›

Đồ án Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)

pdf 55 trang thiennha21 12/04/2022 5570
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_hieu_luc_tru_sau_khoang_cua_cac_dang_che_pham.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC TRỪ SÂU KHOANG CỦA CÁC DẠNG CHẾ PHẨM NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Lê Thị Cẩm Thúy MSSV: 1215100016 Lớp: 12HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
  2. LỜI CAM ĐOAN - - - - - - - - -- - - - - - - - - Tôi tên: Lê Thị Cẩm Thúy Sinh ngày 08 tháng 06 năm 1986 Sinh viên lớp 12HSH01 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tôi xin cam đoan : Đề tài "Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm NPV" do Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của giáo viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng. Sinh viên thực hiện Lê Thị Cẩm Thúy
  3. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ của rất nhiều từ nhiều người, và tôi đặc biệt cảm ơn đến: Thông qua trang giấy này con xin chân thành cám ơn cha mẹ cùng gia đình đã không quản khó khăn, hy sinh nuôi dưỡng và dạy dỗ con nên người, đặc biệt là trong suốt quãng thời gian con ngồi trên ghế nhà trường. Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai, bô môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, người đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này. Chính nhờ Cô mà tôi đã học hỏi được rất nhiều kỹ năng và hiểu biết thêm trong ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật. Tôi chân thành cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành đồ án. Chân thành cảm ơn.
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2 1.4 Đối tượng nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Biện pháp sinh học .3 2.1.1 Định nghĩa 3 2.1.2 Các loại biện pháp sinh học .3 2.1.3 Lịch sử nghiên cứu biện pháp sinh học ở Việt Nam 4 2.2 Giới thiệu về sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab) 5 2.2.1 Phân bố 5 2.2.2 Ký chủ .5 2.2.3 Triệu chứng và mức độ gây hại 6 2.2.4 Hình thái 6 2.2.5 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại 7 2.2.6 Biện pháp phòng chống 9 2.3 Khái quát về virus gây bệnh côn trùng 9 2.3.1 Lịch sử nghiên cứu các nhóm virus gây bệnh côn trùng 9 2.3.2 Các nhóm virus côn trùng .11 2.3.2.1 Nhóm Baculovirus thuộc họ Baculoviridae 11 i
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2 Nhóm Cytoplasmis polyhedrosis virus (CPV) 12 2.3.2.3 Nhóm Entomopox virus (EV) thuộc họ Poxviridae 12 2.3.2.4 Nhóm Irido virus (IV) thuộc họ Iridoviridae .12 2.3.2.5 Nhóm Denso virus (DV) thuộc họ Parvoviridae 13 2.3.2.6 Nhóm virus ARN thuộc họ Picornaviridae 13 2.3.2.7 Nhóm Sigma virus thuộc họ Rhabdoviridae 13 2.3.3 Cấu trúc của virus đa diện nhân NPV 14 2.3.4 Cơ chế xâm nhiễm của virus NPV 16 2.3.5 Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus 18 2.3.6 Triệu chứng của bệnh virus trên sâu ăn tạp 19 2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến virus 19 2.3.8 Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại 20 2.3.8.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV 20 2.3.8.2 Nhược điểm của chế phẩm NPV 21 2.3.8.3 Hiệu quả diệt sâu của virus NPV 22 2.3.9 Sử dụng chế phẩm NPV trên đồng ruộng và tạo chế phẩm NPV trừ sâu .24 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 3.1 Phương pháp nghiên cứu 27 3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .27 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.3 Nội dung nghiên cứu .27 3.1.4 Quá trình tiến hành nghiên cứu .27 3.1.4.1 Tiến hành trồng cải bẹ xanh mỡ .27 3.1.4.2 Pha trộn các dạng chế phẩm NPV 28 3.1.4.3 Thả sâu và tiến hành phun chế phẩm .29 3.1.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Mật số sâu trước và sau phun thuốc 31 ii
  6. Đồ án tốt nghiệp 4.2 Hiệu lực diệt sâu của chế phẩm NPV 33 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 41 iii
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BmNPV Bombyx mori Nuclear polyherosis virus BVTV Bảo vệ thực vật CV Coeff of variation CPV Cytoplasmic polyhedrosis virus ADN Acid Deoxyribo Nucleic DNP Deoxyribo Nucleoprotein DV Denso virus EPN Tuyến trùng ký sinh côn trùng EV Entomopox virus ĐTSH Đấu tranh sinh học GV Granulosis virus HaNPV Helicoverpa armigera Nuclear polyherosis virus IB Inclusion Body IPM Intergrated Pest Managerment IV Irido virus LC50 Lethal Concentration50 LC90 Lethal Concentration90 LT50 Lethai time50 NPV Nuclear polyherosis virus ARN Acid Ribonucleic PIB Plyhedar inclusion body SAT Sâu ăn tạp TP HCM Thành phồ Hồ Chí Minh SpltNPV Spodoptera litura Nuclear polyhedrosis virus BPSH Biện pháp sinh học iv
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bảng 4.1 Mật số sâu sống trước và sau phun ở các nghiệm thức nghiên cứu Bảng 4.2 Hiệu lực diệt sâu của các chế phẩm sau khi tiến hành thí nghiệm v
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Vòng đời sâu khoang Spodoptera Litura Fabricius Hình 2.2: Cấu trúc của thể vùi Hình 2.3: Sơ đồ lây nhiễm, xâm nhập và phát triển của NPV trong cơ thể sâu chủ Hình 4.1 Số sâu sống trước và sau phun ở các nghiệm thức nghiên cứu Hình 4.2 Hiệu lực diệt sâu của các chế phẩm NPV ở các ngày phơi nhiễm vi
  10. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thích hợp và thuận tiện cho cây trồng phát triển. Đồng thời cây trồng phát triển cũng là sâu hại phát sinh, chúng gây hại đáng kể đến năng suất. Theo thống kê của Cục bảo vệ thực vật, hàng năm các loài thiên dịch, bệnh hại đã làm giảm 35%-40% tổng sản lượng, mặt khác làm giảm chất lượng của nông sản. Để phòng chống dịch hại, bảo vệ cây trồng, con người đã sử dụng các biện pháp khác nhau như từ biện pháp thủ công, vật lý, hóa học, sinh học Trong thời gian qua biện pháp hóa học được coi như là biện pháp tích cực nhất, hiệu quả nhanh, đơn giản, dễ sử dụng, chi phí thấp, tuy nhiên vẫn còn tồn tại nhiều bất cập và hệ lụy ảnh hưởng đến cây trồng, môi trường sống và người sử dụng. Trong các loài sâu hại cây trồng thì đáng chú ý nhất là các loài sâu ăn tạp chiếm số lượng nhiều nhất, phân bố rộng rãi, trong đó đáng quan tâm là loài sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura), gây hại với hơn 112 loại cây trồng thuộc 44 họ thực vật (Chari và Patel, 1983) bao gồm các loại cây rau đậu, cây thực phẩm, cây công nghiệp, cây lương thực, cây phân xanh, Đứng trước thực trạng đó thì biện pháp sinh học là một giải pháp được đánh giá là có hiệu quả cao, vì nó không những không gây hại cho người, an toàn cho gia súc, không ảnh hưởng đến các loài sinh vật có ích mà còn góp phần cải thiện môi trường, Trong số này, đáng kể nhất là virus NPV. Virus gây bệnh côn trùng đã được các nhà khoa học trên thế giới phát hiện ra hơn 1000 loài, trong đó các loài thuộc nhóm Baculovirus có tác dụng diệt sâu cao nhất (Phạm Thị Thùy, 2004). Virus đa diện nhân Nuclear Polyhedrovirus (NPV) là một tác nhân gây bệnh rất phổ biến trên sâu ăn tạp, được công nhận là một tiềm năng cho việc quản lý côn trùng, có hiệu quả tiêu diệt cao, do tính chất lây lan virus NPV trong quần thể sâu, đồng thời virus sẽ nhân sinh khối trong cơ thể sâu khoang làm tăng tính chất tiêu diệt sâu, nó đặc biệt hấp dẫn bởi tính an 1
  11. Đồ án tốt nghiệp toàn đối với môi trường và các sinh vật khác. Virus NPV có hiệu quả diệt sâu cao nhưng tác động chậm và hiệu lực của nó sẽ giảm dần theo tác dụng của tia cực tím (El Salamouny et al, 2009) nên các nhà khoa học đã tiến hành thực hiện các cuộc thí nghiệm để bổ sung các chất chống oxy hóa vào trong thành phần của dịch virus côn trùng để nhầm tăng hiệu quả chống oxy hóa dưới tác dụng của tia cực tím trong ánh mặt trời, năng cao hiệu lực của virus côn trùng trong quá trình tiêu diệt sâu hại. Các thử nghiệm trong phòng cho thấy, NPV có hiệu lực cao đối với sâu khoang ăn tạp. Việc phối trộn NPV với boric acid, rỉ đường có khả năng làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. Mặt khác, rỉ đường, trà xanh và bã cà phê có tác dụng lọc tia cựa tím, bảo vệ NPV dưới tác động của ánh nắng mặt trời (Phan Công Vẹn, 2013; Nguyễn Cao Đẳng, 2013). Các nguyên liệu này được đề xuất để làm phụ gia tạo chế phẩm NPV. Tuy nhiên, để có kết luận chính xác, cần phải có thử nghiệm trên cây trồng. Chính vì vậy, sinh viên tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang của các dạng chế phẩm NPV” nhằm khẳng định lại hiệu quả của NPV khi phối trộn với các loại phụ gia. 1.2. Mục tiêu của đề tài Xác định hiệu lực diệt sâu cuả các dạng chế phẩm NPV. 1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài cung cấp dữ liệu làm cơ sở để chọn lọc phụ gia tạo chế phẩm NPV trừ sâu khoang hại cây rau. 1.4. Đối tượng nghiên cứu Chế phẩm của NPV được cung cấp từ phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Nguồn sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura bắt trên đồng và nuôi trong phòng thí nghiệm đến khi vũ hóa, trưởng thành. Cho trưởng thành sinh sản và sử dụng sâu đầu tuổi 2 để tiến hành thí nghiệm. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Biện pháp sinh học 2.1.1 Định nghĩa Biện pháp sinh học có nhiều định nghĩa người đầu tiên sử dụng biện pháp sinh học là Smith (1919) để chỉ việc sử dụng thiên dịch trong phòng trừ côn trùng hại. Theo Tổ chức đấu tranh sinh hoc (OILB) thì “Biện pháp sinh học là biên pháp sử dụng sinh vật hoặc sản phẩm của chúng nhằm ngăn chặn hoặc giảm bớt những thiệt hại do các sinh vật gây ra” Theo Van Driesch và Belows (1996) thì “Biện pháp sinh học là sự kìm hãm chủng quần côn trùng do các hoạt động của thiên địch và là việc sử dụng các loài động vật ký sinh, bắt mồi, nguồn bệnh, vi sinh vật đối kháng hoặc các chủng quần cạnh tranh để kìm hãm chủng quần dịch hại, làm cho chúng giảm mật độ và tác hại” Theo Viện Hàn Lâm Khoa Học Quốc Gia Hoa Kỳ (1987) thì “Biện pháp sinh học là việc sử dụng các cơ thể tự nhiên hay biến đổi, các gen hoặc các sản phẩm của gen để làm giảm ảnh hưởng của các cơ thể không mong muốn và để làm lợi cho các cá thể mong muốn như cây trồng, côn trùng và vi sinh vật có ích” Như vậy Biện pháp sinh học có thể nói đơn giản là dùng các sinh vật để khống chế sinh vật hại và rộng hơn là dùng các sinh vật và sản phẩm của chúng để kìm hãm sinh vật gây hại, làm cho chúng giảm số lượng hoặc độc tính đối với sinh vật mục tiêu. 2.1.2 Các loại biện pháp sinh học Sử dụng sinh vật để tạo điều kiện cho loài mong muốn được phát triển trong khi kìm hãm loài không mong muốn (dịch hại) làm cho chúng giảm mật độ và giảm tác hại đó là công việc của biện pháp sinh học. Tùy theo nguồn gốc và phương thức sử dụng thiên địch mà người ta chia biện pháp sinh học thành 3 kiểu như sau: 3
  13. Đồ án tốt nghiệp ●Biện pháp sinh học cổ điển (Classical) là nhập nội và thuần hóa một loài thiên dịch để khống chế một loài dịch hại có nguồn gốc tại chỗ hoặc ngoại lai. ●Biện pháp sinh học tăng cường (Augmentation) là nâng cao hoạt động của thiên dịch thông qua nhân nuôi và thả thiên địch để chúng kìm hãm dịch hại tại chỗ và ngoại lai. ●Biện pháp sinh học bảo tồn (Conservation) là nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi về nơi cư trú, dinh dưỡng .cho thiên dịch bản địa phát huy tiềm năng sinh học khống chế dịch hại. 2.1.3 Lịch sử nghiên cứu biện pháp sinh học tại Việt Nam Mặc dù biện pháp sinh học (BPSH) trên thế giới đã thành công hơn 100 năm, nhưng đây là một lĩnh vực khoa học tương đối mới ở nước ta. Theo những gì ghi chép lại, nông dân nước ta cũng biết sử dụng kiến vàng để diệt trừ sâu hại trong vườn cam quýt từ khoảng thế kỷ thứ 4. Nhưng nghiên cứu phát triển BPSH thì mới chỉ được bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970. Những nghiên cứu về thành phần thiên địch trên sâu hại lúa của Phạm Bình Quyền (1972-1973), của Viện Bảo vệ thực vật (1972-1973) và việc đánh giá hiệu lực của các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Bt để trừ sâu tơ tại Viện Bảo Vệ Thực Vật (1971-1974) có thể coi là những công trình đầu tiên về nghiên cứu BPSH phòng chống dịch hại ở nước ta (Phạm Văn Lầm, 2003). Từ năm 1973, việc nghiên cứu sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma spp. để trừ sâu hại được bắt đầu tại Viện Bảo Vệ Thực Vật. Sau đó công việc nghiên cứu này cũng được một số cơ quan khác tiến hành như Phòng Sinh thái côn trùng (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật), Bộ môn Động vật không xương sống (Khoa Sinh, Đại học Quốc gia Hà Nội). Đến nửa sau thập niên 1970, việc nghiên cứu sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma spp. để trừ sâu hại được Chi cục BVTV Vĩnh Phúc, Thái Bình hưởng ứng triển khai. Từ thập niên 1980, việc sử dụng ong mắt đỏ Trichogramma để trừ sâu 4
  14. Đồ án tốt nghiệp hại được Trung tâm nghiên cứu cây Bông Nha Hố (nay là Viện nghiên cứu và phát triển cây bông) triển khai ứng dụng trên cây bông. Nghiên cứu nấm B. Bassiana để trừ sâu róm thông Dendrolimus punctatuus được bắt đầu từ giữa thập niên 1970 ở trường Đại học Lâm nghiệp. Từ cuối thập niên 1980 đến nay, việc nghiên cứu BPSH được tiến hành ở nhiều cơ quan như Viện Bảo Vệ Thực Vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Khoa Sinh (Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội), Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, Viện Nghiên cứu và Phát triển cây bông, Viện Công nghiệp thực phẩm, Tác nhân sinh học được nghiên cứu cũng đa dạng, gồm ong mắt đỏ Trichogramma spp., vi khuẩn (B. thuringiensis, S. enteridis), virus côn trùng (NPV), nấm côn trùng (B. bassiana, M. anisopliae, M. flavoviride), nấm đối kháng (Trichoderma spp.), tuyến trùng gây hại côn trùng (Phạm Văn Lầm, 2003). 2.2 Giới thiệu về sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab) Họ Ngài đêm (Noctuidae) Bộ Cánh Vảy (Lepidoptera) 2.2.1 Phân bố Sâu ăn tạp là loài có phổ ký chủ rộng, phân bố hầu hết các nơi trên thế giới và được ghi nhận lần đầu tiên ở huyện Nelson gây hại cho cây thuốc lá (Cottier và Gourlay,1955). Sâu khoang là loài phân bố rộng khắp nơi trên thế giới, ở các nước Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á, Bắc Phi, có ở khắp nơi ở nước ta. 2.2.2 Ký chủ Đây là loài đa thực. Ước tính phá hoại 290 loại cây trồng thuộc 99 họ thực vật, ở nước ta sâu khoang là loài sâu hại quan trọng trên rau màu: rau họ hoa thập tự, cà chua, cà bát, đậu đũa, đậu vàng, bầu bí, rau muống, khoai tây, khoai lang, khoai sọ, thuốc lá, bông, thầu dầu, điền thanh . 5
  15. Đồ án tốt nghiệp 2.2.3 Triệu chứng và mức độ gây hại Sâu non sâu khoang tuổi nhỏ tập trung thành đám gặm ăn lá, chừa lại biểu bì trên và gân lá. Khi sâu lớn thì phân tán, ăn thủng lá chỉ để lại gân lá, có thể cắn trụi hết lá, cắn trụi cành hoa, chui và đục khoét trong quả, nụ hoa. Khi sâu khoang phát sinh thành dịch, chúng gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng. Rau ăn lá thì bị giảm số lượng và giá trị thương phẩm, với cây lấy quả như cà chua thì hoa nụ bị hại sẽ rụng, quả bị hại sẽ rụng sớm, hoặc thối khi trời mưa. 2.2.4 Hình thái Ngài thân dài 16-21 mm, sải cánh 37-42 mm. Cánh trước màu nâu vàng. Phần giữa từ mép trước cánh tới mép sau cánh có một vân ngang rộng màu trắng. Trong đường vân này có 2 đường vân màu nâu (ở con đực không rõ), cánh sau màu trắng loáng phản quang màu tím. Trứng hình bánh cầu, đường kính 0,5mm. Bề mặt trứng có những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đáy trứng (khoảng 36-39 đường) cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo nên những ô nhỏ. Trứng mởi đẻ có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng xám, khi sắp nở có màu xám. Trứng xếp với nhau thành ổ có lông màu nâu vàng phủ bên ngoài. Sâu non đẫy sức dài 38-51mm, phần lớn có màu nâu đen, hoặc nâu tối, một số ít có màu xanh lục. Vạch lưng và vạch phụ lưng màu vàng, trên mỗi đốt dọc theo vạch phụ lưng có một vệt màu đen hình bán nguyệt, trong đó vệt ở đốt bụng thứ 1 và đốt bụng thứ 8 là lớn nhất. Nhộng dài 18-20mm, màu nâu tươi hoặc nâu tối, hình ống tròn. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh các đốt bụng thứ 5, 6, 7 có nhiều chấm lõm. Cuối bụng có một đôi gai ngắn. 6
  16. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1 Vòng đời sâu khoang Spodoptera Litura Fabricius 2.2.5 Tập tính sinh sống và quy luật phát sinh gây hại Ngài sâu khoang thường vũ hóa vào buổi chiều và lúc chập choạng tối bay ra hoạt động. Ban ngày ngài đậu ở dưới là và ở những nơi kín trong bụi cây lùm cỏ. Thời gian ngài hoạt động từ chập tối đến nửa đêm. Sức bay khỏe, trưởng thành có khả năng bay xa tới 1,5km (Salama và Shoukry, 1972). Bị khua động bay vài chục mét và có thể bay cao tới 6-7m. Ngài có xu tính mạnh với mùi vị chua ngọt và với ánh sáng đèn, đặc biệt là đèn có bước sóng ngắn. Trưởng thành đẻ trứng vào đêm thứ 2 sau khi vũ hóa. Một đời con cái giao phối khoảng 3-4 lần, trong khi đó con đực có thể giao phối 10 lần. Ngài cái có tính chọn lọc ký chủ để đẻ trứng, ngài đẻ trứng thành từng ổ khoảng vài trăm quả, thường nằm ở mặt lá, thời gian đẻ trứng thường kéo dài từ 6-8 ngày, số lượng trứng đẻ trung bình của 1 con cái trưởng thành là từ 2000-2600 trứng. Số lượng trứng trên các cây ký chủ khác nhau khá rõ rệt, nếu trong khu vực có trồng cây thầu dầu và điền thanh thì sâu khoang đẻ trên những cây này nhiều hơn các cây khác. 7
  17. Đồ án tốt nghiệp Thời gian sống của ngài sâu khoang ở nhiệt độ cao (hè-thu) ngắn hơn ở nhiệt độ thấp (đông- xuân), ngài được ăn thêm sống lâu hơn là không ăn. Giai đoạn trứng kéo dài trong khoảng 2-3 ngày, sâu khoang hóa nhộng trong đất, giai đoạn nhộng kéo dài từ 7 đến 10 ngày. Sâu non tuổi 1 sống quần tụ với nhau quanh ổ trứng. Lúc này nếu bị khua động sâu có thể bò phân tán hoặc nhả tơ dong mình rơi xuống. Tuổi nhỏ không lẩn tránh ánh sáng, nhưng ở tuổi lớn hơn (tuổi 4) có hiện tượng trốn ánh sáng nên ban ngày thường chui vào chỗ kín hoặc chui xuống khe nẻ ở mặt đất, ban đêm mới chui ra để hoạt động. Sâu có thể di chuyển từ cánh đồng này sang cánh đồng khác, ở đất cát pha hoặc đất thịt nhẹ sâu non còn có thể ăn cả bộ phận dưới mặt đất của cây trong thời gian ẩn nấp ban ngày. Sâu non có 6 tuổi, sâu non tuổi cuối có thể nặng đến 800 mg, trung bình giai đoạn sâu non có thể ăn đến hết 4 g lá, trong đó 80% bị tiêu thụ bởi sâu non tuổi cuối, sâu non đầy sức thì chui xuống đất làm một kén bằng đất hình bầu dục để hóa nhộng bên trong. Đất có hàm lượng nước 20% là thích hợp nhất cho sâu hóa nhộng. Đất quá khô hoặc quá ẩm đều không thuận lợi. Sâu khoang là loài ưu điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp nhất cho sâu sinh trưởng phát dục là 29-300C và độ ẩm không khí thích hợp nhất là trên 90%. Ở Việt Nam điều kiện thời tiết khí hậu, cây trồng thuận lợi cho sâu khoang phát sinh phát triển và thường gây thiệt hại nặng cho cây trồng vào các tháng nóng ẩm mùa hè và mùa thu (từ tháng 4 đến tháng 10). Dịch sâu thường phát sinh vào khoảng tháng 5-6, còn các tháng khác thì có thể gây hại nặng hay nhẹ tùy thuộc vào địa điểm và cây trồng. Những nghiên cứu ở Viện Bảo Vệ Thực Vật từ năm 1997-2000 cho thấy vòng đời sâu khoang ở đồng bằng Sông Hồng từ 20-60 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ. 8
  18. Đồ án tốt nghiệp 2.2.6 Biện pháp phòng chống sâu khoang hại cây trồng. Trong một số năm gần đây để phòng trừ sâu khoang trên thế giới cũng như ở nước ta đã và đang sử dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (JA Wightman, ICRISAT, Andhra Pradesh, India, 1996) bao gồm các biện pháp sau: Dùng bẫy đèn (đặc biệt là đèn tia tím) và bẫy chua ngọt để bắt và tiêu diệt. Vừa có ý nghĩa trong dự phòng dự báo, vừa có ý nghĩa trong việc giảm số lượng sâu trưởng thành trước khi đẻ trứng. Bắt sâu tuổi nhỏ lúc chưa phân tán và ngắt ổ trứng là biện pháp rất có hiệu quả. Khi dự tính được thời gian trưởng thành ra rộ thì định kỳ 2-3 ngày 1 lần đi thu bắt sâu tuổi nhỏ và ngắt ổ trứng chưa nở. Cày bừa, phơi ải kỹ trước khi trồng rau. Trong quá trình sinh trưởng phát triển của rau cần xới xáo, làm cỏ kết hợp diệt sâu, nhộng. Trồng cây hưởng dương, thầu dầu xung quanh cánh đồng hoặc trồng thành hàng ở giữa cánh đồng để dụ sâu khoang đến, sau đó thu nhặt trứng và sâu non trên cây bẫy để tiêu diệt. Sử dụng bẫy pheromone Bảo vệ và khích lệ các loài ong ký sinh sâu non: Apanteles ruficrus, C. marginiventris, A. kazak, Campoletes chloridae, Peribaea orbata, Hyposoter didymator và Telenomus remus (Michael et al, 1984) Sử dụng Bacillus thuringiensis (Krishnaiah et al, 1985) hoặc sử dụng Nuclear Polyhedrosis Virus để tiêu diệt sâu khoang (sử dụng 500 sâu non nhiễm Virus/ha), sử dụng dịch chiết của cây xoan để phun diệt sâu non . 2.3. Khái quát về virus gây bệnh côn trùng 2.3.1 Lịch sử về nghiên cứu các nhóm virus gây bệnh côn trùng Virus gây bệnh trên côn trùng đã được Phillips nghiên cứu vào năm 1720, sau đó nhà khoa học Cornalia và Mamestri nghiên cứu vào năm 1856 trên cơ thể con tằm, 9
  19. Đồ án tốt nghiệp năm 1898 Bolle phát hiện thể đa diên trong ruột con tằm đã giải phóng ra những hạt virus nhỏ. Bệnh virus sâu xanh bông Helicoverpa armigera đã được Mally phát hiện tại Nam Phi năm 1891, đến năm 1936, Parson, Sweetman và Bergold mới xác định được nguyên nhân gây bệnh của những thể đa diện do chính các virus gây bệnh trên côn trùng. Vào năm 1940 trên thế giới xuất hiện kính hiển vi điện tử thì có hàng loạt các công trình nghiên cứu về các loại virus côn trùng. Từ đó cho đến nay có rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu sản xuất và ứng dụng virus đa diện nhân sâu xanh để trừ sâu xanh bông, thuốc lá, ngô, cà chua . Virus gây bệnh trên côn trùng là một trong những nhóm vi sinh vật gây bệnh có nhiều triển vọng trong việc phòng trừ sâu hại cây trồng. Đây là nhóm virus có kích thước rất nhỏ (siêu vi khuẩn) có khả năng sống và sinh sản trên các mô sống, nhưng chúng không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo vì virus gây bệnh trên côn trùng có đặc điểm nổi bật là tính chuyên tính, nghĩa là virus chỉ gây bệnh riêng cho từng loại côn trùng gây hại, chúng cũng chỉ gây bệnh trên nhưng mô nhất định của côn trùng đó và mỗi loại virus có một phổ ký chủ riêng, ví dụ như virus sâu xanh bông thì chỉ có thể lây bệnh cho sâu xanh bông, virus sâu tơ chỉ gây bệnh cho sâu tơ .Do đó tên của virus thường gắn với tên ký chủ, ví dụ như virus đa diện nhân sâu xanh bông được ký hiệu Nuclear polyhedrosis virus Helicoverpa armigera (viết tắt là NPV Ha) chỉ gây bệnh cho riêng Helicoverpa armigera.Virus sâu tơ là virus hạt Granulosis virus chỉ gây bệnh cho sâu tơ Plutella xylostella viết tắt là GV Px. Tuy nhiên nếu lấy chéo cũng có hiệu quả nhưng không đáng kể. Khi nghiên cứu để xác định loại virus, các nhà khoa học thường dựa vào sự xuất hiện của các thể protein khác nhau, bởi virus côn trùng thường có vỏ protein bao bọc để tạo nên thể vùi (virion) với khối đa diện hoặc tình trạng hạt, không phải các loài virus gây bệnh côn trùng đều có thể tạo thể vùi (Phạm Thị Thùy, 2004). 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Các nhóm virus côn trùng Căn cứ vào cấu trúc của các virion, các nhà khoa học đã phân loại và chia virus côn trùng thành 7 nhóm chính như sau 2.3.2.1 Nhóm Baculovirus thuộc họ Baculoviridae Virus thuộc nhóm này có dạng hình que, hình gậy. Kích thước từ 40-70nm x 250- 400 nm, nhóm virus này gồm có 1 vỏ lipoprotein bao bọc quanh 1 protein nằm trong lõi ADN (nucleocapsid) trong đó có các virion, các virion bao gồm 11-25 polypeptide, trong đó có 4-11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid, số còn lại kết hợp với capsid, ADN của Baculovirus có cấu trúc 2 sợi vòng với trọng lượng phân tử từ 50- 100x106, các virion được bao bọc quanh bởi 1 tinh thể protein lưới mắt cáo, các nhà khoa học gọi đó là thể vùi (Polyhedrosis Inclusion Body-PIB). Nhóm Baculovirus bao gồm 4 loại: Virus đa diện nhân (Nuclear polyherosis virus) viết tắt là NPV, đây là virus có hình đa giác, bên trong có chứa nhiều hạt virion hay gọi là các thể vùi PIB. Loại virus này có thể lây lan rất cao với 7 bộ côn trùng như bộ cánh vảy Lepidoptera, bộ hai cánh Diptera, bộ cánh màng Hymenoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthopterra, bộ cánh mạch Neuroptera và bộ cánh nửa Hemiptera trong đó có khoảng 300 loài côn trùng ở bộ cánh vảy và hai cánh là nhiều nhất, tập trung chủ yếu ở họ ngài đêm Noctuidae và họ ngài sáng Piralidae. Virus hạt Granulosis virus (GV) đây là loại virus dạng hạt có hình oval, hình que bên trong chỉ chứa 1 virion ít khi chứa 2 virion, loại virus này chỉ xâm nhập chủ yếu vào tế bào lớp hạ bì của mô mỡ và huyết tương, khả năng diệt sâu cao, ADN này thường có trong lượng phân tử là 80x106, tỷ lệ (guanine - xitozin) trong ADN thường vào khoảng 35%-39% (P.Wildy, 1971). Chúng là những virus chứa ADN (axit deoxiribonucleic). 11
  21. Đồ án tốt nghiệp Virus có thể protein (thể vùi) khác nhau, bên trong có chứa các virion khác nhau cũng có khả năng diệt trừ sâu hại nhưng tỷ lệ thấp hơn NPV và GV. Virus không tạo thể vùi hoặc tạo thành rất mỏng cho nên loại virus này ít có khả năng diệt sâu hại cây trồng. 2.3.2.2 Nhóm Cytoplasmis polyhedrosis virus (CPV) Nhóm virus này thuộc Rioviridae, đây là nhóm virus đa diện tế bào chất có khả năng gây bệnh chỉ khoảng 200 loài côn trùng, tập trung chủ yếu ở bộ cánh vẩy Lepidoptera và bộ hai cánh Diptera. Nhóm virus này tạo ra các thể protein đa diện có chứa các hạt virion hình cầu, đường kính 50-60nm, xâm nhập chủ yếu vào trong tế bào chất của biểu bì ruột nên khả năng diệt sâu cao. Sâu bị bệnh CPV có biểu hiện kém ăn, còi cọc, đầu to hơn cơ thể, giai đoạn cuối của bệnh màu sắc côn trùng biến đổi. Virus đa diện dạng tế bào chất là loại virus chứa ARN (axit ribonucleic), trọng lượng phân tử ARN này là 12,6x106. 2.3.2.3 Nhóm Entomopox virus (EV), thuộc họ Poxviridae Nhóm virus này gây bệnh chủ yếu trên côn trùng ở bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ hai cánh Diptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthoptera. Về hình thái nhóm EV có thể protein, ADN gồm 2 sợi có trọng lượng phân tử 110-200x106 và có ít nhất là 4 enzyme kết hợp, bên trong các thể vùi có chứa các virion hình bầu dục, chúng xâm nhiễm vào các mô mỡ của côn trùng có khả năng diệt sâu không lớn. 2.3.2.4 Nhóm Irido virus (IV) thuộc họ Iridoviridae Đây là nhóm virus trần, chúng không tạo thành các thể vùi, các virion có hình cầu chứa ADN thẳng với hai loại kích thước, kích thước khoảng 130nm với trọng lượng phân tử 114-150x106 và kích thước lớn khoảng 240-288x106, trong virion có nhiều enzyme ADN, ARN polymeraza, nucleotide phosphohydrolaza và protein kinaza. 12
  22. Đồ án tốt nghiệp Nhóm virus này thường xâm nhiễm trong các mô tế bào chất của sâu nên cũng có khả năng diệt sâu nhưng không cao. 2.3.2.5 Nhóm Denso virus (DV) thuộc họ Parvoviridae Nhóm virus này chỉ gây bệnh trên 3 loài sâu hại là Galleria mellonella, Junonia coenia, Agraulis vanilla. Virion chứa sợi ADN có trọng lượng phân tử 1,6-2,2 x106. Nhóm này có kích thước nhỏ đường kính 20-22 nm. 2.3.2.6 Nhóm virus ARN thuộc họ Picornaviridae Nhóm virus này không tạo các thể vùi, chúng thường ký sinh và xâm nhiễm trong mô biểu bì tế bào ruột, có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 35 nm. 2.3.2.7 Nhóm Sigma virus thuộc họ Rhabdoviridae Nhóm này có tác nhân lây nhiễm di truyền, kích thước 140 x 1180 x 7 nm. Trong 7 nhóm virus trên thì nhóm Baculovirus và nhóm CPV là hai nhóm có tác dụng diệt sâu tốt nhất với hiệu quả phòng trừ cao nhất, vì vậy nhiều nước trên thế giới cũng như nước ta nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu. Đây là những virus đã ký sinh trên các loại sâu hại, được các nhà khoa học nhân nuôi để tạo ra chế phẩm virus và sử dụng chúng trong việc phòng trừ sâu hại đó. Chúng gồm ba loại chính là loại virus đa diện dạng nhân (Nuclear polyhedrosis virus), loại virus thể hạt (Granulosis virus) và loại virus đa diện dạng tế bào chất (Cytoplasmis polyhedrosis virus). Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện hơn 1000 loài virus côn trùng. Ngay từ đầu thập kỷ 80 của thế kỷ 20, thuốc trừ sâu virus đã được phát triển với nhịp độ rất nhanh, có hơn 20 loại virus của các loài sâu hại đã được sản xuất theo phương pháp công nghiệp thành dạng thuốc trừ sâu thương mại được bán ra thị trường để phòng trừ các loại sâu hại cây trồng phổ biến. 13
  23. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3 Cấu trúc của virus đa diện nhân NPV NPV thuộc nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae, nên nó mang những đặc điểm cấu tạo đặc trưng của họ này. NPV tạo thể vùi có hình khối đa diện (NPV) (Chu Thị Thơm et al, 2006). NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi ADN (Nuclecocapsid), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nuleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capside. ADN ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi. NPV có dạng hình que, đường kính 0,15 - 15 µm, chứa hàng trăm tiểu thể virus, mỗi tiểu thể gồm một hoặc nhiều nucleocapsid. Mỗi nucleocapsid có cấu tạo bên trong là ADN và bên ngoài được bao bọc bằng một capsid protein. Các virion dính lại với nhau để tạo thành thể vùi là nhờ vào một chất nền cũng được cấu tạo bằng protein (Frances et al, 1998). Hình 2.2: Cấu trúc của thể vùi 14
  24. Đồ án tốt nghiệp Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm ADN và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn - Single Nucleocapsid (NPV - SNPV); nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid - Multiple Nucleocapsid (NPV - MNPV). Khi pha loãng thấy chúng tạo huyền phù màu trắng đục, để quan sát thể vùi thì thường quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 15.280 - 20.000 lần ở độ phóng đại này thì có thể thấy thể vùi đa diện là những khối kết tinh có nhiều cạnh, có dạng gần giống như hình cầu. Phân tử ADN gồm hai sợi có dạng vòng, dài khoảng 40 µm (Burgess, S., 1977). Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một phân tử ADN, phân tử ADN có chiều dài gấp 2 - 3 lần chiều dài nucleocapsid (Skuratovskaya et al, 1977). Cấu tạo Deoxyribo nucleo protein (DNP): Theo kết quả nghiên cứu của Bud et al (1977) DNP được tạo thành do sự kết hợp giữa ADN và protein, sự kết hợp này không đồng nhất. Đường kính DNP đo được 32 nm. DNP ở trong capsid được sắp xếp chắc chắn, gọn gàng. Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptide nhỏ (Summer et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptid (Harrap, 1972; Kelly,1982,1985). Cấu tạo của khối đa diện (polyhedra): Theo Crook et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein 15
  25. Đồ án tốt nghiệp polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, 1963; Harrap, 1972). Polyhedra có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust et al , 1966). Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng có lớp vỏ này chưa được xác định. 2.3.4 Cơ chế xâm nhiễm của virus NPV Theo Vũ Mai Nam (2001) khi giải thích về cơ chế xâm nhiễm của NPVs như sau: virus SpltNPV xâm nhập vào cơ thể sâu qua thức ăn, vào đến ruột giữa do tác động của dịch ruột, vỏ protein vỡ ra. Sâu bị nhiễm có màu trắng bệch, lờ đờ. Hai hoặc ba ngày sau khi bị nhiễm, sâu không ăn, nằm bất động cho đến khi cơ thể sưng lên, vỡ dịch chảy ra ngoài và sâu chết hẳn. Thời gian từ lúc virus xâm nhập vào cơ thể cho đến khi sâu chết thay đổi tùy theo tuổi và loài sâu. Cơ chế giết sâu là ký sinh trên ký chủ và bắt đầu quá trình ký sinh khác làm bệnh lây nhiễm nhanh chóng và lan rộng không ngừng. Mặt khác, xác sâu chết trở thành thức ăn cho sâu sống vì thế sự lây nhiễm càng nhanh hơn (Vũ Mai Nam, 2001). Theo Phạm Thị Thùy (2004) khi thức ăn có chứa virus NPVs vào ruột sâu non, cũng như Bacillus thuringiensis bằng con đường tiêu hóa virus đã thực hiện quá trình hủy toàn bộ chức năng của sâu làm sâu chết. Cơ chế được mô tả như sau: khi vào ruột các thể vùi PIB của virus sẽ giải phóng ra các virion, dưới tác dụng của dịch tiêu hóa, qua biểu bì mô ruột giữa, các virion xâm nhập vào dịch huyết tương, chúng tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong để thực hiện quá trình gây bệnh cho sâu hại, quá trình này trải qua 3 giai đoạn: Giai đoạn tiềm ẩn: kéo dài từ 6 - 12 giờ, đây là giai đoạn xâm nhập của các thể vùi Polyhedral inclusion body xâm nhập vào trong tế bào, các virion được phóng thích ra, chúng tự đính vào các vị trí thích hợp trên màng nhân tế bào thành ruột của sâu. 16
  26. Đồ án tốt nghiệp Giai đoạn tăng trưởng (sinh sản): kéo dài 12 - 48 giờ, đây là giai đoạn tăng nhanh của các virion mới trong dịch ruột của sâu. Đối với sâu tuổi nhỏ chỉ sau 32 giờ trong cơ thể sâu đã chứa đầy các virion trần. Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn tạo thể vùi tức là các thể virion được bao bọc trong thể protein, côn trùng trong giai đoạn này có màu sáng bóng, màu sắc nhạt và đôi khi có màu hồng. Sự phân giải tế bào và sự phân giải của mô cơ thể bắt đầu ngay sau khi virus tạo thể vùi. Sâu tuổi nhỏ chết trong khoảng 3 - 5 ngày sau khi ăn phải thức ăn bị nhiễm virus. Nhưng sâu tuổi lớn thời gian ủ bệnh từ 4 - 6 ngày, có khi dài hơn, vì quá trình ủ bệnh còn phụ thuộc vào tuổi sâu, điều kiện nhiệt độ, ẩm độ và lượng thức ăn khi lây nhiễm Ngay sau khi sâu chết sâu trở nên mềm nhũn, da bị vỡ và giải phóng ra hàng tỷ thể vùi bám trên các bộ phận của cây trồng, đó là nguồn virus lan truyền sang cá thể khác. Hình 2.3: Sơ đồ lây nhiễm, xâm nhập và phát triển của NPV trong cơ thể sâu chủ  Sâu ăn lá cây bị nhiễm virus  Các thể vùi virus hiện diện trong lá  Hệ tiêu hóa trong ruột giữa của sâu 17
  27. Đồ án tốt nghiệp  Các phân tử virus được phóng thích ra khỏi thể vùi và đến gắn vào mao mạch của vách ruột  Sự nhân một số virus trong tế bào sâu Virus 2.3.5 Phương thức lây truyền nguồn bệnh virus Phần lớn các thể vùi của NPV, GV, CPV được giải phóng từ cơ thể sâu bị bệnh đã rã xuống đất hoặc bám trên các bộ phận của thực vật tạo thành những nguồn virus lan truyền bệnh. Những thể vùi của virus cùng thức ăn xâm nhập vào ruột côn trùng. Tại ruột côn trùng dưới tác động của các men tiêu hóa, thể vùi bị hòa tan và giải phóng các virion. Qua biểu mô ruột giữa virion xâm nhập vào dịch máu, tiếp xúc với các tế bào và xâm nhập vào bên trong các tế bào để sinh sản và gây bệnh cho vật chủ. Theo Chu Thị Thơm et al. (2006), việc lây truyền nguồn bệnh virus ở côn trùng xảy ra theo 2 hướng: Lây truyền ngang: nguồn bệnh lây lan giữa các cá thể trong cùng một thế hệ trong điều kiện bệnh phát thành dịch, nguồn virus có thể bám bên ngoài vỏ trứng của vật chủ. Khi trứng nở, ấu trùng gậm vỏ trứng chui ra và nhiễm nguồn bệnh. Lây truyền dọc: là truyền nguồn bệnh qua trứng (qua phôi). Ngoài ra trong một số trường hợp virus có thể xâm nhiễm trực tiếp vào dịch máu qua các vết thương trên cơ thể vật chủ (qua vết chọc đẻ trứng của ong kí sinh, lỗ xâm nhiễm của một số ấu trùng kí sinh vào bên trong vật chủ). 18
  28. Đồ án tốt nghiệp 2.3.6 Triệu chứng của bệnh virus trên sâu ăn tạp Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001), từ việc khảo sát những mẫu sâu thu được ở điều kiện ngoài đồng và trong phòng thí nghiệm ghi nhận các triệu chứng như sau: ●Dạng 1: sâu có màu trắng sáng đôi khi vàng hồng, cơ thể căng phồng lên, da dễ vỡ và dịch màu sữa không có mùi hôi. ●Dạng 2: sâu có màu đen, thân căng, da vỡ, dịch màu cà phê sữa, không hôi hoặc có mùi hôi. ●Dạng 3: sâu màu nâu đen hoặc đen, cơ thể căng phồng, da không vỡ chỉ rách ở các ngắn trên thân, dịch màu nâu đen, không có hoặc có mùi hôi. Sâu non sau khi bị nhiễm bệnh thì sức ăn giảm, động tác chậm, thường bò lên trên cao, cơ thể trước lúc chết bị mềm, các mô trong cơ thể chứa nhiều nước, da dễ bị nứt, chảy ra dịch màu trắng hoặc nâu, chưa có mùi hôi, cho đến khi có nấm mốc mọc mới có mùi. Sâu non bị chết thường có đuôi bám chặt vào cành cây, thân rủ xuống, dịch chảy xuống dưới làm cho phần cơ thể phía trước phình to lên. Dịch trong thân chứa nhiều NPV. Sau khi nhiễm bệnh thường trải qua 4 ngày mới chết, một số kéo dài đến 24 ngày (Trần Văn Mão, 2002). Nhộng sâu ăn khoang tạp bị nhiễm NPV thường bị méo mó, chảy nước màu vàng, rất mềm, dễ bị nhũn. Một số nhộng bị nhiễm có thể chết hoặc vũ hóa thì khả năng sinh sản giảm và truyền virus sang trứng. Trên đồng ruộng, dịch chứa virus có thể lan qua cây trồng và bị ăn bởi các con sâu khác. Sâu sẽ chết trong vòng 4-7 ngày sau khi nhiễm virus (Shepard B. M., 2009). 2.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến virus Tia cực tím của ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu lực của NPV (Phạm Thị Thùy, 2004). Hầu hết những virus hiện diện trên lá sẽ bị bất hoạt trong vòng vài ngày, nếu bị chiếu sáng trực tiếp liên tục thì có thể bị bất hoạt chỉ trong vòng vài giờ (Evan, 1986). 19
  29. Đồ án tốt nghiệp Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực của NPV. Kobayashi et al (1981) đã tiến hành chủng nhộng của con tằm (Bombyx mori) với NPV và quan sát chúng ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả những con nhộng được chủng NPV khi được ủ ở 350C thì sống lâu hơn những con nhộng được ủ ở 250C. Khi nhộng chủng NPV được ủ ở 350C sau đó chuyển sang ủ ở 250C sẽ kéo dài thời gian ủ bệnh hơn những con nhộng được ủ ở 350C. Johnson et al (1982) cũng thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên loài Anticarsia gemmatalis, kết quả cho thấy ở nhiệt độ trên 320C làm chậm tiến trình bệnh của ký chủ. Ở 400C, tất cả các con sâu đều không phát triển bệnh. Trong điều kiện nhiệt độ cao, NPV rất dễ bị mất hoạt tính. NPV ngài độc (Porthetria dispar) ở 600C chỉ tồn tại 18 giờ, ở 650C chỉ 40 phút là mất hoạt tính (Trần Văn Mão, 2002). Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh sản và sống sót của NPV loài Autographa californica, Knittel và Faibrother (1987) thấy rằng không có sự sinh sản và hình thành thể vùi của loài này ở 370C. Theo Phạm Thị Thùy (2004), nhiệt độ và ẩm độ ảnh hưởng không nhiều đến hoạt tính của thể vùi của HaNPV, ngoại trừ nhiệt độ không khí quá cao trên 420C. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên NPV của loài Autographa californica, Knittel và Faibrother (1987) cũng nhận thấy rằng virus bị bất hoạt ngay lập tức ở pH = 2, và bị bất hoạt trong vòng 1 giờ ở pH = 4. Virus bị suy yếu ở pH = 5 và sống sót ở pH = 6. 2.3.8. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm NPV trong phòng trừ dịch hại 2.3.8.1. Ưu điểm của chế phẩm NPV 20
  30. Đồ án tốt nghiệp Theo Szewczyk et al (2009), Baculovirus chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà không làm ảnh hưởng đến động vật có xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác và sẽ bị bất hoạt khi chúng xâm nhập vào tế bào động vật. Điều này có nghĩa là Baculovirus không làm ô nhiễm môi trường sống, không gây ngộ độc thuốc hay lưu tồn như khi sử dụng thuốc hóa học. Baculovirus là chủng có tính chọn lọc ký chủ rất cao so với các nhóm virus thiên địch khác (Frances et al, 1998) do đó mà không làm hại đến các loài côn trùng có ích khác như thuốc hóa học. Baculovirus có cấu trúc với thể bọc bảo vệ, tránh các yếu tố bất lợi của môi trường nên có thể duy trì khả năng sống trong tự nhiên ngoài cơ thể vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007). Cũng theo Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) thì Baculovirus rất thuận lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì có thể đạt nồng độ cao trong mô của ấu trùng (1010 virus/ấu trùng). Chế phẩm có thể giữ hoạt tính trong thời gian rất dài (10 - 15 năm) ngoài cơ thể côn trùng. 2.3.8.2. Nhược điểm của chế phẩm NPV Chế phẩm virus rất khó bảo quản, chúng đòi hỏi điều kiện môi trường phải thích hợp để giữ chúng ở trạng thái nghỉ, đồng thời sản phẩm rất dễ bị nhiễm vi khuẩn gây thối. So với thuốc hóa học thì hiệu lực trừ sâu của virus chậm hơn nhiều. Ngoài ra chế phẩm virus còn gặp khó khăn về vấn đề thương mại. Do Baculovirus rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ có nhiều loài dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một loài dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm virus cũng khó khăn hơn thuốc hóa học vì virus phải được nuôi từ cơ thể sống, chúng không thể phát triển trong môi trường nhân tạo do đó giá thành sản phẩm sẽ tăng lên. Vì là tác nhân sinh học nên Baculovirus dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, ) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi 21
  31. Đồ án tốt nghiệp bằng thuốc hóa học. Một khuyết điểm khác nữa là trong điều kiện tự nhiên, các loài sinh vật có thể tiêu diệt lẫn nhau làm giảm tác động của thuốc trong việc phòng trừ dịch hại (Quang Chân Chân, 2002). 2.3.8.3 Hiệu quả diệt sâu của virus NPV Việc nghiên cứu, xác định LC50 được thực hiện với nhiều chủng virus NPV. Sử dụng Baculovirus Spilarctic obliqua nucleopolyhedrosis virus trong việc phòng trừ Porthesia xanthorrhoea gây hại dâu R.Varatharajan, M.Ingobi Singh và Lreeta (2006) cho biết. Spilarctic obliqua nuclear polyhedrosis virus (SoNPV) được sử dụng có hiệu quả trong việc phòng trừ S. obliqua cũng như Porthesia xanthorrhoea. Các tác giả cũng đã xác 4 định được LC50 của SoNPV đối với sâu S. obliqua ở nồng độ là 2,5 x 10 PIB/ml và 4 của P. xanthorrhoea ở nồng độ là 3,7 x 10 PIB/ml. LT50 của SoNPV dùng để phòng trừ S. oblique là 5,73 ngày và P. xanthorrhoea 6,89 ngày. Bằng cách lây nhiễm SoNPV trong việc phòng trừ P.xanthorrhoea có thể dễ dàng dùng để sản xuất một lượng sinh khối lớn cho việc sản xuất thuốc trừ sâu. Hiệu lực của SpltNPV dùng để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau được thực hiện bởi B.S.Ravishankar và M.G.Venkatesha (2010). Các tác giả thực hiện 3 thí nghiệm để xác định mức độ ảnh hưởng của NPV đến các loài cây ký chủ. Cụ thể như sau: Thí nghiệm đầu tiên nuôi sâu non Spodoptera litura trên các loài cây ký chủ khác nhau và khi tới tuổi 2 thì thay bằng thức ăn nhân tạo được lây nhiễm ở các nồng độ khác nhau. Giá trị LC50 của NPV đối với sâu Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau như sau: bắp cải 0,42; bông 0,61; khoai tây 0,75; lạc 0,93 và hoa hồng 1,28 PIB/mm2. Trong thí nghiệm 2, Spodoptera litura được nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo cho đến tuổi 2 và sau đó được cho ăn trên các cây ký chủ khác nhau khi đã nhiễm SpltNPV. Giá trị LC50 trên hoa hồng là cao nhất 1,81; tiếp theo là lạc; khoai tây; bông và bắp cải (0,40 PIB/ml). Trong thí nghiệm 3 Spodoptera litura được nuôi trên các cây ký chủ khác nhau cho đến tuổi 2 và sử dụng phương pháp nhúng lá để đánh giá LC50. Giá trị LC50 tăng theo thứ tự là lạc, khoai tây, bông và bắp cải (1,02 22
  32. Đồ án tốt nghiệp PIB/ml). Trong cả 3 thí nghiệm trên thì LC50 của bắp cải là thấp nhất và của hoa hồng là cao nhất. Xác định LC50 của NPV trong trường hợp có trộn thêm acid boric để tăng cường khả năng diệt sâu Lauro Morales và cộng sự (1997). Nồng độ boric acid (0,02; 0,03; 0,045; 0,067 và 0,101 g/ml) được kết hợp với AgNPV làm tăng hiệu lực diệt sâu. Bảy ngày 5 sau khi nhiễm nồng độ gây chết trung bình 50% (LC50) là 1,52 x 10 chỉ có AgNPV và 7,95 x 102 khi phối trộn AgNPV với 0,045 g/100ml boric acid. Quan sát các ngày sau khi nhiễm (9,11 đến 14 ngày) thì LC50 của hổn hợp NPV + boric acid thấp hơn 4 lần khi chỉ có NPV. Thời gian gây chết trung bình 50% (LT50) là 13,6 ngày khi chỉ có NPV, trong khi đó hổn hợp NPV + boric acid thì giá trị LT50 giao động từ 13,7 ngày (boric acid 0,02 g/100ml) đến 7,4 ngày (boric acid 0,101 g/ml). Do đó có thể bổ sung boric acid vào AgNPV để tăng hiệu lực diệt sâu A. gemmatalis và rút ngắn thời gian tử vong bởi các tác nhân gây bệnh. Kết quả nghiên cứu NPV và hiệu quả của sự kết hợp NPV với thuốc hóa học để phòng trừ sâu ăn tạp Spodoptera litura (Trần Thị Kiều Trang và S. Chaudhari, 2002). Sử dụng NPV để phòng trừ sâu hại là một trong những biện pháp tối hảo trong chương trình IPM, NPV là một trong những nhóm phụ của họ Baculovirus được xem như một loại thuốc sinh học với tính chuyên biệt cao đối với nhiều loài sâu hại thuộc họ Lepidoptera. Nồng độ sử dụng tùy thuộc nhiều vào độ tuổi của sâu. Sâu 2 ngày tuổi sẽ bị nhiễm nhanh gấp 1.500.000 lần so với sâu ở 8 ngày tuổi, thời gian yêu cầu để 50% sâu chết gia tăng với tuổi sâu. LT50 tăng từ 4,4 ngày đối với sâu 2 ngày tuổi đến 9,4 ngày ở sâu 8 ngày tuổi. LT50 có sự phụ thuộc vào liều lượng, LT50 tăng khi tuổi sâu tăng, giảm khi liều lượng tăng. Sự kết hợp NPV với một số thuốc hóa học ở liều lượng cực nhỏ cho thấy có kết quả tốt như trong trường hợp NPV kết hợp với Actara và Difubenzuron cho tác dụng bỗ trợ tăng phần trăm tỷ lệ chết của sâu và thời gian gây chết được rút ngắn hơn so với sử dụng NPV đơn độc. Từ các kết quả nhận được cho thấy tiềm năng sử dụng NPV để phòng trừ Spodoptera litura trên các loài rau màu là có triển vọng tốt phù hợp với chương trình an toàn lương thực thực phẩm. 23
  33. Đồ án tốt nghiệp Nghiên cứu của Baskaran et al, (1999) khi chỉ có NPV (108 PIB/ml) và kết hợp giữa NPV ở nồng độ (2 x 104 PIB/ml) với dầu neem (1%), chiết suất từ nhân hạt neem (5%) và chiết suất từ bánh neem 5%. Kết quả cho thấy sự tăng hiệu lực NPV và tỷ lệ tử vong tăng từ 31,1% đến 81,5% và 57,6% tương ứng. Sự kết hợp giữa NPV với Vitex negundo 10% không làm tăng hiệu lực của NPV, trong khi đó Prosopis juliflora và Ipomoea carnea gây ra sự đối kháng với virus NPV. Kết hợp của virus NPV với các sản phẩm từ Neem làm giảm sự thiệt hại của sâu non gây ra và làm giảm LT50 của virus NPV. Sử dụng kết hợp của NPV với dầu neem ở các nồng độ khác nhau (0,1 - 1%) và chiết suất từ nhân hạt neem làm giảm LC50 của virus NPV tương ứng từ 1,06 - 1,43 (lần) và 1,03 - 1,33 lần. 2.3.9 Sử dụng chế phẩm NPV trên đồng ruộng và tạo chế phẩm NPV trừ sâu Ảnh hưởng của tia cực tím đến NPV: Các nghiên cứu đã chứng minh rằng hiệu lực trừ sâu của NPV bị suy giảm do ảnh hưởng của tia UV có trong nắng mặt trời (ELnagar 1982; Jgnoffo và cộng sự, 1989; Jones và cộng sự, 1993; El Salamouny và cộng sự, 2009). Vì vậy, khi sử dụng NPV để trừ sâu trên đồng, cần thiết phải bổ sung phụ gia bảo vệ virus (Shapiro et al., 2008). Nhiều cố gắng đã được thực hiện để bảo vệ virus khỏi tác động của tia UV có trong nắng mặt trời bằng cách sử dụng các hóa chất để làm phụ gia như các loại thuốc nhuộm (Shapiro, 1989; Ramakrichman và Chaudhary, 1991; Reddy và Divakar, 2001) hoặc Cu(NO3)2 và CuSO4 (Arivudainambi và cộng sự, 2000). Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên như lignin (phụ phẩm của công nghiệp giấy) cũng có khả năng bảo vệ virus khỏi ảnh hưởng của tia UV (Jacques, 1977; Tames-guera và cộng sự, 2000; El Salamouny và cộng sự, 2002; Elnagar và cộng sự, 2003). Các nghiên cứu cũng cho biết các chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ virus từ nắng mặt trời như Dilodin và Inol (Zarin và Eglite, 1985), các Vitamin (Murahabaskaran và cộng sự, 2000) hoặc các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên như: folic acid (Deotale và cộng sự, 2007); Riboflavin, Pyridoxin, dịch chiết của lá xoài và 24
  34. Đồ án tốt nghiệp lá bạch đàn (Deotale và cộng sự, 2003), dịch chiết từ cây cacao, cà và cây cà phê (Salamouny và cộng sự, 2009). Theo A. El-Helaly và cộng sự (2008) thì có nhiều chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có khả năng bảo vệ virus NPV khỏi tác động của tia UV như trà xanh, bắp cải tím, cacao, ớt, cà phê, Nghiên cứu tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV: Tiêu chí để tạo chế phẩm virus NPV trừ sâu là kéo dài hoạt lực cũng như sự bền vững của virus trên đồng (Jones et al, 1997). Việc tạo chế phẩm có thể cải thiện đáng kể hiệu quả của virus. Các chất phụ gia cho vào virus nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết của virus (Bell và Kanavel, 1975; Burges và Jones, 1998). Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh do virus NPV, các tác giả đã phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ đường . Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 105 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng hơn so với không trộn. Tuy nhiên, tác giả cho biết, nếu không bổ sung mật đường thì sự phối hợp này không có hiệu quả. Tương tự như vậy, Baskaran và cộng sự (1999) cho biết, phối trộn NPV (2 X 104 PIB/ml) với dầu neem 1% và dịch chiết bánh dầu neem 5% cũng làm tăng hiệu quả diệt sâu của NPV. Các tác giả thống nhất rằng, việc bổ sung dịch chiết neem vào chế phẩm NPV làm cho sâu khoang chết nhanh hơn so với không bổ sung và quan trọng hơn cả là làm giảm được tác động của neem đối với các loài thiên địch. Seon-Gon Kim và ctv (2001) cho biết, phối trộn nồng độ 1x108 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 200 ppm có giá trị LT50 và LT90 là 1,94 ngày và 8,33 ngày. Hiệu lực diệt sâu của Spodoptera litura NPV (SpltNPV) nồng độ 1x108 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 75–200 ppm cho kết quả diệt sâu chết 100% sau 9 ngày thí nghiệm (DAT). Tạo chế phẩm thương mại NPV: Spodoptera litura NPV được sản xuất dưới dạng bột thấm nước theo công thức: 50% sâu bị chết do virus đã được đem đông lạnh + 25
  35. Đồ án tốt nghiệp 20% hỗn hợp bao gồm silica tổng hợp (Neosyl) và chất hoạt động bề mặt (Etocas 30). Kaolin cho vào như là chất chống đóng cục (Mcking ley và cộng sự, 1989). Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang trong chế phẩm bột thấm nước, Claudia C. Medugno và cộng sự (1999) cho rằng, trộn kaolin sẽ làm giảm hiệu lực của chế phẩm trong thời gian bảo quản. Đối với chế phẩm dạng nước, Jin và cộng sự (2000) cho biết, thêm đường Sucrose (1-5%) làm tăng khả năng ăn của sâu. Thêm đường trắng hoặc rỉ đường và Triton X- 100 có khả năng tăng hiệu lực của chế phẩm. Các nghiên cứu đều cho rằng, hiệu lực của virus ảnh hưởng bởi thời gian và biện pháp bảo quản. Rodrigo Lasa và cộng sự (2008) cho biết, hiệu lực trừ sâu xanh da láng của virus SE NPV bị giảm 16,67 lần sau 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ 250C và hiệu lực không thay đổi nếu bảo quản virus ở điều kiện 40C và -200C. Nhóm tác giả cũng cho biết, bổ sung các chất kháng khuẩn và chất chống oxy hóa có thể duy trì hiệu lực của virus trong vòng 18 tháng ở điều kiện bảo quản trong tủ lạnh. 26
  36. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương pháp nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài nghiên cứu tiến hành trong 3 tháng từ ngày 16/12/2013 đến ngày 14/03/2013, tại xã Bình Mỹ, huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu Thùng xốp lớn kích thước 42x30x30cm có khoét lỗ nhỏ để thoát nước Hỗn hợp đất xốp, phân chuồng, tro trấu, xơ dừa (theo tỷ lệ 2:1:1:1) Bình xit thuốc, dụng cụ đo thể tích (loại 1 lít), ca nhựa để pha thuốc Giống cải bẹ xanh mỡ cao sản (Công ty Phú Nông) Các dạng chế phẩm NPV: +NPV nồng độ 2 x106 PIB /ml +NPV nồng độ 2 x 106 PIB /ml + dịch chiết trà xanh 1% +NPV nồng độ 2 x 106 PIB/ml + dịch chiết cà phê 1% +NPV nồng độ 2 x 106 PIB/ml+ rỉ đường 1% +NPV nồng độ 2 x 106 PIB/ml + boric acid 1% Thuốc Sherpa 25EC 0,15% 3.1.3 Nội dung nghiên cứu Đánh giá hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp của các dạng chế phẩm NPV trên cây trồng. 3.1.4 Quá trình tiến hành nghiên cứu 3.1.4.1 Tiến hành trồng cải bẹ xanh mỡ Hạt giống cải bẹ xanh mỡ được mua tại cửa hàng bán thiết bị dụng cụ và hạt giống nông nghiệp. Giống cải được trồng để tiến hành làm thí nghiệm là giống của Công ty Phú Nông. Được trồng trong các khay xốp, giá thể để trồng là hỗn hợp đất, phân chuồng, tro trấu và xơ dừa có độ ẩm nhất định. 27
  37. Đồ án tốt nghiệp Trong 5 ngày đầu tiên từ khi gieo hạt đến khi nảy nầm thì tiến hành tưới nước mỗi ngày, sau đó tưới vào buổi sáng hoặc chiều mát. Đến khi rau được 15 ngày tuổi (khoảng 7cm) thì tiến hành tách ra khỏi khay xốp và chuyển sang trồng trong 21 thùng xốp, bố trí mỗi thùng 7 cây. Tiếp tục trồng đến khi cây cải bẹ xanh được 30 ngày tuổi thì có thể sử dụng để tiến hành làm thí nghiệm, trong quá trình trồng thì cần chú ý hạn chế không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để bảo vệ cây cải bẹ xanh. Do thí nghiệm được tiến hành vào giữa cuối tháng 12/2013 và kết thúc đến giữa cuối tháng 03/2014 nên không tiến làm mái che nắng cho cây cải. 3.1.4.2 Pha trộn các dạng chế phẩm NPV Dịch NPV thuần nồng độ 2x106 PIB/ml được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tiến hành chuẩn bị dịch chiết thực vật, sử dụng phương pháp của Shapiro et al (2008). +Lá trà xanh (loại lá già) được đem đi phơi khô và xay nhỏ. Chuẩn bị dịch chiết: Lấy 1g nguyên liệu khô, hòa với 100 ml nước cất và để ở nhiệt độ phòng 24h. Sau đó lọc lấy dịch chiết có tỷ lệ 1% và cho vào tủ lạnh để dùng. +Bã cà phê (sau khi pha xong) được phơi khô sau đó lấy 1g cho vào 1ml nước cất và để ở nhiệt độ phòng 24h rồi lọc lấy dịch chiết trên. Bổ sung dịch chiết vào chế phẩm và tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của A. El-Helaly et al (2008). Dùng pipet hút 5ml dịch virus nồng độ 4 x 106 PIB/ml + 5 ml dịch chiết trà xanh 1% ta được dịch virus có nồng độ 2 x 106 PIB/ml. Làm tương tự cho dịch chiết cà phê 1%. Sử dụng để tiến hành thí nghiệm. Tiến hành chuẩn bị chế phẩm NPV(2 x 106 PIB/ml) + Boric acid 1%, NPV (2 x 106 PIB/ml) + Rỉ đường 1%. 28
  38. Đồ án tốt nghiệp 3.1.4.3 Thả sâu và tiến hành phun chế phẩm Sâu khoang Spodoptera litura được thu nhận trên cây thầu dầu rồi đem về nuôi trong phòng để sâu vào nhộng, vũ hóa trưởng thành. Tiến hành cho trưởng thành giao phối, đẻ trứng và thu nhận sâu tuổi 2 để làm thí nghiệm. Sau đó thả lên cây cải, để tránh tình trạng sâu bị tổn thương, cần tiến hành thực hiện các thao tác nhẹ nhàng. Sử dụng kéo cắt lá thầu dầu sao cho mỗi mẫu lá chứa 2 con sâu khoang. Sau đó để phần lá thầu dầu đó vào nách lá của cây, để sâu khoang có thể tự di chuyển sang cây cải. Bố trí sao cho mỗi thùng chứa 12 con sâu. Trong thí nghiệm này tiến hành với 6 dạng chế phẩm khác nhau, sâu tuổi 2 và được tiến hành lặp lại 3 lần. Sau khi thả sâu được 1 ngày thì bắt đầu tiến hành đếm số lượng sâu có trong 1 thùng trước khi tiến hành phun chế phẩm làm thí nghiệm: Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nghiệm thức Số con sâu tiến hành thí nghiệm (3 lần lặp) Đối chứng (không phun) 10 11 10 NPV thuần 10 10 10 NPV + dịch chiết trà xanh 1% 10 10 10 NPV + dịch chiết cà phê 1% 10 10 10 NPV + rỉ đường 1% 10 10 10 NPV + Boric acid 1% 10 10 10 Shepra 25EC (0.15%) 10 10 10 Tiến hành phun ướt mặt bề mặt lá cải bẹ xanh với các chế phẩm vào lúc chiều mát. Sau đó tiến hành đếm lại vào ngày thứ 3, 7, 9, 12 sau khi phun, và cần phun thuốc lại lần 2 cách lần phun đầu tiên 5 ngày. 29
  39. Đồ án tốt nghiệp 3.1.4.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm được đưa vào xử lý thống kê, bằng chương trình Microsoft Excel, Statgraphic centurion, Công thức Henderson-Tilton Công thức Henderson-Tilton Trong đó: ● nCb: số sâu sống ở ô đối chứng trước khi phun ● nCa: số sâu sống ở ô đối chứng sau khi phun ● nTb: số sâu sống ở ô xử lý trước khi phun thuốc ● nTa: số sâu sống ở ô xử lý sau khi phun thuốc 30
  40. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Mật số sâu trước và sau khi phun thuốc Do số sâu được thả hầu hết là sâu tuổi 2 và cây cải phát triển tốt nên tất cả các sâu thả đều sống được và thích nghi trên cây cải. Tỷ lệ sâu thất thoát thấp. Do vậy, số sâu ở các công thức thí nghiệm tương đương nhau, biến động từ 10-11 sâu /nghiệm thức. Bảng 4.1 Số sâu sống trước và sau phun ở các nghiệm thức nghiên cứu Nghiệm thức Số sâu sống ở . ngày sau phun (sâu/nghiệm thức) Trước phun 3 7 9 12 Đối chứng 10.33 9.33 7.33 6.00 5.67 NPV 10.00 8.00 2.33 0.67 0 NPV + dịch chiết trà xanh 1% 10.00 9.33 3.33 0 0 NPV + dịch chiết cà phê 1% 10.00 6.33 1.00 0 0 NPV + Rỉ đường 1% 10.00 9.00 7.00 2.33 0 NPV+ Boric acid 1% 10.00 9.67 5.33 0.33 0 Sherpa 25 EC 0,15% 10.00 8.00 2.33 0 0 Số liệu bảng 4.1 cho thấy trước khi phun thuốc, mật số sâu ở tất cả các công thức gần giống nhau (trừ công thức đối chứng có số sâu lớn hơn các công thức khác 0,33 sâu) Sau khi phun thuốc mật độ sâu ở công thức đối chứng giảm dần qua các định kỳ điều tra. Cụ thể là sau khi phun 3 ngày, 7 ngày số lượng sâu ở đối chứng chỉ còn 7.33 cá thể so với 10.33 cá thể trước đó. Giải thích điều này, chúng tôi thấy rằng sau khi thả ra đồng sâu bị tác động bởi nhiều yếu tố đặc biệt là yếu tố thiên địch. Theo dõi trên các ô thí nghiệm, chúng tôi thấy có sự xuất hiện của các loài thiên địch bắt mồi như: nhện lớn bắt mồi, các loài bọ xít bắt mồi. Theo chúng tôi, số sâu giảm tự nhiên ở đây là do sự hoạt động của các loài thiên địch bắt mồi. Sau khi phun 9 ngày, số lượng sâu đối chứng còn được 6 cá thể. 31
  41. Đồ án tốt nghiệp Trong khi đó, vào giai đoạn 3 ngày sau khi xử lý, số sâu ở các công thức xử lý thuốc Shepra 25EC, xử lý NPV và công thức xử lý NPV + dịch chiết cà phê đều có xu hướng giảm hơn so với đối chứng. Trái lại, số sâu ở các công thức phun NPV+ rỉ đường, NPV+ Boric acid và NPV + dịch chiết trà xanh đều không giảm so với đối chứng. Theo các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, thời gian ủ bệnh của sâu do NPV đối với sâu khoang tuổi 2 ở nồng độ 106 PIB/ml kéo dài >3 ngày. Vì vậy, số sâu giảm ở đây chủ yếu là giảm tự nhiên do sự hoạt động của các loài bắt mồi ăn thịt. Ở thời điểm này thuốc hóa học đã có tác dụng nhưng số sâu ở công thức xử lý thuốc vẫn không giảm nhiều so với đối chứng. Đến ngày thứ 7 sau khi phun số lượng sâu ở các công thức phun thuốc hóa học và chế phẩm NPV đều giảm hẳn so với công thức đối chứng trừ công thức NPV+rỉ đường. Từ ngày thứ 9 sau khi xử lý, số sâu ở các công thức xử lý thuốc và NPV đều giảm hẳn so với đối chứng. Điều này hoàn toàn phù hợp với các kết quả nghiên cứu về virus NPV vì thời gian ủ bệnh của NPV khá dài. Ở thời điểm này, hầu hết sâu bị chết hết, trừ công thức NPV + rỉ đường còn sống 2.33 cá thể. Đến ngày thứ 12 sau khi phun, toàn bộ sâu ở các công thức xử lý đều chết hết, trong khi đối chứng còn đến 5.67 sâu, đang ở giai đoạn chuẩn bị vào nhộng. Số sâu sống ở các ngày sau phun Đối chứng (không phun) 12.00 NPV 10.00 NPV + dịch chiết trà xanh 8.00 1% NPV + dịch chiết cà phê 1% 6.00 NPV + Rỉ đường 1% 4.00 2.00 NPV+ boric acid 1% - Sherpa 25 EC 0,15% Trước 3 7 9 12 phun Hình 4.1 Số sâu sống trước và sau phun ở các nghiệm thức nghiên cứu 32
  42. Đồ án tốt nghiệp 4. 2. Hiệu lực diệt sâu của chế phẩm NPV: Hiệu lực trừ sâu là chỉ tiêu quan trọng trong việc lựa chọn chế phẩm NPV có hiệu quả tốt nhất, thời gian ngắn và diệt sâu triệt để. Bảng 4.2 Hiệu lực diệt sâu của các chế phẩm sau khi tiến hành thí nghiệm. Hiệu lực diệt sâu (%) ở .ngày phơi nhiễm Nghiệm thức 3 7 9 12 11.17(b) 69.35(ab) 77.78(ab) 100.00 NPV 0.33(b) 48.47(bc) 100.00(a) 100.00 NPV + dịch chiết trà xanh 1% 31.33(a) 88.89(a) 100.00(a) 100.00 NPV + dịch chiết cà phê 1% 3.33(b) 14.44(d) 52.02(b) 100.00 NPV + Rỉ đường 1% 0.00(b) 20.65(cd) 94.76(ab) 100.00 NPV+ boric acid 1% 11.17(b) 66.39(ab) 100.00(a) 100.00 Sherpa 25 EC Bảng số liệu 4.2 cho thấy hiệu lực diệt sâu có nhiều biến động tùy thuộc vào dạng chế phẩm khác nhau. Theo dõi ở 3 ngày đầu sau khi nhiễm thì không thấy có hiện tượng sâu chết mà chỉ thấy sâu bị lờ đờ, kém ăn. Như đã trình bày, do thời gian đầu NPV chưa phát huy tác dụng nên sâu chết ở các công thức xử lý NPV chủ yếu là do các tác nhân bắt mồi ăn thịt. ở thời điểm này, số sâu chết và hiệu lực diệt sâu ở công thức này cao theo chúng tôi, có lẽ do NPV + bã cà phê thu hút thiên địch đến nhiều hơn nên tác động hổ trợ của yếu tố tự nhiên cao và sâu chết nhiều hơn. Đến ngày thứ 3 thì sâu bắt đầu có hiện tượng chết ở các chế phẩm NPV dịch (11.17%) tương đương với thuốc hóa học Sherpa 25 EC, và chế phẩm NPV+dịch chiết cà phê 1% có tỷ lệ chết cao nhất (31.33%) Đến ngày thứ 7 sau khi phun, hiệu lực trừ sâu của NPV tăng lên cao hẳn. Trong đó, hiệu lực cao nhất là NPV+ dịch chiết cà phê 1% (88.89%). NPV thuần có hiệu lực tương đương với thuốc hóa học (69,35 so với 66,39%), NPV+dịch chiết trà xanh 1% 33
  43. Đồ án tốt nghiệp đạt 48% và thấp nhất là NPV + rỉ đường và NPV + acid boric ( 14 và 21%). Như vậy, trong thí nghiệm này, đến ngày thứ 7 sau khi phun, trà xanh, rỉ đường và aicd boric chưa thể hiện vai trò tăng cường hoạt lực diệt sâu cũng như rút ngắn thời gian diệt sâu của NPV như các kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Phan Công Vẹn (2013) và Nguyễn Cao Đẳng (2013). Việc sử dụng thuốc BVTV nói chung và NPV nói riêng trên đồng ruộng phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Vì vậy, để có kết luận chính xác hơn, cần phải tiến hành thí nghiệm nhiều lần và trên diện rộng hơn. Đến ngày thứ 9 sau khi phun, hiệu lực diệt sâu của NPV+ dịch chiết trà xanh 1%, NPV+dịch chiết cà phê 1%, NPV+ Boric acid 1% đạt tối đa xấp xỉ 100%, tương đương với thuốc hóa học và có xu hướng cao hơn NPV thuần. Như vậy, đến thời điểm này, cà phê, trà xanh và acid boric đã thể hiện được vai trò tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV. Riêng hiệu lực diệt sâu ở công thức NPV+ rỉ đường vẫn còn khá thấp và có xu hướng thấp hơn so với đối chứng (sai khác không có ý nghĩa). Tuy vậy, đến ngày thứ 12 sau khi phun, hiệu lực của tất cả các công thức đều đạt 100%. Như vậy, NPV có hiệu lực trừ sâu cao. Khi phun trên đồng ruộng, hiệu lực trừ sâu của NPV cao tương đương với thuốc hóa học. Vì vậy, nên khuyến cáo sử dụng NPV để trừ sâu khoang ăn tạp, thay cho thuốc hóa học. Bổ sung cà phê, acid boric và trà xanh có tác dụng rút ngắn thời gian diệt sâu của NPV. Riêng trong thí nghiệm này, trà xanh chưa thể hiện hiệu quả trong việc phối trộn với NPV. 34
  44. Đồ án tốt nghiệp Hiệu lực diệt sâu tuổi 2 của các dạng chế phẩm 120 NPV dịch gốc 100 NPV + dịch chiết trà xanh 1% 80 NPV + dịch chiết cà phê1% 60 NPV + Rỉ đường 1% 40 NPV+ Boric acid 1% 20 Sherpa 25 EC - 3 7 9 12 Hình 4.2 Hiệu lực diệt sâu của các chế phẩm NPV ở các ngày phơi nhiễm Qua bảng số liệu 4.2 ta thấy được hiệu lực diệt sâu của NPV+ dịch chiết cà phê 1% có hiệu lực diệt sâu tối ưu nhất qua các ngày phơi nhiễm, và nhận thấy còn cao hơn thuốc hóa học Sherpa 25EC. Còn riêng hiệu lực diệt sâu của NPV+Boric acid 1%, NPV +rỉ đường 1% trong ngày thứ 7 bị thấp và việc trộn tỷ lệ rỉ đường 1%, boric 1% có vẻ không tốt và tác dụng chậm trong điều kiện ngoài đồng, trái lại việc bổ sung trà và cà phê tăng hiệu quả. Giải thích điều này thì các nhà khoa học đã chứng minh rằng trà và cà phê có khả năng hấp thu được tia cực tím nên tăng cường hiệu lực của NPV khi phun ra đồng. 35
  45. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Các dạng chế phẩm NPV đều có hiệu lực cao đối với sâu khoang ăn tạp trong điều kiện thử nghiệm trên đồng. - Hiệu lực diệt sâu của NPV liều lượng 2 x 106PIB/ml cho hiệu lực trừ sâu tương đương với thuốc Sherpa EC liều dùng 0,15% (liều khuyến cáo). - Bổ sung bã cà phê có tác dụng làm cho sâu chết nhanh hơn so với không bổ sung. - Trong khuôn khổ liều lượng của thí nghiệm này, không có sự sai khác rõ rệt về hiệu lực diệt sâu cũng như thời gian diệt sâu giữa NPV với thuốc hóa học cũng như giữa NPV thuần với NPV + rỉ đường, NPV + dịch chiết trà xanh , NPV + acid boric. 5.2 Kiến nghị Cần tiến hành thí nghiệm thêm vài lần nữa để có kết luận chính xác hơn. Tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng các dạng chế phẩm NPV trong quá trình sản xuất rau sạch ở qui mô lớn. 36
  46. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: [1] Quang Chân Chân (2002), Siêu vi khuẩn thiên địch Baculovirus và hiệu quả sử dụng trong nông nghiệp, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [2] Trần Thị Thùy Dung (2008), Quy trình chế biến thức ăn nhân tạo và khảo sát ảnh hưởng của Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius) trong phòng thí nghiệm, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. [3] Nguyễn Cao Đẳng (2013), Lựa chọn chất phụ gia có nguồn gốc thực vật bổ sung vào chế phẩm NPV, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. [4] Nguyễn Thị Hai. Sâu hại và thiên địch của chúng trên cây bông tại Ninh Thuận và Đồng Nai.NXB Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, tr.108-120. 1996. [5] Nguyễn Văn Huỳnh (1999), Côn trùng nông nghiệp, Đại học Cần Thơ. [6] Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), “Côn trùng gây hại cây trồng chính ở [7] Phạm Văn Lầm. Biện Pháp sinh học phòng chống dịch hại Nông nghiệ, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 1995. [8] Phạm Văn Lầm. Nghiên cứu phát triển biện pháp sinh học phòng chống dịch hại nông nghiệp ở Việt Nam. Báo cáo trình bày tại Hội thảo Quốc gia về Khoa học vào công nghệ BVTV kỷ niệm 50 năm ngày bắt đầu các hoạt động BVTV ở Việt Nam, ngày 7-8/01/2003, Hà Nội, 16 tr. 2003. [9] Trần Văn Mão (2002), Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích, Tập II: Sử dụng vi sinh vật có ích, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. [10] Nguyễn Đức Khiêm, 2006. Giáo trình Côn trùng nông nghiệp. NXB Nông nghiệp Hà Nội. [11] Nguyễn Thị Kiều Khuyên (2002), Tình hình thiên địch trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fab.), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Hubner.) và một số đặc điểm hình thái, sinh học của sâu xếp lá (Lamprosenma indica Fab.), tại Cần Thơ, Luận văn tốt nghiệp, Đại học Cần Thơ. 37
  47. Đồ án tốt nghiệp [12] Ngô Trung Sơn (1999), Nghiên cứu sử dụng HaNPV trong phòng trừ tổng hợp sâu xanh hại bông tại Ninh Thuận. Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. [13] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài và Nguyễn Văn Tó (2006), Tìm hiểu về chế phẩm vi sinh vật dùng trong nông nghiệp, Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động, Nhà xuất bản lao động, Hà Nội. [14] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006). Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống. Nhà xuất bản Lao động, Hà Nội. [15] Nguyễn Công Thuật (1996), Phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại cây trồng. Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp. [16] Phạm Thị Thùy (2004), Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. [17] Phan Công Vẹn (2013), Nâng cao hiệu lực diệt sâu của chế phẩm NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus), Luận văn tốt nghiệp, Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh. Tiếng nước ngoài: [18] Adam, J. R. DNA Mc Clintock, J. T, 1991. Baculoviridae Nuclear polyherosis viruses. Part 1. Nuclear polyherosis viruse of insects, in atlas of invertebrate virus. CRC. BoCa Raton, FL, p. 87-204. [19] Albert, H. U. DNA N. E. Alger (2003), “Nosema bombycis algerae: Infection of the white mouse by a mosquito parasite” Journal of Invertebrate Pathology, Volume 83, Issue 1, May, Pages 51-59. [20] B. S. Ravishankar DNA M. G. Venkatesha (2010). “Effectiveness of SlNPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera: Noctuidae) on different host plants”. Journal of Biopesticides 3 (1 Special Issue) 167 - 171. [21] Bergold, G. H. (1963a), “Fine structure of some insect viruses”, Journal Insect Pathology, 5, 111 - 128. [22] Bergold, G. H. (1963b), “The molecular structure of some insect virus inclusion bodies”, Journal Ultrastructs. Res., 8, 360 - 378. 38
  48. Đồ án tốt nghiệp [23] Chukhrij M.G. Biologia Baculovirusov i vius txitoplazmatichexkovo poliedroza. Kishinhev, 1988. [24] Coppel H.C., J.W. Mertins. Biological Insect Pest Suppression. Springer- Verlag Berlin Heidelberg, New York. 1977. [25] Crook, N. E. DNA Jarrett P. (1991), “Viral DNA bacterial pathogens of insects”. Socirty for Applied Bacteriology 20: 91-96. [26] DeBach P. Biological control by natural enemies. Cambridge University Press. 1974. [27] DeBach P. Biological control of Insect Pest DNA Weeds. Reinhold Publishing Corp. New York. 1964. [28] DeBach P, Rosen D. Biological control by natural enemies (2nd ed.). Cambridge University Press. 1991. [29] Doutt R.The Historical development of biological control. In: Biological control of insect pests DNA weeds. New York Reinhold, p.21-42. 1964; [30] El Salamouny S., Shapiro M., Ling K. S. DNA Shepard B. M. (2009a). Black tea DNA lignin as Ultraviolet protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus. Journal of Entomological Science. 44(1): 50-58. [31] El Salamouny S., Ranwala D., Shapiro M., Shepard M. DNA Farrar R. (2009b). Tea, coffee, DNA cocoa as ultraviolet radiation protectants for the beet armyworm nucleopolyhedrovirus. Journal of Economic Entomology. 102(5): (In Press). [32] Fries, I. (2010), Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera), Journal of Invertebrate Pathology, Volume 103, Supplement 1, January, Pages S73-S79. [33] Hatakeyama, Y., H. Oda, R. Tsunoda, Y. Imura, T. Maeda, T. T. Xuan, T. V. Hai, DNA H. Iwano (2009), Infection DNA phylogenetic analyses of microsporidia isolated from the common cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) in Vietnam Journal of Jananese Society of applied Entomology & Zoogly. [34] Hidetoshi Iwano DNA Ren Ishihara, 1991. Dimorphism of Spores of Nosema bombycis spp. in Cultured Cell. Journal of Invertebrate Pathology 57, 211 - 219. 39
  49. Đồ án tốt nghiệp [35] Hidetoshi Iwano, Nobuaki Shimizu, Fuji Kawahami DNA Ren Ishihara, 1993. Spore Dimorphism DNA some other biological features of a Nosema bombycis sp. isolated from the lawn grass cutworm Spodoptera depravata Butler. Journal of appl. Entomology. Zoo. 29, 219-227. [36] Huffaker C.B., Messenger P. S. Theory DNA Practice of Biological control. Academic Press, Inc. New York, San Francisco, London. 1976. [37] Hugh Evan và Martin Shapiro (1997), “Viruses”, Manual of Techniques in Insect Pathology, Biological Techniques, p 17-53. [38] Huter - Fujita F. R., P. F. Entwiste, H. F. Evans DNA N. E. Cook (1998), “Insect virus DNA Pest Management”, Wiley, New York. [39] Iwano, H. DNA R. Ishihara (1991), Dimorphism of Spores of Nosema spp. in Cultured Cell, Journal of Invertebrate Pathology 57, pp. 211-219. 40
  50. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: HÌNH ẢNH Hình 1: Hạt giống cải bẹ xanh mỡ Hình 2: Thùng cải dùng để tiến hành thí nghiệm Hình 3: Thả sâu khoang trên lá cải 41
  51. Đồ án tốt nghiệp Hình 4: Lọ chức các chế phẩm NPV sử dụng cho thí nghiệm Hình 5: Hút chế phẩm NPV (1ml) Hình 6: Thuốc trừ sâu hóa học Sherpa 25EC 42
  52. Đồ án tốt nghiệp Hình 7: Hút Sherpa 25EC (1.5ml) Hình 8: Nhỏ Sherpa 25 EC vào nước Hình 9: Chiết dung dịch thuốc Sherpa 25EC vào bình phun 43
  53. Đồ án tốt nghiệp Hình 10: Sâu khoang chế trên lá cây cải bẹ xanh Hình 11: Sâu khoang chết trên thùng xốp PHỤ LỤC B: BẢNG BIỂU * Phân tích Statgraphic centurion ở ngày thứ 3 sau phun ANOVA Table for hieu luc by ct Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2083.61 5 416.722 4.02 0.0225 Within groups 1244.33 12 103.694 Total (Corr.) 3327.94 17 Multiple Range Tests for hieu luc by ct 44
  54. Đồ án tốt nghiệp Method: 95.0 percent LSD ct Count Mean Homogeneo us Groups NPV+ Boric acid 1% 3 0.0 X NPV+ dịch chiết trà 1% 3 0.333333 X NPV+ Ri duong 1% 3 3.33333 X NPV thuần 3 11.1667 X Sherpa 25 EC 3 11.1667 X NPV+ dịch chiết cà phê 1% 3 31.3333 X *Phân tích Statgraphic centurion ở ngày thứ 7 sau phun ANOVA Table for hl7 by ct Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12817.9 5 2563.59 7.75 0.0018 Within groups 3967.17 12 330.598 Total (Corr.) 16785.1 17 Multiple Range Tests for hl7 by ct Method: 95.0 percent LSD ct Count Mean Homogeneous Groups NPV+ Ri duong 1% 3 14.4433 X NPV+ Boric acid 1% 3 20.6467 XX NPV+ dịch chiết trà 1% 3 48.4733 XX Sherpa 25 EC 3 66.39 XX NPV thuần 3 69.3533 XX 45
  55. Đồ án tốt nghiệp NPV+ dịch chiết cà phê 1% 3 88.89 X *Phân tích Statgraphic centurion ở ngày thứ 9 sau phun ANOVA Table for hl9 by ct Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5623.83 5 1124.77 1.83 0.1809 Within groups 7366.61 12 613.884 Total (Corr.) 12990.4 17 Multiple Range Tests for hl9 by ct Method: 95.0 percent LSD ct Count Mean Homogeneous Groups NPV+ Ri duong 1% 3 52.0233 X NPV thuần 3 77.7767 XX NPV+ Boric acid 1% 3 94.7633 XX NPV+ dịch chiết trà 1% 3 100.0 X Sherpa 25 EC 3 100.0 X NPV+ dịch chiết cà phê 1% 3 100.0 X 46