuôi ủ. Trong khi đó màu ống đối chứng không đổi màu. N1 ĐC ĐC N2 Hình 4.3: Phản ứng khử nitrate của hai chủng vi khuẩn N1và N2 47
  49. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 4.1.2.2 Kết quả một số thử nghiệm sinh hóa khác Các thử nghiệm sinh hóa khác cũng được thực hiện, hình ảnh minh họa được thể hiện phần phụ lục I Các thử nghiệm sinh hóa khác được biểu thị trong bảng 4.1. Bảng 4.1.Bảng tóm tắt thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm sinh hóa Chủng N1 Chủng N2 Gram - - Catalase + + Thủy phân tinh bột + + VP.test - - M.R test - - Sinh indol - - Glucose - + Lacrose - + Sinh H2S - - Citrate + + Tính di động - - Khử Nitrate + + Dựa vào kết quả bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy đặc trưng hai chủng này như sau: 48
  50. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chủng N1: Thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, không có khả năng đồng hóa nguồn carbon glucose và lactose, citrate, có khả năng phân giải H2O2 do chúng có enzyme ngoại bào catalase và phân giải tinh bột (có hệ enzyme amylase), âm tính thử nghiệm indol và MR-VP, không sinh khí H2S, không có khả năng di động. Chủng N2 : Thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng đồng hóa glucose và lactose, citrate, phân giải H2O2, phân giải tinh bột (có hệ enzyme amylase), âm tính thử nghiệm indol và MR-VP, không sinh khí H2S, không có khả năng di động. Hình 4.4.Hai chủng vi khuẩn N1( phải) và N2 (trái) bắt màu hồng thuốc nhuộm dưới kính hiển vi quang học , vật kính 100X So với kết quả của Yu và ctv (2009) thì kết quả các thử nghiệm không có sự tương đồng ở một số các thử nghiệm sinh hóa như thử nghiệm catalase, khả năng thủy phân tinh bột Điều này chứng tỏ hai chủng vi khuẩn N1 và N2 không thuộc nhóm Stenotrophomonas sp và Oceanimonas sp. Do đó, có khả năng hai chủng N1 và N2 là hai chủng mới và phải cần những phân tích về trình tự gene để có thể xác định chính xác được loài của hai chủng N1 và N2. 49
  51. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 4.2 Kết quả đánh giá khả năng xử lý nitrate của các chủng này trong phòng thí nghiệm 4.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn nitrate Phương trình đường chuẩn độ hấp thụ mật độ quang theo nồng độ với dung dịch nitrate chuẩn (100µg/ml). Y= 14.171x + 0.2966 Trong đó: Y là nồng độ µg/ml, x : mật độ quang R2=0.9901( hệ số tương quan) Hình 4.5: Phương trình đường chuẩn nitrate Hệ số tương quan R= 0,9901 thỏa điều kiện về nguyên tắc xây dựng đường chuẩn (≥0,99) nitrate theo nồng độ, các kết quả tính toán được thay vào phương trình trên. 50
  52. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 4.2.2. Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả xử lý nitrate của các chủng thu được bổ sung trực tiếp vào môi trường Sau thời gian nuôi ủ hai chủng vi khuẩn trên, tiến hành đo hàm lượng nitrate trong môi trường khảo sát thu được kết quả thể hiện trên Hình 4.6. Hình 4.6. Nồng độ nitrate còn lại sau 8 ngày khảo sát ở chủng N1 và N2. Dựa vào hình 4.6, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ nitrate trong môi trường có bổ sung vi khuẩn giảm dần theo thời gian phân tích so với đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng hai chủng vi khuẩn N1 và N2 có khả năng xử lý nitrate khá mạnh. 51
  53. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Ở ngày đầu tiên, hàm lượng nitrate giảm xuống khá mạnh ở cả hai chủng khảo sát. Cụ thể là hiệu quả loại bỏ nitrate ở chủng N1 là 59,37% và chủng N2 là 52,12%. So với thí nghiệm của Yu và ctv (2009) thì hiệu quả xử lý nitrate trên hai chủng ZZ15 và YC13 tương ứng là 72,5% và 54,8% sau một ngày khảo sát. Sở dĩ khả năng khử nitrate của hai chủng này mạnh trong 24 giờ đầu tiên có thể do chủng vi sinh vật cung cấp đang ở phase tăng trưởng đồng thời sử dụng với mật độ cao (> 109 cfu/ml) nên khi đưa vào môi trường thì sẽ rút ngắn thời gian thích nghi. Mặt khác, do trong 24 giờ đầu môi trường dinh dưỡng đầy đủ, hàm lượng cao nên khi đó vi khuẩn sẽ hoạt động mạnh nhất nên hiệu quả khử nitrate sẽ mạnh nhất. Thời gian khảo sát càng tăng thì hiệu quả khử nitrate càng giảm, điều này có thể do mật độ vi khuẩn trong môi trường tăng nhưng thành phần môi trường dinh dưỡng giảm và hàm lượng nitrate cũng giảm theo thời gian nên xảy ra quá trình cạnh tranh nguồn dinh dưỡng dẫn đến hiệu quả xử lý nitrate không cao. Ở ngày thứ 8 của quá trình khảo sát, nồng độ nitrate còn lại ở chủng N1 là 0,0192 mg/ml, chủng N2 là 0,0156 mg/ml. Như vậy hiệu quả loại bỏ nitrate sau 8 ngày đạt 92,5% ở chủng N1 và 93,56% đối với chủng N2. So sánh với kết quả của Yu và ctv (2009), hiệu quả xử lý nitrate của chủng ZZ15 là 96,6% và của chủng YC13 là 95,3% sau 9 ngày khảo sát thì hiệu quả xử lý nitrate của hai chủng N1 và N2 sau 8 ngày là khá cao và không thua kém hai chủng ZZ15 và YC13. 52
  54. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 4.2.3. Kết quả đánh giá hiệu quả xử lý nitrate của các chủng vi khuẩn khảo sát bằng cách bổ sung hạt gel anginate chứa vi khuẩn vào môi trường khảo sát. Sau 8 ngày nuôi ủ với hai chủng vi khuẩn N1 và N2 trên môi trường nói trên các kết quả đo mật độ quang được tính toán theo phương pháp mô tả mục 3.3.5. Kết quả đo đạt được thể hiện bảng 4 phụ lục II. Khả năng làm giảm lượng nitrate được biểu thị hình 4.7 Hình 4.7. Nồng độ nitrate còn lại sau mỗi ngày trong 8 ngày khảo sát theo phương pháp cố định Dựa vào hình 4.7, chúng tôi thấy rằng sau ngày đầu tiên ở cả 2 chủng N1 và N2 có sự khử nitrate nhẹ từ nồng độ ban đầu là 0,2478mg/ml xuống còn khoảng 0,2387 53
  55. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt mg/ml ở chủng N1 và còn 0,235 mg/ml ở chủng N2, tương đương hiệu quả khử nitrate đạt 2,96% ở chủng N1 và đạt 4,47% ở chủng N2. Ở ngày thứ 2 chúng tôi thấy có sự giảm rất mạnh lượng nitrate ở chủng N1, nồng độ nitrate còn lại 39,88%, hiệu quả làm giảm lượng nitrate sau 2 ngày đạt 61,12%, các ngày còn lại có xu hướng giảm chậm dần. Còn chủng N2 chúng tôi thấy có sự giảm đều đặn sau 4 ngày hiệu quả làm giảm đạt 57,28%. Nhận xét thấy rằng với chủng N1 chỉ mất 2 ngày làm giảm đến hơn 61% lượng nitrate ban đầu, trong khi chủng N2 lại mất đến 4 ngày mới làm giảm được 57,28%. Điều này có thể giải thích, ở ngày đầu tiên ở cả hai chủng khảo sát, các tế bào vi khuẩn phần lớn ở trong các hạt gel, một phần tế các bào vi khuẩn này thoát ra ngoài môi trường, dần thích nghi và tiêu thụ nguồn cơ chất nên nồng độ nitrate có sự giảm chậm. Ở ngày thứ hai thì chủng N1 có sự giảm nồng độ nitrate mạnh nhất so với các ngày còn lại, trong khi đó chủng N2 có sự giảm đều đặn và chậm hơn và mất 4 ngày chỉ đạt 57,28 % so với 2 ngày ở chủng N1 đạt 60,12%.Với phương pháp cố định các tế bào vi khuẩn trong các hạt gel aginate này thì chủng N1 tỏ ra ưu thế hơn chủng N2 về thời gian. Tuy nhiên sau 8 ngày nuôi ủ thì hàm lượng nitrate còn lại ở hai chủng khá thấp, cụ thể chủng N1 còn 8,25% và chủng N2 còn 5,3% thì chủng N2 tỏ ra hiệu quả làm giảm thấp hơn chủng N1 về nồng độ nitrate. Hiệu quả loại bỏ đạt 91,75% ở chủng N1 và 94,67% ở chủng N2 So với kết quả thu được theo phương pháp bổ sung trực tiếp thì gần như là tương tương nhau (chủng N1 là 92,50% và chủng N2 là 93,56%). Có thể nói là phương pháp cố định tế bào trong các gel alginate tỏ ra nhiều ưu điểm hơn vì có thể vừa làm giảm được lượng nitrate không thua kém phương pháp bổ sung 54
  56. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt trực tiếp vừa có thể thu hồi được tế bào vi khuẩn, thuận lợi hơn trong vấn đề bảo quản sản phẩm. Tuy nhiên vấn đề của phương pháp cố định vi khuẩn này thì hiệu quả khi tiến hành xử lý trong điều kiện quy mô lớn cần phải được nghiên cứu kỹ hơn. Tóm lại, việc tìm ra được các chủng vi khuẩn có hiệu quả xử lý nitrate mạnh giúp cho quá trình xử lý nitrate trong nước thải thuận lợi hơn, giúp giảm chi phí xử lý. Tuy nhiên, để hai chủng vi khuẩn này thực sự thể hiện được vai trò của nó thì đòi hỏi phải có những nghiên cứu sâu hơn nhằm xác định được chính xác loài cũng như hiệu quả xử lý trên quy mô pilot và quy trình sản xuất chế phẩm để tạo ra được 1 chế phẩm thực sự có chất lượng, có khả năng cạnh tranh trên thị trường. 55
  57. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập được hai chủng vi khuẩn N1 và N2 có khả năng xử lý nitrate từ môi trường nước thải nhà máy giấy Sài Gòn. - Hiệu quả làm giảm lượng nitrate khi bổ sung vi khuẩn trực tiếp đạt mức 92,5% ở chủng N1 và 93,56% cho chủng N2 sau 8 ngày khảo sát. - Kết quả xử lý nitrate theo phương pháp cố định các tế bào trong gel alginate sau 8 ngày thu được hiệu quả loại bỏ nitrate ở chủng N1 đạt mức 91,78% và chủng N2 là 94,70%, so với phương pháp bổ sung trực tiếp dịch vi khuẩn thì cho thấy kết quả tương đương nhau và thể hiện nhiều ưu điểm hơn phương pháp bổ sung trực tiếp. 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục thử nghiệm hiệu quả xử lý nitrate trong điều kiện nước thải với quy mô phòng thí nghiệm và quy mô nhà máy. - Hoàn thiện quy trình nghiên cứu hạt alginate cố định vi khuẩn nhằm tạo ra hạt alginate bền và có hiệu quả hơn. - Tiến hành định danh hai chủng vi khuẩn N1 và N2 bằng phương pháp sinh học phân tử như PCR, giải trình tự. - Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm xử lý nitrate từ hai chủng vi khuẩn N1 và N2. 56
  58. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1].Bộ KHCN & MT, Tiêu chuẩn môi trường Việt Nam: TCVN 5945-1995 [2].Trần Linh Thước (2009). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước ,thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục,TP.HCM Tài liệu tiếng anh [1]Abir U. Igamberdiev and Robert D. Hill (2002). Nitrate, NO and haemoglobin in plant adaptation to hypoxia an alternative to classic fermentation pathways.Journal Of Experimental [2].Bo Bocher, Lori Ward, 1995. Tracing the Flow of Chemicals: How to Reduce Nitrate and Pesticide Leaching, Turf Science, p. 64-67. [3]. Gerald A., 1981, Removal of Nitrate from Contaminated Water Supplies for Public Use, Environmental Protection Agency, Cincinnati. [4]Lu Yu (2009).Identification of novel denitrification bacteria Stenotrophomons sp.ZZ15 and Oceanimonas sp.YC13 and application for removal from industrial wastewater, v.20, p 391-400 [5].Neal,L (1995).Turfgrass Nitrogen Evaluated, Water Environment and Technology, p. 57. Tài liệu internet Michael C. Haveber (2004).Technology Nitrate, Arsenic and Perchlorate removal. Presented by Layne Christensen company 57
  59. SVTH: Nguyễn Thanh Nam GVHD: ThS.Phạm Minh Nhựt 58