Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm tôm tươi tại chợ Bà Chiểu

76 trang thiennha21 12/04/2022 4350

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm tôm tươi tại chợ Bà Chiểu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_danh_gia_cac_chi_tieu_vi_sinh_tren_san_pham_tom_tuoi_t.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm tôm tươi tại chợ Bà Chiểu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRÊN SẢN PHẨM TÔM TƯƠI TẠI CHỢ BÀ CHIỂU Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. PHẠM MINH NHỰT ThS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THÁI TRƯƠNG MSSV: 0851110258 Lớp: 08DSH3 TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay cùng với tốc độ phát triển của xã hội, đời sống của con người ngày càng được cải thiện, nhu cầu dinh dưỡng trong bữa ăn hàng ngày cũng được chú trọng hơn. Việc đòi hỏi thực phẩm cung cấp vừa bảo đảm về chất lượng, vừa an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng là một điều vô cùng thiết yếu. Tuy nhiên, trong vài năm trở lại đây, tình trạng ngộ độc thực phẩm ở nước ta đang ở mức đáng báo động. Bằng chứng là có rất nhiều vụ ngộ độc xảy ra, nguyên nhân từ việc sử dụng các loại hóa chất trong bảo quản thực phẩm, do thực phẩm bị ôi thiu dẫn đến sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và sản sinh độc tố. Bên cạnh nguồn thực phẩm truyền thống mà con người sử dụng trong bữa ăn hằng ngày như thịt heo, thịt bò, cá thì hải sản đang được con người ngày càng ưa chuộng vì có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và một trong những nguồn hải sản đó là tôm.Tuy nhiên, ngoài việc chứa nhiều chất dinh dưỡng, tôm cũng là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, đây là tác nhân chính làm hư hỏng, biến chất thực phẩm cũng như gây ra tình trạng ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng ba triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật 42,2%, do hoá chất 24,9%, do độc tố tự nhiên 25,2% [13]. Chính vì thế, việc đánh giá chất lượng của tôm trên thị trường sẽ giúp giảm tình trạng ngộ độc do loại thực phẩm này gây ra đối với người tiêu dùng. Xuất phát từ tình hình trên, được sự chấp thuận của khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kĩ Thuật Công Nghệ Tp.HCM và dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt và ThS. Nguyễn Thị Thu Hương, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm tôm tươi tại chợ Bà Chiểu”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM 2. Mục đích 1
Đồ án tốt nghiệp Tìm hiểu nguyên nhân biến chất và hư hỏng mẫu tôm, đánh giá một số chỉ tiêu vi sinh vật trên mẫu tôm tại các quầy tại chợ Bà Chiểu. 3. Mục tiêu đề tài: - Khảo sát mức độ nhiễm tồng vi sinh vật hiếu khí (TPC), Coliforms, E.Coli, và Listeria monocytogenes trên mẫu tôm tươi lấy tại 8 quầy thủy sản tại chợ Bà Chiểu. - Đề ra các biện pháp xử lí thích hợp cho các quầy tôm nói riêng và cho khu vực buôn bán thủy hải sản tại chợ Bà Chiểu nói chung. 4. Phạm vi nghiên cứu - Tiến hành lấy mẫu tôm tươi ngẫu nhiên tại 8 quầy ở chợ Bà Chiểu. - Phân tích 4 chỉ tiêu vi sinh có khả năng hiện diện trong mẫu: TPC Coliforms E. Coli Listeria monocytogenes - Đánh giá và ghi nhận kết quả dựa trên 4 chỉ tiêu phân tích. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu tổng quan về tôm [1] Tôm là đối tượng rất quan trọng trong nghành thủy sản nước ta, chiếm tỷ lệ khoảng 70 – 80% kim nghạch xuất khẩu của nghành thủy sản. Tôm có giá trị dinh dưỡng cao, tổ chức cơ, thịt rắn chắc, có mùi vị thơm ngon đặc trưng hấp dẫn. Nghề chế biến tôm đặc biệt là tôm đông lạnh rất phát triển để đáp ứng cho nhu cầu về xuất khẩu và một phần cho thực phẩm trong nước. Một số loại tôm được sử dụng phổ biến trong thực phẩm: 1.1.1. Họ tôm he [1] 1.1.1.1. Tôm sú (Penaeus monodon): là loại tôm có kich thước lớn, ngực tôm có vân ngang. Tôm sú phân bố rồng ở các đầm nước lợ hay các vùng biển có độ sâu 40m, tập trung nhiều ở độ sâu 10 – 25m. 1.1.1.2. Tôm he mùa (Penaeus merguiensis): hay còn gọi là tôm bạc, phân bố khắp nơi nhưng tập trung chủ yếu ở Nam Trung Bộ, Vũng Tàu, Rạch Giá, Vịnh Thái Lan. Thân tôm dẹt, đầu có răng cưa, đuôi dài, không có gai màu vàng nhạt phớt xanh, có nhiều đốm đen đỏ, thân màu vàng nhạt phớt xanh, tôm có chiều dài 140 – 200mm, khối lượng 25 – 80g, mùa vụ từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau, và từ tháng 5 đến tháng 9. 1.1.1.3. Tôm thẻ (Penaeus seminelcatus): còn gọi là tôm sú vằn, tôm có mảu đặc trưng xanh thẳm, có vằn ngang ở vùng bụng, râu tôm có màu vàng đỏ nhạt, phân bố ở độ sâu 60m, nhưng tập trung chủ yếu ở 30 – 40m, tập trung chủ yếu ở khu vực Trung Bộ, tập trung chủ yếu ở Phú Khanh, Nghĩa Bình, mùa vụ từ tháng 4 và tháng 7 – 9, tôm có chiều dài từ 120 – 250mm, với khối lượng từ 120 – 145g. 1.1.2. Họ tôm hùm (Homaridae) và họ tôm rồng (Palinuridae) Chưa có sự phân biệt rõ giữa 2 loài này, thường gọi chung là tôm hùm, tôm hùm có thịt thơm ngon, có giá trị kinh tế cao nhất. 1.1.2.1. Tôm hùm sao (Panulirus ornatus): còn gọi là tôm hùm bong, có kích thước lớn, chiều dài khai thác 250 – 450mm, với khối lượng 1230 – 2310g. 3
Đồ án tốt nghiệp 1.1.2.2. Tôm hùm đỏ (P. longipes): chiều dài khai thác 160 – 280mm với khối lượng 245 – 495g. 1.1.2.3. Tôm hùm sỏi (P. homarus): còn gọi là tôm hùm đá, chiều dài khai thác 165 – 350mm với khối lượng 45 – 85g. 1.1.3. Tôm càng xanh (Palaemonidae) Là đối tượng được khai thác nhiều, sinh sống ở sông ngòi, kênh rạch, đồng ao ở Nam Bộ. Tôm sống trong môi trường nước lợ và nước ngọt, mùa vụ quanh năm nhưng tập trung chủ yếu là tháng 10 – 12. Thân tôm tròn, có màu xanh lơ đậm, chùy đầu phát triển, tôm có sọc đen dài, phần dưới có màu vàng hoặc da cam. Tôm có chiều dài 110 – 200mm, và khối lượng 30 – 120g. 1.1.4. Họ tôm vỗ (Scyllaridae) Có 4 loài, trong đó loài có giá trị kinh tế khá lớn là Ibacus ciliates, tôm vỗ còn được gọi là tôm Mũ Ni. Tôm vỗ có đầu to và dẹt, thân ngắn, tôm có màu vàng xám hay đen xám, tôm vỗ là loại tôm thịt chắc thơm ngon, có giá trị kinh tế, chiều dài khai thác là 140 – 210mm với khối lượng 80 – 300g. 1.2. Thành phần hóa học của tôm [1][2] 1.2.1. Thành phần hóa học của tôm Thành phần hóa học gồm: nước, protein lipid, muối vô cơ, vitamin Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống. Thành phần hóa học ở động vật thủy sản thường khác nhau theo giống loài, trong cùng loại, nếu có hoàn cảnh sống khác nhau thì thành phần hóa học khác nhau, thành phần hóa học còn phụ thuộc vào trạng thái sinh hóa, lý hóa, giới tính, mùa vụ, thời tiết. Thành phần hóa học của tôm so với cá nói chung là nước nhiều và protit ít hơn, lượng mỡ phần lớn dưới 2% và ít thay đổi theo thời tiết. 4
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1: Thành phần hóa học của tôm [2] (theo trọng lượng tôm) Thành phần Đơn vị Tôm Protit g/ 100g 19 – 33 Lipid - 0,3 – 1,4 Nước - 76 – 79 Tro - 1,3 – 1,87 Gluxit - - Canxi mg/ 100g 29 – 50 Photpho - 33 – 67,6 Sắt - 1,2 – 5,1 Na - 11 – 127 K - 127 – 565 Bảng 1.2: Hàm lượng vitamin trong tôm he A (UI/g) B1 (mg %) B2 (mg %) PP (mg %) 360 0,01 0,11 1,7 Ngoài ra, trong thành phần hóa học của động vật thủy sản còn có một thành phần cũng không kém phần quan trọng là sắc tố - được thể hiện rõ dưới lớp da, đây là các tế bào sắc tố (chromatophore). Trong tế bào có nhiều sắc tố, màu sắc của nó khác nhau theo từng họ. Thuộc họ sắc tố mơ (lipochrome) có các màu đỏ, hồng, vàng, vàng xậm, thuộc họ sắc tố đen (lipochrome) có màu đen, tím đen, nâu đen. Trong mẫu tôm có huyết cầu màu xanh (hemocyanin). Đặc biệt khi gia nhiệt thì vỏ của tôm đều biến thành màu vàng, đỏ hay tím đỏ, sắc tố đó là astacin (C40H48O). 1.2.2. Hệ vi sinh vật ở tôm [2] 5
Đồ án tốt nghiệp Hệ vi sinh vật trên tôm cũng như cá gồm chủ yếu các vi sinh vật gây thối rữa. Trong đầu tôm thường chứa nhiều vi khuẩn Pseudononas flourescens, Clostridium sporogenes, Clostridium putrificus, Proteus vugaris Hệ vi sinh vật của tôm phụ thuộc vào điều kiện sống, điều kiện đánh bắt, vận chuyển, bảo quản và sơ chế. Hình 1.1: Mật độ vi khuẩn có trong tôm Vi khuẩn hiện diện ở loài thân mềm giống với vi khuẩn trong cá biển nhưng số lượng vi khuẩn G+ như Bacillus, Micrococcus, Enterobacteriaceae , Streptococcus chiếm số lượng lớn hơn. 1.3. Đặc điểm chung của tôm [1][2] 1.3.1. Hình dạng Nhìn từ bên ngoài, tôm gồm các bộ phận sau: Chủy: dạng như lưỡi kiếm, cứng, có răng cưa. Với tôm sú, phía trên chủy có 7- 8 răng và dưới chủy có 3 răng. Mũi khứu giác và râu: cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm 3 cặp chân hàm: lấy thức ăn và bơi lội 5 cặp chân ngực: lấy thức ăn và bò Cặp chân bụng: bơi Đuôi: có 1 cặp chân đuôi để tôm có thể nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao hay xuống thấp. Bộ phận sinh dục (nằm dưới bụng) Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái, thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài. 6
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Tỷ trọng của tôm Gần bằng tỉ trọng của nước, thay đổi tùy theo bộ phận trên cơ thể của tôm, phụ thuộc vào thân nhiệt của tôm, tôm có nhiệt đô càng nhỏ thì tỉ trọng càng nhỏ. 1.3.3. Điểm băng Là điểm ở đó nhiệt độ làm cho tôm bắt đầu đóng băng, nước trong cơ thể tôm tồn tại ở dạng dung dịch do đó điểm băng tuân theo định luật Raun. Dung dịch càng loãng đóng băng càng nhanh, điểm đóng băng của tôm gần điểm đóng băng của nước (0oC). Thông thường điểm băng của các loài tôm từ -0,6oC ÷ -2,6oC. Điểm băng của tôm tỉ lệ nghịch với pH của dung dịch trong cơ thể tôm. Áp suất thẩm thấu của động vật thủy sản nước ngọt thấp hơn nước mặn do đó điểm băng của thủy sản nước ngọt cao hơn nước mặn. 1.3.4. Yếu tố hóa học a. Trimethylamin oxyt (TMAO) TMAO là thành phần đặc trưng và quan trọng của nhóm chất chứa nitơ phi protein. Hàm lượng TMAO trong cá khác nhau tùy theo loài, điều kiện sinh sống, kích cỡ. Cá hoạt động bơi lội nhiều, kích cỡ lớn chứa nhiều TMAO hơn cá nhỏ, ít bơi lội trong nước Theo Tokunaga (1970), hàm lượng TMAO ở tôm tập trung cao nhất trong cơ thịt sẫm (vùng tối), TMAO có vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu của tôm, vì vậy giúp tôm chống lại áp suất thẩm thấu gây ra do sự chênh lệch nồng độ muối trong nước biển. b. Các axit amin tự do Các axit amin tự do chiếm khoảng 0,5-2% trọng lượng cơ thịt, chúng góp phần tạo nên mùi vị thơm ngon đặc trng của nguyên liệu. Hàm lượng axit amin tự do càng nhiều thì vi khuẩn gây hư hỏng phát triển càng nhanh và sinh ra mùi ammoniac. Các loài tôm có cơ thịt sẫm và thường vận động, có hàm lượng histidine cao. Cơ thịt sẫm chứa histidin nhiều hơn cơ thịt trắng. Trong thời gian bảo quản, histidine bị vi sinh vật khử nhóm carboxyl hình thành độc tố histamine. 7
Đồ án tốt nghiệp c. Urê Urê có phổ biến trong tất cả cơ thịt tôm, nhưng nói chung có ít hơn 0,05% trong cơ thịt. Trong quá trình bảo quản, urê phân huỷ thành NH3 và CO2 dưới tác dụng của enzym urease của vi sinh vật. Do urê hoà tan trong nước và thấm qua màng tế bào nên nó dễ được tách ra khỏi miếng phi lê. Amoniac có mùi đặc trưng (mùi khai). Trong cơ thịt của tôm tươi có một lượng nhỏ amonia, lượng amoniac thấp nhưng khi bị hư hỏng do vi sinh vật thì lượng amoniac tăng nhanh. Khi sự hư hỏng tiến triển, pH của cơ thịt chuyển sang môi trường kiềm do lượng amoniac tăng lên và tạo nên mùi ươn thối của tôm. e. Creatine Là thành phần chính của hợp chất phi protein. Cá ở trạng thái nghỉ ngơi creatine tồn tại dưới dạng mạch vòng phospho và cung cấp năng lượng. 1.4. Tác hại của vi sinh vật lên các động vật thủy sản Tác hại chủ yếu của vi sinh vật vào các động vật thủy hải sản là gây ra sự thối rửa, ươn hỏng .Khi cá bị ươn hỏng luôn có một hệ vi sinh vật tồn tại (spoilage flora). Hệ vi sinh vật gồm nhiều loại khác nhau nhưng chỉ có một số loại mới gây ra sư ươn hỏng (spoilage bacteria). Là những vi khuẩn đặc trưng gây nên sự biến mùi và vị có liên quan với sự hư hỏng. Một lượng lớn vi khuẩn trong cá ươn không có vai trò gì trong quá trình hư hỏng. Mỗi sản phẩm cá có những vi khuẩn gây hỏng đặc trưng riêng của nó và lượng vi khuẩn này (so với lượng vi khuẩn tổng số) có liên quan đến thời hạn bảo quản. * Chỉ tiêu vi sinh vật trên sản phẩm tôm (TCVN 5289 – 1992) 8
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3: Giới hạn chỉ tiêu vi sinh trên sản phẩm tôm đông lạnh xuất khẩu Chỉ tiêu vi sinh Giới hạn TSVKHK (TPC) ≤ 106 CFU/ g sản phẩm Coliform ≤ 102 CFU/ g sản phẩm Staphylococcus 1*102 CFU/ g sản phẩm Samonella Không cho phép E.Coli 1*102 CFU/ g sản phẩm Vibrio paraheamolyticus 1*102 CFU/ g sản phẩm 1.5. Một số dạng hư hỏng ở tôm [2] 1.5.1. Sự biến đỏ của tôm Khi tôm bị ươn, thối bao giờ cũng kèm theo sự biến đỏ. Biến đỏ cũng xảy ra khi tôm bị gia nhiệt hay bảo quản trong môi trường axit. Cơ chế của sự biến đỏ được giải thích như sau: tôm tươi trong vỏ và thịt chứa chất astaxanthin có màu xanh tím, bình thường astaxanthin kết hợp với protein tạo thành phức bền nhưng dưới tác dụng của nhiệt, axit, sự phân huỷ của thịt tôm làm cho astaxanthin bị tách ra khỏi protein. Astaxnthin sẽ bị oxi hoá tạo thành astaxin có màu đỏ gạch. Cơ chế của quá trình thối rửa: Protein peptone axit amin ammoniac, sunfuahydro, indol, cadaverin, mercaptal 1.5.2. Sự biến đen của tôm Hiện tượng biến đen của tôm do hai nguyên nhân khác nhau. Thứ nhất là do vi khuẩn phát triển mạnh trên tôm sau khi đánh bắt tạo thành các khuẩn lạc màu đen. Thứ hai là do triozin bị oxi hoá tạo thành melanin, sự tích tụ melanin làm cho tôm có màu đen. Sự biến đen của tôm chỉ làm giảm giá trị cảm quan còn chất lượng dinh dưỡng vẫn đảm bảo. 1.6. Các phương pháp bảo quản [2] 1.6.1. Bảo quản ở nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp có tác dụng kìm hãm hoạt động của vi sinh vật. Mức độ ức chế tùy thuộc vào loài vi sinh vật .Đa số vi sinh vật ngừng phát triển ở nhiệt độ lạnh, 9
Đồ án tốt nghiệp khô nhưng vẫn có một số vẫn có thể phát triển chung quanh 0oC thậm chí phát triển chậm ở nhiệt độ -6oC đến -10oC (Micrococcus cereus). Song từ 0oC tuy vi sinh vật có thể phát triển nhưng khả năng phân giải các chất đạm, chết béo là rất ít. Vì thế mà bảo quản ở nhiệt độ thấp đươc sử dụng rất nhiều trong việc bảo quản thủy hải sản. Có hai phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp đó là ướp lạnh và lạnh đông . Tùy vào thời gian bào quản và loại hải sản nào mà ta lựa chọn phương pháp cho phù hợp. 1.6.2. Ướp lạnh Là quá trình làm ức chế các quá trình hoạt động của enzyme và các vi sinh vật gây thối. Ướp lạnh không làm ngừng quá trình phân huỷ cá mà chỉ làm quá trình này chậm lại. Trong khi ướp thân nhiệt của các động vật thủy sản chưa đến điểm đóng băng của dịch tế bào. Đây cũng là điểm khác nhau cơ bản giữa phương pháp ướp lạnh và phương pháp đông lạnh. Do phưng pháp này chỉ bảo quản được trong thời gian ngắn nên sản phẩm thường gặp của phương pháp này là các loài thủy sản ướp lạnh sao khi đánh bắt như cá ướp lạnh, tôm ướp lạnh Phương pháp này thường sử dụng nước đá kết hợp thêm một số hóa chất ở những tỉ lệ thích hợp. 1.6.3. Lạnh đông Mục đích của quá trình lạnh đông thủy sản là hạ nhiệt độ xuống thấp. Vì vậy làm chậm lại sự ươn hỏng và sản phẩm hầu như không bị thay đổi tính chất ban đầu của nguyên liệu tươi. Nhiệt độ bảo quản của phương pháp này thường -18oC trở. 1.6.4. Bảo quản ở trạng thái khô Vi sinh vật thường phát triển được khi môi trường có ẩm độ nhất định, độ ẩm tới hạn cho sinh trưởng của vi khuẩn là 30%, nấm mốc là 15%. Khi môi trường có ẩm độ thấp hơn ngưỡng này thì chúng không thể phát triển được. Vì vậy để hạn chế vi sinh vật phát triển hư hại cho thủy hải sản trong quá trình bảo quản người ta thường sấy khô thủy hài sản đi . Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm đươc bảo quản theo phương pháp này như cá khô, tôm khô, mực khô . Hiện nay người ta dùng phương pháp sấy chân không ở nhiệt độ thấp, sản phẩm sấy sẽ không 10
Đồ án tốt nghiệp bị thay đổi màu sắc, giữ nguyên giá trị dinh dưỡng, vitamin và khoáng chất được ổn định. Tuy nhiên trong quá trình ấy khô cũng không thể tiêu diệt tất cả các tế bào vi sinh vật , nhất là các bào tử vi khuẩn và nấm mốc rất bền với trạng thái khô hạn. 1.7. Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong sản phẩm tôm tươi [3][6] 1.7.1. Salmonella sp Hình 1.2: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn 1.7.1.1. Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella sp 1.7.1.2. Đặc điểm [3][5] Salmonella là trực khuẩn Gram âm. Hầu hết các loài Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vậy có khả năng di động, không sinh bào tử. Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – 3µm. Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, thích hợp ở 370C, pH tối ưu 7,2 - 7,6. Đặc điểm sinh hóa: Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP 11
Đồ án tốt nghiệp âm tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính) Lên men sinh hơi các đường glucose, manit, sorbitol, lên men không đều sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose (Tô Minh Châu và Trần Bích Liên, 1999). 1.7.1.3. Yếu tố độc lực [4][5][6] Có hai loại độc tố là nội độc tố và ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại là LT và ST. Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase trong tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), c- - - + AMP sẽ kích thích tiết Cl và HCO3 ra khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na vào bên trong tế bào. Hậu quả tích nước trong ống ruột dẫn đến tiêu chảy. Độc tố ST bền với nhiệt, cơ chế tác động tương tự như LT. ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) ở trong tế bào dẫn tới hiện tượng tiêu chảy. 1.7.1.4. Khả năng gây bệnh [6] Salmonella xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng và hầu hết là do ăn phải thức ăn bị nhiễm như thực phẩm, sữa, nước uống . Sau khi xuyên qua hàng rào acid dạ dày, vi khuẩn di động về phía ruột non và sinh sản ở đó, tiếp tục chui qua 1 màng nhày và vào thành ruột Salmonella nhiễm vào cơ thể từ hai nguồn: từ phân người hoặc động vật, từ người bệnh. Trong đó phải kể đến tác động của động vật lông vũ, trứng và phân của chúng đã làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng hơn. Ngoài ra chuột, mèo, ruồi cũng là tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi hơn khi phân của chúng nhiễm vào các thực phẩm không được bảo quản kỹ. Trong quá trình giết mổ củng cần đề phòng sự nhiễm Salmonella nếu không thực hiện đúng quy trình an toàn thực phẩm.  Bệnh thương hàn 12
Đồ án tốt nghiệp Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi, sau đó đến S. paratyphi A, còn S. paratyphi B và S. paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người này sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào cơ thể qua đường tiêu hóa đến ruột non thì chui qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đó chúng nhân lên và một phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng ra nội độc tố, nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, gây thương tổn, xuất huyết tiêu hóa, có thể gây thủng ruột.  Các bệnh khác Các bệnh không phải thương hàn do Salmonella gây ra thường là một nhiễm trùng giới hạn ở ống tiêu hóa trong các trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà Salmonella typhimurium là tác nhân hay gặp nhất, sau đó là Salmonella enteritidis Nhiễm trùng nhiễm độc do Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 giờ, bệnh biểu hiện có sốt, nôn, tiêu chảy, bệnh khỏi sau 2 - 5 ngày, không có biến chứng. 1.7.2. Escherichia Coli [3][5] Hình 1.3: Escherichia Coli 1.7.2.1. Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae 13
Đồ án tốt nghiệp Chi: Escherichia Loài: E. Coli 1.7.2.2. Đặc điểm  Hình thái và đặc điểm nuôi cấy E.coli là trực khuẩn Gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng E.coli có vỏ polysaccharide, không sinh bào tử. E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. Thường sống trong ruột già của người và động vật và theo phân đi ra ngoài. Đây là những vi sinh vật có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 500C. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH tối ưu là 4,4, phát triển mạnh trong môi trường Mac Conkey, EMB. Trên môi trường EMB, E. coli cho khuẩn lạc có màu ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng lớn hơn 0,5µm. Trong môi trường lỏng, E. coli làm đổi màu môi trường, sinh hơi hoặc làm đục môi trường.  Đặc tính sinh hóa E.coli lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi như: Glucose, lactose, ramnose; khử nitrat thành nitric, gây nhầy nhớt hư hỏng thực phẩm, indol dương tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính, H2S âm tính. 1.7.2.3. Yếu tố độc lực  Nhóm STEC STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.  Nhóm EPEC Các yếu tố độc lực chính bao gồm gen eae mã hóa protein itimin cần thiết cho việc tạo ra tổn thương dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP ( 14
Đồ án tốt nghiệp bundle – forming pilus ), PER ( plasmid – encoded regulator ) và Ler ( LEE – encorded regulator). Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP (mitochondria – associated protein), EAST – 1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô và CDT ( Cytolethan distending toxin )  Nhóm ETEC Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF).  Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC gồm những E. Coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường ruột là ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường ruột LT và ST. E.Coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc có thể tiết cả LT và ST. . Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E.Coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin - CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào. . Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Sta (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác như Yersinia enterocolitica và V. cholerae non – O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa. Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC. 15
Đồ án tốt nghiệp  Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF). Gen của CFA thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa cho độc tố ST và/hoặc LT.  Nhóm EAEC Những yếu tố độc lực chính của EAEC bao gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST – 1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1). AFF được xem là yếu tố quyết định độc lực.  Nhóm EYIC EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140 MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa : Invasion plasmid antigen). EIEC còn có khả năng sản xuất độc ruột giống một số Shigella. Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin), cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào và xâm lấn sang các tế bào khác. 1.7.2.3. Khả năng gây bệnh Khả năng gây bệnh rất đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu, với cơ thể yếu thì gây nhiễm khuẩn máu, gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, gây tiêu chảy. - Bệnh tiêu chảy do E.coli - Các nhiễm khuẩn khác do E.coli E. coli có thể gây nên nhiễm khuẩn đường tiết niệu: sự ứ động nước tiểu do sỏi, thai nghén tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu dễ xảy ra . Mặt khác, khi thông niệu đạo, người ta có thể gây ra nhiễm khuẩn ngược dòng. 16
Đồ án tốt nghiệp E. coli có thể gây ra nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn gan mật, viêm màng não ở trẻ còn bú, nhiễm khuẩn huyết 1.7.3. Giới thiệu về Listeria monocytogenes [3][4][5][7] 1.7.3.1. Lịch sử phát hiện L. monocytogenes lần đầu tiên được mô tả bởi E.G.D Murray vào năm 1926 dựa trên sáu trường hợp đột tử ở trẻ. Murray giới thiệu Vi khuẩn monocytogenes trước khi JH Harvey Pirie thay đổi tên chi là Listeria năm 1940. Mãi cho đến năm 1981 L. monocytogenes được xác định là một nguyên nhân gây bệnh từ thực phẩm. Listeria được xem là vấn đề nghiêm trọng nhiễm vào các sản phẩm thịt và thịt gia cầm vào những năm 1980. Năm 1999, loài L. monocytogenes đặc biệt cực độc đã tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề. Năm 2006, trong một nỗ lực bảo vệ cộng đồng, Cơ quan lương thực và dược phẩm FDA phê chuẩn tán thành việc sử dụng thuốc xịt khử trùng giúp giảm nhiễm khuẩn các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn. Thuốc phun bao gồm 1 hỗn hợp gồm 6 loại virus vô hại diệt khuẩn L. monocytogenes. 1.7.3.2. Phân loại Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học của Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Listeriaceae Giống: Listeriaceae Lúc đầu Listeria chỉ được biết đến với một hay hai loài chủ yếu là Listeria monocytogenes, về sau thì xác định được 6 loài gồm: Listeria monocytogenes 17
Đồ án tốt nghiệp Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria ivanovii Listeria grayi Listeria welshimeri Đến nay chỉ có loài L. monocytogenes cho thấy là tác nhân chính gây bệnh cho người và động vật, khi đó L. invanovii chi gây bệnh cho động vật đặc biệt là thú. 1.7.3.3. Đặc điểm Hình 1.4: L. monocytogenes. Đặc điểm chung L. monocytogenes là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi phát triển ở nhiệt độ từ 1 - 45oC, không tạo bào tử nhưng có chuyển động điển hình khi được cấy ở nhiệt độ 20 - 25oC và có thể phát triển trong tế bào . Là vi khuẩn hình que mảnh, chiều ngang khoảng 0,5µm, chiều dài khoảng 1- 2µm. Phản ứng catalase dương tính, sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào. Vi khuẩn này có thể tồn tại ở pH rộng từ 4,3 - 9,6. 18
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.5: Tế bào vi khuẩn L. monocytogenes Gram (+) Vi khuẩn L. monocytogenes sống rất dai và khác với đa số vi khuẩn khác L. monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C. Hiện nay các nhà khoa học cho rằng con đường nhiễm L. monocytogenes phổ biến nhất là qua thực phẩm. Đặc điểm sinh hóa Tùy từng loài hay từng kiểu huyết thanh mà Listeria. spp có các biểu hiện sinh hóa khác nhau. Đặc điểm sinh hóa chung của Listeria. spp được thể hiện như sau. Bảng 1.4: Đặc điểm sinh hóa của một số loài Listeria Loài Acid sản sinh từ Độc -Hemolysis1 Manitol Rhamnose Xylose tính2 L. monocytogenes + - + - + 3 L. ivanovii + - - + + L. innocua - - V4 - - L. welshimeri - - V4 + - L. seeligeri + - - + - 5 L. grayi - + V4 - - (1) Thử nghiệm trên môi trường thạch máu cừu. (2) Thử nghiệm trên chuột. (3) Những chủng lên men ribose được phân thành L. ivanovii subsp. Invanovii và không lên men như L. ivanovii. Lomdiniesis. V4: biotypes thay đổi 19
Đồ án tốt nghiệp (5) Bao gồm hai loài phụ L. grayi. Murrayi biến đổi nitrate và L. gayi subsp. Grayi không biến đổi nitrate 1.7.3.4. Cấu trúc Lông Nhân Ribosomes Tiên mao Màng tế Vỏ tế Bao vỏ bào bào Hình 1.6: Cấu tạo tế bào L. monocytogenes. 1.7.4.5. Yếu tố độc lực Phần lớn tổ hợp gen này tham gia trong việc xâm nhập vào tế bào chủ và tiến hành chu kỳ xâm nhiễm bên trong các tế bào của tác nhân gây bệnh. Tổ hợp này mã hóa bao gồm 6 gen plcB, hly, mpl, actA, plcB, prfA và có 3 khung đọc mở X, Y, Z. Bảng 1.5: Chức năng của các gen trong hoạt động tạo độc tố của L. monocytogenes. [5][7] Gen Chức năng Hoạt hóa cho quá trình lây lan tronh tế prfA Positive regulotory factor A bào chủ của vi khuẩn. Phosphatidylinositol-specific Dung giải màng không bào của thể thực plcA phopholipase C bào. Phosphatidylcholine-specific Dung giải màng không bào của thể thực plcB phospholipase C bào. 20
Đồ án tốt nghiệp hlyA Listeriolysin O Giải phóng vi khuẩn ra khỏi không bào. Tham gia trong quá trình hoạt động của Mpl Zinc-dependent metalloprotease plcB. Giúp lây nhiễm từ tế bào này sang tế bào actA Actin-polymerizing protein khác. inlA Internalin A Nội bộ hóa tế bào chủ. inlB Internalin B Nội bộ hóa tế bào chủ. 1.7.3.6. Con đường xâm nhiễm Sự xâm nhiễm của L. monocytogenes được mô tả theo các bước nhất định sau: Sự xâm nhiễm và tiếp thu mầm bệnh Thoát khỏi thể thực bào của không bào Nhân lên trong tế bào chất của vật chủ Định hướng di chuyển trong tế bào chất 1.7.3.7. Khả năng gây bệnh Trên người Thông thường đối với người khỏe mạnh, sự tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm là nguyên nhân gây ra viêm dạ dày – ruột, triệu chứng sốt. Trái lại, L. monocytogenes là tác nhân gây chết đặc biệt là ở trẻ em dưới 1 tháng tuổi, phụ nữ mang thai, những người nhận mô cấy ghép và những bệnh nhân có hệ miễn dịch kém. Trên động vật Trong số các động vật, bệnh do listeria tác động chuyên biệt trên gia súc, cừu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2 đến 6 tuần. Động vật bị nhiễm Listeria khi ăn phải thức ăn nhiễm, qua đường hô hấp hoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xảy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự đông đúc, sự vận chuyển, điều kiện môi trường kém). Động vật bị nhiễm bệnh do listeria thường sốt, biếng ăn, suy nhược và mất phương hướng 1.7.4. Giới thiệu về Vibrio Spp. [3][4][5][8][9][11][15] 1.7.4.1. Lịch sử phát hiện Vibrio Spp. 21
Đồ án tốt nghiệp Năm 1883, Robert Koch, một bác sĩ người Đức, là người đầu tiên đã phát hiện ra sự tồn tại của Vibrio Spp. Năm 1854, nhà khoa học Ý Pacini đã phát hiện ra Vibrio chorelae khi dịch tả tấn công thành Florence. Vibrio parahaemolyticus: được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hào Người ta đã xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus. Hình 1.7: V.parahaemolyticus, V.cholerae, V.vulnificus 1.7.4.5. Yếu tố độc lực [8][9][11][14] Vibrio cholerae sản xuất nhiều loại độc tố tác động với adenylate cyclase trong tế bào ruột và với nhiều thành phần của hệ thống điều hành ruột, bao gồm những tế bào thần kinh ruột và những tế bào Enterochromaffin (EC), để tạo ra tình trạng bài tiết và tiêu chảy với lượng lớn. Bên cạnh độc tố dịch tả (cholera toxin), vi khuẩn tả còn sản xuất zonula occludens toxin (ZOT), độc tố này làm tăng sự thẫm thấu qua chỗ nối chặt chẽ giữa 2 tế bào ruột, và độc tố phụ (ACE: assessor cholera enterotoxin), chưa có rõ phận sự trên những tế bào ruột. Độc tố cholerae toxin là một phức hợp protein do phẩy khuẩn Vibrio cholerae tiết ra. Ảnh hưởng của độc tố phụ thuộc vào một thụ quan đặc biệt có tên monosialosyl ganglioside (GM1 ganglioside) có trên bề mặt các tế bào niêm mạc. Phẩy khuẩn sản xuất men tan nhầy và chất giúp nó xâm nhập vào tế bào đồng thời tác động làm ganglioside chuyển thành monosialosyl có thể nhận độc tố. 22
Đồ án tốt nghiệp ToxR là một protein điều hoà thực hiện chức năng "khơi mào" hệ thống điều khiển. ToxR cũng được cho là tương tác với ToxS để thực hiện chức năng nhận biết các thay đổi của yếu tố môi trường và chuyển các tín hiệu (ở mức phân tử) đến nhiễm sắc thể dẫn đến quá trình sao mã của các gene giúp vi khuẩn gắn kết với màng tế bào và sản xuất độc tố. 1.7.4.6. Triệu chứng Trên người: - Thời kì đầu: Người bị bệnh sẽ thấy tiêu chảy nhiều lần. - Thời kì toàn phát: Triệu chứng lâm sàng. Người bị bệnh tiêu chảy nhiều lần, phân nước màu trắng, nôn dễ dàng, mệt mỏi, khát, nhịp tim nhanh, hạ thân nhiệt, mất nước nghiêm trọng, không chữa trị, khả năng tử vong lến đến 50 – 70%. Trên tôm: Tôm bị nhiễm Vibrio spp ở trạng thái không bình thường, hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, tôm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lòng vòng. Vỏ tôm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ. Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tôm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh. 1.7.5. Coliforms [3][4][5][7] 1.7.5.1. Giới thiệu Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. 1.7.5.2 Nguồn gốc 23
Đồ án tốt nghiệp Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân người. (Gedreich 978). Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchison và Ridgway 1977). Đầu thập niên 1900 ( Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham ( Durham năm 1983) thì khái niệm về vi khuẩn Coliforms và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901. Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978). Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMViC (Indole, Methyl đỏ, Voges-Proskauer và muối của acid Citric). 1.7.5.3. Đặc điểm Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy,1991). Chúng thường có 24
Đồ án tốt nghiệp mặt trong đường ruột động vật có vú. ( ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất trên cơ thể người). Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter freundii có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường ( nước giàu chất dinh dưỡng, đất và động vật) cũng như trơn nước uống có nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối cao. Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45oC , nó bao gồm Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Enterobacter Citrobacter Klebsiella Hình 1.8: Coliforms chịu nhiệt lên men đường lactose 1.7.5.4. Hiện diện Vi khuẩn Coliforms hiện diện khắp nơi, kể cả trong đất, da, thực phẩm, nước sông, ao hồ, rau cải Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết của nước hay rau. Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy. Vì vi khuẩn Coliforms vẫn có khả năng sống sót trong nước uống. Sự hiện diện của Coliforms trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân. Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất. 25
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6: Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm [4][5] Giới hạn cho phép CFU/g hay Thực phẩm CFU/ml thực phẩm Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích 50 Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực 102 Thủy sản khô sơ chế: cá khô 102 Trứng 102 Sản phẩm từ trứng 10 Sữa 10 Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước 103 khi dùng ( bột, miếng, mì), dùng trực Nước giải khát không cồn 10 1.8. Kim ngạch xuất khẩu tôm trên Thế giới và Việt Nam [2] 1.8.1. Trên thế giới Bảng 1.7: Sản lượng tôm toàn cầu từ 2007 – 2011 SẢN LƯỢNG TÔM HÀNG NĂM TRÊN THẾ GIỚI Châu Á 2007 2008 2009 2010 2011 Trung 1,265,636 1,286,074 1,181,130 899,600 962,000 Quốc Thái Lan 504,856 507,500 541,994 548,800 553,200 Việt Nam 376,700 381,300 302,400 357,700 403,600 Indonesia 330,155 408,346 299,050 333,860 390,631 Ấn Độ 107,665 86,600 76,261 94,190 107,737 Bangldesh 63,600 67,197 105,000 110,000 115,000 Tổng châu 2,648,612 2,719,017 2,505,835 2,344,150 2,532,168 Á 26
Đồ án tốt nghiệp Châu Mỹ 2007 2008 2009 2010 2011 Latin Ecuador 150,000 150,000 140,000 145,000 148,000 Mexico 111,787 130,201 130,000 91,500 120,000 Brazil 65,000 65,000 65,000 72,000 82,000 Colombia 20,300 20,300 20,016 16,500 15,000 Tổng châu Mỹ 391,078 408,089 393,016 376,300 402,000 Latin Tổng 3,039,690 3,127,106 2,898,851 2,720,450 2,934,168 *Đơn vị: tấn, không bao gồm tôm panđan nước ngọt 1.11.2. Ở Việt Nam [1][2] Năm 2011, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn vào các thị trường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và EU. Năm 2010, giá trị XK tôm sang 3 thị trường này chiếm trên 71% tổng giá trị XK tôm cả nước. Sang năm 2011, tỷ trọng này giảm xuống còn 66%. Trong khi đó, XK sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, ASEAN và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh. XK tôm sang Nga tăng 124% so với năm 2010, sang Hàn Quốc tăng 23%, sang ASEAN tăng 54,7%. Giá trung bình tôm XK hàng tháng của Việt Nam năm nay đạt 9,2 – 9,9 USD/kg, cao hơn khoảng 12-18%, có thời điểm cao hơn 28% so với năm trước. Hầu hết các loại tôm XK đều có giá tăng. Tôm sú vẫn chiếm vị trí chủ đạo trong cơ cấu XK tôm của Việt Nam trong năm 2011. Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là mặt hàng tôm sú sống/tươi/đông lạnh (thuộc mã 030613). Tỷ trọng của tôm chân trắng trong tổng X K tôm đã lên tới 29%, so với 26% năm 2010. Tỷ trọng nhóm hàng XK tôm đã qua chế biến đang có xu hướng tăng. Năm 2010, giá trị XK tôm sống/tươi/đông lạnh chiếm gần 76% tổng giá trị XK. 27
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 2.1.1. Thời gian Thời gian bắt đầu thực hiện: Từ ngày 02/04/2012 đến ngày 28/07/2012 2.1.2. Địa điểm 2.1.2.1. Địa điểm thu mẫu Khu vực: chợ Bà Chiểu, Bạch Đằng, P.1, Q. Bình Thạnh, TpHCM. 2.1.2.2. Địa điểm phân tích Phòng thí nghiệm Vi sinh – Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Kĩ Thuật Công Nghệ TpHCM. KHU VỰC CHỢ TỰ PHÁT 4 M GIA M KHU VỰC THỦY HẢI SẢN X Ẩ X N PH N Ả NG X 2 3 S N, Ụ Ả D I S Ả , NHÀ DÂN 1 X 6 H Ợ X C Ự CH 7 X C Ự 5 KHU V 8 KHU V KHU VỰC KHU VỰC HÀNG HÓA, THỰC PHẨM HẰNG NGÀY, CÁC MUA BÁN SẢN PHẨM KHÔ, THỊT, VÀ GIA CẦM TRÁI CÂY TƯƠI Chú Thích: Buôn bán sản phẩm thủy hài sản (cá, tôm, mực) : Buôn bán sản phẩm thủy sản, chủ yếu là cá tươi X : : Buôn bán sản phẩm đặc thù (các loại tôm tươi) Hình 2.1: Sơ đồ lấy mẫu 28
Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu 2.2.1. Hóa chất – môi trườngnuôi cấy - Plate Count Agar (PCA) (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Tryptone Soya Agar (TSA) (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Endo Agar (MERCK – Đức) - Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Eosine Methylene Blue Agar (EMB) (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Canh trypton (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Canh MR-VP (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Thạch Simmon citrate Agar (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Thuốc khử Kovac’s (MERCK – Đức) - Thuốc khử Methyl Red (MERCK – Đức) - Thuốc khử α- naphtol 5% (MERCK – Đức) - KOH 40% (MERCK – Đức) - Môi trường Oxford Agar (MERCK – Đức) - Môi trường thạch máu. - Dịch đường lên men (M130), cho các thử nghiệm 0,5% dextrose, esculin, maltose, rhamnose, mannitol, và xylose. - Môi trường TSYEB, SIM Agar (MERCK – Đức) - Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - Bộ thuốc nhuộm Gram. (TITAN BIOTECH - Ấn Độ) - NaCl 0,85% ( Trung Quốc) - Cồn 70o, 960 2.2.2. Dụng cụ - Ống nghiệm - Đĩa Petri vô trùng - Cân điện tử - Bình tam giác 29
Đồ án tốt nghiệp - Bình định mức - Cốc thủy tinh - Kéo - Đũa thủy tinh - Túi nilon vô khuẩn - Đèn cồn - Que cấy - Bình chứa môi trường - Bông - Pipetman 2.2.3. Thiết bị - Autoclave - Tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy - Bếp từ, bếp đun - Tủ ấm 30oC, 37oC - Bể ổn nhiệt 2.3. Phương pháp nghiên cứu[3][4][7] 2.3.1. Phương pháp đánh giá cảm quan (TCVN 5277 – 90) - Xác định dạng bên ngoài và trạng thái cơ lý của sản phẩm Xác định độ nguyên vẹn về các khuyết tật về dạng bên ngoài của sản phẩm tươi theo qui định trong các tiêu chuẩn yêu cầu kĩ thuật về mức độ dập nát, tróc vẫy, gãy vây, bong vỏ Xác định mức độ cứng, đàn hồi của sản phẩm bằng cách ấn ngón tay lên sản phẩm và quan sát sự biến đổi của vết lõm dùng tay bóp sản phẩm để xác định mức độ cứng thân. - Xác định màu sắc Quan sát màu sắc chung của sản phẩm và các bộ phận có liên quan đến độ tươi như mắt, mang Xác định các khuyết tật hoặc biến màu theo yêu cầu cụ thể 30
Đồ án tốt nghiệp trong các tiêu chuẩn yêu cầu kĩ thuật (Khi cần xác định màu sắc trước và sau khi luộc chín). - Xác định mùi Có thể ngửi trực tiếp để xác định mùi của sản phẩm, có thể làm tăng mùi bằng cách dùng thanh tre nhọn đâm sâu vào phần thịt của sản phẩm và rút ra để ngửi hoặc cắt một mẫu sản phẩm nhúng vào nước sôi rồi lấy ra ngửi qua hơi nước bay lên. - Xác định vị: xác định vị sau khi đã nấu chín 2.3.2. Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu 2.3.2.1. Thu mẫu và xử lí mẫu tôm Mẫu tôm được lấy từ 8 quầy thủy sản tại chợ Bà Chiểu (4 mẫu/quầy), mẫu được cho vào túi PE và được vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Đầu tiên, làm sạch tất cả các mẫu bằng nước, sau đó dùng kéo cắt những bộ phận không cần thiết của tôm như: râu, đuôi (tất cả các thao tác phải sử dụng găng tay). Cho các mẫu tôm đã được xử lí vào các túi PE vô trùng, kí hiệu chính xác từng mẫu. 2.3.2.2. Phương pháp chuẫn bị mẫu [3][4][7][10]  Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. Kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau: Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất. Các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sốc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được 31
Đồ án tốt nghiệp Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp. Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm, thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng NaCl ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này chúng tôi làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn. Pha loãng Mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Độ pha loãng 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Hình 2.2: Cách thức pha loãng mẫu  Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích, việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng, có thể đồng nhất mẫu bằng tay (nếu không có đủ điều kiện). 32
Đồ án tốt nghiệp Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g 2.3.3. Phương pháp định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) [3][4][7][10] 2.3.3.1 Phương pháp đổ đĩa  Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản.  Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy, các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ. 2.3.3.2. Quy trình phân tích 33
Đồ án tốt nghiệp Cân 25g mẫu và 225ml môi trường NACl 0,85% đồng nhất được độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, -4 10 . Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ Chọn các đĩaHình có s2.3ố khu: Quyẩn ltrìnhạc trong phân kho tíchảng TPC25-250 để đếm Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu Hình 2.3: Quy trình phân tích TPC 2.3.3.3. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường NaCl 0,85% đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất bằng tay trong 1 phút. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3.  Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp 34
Đồ án tốt nghiệp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ. Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm Hút 1ml mẫu từ Đỗ khoảng ống nghiệm 10 – 15ml PCA Đĩa Petri vô trùng Xoay đĩa ngược chiều kim đồng hồ từ 2 – 3 vòng Lật ngược đĩa, ủ 30oC – 48h Hình 2.4: Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí  Ghi kết quả - Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: > 2,5x107 CFU/g - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: < 2,5x102 CFU/g - Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc  Công thức tính kết quả: N A (cfu/g) n V f n V f 1 1 1 i i i Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml 35
Đồ án tốt nghiệp mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng Bảng 2.1: Ghi nhận kết quả sau khi đếm khuẩn lạc TPC TPC M1 M2 M3 M4 10-2 10-3 10-4 N A(CFU/g) 2.3.4. Phương pháp định lượng Coliforms tổng số bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [3][4][7][10] 2.3.4.1. Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. 2.3.4.2. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp có chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ 37oC sau 24- 48 giờ. Ngoài lactose môi trường chọn lọc cho coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương. Trên môi trường này khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đường kính > 0,5cm xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL Để phát hiện được bộ phận tế bào bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không phát triển được trong môi trường chọn lọc, do đó trước tiên mẫu phải được cấy vào môi trường tăng sinh không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.3.4.3. Qui trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường NaCL 0,85% đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã khử trùng Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ Đỗ khoảng 15ml môi trường Endo Agar đã đun tan và làm nguội 45oC Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. Hình 2.5: Quy trình phân tích Coliforms 2.3.4.4. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu. 37
Đồ án tốt nghiệp Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml NaCl đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.  Cấy mẫu. Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa, đỗ thêm 10 - 15ml môi trường Endo Agar (môi trường Endo dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguội 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằn chọn lọc vi khuẩn coliforms. Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm Mẫu đã pha 1ml loãng -1 10 Phục hồi vi o 5ml TSA ở 45 C sinh vật Chọn lọc khuẩn Endo Agar 10ml lạc ở 45oC Coliform Hình 2.6: Phương pháp xác định Coliforms  Thử nghiệm khẳng định. 38
Đồ án tốt nghiệp Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R. Tỷ lệ xác nhận R = (số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số ống BGBl thử nghiệm)  Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi. Công thức tính Tổng số coliforms (cfu/g). N C R n Vf Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: Tổng số khuẩn lạc đếm được. V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: Độ pha loãng tương ứng. R: Tỷ lệ xác nhận R = (Số KL sinh hơi trong BGBL) / (Tổng số ống BGBL). Ghi nhận kết quả: Tổng số coliforms phát hiện trong 25g mẫu. * Bảng ghi kết quả Bảng 2.2: Ghi nhận kết quả sau khi đếm khuẩn lạc Coliforms LẦN 1 Mẫu Coliforms (CFU/g) Qn 2.3.5. Phương pháp định tính E.Coli trong thực phẩm [3][4][7][10] 2.3.5.1. Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm , đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm 2.3.5.2. Nguyên tắc 39
Đồ án tốt nghiệp Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC). 2.3.5.3. Qui trình thực hiện Cân 25g mẫu + 225ml môi Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml trường NaCl 0,85%, đồng nhất môi trường BGBL mẫu trong 30 giây Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính o Ủ ở 37 ± 0,5 C trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa: Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Indol Methyl Red VP Citratase (+) (+) (-) (-) Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Hình 2.7: Sơ đồ phân lập và định danh E.Coli [3][4][7][10] 40
Đồ án tốt nghiệp 2.3.5.4. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị mẫu. Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường NaCl 0,85% đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.  Cấy mẫu. Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc E.coli, khuẩn lạc màu tím, ánh kim bờ tròn đều, đường kính khoảng 0.5mm. Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc.  Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMVIC. Thực hiện như sau. Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac. Phản ứng dương(+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt 3m dung dịch 1-α napthol 5% trong cồn bổ sung them 3ml dung dịch KOH 40 % hay NaOH 40 %. Quan sát phản 41
Đồ án tốt nghiệp ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu. Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu. Bảng 2.3: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges Prokauer - 4 Khả năng sử dung citrate -  Ghi kết quả Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu 2.3.6. Phân lập và định danh Listeria monocytogenes [12][13][15][16] 2.3.6.1. Ý nghĩa Là phương pháp đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật trên các sản phẫm thủy sản và thực phẩm, có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm nguy cơ nhiễm Listeria monocytogenes trên các sản phẩm thực phẩm hằng ngày. 2.3.6.2. Nguyên tắc  Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc. Cấy phần mẫu thử vào môi trường chọn lọc và nuôi ấm ở 30oC trong 48h.  Phân lập và nhận dạng sơ bộ Cấy từ mẫu thử trong môi trường tăng sinh và môi trường phân lập, nuôi ấm ở 37oC và sau 48h, kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc được coi là Listeria spp theo dáng vẻ bên ngoài (tròn, lồi).  Khẳng định. Cấy truyền các khuẩn lạc Listeria spp giả định lên một môi trường đặc không chọn lọc, và khẳng định bằng các hình thức thử nghiệm sinh hóa lý. 42
Đồ án tốt nghiệp Cân 25g mẫu 225ml môi trường NaCl 0,85%, đồng nhất mẫu trong 30 giây Nuôi ấm ở 30oC – 48h Ống mẫu 0,1ml Dùng que cấy vòng, lấy ít sinh khối, cấy ria trên môi trường thạch Oxford Nuôi ấm ở 37oC – 24h 43
Đồ án tốt nghiệp Cấy vào môi trường TSYEA Oxford Nuôi ấm ở 37oC – 24h Các phép thử sinh hóa TSYEA TSYEB Thạch Xylose và CAMP máu Rhammnos e 25oC 24h 37oC 37oC 24h 24h Catalse Gram Di động Gây tan (+) 37oC 24h huyết β- (+) (+), xoắn que, hemolyse mảnh Ghi nhận kết quả Hình 2.8: Sơ đồ phân lập và định danh Listeria monocytogenes [12][13] 2.3.6.3. Thuyết minh qui trình [10][12][13]  Chuẩn bị mẫu (tương tự đối với E.Coli) 44
Đồ án tốt nghiệp Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu cho vào bao nilong vô khuẩn. Thêm vào 225ml môi trường NaCl 0,85% hay nước Peptone đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1.  Cấy mẫu. Phân lập: dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối, sau đó ria cấy đều trên bề mặt thạch Oxford sau khi đã đông lại, có thể cấy 2 – 3 chiều, mục đích nhằm để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ ràng. Lật ngược đĩa, sau đó đem ủ ở 37oC – 24h, kiểm tra các đĩa cấy để nhận biết sự có mặt của Listeria spp, đặc trưng của các khuẩn lạc này là tròn lồi, có quầng sáng nâu thẵm hoặc thâm đen.  Khẳng định Chọn các khuẩn lạc để khằng định: Từ mỗi đĩa môi trường phân lập (thạch Oxford) chọn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc có nghi ngờ, hoặc nếu có ít hơn 5 khuẩn lạc thì nên chọn tất cả để thử kháng sinh. Nuôi ấm Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn trên bề mặt thạch TSYEA sao cho các khuẩn lạc mọc tách rõ. Đặt các đĩa này trong tủ ấm ở 37oC trong 24h, hoặc cho đến khi các khuẩn lạc mọc. Độ dày của lớp môi trường thạch (15ml/ đĩa). Dùng chum tia sáng trắng để rọi các đĩa, kiểm tra các khuẩn lạc listeria spp, khuẩn lạc có màu xanh và hình dạng hạt. Hình 2.9: Phương thức quan sát hình thái khuẩn lạc Listeria Spp 45
Đồ án tốt nghiệp 2.3.6.4. Thử nghiệm khẳng định  Nhuộm Gram: - Dùng khuyên cấy khuẩn chấm 1 khóm vi khuẩn riêng rẽ trên môi trường TSYEA, làm huyền trọc trong 1 giọt nước muối trên kính, xong trải mỏng thành phiến phết. Nên phân tán đều, không dầy, để có thể quan sát được từng tế bào vi khuẩn. - Lưu định phiến phết bằng cách đưa nhanh tấm kính qua lại trên ngọn lửa độ 4 – 5 lần - Phủ dung dịch Crystal Violet lên phiếm phết, để 1 phút, rửa nước và nghiêng kính cho ráo. - Phủ dung dịch Iodine: Lần I để 30 giây, đổ bỏ. Lần II để 30 giây, đổ bỏ. - Phủ cồn 95% lên phiến phết, để 30 giây. - Rửa nước và nghiêng kính cho ráo. Quan sát phiến phết, nếu còn những vết màu tim đậm phải tẩy màu lần nữa. - Nhuộm lại với dung dịch Safranin trong 30 giây. - Rửa nước, để khô và khảo sát với vật kính dầu. - Ghi nhận kết quả: vi khuẩn có hình dạng hình que, mảnh.  Thử nghiệm Catalse Lấy một khuẩn lạc điền hình và hòa vào một giọt dung dịch hidro peroxit 3% trên phiến kính, khi thấy có tạo bọt là mẫu catalaza dương tính.  Khảo sát khả năng di động trên môi trường TSYEB - Dùng kim cấy cấy sâu vào môi trường di động bằng cách lấy từ một khuẩn lạc điển hình trên TSYEA và nuôi trong tủ ấm ở 25oC trong 48h. - Kiểm tra sự mọc xung quanh móc cấy. Listeria spp là loại có chuyển động, kiểu mọc điển hình giống như cái ô, nếu kết quả là âm tính, nuôi ấm thêm 5 ngày kiểm tra lại vết cấy.  Đặc tính phân giải máu 46
Đồ án tốt nghiệp - Làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng. Vạch các ô hình lưới dưới đáy đĩa petri từ 20-25 ô/đĩa. Lấy một khuẩn lạc điển hình trên đĩa TSYEA và sau đó dùng kim cấy chấm vào mỗi ô một khuẩn lạc. Đồng thời chấm các chủng kiểm tra âm tính và dương tính (L.innocua, L.monocytogenes, L.ivanivii). - Sau khi nuôi ấm ở 37oC trong 48h, kiểm tra các chủng từ mẫu thử và mẫu so sánh, L.monocytogenes cho các vùng sáng trong và hẹp, L.innocua có thể cho vùng không trong xung quanh vết chấm, L.ivanovii thường cho các vùng vạch trong, rộng, làm tan máu. Đặt các đĩa vào vùng rọi sáng để kiểm tra và so sánh các chủng xét nghiệm với chủng so sánh.  .Khả năng lên men đường Xylose, Rhamnose - Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5 - 1% đường cần thử nghiệm. - VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH thay đổi màu chất chỉ thị phenolred. + Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng. + Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ. 2.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bắt đầu ngày 02/04/2012, Lấy mẫu tôm tươi tại các quầy (8 quầy) tại khu vực thủy sản – chợ Bà Chiểu  Sơ đồ bố trí - Tổng số quầy cần phân tích: 8 quầy. - Tổnh số mẫu đã lấy trong thời gian thực hiện đề tài: 32 mẫu. Thời gian phân tích một mẫu là từ 5 – 6 ngày. - Số giống tôm được phân tích: 2 (Tôm bac, tôm sú). - Mỗi mẫu phân tích 4 chỉ tiêu vi sinh: + Tổng số vi sinh vật hiếu khí. + Định lượng Coliforms. + Định tính E.coli. + Phân lập và định danh Listeria monocytogenes. 47
Đồ án tốt nghiệp Lấy 4 mẫu tôm M1, M2, M3, M4/quầy Đánh giá cảm quan mẫu Xử lí mẫu Kết luận cảm quan mẫu Chuẩn bị mẫu phân tích Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh + Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí TPC. + Chỉ tiêu coliforms tổng số. + Định tính E.coli. + PhânHình lập và 2.10 định: B danhố trí Listeriathí nghi monocytogenseệm - Đánh giá kết quả các chỉ tiêu vi sinh phân tích - Đưa ra những khuyến cáo về việc bảo qu ản mua bán sản phẩm tôm tươi - Đề xuất một số giải pháp nhầm nâng cao chất lượng tôm tươi mẫu phân tích Hình 2.10: Bố trí thí nghiệm 48
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hiện trạng khu vực thủy hải sản tại chợ Bà Chiểu 3.1.1. Đặc điểm khu vực chợ Có tính hợp lí, rõ ràng, gồm một số khu vực điền hình: Khu vực rau quả, khu vực mua bán trái cây tươi, khu vực thủy hải sản Số lượng người mua rất đông, nhất là vào các giờ cao điểm (từ 16h – 17h30), các sản phẩm thủy hải sản được tập trung lại các quầy tại chợ với số lượng rất lớn, trong đó các sản phẩm cá tươi và tôm là 2 mặt hàng chiếm số lượng lớn. 3.1.2. Đặc điểm quầy thủy sản (nơi thu mẫu): 3.1.2.1. Bố trí không hợp lí, rõ ràng: Các quầy thủy sản được bố trí không hợp lí, không tập trung, mà nằm một cách rải rác, không có trật tự tại chợ. Có một số quầy (Q6, Q8) được sắp xếp gần khu vực tập trung rác thải và ờ khu vực có mặt bằng xuống cấp, luôn có nước bẩn đọng lắng của chợ 3.1.2.2. Điều kiện buôn bán Mặt hàng của một số quầy quá đa dạng, không cụ thể hóa, có quầy bán tôm đặc trưng, lại có một số quầy bán rất nhiều loại thủy hải sản, đặc biệt có một vài quầy (Q2, Q5) có bán kèm theo một số sản phẩm thủy hải sản khô. Không gian buôn bán giữa các quầy không đồng đều, có những quầy có khu vực rộng, có những quầy lại rất hẹp, không thông thoáng Do có một số lượng lớn khách hàng mỗi ngày, nên những quầy thủy hải sản tại chợ thường có nhiều bụi bẩn và có rất nhiều nguy cơ bị lây nhiễm bởi các điều kiện ngoại nhiễm. 3.1.2.3. Môi trường xung quanh: Môi trường không sạch sẽ, có quá nhiều nguồn nước bẩn xung quanh khu vực thủy sản. → Dựa vào các nguyên nhân trên, chúng tôi nhận thấy rằng việc bố trí khu vực kinh doanh mặt hàng thủy sản tại chợ Bà Chiểu không hợp lí do các quầy hàng buôn bán tự do, không chuyên biệt cho từng loại thủy hải sản nên dễ dẫn đến tình trạng 49
Đồ án tốt nghiệp nhiễm chéo làm cho nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên tôm tươi là khá cao, chính vì vậy cần phải có những biện pháp nhằm ngăn ngừa khả năng nhiễm vi sinh trên thực phẩm. 3.2. Kết quả đánh giá cảm quan mẫu (Theo TCVN 5277 – 90). 3.2.1. Màu sắc và trạng thái mẫu Đối với tôm bạc, tôm có màu trắng, hơi hồng, không đốm đen, không bị xanh đầu. Còn đối với tôm sú, tôm có màu xanh đen bóng, có vân xanh đặc trưng trên thân. Riêng phần đầu, đầu tôm không bị xanh đầu, nguyên vẹn, râu tôm khồng đứt rìa, mắt tôm đen, lồi, bóng, thân có hình dáng đặc thù của loài tôm sú nước ngọt, không đốm đen, dài, bóng và có độ sáng, chân đuôi tôm chưa mất hình dạng ban đầu. Về phần đuôi, đuôi có hình rẻ quạt, số lượng đuôi đều, đẹp, ít đốm đen, thịt tươi trong, không có vân đen, đàn hồi, kết cấu chắc, không bị vỡ. 3.2.2. Mùi vị Ở trạng thái mẫu sống, tôm có mùi rong cỏ đặc trưng, sau khi đun thì có mùi thanh, dễ chịu. 3.2.3. Màu sắc nước Trong điều kiện tự nhiên, nước tôm có màu xanh đen nhạt (do trong quá trình xử lí mẫu, túi mật của tôm bị vỡ ra, làm biến mất màu tự nhiên của nước), sau khi đun sôi, màu sắc nước tôm bắt đầu chuyển màu vàng cam khá trong. Độ trong và độ đục cũng rất khác nhau theo từng quầy. 3.2.4. Độ đàn hồi của thịt Sử dụng ngón tay ấn nhẹ vào thịt tôm sau khi đun, dựa vào mức độ “nẩy” của thịt tôm, chúng tôi nhân thấy rằng thịt tôm ở 8 quầy có kết cấu dai, săn chắc, không vỡ, có độ ẩm thích hợp. 50
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.1: Hình ảnh đánh giá cảm quan mẫu tôm Chú Thích: A: Mẫu tôm tươi B: Mẫu tôm sau khi đã được đun sôi và cho ráo nước. C: Màu nước tôm sau khi đun, so sánh về màu sắc, độ trong, và độ đục. Dựa vào kết quả đánh giá cảm quan chúng tôi nhận thấy rằng, phần lớn các mẫu tôm tươi được lấy từ chợ vẫn trong tình trạng rất tốt, màu sắc và mùi vị vẫn còn tính đặc trưng của sản phẩm. Do thời điểm lấy mẫu là bắt đầu từ lúc 7h30 – 8h30, đây là thời điểm tôm vừa được vận chuyển từ các nơi về, nên sản phẩm thường có trạng thái tươi, ngon và mới. Tuy nhiên vẫn còn có 4 mẫu thuộc Q6 và 2 mẫu thuộc Q8 có tính chất không ổn định về mùi và độ đàn hồi, 3 mẫu Q6 và 1 mẫu Q8 vẫn còn mùi tanh , trạng thái của các mẫu tôm không tốt so với các mẫu khác, khi dùng tay ấn vào thịt tôm của các mẫu này, mức độ lõm thịt khá sâu nhưng thời gian để cho mẫu trở về trạng thái ban đầu là khá lâu, điều này có thể lý giải do một số các nguyên nhân sau: sản phẩm tôm còn thừa cho ngày hôm qua, nguồn gốc mẫu không rõ ràng, sản phẩm đã trải qua quá trình ướp lạnh qua đêm, điạ điểm kinh doanh gần các nguồn nhiễm tại chợ (rác thải, cống ngầm). Việc đánh giá cảm quan của sản phẩm giúp chúng tôi có cái nhìn sơ bộ về tình trạng mẫu trước khi phân tích. Đối với những mẫu tôm có các dấu hiệu cảm quan không tốt điều này có thể dẫn đến sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong mẫu khá cao. Tuy nhiên, đối với các mẫu tôm đạt trạng thái cảm quan tốt thì cũng không chứng tỏ chúng không mang các vi sinh vật gây bệnh. Do đó, kết quả 51
Đồ án tốt nghiệp các mẫu tôm này đạt chất lượng hay không còn phụ thuộc vào kết quả đánh giá sự hiện diện của các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh mà chúng tôi khảo sát. 3.3. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật hiện diện trong mẫu 3.3.1. Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) TPC TỔNG Q8 Q7 Q6 Q5 Q4 Q3 Q2 Q1 TIÊU CHUẨN 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 Hình 3.2: Kết quả đánh giá chỉ tiêu TPC tổng trên 8 quầy Dựa vào hình 3.2, chúng tôi thấy rằng trong 32 mẫu tôm được lấy tại 8 quầy, mỗi mẫu đều nhiễm TPC với những mật độ khác nhau, trong đó quầy có mức độ nhiễm cao nhất là Q1 và quầy có mức độ nhiễm thấp nhất là Q3, các quầy còn lại nhiễm với mức độ tương đương nhau, tỷ lệ chênh lệch không nhiều. Mặc dù có sự khác biệt về mật độ TPC nhưng trong tổng số 32 mẫu tôm phân tích, không có bất kì mẫu nào vượt quá chỉ tiêu vi sinh cho phép (theo TCVN5289/92: 106 CFU/g). Tuy không có mẫu nào vượt quá chỉ tiêu cho phép, nhưng đối với sản phẩm phục vụ bữa ăn hàng ngày và có ảnh hưởng trực tiếp đến với sức khỏe con người thì ta cần phải lưu tâm. Nguyên nhân có sự hiện diện của các vi sinh vật tổng số là do nguồn gốc nơi lấy mẫu không rõ ràng. Trạng thái của tôm không được bảo đảm trong suốt quá trình từ khai thác đến vận chuyển, phương thức bảo quản mẫu không hợp lý, khu vực bán mẫu tôm không vệ sinh, bị ô nhiễm từ nhiều nguồn và từ các tác nhân môi 52
Đồ án tốt nghiệp trường bên ngoài, người bán mẫu (tiểu thương) không thực hiện đúng các nguyên tắc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo quy định. M1Q1 M1Q2 M1Q3 M1Q4 Hình 3.3: Khuẩn lạc TPC trên môi trường PCA 3.3.2. Đánh giá chỉ tiêu Coliforms COLIFORMS TỔNG SỐ Q8 Q7 Q6 Q5 Q4 Q3 Q2 Q1 TIÊU CHUẨN 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Hình 3.4: Kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms tổng trên 8 quầy 53
Đồ án tốt nghiệp Dựa vào hình 4.4, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu tôm thu từ Q6, Q7 và Q8 có mức độ nhiễm coliforms cao nhất, trong đó Q6 là quầy có mức độ nhiễm cao nhất và Q5 là quầy có mức độ nhiễm thấp nhất, mức độ nhiễm giữa các quầy só sự chênh lệch rất lớn, không đồng đều nhau. Trong tất cả 32 mẫu tôm tươi lấy từ 8 quầy, có tất cả 8 quầy nhiễm (tương đương với 32 mẫu), trong đó có 5 quầy (tương đương 20 mẫu) có mật độ coliforms vượt quá mức chỉ tiêu giới hạn cho phép (102 CFU/g) – TCVN 5289 /92, Q1 vượt 4%, Q4 vượt 45%, Q6 vượt 320%, Q7 vượt 217%, Q8 vượt 80%. Mặc dù đối với chỉ tiêu TPC, mức độ nhiễm vượt quá chỉ tiêu cho phép là không có trên 32 mẫu, nhưng đối với chỉ tiêu coliforms có đến 5 quầy có mức độ nhiễm cao (Q1, Q4, Q6, Q7, Q8) chiếm 62,5% tổng số quầy. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị an toàn đối với thực phẩm vì khi chỉ tiêu coliform trong mẫu cao chứng tỏ có sự hiện diện của các vi sinh vật đường ruột như E. Coli, Salmonella, Shigella. Các vi sinh vật này chính là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. Sự hiện diện của coliforms trong mẫu với mật độ cao có thể do hiện trạng khu vực xung quanh mẫu có nhiều nguy cơ nhiễm coliforms , môi trường nước là đáng lưu ý nhất, từ môi trường nước nuôi tôm cho đến môi trường nước để giữ độ tươi cho tôm, việc bố trí không khoa học các quầy thủy sản không hợp lí cũng là một nguyên nhân gây ra sự nhiễm chéo coliforms giữa các quầy khác nhau (quầy cá, rau, thịt, ) các dụng cụ chứa mẫu tôm tươi (thùng, bể) cũng không được chú trọng trong việc vệ sinh kĩ lưỡng, thông thường những tiểu thương chỉ sử dụng nước chứa tôm dùng vệ sinh các dụng cụ, rất có thể các dụng cụ này đã bị nhiễm từ nước rửa. Đối với những người bán tại chợ (tương tự như đánh giá chỉ tiêu TPC), họ không sử dụng và thực hiện đúng các nguyên tắc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, những người bán có thể bị nhiễm coliforms sau đó nhiễm lây lan qua cho mẫu. Đối với 2 quầy nhiễm Q6 và Q8, như đã đánh giá cảm quan trên và nhìn nhận về hiện trạng lấy mẫu, chúng tôi có thể nhận định rằng, 2 quầy này nhiễm Coliforms chủ yếu thông qua các tác nhân bên ngoài: môi trường, nguồn nước, 54
Đồ án tốt nghiệp không gian buôn bán ), đây chính là những nguyên nhân tiền đề làm tăng mối nguy nhiễm Coliforms trên các quầy thủy hải sản tại chợ Bà Chiểu. Hình 3.5: Khuẫn lạc Coliforms trên môi trường ENDO ĐC M1 M2 M3 M4 (+) (+) (+) (+) Hình 3.6: Colifomrs trên môi trường BGBL 3.3.3. Chỉ tiêu E.Coli Bảng 3.3: Kết quả các mẫu phân tích dương tính E.Coli Mẫu E.Coli M3Q6 Dương tính M2Q8 Dương tính 55
Đồ án tốt nghiệp 6,25% Âm Tính Dương Tính 93,75% Hình 3.7: Tỷ lệ nhiễm E. Coli trên 32 mẫu tôm Hình 3.8: Khuẩn lạc E.Coli trên môi trường EMB Dựa vào hình 4.7, chúng tôi thấy rằng trong 32 mẫu cần phân tích, có 2 mẫu được xác định là dương tính với E. Coli, 2 mẫu đó là: 1 mẫu ở quầy 6 (M3Q6) và 1 mẫu ở quầy 8 (M2Q8). Việc các mẫu tôm ở Q6 và Q8 có sự hiện diện của E. Coli là điều có thể dự báo được vì kết quả đánh giá cảm quan các mẫu tôm thu từ hai quầy này không tốt và kết quả đánh giá chỉ tiêu Coliforms cao hơn tiêu chuẩn rất nhiều lần. Sự hiện diên của E. Coli trong mẫu có thể do một số nguyên nhân: Môi trường kinh doanh buôn bán tại chợ Bà Chiểu là rất phức tạp, việc bố trí các quầy thủy sản không hợp lí giữa các quầy, phân bố không đều, nằm rải rác ở các 56
Đồ án tốt nghiệp khu vực nhỏ và không hợp lí (Q5, Q6, Q7 và Q8), việc này đã làm dẫn đến hiện tượng nhiễm E. Coli từ các mẫu khác nhau trong chợ như: quầy cá, quầy thịt, khu vực buôn bán thủy sản có quá nhiều vấn đề cần phải lưu ý: nguồn nước sử dụng, môi trường buôn bán chung, các nguyên nhân này mang tính chất phức tạp và thay đổi theo từng ngày, một số quầy (Q6, Q3) tập trung gần ngay khu vực tập trung rác thải, điều này một số lượng lớn mẫu tôm có thể bị nhiễm ngay từ môi trường ngoài.Vi khuẩn E. coli có thể lan truyền từ người không rửa tay sau khi đi vệ sinh mà tiếp xúc trực tiếp với các mẫu tôm. 3.3.4. Chỉ tiêu Listeria monocytogenes Bảng 3.4: Đánh giá chĩ tiêu Listeria monocytogenes trên 8 quầy LISTERIA MONOCYTOGENES Mẫu Kết quả Q1 (-) Q2 (-) Q3 (-) Q4 (-) Q5 (-) Q6 (-) Q7 (-) Q8 (-) Dựa vào kết quả bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy rằng không có bất kì mẫu nào trong tổng số 32 mẫu nhiễm Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes là vi khuẩn yếm khí thùy nghi và phát triển rất bền vững trong môi trường và có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5oC (vi khuẩn ưa lạnh), chính vì những đặc điểm sinh học này cho nên mức độ hiện nhiễm Listeria monocytogenes trên các sản phẩm thủy hải sản tươi sống là rất ít. Chính vì điều này mà nguy cơ lây nhiễm chéo thường rất khó xảy ra. Listeria monocytogenes thông 57
Đồ án tốt nghiệp thường chỉ nhiễm trên các mẫu hoa, quả và thực phẩm thiết yếu tươi sống (VD: dưa hấu vàng, sữa, thịt ) mà ở trong khu vực chợ Bà Chiểu, các mẫu này nằm ở các khu vực cách xa nhau, mẫu tôm được lấy từ nguồn mẫu không có bị nhiễm Listeria monocytogenes. Trong quá trình vận chuyển trước khi được đem ra thị trường tiêu thụ, mẫu vẫn ở trạng thái ổn định và không bị nhiễm, quá trình vệ sinh nguồn mẫu được đảm bảo, việc vệ sinh các bề mặt tiếp xúc, dụng cụ xử lí mẫu thực hiện có hiệu quả. Tóm lại, trong tổng số 32 mẫu tôm thu được từ 8 quầy ở chợ Bà Chiểu, chúng tôi nhận thấy rằng phần lớn tôm tại các quầy có các đặc điểm cảm quan tốt, chỉ tiêu TPC thấp, riêng đối với chỉ tiêu Coliforms thì có đến 5 quầy vượt mức cho phép và cao nhất ở các mẫu tôm ở quầy Q6 và Q8. Đặc biệt cũng chính các mẫu tôm ở hai quầy này có sự hiện diện của vi khuẩn E. Coli. Mặc dù vậy tất cả các mẫu đều không có sự hiện diện của vi khuẩn L. monocytogenes. Như vậy, nhìn chung tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm của các quầy thủy sản cũng không đáng mức báo động ngoại trừ các mẫu ở Q6 và Q8. Do đó, chúng tôi khuyến cáo với người 6 tiêu dùng nên cân nhắc khi sử dụng sản phẩm tôm từ 2 quầy 8 do dễ dẫn đến tiêu chảy. Riêng đối với các sản phẩm tôm từ chợ Bà Chiểu thì người tiêu dùng không nên ăn sống, tái mà phải chế biến kỹ để tránh tình trạng rối loạn tiêu hóa do vi khuẩn đường ruột gây ra. 58
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận  Đánh giá cảm quan Hầu hết các mẫu tôm (27/32 mẫu) đều có đánh giá tốt về mặt cảm quan từ trạng thái đến mùi vị, tất cả các mẫu tôm đều ở trong tình trạng bên ngoài nguyên vẹn, các bộ phận của tôm không bị tách rời, tôm vẫn giữ được mùi vị đặc trưng tự nhiên (mùi rong), và sau khi nấu chín (mùi thơm dễ chịu), vị ngọt nhẹ của thịt tôm. Đối với màu sắc, sau khi nấu chín tôm có màu đỏ tươi, có giá trị cảm quan cao, thịt tôm có độ đàn hồi, dai, chắc thịt.  Chỉ tiêu TPC Trong tổng số 32 mẫu tôm tươi được lấy tại 8 quầy cần phân tích thì có tất cả 32 mẫu đều bị nhiễm TPC, trong đó không có mẫu nào nhiễm TPC vượt quá chỉ tiêu cho phép (106CFU/g).  Chỉ tiêu Coliforms Ở chỉ tiêu Coliforms, kết quả có 32 mẫu nhiễm Coliforms trong tổng số 32 mẩu được phân tích, phát hiện có 5 quầy trên tổng số 8 quầy (chiếm 62,5% tổng số quầy được phân tích) có mức độ nhiễm Coliforms vượt quá giới hạn cho phép (102CFU/g).  Đánh giá mức độ nhiễm E.Coli Ở thí nghiệm này, phát hiện có 2 mẫu nhiễm E.Coli trong tổng số 32 mẫu được phân tích, tỷ lệ mẫu không đạt chiếm 6,25%.  Phát hiện Listeria monocytogenes Phát hiện không có mẫu tôm dương tính với Listeria monocytogenes trong tổng số 32 mẫu được phân tích (tỷ lệ mẫu không đạt chiếm 0%). 4.2. Đề nghị - Kiểm tra thêm một số chỉ tiêu vi sinh vật có khả năng hiện diện trên sản phẩm thủy hải sản tươi sống. (Vd: Vibrio spp ) - Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu, địa điểm lấy mẫu. 59
Đồ án tốt nghiệp - Cần mở rộng đánh giá thêm một số đối tượng thủy haỉ sản khác ngoài tôm như: cá, mực 60
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Trọng Nho, Tạ Khắc Thường, Lục Minh Diệp (2003). Giáo trình kỹ thuật nuôi Giáp xác, NXB Nông nghiệp TP.HCM. [2]. ThS.Phan Thị Thanh Quế. Giáo trình Công nghệ chế biến thủy hải sản. Đại Học Cần Thơ, Năm 2005. [3]. Nguyễn Tiến Dũng (2006). Tài liệu bài giảng Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm. Đại học Khoa Học Tự Nhiên. [4]. Trần Linh Thước (2008). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phầm. NXB Giáo dục [5]. Lương Đức Phẩm (2000). Vi sinh vật và an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp Hà Nội. [6]. Trần Thị Hoa Sim (2005). Nghiên cứu khả năng gây bệnh cho chuột ở các chủng Samonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm, thực phẩm. Luận văn tốt nghiệp Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm TpHCM. [7]. PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp. Vi sinh vật trong thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. [8]. Bùi Quang Tề (1996). Bệnh tôm cá và giải pháp phòng trị. Tạp chí thuỷ sản số 4/1996. [9]. Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. [10]. Phạm Minh Nhựt (2007). Tài liệu bài giảng Phương pháp đánh giá chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm. Lưu hành nội bộ Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. HCM. [11]. Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004).The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Ghent University, Belgium. 61
Đồ án tốt nghiệp [12]. TCVN 6404:1998 (ISO 7218:1997).Vi sinh vật học – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật. [13]. Nguyễn Thị Xuân Oanh (2011). Phát hiện Listeria monocytogenes. Viện Pasteur TpHCM [14]. AFNOR (1997). Norme Française NF V 08-055. Microbiologie des aliments. Recherche de Listeria monocytogenes. Méthode de Routine. Paris, France. [15]. cholerae-trong-san.html [16]. AnalyticalManualBAM/UCM071400 62
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A. Kết quả đếm khuẩn lạc TPC TPC Q1 M1 M2 M3 M4 10-2 185 176 >250 247 189 124 >250 192 10-3 120 91 191 115 >250 158 173 152 10-4 113 104 133 86 64 93 142 161 N 789 772 628 820 A(CFU/g) 3,5x104 6,38x104 2,96x104 6,72x104 TPC Q2 M1 M2 M3 M4 10-2 158 >250 192 147 90 >250 115 170 10-3 115 131 43 250 102 >250 212 130 86 10-3 59 72 <50 55 77 83 175 133 10-4 <25 <25 <25 135 67 <25 <25 124 N 447 332 439 648 63
Đồ án tốt nghiệp A(CFU/g) 2,1x104 2,9x104 3,6x104 2,9x104 TPC Q4 M1 M2 M3 M4 10-2 236 >250 >250 247 224 >250 248 190 10-3 103 96 102 111 >250 194 126 151 10-4 79 66 54 86 250 206 203 >250 >250 212 187 10-3 167 151 250 72 220 102 241 >250 >250 >250 10-3 236 190 128 177 144 83 90 138 10-4 <25 51 62 <25 <25 <25 <25 <25 N 549 689 468 228 A(CFU/g) 4,5x104 3,1x104 3,9x104 1,14x105 64
Đồ án tốt nghiệp TPC Q7 M1 M2 M3 M4 10-2 >250 140 >250 162 211 >250 125 96 10-3 152 111 102 132 181 145 70 55 10-4 250 >250 126 183 143 >250 >250 >250 10-3 54 73 92 60 58 <50 60 <25 10-4 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 N 127 461 201 60 A(CFU/g) 6,3x104 2,09x104 1,83x104 6x104 B. Một số hình ảnh thí nghiệm 1. Tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) Hình B.1.1: TPC – Q1 trên PCA 65
Đồ án tốt nghiệp Hình B.1.2: TPC – Q2 Hình B.1.3: TPC – Q3 2. Coliforms tổng số Hình B.2.1: Coliforms – Q1 66
Đồ án tốt nghiệp Hình B.2.2: Coliforms – Q2, Q3 Hình B.2.3: Coliforms – Q8, tỷ lệ R= 3/4 3. E. Coli Hình B.3.1: Khuẩn lạc trên Hình B.3.2: Thử nghiệm môi trường EMB sinh hơi trên BGBL 67
Đồ án tốt nghiệp Hình B.3.3: Khuẩn lạc trên Hình B.3.4: Thử nghiệm môi trường TSA Indol Hình B.3.5: Thử nghiệm MR – VP, Simon citrate 4. Listeria monocytogenes 68
Đồ án tốt nghiệp Hình B.4.1: Khuẩn lạc trên môi trường Oxford B. Thành phần – cách pha của một số môi trường và thuốc khử 2.1 Môi trường pha loãng 2.1.1 Nước muối sinh lý - Thành phần: Natriclorua : 8,5 g Nước cất : đủ 1000 ml - Cách pha chế: hòa tan muối trong nước cất thành trùng bằng nồi hấp 121 ±10C trong 15 phút. 2.1.2 Nước pepton - Thành phần: Peptone : 1,0 g 69
Đồ án tốt nghiệp Natriclorua : 8,5 g Nước cất : 1000 ml - Cách pha chế: Hòa tan các thành phần trên trong nước cất điều chỉnh pH là 7,0 ±0,2 ở 240C chứa trong ống nghiệm hoặc bình có dung tích phù hợp tiệt trùng nồi hấp ở 121 ±10C trong 15 phút, nếu chưa dùng caand bảo quản trong tối 0 – 5 0C không quá một tháng. 2.1.3 Dung dịch đệm - Thành phần Pepton : 10g Natriclorua : 5g Dinatri hydrophotphat (Na2HPO4): 9g Kali hidrophotphat : 1,5g Nước cất : 1000ml - Cách pha chế: Đun để hòa tan các thành phần trên, chỉnh pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C. Rót vào các bình hoặc ống nghiệm với dung tích phù hợp, thành trùng ở 121 ±10C trong 15 phút. Nếu chưa dùng cần bảo quản trong tối ở 0-50C không quá một tháng 2.2 Môi trường thạch Tryton Glucoza - Thành phần: Trypton : 5g Cao men : 2,5g D- Glucoza : 12-18g Nước cất : 1000 ml - Cách pha chế: Đun để hòa tna các thành phần trên, chỉnh pH là 7,0±0,2 ở 250C. Rót vào các bình hoặc óng nghiệm với dung tích phù hợp với một lượng môi trường không quá ½ dung tích bình thanh trùng ở 121 ±10C trong 15 phút để nguội trong nồi cách thủy đến 45±10C. Nếu chưa dùng cần bảo quản môi trường trong tối ở 0 – 50C không quá 70
Đồ án tốt nghiệp một tháng. Trước khi dùng đun cách thủy cho chảy môi trường và để nguội trong nồi cách thủy tới 45±10C. 2.3. Môi trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB) - Thành phần: Cao nấm men : 3 g Peptone hoặc gelysate: 7 g NaCl : 5 g Muối mật : 1,5 g Lactose : 10 g Neutral red : 0,03 g Crytal violet : 0,002 g Agar : 15g Nước cất : 1000ml - Cách pha chế: Hòa tan thành phần trên trong nước cất đun nhỏ lửa sôi thỉnh thoảng quấy đều, để sôi trong 2 phút, không để sôi quá lâu hoặc đun nhiều lần. Làm nguội trong moi trường cách thủy đến 450C ±10C, điều chỉnh pH là 7,4 ±0,1 ở 250C không được thành trùng trong nồi hấp, cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường khi dùng. Nên sử dụng môi trường trong vòng 3 giờ kể từ khi pha chế xong. 2.4. Môi trường Brilliant Green Bile Lactoza (BGBL) - Thành phần: Peptone : 10 g Lactoza : 10g Mật bò : 20g Dung dịch 0,1% Brilliant Green : 13,3g Nước cất đủ : 1000ml Cách pha chế: Hòa tan pepton và lactoza trong 500ml nước cất. hòa tan 20g mật bò trong 200ml nước cất, trộn hai dung dịch thêm nước cất đến 975ml. chỉnh pH 7,4 ±0,1 ở 25oC, cho thêm 13,3ml dung dịch Brilliant Green 0,1% trong nước 71
Đồ án tốt nghiệp cất, thêm nước cất đủ 1000ml rót vào các ống nghiệm cỡ 16mm có chuông durham, hấm thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút. 2.5. Môi trường thạch Eosine Methylen Blue Agar (EMB) - Thành phần: Peptone : 10g Lactoza : 10g Dikali hydrophotphat: 2g Eosine : 0,4g Methylen xanh : 0,065g Thạch : 15g Nước cất : 1000ml - Cách pha chế: đun để hòa tan thành phần bên trong nước cất, hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 7,2±0,1 ở 25oC. 2.6. Canh Metyl Red Voges Prokauer (MR-VP) -Thành phần Peptone : 5g Dikali hidrophotphat: 5g Dextroxa hoặc glucoza: 5g Nước cất đủ : 1000ml - Cách pha chế: đun để hòa tan thành phần trên trong nước cất, rót vào ống nghiệm có dung tích phù hợp hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 7,5±0,1 ở 25oC. 2.7 Môi trường thạch Simmons Citrate Agar - Thành phần Amonidihydrophotphat: 1g Dikali hydrophotphat: 1g Natriclorua : 5g Natricitrat : 2g Magiesunfat : 0,2g 72
Đồ án tốt nghiệp Bromothymol xanh : 0,08g Agar : 12,5g Nước cất : 1000ml - Cách pha chế: đun để hòa tan thành phần trên trong nước cất. hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 6,6±0,1 ở 25oC. 2.8 Thuốc khử Kovac (để thử phản ứng indol) - Thành phần P-Dimethylaminobenzaldehyde: 10g Isoamul alcohol: 150ml HCl đậm đặc : 50ml - Cách pha chế: hòa tan 10g P-Dimethylaminobenzaldehyt vào 150ml isoamul alconol đun nhẹ ở 50-59oC đến tan hết, để nguội và cho thêm 50ml axit sunfuaric đậm đặc. 2.9. Thuốc khử KOH 40% - Thành phần KOH : 40g Nước cất : 1000ml 2.10. Thuốc khử α - naphthol 5% α – naphthol : 5g Etanol tuyệt đối : 100ml 2.11. Môi trường thạch MacConkey - Thành phần Pepton : 20g Lactoza : 10g Natriclorua : 5g Tím tinh thể, dung dịch 0,1 %: 1ml Đỏ trung tính, dung dịch 1%: 3ml Agar : 13,5g Nước cất : 1000ml 73
Đồ án tốt nghiệp - Cách pha chế: đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất, hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 7,2 ± 0,2 ở 25oC. Nước Trypton (dùng để thử phản ứng indol) - Thành phần Trypton : 20g Natriclorua : 5g Nước cất : 1000ml - Cách pha chế: hòa tan thành phần trên trong nước cất và chỉnh pH = 7,5, sau đó phân phối vào từng ống nghiệm khoảng 5ml và hấp 1150C/10 phút. 2.12. Môi trường Trypticase Soya Agar (TSA) - Thành phần Trypticase peptone : 15g Phytone peptone : 5g NaCl : 5g Agar : 15g - Cách pha chế: đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất. hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 7,2±0,2 ở 25oC. 2.13. Môi trường Plate Count Agar (PCA) - Thành phần Tryptone : 5g Cao nấm men : 2,5g Dlucose : 1g Agar : 13g Nước : 1000ml - Cách pha chế: đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất. hấp thanh trùng ở 121±0,1oC trong 15 phút, chỉnh pH là 7,2±0,2 ở 25oC 2.14. Môi trường thạch Oxford (phân lập Listeria monocytogenes) - Thành phần Môi trường thạch Columbia cơ bản: 39g 74
Đồ án tốt nghiệp Aesculin : 1g Amoni sắt (III) citrate : 0,5g Liti Clorua : 15g Nước : 1000ml. - Chuẩn bị: hòa tan các thành phần rắn trong nước bằng cách đun sôi. 75